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转录因子LAG-1/CSL在控制血清素化疗神经元的末期分化-厦门论文发表
发表时间:2021-07-14     阅读次数:     字体:【

转录因子LAG-1/CSL在控制血清素化疗神经元的末期分化、命运维持和可塑性方面起着一定独立的作用-厦门论文发表

· 米伦·梅卡斯

· 安格拉·希梅诺-马丁

· 安德里亚·米伦-特雷霍

· 马克·阿尔克马

· 努里亚火焰

· 发布时间: 2021年7月7日

· https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334

抽象

在开发过程中,信号调节转录因子 TFs) 充当基础抑制剂,通过形态或细胞对细胞信号向激活器转移时发出信号,调解精确和瞬时反应。相反,在神经元规范的最后一步,终端选择器 TFs 通过作为激活器的持久功能直接启动和维持神经元类型的特定基因表达。C. elegans包含3种血清素合成神经元,这些神经元共享血清素生物合成通路基因的表达,但不包括其他效应基因。在这里,我们发现LAG-1是一个非常规的角色,它是F1通路的信号调节TF介导器,作为ADF血清化化疗神经元的终端选择器,但不是其他血清素神经元类型。ADF效应基因的调控区域包含功能性LAG-1结合位点,这些位点可以调节激活,但不会进行基础抑制。滞后-1突变体在ADF效应基因激活中表现出广泛的缺陷,LAG-1需要保持ADF细胞的命运和功能。出人意料的是,与在 Notch 受体激活之前报告的 LAG-1 基础抑制状态相反,LAG-1 在 ADF 神经元中的基因表达激活不需要 Notch 信号,这显示了独立于 Notch 的 LAG-1 的默认激活状态。我们假设,目标基因上终端选择器的持久活动需要从接收瞬态缺口信号中脱钩 LAG-1 激活角色。

引文:Maicas M、 Jimeno-Martón + 、米伦-特雷霍 A、阿尔克马 MJ、火焰 N (2021) 转录因子 LAG-1/CSL 在控制血清素化疗神经元的末期分化、命运维护和可塑性方面发挥着独立的作用。PLoS 生物 19 (7): e3001334.https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334

学术编辑:叶冰,密歇根大学,美国

收到:2021年1月26日:接受:2021年6月21日:已发布:2021年7月7日

版权所有2021年?梅卡斯等人。这是一个开放访问文章,根据《知识共享归属许可证》的条款分发,允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制,前提是原始作者和来源得到记分。

数据可用性:所有相关数据均在文件及其支持信息文件中。

资金:NF研究由欧洲研究理事会(ERC StG 281920) 资助;ERC COG 101002203)、西班牙政府(SAF2017-84790-R)和瓦伦西亚纳将军(PROMETEO/2018/055)。A.M.T 持有西班牙政府和 A.J 的 PRE2018-086632 奖学金和瓦伦西亚纳将军的 ACIF/2015/398 奖学金。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或编写手稿方面没有作用。

竞争利益:作者宣称不存在相互竞争的利益。

缩写5HT,血清素:bHLH,基本螺旋环他:CRM,西斯-监管模块;CSL, CBF-1, 苏 (H), 滞后 - 1;ETS,红细胞转化具体:高清,荷马多曼;L1,第一幼虫阶段;NHR,核激素受体;NICD,细胞内缺口域;sc-RNAseq,单细胞雷纳塞克;SOX,与SRY相关的HMG盒基因;TF,转录因子:TIR-1,收费和插话1接收器;ZF, 锌手指

介绍

神经系统中大量神经元类型的生成是一个复杂而漫长的过程,目前尚不为人所知。在神经元规范的最初步骤中,形态和细胞表面信号分子指定天真的细胞对受限神经元祖先[1]。不同类型的神经元祖先在基因表达水平上的急剧差异对于精确的神经元诱导至关重要。因此,这些信号分子通过称为信号调节 TF 的特定转录因子 (TFs) 起作用。在基础条件下,信号调节的 TF 充当抑制剂,当信号分子收到[2]时,它们会转移到时间和空间限制的基因激活。不同的机制,包括蛋白质不稳定、翻译后修改、负反馈回路或交叉抑制,确保信号调节TF[23]的瞬时激活效果。

在开发后期,在神经元终端分化过程中,与信号调节 TF 介导的瞬态激活效应相比,TFs 特定组合(称为终端选择器)的持久作用确保了神经元类型特定效应基因(如离子通道、神经递质受体、神经递质生物合成酶等)的直接和持续转录激活[4]。效应基因最终负责神经元的特定特性和生理功能,其表达在整个细胞的一生中得以维持。因此,终端选择器 TFs 也不断表达,它们不仅需要建立,而且需要保持正确的效应基因表达[56]

神经元末梢选择器在不同的元祖群中被描述,包括哺乳动物[5,7],尽管它们在C中具有最佳特征。elegans,其中至少一个终端选择器是已知的76出112种不同的神经元类型[8]。有趣的是,尽管有无数的 TF 充当终端选择器的例子,但已知只有少数 TF 家庭充当来自C 50 多个不同家庭的神经元终端选择器。电子基因。这包括Erythroblast T运行S特定 ETS), SRY 相关的 HMG-b基因 SOX), Nuclear H或月R接受器 NHR), Basic Helix Loop Helix (bHLH), Zinc F因格 ZF), 以及最突出的是 Homeodomain (HD) 家族[8]。然而,对于C中的许多神经元类型。电子元件,到目前为止还没有确定一个终端选择器,因此额外的TF家族也可以直接参与神经元终端分化。

血清素 5HT) 是存在于所有动物群体中的植物性保守神经递质。相同的酶和转运器用于不同的生物体合成,释放和重新吸收5HT,这统称为5HT通路效应基因(1A)。C.电子元包含3种不同类型的5HT合成神经元:ADF化学感官神经元、NSM神经精体神经元和HSN运动神经元(1B)。尽管共享 5HT 通路基因的表达,但每个 5HT 神经元类型表示一组非常不同的额外效应基因[9]。因此,在 NSM 和 HSN 中执行的终端选择器的组合是不同的[910]。与具有良好特征的 NSM 和 HSN 终端分化程序相比,ADF 化疗神经元尚未确定终端选择器。

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1。CSL/LAG-1 结合位点是ADF化学感官神经元血清素通路基因表达所必需的。

A) 植物学保存血清素生物合成通路。C. elegans蛋白质名称出现在深色字体中,哺乳动物以灰色出现。(B) C.埃莱甘斯草本血清素合成系统由3种类型的双边神经元(NSM、ADF和HSN组成,L:左,R:右)。(C) 5HT通路基因最小CRM活跃在ADF神经元中。所有 CRM 共享的最显著代表性过高的图案均以蓝色描述。括号中的数字表示每个结构的坐标,这些坐标是指转化启动站点。红色框表示编码外科。(D) tph-1最小 CRM 扫描突变分析会破坏前 40 bp 的功能。20 bp 的序列窗口变异为政治窗口。+:>80%:+/?: 80%~20% ;?:平均野生类型表达值的<20%。有关原始数据,请参阅S1 无花果。(E) 显示tph-1最小 CRM tph-1prom17和合成构造tph-1prom46 (3X 40 bp 窗口) 的年轻成人图像,这些图像仅用 ADF 神经元表示。比例杆:10 μm。(F) PWM 最重要的丰富主题及其最接近的匹配,对应哺乳动物 RBPJ。(G) 预测CSL结合位点的突变分析。请注意,对于cat-1prom14,除了在图 1C (CGTGAA) 中标识的图案外,还发现了一个与 CSL 共识网站 (TATGGGAA) 匹配的额外主题。选择这种更好的匹配进行突变分析。+、+/?和?范围值与 D 相同。有关点突变描述和原始数据,请参阅S1 无花果AADC,芳香L-氨基酸去碳化酶;CRM,西斯-监管模块;CSL, CBF-1, 苏 (H), 滞后 - 1;GCH,GTP环流:PWM,位置重量矩阵:SERT,血清素运输机;TPH,色氨酸羟基酶;特普,色氨酸;VMAT,血管单胺运输机;5HT,血清素;5HTP,5-羟基普坦。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.g001

