摘要 目的：建立固本明目颗粒挥发油中丁香酚含量的HPLC测定方法。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）测定丁香酚的含量：色谱柱为Waters C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-水（55：45，V/V）；流速为1.0ml/min；检测波长为280nm；柱温为35℃。结果：丁香酚在100.08μg/ml~1000.80μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系（R=0.9996），平均加样回收率为95.89%，RSD1.01%；。结论：本试验所建立的质量分析方法专属性强，准确，重复性好，可用于固本明目颗粒中丁香酚的质量控制。
关键词 丁香酚；高效液相色谱；固本明目颗粒
中图分类号：R917 文献标识码：A
HPLC Determination of Eugenol of Guben Mingmu Keli
ABSTRACT OBJECTIVE: To establish the HPLC method for determination of eugenol of Guben Mingmu Keli . METHODS: High performance liquid chromatography (HPLC) was applied to determine the content of eugenol. The determination was performed on Waters C18（250 mm×4.6 mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-water（55：45，V/V）at the flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength was set at 280 nm，and column temperature was 35℃. RESULTS: There was a good linear relationship within the range of 100.08μg/ml~10008.0 μg/ml for eugenol. The average recovery of embelin was 95.89%.And the RSD was 1.01%. CONCLUSIONS: The method is exclusive, reliable, reproducible and feasible for the quality control of eugenol.
KEYWORDS eugenol;HPLC; Guben Mingmu Keli
固本明目颗粒是地方标准上升国家标准品种[1]，标准号：WS-10485(ZD-0485)-2002-2012Z。处方为红花、诃子、塞北紫堇、丁香、冰片、熊胆粉等六味，其中丁香、红花提取挥发油后，喷入最后的成品，但实际生产过程中发现，该制法无法保证产品的稳定性，丁香酚含量降低严重。为解决上述问题，作者使用现代药剂学新技术，将挥发油用倍他环糊精（β-CD）进行包合[2]，在制粒过程中进行加入，得到成品后，稳定得到改善。但由于蔗糖的包裹，原标准挥发油测定方法（GC法）无法有效的对丁香酚进行含量测定。
本实验采用HPLC法对丁香中丁香酚进行了含量测定研究，结果表明：本方法专属性好，精密度高，测定结果准确，溶液稳定好，能用于包合后固本明目颗粒的质量控制。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪，包括LC-20AT泵，SPD-M20A检测器，SIL-20A进样器（日本岛津公司）；岛津AUW220D电子天平（日本岛津公司）；岛津GC-2014C高效气相色谱仪（日本岛津）；KQ-300B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
固本明目颗粒（山东金诃药物研究开发有限公司，批号：20160512、20160513、20160514），丁香酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110725-201414），甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 含量测定
2.1 液相色谱条件
参考文献，选择甲醇-水为流动性[3-5]，结果表明：当甲醇-水比例为55:45时，丁香酚主峰保留时间为13.00min左右，且与杂质分离度良好，适用于固本明目颗粒的含量测定；通过DAD进行扫描知，丁香酚在210m、230nm、280nm处均有最大吸收波长，但实验结果表明：280nm处杂质更少，更加有利于固本明目颗粒中丁香酚的含量测定，选择280nm为检测波长；沃特世科技有限公司生产C18柱（250mm*4.6mm，5um）；使用35℃柱温；进样10ul。
图1 丁香酚DAD波长扫描色谱图
2.2 溶液的制备
对照品溶液的制备：精密称取丁香酚对照品适量，置于棕色瓶中，使用70%乙醇溶解并稀释至刻度，制成浓度约为0.5mg/ml的溶液。
供试品溶液的制备：本品研细后，称取约0.5g，置50ml棕色容量瓶中，加入40ml70%乙醇溶液，密封，超声处理20min。超声完毕后，放冷，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品测定溶液。
2.3 系统适用性及阴性试验考察
