厦门免费医学论文发表-微管细胞骨架的衰变促进了神经元衰老
皮拉尔·奥肯维-拉莫斯 ，罗里·高斯林 ，莫妮卡·乔伊诺夫斯卡-蒙加，克里蒂·古普塔，塞缪尔·希尔兹，海法·阿尔哈迪安，
抽象
自然衰老伴随着运动、感觉和认知功能的下降，所有这些都会影响生活质量。衰老也是许多神经退行性疾病的主要危险因素，包括帕金森病和阿尔茨海默病。因此，我们需要更好地了解与年龄相关的神经元衰变背后的细胞和生理过程。然而，由于哺乳动物或脊椎动物模型的年龄化需要大量时间，因此获得这种理解是一个缓慢的过程。在这里，我们在果蝇大脑中引入了一种新的细胞模型，其中我们报告了以前在灵长类动物大脑中观察到的经典衰老特征。这些特征包括轴突肿胀、细胞骨架腐烂、轴突口径降低以及突触末梢处出现的形态学变化。在苍蝇的大脑中，这些变化在几周内开始发生，非常适合研究衰老的潜在机制。我们发现神经元微管（MT）细胞骨架的衰变先于其他衰老标志的出现。我们发现 MT 结合因子 Tau、EB1 和 Shot/MACF1 对于轴突和突触中的 MT 维持是必需的，并且它们在衰老过程中的功能丧失会触发 MT 束衰变，随后轴突和突触末端下降。此外，改善MT网络的基因操作减缓了神经元衰老标志的发生，并赋予衰老标本优于年龄匹配对照组的能力。我们的研究表明，MT网络是衰老神经元的关键病变部位，因此MT细胞骨架为改善高龄神经元衰变提供了一个有前途的靶点。
数字
图7图8图1图2图3图4图5图6图7图8图1图2图3
引文： Okenve-Ramos P， Gosling R， Chojnowska-Monga M， Gupta K， Shields S， Alhadyian H， et al. （2024） 微管细胞骨架的衰变促进了神经元衰老。PLoS 生物学 22（3）： 编号：E3002504。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504
学术编辑： Simon Bullock，MRC分子生物学实验室，英国
收到： 2023年2月6日;接受： 2024年1月17日;发表： 3月 13， 2024
版权所有： ? 2024 Okenve-Ramos et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。包含统计细节和基因型的文件、带有用于定量分析的数据点的元数据文件以及本文中使用的蛋白质印迹，可从 figshare 数据库获得：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22080953。
资金： 这项工作由生物技术和生物科学研究委员会资助给N.S.S. BB/M007456/1、BB/R018960/1和BB/W016907/1，以及E.G NLD BBSRC DTP、BB/T008695/1，以及由Wellcome Trust资助给R.G.和S.S.WT204002。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
缩写： 大 关闭后的天数;LTM公司 微管;MTA， 微管靶向剂;MTBP， 微管结合蛋白;投资回报率， 感兴趣区域;室温， 室温;STED， 受激发射消耗
介绍
正常的生理衰老会导致感觉、运动和认知功能的下降，在生命的最后十年中，恶化会加速。例如，短期记忆随着年龄的增长而缓慢恶化，在70岁后急剧加速。同样，听觉和视觉等感觉功能减弱在80岁以上的人群中也变得普遍[1-5]。这些功能的恶化以行为改变和缺陷为特征。例如，感官输入的丧失与社交和身体活动的减少有关，导致进行性社会孤立，影响日常生活活动和生活质量[6]。
导致与年龄相关的大脑功能和认知行为下降的关键因素尚不清楚。然而，有研究表明这不是由于广泛的细胞死亡[7,8]。相反，突触、轴突和树突等神经元结构的明显年龄相关改变被认为是人类衰老过程中脑组织大量体积损失的原因[2,9]。哺乳动物大脑中这种改变的例子包括萎缩性轴突的进行性发生，通常以不规则的膜轮廓和肿胀为特征[10]。外周小鼠运动轴突的轴突直径随年龄增长而显著减小[11–13]。此外，在包含小鼠视网膜的轴突中，观察到静脉曲张和突触含量降低[14]。突触结构在衰老过程中也显示出形态变化。例如，在大鼠海马体和小鼠小脑中，突触出现离散的膜肿胀或水肿，并表现出活动区减少[15–17]。了解这些结构变化背后的原因对于改善神经系统的时间依赖性衰退至关重要。
一个有希望的起点是微管 （MT） 细胞骨架，因为它是神经元的重要组成部分，尤其是轴突。MT 排列成平行束，在整个轴突中不间断地运行。MT形成分子高速公路，促进维持生命的运输，这是轴突中大多数生物过程所必需的，并在驱动形态发生过程中发挥重要作用[18\u201220]。然而，鉴于MT持续面临机械挑战，长期维护MT束是一项艰巨的任务[21\u201224]。因此，据报道，人类和其他灵长类动物的衰老轴突的MT密度和组织发生了变化[10,25]。
考虑到细胞功能对MT的独特依赖性，我们询问MT恶化是否可能是轴突衰变的原因，而不是继发性后果。MTs在体内的调控需要MT结合蛋白（MTBPs）的功能，MTBPs调节MT的成核、聚合、拆解、稳定和交联、翻译后修饰和修复[26\u201229]。这种复杂的MTBP调节网络的不平衡可以解释衰老期间MT衰减和神经元萎缩[23,25,30–32]。我们提出，更好地了解MT调节及其在轴突维持和衰老中的作用，可以为获得与年龄相关的神经元衰变的新见解和揭示新的治疗策略提供一条有希望的途径。
为了克服轴突细胞生物学和MT调控机制的高度复杂性，我们使用了模式生物果蝇黑腹果蝇。重要的是，果蝇在几周内显示出明显的严重衰老迹象，包括抗应激能力减弱、行为改变、新陈代谢改变、肠道屏障功能降低和心脏功能受损[33]。也有报道称，衰老会影响果蝇神经元，包括与年龄相关的线粒体动力学、突触含量和神经元功能下降的变化[34–40]。
使用该模型，我们对位于苍蝇视觉系统内的细胞中的神经元衰老进行了详细表征。我们观察到明显的衰老标志，与在哺乳动物中观察到的特征非常相似，包括轴突肿胀、轴突直径改变以及细胞骨架和突触衰变。最早的老化表型是 MT 束衰变：不连续性、束组织紊乱和 MT 体积损失。基于它们在果蝇神经元轴突发育中的关键功能，我们选择了 3 个 MTBP 来进一步研究它们在轴突维持中的可能作用：Tau、光谱蛋白短停 （Shot） 和末端结合蛋白 1 （EB1）。MT 晶格结合因子 Tau 和 Shot 都调节发育中神经元的 MT 稳定性。MT 加末端结合因子 EB1 作为支架蛋白介导多个 MTBP 的 MT 加末端结合。除此之外，已知Tau、Shot和EB1共同为生长中的轴突聚合MT提供指导[29,41–45]。在这里，我们发现这些MT调节因子的遗传减少诱导了类似衰老的MT缺陷，并加剧了年龄依赖性神经元衰变。此外，通过进行已知可以稳定和增强MT网络的遗传操作，神经元可以免受衰老特征的影响。结果，MT失调与神经元衰变之间存在因果关系。
结果
年龄会改变轴突和突触末梢的形态
为了了解轴突和突触末梢如何随着年龄的增长而变化，以及是什么驱动了这一过程，我们着手建立一个体内细胞模型，这将使我们能够研究衰老的细胞生物学。我们专注于果蝇视觉系统，特别是T1神经元，T1神经元是髓质皮中的二级中间神经元（图1A）。T1神经元形成突起，分叉成1个分支，在髓质M2层中与几个突触伙伴接触，另一个突触伙伴投射到层中[46,47]（图1A）。有几个特性使 T1 神经元的髓质定位轴突成为亚细胞研究的理想选择：它们是大口径轴突，在刻板的髓质位置具有特征性的突触末梢;由于它们靠近组织表面，因此易于成像和操作;并且有许多遗传工具可用于促进其有效的可视化和操作。
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图 1. 果蝇视觉系统内的轴突和突触末梢在衰老过程中会恶化。
(A） 成年果蝇大脑的视叶区域的表示，描绘了 T1 神经元的体细胞 （S），该神经元具有分叉终止于髓质 （ME;T，本研究中分析的终端）和椎板 （LA）。（乙、丙）来自年轻（6-10 天）和老年标本（29-31 天）的 T1 髓质突起的轴突 （B） 和末端 （C），用质膜标记物 myr-Tom （myr） 标记。在老化的标本中，轴突显示变薄（箭头）和肿胀（星号;蓝色虚线框显示为下面的 1.7 倍放大图像），轴突末端出现分解并伴有肿胀（箭头）和整体面积缩小。（D） X 轴上显示的 B 和 C 中显示的表型的量化，以及 DAE 中的年龄组。在左边的 3 个图表中，数据点以淡紫色显示，并以 SEM ±平均值显示。 图中显示了通过 Kruskall-Wallis 方差分析多重比较检验获得的 P 值。对于末端形态，数据表示为正常突触与肿胀/破裂突触的分布;通过卡方检验获得的显著性如上所示。数据取自每个年龄组至少 10 个标本、100 个轴突或 300 个末端。有关详细的统计值和基因型，请参见 S1 表中的表 A。所有单个值都在 S1 数据点中提供。B 中的比例尺表示 B 中的 10 μm 和 C. DAE 中的 14 μm，即闭合后的几天。