在这里,我们演示了LAG-1,一种来自CB-1、S u(H)、L AG-1(CSL)家族的信号调节TF,它通常显示抑制器活动,直到缺口被激活或独立于缺口,是ADF神经元的终端选择器,作为独立于缺口信号的激活器。 通过cis-监管分析,我们确定了所有 5HT 通路基因的 ADF 活性调节序列中的功能 CSL 绑定位点。重要的是,与之前报道的LAG-1的基础抑制作用不同,这些站点需要ADF效应基因激活,但不调解基底抑制。我们发现滞后-1突变体在ADF终端分化中表现出广泛的缺陷。LAG-1 是持续要求后体,以保持正确的ADF效应体基因表达和功能。最后,我们发现,在某些情况下,LAG-1异位表达足以驱动ADF效应基因表达。总之,这些结果将LAG-1定义为ADF终端选择器。出人意料的是,我们发现LAG-1履行了独立于缺口信号的终端选择器的激活作用,从而充当了构成激活器。此外,我们还探索了在ADF中关于tph-1/色氨酸羟基酶基因表达可塑性的LAG-1操作。我们的结果解开了一个复杂的场景,其中不同的环境刺激调节tph-1/色氨酸羟基酶基因表达通过不同的TF和不同的cis-监管区域,和一些,但不是全部,对这些刺激的反应依赖于LAG-1功能。

结果

CSL/LAG-1 结合位点是ADF化学感官神经元血清素通路基因表达所必需的

对神经元类型-特定效应基因的Cis-监管分析有助于识别指导神经元类型分化的转录调节逻辑[11]。因此,我们分离了驱动ADF神经元(1C和S1图)[9]中驱动血清素通路基因转录的最小cis-监管模块CRMs)。接下来,我们专注于最小的CRM,一个99-bp区域位于上游tph-1/色氨酸羟基酶轨迹tph-1prom17):此构造仅在 ADF 神经元 (图1C 和 1E)中驱动gfp表达。我们进行了连续扫描突变,并确定了tph-1prom-17内的 40 bp 区域,该区域是 ADF 神经元表达 ( 1D)所必需的。具有 3 份 40 bp 最小区域tph-1prom46)的合成构造足以在 ADF 神经元 ( 1E)中驱动gfp表达,而放置在未在 ADF 中表示的神经元最小促进器前面的 40 bp 区域的单个副本无法驱动 ADF 表达S1 无花果)。总之,这些数据表明,位于这个40bb小区域的cis-监管信息是必要的,当多聚时,足以推动ADF神经元中的基因表达。

终端选择器直接核化神经元类型-特定效应基因的表达:因此,我们使用6个最小5HT通路基因CRM,包括tph-1轨迹中的40bb小区域,进行了新主题发现分析[12]。 最丰富图案高度类似于 RBPJ 绑定主题 ( 1C 和 1F)。RBPJ,也被称为CBF1,是高度保守的CSL TF家族的脊椎动物成员,在C。电子甘是由独特的成员LAG-1组成。5HT通路基因CRM中CSL图案的中断导致ADF神经元中具有很强的GFP表达缺陷,在突变时没有明显的上位调节或异位GFP表达(1GS1图),这表明LAG-1通过与CSL图案的结合,可以直接激活ADF终端分化。

LAG-1 控制 ADF 神经元终端分化

我们接下来分析了ADF神经元末位分化在滞后-1突变体。LAG-1 是一级信号通路的信号调节 TF,在开发过程中调节细胞-细胞相互作用。滞后-1(q385)等位基因是一个过早停止(2A),显示所有特征滞后1等位基因中最强的表型,包括杀伤力,它被认为是一个空等位基因[13,14]滞后-1(q385)个人在第一个幼虫阶段(L1)孵化后不久被捕,有许多缺陷,反映了在胚胎生成过程中F缺口介质细胞命运规范的失败[14]。对刚孵化的滞后-1(q385)蠕虫的分析显示ADF神经元(2B)5HT通路记者基因表达的戏剧性丧失。有趣的是,2名内生记者分析, tph-1/色氨酸羟基酶(vlc46)mod-5/5HT传输器(vlc47),与其他得分记者相比,显示最大的表达缺陷,作为多拷贝染色体外体或集成简单阵列 [- 221 (猫 - 1gfp),奥蒂斯 225 (猫 - 4::gfp),vlcex2433 (bas - 1gfp)] ( 2b 。这一观察表明,内源性记者可能对滞后1损失更敏感。其他与血清素生物合成没有直接关系的效应基因的表达, srh-142/蛇形受体gpa-13/G+蛋白,在滞后-1(q385)动物(2C)中也减少,这表明LAG-1在ADF神经元末期分化中的作用更广泛,不仅限于血清素代谢,正如终端选择器所期望的那样。重要的是,我们确定ADF神经元仍然以滞后-1(q385)突变体生成,因为82%的滞后-1(q395)动物仍然表现出可检测srh-142/蛇形受体表达,尽管水平较低(2C)。接下来,我们分析了ADF的姊妹细胞AWB神经元的odr-1/瓜尼拉酸环状效应体基因表达,发现滞后-1(q385)突变动物和野生类动物S2无花果)中类似的odr-1/瓜尼拉酸环素表达。总之,这些结果表明,LAG-1功能对于ADF血统(ADF和AWB神经元)终端分支中2个神经元的生成或ADF神经元的生存是可有可无的,但需要纠正ADF神经元末期分化,可能通过直接激活ADF表达效应基因。类似的广泛ADF表达缺陷在热敏性低形态等位基因滞后-1(om13)中发现,尽管表型只有在蠕虫生长在15°C时才能观察到,并且只有在L1(S2)期间才会暂时观察到。此等位基因显示轻微的细菌线和体缺陷,在 20 到 25 °C 时更强,而 15 °C[15]。我们观察到的瞬态表型可能是由于这种低形态等位基因的弱性,在这种等位基因中,ADF神经元的足够LAG-1活性可能在较长时间或较高温度下达到。最后,如下所述,滞后-1 RNAi还特别在ADF中显示广泛的血清素通路基因表达缺陷。

2.LAG-1 TF控制ADF终端分化。

A)滞后-1轨迹,灰色框表示外显子,蓝色框对应于 LAG-1 DNA 绑定域的外显子编码。红条定位相应等位基因的点突变。(B)滞后-1(q385)突变表型的量化显示所有血清素通路基因存在显著的ADF表达缺陷。tph-1(vlc46)mod-5(vlc47)是记者的敲门声。L1 阶段图像显示 ADF 中的tph-1表达缺陷。比例杆:15微米。有关数字值,请参阅S1 数据。(C)滞后-1(q385)突变体显示额外效应基因srh-142 (vlcIs10)gpa-13 (pkIs589) 的表达缺陷。对于gpa-13表达分析,使用微弱srh-142记者表达来识别ADF神经元。显微图显示微弱 srh-142和缺失 gpa-13表达在延迟 - 1 (q385)突变动物的 ADF 中。比例杆:10 μm。有关数字值,请参阅S1 数据TF,转录因子。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.g002

LAG-1表示在后线性ADF神经元中,以诱导和维持ADF神经元的命运

Cis-监管分析和滞后-1突变特征表明,LAG-1充当ADF化疗神经元的终端选择器。可用来自C的单细胞 RNAseq (sc-RNAseq) 表达数据。电子人胚胎[16]揭示了 ADF 血统中的双边滞后 1表达,从后线性 ADF 神经母细胞开始,支持 LAG-1 ( 3A)的终端角色。胚胎滞后-1表达也检测到在3个额外的后层神经母细胞RIB,AIM和RIH的终端分裂。有趣的是,AIM 和 RIH 快速mod-5/5HT 运输机cat-1/血管单胺运输机从细胞外空间重新吸收 5HT。除了ADF规格缺陷外,滞后-1(q385)动物还显示出MOD-5/5HT运输机-1/血管单胺运输机AIM和RIH(S2)中的表达缺陷,这表明LAG-1也可以在这些额外神经元类型的终端分化中发挥作用。

