厦门免费医学论文发表-多磷酸激酶调节 E 饥饿期间的 LPS 结构和多粘菌素抗性。大肠杆菌

抽象

多磷酸盐 （polyP） 是无机磷酸盐链，长度可达 1,000 多个残基。在大肠杆菌中，息肉由息肉激酶 （PPK） 产生，被认为在细胞应激反应期间起保护作用。然而，受 PPK 活性和 polyP 积累影响的分子途径仍然表征不佳。在这项工作中，我们使用无标记质谱法研究了饥饿期间不能产生polyP（Δppk）的细菌的反应，以确定PPK调控的新途径。为了应对饥饿，我们发现 92 种蛋白质在野生型和 Δppk 突变细胞之间显着差异表达。野生型细胞富集了与氨基酸生物合成和转运相关的蛋白质，而 Δppk 突变体富集了与翻译和核糖体生物发生相关的蛋白质，这表明如果没有 PPK，即使没有所需的构建块，细胞仍然无法适当地为生长做好准备。从我们的数据集来看，我们对 Arn 和 EptA 蛋白特别感兴趣，与野生型对照相比，它们在 Δppk 突变体中下调，因为它们在与多粘菌素耐药性相关的脂质 A 修饰中发挥作用。使用蛋白质印迹，我们确认了这些和相关蛋白在 K-12 菌株和尿路致病菌株中的差异表达，并提供证据表明 Δppk 细胞中的这种错误调节源于饥饿期间未能诱导 BasRS 双组分系统。我们还表明，无法上调 Arn 和 EptA 表达的 Δppk 突变体在脂质 A 上缺乏相应的 L-Ara4N 和 pEtN 修饰。与这一观察结果一致，ppk 的缺失恢复了携带组成型活性 basR 等位基因的耐药菌株的多粘菌素敏感性。总体而言，我们显示了 PPK 在饥饿期间脂质 A 修饰中的新作用，并为靶向 PPK 以使细菌对多粘菌素治疗敏感提供了基本原理。我们进一步预计，我们的蛋白质组学工作将为对PPK影响的各种途径感兴趣的研究人员提供重要资源。

数字

图4图1图2图3图4图1图2图3

引文： Baijal K， Abramchuk I， Herrera CM， Mah T-F， Trent MS， Lavallée-Adam M， et al. （2024） 多磷酸激酶调节 E 饥饿期间的 LPS 结构和多粘菌素抗性。大肠杆菌。PLoS 生物学 22（3）： 编号：E3002558。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558

学术编辑： Sebastian E. Winter，德克萨斯大学西南分校：美国德克萨斯大学西南医学中心

收到： 2023年8月9日;接受： 2024年2月21日;发表： 3月 13， 2024

版权所有： ? 2024 Baijal et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 评估本文结论所需的所有数据都包含在论文和/或补充材料中。未裁剪的印迹和图像可以在S1_Raw_Images中找到。这项工作中使用的细菌菌株和质粒可以由唐尼实验室提供。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴存储库存入ProteomeXchange联盟，数据集标识符为PXD043566。

资金： 这项工作由加拿大卫生研究院（https://cihr-irsc.gc.ca/）资助，授予医学博士和MLA的资助号为PJT-174987，以及加拿大自然科学与工程研究委员会（https://www.nserc-crsng.gc.ca/）对MLA的发现资助。I.A.的部分资金来自加拿大自然科学与工程研究委员会的加拿大研究生奖学金。特伦特实验室得到了美国国立卫生研究院 （https://www.nih.gov/） AI50098、AI38576 和 AI174416 的资助。资助者在实验设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

缩写： AGC， 自动增益控制;国际舞蹈委员会， 碰撞诱导的解离;罗斯福 错误发现率;去 基因本体论;GSEA， 基因集富集分析;LPS， 脂 多糖;PPK， 多磷酸激酶;RT-qPCR， 逆转录酶定量PCR;三氯酸， 三氯乙酸;柚茶， 四乙基溴化铵;薄 薄层层析