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为了研究T1神经元的髓质轴突，我们通过由GMR31F10-Gal4系驱动的荧光标记膜标记物肉豆蔻酰化番茄（myr-Tom）的靶向表达来标记膜[48]。通过离体活体成像方法对标记的轴突进行可视化（参见材料和方法）。我们对不同年龄的标本进行了比较分析。由于果蝇的饲养温度范围是可变的，较高的温度有助于更快的标本老化，因此我们选择在29°C下对果蝇进行陈酿，这个温度与生态相关，可以更快地进行实验[49]。在这些条件下，我们发现T1轴突的直径与年轻的轴突相比减小，它们的膜变得不规则，并且它们经常出现轴突肿胀（图1B）。这些变化在封闭后 （DAE） 超过 29 天的果蝇中显着（图 1D）。视觉系统中的其他神经元在轴突中也经历了类似的与年龄相关的变化，如L2层神经元所示（S1图），表明这些改变不是T1依赖性的，并且可能广泛存在于其他果蝇神经元细胞类型中。
除了轴突轴的形态变化外，我们发现衰老改变了含有突触的轴突末端的形态。在年轻的标本中，髓质神经堆M2层的T1末端由手形的密集树状物组成（图1A和1C）。在老标本中（从大约 30 天大开始），这些树状结构变得不规则且不那么紧凑，导致末端面积整体减少，在极端情况下，突触膜明显碎裂（图 1C 和 1D）。此外，突触末梢出现肿胀，呈高度球形和静脉曲张形状（图1C和1D中的箭头）。这些变化发生在没有神经元死亡的情况下，正如用RedStinger标记的T1神经元核的定量所表明的那样[50]（S2图）。果蝇中发生的这些衰老改变与小鼠视网膜、运动轴突和灵长类动物大脑中发生的转变相似，它们都表现出轴突静脉曲张和轴突末梢减少[10–12,14]。
为了证明这些改变不是外源性膜标志物myr-Tom长期表达的结果，我们使用了条件表达系统Gal4 / Gal80ts [51,52]（参见材料和方法），使我们能够将膜标记物的表达限制在幼蝇和老年果蝇中相等的短时间内。该系统依赖于转录阻遏蛋白 Gal80 的普遍表达，该转录阻遏蛋白包含一个温度敏感突变，使其在 29°C 时失活。 因此，在 29°C 下，Gal80 失活，使 Gal4 能够自由诱导 UAS 依赖性转基因的转录，而在 18°C 下饲养的果蝇中，转基因的表达被活性 Gal80 抑制。由于在 18°C 下饲养果蝇会延迟发育，因此我们在 18°C 下将果蝇陈化 53 至 56（老）或 0 至 3 天（幼果），在没有 myr-Tom 的情况下（标记表达在 18°C 时受到抑制），然后在 29°C 下将幼果蝇和老果蝇培养 4 天，以实现 myr-Tom 的短期表达， 在解剖和成像大脑之前（S3图）。我们发现，与年轻标本相比，来自旧标本的轴突表现出：直径减小、膜轮廓不规则、肿胀增加和突触形态改变（S3E 图）。这表明使用该模型观察到的缺陷是衰老的结果，而不是由于持续延长的myr-Tom表达而导致的长期压力。这些结果进一步证实，在轴突和突触末梢中发现的显着衰老改变与果蝇饲养的温度无关。
综上所述，我们的数据表明，在衰老过程中，轴突和突触区室都会发生显着的结构变化。老化的神经元除了突触末梢形态的改变外，还表现出轴突直径的减小，从而产生肿胀，这表明轴突和突触的完整性受到损害。
MT 细胞骨架的变化先于衰老过程中的轴突和突触衰变
MT细胞骨架是决定细胞形状以及轴突和突触末梢形态的关键因素[53–55]。MT也被认为是调节轴突口径的关键因素，特别是在神经丝丰度低或缺失的情况下[19,56–58]。因此，我们假设 MT 可以在用我们的模型观察到的与年龄相关的神经元缺陷的背景下发挥关键作用。为此，我们首先研究了衰老是否会急性影响神经元的MT细胞骨架。
为了可视化 T1 神经元中的轴突和突触 MT，我们表达了 GFP 标记的 α-微管蛋白（微管蛋白：：GFP，Grieder 及其同事）。正如预期的那样，年轻人中 T1 神经元的轴突 MT 沿轴突排列成突出、连续和均匀的束，轴突在突触末端张开成多个较细的束分支（左图，图 2A 和 2B）。然而，在较老的标本中，我们观察到轴突 MT 失去了紧密、平行的排列，偏离了它们的束，导致病灶紊乱（“MT 解束”）。此外，轴突内的某些区域似乎含有较薄的MT束，并且在极端情况下，似乎没有MT（“MT断裂”）（右图，图2A，2C和S4为更高放大倍率下的更多示例）。我们使用高端共聚焦显微镜以及受激发射耗竭 （STED） 超分辨率显微镜（S5A 和 S5B 图）证实了轴突 MT 束的年龄依赖性整体变薄。通过测量 T1 轴突内 MT 束的横截面（作为束直径的指示），我们发现当使用这两种技术成像时，老年标本与年轻标本显着减少（S5C 和 S5D 图）。同时，我们还观察到张开的突触 MT 经常出现碎片化，并且随着年龄的增长而数量减少（从 38 天减少 50% 以上;图2B和2C）。对多个时间点的衰老表型的评估显示，轴突和突触 MT 束的恶化从 19 天开始就已经很突出，这表明 MT 缺陷发生在形态学变化开始之前，例如轴突变薄和突触改变（可在大约 30 天之前检测到;图 2C 与图 1D）。
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图 2. MT 畸变先于衰老过程中的轴突和突触衰变。
(A、B）T1神经元轴突（A）和突触末梢（B）位于年轻（6-10天）或老年（29-31天）的髓质区域，并用GFP标记的α-微管蛋白（微管蛋白或浴缸，在倒置灰度图像中，以便于可视化）和质膜标记物MYR-Tom（MYR，插图中的洋红色）。在 A 中，洋红色圆圈框显示如下放大 2.3 倍，老苍蝇显示 MT 解束（箭头，A 中的插图 1 和 2）以及 MT 束上的断裂（白色箭头，插图 3 和 4 在 A 中）与同一轴突（蓝色箭头）或幼蝇中的不间断 MT 伸展相比。在 B 中，老果蝇还显示出突触末端（插图）和看起来支离破碎的 MT（B 中插图中的 V 形）的 MT 减少。（C） A和B中所示表型的量化，年龄组在X轴下方表示;数据点显示为蓝色圆圈，SEM±均值条显示;通过 Kruskall-Wallis 方差分析多重比较检验获得的 p 值如上所示。数据取自每个年龄组至少 17 个标本。有关详细的统计值和基因型，请参见 S1 表中的表 D。所有单个值都在 S1 数据点中提供。A 中的比例尺代表 A 中的 10 μm 和 B 中的 5 μm。
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为了摒弃由于微管蛋白：：GFP的长期表达而对此类表型造成的任何混杂因素，我们使用了与myrTom相同的方法：Gal4 / Gal80ts系统用于控制微管蛋白-GFP在年轻和老年标本中等时间的表达。在这些时间控制表达的条件下，老年标本仍然发展出相同的年龄相关 MT 表型（S6 图），从而排除了微管蛋白-GFP 的长期表达作为所述衰老表型的原因。
为了进一步验证观察到的表型是否是衰老的结果，我们将我们的细胞模型与胰岛素/IGF信号通路相结合，胰岛素/IGF信号通路是一种经过充分研究的长寿通路，已知可以调节各种生物体的衰老速度[59]。我们利用了chico1等位基因，是胰岛素受体底物CHICO中的一种突变，可使杂合子的寿命延长至36%[60]。我们推断，调节衰老和改善生物体整体健康状况的寿命延长因素将改善不同组织的健康，包括神经系统。奇科中的 T1 神经元1杂合子背景改善了老果蝇中所有测量的衰老特征，包括肿胀和轴突变薄，以及轴突和突触末梢的MT恶化（图3）。
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图 3. 胰岛素受体底物 CHICO 的突变可改善神经元衰老标志和 MT 衰变。
(A-D）30-35 天老标本髓质中的 T1 轴突（顶部）和突触末梢（底部）用 GFP 标记的 α-微管蛋白（微管蛋白，A 和 B 中的洋红色，C 和 D 中的灰度）和质膜标记物 myr-Tom（myr，A 和 B 中的绿色）。A中老标本的衰老表型包括轴突肿胀（星号）、轴突变薄（箭头）和MT断裂/变薄（框内区域显示为2倍放大插图）;以及 C 中所示的突触末梢中张开的 MT 的减少（框内区域显示为 2 倍放大的插图）。奇科1B 和 D 中的杂合子抑制年龄匹配标本中衰老神经元的表型。（E） 在不存在或存在chico的情况下，A-D中显示的表型的定量1/+，在 X 轴下方表示;数据点显示为蓝色圆圈，SEM±均值显示;通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值如上所示。数据取自每组至少 16 个标本。有关详细的统计值和基因型，请参阅 S1 表中的表 F。所有单个值都在 S1 数据点中提供。A 中的比例尺代表 A 和 B 中的 10 μm，C 和 D 中的比例尺代表 6 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.g003
总而言之，我们的研究结果表明，这里报告的标志是生理衰老的结果。此外，MT 束恶化发生在形态学变化开始之前，这表明 MT 束恶化是与衰老过程中观察到的轴突和突触衰变有关的重要事件。
微管蛋白与轴突 MT 的掺入量随着年龄的增长而减少
我们在旧标本中观察到的轴突 MT 束变薄和突触 MT 的减少可能表明，介导轴突中 MT 密度维持的机制随着年龄的增长而受到损害。这些机制可能包括轴突内的MT成核、聚合和稳定，这是主要在轴突发育方面进行的多项研究的主题[26\u201229]。然而，据我们所知，对成熟轴突中的MT补充和维持知之甚少，这有望成为抵消磨损等过程的重要机制，例如由运动蛋白施加的磨损（见引言）。