3.LAG-1表示在后线性ADF诱导和维持ADF神经元的命运。

A) ADF血统代表由sc-RNAseq [16]评估的胚胎滞后-1表达式。黑线在大多数情况下不代表与接受程序化细胞死亡的细胞相对应的表达数据。(B) 标记有 mNeonGreen 的滞后 1轨迹,以监控体内的滞后-1表达。红色框表示滞后-1的编码外显子、灰色框T2A序列、绿色框mNeongreen荧光灯、黄色三角 LoxP 站点和蓝色框 3x 标志标记。此轨迹产生单个 mRNA ,在翻译时经历自催化。MNEON绿色表达在ADF中观察到L1,表达在整个动物的生活中保持。比例杆:20 微米和 10μm。ADF 身份通过与tph-1的同地化来评估 dsred。(S2 数据 C)滞后-1 P0 RNAi 显示,在 ADF 中持续需要滞后 1来保持tph-1 (otIs517)cat-1 (otIs221)表达和 5HT 染色,但不包括用于 shr-142 (vlcEx809)记者表达维护。显微图显示,滞后-1 RNAi喂养蠕虫的成人ADF中缺少tph-1表达和5HT染色缺陷,而其他血清素细胞不受影响。有关所有复制的原始数据,请参阅S1 数据。比例杆:12微米。有关数字值,请参阅S1 数据L1,第一幼虫阶段;n.s,无足轻重;sc-RNAseq,单细胞雷纳塞克;5HT,血清素。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.g003

为了评估后离子LAG-1表达,我们用荧光报告器(滞后-1:T2A ::mNeonGreen)(3B)标记了内源滞后-1轨迹。此构造生成一个独特的 mRNA transcript ,在翻译后,经过自催化,产生 2 种独立蛋白质, LAG - 1 和荧光 mNeonGreen 蛋白,确保正确的 LAG - 1 功能( 3B )。L1,mNeon绿色表达在头部的几个神经元中观察到,包括ADF神经元(3B)。ADF神经元的强LAG-1表达在所有幼虫阶段和动物的整个生命(3B)中都保持。在L1和年轻成人阶段观察到类似的强ADF表达的融合蛋白LAG-1::GFP使用雾重组记者株vlcEx496)(S3无花果)。

接下来,在已知的ADF基因监管网络的背景下,我们进一步将滞后-1表达定性为"滞后-1"。在胚胎发育期间,LIM HD TF lim-4ADF/AWB母细胞中表达。lim-4 (yz12)突变动物在 ADF 血统的末期分裂中产生 2 个神经元,但 ADF 神经元未能正确区分[17]。我们的数据表明,ADF神经元S4图)中的LAG-1表达需要LIM-4。

终端选择器通常需要保持神经元的命运[6]。由于LAG-1在ADF神经元中不断表达,我们检查其活性是否也需要ADF细胞命运维持。后脑膜敲击滞后-1喂养滞后-1 RNAi L1 rrf-3(pk1426)动物,RNAi神经元敏感菌株,导致无菌动物,类似于后脑膜林-12glp-1缺口受体RNAi治疗。滞后-1P0 RNAi动物在幼年成年动物中表现出tph-1/色氨酸羟基酶-1/血管单胺运输器、bas-1/芳香氨基酸去碳化酶-4/GTP环状水解剂记者表达在年轻成年动物中的显著损失,以及5HT染色缺陷(3CS4图)。这些缺陷不是由于ADF神经元的神经退化,因为srh-142/蛇形受体记者表达不受影响(3C)。

接下来,我们试图评估滞后-1突变体中的ADF规范缺陷是否可以通过srh-142促进器下的细胞自主LAG-1表达来挽救,后者不影响滞后-1(om13)低形态突变体S4图)。滞后-1基因代码为4种不同的拼接变种S3无花果),我们没有观察到显着tph-1/色氨酸羟基酶表达救援与任何个人同形或4个成绩单S4无花果)的组合。滞后-1(om13)表型仅在L1期间短暂观察到:这个短的时间窗口可能会限制我们检测滞后-1救援的能力;或者,救援可能需要不同级别的具体等形或较早的表达。作为细胞自主救援的替代方案,我们使用ADF特异性促进器srh-142驱动滞后-1双链RNA,在后线性ADF神经元中进行了细胞自动击倒滞后-1。细胞类型–特定滞后-1 RNAi消耗内源性LAG-1,特别是从ADF神经元(4A),这种耗竭足以诱导ADF(4A)内源性tph-1/色氨酸羟基酶的表达缺陷。这些数据支持在 ADF 终端分化中为 LAG-1 发挥单元格自主作用。

4。LAG-1在ADF中自主作用细胞,足以诱导ADF效应体基因表达。

A) ADF 特异性滞后-1击倒表达意义和反感滞后-1srh-142促进器减少内源滞后-1 (vlc30)tph-1 (vlc46)表达仅在 ADF 中,支持 LAG-1 的细胞自主效果。年轻的成人图像显示了滞后-1 RNAi的特殊性。比例杆:10 μm。有关数字值,请参阅S1 数据。(B) 使用热冲击- 诱导记者对 2 种不同滞后 -1等位体的胚胎异位表达。LAG-1D等形形式诱导异位tph-1(zdIs13)记者表达,而LAG-1A等形形式没有效果。对2条独立的转基因线也观察到类似的效果。滞后-1d热震撼胚胎的代表显微图显示tph-1(zdIs13)记者在头部7个细胞中的表情。星号标记异位GFP表达细胞。比例杆:10 μm。有关数字值,请参阅S1 数据n.s,不重要。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.g004

最后,我们评估了LAG-1是否不仅必要,而且足以诱发ADF的命运。在神经生成阶段,我们使用热冲击+诱导促进剂在胚胎中广泛表达LAG-1。LAG-1等形D,但不是LAG-1等形A,足以驱动异位tph-1记者表达(4B),表明LAG-1在某些情况下足以诱导ADF基因表达和解开LAG-1的同形异形特定功能。两种等形体共享CSL DNA结合域和诺奇相互作用域,位于蛋白质的卡盒末梢区域,但在具有未知功能的氨基终端区域不同。

总之,我们的数据强烈表明,LAG-1作为终端选择器,直接诱导和维持ADF效应基因的表达。

依赖于 ADF 神经元的生理过程需要后体质 LAG-1 功能

ADF化疗神经元的5HT释放会调解各种过程和行为。因此,我们接下来探讨是否需要后仿生滞后-1函数来正确显示ADF调节的行为。为了规避滞后-1(q385)空突变体的幼虫杀伤力,我们利用了RNAi在rrf-3(pk1426)敏感菌株中对滞后-1的后脑膜敲击。

ADF与喂养良好的动物的咽部抽水有牵连[18];然而,这个角色并不清楚,因为其他报告涉及NSM释放的5HT,而不是ADF作为咽泵的主要调节器[19]。我们发现滞后-1 RNAi喂养的rrf-3(pk1426)蠕虫与L4440 RNAi喂养的动物(5A)相比,在泵送率方面没有差别,这表明LAG-1功能不需要,至少在这些条件下,来调节咽部泵送。