介绍

多磷酸盐（polyP）是无机磷酸盐的均聚物，通过高能磷酸酐键连接在一起。尽管息肉存在于从细菌到人类的各种生物体中，但其细胞内浓度和产生机制差异很大[1–3]。在大肠杆菌（E.coli），polyP由多磷酸激酶（polyphosphate kinase，PPK）合成，并被胞外多磷酸酶PPX降解[1]。一般来说，E.大肠杆菌在营养丰富的培养基中进行对数生长时几乎不会产生可检测的息肉[4]。然而，为了应对多种细胞应激源，包括暴露于次氯酸（漂白剂）[5]、热休克[6]和营养饥饿[7]引起的氧化应激，PPK使用ATP作为共底物[1]快速合成polyP。这种应激诱导的息肉群体与蛋白质折叠和周转[5,6]、转录[8,9]和翻译控制[10]以及细菌异染色质的调节[11]有关。在某些情况下，息肉被认为通过直接与蛋白质靶标相互作用来调节其活性来赋予这些变化。例如，营养物质下移过程中产生的息肉与Lon蛋白酶相互作用，将其活性引导至ADP结合的DnaA和核糖体蛋白的降解[12\u201214]。总的来说，这些途径抑制 DNA 复制，同时增加细胞内氨基酸库以帮助 E。大肠杆菌适应不断变化的条件[12,14]。息肉还可以通过螯合阳离子发挥作用，例如，作为芬顿反应的抑制剂，其中铁催化活性氧的形成[15]。大肠杆菌 ppk 突变体（例如 Δppk）对细胞应激的敏感性增加 [5,6,16]，运动性 [17]、生物膜形成 [16] 和毒力降低 [18–20]。虽然这些表型背后的分子事件并不总是已知的，但PPK酶在细胞应激期间作为生存调节剂的作用在整个细菌王国中是保守的。值得注意的是，除了合成polyP外，PPK酶还可以使用polyP作为供体底物来催化核苷二磷酸的磷酸化[21]，尽管这些功能在多大程度上有助于抗应激尚不清楚。

致病性E的PPK状态。在小鼠感染模型中，大肠杆菌是传染性的重要调节因子[18,22]。有人认为，息肉是由E释放的。大肠杆菌可能在巨噬细胞的重编程中发挥重要作用，这可能涉及息肉与细胞膜上的宿主受体相互作用或进入宿主细胞[18]。PPK也被提出作为各种细菌感染的新靶点[16,23]。值得注意的是，美沙拉嗪是一种用于治疗溃疡性结肠炎和克罗恩病的药物，在体外抑制PPK酶，并可减少氨苄西林耐药的尿路致病性E持久细胞的形成。大肠杆菌以PPK依赖性方式存在[16]。追求 PPK 作为有效的治疗靶点需要彻底了解 PPK 如何在系统范围内影响细菌应激反应。

为了更好地了解 PPK 和 polyP 在细菌应激反应中的作用，我们使用无标记蛋白质组学来鉴定 Δppk 突变细胞中相对于野生型 MG1655 K-12 对照中上调或下调的蛋白质，当 polyP 水平高时，这些蛋白质经历了长时间的饥饿。我们报告说，突变的 Δppk 细胞无法上调氨基酸生物合成所需的途径，而是富集用于与核糖体生物发生相关的过程。在后续工作中，我们显示了PPK在脂质A修饰中的作用，脂质A是革兰氏阴性菌细胞表面脂多糖（LPS）的脂质锚[24]。我们证明，在饥饿期间，PPK 是表达 EptA 和 Arn 蛋白所必需的，以及它们各自的磷酸乙醇胺 （pEtN） 和 4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖 （L-Ara4N） 脂质 A 修饰，以及上游 BasRS 双组分系统的表达。在抗生素耐药菌株背景下，缺乏ppk的细胞对阳离子抗菌肽多粘菌素B的敏感性增加，我们的工作为研究息肉的分子功能提供了新的资源，并为PPK抑制如何在临床上得到最好的利用提供了新的见解。