为了研究成熟神经元中的MT补充和维持以及它们是否受年龄影响，我们进行了一项脉冲追逐实验，其中微管蛋白：：GFP在年轻或老年标本的4天限制时间内表达，之后我们检查了GMR31F10-Gal4驱动的微管蛋白：：GFP在多大程度上被掺入轴突MT束中。为了实现这一点，我们使用了条件 Gal4/Gal80ts表达系统：将幼果蝇和老年果蝇保持在18°C（微管蛋白：：GFP表达无活性），直到移至29°C4天（微管蛋白：：GFP表达活性）。幼蝇在0-3日龄时移至29°C。老苍蝇在53至56岁时移动。在年轻和老年标本中，微管蛋白：：GFP被掺入轴突和突触MT中，表明MT在两个时间点继续在成年T1神经元中得到补充（图4A和4B）。为了评估微管蛋白：：GFP掺入的水平，我们量化了轴突MT束中GFP的强度，并排除由于驱动活性变化而导致的潜在伪影，我们将微管蛋白：：GFP归一化为共表达的myr-Tom。这些分析显示，与年轻组相比，老年果蝇轴突的GFP强度显着降低（图4C，左图）。即使在微管蛋白表达脉冲增加到 15 天的情况下，我们观察到掺入 MT 的微管蛋白：：GFP 显着降低（图 4C，右图）。
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图 4. 在脉冲追逐实验中，微管蛋白-GFP 在轴突 MT 处的存在减少表明 MT 补充随年龄的变化。
(A、B）使用 UAS/Gal4/Gal80 表达 GFP 标记的 α-微管蛋白（微管蛋白，绿色和倒空灰度图像）和质膜标记物 myr-Tom（myr，洋红色）的果蝇髓质中的 T1 轴突末端ts系统。通过温度从 18°C 到 29°C 的变化，成人大脑中基因表达的诱导被限制在 4 天。 为此，苍蝇在整个发育和成年过程中保持在 18°C，直到成像前的最后 4 天，此时它们被转移到 29°C 以启动基因表达。将年轻标本（A;4-7天大的苍蝇，在18°C下“关闭”+在29°C下“打开”4天）与老标本（B;57-60天大的苍蝇在18°C下“关闭”53-56天+ 29°C下4天“打开”）。可以观察到 Tub-GFP 并入轴突和轴突末端（由洋红色轮廓表示）的 MT（箭头）中，胞质信号非常低。（C） 在 2 个实验条件下（4 天或 15 天表达方案下）中 GFP-tub 和 myr-Tom 之间的比率（Ratio GFP/Tom）的量化，X 轴上标明了年轻与老标本;数据点显示为蓝色圆圈，SEM±均值显示;通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值如上所示。个体数据分别取自每个年龄组至少 5 或 6 个标本，表达 4 天或 15 天。有关详细的统计值和基因型，请参阅 S1 表中的表 G。所有单个值都在 S1 数据点中提供。比例尺可以在右下角的 A 中找到，对应于 5 μm。MT，微管。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.g004
这些数据强烈表明，MT 的补充和维持在衰老过程中会减少，这可以解释我们在衰老果蝇中观察到的轴突 MT 束的恶化。
EB1 和 Tau 的 MT 结合活性随着年龄的增长而降低
接下来，我们着手研究可能导致 MT 完整性和补充随年龄增长而降低的机制。EB1 和 Tau 是负责维护 MT 捆绑包的潜在候选者。EB1是一种支架蛋白，优先定位于聚合MT末端，介导聚合动力学中涉及的因子的结合，并引导MT延伸成有组织的束[29,41\u201244]。Tau沿MT的晶格稳定MT，并通过将EB1维持在延伸的MT末端来促进MT聚合[43,61,62]。虽然内源性果蝇Tau的缺失不会影响寿命[63]，但Tau的异常定位是人脑衰老的标志，与记忆功能障碍相关[64,65]。
我们首先研究了全脑中 EB1 和 Tau 定位的年龄依赖性变化。在年轻标本的髓质中，我们发现EB1抗体染色在整个脑组织中表现为明显的斑点，在含有T1轴突MT的区域内有短而连续的中风区域（图5A）（S7B图）。如前所述，这种表达模式可能代表EB1与正端和/或沿MT晶格的离散区域结合[24,43]。值得注意的是，EB1轴突定位在从老果蝇中解剖的大脑中较弱，正如延髓内轴突区域EB1强度显着降低所表明的那样（图5A和5B）。
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图 5. EB1 和 Tau 的功能在老化过程中会发生变化。
(A） 用抗 EB1 标记的幼蝇（3-6 天，29°C）和老年（28-35 天，29°C）苍蝇髓质的轴突区域。（E） 用内源性 GFP 标记的 Tau 标记的髓质的轴突区域（携带 tauwee304/+等位基因）在 2 个不同的时间点（5-7 岁和 33-35 日龄，均在 29°C 下老化）。在老化的标本中，轴突显示EB1和GFP-Tau的减少（A和E中的虚线青色框分别显示为2倍和2.3倍放大的嵌体。E中的箭头表示聚集体状结构）。A 和 E 中的图像用于 （B） EB1 信号强度的量化和 （F） 具有高水平 GFP-Tau 的轴突数量（高于 220 个强度单位）。如上所述，年龄类别在 X 轴下方表示。数据点表示延髓，显示为蓝色圆圈和SEM±均值;通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值如上所示。数据取自每个年龄组至少 17 个标本。（C 和 G） 蛋白质印迹法的总 EB1 和 Tau 显示，在衰老过程中 Tau 减少，而 EB1 水平保持不变。年龄类别在 X 轴下方表示（C 为 4-9 和 29-32，G 为 8-10 和 29-31）。数据点代表独立的裂解物，显示为蓝色圆圈和SEM±均值;通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值如上所示。使用年轻（4-6 天龄）和老年（28-31 天龄）标本的头部提取物进行 （D 和 H） MT 结合测定，然后进行分馏以获得富含 MT 的沉淀和可溶性 SN。MT 和 SN 组分均采用抗 EB1、抗 Tau 和抗微管蛋白进行检测。数据点代表独立的 MT 结合测定，显示为蓝色圆圈和 SEM ±平均值;通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值如上所示。定量证实，与 MT 结合的 EB1 和 Tau 量随着年龄的增长而减少。有关详细的统计值和基因型，请参见 S1 表中的表 H。所有单个值均在 S1 数据点中提供，所有蛋白质印迹都可以在 S1 蛋白质印迹中找到。A 中的比例尺代表 A 和 E 中的 20 μm。 MT，微管;SN， 上清液。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.g005
Tau 抗体染色在全脑中被证明是不可靠的。作为替代策略，我们使用了可行的 tau黄波304等位基因，包含插入其基因组位点的GFP[66]。在年轻成年 tau 中wee304/+标本，Tau黄波304主要局限于延髓内的轴突，呈丝状图案，与沿MT晶格的结合一致（图5E）。使用 MT 探针 Sirt-Tubulin 进一步证明了 Tau 与 MT 的共定位（S7A 图）。然而，这种模式在老年髓质中发生了变化，显示出 Tau 显着减少黄波304轴突中的GFP强度（图5E和5F）。此外，我们观察到聚集体状结构的出现（图5E，箭头）。果蝇tau的这种重新定位与在老年人类个体或某些tau蛋白病（包括阿尔茨海默病）上观察到的改变相似[67,68]。
衰老神经元中 EB1 和 Tau 的轴突关联减少可能反映了其水平的整体降低。为了验证这一假设，我们量化了不同年龄分离的果蝇头提取物中的 Tau 和 EB1 蛋白水平。我们发现，EB1的水平在旧标本中保持不变（图5C），而在旧标本中，总Tau蛋白减少（图5G）。Tau 的减少可能是由于表达降低或 Tau 在聚集体中的隔离，而这在我们的蛋白质印迹研究中可能没有检测到。
为了进一步了解 Tau 和 EB1 的 MT 调节功能是否可能在衰老过程中发生改变，我们比较了这些因子在成年年轻和老年大脑中的 MT 结合特性。为此，我们使用不同年龄的苍蝇头提取物进行了标准的MT结合离心测定[69]。我们发现，与年轻大脑相比，在老年大脑中富含 MT 的部分中检测到的 EB1 和 Tau 的量显着下降（图 5D 和 5H），这意味着旧标本中与 MT 结合的 EB1 和 Tau 较少。这表明 EB1 结合 MT 的能力随着年龄的增长而降低，并且与我们在衰老轴突中观察到的 EB1 强度降低一致，而衰老大脑中的轴突 Tau 丢失可能是由于 MT 结合减少和旧大脑中蛋白质水平的整体降低。
MT 调节剂的丢失加剧了老化特征
我们的研究结果可能表明，与年龄相关的关键 MT 调节因子的功能和/或丰度下降可能是 MT 丢失和分拆的原因，甚至是衰老过程中发生的随后轴突和突触衰变的原因。为了评估这种可能性，我们在先前验证的RNAi构建体的T1神经元中进行了靶向表达，以对抗几种必需的MT调节因子：Tau、EB1以及果蝇光谱图拉普拉金Shot作为另一种重要的MT调节因子[29,41]。与年龄匹配的对照组相比，旧标本中 Tau 的 T1 特异性敲除导致 MT 束受到干扰或显示断裂的位点数量显着增加。这些MT表型与轴突肿胀数量的增加相关（图6C，S8A和S8B）。
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图 6. 敲除 Eb1、Tau 和 Shot 会加剧与年龄相关的 MT 衰变和衰老标志。