制备缺少丁香的阴性样品，同法制备阴性样品溶液。吸取上述三种溶液（对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液）各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。分析表明：供试品色谱中，在供试品溶液色谱中检出与丁香酚对照相应的位置检出相应色谱峰，且丁香酚峰型较好，主峰与相邻的杂质峰分离度较好，主峰保留时间适中，阴性样品无干扰，可用于固本明目颗粒中丁香酚的质量控制。结果见图2。
图2-1 丁香酚HPLC测定色谱图 图2-2 固本明目颗粒HPLC测定色谱图
图2-3丁香阴性样品HPLC测定色谱图
2.4线性关系试验考察
精密量取丁香酚对照品贮备溶液(1000.80ug/ml) 1ml、2ml、3ml、5ml、7ml、10ml，分别置10ml棕色容量瓶中，使用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，自动进样器进样10μl，记录丁香酚峰的峰面积，以峰面积(A)对对照品浓度(C)进行线性回归。试验结果：丁香酚的线性回归方程为A=10911C+91933，相关系数r=0.9996（n=5）。结果表明：在100.08μg/ml~1000.80μg/ml浓度范围内，丁香酚的峰面积(A)与对照品浓度(C)线性关系良好。
2.5 系统精密度试验
精密吸取丁香酚对照品溶液10μl，进样，记录色谱图中丁香酚峰面积，连续进样6次，以峰面积计算相对标准偏差RSD%，评价系统精密性。试验结果：丁香酚峰面积的平均值为`x=5423268，RSD%=0.57%（n=6）。结果表明：精密度良好，用于固本明目颗粒中丁香酚的测定。
2.6 溶液稳定性试验
供试品溶液制备完成后，分别于0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时分别进样10ul。记录峰面积，计算相对标准偏差RSD%，评价供试品溶液稳定性及系统的耐用性。试验结果：丁香酚峰面积的平均值`x=5994092，RSD%=0.81%（n=6）。结果表明：供试品溶液在8h内测定丁香酚结果稳定，能满足实验的需要，。
2.7 样品重复性试验
固本明目颗粒（批号20160512）研细后，取约0.5g，共称取6份，精密称定，置50ml容量瓶中，分别制备供试品溶液，测定丁香酚含量并计算RSD%，评价系统重复性。试验结果：样品中丁香酚的平均含量`x=2.81%（n=6），RSD=0.53%（n=6）。结果表明：该实验方法的重复性良好，能满足实验需要。
2.8 加样回收率试验
取固本明目颗粒（批号20160512，含量2.81%）正常取样量的一半，即取0.25g，置50ml棕色容量瓶中，各精密称取6份，精密加入丁香酚对照溶液（1.0008mg/ml）15ml，再加入70%乙醇25ml，超声处理20分钟，超声完毕后，放冷后，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，高效液相色谱仪进样10μl，以外标法测定丁香酚的含量，以含量计算的丁香酚对照回收率平均`x及相对标准偏差RSD%。试验结果：实验中丁香酚对照品的平均加样回收`x=96.89%（n=6），RSD%=1.01%（n=6）。结果表明：该丁香酚测定方法准确性良好，可用于固本明目颗粒的含量控制。
2.9 样品含量测定
分别测定20160512、20160513、20160513的三批固本明目颗粒样品的。分别计算样品中丁香酚的含量。试验结果：丁香酚的平均含量分别为0.141mg/袋、0.138 mg/袋、0.151mg/袋（n=3）。
3讨论
3.1 测定波长的选择
DAD扫描显示丁香酚在210nm、230nm及280nm处均有最大吸收，文献报道中多以230nm为测定波长，但实验中发现虽然210nm、230nm下主峰面积更大，但280nm下杂质峰明显减少，参考文献[6]，更加有利于固本明目颗粒的检测，故选择280nm为测定波长。
3.2 流动相的选择
文献报道，多以甲醇-水体系为流动性，也有乙腈-磷酸体系进行测定的[7]，但考虑甲醇-水体系更加简单，同时摸索了相应比例，以甲醇-水比例为55：45为流动性时，主峰相对保留时间为13min左右，杂质峰较少，丁香酚与其他相邻色谱峰的分离度大于1.5，能用于固本明目颗粒的含量测定。
3.3供试品溶液的制备
固本明目颗粒原工艺为挥发油喷入颗粒表面，使用乙醇进行提取，能完成实验，改进工艺后挥发油经包合后制颗粒，使用蔗糖包裹后，乙醇无法提取出包合后丁香酚。研究表明,DMF能使样品完全溶解，但DMF腐蚀性较大，且杂质较多，不利于实验，通过实验，使用70%乙醇对丁香酚的提取率与DMF一致，同时70%乙醇提取杂质较少，选择70%乙醇为提取溶剂。
3.4 GC法和HPLC法比较
为确定新方法的准确性，使用原GC法进行了测定，并进行了比较，20160512、20160513、20160513的三批固本明目颗粒样品GC内标法结果分别为：0.138mg/袋、0.135 mg/袋、0.149mg/袋（n=3）。但HPLC法较GC法具有操作简便、灵敏度高、准确性好和精密度好的特点，同时HPLC法具有不受样品挥发性和热稳定性的特点[2]，分离温度低，各组分容易被分离，更有利于对热不稳定样品的测定。
4结论
本研究建立了固本明目颗粒中丁香酚的高效液相色谱的定量研究，该测定方法简便、准确，回收率，重复性均能达到要求，可用于控制固本明目颗粒的质量，同时为进一步开发利用奠定基础。
参考文献：
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*作者：（1987年-？），男，汉族，山东济南人，山东金诃药物研究开发有限公司，经理，工程师，主要从事药品质量标准制定、新药研究开发及药物分析工作。