结果

野生型对照和 Δppk E 之间的蛋白质组学差异。营养匮乏时的大肠杆菌

我们使用无标记质谱分析来比较野生型 MG1655 K-12 和 Δppk 突变体在从 LB 转向 MOPS 最小培养基后蛋白质组学差异（图 1A）。在细菌息肉领域，通常使用从富含营养的培养基向MOPS最小培养基的转变来触发息肉积累[4,25,26]。在用于分析的 3 小时时间点，野生型细胞的所有 5 个重复都显示 polyP 的积累，而 Δppk 突变体没有（S1 图）。质谱数据的生物信息学分析共发现 1,909 种蛋白质，其中 78 种在两种条件下表达显著差异（错误发现率 （FDR） 调整的 p 值< 0.05）（图 1B 和 S1 表）。此外，14 种蛋白质被归类为全有或全无（在 Δppk 突变细胞的 0 个重复中检测到，但在野生型细胞的所有 5 个重复中检测到，反之亦然）（图 1C 和 S1 表）。我们使用蛋白质印迹法确认了 7 个热门命中中 6 个（ArnB、ArnC、MetE、YbdL、YeaG 和 OtsA）的表达差异，验证了数据集的整体高质量（图 1D）。只有 RaiA-3Flag 在靶向蛋白质印迹实验中未能确认，重复之间的结果不一致。

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图 1. 应激期间 Δppk 细胞的广泛蛋白质组学变化。

（A） 蛋白质组学分析的实验装置。细胞在LB培养基中生长至中指数期，然后转移到MOPS最小培养基（0.1mM K2HPO公司4，0.4%葡萄糖）3 h诱导氨基酸饥饿和息肉积累。该实验使用 n = 5 个生物学重复进行。（B） 显著差异表达蛋白的火山图（log2（倍数变化 Δppk/WT））。红色和蓝色分别是野生型和 Δppk 菌株中显着上调的蛋白质（FDR 调整的 p 值 < 0.05）。（C） 气泡图显示仅在野生型细胞或 Δppk 突变体中检测到的“全有或全无”蛋白。数据表示每种条件下 5 个生物学重复的原始蛋白质谱计数。（D） 选择质谱数据的确认。染色体 C 末端 3Flag 标记的菌株在用于质谱分析的相同条件下生长。使用 12%（用于 YbdL-3Flag）和 10%（用于所有其他蛋白质）SDS-PAGE凝胶分离蛋白质提取物，转移到PVDF膜上，并使用抗Flag抗体进行探测。图像代表了 ≥3 实验的结果。（E） 在质谱分析鉴定的差异表达和“全有或全无蛋白”中显着富集的 GO 术语。（F） 基于GSEA的野生型和Δppk突变细胞的GO术语被认为具有差异表达。图 1B、1C 和 1E 的基础数据可在 S1 数据中找到。FDR，错误发现率;GO： 基因本体论;GSEA，基因集富集分析。

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Varas及其同事之前的工作使用质谱法比较了营养丰富的LB培养基中野生型对照和Δppk突变体的蛋白质组[27]，其中没有可检测到的息肉积累[4,28]。在那里，作者在Δppk细胞中发现了60种上调的蛋白质和32种下调的蛋白质[29]。这些差异表达的蛋白质与我们工作中描述的数据集之间的重叠很差（S2表）。这表明，与在LB培养基中生长的细菌相比，经历压力的细菌之间存在巨大的蛋白质组学差异，并且我们的工作揭示了PPK和polyP在饥饿期间蛋白质组调控中的独特作用。