(A、B）用 GFP 标记的 α-微管蛋白（插图中的微管蛋白、灰度和洋红色）和质膜标记物 myr-Tom（插图中的 myr，绿色）标记的 28-30 只老苍蝇髓质中 T1 轴突的代表性图像。不存在 （A） 或存在联合 Tau 和 Shot 敲低 （Tau核糖核酸（RNAi） 拍摄核糖核酸（RNAi）在 B） 中进行比较。Tau 和 Shot 敲低联合增强了衰老神经元的表型，包括轴突肿胀，通常显示 MT 解束（箭头）和 MT 断裂（星号）;盒装区域显示为下面放大的 2 倍双/单通道图像。（C） A 和 B 中显示的表型的定量以及 Tau （Tau核糖核酸（RNAi））， Shot （射击核糖核酸（RNAi））和EB1杂合子背景中的EB1（EB1核糖核酸（RNAi）;DBP型+/Df);具体的击倒在 X 轴下方指示。数据点显示为蓝色圆圈，SEM±均值显示;通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值如上所示。数据取自每个年龄组和条件的至少 14 个标本。有关详细的统计值和基因型，请参见 S1 表中的表 I。所有单个值都在 S1 数据点中提供。A 中的比例尺表示所有图像中的 10 μm。MT，微管。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.g006
Tau 和 Shot 先前被证明可以冗余调节发育神经元的 MT 稳定性 [62]。此外，Shot还为MT生长提供指导[41]。因此，我们单独或用tau进行T1特异性敲低，发现MT表型和轴突肿胀的增加与单独敲除tau时观察到的相似，MT断裂和轴突肿胀在双重敲除后明显增强（图6，S8A和S8C ).我们将分析扩展到突触末梢，揭示了突触 MT 数量缺陷的明显恶化以及 T1 特异性双敲低中肿胀和断裂的突触增加（S9A、S9C 和 S9E 图）。
EB1半衰期长已有报道[41]。为了在我们的研究中克服这个问题，我们在 EB1 杂合突变背景中对 EB1 进行了 T1 特异性敲低（使用携带 EB1 基因缺陷的等位基因 Df（2R）Exel6065）。这种情况导致 MT 断裂、MT 紊乱区域和衰老轴突中轴突肿胀的发展增加（图 6C、S8A 和 S8D）。
敲除实验均未在年轻标本中诱导 MT 断裂和脱束/杂乱或轴突肿胀（S10 和 S11 图），这表明成年标本的 MT 表型和轴突肿胀随年龄而增加。
综上所述，我们发现 MT 调节因子活性（如 Tau、Shot 和 EB1）的丧失加剧了衰老神经元中的 MT 表型，这表明这些因素有助于维持轴突 MT 束。此外，它们的功能缺陷大大加剧了与年龄相关的轴突和突触萎缩，表明它们可能是与神经元衰老的正常过程有关的因素。
保护和增强 MT 束可改善轴突衰老表型
MT 束恶化和关键 MT 调节因子减少为 MT（图 5），以及它们的功能表型丧失（图 6、S8 和 S9）和非 MT 相关轴突表型的迟发（图 1 和 2）的结合表明，异常的 MT 调节是衰老过程中轴突衰变的主要原因。因此，我们推断，我们可以通过人为地增强特定 MT 调节因子的功能来减缓与年龄相关的轴突萎缩，以保护 MT 在衰老过程中免受衰变。
通过过表达Tau来抵消MT中Tau的丢失可能会适得其反，正如果蝇神经元中这种策略的有害结果所表明的那样[70]。或者，我们在 T1 神经元中过表达 EB1，并在 4 至 5 周时检查了衰老相关表型。我们观察到所有测试的衰老表型（图 7D、S9E 和 S13）都有改善，包括轴突 MT 束的混乱和断裂减少，此外 MT 束直径和突触末端 MT 数量增加。此外，EB1 过表达挽救了非 MT 相关表型，包括轴突肿胀的减少、轴突口径的增加以及旧标本中突触末梢的恢复形态。
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图 7. EB1 和 Shot 的表达式EGC公司改善轴突衰老表型。
(A、B）29-31 天龄的老标本髓质中的 T1 轴突用质膜标记物 myr-Tom（myr，A 和 B 中的灰度，双通道图像中的绿色）标记。在 A 中的老标本中可以观察到衰老表型，包括轴突肿胀、轴突变薄和 MT 脱束，但在 Shot 的 T1 特异性表达中不存在EGC公司编码 Shot 的 C 末端（A 与 B 相比，盒装区域 1 显示为 2 倍放大插图，其中 MT 在 A 或 GFP 标记的 Shot 中用 GFP 标记的 α-微管蛋白标记EGC公司在 B）。（C） 来自旧标本（29-30 天龄，用 GFP 标记的 α-微管蛋白或 GFP 标记的 Shot）的 T1 神经元的 MT 轴突束EGC公司），使用Airyscanning高端共聚焦显微镜成像，在拍摄时显得更厚EGC公司表达。（D） A-C 中显示的表型的定量，以及 EB1 异位表达的条件。具体条件在 X 轴下方表示。数据点显示为蓝色圆圈，SEM±均值显示;通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值如上所示。数据取自每组至少 13 个标本（MT 束的直径测量值至少为 6 个，轴突的直径测量值至少为 10 个）。有关详细的统计值和基因型，请参阅 S1 表中的表 L。所有单个值都在 S1 数据点中提供。A 中的比例尺代表 A 和 B 中的 10 μm，以及 C 中的 2 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.g007
接下来，我们测试了另一种减缓年龄相关性轴索萎缩的方法，方法是表达融合到 GFP 的 Shot 的 C 末端（ShotEGC公司：：GFP）作为保护MT在老化过程中不变质的替代品。拍摄EGC公司包含 Gas2 相关结构域/GRD，它与 MT 晶格弱相关并保护它们免受解聚，以及 C 尾，它与 MT 晶格有适度的关联，并包含 EB1 结合的 SxIP 动机。在镜头中结合EGC公司：：GFP结构，这些结构域在整个MT晶格上介导强结合，完全装饰MT束，保护它们免受解聚，并促进与EB1的结合[29,41]。与我们之前在原代神经元和成纤维细胞方面的工作一致[41]，我们发现 ShotEGC公司：：GFP 还装饰 T1 神经元中的轴突 MT（S12 图）。与EB1 overexpression， Shot相似EGC公司：：GFP 主要改善恶化的 MT，并显着改善轴突中所有检查的衰老表型，包括轴突肿胀和较薄的轴突（图 7A-7D）和突触末梢（S9B、S9D 和 S9E 图）。总之，通过 EB1：：GFP 和 Shot 加强 MT 网络EGC公司：：GFP 过表达足以挽救 T1 神经元中与年龄相关的表型。
拍摄时EGC公司使用 Gal4/Gal80 在成人大脑的 T1 成熟神经元中严格过表达ts系统，所有测试的年龄相关 MT 表型以及轴突肿胀均得到显着改善。另一方面，在成人 T1 神经元中过表达 EB1 可显着挽救轴突肿胀，而对 MT 断裂和解束的改善较弱（S14 图）。该数据表明，ShotEGC公司足以阻断成人大脑中的MT和轴突衰变，而EB1介导的衰老过程中的保护作用可能需要在早期发育阶段表达才能完全挽救MT萎缩。
这些发现进一步支持了我们的假设，即MT衰变可能是衰老过程中轴突和突触衰变的重要原因。他们进一步强调了将MT调节作为潜在治疗干预目标的前景，以对抗衰老过程中神经元的恶化。
拍摄EGC公司EB1表达改善果蝇的运动性能
为了评估亚细胞神经元表型的改善是否对果蝇的全身性能有影响，我们检查了果蝇的运动作为已知受衰老影响的读数[38,71]。为此，我们测试了苍蝇的负趋向反应，这是苍蝇在被敲击到容器底部后向上行走的自然反应。它通常通过测量苍蝇爬升的距离作为时间的函数来量化（S14A图）。在我们的实验中，我们使用了GeneSwitch系统，这是一种改良的GAL4-UAS系统，在药物RU-486存在时诱导GAL4表达[72]。该系统允许我们在没有（没有转基因表达）或存在 RU-486（诱导表达）的情况下比较来自相同背景和基因型的果蝇，排除了这些果蝇的不同遗传背景有助于运动改善的可能性。使用这种方法，成年标本在其整个生命周期中都饲养在补充有RU-486的标准苍蝇食物上，以诱导Shot的过表达EGC公司：：GFP 或 EB1：：GFP。使用 Shot-GFP 表达作为 GeneSwitch 活性的读数，我们发现，正如预期的那样，喂食苍蝇补充 RU-486 的食物诱导表达。然而，这种表达并未在整个生命周期中保持：在雌性中，在6至10天的早期观察到表达，并在29°C下维持在22天，但在27日龄或更老的果蝇中则不存在。在补充RU-486食物饲养的雄性中，在6至10天大的标本中观察到外源性表达，但在22日龄或更大的果蝇中已经不存在（S8A和S8B图）。至于运动能力，阴性的地理趋向测试表明，在含有食物和表达 Shot 的 RU-486 上饲养的 22-25 天大的雌性行走距离显着增加EGC公司或EB1，与相同基因型的果蝇相比，但没有RU-486饲养（图8C）。在老年雄性标本中没有观察到这种运动的改善（图8D），这与上述GeneSwitch表达谱一致。与非 RU-486 动物相比，当饲喂 RU-486 时，幼崽和对照（无 UAS 转基因）标本的运动没有改善。
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图 8. 镜头的表达EGC公司使用 Geneswitch 系统在成年果蝇中的 EB1 改善了老年果蝇的运动。