· 原始图像

5.ADF 介停的过程需要后晶级 LAG-1 功能。

A)滞后-1 P0 RNAi喂养的蠕虫在咽泵率方面没有缺陷。n ≥ 10。表示均值和SEM。有关所有复制的原始数据,请参阅S1 数据。有关数字值,请参阅S1 数据。(B)滞后-1 P0 RNAi 喂养的蠕虫显示,与控制 RNAi 相比,信息素诱导的 dauer 显著增加。n=控制中的148蠕虫和滞后-1 RNAi中的n=474。 百分比和 SEP 表示。有关所有复制的原始数据,请参阅S1 数据。有关数字值,请参阅S1 数据。(C)滞后-1 P0 RNAi 喂养的蠕虫含有明显较高的油红色染色的脂质水平。有关所有复制的原始数据,请参阅S1 数据;n每个复制≥ 15。比例栏:表示 13 μm 均值和 SEM。有关数字值,请参阅S1 数据。(D) 在短的饥饿期后,当接近一块食物时,在落后的1 P0 RNAi和控制动物时,对蠕虫的速度进行量化。曲线表示每个条件的平均值。n =19蠕虫在控制中:n=滞后-1 RNAi中的17个蠕虫。有关数字值,请参阅S1 数据。(E) 在食物接触前 15 秒的平均减速率显示滞后1 RNAi 和对照动物之间存在显著差异。 n=L4440中的19个蠕虫;n=滞后-1 RNAi中的17个蠕虫。双尾t测试。表示均值和SEM。有关数字值,请参阅S1 数据。(F) 控制蠕虫中的钙成像定量表明 ADF 由 Cu 激活+2并逐步适应刺激。曲线表示分析蠕虫的平均值。n记录了15种动物≥。有关数字值,请参阅S1 数据。(G) ADF未由Cu激活+2在滞后-1 P0 RNAi喂养的动物。曲线表示分析蠕虫的平均值。n记录了15种动物≥。有关数字值,请参阅S1 数据n.s,不重要。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.g005

ADF,连同ASI和ASG化学感官神经元,需要防止道尔进入[20],因此tph-1/色氨酸氢酶突变动物显示增强的道尔进入[21,22]。我们发现,与控制(5B)相比,P0滞后-1 RNAi喂养蠕虫中信息素治疗时,较戴尔动物的百分比显著增加,这表明需要LAG-1来防止道尔进入。值得注意的是,滞后-1(om13)低形态等位基因在L1之后没有明显的ADF规范缺陷,以前曾被用来显示滞后-1在道尔维护和道尔出口中的作用,这个过程是通过表达IL2神经元中的Noch配体滞后-2来调解的,但ADF神经元在这个过程中的作用尚未报告[23]。

ADF神经元的5HT释放也促进脂肪动员[24];因此,我们发现滞后-1 RNAi诱导脂质储存显著增加(5C),一种现象型也观察到在tph-1/色氨酸氢酶突变体[24]。此外,ADF功能还涉及觅食:在食物匮乏期后,当蠕虫接近食物来源时,它们的速度会降低[25]。这种行为由NSM和ADF神经元的5HT释放[26]进行调解。我们发现,RNAi 对滞后-1的后脑膜敲击不会影响玄武岩运动,但滞后-1 RNAi 喂养的动物在接触前在食物检测时不会减速( 5D 和 5E)。由于滞后-1 RNAi和滞后-1(q385)突变体均未显示NSM血清素规范缺陷,我们的结果表明,ADF中的后离子LAG-1功能对于正确的觅食行为是必需的。

最后,我们通过钙成像直接测试了滞后-1 RNAi喂养蠕虫中的ADF激活。不出所料,ADF L4440喂养的控制RNAI动物对库的短暂暴露做出反应+2解决方案[27]无花果 5F)。与此形成鲜明对比的是,同样的刺激未能激活用滞后-1 RNAi(5G)喂养的蠕虫中的ADF神经元。因此,LAG-1 函数要求在死后允许铜检测或针对此刺激获得正确的激活。

总之,我们的生理和行为检测表明,脑后LAG-1功能不仅需要5HT通路基因表达,还需要正确的ADF激活和ADF介导过程的正确性能。

ADF神经元的LAG-1激活功能是无缺口的独立功能

LAG-1 是植物学上保存的 Notch 细胞间信号通路[13]的信号调节转录介介器。因此,我们接下来旨在探索缺口通路其他组件的耗竭是否产生类似的 ADF 规范缺陷。C. elegans基因组代码为2个缺口受体GLP-1和LIN-12,它们在激活后被蛋白裂开,允许细胞内域转移到细胞核(6A)。在细胞核中,缺口细胞内域 NICD) 与 LAG-1 和协活器 SEL-8 形成复合体,将 LAG-1 的基底抑制器活动转移到目标基因的转录激活[28]。先前报道的滞后-1的表型被glp-1、lin-12sel-8突变体模仿[14,29]。因此rrf-3(pk1426)L1幼虫与glp-1,lin-12,sel-8 RNAi喂养发展成年轻人,是无菌或产生死胚胎,类似于滞后1 RNAi喂养的动物。 然而,与滞后-1 RNAi相比,这些动物没有表现出tph-1/色氨酸羟基酶-1/血管单胺运输机记者表达(6B和6C)的缺陷。接下来,我们分析了ADF的命运在-12(n941)glp-1(q46)双突变体和塞尔-8(ok387)单突变体,这应该废除所有酶缺口通路活性。类似于滞后-1(q385)空同源动物,这些动物死在L1:然而,与滞后-1突变体相反,L1幼虫在ADF神经元(6B和6C)中表现出正常的tph-1/色氨酸羟基酶记者表情。

6。ADF 规范不需要glp-1lin-12缺口受体和sel-8导体。

A) C中缺口信号通路的示意图表示。埃利根斯。(B) Glp-1lin-12缺口受体的 P0 RNAi 和双突变分析以及glp-1的温度敏感等位基因分析显示,ADF 神经元中的tph-1 (otIs517)cat-1 (otIs221)记者表达没有显著差异。L1 阶段共焦图像,显示温度移位测定具有代表性的示例。比例杆:15微米。请参阅S1 数据,了解所有复制品的数字值和 YA 阶段的温度敏感等位基因分。(C) P0 RNAi 和对sel-8共生剂的突变分析显示,ADF 神经元中的tph-1 (otIs517)cat-1 (otIs221)记者表达没有差异。L1 阶段对焦图像,显示具有代表性的示例。有关数字值,请参阅S1 数据L1,第一幼虫阶段;NICD,细胞内缺口域;n.s,无足轻重;是的,年轻的成年人

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.g006

glp-1是早期胚胎发育所需的母体[30]。为了绕过这一要求,并测试产妇提供glp-1-12(n941)glp-1(q46)双突变体可能有助于ADF终端分化的可能性,我们使用了glp-1的温度敏感等位基因。glp-1 (e2144)受精卵的母亲,其中含有胚胎,已经通过母体glp-1需要的阶段,被放置在限制温度下,并允许产卵。卵子生长在限制温度下,因为大约30细胞阶段,这相当于ADF出生前的4个部门。正如glp-1耗尽所预期的那样,这些动物是无菌的:然而,它们不显示tph-1/色氨酸羟基酶记者表达缺陷在ADF神经元在L1或作为年轻的成年人(6B)。最后,我们无法使用内源性敲击和基于雾气的荧光记者S5 图)检测 L1 或年轻成人的LIN-1glp-1 ADF 表达。同样,可用的胚胎或L2 sc-RNAseq数据不会显示ADF或ADF母细胞中的塞尔-8、glp-1lin-12表达式[16,31](S5)。总之,这些数据有力地表明,LAG-1作为ADF效应基因的激活器的功能独立于规范的缺口通路。

以前曾报告过 CSL TF 的无要独立激活功能。在哺乳动物中,Rbpj/CSL通过与 bHLH TF Ptf1a[32 , 33]的相互作用,指定小鼠胰腺细胞、小脑和脊髓 GABAergic 神经元。这些数据促使我们探讨LAG-1与HLH-13,C一起作用的可能性。 在ADF神经元的规范中,Ptf1a的电子人矫形器。然而hlh-13(tm2279)突变体在ADF神经元S6图)中显示正常的5HT通路基因表达。在哺乳动物中,Rbpj、Ptf1a和E蛋白形成一种三元复合物,将由Ebox和CSL站点[33,34]组成的DNA图案结合在一起。因此,我们推断,如果LAG-1与其他未知的TF有类似的相互作用,ADF效应基因的调控区域可能存在一个复合站点"CSL?未知DNA图案"。因此,我们执行序列对齐与所有实验确定的功能CSL绑定位点+/?30 bp的侧翼序列在C。伊莱甘斯和其他卡诺哈布迪蒂斯物种。我们从19个不同的物种S6图)中检索了66个保存的CSL结合点。所有这些序列的对齐不会显示CSL站点S6图)侧翼的任何附加主题,这可能是由于附加主题的位置和/或方向的灵活性。因此,我们使用这组 66 个序列进行了无主题分析,除了 CSL 绑定站点之外,还检索了 2 个与 bHLH TF 绑定主题S6 图 具有某种相似性的图案。C. elegans基因组代码为 41 bHLH TFs 除了hlh-13之外,其他 bHLH TF 有可能与 LAG-1 合作,诱导 ADF 的命运。应进一步研究,以确定这一因素。