我们对显著差异表达和全有或全无的蛋白质（共 92 个）进行了基因本体 （GO） [30] 富集分析，并鉴定了 16 个富集的 GO 术语（FDR 调整的 p 值< 0.05）（图 1E）。这些术语包括与氨基酸、有机酸和小分子生物合成相关的术语。接下来，我们对 1,909 种蛋白质的整个数据集使用基因集富集分析 （GSEA） [31] 来寻找在野生型细胞和 Δppk 突变体之间差异表达的 GO 术语。该分析表明，野生型细胞富含与氨基酸生物合成和转运相关的蛋白质（图1F）。相反，Δppk 突变细胞富集了与核糖体生物发生和翻译广泛相关的蛋白质（图 1F）。我们还在数据集中检索了严格反应的关键调节因子，这是一种由营养饥饿激活并由警报素四磷酸鸟苷（ppGpp）和五磷酸鸟苷（pppGpp）介导的应激信号系统，统称为（p）ppGpp[32]。值得注意的是，我们没有观察到参与（p）ppGpp合成的蛋白质（如RelA、SpoT和GppA[33]）或其他调节因子（如DksA[34]和RplK[35]）在野生型和Δppk突变体之间的显著差异表达。无论如何，这些数据指向一个模型，其中 Δppk 突变体无法通过保持生长准备来正确响应饥饿，同时未能激活途径以增加氨基酸和为此目的所需的其他生物分子的可用性。根据这一解释，息肉与Lon蛋白酶相互作用，促进核糖体蛋白（包括S2、L9和L13）以及类核蛋白（如HupA、HimA（IhfA）和翻译延伸蛋白InfC）的降解[12,36]。有人提出，这种降解是为了提供游离氨基酸，以便在饥饿期间进行靶向翻译[12]。与这些数据一致，与野生型对照相比，我们在 Δppk 突变体中检测到 30S 核糖体蛋白 S7 和 S8 的显着上调（图 1B 和 S1 表）。总体而言，我们的工作表明，PPK是及时应对MOPS引起的饥饿所必需的。

缺乏氨基酸不能解释 Δppk 突变表型

与 Δppk 突变体（33% 的显着差异表达蛋白，S1 表）相比，我们检测到野生型对照中许多氨基酸生物合成和结合酶的上调。我们想知道缺乏可用的氨基酸是否可以解释在我们的实验中观察到的表型和蛋白质组学差异。与在MOPS培养基中生长的野生型细胞相比，Δppk突变体的生长速率和最大细胞密度降低（图2A-2C）。我们发现 Δppk 细胞在滞后期也有显着增加（图 2D）。添加0.05%氨基酸的MOPS培养基改善了两种菌株的生长参数，但生长速率和滞后期的差异仍然存在（图2B和2D）。即使添加了 10 倍的过量氨基酸 （0.5%），ppk 突变导致的生长速率缺陷仍然存在（图 2B）。在蛋白质水平上，向 MOPS 培养基中添加氨基酸可增加 YbdL-3Flag 的表达，而野生型细胞中 MetE-3Flag、YeaG-3Flag 和 OtsA-3Flag 的表达略有增加（图 2E）。然而，在 Δppk 突变体中，氨基酸的添加未能将蛋白质表达恢复到未经处理的野生型细胞中的水平（图 2E）。总之，这些数据表明，虽然氨基酸缺乏可能导致Δppk突变细胞的某些表型，但它们不太可能解释在我们的蛋白质组学数据集中观察到的广泛蛋白质失调。相反，我们假设野生型细胞通过调节多种途径的表达来比 Δppk 细胞更迅速地响应 MOPS 诱导的应激。蛋白质差异可能源于转录或翻译的变化，或蛋白质稳定性的变化。对这些不同途径的研究将揭示对 PPK 和 polyP 作用模式的新见解。

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图 2. 氨基酸缺乏对Δppk突变体生长和蛋白质组调控的影响。