(A、B）不同年龄（29°C 下 6-10、22-25 和 27-30 天）标本的髓质轴突区域，携带 elav-Gene-Switch 系统和 UAS-GFP 标记的 ShotEGC公司片段，在没有 （?） 或 （+） RU-486 的食物中持续维持。RU-486 诱导 GFP 表达，这在雌性和雄性年轻标本中很突出。然而，GFP表达水平随着标本年龄的增长而降低，雄性从22-25天开始没有GFP，雌性在22-25天时保持GFP表达，在29°C时损失27-30天。具体条件在 X 轴下方指示，包括控制苍蝇或表示 Shot 的苍蝇EGC公司或成年期的 EB1 与泛神经元 Elav-GeneSwitch 驱动程序。在 RU-486 存在的情况下，每种基因型的步行距离已归一化为无需药物治疗的相同基因型的平均步行距离。数据点显示为圆圈，SEM±均值显示;通过 Mann-Whitney 检验比较具有或没有 RU-486 的相同基因型对获得的 p 值。有关详细的统计值和基因型，请参阅 S1 表中的表 N。所有单个值都在 S1 数据点中提供。比例尺 A = 20 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.g008
除了 GeneSwitch 系统外，我们还使用了 Gal4/Gal80ts系统与泛神经元 elav-Gal4 驱动结合以限制 EB1：：GFP 和 Shot 的表达EGC公司：：GFP到成人阶段（封闭后开始）。我们发现幼蝇在 4 到 5 个 DAE 时表达 ShotEGC公司：：GFP的表现与年龄匹配的野生型对照相似，而表达EB1：：GFP的果蝇的运动略有减少（S15B图）。与幼蝇相比，年长的对照果蝇（25至26 DAE）的运动明显减少，这部分被Shot的表情所挽救EGC公司：：GFP（S15B 图）。
我们的数据强烈表明，恢复神经元 MT 网络可改善神经系统功能，并在衰老过程中对更广泛的身体生理产生积极影响。鉴于运动需要神经系统之外的生理机能，同样受到衰老的影响，例如肌肉的活动，预计不会进行全面抢救。因此，精心设计的靶向 MT 调节策略可能为改善神经元中与年龄相关的病理变化并改善其功能提供途径。
讨论
在这项研究中，我们建立了一个新的模型来研究果蝇大脑中的神经元衰老。该模型很容易进行遗传和实验操作，并且仅在 5 周内就显示出保守的衰老特征。果蝇轴突和突触的这些与年龄相关的形态学变化，让人联想到高等生物体中描述的改变，包括轴突肿胀的出现、轴突口径的降低以及突触末梢的破坏，并伴有膜肿胀或水肿[10–17]。我们的研究进一步表明，MT 恶化部分是由于 MT 补充减少，是衰老病理学其他迹象之前的重要变化，并且可能是由 MT 调节因子功能的年龄依赖性降低引起的。重要的是，我们发现减少关键的 MT 调节因子（如 Tau、EB1 或 Shot）会加剧与衰老相关的 MT 缺陷以及轴突和突触萎缩。作为另一个重要结果，我们的工作证明，保护和增强成熟神经元中的MT可以防止与年龄相关的轴突和突触恶化。这种基于 MT 的方法还改善了神经元功能，神经元功能在衰老过程中自然下降。
因此，我们提出MT畸变可以被认为是年龄诱导的神经元衰变的重要致病因素，为正常衰老过程中的神经元萎缩提供了新的机制见解。我们的工作还表明，有可能采用以MT为重点的策略来保护神经元在衰老过程中不恶化。
神经元衰老标志及其与高等生物的保守性
我们的研究表明，T1神经元的数量在衰老过程中没有改变（S2图）。相反，随着时间的推移，它们的轴突和突触末梢会经历显着的形态变化（图1）。总体而言，轴突变薄并出现肿胀，突触末梢似乎肿胀和分裂。在老年啮齿动物和灵长类动物的几个大脑区域中也描述了类似的形态改变。例如，大鼠海马和小鼠小脑的突触末梢会随着年龄的增长而出现肿胀或水肿[15–17]。此外，在老年恒河猴大脑背外侧前额叶皮层的轴突中发现轴突肿胀或憩室[10]，并且发现小鼠周围神经系统内轴突的直径随着年龄的增长而减小[11\u201213,73]。至关重要的是，这种在高等生物体衰老过程中自然发生的生物学变化似乎发生在没有神经元丢失的情况下[74]，并且与神经元网络的功能衰减相关[75,76]。事实上，轴突肿胀被认为是轴突变性和轴突萎缩的标志[77]，轴突口径/直径是神经元传导特性的关键决定因素，较薄的轴突与导电性降低相关[57]。因此，本文提出的果蝇神经元的年龄依赖性改变与在哺乳动物中观察到的改变一致，证明了我们模型的有效性和有效性。
MT细胞骨架在神经元衰老中的重要性
尽管先前的研究均未将上述形态学改变与MT细胞骨架的缺陷联系起来，但其他无脊椎动物模型[78]和高等生物[79]中MTs已被提出受到衰老的影响。据报道，在衰老过程中，人类和非人灵长类动物大脑中都会发生MT密度降低和轴突内MT组织的改变[10,25]。据报道，在人类锥体神经元中，在Tau神经原纤维缠结形成之前，MT密度降低了55%[25]，这表明在其他真正的衰老标志之前，细胞骨架水平发生了变化。在秀丽隐杆线虫中，MT束在老年标本中杂乱无章[78]。考虑到以前的报告以及我们的新发现，我们提出，在老年神经元中观察到的MT细胞骨架的变化构成了一种普遍的现象，在灵长类动物和无脊椎动物中很明显。
这里介绍的工作进一步表明，MT在衰老过程中的恶化与自然轴突衰变之间存在因果关系，例如轴突口径的降低和轴突肿胀的形成。我们不仅表明 MT 束损伤先于其他神经元形态学变化，而且降低或增强特定 MT 调节因子的功能足以分别加重或挽救轴突衰变。然而，肿胀的出现可能促进了 MT 缺陷，例如分拆。MT恶化导致轴突扰动的机制尚不清楚。它们可能涉及膜张力和/或轴突膜相关周期骨架的变化，这两者都高度依赖于MT细胞骨架[53,80,81]。例如，MT完整性受损会产生膜张力驱动的不稳定性，导致培养神经元中的轴突珠[53,82,83]。肿胀是否出现在 MT 可能恶化的同一空间位置是具有挑战性的。我们预计肿胀和MT恶化的区域都是动态的[53]，因此，这种相关性研究需要对大脑中的MT和轴突膜进行长期的实时成像。MT 断裂或紊乱区域也可能阻止细胞器沿轴突的运输，导致急性蓄积和肿胀的发展。事实上，在不同物种的老年生物体中经常观察到轴突运输的中断和细胞器沿轴突的异常积累，包括恒河猴、果蝇和 C。秀丽隐杆线虫[10,40,84,85]。在 C.秀丽隐杆线虫，衰老会影响运动蛋白UNC-104的活性，阻止其在轴突中的定位，并使神经回路更加脆弱[84]。我们之前发现，Tau 和 Shot 的缺失同样会影响 UNC-104 向轴突的易位。随着时间的推移，这会导致突触中关键突触蛋白的减少[62]。在我们的模型中，MT 恶化增强了突触衰变和轴突肿胀，这一事实可能表明 T1 神经元的运输能力也随着年龄的增长而下降。
重要的是，我们发现，通过增加特定MT调节因子的功能来保留MTs，我们可以改善衰老轴突的健康（图7，S9，S13和S14），从而坚定地证明 MTs是衰老过程中神经元衰变的重要贡献者，尽管我们不能放弃其他途径导致大脑衰老。事实上，在神经退行性疾病（阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、遗传性感觉自主神经病变）中，观察到轴突MT束显著衰减[25,86–91]。虽然这些疾病如何导致这种改变，以及MT衰变是否与轴突和突触萎缩同时发生仍然是一个悬而未决的问题，但我们的结果表明，MT恶化可能是一个介导因素。衰老被认为是上述神经退行性疾病的共同关键危险因素，也是衰老的常见病变，这些病变包括MT恶化、轴突肿胀、突触碎裂和运输缺陷[10,25,30,31,40,85,92–94].MT 束恶化可能是一种关键的共享机制，如果不加以纠正，可能会引发运输缺陷，可能会影响突触物质（细胞器和蛋白质）在体细胞和末端之间的运动，导致轴突和突触衰变。在这个模型中，年龄会降低MT束的维持效率，最终使轴突致敏，使它们在疾病条件下更加脆弱。
成熟神经元中的MT调节
轴突MT束如何在成熟神经元中和衰老过程中维持，在过去获得的关注有限。我们的微管蛋白：：GFP脉冲追逐实验表明，成熟轴突中的MTs持续更新，可能涉及MT的分解、成核、聚合和修复[24,95]。然而，随着年龄的增长，MT的补充似乎严重减少。因此，观察到的轴突 MT 断裂和 MT 束直径随年龄增长而减小可能是 MT 体积净损失的直接结果，这是由于 MT 不稳定性增加导致 MT 丢失，或 MT 更换速率降低。
我们的研究结果表明，减弱 Tau、EB1 和 spectraplakin Shot 的功能会加剧成年果蝇轴突中与衰老相关的 MT 断裂，这表明了衰老过程中介导 MT 体积损失的机制。这些发现表明，成人轴突中 MT 稳态的调节涉及 Tau、EB1 和 Shot 的功能。Tau 和 Shot 促进 MT 稳定性的能力 [62] 以及 EB1 在促进 MT 聚合动力学和修复受损 MT 轴中的作用 [24,41,96–98] 可能直接影响成熟神经元轴突在衰老过程中 MT 丢失和替换的速度。
随着老化标本中 MT 体积的损失，我们还观察到成熟轴突中杂乱无章的 MT 病灶，其数量通过降低 Tau、EB1 和 Shot 的功能而增加。这种病灶可能是由于Tau蛋白在衰老过程中丢失而导致的MT捆绑减少所致，因为Tau可以通过其投射结构域将MT捆绑在一起[99]。同样，Shot和其他光谱蛋白被提出通过尚不清楚的机制束缚MTs[41,45]。或者，聚合 MT 与皮质肌动蛋白细胞骨架的连锁丢失会导致异常的 MT 延伸到无序和弯曲的构象中，从而导致衰老轴突中的 MT 病灶紊乱。Shot、EB1和Tau在神经元发育中的这种连锁功能中协同作用[29,41,43,45,100]。这种功能似乎在衰老期间仍然是必不可少的，因为我们的数据表明，在衰老过程中，Tau、Eb1 和 Shot 丢失后，这种表型会增加，并且这种表型在表达后得到挽救EGC公司.