LAG-1 调节 ADF tph-1/色氨酸羟基酶表达可塑性,可塑性,可感染病原体和胆汁缺陷

ADF是一种塑料感官神经元,为了应对几次侮辱,它对tph-1/色氨酸羟基酶5HT生物合成的限速酶)的表达进行了向上调节,增加了5HT信号。因此,我们测试了LAG-1在Tph-1/色氨酸羟基酶表达可塑性中的作用。

与先前基于tph-1/色氨酸氢酶转基因记者株的报告一致[223536] 我们发现,道尔进入,热应激,和unc-43/CAMKII功能增益突变(神经元活动和突触可塑性的调解器)诱导内源性tph-1/色氨酸羟基酶轨迹vlc46)(7A,7C和7D)的表达。在滞后-1 RNAi喂养的蠕虫的较量动物中观察到类似的表达增加,在热冲击滞后-1(om13)unc-43(n498gof):滞后-1(om13)双突变动物(7B+7D),表明tph-1/色氨酸羟基酶表达可塑性在这些条件下是独立于LAG-1功能。

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7.LAG-1通过特定刺激调解tph-1表达诱导。

A) ADF mNeon绿色强度量化tph-1(vlc46)内源性记者在道尔阶段显示与L4相比显著增加。n>60个神经元。中位数和IQR表示。有关数字值,请参阅S1 数据。(B) 道尔动物显示 ADF yzIs71 (tph-1gfp)记者表达在滞后 1 RNAi 和控制动物, 表明 LAG-1 不调解tph-1感应在道尔.中位数和IQR表示。有关数字值,请参阅S1 数据。(C) L1 ADF mNeon 绿色强度在热冲击时对tph-1 (vlc46)进行量化。热冲击在野生型和滞后-1(om13)突变蠕虫中诱导tph-1表达,表明热反应中不需要滞后-1。中位数和IQR表示。有关数字值,请参阅S1 数据。(D) L1 ADF mNeon绿色强度定量的tph-1(vlc46)内源性记者在unc-43(n498)/CAMKII获得功能突变。unc-43 (n498gof)在野生型和滞后-1(om-13)突变体中诱导tph-1表达,表明不需要滞后 1来调解对神经元激活的反应。中位数和IQR表示。有关数字值,请参阅S1 数据。(E) L1 ADF mNeon 绿色强度定量tph-1 (vlc46)内源性记者在dyf-1 (yz66)突变体中显示 tph-1表达水平增加,在dyf-1 (yz66) 中未观察到; 滞后 -1 (om13)双突变体, 建议滞后-1调解tph-1表达对西莉亚损伤的反应。中位数和IQR表示。有关数字值,请参阅S1 数据。(F) 在额外的充气内运输蛋白突变体che-11(e1810)中观察到tph-1(vlc46)内源性记者诱导的类似滞后-1依赖性。中位数和IQR表示。有关数字值,请参阅S1 数据。(G) 年轻的成人ADF mNeon绿色强度定量tph-1(vlc46)内源性记者在tir-1(yz68gof)功能增益突变,模仿对致病菌的反应。中位数和IQR表示。有关数字值,请参阅S1 数据。(H) tir-1 (yz68gof) 诱导yzIs71 (tph-1gfp)记者在用滞后 1 RNAi 治疗的动物中未观察到,这表明滞后-1调解tph-1表达对致病细菌的反应。中位数和IQR表示。有关数字值,请参阅S1 数据。智商,四分五十范围:n.s.,无足轻重;是的,年轻的成年人

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.g007

tph-1/色氨酸羟基酶转录记者表达也诱导在有西利亚形态缺陷的动物[22]。根据这些数据,我们发现内源性tph-1/色氨酸羟基酶表达vlc46)是在有西利亚缺陷的突变体中诱导的dyf-1(yz66)che-11(e1810)(7E和7F)。重要的是,当LAG-1函数与滞后-1(om13)等位基因(7E和7F)受损时,不会观察到这种诱导,这表明,与道尔状态、热应力或CAMKII过度激活相比,LAG-1调解了由西莉亚形态缺陷引起的tph-1表达可塑性。

最后,我们分析了tph-1/色氨酸羟基酶诱导致病性感染。致病菌伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨诱导tph-1/色氨酸羟基酶ADF神经元中的表达:转录的这种增加是由收费和插话1受体(TIR-1)[37-39]调解。与先前与转录记者37-39)的报道一致,我们发现功能增益等位基因tir-1 (yz68)显示内源性tph-1/色氨酸氢酶轨迹vlc46 无花果 7G)的表达增加。我们未能产生可行的tir - 1 (yz68); 滞后 - 1 (om13)双突变体;因此,我们在tir-1(yz68);rrf-3(pk1416)动物中执行了滞后-1 RNAi。滞后-1RNAi废除tph-1/色氨酸羟基酶记者感应(7H),这表明,类似于西莉亚形态缺陷,LAG-1是必要的调解ADF塑料反应致病细菌。与其作为终端选择器的角色类似tph-1/色氨酸羟基酶表达可塑性的LAG-1功能也是独立的,因为tph-1/色氨酸羟基酶感应S7图)既不是glp-1也不是-12所必需的。

DAF-19,C中唯一的RFX TF。 电子人,是需要发展tph-1/色氨酸羟基酶表达,以及调解tph-1/色氨酸羟基酶转录增加后,不同的侮辱,包括细菌感染或西莉亚形态缺陷。然而,DAF-19不调节其他ADF 5HT效应基因的表达[38]。DAF-19被建议通过尚未确定的因素[38]间接地对tph-1表达采取行动。我们发现daf-19(m86)突变体中的ADF LAG-1表示与控制S8图)相比没有差异,表明滞后-1转录不是DAF-19的下游。

不同的cis- 监管元素调解tph-1/色氨酸羟基酶表达可塑性到外部刺激

塑料基因表达反应如何在cis- 监管级别集成的机械细节仍然非常稀少。因此,我们接下来分析,如果tph-1/色氨酸羟基酶表达调制是通过包含功能性LAG-1/CSL绑定位点(8A)的发育最小CRM(tph-1p17)进行调解。有趣的是,如下所述,我们的结果表明,各种复杂的cis-监管机制用于整合对不同刺激的反应。