我们的研究表明，MT 恶化可能是由于 MT 调节剂（如 Tau 和 EB1）功能的自然年龄依赖性降低。导致这种减少的原因还有待确定，但改变它们的翻译后修饰状态是一种可能的解释[101,102]，或者它们可能受到细胞质ROS或钙变化的影响[103,104]，所有这些都已知在衰老的大脑中发生变化。我们的发现可能再次与衰老的人脑有重要的相似之处，其中Tau的功能和定位也发生了变化[68,105]。
MT细胞骨架作为治疗靶点的价值
在这项工作中，我们表明改善 MT 的健康状况可以阻止衰老过程中的神经元衰变。通过靶向和保护 MT，我们可能能够降低对年龄相关疾病的易感性，例如，通过减少与年龄相关的轴突运输能力下降。使用这种 MT 靶向策略来对抗衰老在其他情况下也可能有益，因为 MT 的可比下降可能发生在其他细胞类型（和/或组织）中。例如，纺锤体形成过程中 MT 动力学的改变是卵母细胞中与年龄相关的染色体分离错误的主要原因。此外，在老年小鼠卵母细胞中观察到的线粒体活性变化与细胞骨架的改变有关，共同可能导致雌性哺乳动物卵母细胞不育症随年龄增长而增加[106,107]。这些都凸显了靶向MTs减缓不同细胞类型衰老过程的潜力。
包括我们的研究在内的几项研究都指出了这种方法的有效性。例如，在脑出血引起的小鼠创伤模型中，通过增加MT的乙酰化来靶向MTs（通常与MT稳定性有关），可以保护轴突和线粒体的转运[108]。此外，使用MT靶向剂（MTA）对MT的操纵已被证明在年龄相关性神经退行性疾病中很有价值，最近的报道强调了MT稳定化合物（如埃博霉素D）在几种tau蛋白病模型中的有益治疗效果[109–111]。然而，MTAs可诱发毒性并引发神经病变等副作用，长期使用可导致耐药性[111]。因此，通过操纵MT结合蛋白修饰MT可能是一种更有前途的替代方法[102,112]。
材料和方法
苍蝇饲养和饲养
本项目使用了以下苍蝇。Gal4 驱动程序系列包括：elav-Gal4 （3RD路染色体，在所有阶段都泛神经元表达;[113]）、GMR31F10-Gal4（Bloomington股票49685;在T1髓质神经元中表达;[48]）、GMR53G02-GAL4（Bloomington股票50446;在T2髓质神经元中表达;[114]）、elav-GS-Gal4（布卢明顿股票 43642）。突变种群：EB1缺乏症Df（2R）Exel6065（EB1Df;布卢明顿股票 7547）、奇科1（布卢明顿股票）。转基因靶向表达的细胞系为UAS-ShotEGC公司-GFP和UAS-EB1-GFP [41]、UAS-GFP-α-微管蛋白84B [115]、UAS-RedStinger（布卢明顿库存84277）和UAS-myr：：td番茄（布卢明顿库存32222）。靶向基因敲低的细胞系为UAS-tau核糖核酸（RNAi） (头GD25023维也纳果蝇RNAi中心，奥地利[116]），UAS射击核糖核酸（RNAi） [117] 和 UAS-EB1核糖核酸（RNAi） (DBP型24451维也纳果蝇RNAi中心，奥地利，[41]）。
对于老化实验，除非另有说明，否则所有苍蝇在29°C的标准糖酵母糖蜜培养基上以低密度（每瓶最多20只苍蝇）陈酿。每3天将实验苍蝇转移到新鲜的小瓶中。本研究使用了相同数量的男性和女性。
对于用于GeneSwitch实验的RU-486药物喂养，苍蝇封闭在补充了指示浓度的RU-486（默克集团M8046）的食物上。对于含有RU-486的食品，使用25mg/ml的100%乙醇储备溶液制备25μg/ml的RU-486水溶液，并将300μl置于每个苍蝇食品瓶的表面上。通过使用300μl最终乙醇浓度相等的溶液生成对照瓶。将小瓶干燥24小时。每3天将实验苍蝇转移到含有RU-486或对照溶液的新鲜小瓶中。
解剖成蝇头
在冰上短暂麻醉标本 1 分 30 秒后，在 Dulbecco 的 PBS （Sigma， RNBF2227） 中对果蝇脑进行解剖。与从用一氧化碳麻醉的苍蝇获得的大脑相比，这种短暂的冰处理显示突触MT没有减少2 (S16 图）。对于实时成像，将解剖的大脑及其层状物和眼睛附着在MatTek玻璃底培养皿（P35G1.5-14C）上的一滴Dulbecco的PBS中，并用垫片覆盖。大脑立即被成像。
为了用活细胞MT探针Sirt-微管蛋白标记MT，将新鲜解剖的大脑在含有Sirt-微管蛋白的Dulbecco培养基中在黑暗中孵育1小时（稀释度为1：100）。如上所述，在Dulbecco的培养基中清洗大脑并安装用于实时成像。
免疫组化
如上所述进行果蝇脑解剖，并在室温（RT）下固定在4%多聚甲醛（PFA;0.05M磷酸盐缓冲液中，pH 7至7.2）中30分钟。对于抗EB1染色，将脑在-20°C下固定10分钟，在+TIP固定中（90%甲醇，3%甲醛，5mM碳酸钠，pH 9;储存在-80°C [43]）。在PBT（含有0.3%Triton X-100的PBS）中洗涤大脑。用PBT进行抗体染色和洗涤。
使用的抗体包括：抗 DmEB1（来自 H. Ohkura 的礼物;兔子，1：2,000;[96]）;抗GFP（ab290，Abcam，1：500）;FITC、Cy3 或 Cy5 偶联的二抗 （Jackson ImmunoResearch）;STAR 580 （Abberior STAR 580） 用于超分辨率。将标本嵌入Vectashield（VectorLabs）中。
显微镜和数据分析
对于所有衰老参数，果蝇大脑在利物浦大学细胞成像中心用 3i 马里亚纳群岛转盘共聚焦显微镜成像，但使用 STED 系统 STEDYCON 或 LSM 900 Airyscan2 的 MT 直径研究除外。
为了测量成年果蝇视叶中的衰老标志（MT 直径除外），如上所述解剖大脑，并立即用 3i 马里亚纳群岛转盘共聚焦显微镜成像。包含 4 个最近端轴突末端的髓质柱部分用于量化 MT、轴突表型和肿胀数量。为了测量Tub-GFP掺入轴突MTs，使用斐济的分段线工具沿着这些轴突绘制一条线，以测量平均强度。为了测量UAS-myr：：tdTomato的强度，使用多边形选择工具在轴突周围绘制一个拟合框，并计算平均强度。为了测量轴突和 MT 核心直径，对脑图像进行定向，以便水平显示髓质轴突投影列。ImageJ 的线工具用于测量轴突及其 MT 核心的直径，位于由网格预先确定的均匀间隔的无偏位置。从多个测量点获得每个轴突的平均值。为了对突触读数进行评分，在延髓的中央部分画了一个正方形，并在刻度内绘制了突触（每个延髓大约 30 到 50 个）。突触MT和形态分类是手动计算的。为了测量突触末梢的面积，使用徒手选择工具在膜周围绘制，用myr：：tdTomato标记。用RedStinger标记的细胞核在Fiji，Image J软件中手动定量。
对于轴突中Tau的像素强度分析，使用Fiji，Image J软件从Z-stacks生成最大投影。使用线工具，每个髓质有 4 个感兴趣区域 （ROI），跨越 8 个轴突束，彼此平行定位。根据 ROI 生成强度直方图，并设置灰度值 >220 的像素强度阈值箱。对高于阈值的峰值进行计数，并取 4 个 ROI 的平均值。对于轴突中 EB1 的像素强度分析，从每个延髓的 2 个区域（上半部分和下半部分）生成来自 6 个堆栈的最大投影。使用 ImageJ 上的“手动绘制”工具选择 10 根髓质轴突柱，并在 EB1 通道中测量平均强度。计算并绘制了每个髓质的平均强度。
MT 结合试验和蛋白质印迹
MT结合试验的进行与先前发表的一样[69,118]。简而言之，对于每个年龄组，将 6 个头均质于 40 μl MT 结合测定缓冲液（100 mM MES （pH 6.8）、500 μm MgSO 4、1 mM EGTA、4 mM DTT、2 mM dGTP、20 μm 紫杉醇、0.1% triton X-100、30 mM NaF、20 mM 焦磷酸钠、40 mM 2-甘油磷酸盐、3.5 mM 原钒酸钠、10 μm 星形孢菌素、 和蛋白酶抑制剂混合物）。匀浆在 4°C 下以 12,000 g 离心 1 小时。 将代表胞质部分的上清液转移到新鲜试管中，同时将代表富集MT结合蛋白的组分的沉淀重悬于20μlMT结合测定缓冲液中。将样品在 Laemmli 缓冲液中在 95°C 下加热 10 分钟，并通过电泳分离。
蛋白质印迹
对于总蛋白水平分析，将头部均质化在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷 RIPA 缓冲液中。在电泳之前，将样品在 95°C 的 Laemmli 缓冲液中加热 10 分钟。对于电泳分离，在电泳缓冲液（25 mM Tris Base、192 mM 甘氨酸、10% w/v SDS）中，在 10% 无染色 SDS-PAGE 凝胶 （BioRad） 中分离提取物，然后转移到硝酸纤维素膜上，然后在室温下封闭在 5% 牛血清白蛋白中 1 小时。 用一抗探测蛋白质，并通过与 HRP 偶联的二抗 （Invitrogen） 孵育进行检测。使用了以下一抗：抗 GAPDH （Thermo Fisher GA1R）、抗 GFP （Abcam 6673）、抗肌动蛋白 （JLA20， MercK）、抗 a-微管蛋白 （T9026， Merck）、抗 DTau （L. Partridge） 和抗 EB1 （H. Ohkura）。发现用作上样对照的 GAPDH 和肌动蛋白水平在年轻和老年标本的头部组织之间没有差异（S17 图）。
阴性地质趋向性测定
在实验前一天，最多将20只苍蝇转移到新鲜培养基瓶中。在实验当天，苍蝇被转移到不使用一氧化碳的刻度小瓶中2.苍蝇有 30 分钟的时间适应新环境。接下来，将苍蝇敲击到小瓶底部，并拍摄它们的行走行为。对于 Gal4/Gal80ts实验，每只苍蝇的位置在15 s后进行注释。对于 GeneSwitch 实验，我们首先确定了对照未处理的苍蝇达到最大步行距离的 2/3 的时间点。建立的时间点用于确定每只苍蝇在这段时间内到达的位置。进行了三次技术复制，包括Gal4/Gal80每种基因型的约220至340只幼蝇和170至290只老蝇tsGeneSwitch 实验中每个基因型和年龄在 330 到 700 之间。
统计分析
在GraphPad Prism 9中使用Mann-Whitney秩和检验进行统计分析（表示为P兆瓦），通过 Kruskall-Wallis 方差分析多重比较检验或 Chi2（P池），具有 95% 置信区间。确切的 p 值在图表中表示，确切的样本量和其他统计值在 S1 表的表 A 至 Q 中表示。
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随着年龄的增长，果蝇视觉系统内的神经元广泛恶化。
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S1 图。 随着年龄的增长，果蝇视觉系统内的神经元广泛恶化。
(A 和 B）来自年轻（5-7 天，A）和老年标本（28-30 天，B）的视叶髓质内 L2 神经元的轴突和末端，用质膜标记物 myr-Tom （myr） 标记。在老化的标本中，轴突显示变薄（箭头）和肿胀（星号;虚线蓝色框显示为下面的 1.7 倍放大图像）。A 和 B 的比例尺可以在 A 右下角 = 10 μm 中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s001
（TIF）
S2 图。 在衰老过程中，T1神经元中没有神经元死亡。
(A） 用细胞核标记物 RedStringer（品红色）和 GFP 标记的 α-微管蛋白（绿色）标记的 T1 神经元。蓝色虚线框在下面的插图中显示为 2 倍放大图像。（B） 对不同年龄用 RedStinger 标记的细胞核进行定量，以确定 T1 神经元的数量。数据显示为每个髓质细胞核的平均± SEM，单个数据点为蓝色;图中显示了使用 Kruskall-Wallis 方差分析检验获得的不同条件下的 p 值。有关详细的统计值和基因型，请参阅 S1 表中的表 B。所有单个值都在 S1 数据点中提供。比例尺 A = 30 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s002
（TIF）
S3 图。 T1神经元在衰老过程中的恶化与温度和标志物表达无关。
（A-D）使用 UAS/Gal4/Gal80 用质膜标记物标记的苍蝇髓质中的 T1 轴突（顶部）和突触末梢（底部）ts系统。基因表达是由温度从18°C到29°C的变化诱导的。 苍蝇在整个发育和成年期保持在 18°C 下，直到成像前的最后 4 天，此时它们被转移到 29°C 以诱导 myr-Tomato 基因表达。将幼年标本（A和C;4-7天大的苍蝇，在18°C下“关闭”+在29°C下“打开”下4天）与老标本（B和D;57-60天大的苍蝇在18°C下“关闭”+29°C下4天“打开”下53-56天）。在老化的标本中，轴突显示变薄（箭头）和肿胀（星号），而突触末梢显示肿胀和分解（箭头和虚线蓝色框显示为下图插图中的 3 倍放大图像）。（E） A-D 中显示的表型的量化，X 轴上表示年轻与年老。在前 2 个图表中，数据点以蓝色显示，并以 SEM ±平均条显示（通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值如上所示）。对于终末形态，数据显示为正常突触与肿胀/破裂突触的分布（通过上述卡方检验获得的显著性）。数据取自每个年龄组至少 5 个标本。有关详细的统计值和基因型，请参阅 S1 表中的表 C。所有单个值都在 S1 数据点中提供。A 中的比例尺表示所有图像中的 20 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s003
（TIF）
S4 图。 老化过程中 MT 变化的额外示例。
(A） 用 GFP 标记的 α-微管蛋白（倒灰度）标记的 MT 束，来自不同年龄组的 T1 神经元轴突：年轻（6-10 天大）或老年（29-31 或 38-42 天）。与正常/完整的 MT 延伸（蓝色箭头）相比，老年苍蝇显示 MT 解束（箭头）以及 MT（白色箭头）的断裂和变薄。（B） 来自 T1 神经元轴突的 MT 束，来自用 GFP 标记的 α-微管蛋白（tub，品红色）和质膜标记物 myr-Tom（myr，绿色）标记的标本，在 19-23 天的标本中显示 MT 解束（箭头）。在这项研究中量化的典型轴突肿胀的例子（蓝色箭头）可以在 29-31 天大的标本中观察到。在 5-10 日龄时，20% 的肿胀包含未束的杂乱无章的微管;在 19-23 岁时，21%，在 29-31 岁时，40%，在 38-42 岁时，56% 的肿胀含有松散的紊乱的微管。比例尺 = 4 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s004
（TIF）
S5 图。 随着年龄的增长，轴突内的 MT 束会变薄。
(A 和 B）使用Airy扫描高端共聚焦显微镜（A）或STED超分辨率显微镜（B）对α来自年轻（8-10天龄）和老年（34-36天龄）标本的T1神经元的MT轴突束进行成像。（C 和 D）使用这两种成像技术获得的图像已用于量化 MT 束的直径（C 用 Airy 扫描，D 用 STED 扫描）。结果以平均± SEM 表示，单个数据点以蓝色显示。每个图中都显示了使用 Mann-Whitney 检验获得的 P 值。从每个年龄组至少 13 个标本中获取数据点，用于 Airy 扫描，从 3 个标本中获取 STED。有关详细的统计值和基因型，请参阅 S1 表中的表 D。所有单个值都在 S1 数据点中提供。A 中的比例尺表示 4 μm，B 中的比例尺表示 0.5 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s005
（TIF）
S6 图。 老化过程中的 MT 改变与 MT 报告基因表达无关，并且对老化标本具有特异性。
(A-D）苍蝇髓质中的 T1 轴突（A 和 B）和突触末梢（底部和 D），其 MT 用 GFP 标记的 α-微管蛋白（微管蛋白，灰度图像和插图中的绿色）和质膜标记物 myr-Tom（myr，洋红色），使用 UAS/Gal4/Gal80ts系统。基因表达是由温度从18°C到29°C的变化诱导的。 果蝇在整个发育和成年过程中保持在 18°C 下，直到成像前的最后 15 天，此时它们被转移到 29°C 以诱导基因表达（使用 15 天表达来实现足够的 MT 标记）。将年轻标本（A和C;15-17日龄的苍蝇在18°C下“关闭”+在29°C下“打开”下15天）与老标本（B和D;69-71天大的苍蝇在18°C下“关闭”+ 29°C下15天“打开”）进行比较。在 A 和 B 中，青色圆圈的盒子在下面放大了 3.7 倍，老苍蝇在 B 中显示，与年轻的轴突相比，MT 的解束（B 中的插图 1 和 2）以及 MT 的断裂和变薄（B 中的插图 3 和 4）。（D） 与 C 中的年轻对照组相比，老苍蝇在突触末梢中张开的 MT 也有所减少（框框区域显示为 2 倍放大的插图）。（E） A-D中显示的表型的量化，X轴上表示年轻与年老;数据点显示为蓝色圆圈，SEM±均值显示;通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值如上所示。数据取自每个年龄组至少 5 个标本。有关详细的统计值和基因型，请参阅 S1 表中的表 E。所有单个值都在 S1 数据点中提供。比例尺 = 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s006
（TIF）
S7 图。 MT 的 Tau-GFP 和 EB1 本地化。
(A） 来自 5-7 天大标本的髓质轴突区域，用内源性 GFP 标记的 Tau（彩色图像中的绿色和倒灰度图像）和活细胞 MT 探针 Sirt-微管蛋白（彩色图像和倒灰度图像中的洋红色）标记，显示 Tau 与 MT 的共定位（A 中的箭头）。（B） 来自 3 至 5 天龄标本的延髓轴突区域，用抗 EB1 标记（彩色图像中的绿色和倒灰度图像中）并在 T1 神经元中表达 GFP 标记的 α-微管蛋白（彩色图像中的洋红色和倒灰度图像中的洋红色）显示 EB1 信号共定位到 T1 MT（B 中的箭头）。比例尺 A = 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s007
（TIF）
S8 图。 由 EB1、Tau 和 Shot 丢失引起的与年龄相关的 MT 衰变和老化标志的例子。
(A-D）用GFP标记的α-微管蛋白（微管蛋白，灰度和洋红色）和质膜标记物myr-Tom（myr，插图中的绿色）标记的28-30天龄果蝇髓质中T1轴突的代表性图像。不存在 （A） 或存在 Tau 敲低 （Tau核糖核酸（RNAi）in B）、Shot knockdown （Shot核糖核酸（RNAi）C）和缺乏杂合背景下的EB1敲低（EB1核糖核酸（RNAi）;DBP型+/Df在 D）。上述 MT 调节因子的敲除增强了衰老神经元的表型，包括轴突肿胀，通常显示 MT 解束（箭头）和 MT 断裂（星号）;盒装区域显示为下面放大的 2 倍双/单通道图像。盒装区域显示为下面放大的 2 倍双/单通道图像。比例尺 A = 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s008
（TIF）
S9 图。 衰老过程中突触末梢的恶化可以通过改变MT调节剂的功能来加剧或挽救。
(A-D）来自旧标本（28-30 天 A 和 C;29-31 天 B 和 D）的 T1 髓质突起的末端，质膜用 myr-Tom （myr） 标记，其 MT 用 GFP 标记的 α-微管蛋白 （A-C） 或 GFP 标记的 ShotEGC公司突触末端的老化表型，包括突触 MT（箭头）的减少和断裂和肿胀的末端（星号）的增加，在 Tau 和 Shot 敲低（Tau核糖核酸（RNAi）拍摄核糖核酸（RNAi）在 C）。相同的衰老表型被 Shot 的表达抑制EGC公司（四）项（五）A 至 D 中显示的表型的定量以及 EB1 异位表达的条件。具体条件在 X 轴下方标明。在上面的图表中，数据点显示为蓝色圆圈，SEM±均值显示;通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值如上所示。对于末端形态，数据表示为正常突触与肿胀/破裂突触的分布;通过卡方检验获得的显著性如上所示。数据取自每组至少 14 个标本。有关详细的统计值和基因型，请参阅 S1 表中的表 J。所有单个值都在 S1 数据点中提供。A 中的比例尺表示 A-D 中的 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s009