的反应。

A) 分析记者结构的示意图表示。(B)c-43(n498gof)突变不会激活幼年成年动物tph-1prom17,ADF最小CRM。中位数和IQR表示。有关数字值,请参阅S1 数据。(C) tir-1 (yz68gof)突变不会激活年轻成年动物的tph-1prom17。中位数和IQR表示。有关数字值,请参阅S1 数据。(D) 道尔阶段诱导转录tph-1prom17,但不是tph-1prom46 3XCSL 合成增强剂。CSL 结合位点tph-1prom42)的突变在正常条件下完全废除了 GFP 表达,并排除了其在 dauer 中的诱导。中位数和IQR表示。有关数字值,请参阅S1 数据。(E) 热冲击诱导 L1 蠕虫中 ADF 最小 CRM tph-1prom17的转录。tph-1prom46 3XCSL 合成增强剂在热冲击应激下不会激活。CSL 结合位点的突变在正常条件下完全废除了 GFP 表达,并排除了在热冲击时感应。中位数和IQR表示。有关数字值,请参阅S1 数据。(F) dyf-1 (yz66)突变诱导年轻成年动物的 ADF 最小 CRM tph-1prom17tph-1prom46 3XCSL 合成增强剂的转录。CSL 结合位点的突变在正常条件下完全废除了 GFP 表达,并排除了dyf-1 (yz66)突变体的诱导。中位数和IQR表示。有关数字值,请参阅S1 数据。(G) tph-1/色氨酸羟基酶表达可塑性背后的信号机制摘要。CRM,西斯-监管模块;CSL, CBF-1, 苏 (H), 滞后 - 1;智商,四分五十范围:n.s,不重要。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.g008

unc-43/CAMKII功能增益突变,诱导内源性tph-1/色氨酸羟基酶独立于LAG-1(7D),不会通过tph-1prom17(8B)诱导激活,这表明这种发育CRM之外的顺向调节元素调解了塑料基因表达对神经元活动的反应。出人意料的是tir-1 (yz68)功能增益等位基因,这需要LAG-1的内源性tph-1/色氨酸羟基酶感应(7H),不激活tph-1prom17(8C),这表明对致病菌的反应也整合在发育最小CRM之外。另一个CSL结合点位于tph-1/色氨酸羟基酶的相互区域,该区域位于tph-1prom17 CRM(S8无花果)之外。与tph-1prom17 CSL 绑定站点的绝对要求相反,该站点在包含两个 CSL 站点的较长tph-1 CRMtph-1prom2)的背景下发生突变,仅产生 GFP 表达的部分损失S8 无花果)。只有当两个 CSL 站点都发生变异时,GFP 表达才会完全取消,这会破坏此附加 CSL 站点S8 图)的功能。与缺乏tph-1prom17激活相比tph-1prom2表达在tir-1 (yz68)功能增益动物中诱导。tr-1(yz68)当两个CSL站点发生变异时S8图)将完全取消tph-1prom2的诱导。因此,LAG-1通过两个CSL结合点在病原菌存在的情况下调解tph-1基因诱导。

相比之下,道尔状态、热应力和西莉亚形态缺陷通过激活tph-1prom17最小 CRM(无花果 8D+8F)来增强tph-1 /色氨酸羟基酶表达。正如我们先前确定的,热应激和多尔阶段诱导内源性tph-1/色氨酸羟基酶独立于LAG-1(7A+7C)作用,我们假设,对这些刺激的反应可以通过额外的非CSL结合站点整合。根据这一假设,我们发现热应激和道尔状态均未增加tph-1prom46转录,合成报告器由 ADF 中特别表达的 3 个 CSL 绑定图案组成,表明这些刺激作用于tph-1prom17最小 CRM(图 8D)中存在的其他 TF 绑定点8E)。有趣的是,最小CRM(tph-1prom42)中的CSL突变不仅在基底条件下废除转录,而且还防止在热应激或 dauers(8D)时增强表达和 8E),表明在 CRM 中可能需要基本的活动水平,以便允许塑料反应在动物生命后期集成外部刺激,即使它们独立于 LAG-1 进行调解。

最后,我们发现dyf-1(yz66)西莉亚形态突变体, 它以LAG-1+依赖方式诱导内源性tph-1/色氨酸羟基酶转录(7G),不仅激活tph-1prom17最小CRM,而且还增强3XCSL合成构造(8F)的转录,表明来自此刺激的信息通过发育激活的CSL结合站点整合。dyf-1 (yz66)突变体未能诱导转录tph-1最小 CRM,除非 CSL 结合位点tph-1prom42) 8F)发生突变,进一步支持 LAG-1 调解这些刺激的直接作用。

总之,我们发现,除了作为ADF终端选择器的发展作用外,LAG-1还积极参与ADF基因表达可塑性的调节。我们的研究结果揭示了一个复杂的场景,结合了LAG-1依赖和独立的基因表达反应。LAG-1– 通过发育最小 CRM 调节某些外部刺激(热应激和 dauer)的独立集成,而其他刺激(神经活性)则在此最小调节区域( 8G)之外起作用。看来,LAG-1–中介的反应也针对刺激。虽然西利亚缺陷通过发育增强剂中的CSL站点起作用,但有关致病菌的信息通过2个CSL结合站点集成,其中一个位于最小的发育增强剂(8G)之外。

讨论

在这项工作中,我们描述了CSL TF家族在C的神经元终端分化中的作用。埃利根斯。我们发现,LAG-1,一个信号调节的TF调停器的缺口信号,诱导和维持ADF血清素神经元的终端分化程序。结果表明, LAG - 1 在 ADF 基因表达和功能中发挥的持久激活作用是独立于缺性的。LAG-1 作为独立于 Notch 信号的激活器的角色与之前关于 LAG-1 函数的报告形成鲜明对比。

对核心监管要素的分析允许识别新颖的终端选择器

终端选择器核化多个效应基因的转录:因此,其目标基因的监管区域共享相应的监管特征。我们研究了活跃在 ADF 中的 5HT 通路基因的 CRM,并确定了功能性 CSL 结合位点的共同存在,从而意外地将 LAG-1 识别为 ADF 神经元命运的终端选择器。

先前确定的终端选择器大多从前方基因筛选中分离出来。然而,滞后-1的空表型是幼虫或胚胎致命[14],我们发现滞后-1(om13),一种部分致命的低形态等位基因,在成年动物中不显示ADF表型。这些事实可能解释了为什么滞后-1等位基因以前没有从ADF规范缺陷的前方基因筛选中分离出[22,35,38,40,41]。还使用类似的cis-监管方法[11]识别了具有致命表型的其他终端选择器,这突出了前瞻遗传学和cis-监管分析的互补性。我们的结果不仅扩展了C的数量。电子元类型与指定的终端选择器,但更重要的是扩大不同TF系列的数量,作为终端选择器。

LAG-1 终端选择器操作独立于缺口信号

C. elegans LAG-1 已被证明在没有缺口信号的情况下充当基底抑制剂[42,43]。在这里,我们将LAG-1的无缺口功能描述为激活器。最有可能的是,ADF神经元的这些无缺口的LAG-1激活功能与未知组织特定的同因子协同调停,如下所述。

此外,我们发现,LAG-1 缺口独立激活功能不断需要保持 ADF 中的正确基因表达。LAG-1的后脑部去除不仅影响记者的表达和5HT染色,还会导致ADF介导生理过程的广泛功能缺陷,暴露出LAG-1在ADF基因表达和功能中的广泛作用。最后,在某些情况下,LAG-1也足以驱动ADF效应体基因表达。总之,LAG-1显示了终端选择器的所有已知属性:细胞命运感应、对效应基因的直接作用以及细胞命运维持[8]。除了激活终端选择器的角色外,在某些情况下,这些 TFs 还被证明充当替代细胞命运的抑制器[44-46];虽然我们的工作没有深入探讨LAG-1的这种可能性,但滞后-1突变体并没有对ADF神经元odr-1ADF姐妹细胞AWB的效应基因)中的odr-1记者的表达进行向上调节,这表明滞后-1的作用主要是激活基因表达,而不是抑制替代命运。

LAG-1 调节 ADF 塑料基因表达对特定外部刺激的反应

在某些细胞类型中,在发育过程中实现稳健稳定的细胞身份必须与确保对特定外部刺激做出自适应反应的其他机制相结合。基因表达的坚固性和可塑性如何整合在细胞中目前还没有得到很好的了解。终端选择器与其他转录激活器和抑制器协同工作,参与在 Dauer 进入[47]时发生的开/关基因开关或获取性变形基因表达[48]。除了这些开/关开关外,一些基因可塑性反应还需要对基因表达进行细微的调节。在这里,我们发现了终端选择器在调整基因表达以响应外部刺激方面的作用。