（TIF）
S10 图。 MT 衰变和老化标志在具有 EB1、Tau 和 Shot 敲低的年轻标本中不存在。
(A 和 B）用GFP标记的α-微管蛋白（微管蛋白，灰度和洋红色）和质膜标记物myr-Tom（myr，插图中的绿色）标记的3-7天龄果蝇髓质中T1轴突的代表性图像。图像显示不存在 （A） 或存在 Tau 和 Shot 组合敲除 （Tau核糖核酸（RNAi） 拍摄核糖核酸（RNAi）在 B）。MTs轴突束保持其直径和组织，轴突在存在敲除的情况下没有肿胀和直径减小的区域;盒装区域显示为下面放大的 2 倍双/单通道图像。（C） A 和 B 中所示表型的定量以及 Tau 进一步敲低的条件（Tau核糖核酸（RNAi））， Shot （射击核糖核酸（RNAi））和EB1杂合背景中的EB1（EB1核糖核酸（RNAi）;DBP型+/Df);具体的击倒在 X 轴下方指示。数据点显示为蓝色圆圈，SEM±均值显示;通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值如上所示。数据取自每个年龄组和条件至少 13 个标本，但 Shot 的 8 个标本除外。有关详细的统计值和基因型，请参阅 S1 表中的表 K。所有单个值都在 S1 数据点中提供。盒装区域显示为下面放大的 2 倍双/单通道图像。比例尺 A = 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s010
（TIF）
S11 图。 具有 EB1、Tau 和 Shot 单次击倒的年轻标本示例。
(A、D）用GFP标记的α-微管蛋白（微管蛋白，灰度和洋红色）和质膜标记物myr-Tom（myr，插图中的绿色）标记的5-8天龄果蝇髓质中T1轴突的代表性图像。图像显示年轻标本在不存在 （A） 或存在 Tau 敲除 （Tau核糖核酸（RNAi）in B）、Shot knockdown （Shot核糖核酸（RNAi）在 C 中）和缺陷杂合背景 （EB1核糖核酸（RNAi）;DBP型+/Df在 D）。在存在敲除的情况下，MTs轴突束的直径和组织没有改变，轴突没有肿胀，其直径保持不变;盒装区域显示为下面放大的 2 倍双/单通道图像。A 中的比例尺表示所有图像中的 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s011
（TIF）
S12 图。 拍摄EGC公司MT 的本地化。
(A） 来自表达 GFP 标记的 Shot 的 5-7 天大标本的髓质轴突区域EGC公司片段和 T1 神经元中的质膜标记物 myr-Tom （myr），并用活细胞 MT 探针 Sirt-Tubulin（红色 Myr，ShotEGC公司绿色和微管蛋白苏尔特在蓝色中，单个通道显示在倒置的灰度图像中）。拍摄EGC公司共定位到 MT 的轴（一些示例用箭头表示）。比例尺 A = 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s012
（TIF）
S13 图。 EB1 的表达可改善轴突衰老表型。
(A-F）髓质中的 T1 轴突用质膜标记物 myr-Tom（myr，A 和 B 中的灰度，标本年龄在 35 至 38 天之间）或用 GFP 标记的 α-微管蛋白（微管蛋白，标本年龄在 26 至 28 天之间）标记。在老标本中可以观察到衰老表型，包括轴突肿胀（A 中的箭头）、轴突变薄（A 中的插图）、MT 解束（C 中的插图）和稀疏的突触 MT（E 中的插图），但在 EB1 的 T1 特异性表达中不存在 （B， D， F）。A-D 中的比例尺表示 10 μm，E 和 F 中的比例尺为 14 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s013
（TIF）
S14 图 Shot 的发育后表达EGC公司但 EB1 不足以挽救所有轴突衰老表型。
(A-C）27-33 天龄的老标本髓质中的 T1 轴突控制大脑 （A），过表达 EB1 （B） 或 ShotEGC公司（C）. 大脑用质膜标记物 myr-Tom（myr，A-C 中的灰度图像和双通道图像中的绿色）和 MT 标记物 GFP 标记的 α-微管蛋白，在 A 和 B 中，或 GFP 标记的 ShotEGC公司在 C 中（两者的 MT 和双通道图像中的洋红色）。使用 UAS/Gal4/Gal80ts系统，发育后通过将新封闭的果蝇从 18°C 转移到 29°C 来诱导基因表达。 衰老表型包括轴突肿胀、轴突变薄 （A）、MT 变薄（A 中的盒区 1）和 MT 解束（A 中的盒区 2）可以在发育后过表达 EB1 的标本中观察到，但在 Shot 的发育后表达中不存在EGC公司在成人 T1 神经元中（A 和 B 与 C 相比，框区 1 和 2 显示为 2 倍放大插图，MT 在 A 和 B 中用 GFP 标记的 α-微管蛋白标记，或 GFP 标记的 ShotEGC公司在 B）。（C） A 和 B 中所示的旧标本中表型的定量，以及 C 中旧标本中 EB1 发育后表达的条件（27-33 天龄）。具体条件在 X 轴下方标明;数据点显示为蓝色圆圈，SEM±均值显示;通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值如上所示。数据取自每组至少 23 个标本。有关详细的统计值和基因型，请参见 S1 表中的表 M。所有单个值都在 S1 数据点中提供。盒装区域显示为下面放大的 2 倍双/单通道图像。A 中的比例尺表示 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s014
（TIF）
S15 图。 老年苍蝇运动能力的下降改善了成年苍蝇的表达EGC公司.
(A） 在窄量筒中允许苍蝇向上行走 15 秒的负趋向性行走试验的表示。（B） 量化苍蝇在 15 秒内在 2 个不同年龄（4-5 天和 25-26 天）行走的距离。具体条件在 X 轴下方标明，包括控制苍蝇或表示 Shot 的苍蝇EGC公司或成年期的 EB1，使用 UAS/Gal4/Gal80 的泛神经元 elav-Gal4 驱动程序ts系统（通过将新孵化的果蝇从 18°C 转移到 29°C 来诱导发育完成后诱导基因表达，对照组用相同的方案处理但缺乏转基因）。数据点显示为蓝色圆圈，± SEM 的平均值显示，通过 Kruskall-Wallis 方差分析多重比较检验获得的 P 值显示在图中。数据取自每组至少 140 个标本。有关详细的统计值和基因型，请参阅 S1 表中的表 O。所有单个值都在 S1 数据点中提供。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s015
（TIF）
S16 图。 冰/冷和 CO 对 T1 MT 的影响比较2基于解剖前的麻醉治疗。
（A 和 B）带有 GFP 标记的 α-微管蛋白（微管蛋白）标记的 MT 的突触末端，来自 4-7 天大的标本，这些标本已麻醉 90 秒，通过在冰上孵育 （A） 或暴露于 CO2（B）（方框区域显示为 2 倍放大插图）。（C） 从 A 和 B 中显示的类似图像中量化突触 MT，并在 X 轴下方指示麻醉治疗类型;数据点显示为蓝色圆圈，SEM±均值显示;通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值。有关详细的统计值和基因型，请参阅 S1 表中的表 P。所有单个值都在 S1 数据点中提供。比例尺可以在左下角的 A 中找到（A 和 B，10 μm）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s016
（TIF）
S17 图。 上样对照蛋白 Gapdh 和 Actin 的水平在衰老过程中不会改变。
比较了年轻（29°C下4-9天）和老年（29°C下29-32天）标本中蛋白质印迹中总Gapdh和肌动蛋白相对于总蛋白的定量，表明年轻和年老之间没有显着差异。这些图表描绘了代表独立裂解物的数据点，以及 SEM ±均值条;通过 Mann-Whitney 检验获得的 p 值。对于每个实验，值已归一化为相应的年轻人。有关详细的统计值和基因型，请参阅 S1 表中的表 Q。所有单个值均在 S1 数据点中提供，所有蛋白质印迹都可以在 S1 蛋白质印迹中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s017
（TIF）
S1 表。 收集表格，包括基因型和相应的统计细节。
本研究中所有资格的统计细节和特定基因型都可以在此表格集中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s018
（PDF格式）
S1 数据点。 用于统计分析的基础数据点。
所有定量分析的所有数据点都可以在此 excel 中找到。不同图形的值可以在 excel 文件底部的不同工作表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s019
（XLSX）
S1 蛋白质印迹。 图 5 和 S16 中用于统计分析的基础蛋白质印迹。
图 5 和 S16 中用于定量的蛋白质印迹汇编。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002504.s020
（PDF格式）
确认
我们感谢利物浦大学成像设施的帮助。感谢 Hiro Ohkura 提供 DmEB1 抗体。我们感谢安德烈亚斯·普罗科普（Andreas Prokop）对这份手稿提出的建设性意见。本研究使用了从布卢明顿果蝇种群中心（NIH P40OD018537）和维也纳获得的种群。
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