以前在C中的工作。elegans识别出多种刺激,这些刺激会增加tph-1/色氨酸羟基酶转录水平。这些刺激通过不同的平行途径工作:然而tph-1/色氨酸羟基酶表达可塑性的直接抄本调解人没有描述[22,35,36,38]。在这里,我们发现,对特定刺激(西莉亚形态缺陷和致病菌)的转录反应,而不是对其他人(dauer,热应激和神经元活动),需要LAG-1功能。这种特异性很重要,因为它揭示了一个复杂的场景,即终端选择器功能并不总是必要的来调节基因表达,额外的TF可以专门用于调解基因表达的可塑性。

物理上保护 CSL TFs 在神经元终端分化中的无缺口角色

以前曾报道过在 Drosophila 机械感官套接细胞命运维护[49]中的 Su (H) 和小鼠胰腺细胞规范中的 Rbpj 以及小脑和脊髓 GABAergic 神经元的Rrbpj的无缺口独立激活功能。Su (H) 在德罗索菲拉充当激活器的机制尚不得而知,但在哺乳动物中,Rbpj 通过其 NICD 与 bHLH TF Ptf1a 的交互域进行交互。我们发现hlh-13,C.Ptf1a 的电子正词正词, 不需要在 Adf 中正确tph - 1 / 色氨酸羟基酶记者表达。然而,哺乳动物细胞中描述的正式逻辑可能仍然在C中运作。埃莱甘斯ADF:即,额外的非特异性TF可能与LAG-1一起作用,以调解其在ADF神经元中具有的独立激活作用。因此,CSL TFs 在激活神经元末端分化方面表现出植物学上保存不动的"缺口"作用。我们还发现,LAG-1是神经元细胞命运维持的连续要求。有趣的是,尽管尚未研究 Rbpj 的后生作用,但成人脊髓中的一些神经元群保持 Rbpj 表达[50],这表明,与 LAG-1 类似,哺乳动物 RBPJ 可能会在细胞命运维持或神经元可塑性方面表现出额外的非缺口角色。-厦门论文发表

材料和方法

C.埃莱甘斯菌株保持如描述的那样[51]。野生类动物是布里斯托尔菌株N2。本研究中使用的菌株列在S2 数据中。删除等位基因由 PCR 和点突变通过测序进行基因化。引号包含在S3 数据中。

C的生成 电子根转基因线

cis-监管分析的基因构造是通过克隆到pPD95.75向量而生成的。合成构造tph-1prom46 (GenScript) 和tph-1prom45构造是通过对磷酸化引金进行退化并克隆成 pPD95.75 生成的。引物列在S3 数据中(还包括这些发起人的整个序列)。MEME 套件工具[12] TOMTOM[52]用于主题丰富分析。RTGGGAA[13] YGTGGGAA[53]LAG-1 共识站点用于识别其他站点。现场指导的突变是由快速改变II XL现场指导的突变套件(斯特拉塔赫内)执行。外位滞后-1表达式、ADF滞后-1救援实验、微投影和CRISPR/Cas9介质应变生成详细信息包含在S4数据中。所有引金都列在S3 数据中。

RNAi喂养实验和细胞类型–特定RNAi

RNAi喂养实验是按照标准协议进行的[54];有关详细信息,请参阅S4 数据PCR 融合srh-142促进器以感知或反感滞后-1 cDNA 序列被注入细胞特异性滞后-1 RNAi 实验,如前所述[55],100 ng/μl 每个感官或反感 PCR 与ttx-3*mcherry (25 ng/μl) 和rol-6 (su1006) (25 ng/μl) 投币标记。引号列在S3 数据中。

5HT 染色

C.使用管固定协议[56]进行5HT抗体染色:S4数据中描述了确切的协议。

行为和生理分析

Dauer 感应使用过滤液体培养的蠕虫生长在 7 蠕虫/μl 4 天。简言之,在60毫米的IPTG RNAi种子板中添加了300微克的信息素,其中含有提取物或控制提取物(仅培养介质)。干燥后,在一滴碱性次氯酸盐溶液中加入草本蠕虫,维持在27°C。 72小时后(P0)在每个条件下得分。对于tph-1记者在 dauer 的量化,荧光记者的强度水平在 ADF 神经元n > 60 神经元) 中进行量化。对于噬菌体泵送率,使用 ZEISS Axio Zoom.V16 显微镜记录了至少12种以滞后 1 RNAi (P0) 或控制细菌为食的年轻成人蠕虫的定量。咽泵率的测量是通过计算咽泡在10秒内的收缩。为了量化脂质积累,油红色O染色是按照先前报告的[57]进行的,S4数据中包括了轻微的修改。对增强的减速反应的分析按描述[25]执行。用滞后-1 RNAi(P0)或L4440控制细菌喂养的年轻成年蠕虫用M9 1X缓冲器清洗5次,并自由爬行(2小时)转移到非种子IPTG板, 其阿加周边被划定了4M果糖(D-果糖(默克米利波雷),1%红色刚果染料/ddH2O)环,以避免蠕虫成为替罪羊。禁食后,动物被回收用M9 1X介质清洗盘子。为了分析接近食物来源的蠕虫的运动,蠕虫被放置在IPTG板中,这些板中含有25微升的5倍浓缩细菌。动物被记录在室温(22°C),用多虫跟踪装置。每RNAi克隆记录了四组8至15种蠕虫,每个病种大约50种蠕虫。RNAi 空矢量 L4440 被认为是对照组。记录和分析详细信息包含在S4 数据中。对于钙成像记录敏感的RNAi菌株rrf-3(pk1426),携带基因工程蛋白,GCaMP3,只表达在ADF的动物使用[58]。用孵化(P0)用RNAi喂养的年轻成年动物用M9 1X清洗,用1m四甲酸四氟化物(西格玛)治疗30分钟,使它们的运动瘫痪。蠕虫被转移到一个甲基丙烯酸微流体室(美国马萨诸塞州伍斯特理工学院的自定义),并定居在一个倒荧光显微镜(Axio VertA.1,蔡司)连接到液体流动系统。M13 缓冲器(30 mM 三重奏、100 mM NaCl 和 10 mM KCl)用作基础解决方案,并准备在 M13 缓冲区中添加 CuSO4 (10 mM)并调整为 pH 4。两个缓冲器都含有四米索 (1 mM),以避免蠕虫移动。图像是用CCD相机拍摄的(Prosilica GC2450,德国斯塔德特罗达联合视觉技术公司),20倍目标为每秒2帧,微型管理器软件[59]。分析的更多细节包含在S4 数据中。

温度移位实验

glp-1 (e2144) 25 °C 的限制温度下,将草本草本放在预热板上。 母亲在6小时后被移除,L1和年轻的成年蠕虫被评分。

热休克治疗

20 °C 孵育蠕虫的板被转移到 37.5 °C 90 分钟,并返回到 20 °C 6 小时。滞后-1(om13)蠕虫在15°C前和热后休克治疗中孵育。荧光记者的表情在L1幼虫阶段的ADF神经元中量化。S4数据中解释了异位滞后-1表达和5HT命运感应的胚胎热冲击。

评分

得分是在蔡司轴星2显微镜中使用40X或63X目标进行的。使用TCS-SP8莱卡显微系统共聚焦显微镜使用63X目标获得数字显微图。评分值和条件详见S1数据

对于cis分析和 RNAi 筛查实验,分析了每行或每 RNAi 克隆和复制的至少 30 只年轻成年动物:突变体分析,50个人得分(100神经元)。通过在荧光显微镜下直接观察,定性地确定了"不晕"或"关闭":缺乏可检测的GFP信号被认为是关闭的,如果GFP表达明显弱于野生类型但仍可检测,则包括"FAINT"类别。

对于现场定向突变,野生类型线的平均表达值被视为参考值。当 GFP 表达是相应野生类型构造平均表达的 100% 至 80% 时,突变构造被视为显示正常表达("+"表型)。与野生类型参考值相比,80% 到 20% 的减少被视为部分表型"+/?"。在不到20%的动物中检测到的GFP表达被认为是表达丧失("?"表型)。

Cis-监管和突变分析在25°C进行,而RNAI实验和强度水平分析在20°C进行,除非S1数据中显示其他温度。

为了量化强度水平,分析了至少30个蠕虫(60个神经元)的测量结果。通过在蔡司 Axioplan 2 显微镜中为每位记者在固定曝光时间拍摄单个 ADF 神经元的图像来评估强度水平(有关曝光时间,请参阅S1 数据)。每个ADF神经元的外部轮廓被划定,整个神经元内的荧光强度使用EmalJ软件进行量化,并按神经元的区域进行标准化。每个实验的所有遗传背景或条件都是在同一天完成的。年轻的成年动物得分,除非其他阶段被指示。

统计学

突变体和 RNAi 分析数据被明确分类为"开"或"关",并且使用双尾费舍尔精确测试检查了关联的重要性:"淡"表型被包括为统计的"上"。对于荧光记者的强度水平,由于样品没有遵循正常分布,使用非参数曼-惠特尼测试与邦费罗尼校正进行多次比较。对于减速率,确认了数据的正常性,并使用双尾t测试比较了数据集。对于钙成像分析,荧光强度相对于初始强度 F0、ΔF = (F ? F0) / F0 × 100% 的变化百分比被绘制为时间函数。使用以下统计命名:n.s,无足轻重:*p<0.05;**p<0.01;p < 0.001。

支持信息

CSL/LAG-1 结合位点突变分析ADF血清素通路基因CRM的主要数据。

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柔软

恩塔尔

y F

伊古尔

e 1

+

tph-1普罗姆17::gfp (-283/-184)

tph-1普罗姆42::gfp

CSL穆特

-

+

巴斯-1普罗姆7::gfp (-166/-4)

+

-1普罗姆14::gfp (-1088/-566)

-1普罗姆80::gfp

+

-

CSL穆特

+/-

CSL穆特

+

-1普罗姆37::gfp (-180/+5)

-1普罗姆77::gfp

CSL穆特

模组-5prom8::gfp (+1490/ +2133)

模组-5prom10::gfp

+/-

CSL

巴斯 - 1 普罗姆 90:: gfp

CSL穆特

-

巴斯-1普罗姆74::gfp

+/-

CSL穆特

GFP

GFP

GFP

GFP

GFP

GFP

GFP

GFP

GFP

GFP

GFP

B 德

第四

埃西翁

+

-4普罗姆6::gfp (-629/-3)

-4普罗姆69::gfp

-

CSL穆特

-4普罗姆73::gfp

CSL穆特

-

GFP

GFP

GFP

塔特克特·卡奇·盖奇

塔特克

塔克加奇

阿加塔克卡

阿加特塔克

塔克格卡

卡塔格加特

卡塔特加加特

% e

xpr

埃西翁

每行

特卡特克格

加特

特卡特加特

克特卡特卡加加

克茨加卡加

82

77

72

95

0

88

27

5

97

78

20

90

48

98

37

87

43

93

0

87

3

12

97

67

0

80

20

95

12

82

37

90

0

85

2

88

58

80

0

92

10

82

35

塔塔格特卡塔塔

塔塔格塔塔

塔加特克·卡奇克特克

塔加特

TT格茨克

加塔特卡卡卡特

加塔特克

塔克卡特

tph-1

-4

巴斯-1

-1

模组-5

其他

第四

埃西翁

国家智能市场、新南、安定、目标、

美味牛肝菌

s, 阿德

PDE

% e

xpr

埃西翁

每行

95

0

93

0

90

0

其他

第四

埃西翁

+

tph-1舞会17(99bp)

T T T T T T T

T T T T T T T

T T T T T T T

T T T T T T T

T T T T T T T

-

-

+

+/-

+

突变扫描#1

突变

扫描#2

突变

扫描#3

突变

扫描#4

突变

扫描#5

GFP

GFP

GFP

GFP

GFP

GFP

B 德

第四

埃西翁

格格特卡

泰特·阿特克茨卡奇格

加亚克

卡特加卡

T

3倍

+

GFP

3

83

2

88

52

93

43

92

37

83

88

93

C

国家智能市场、新南、安定、目标、

美味牛肝菌

s, 阿德

PDE

国家智能市场、新南、安定、目标、-厦门论文发表

美味牛肝菌

s, 阿德

PDE

国家智能市场、新南航、中兴安

s,

艾德

PDE

国家智能市场、新南航、中兴安

s,

艾德

PDE

是的,不明

是的,不明

是的,不明

是的,不明

格格特卡

泰特·阿特克茨卡奇格

加亚克

卡特加卡

T

1X

GFP

格西-5

最小发起人

其他

第四

埃西翁

B 德

第四

埃西翁

GFP

格西-5

最小发起人

-

-

阿瑟

阿瑟

% e

xpr

埃西翁

每行

0

0

0

0

0

0

补充图1。CSL/拉格的主要数据

-

1 个绑定站点

突变

ADF血清素通路基因CRM的分析

A) Primary data for the scanning mutation analysis of

tph

-

1

minimal CRM from

figure

1D. Each number represents the % of GFP cells

in a particular transgenic

line. +:

> 80% of mean wild type construct expression, +/

?

: values indicate a

渗透 80

-

20% 的平均野生类型表达值:

?

:值较少

超过平均值的20%

野生类型值

."其他表达式"是指表达式

其他神经元。

B)

CSL 图案的单个副本不足以驱动 ADF 表达式。

结果

特夫

-

1 普罗姆45

一个副本

第一

40个基点

特夫

-

1

p17

最小克隆的CRM

在前面

格西

-

5

极小

促进

仅表示在ASER神经元中。

C)

预测 CSL 绑定站点突变分析的主要数据来自

数字

1G.在每个构造之上,包括野生类型共识序列

在首都

字母在上下文中

一个较长的区域,箭头引入后

点突变

红色突出显示。每个数字代表 GFP 的百分比

特定的细胞

转基因线。+, +/

-

-

是相同的,在A"其他

表达"是指

表达在其他神经元。

1 / 12

下载

无花果份额

S1 无花果。CSL/LAG-1 结合位点突变分析ADF血清素通路基因CRM的主要数据。

CRM,西斯-监管模块;CSL, CBF-1, 苏 (H), 滞后 - 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.s001

PDF)

S2 无花果。滞后-1突变体显示ADF血清素神经元和RIH和AIM血清素再上位神经元的表达缺陷。

n.s,不重要。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.s002

PDF)

S3 无花果。LAG-1雾化记者的表情类似于内生标记滞后1记者。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.s003

PDF)

S4 无花果。LIM-4 激活 ADF 中的滞后-1表达式,而通过最小的 ADF CRM 执行单元命运维护需要 LAG-1。

CRM,西斯-监管模块;n.s,不重要。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.s004

PDF)

S5 无花果。LIN-12和GLP-1缺口受体不表示在ADF神经元终端血统中。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.s005

PDF)

S6 无花果。功能CSL绑定站点侧翼序列的德诺沃主题分析。

CSL, CBF-1, 苏 (H), 滞后 - 1;WT,野生类型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.s006

PDF)

S7 无花果。在特定刺激下tph-1上调节不需要 LIN-12 和 GLP-1缺口受体。

L1,第一幼虫阶段;是的,年轻的成年人

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.s007

PDF)

S8 无花果。DAF-19 不调节 LAG-1 表达,其他 CSL 站点在细菌感染时会参与tph-1响应。

CSL, CBF-1, 苏 (H), 滞后 - 1;n.s,不重要。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.s008

PDF)

S1 数据。原始数字值。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.s009

XLSX)

S2 数据。株。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.s010

XLSX)

S3 数据。引。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.s011

PDF)

S4 数据。支持方法。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001334.s012

PDF)

确认

我们感谢CGC(P40 OD010440)提供菌株;劳拉·奇里维拉博士、诺埃米·达罗基和埃利亚·加西亚寻求技术帮助;卡洛斯·莫拉博士为建造tph-1mod-5内源性记者;拉法尔·乔斯克博士分享glp-1内源性记者;伊瓦·格林瓦尔德博士、路易莎·科切拉博士和伊内斯·卡雷拉博士进行科学讨论和论文评论。

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