（A） 野生型和 Δppk 突变细胞在未添加 0.05% 或 0.5% 氨基酸的 MOPS 培养基中生长。细胞在LB至中指数期生长，然后稀释至0.1OD600在MOPS最小培养基中，不存在或存在0.05%或0.5%氨基酸。使用 BioscreenC 酶标仪（37°C，振荡，波长 600 nm）监测生长。误差线表示 3 个生物学重复的平均值的标准偏差。对于标准偏差小于符号本身大小的数据点，不显示误差线。（B-D）氨基酸对野生型和Δppk突变体生长动力学的影响。生长速度 （OD600/min） （B），最大外径600图2A所示生长曲线的（C）和滞后时间（分钟）（D）测量值使用GrowthRates 6.2（贝灵厄姆研究所）计算。显示具有标准差的平均值。， p < 0.0001;p < 0.001，n.s.，通过双向方差分析和 Tukey 事后分析不显著。图 2A-D 的基础数据可以在 S2 数据中找到。（E）补充氨基酸对显著差异表达蛋白表达的影响。将细胞在LB中生长至指数中期，然后在存在或不存在0.05%氨基酸的情况下转移到MOPS最小培养基中3小时。使用12%SDS-PAGE凝胶分离蛋白质提取物，转移到PVDF膜上，并使用抗Flag抗体进行检测。图像代表了 ≥3 实验的结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.g002

PPK在调节脂质A修饰所需蛋白质的表达中发挥作用

我们对蛋白ArnB、ArnC和EptA很感兴趣，它们仅在野生型对照中检测到，而在Δppk突变体样本中未检测到，因为它们在与阳离子抗生素耐药性相关的通路中起作用[24,37–39]。Arn蛋白（ArnA、B、C和D）在内膜的细胞质侧合成L-Ara4N修饰的供体底物，即十一烯基磷酸-L-Ara4N[38–40]（图3A）。然后通过ArnE和ArnF将十一烯基底物翻转过膜[41]（图3A）。然后，糖基转移酶ArnT将L-Ara4N从不十一烯基供体转移到内膜周质面LPS的脂质A结构域[42]（图3A）。与ArnT一样，负责pEtN修饰的EptA活性位点位于周质中[43]（图3A）。最后，pEtN和L-Ara4N修饰的脂质A都通过LPS转运系统转运到外膜[44]。有关该通路的更多信息，请参阅Whitfield和Trent的综述[45]。

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图 3.

（A） PPK 在饥饿期间正向调节 BasRS 转录回路。（A） Arn 和 EptA 催化的脂质 A 修饰 E 示意图。大肠杆菌。ArnA、ArnB、ArnC、ArnD 合成供体底物 （Und-P-α-LAra4N）。ArnE 和 ArnF 翻转供体底物并将其转运到 ArnT。ArnT 和 EptA 将它们各自的修饰转移到新合成的脂质 A 分子上。请注意，pEtN 和 L-Ara4N 显示为单个修饰，但含有 2 个部分（总）pEtN 和/或 L-Ara4N 的双重修饰物质也是可能的。（B-D）MOPS 饥饿 3 h 后 EptA-3Flag （B）、ArnA-3Flag （C） 和 ArnT-3Flag （D） 的表达。使用SDS-PAGE分离提取的蛋白质样品，转移到PVDF中，并使用抗Flag抗体进行检测。请注意，标记引起的极性效应可能会影响野生型和突变型菌株背景中的 eptA 调控和可视化表达。（E） 镁（Mg）示意图2+）和铁（Fe3+） 依赖性诱导 arnBCADTEF 和 PhoPQ 和 BasRS 双组分系统进行 eptA 转录。（F） MOPS 饥饿后的 BasS-3Flag 和 BasR-3Flag 表达。从指定的菌株中提取蛋白质并如上所述进行分析。（G） 在 MOPS 最小培养基中生长过程中野生型和 Δppk 突变体中 arn、eptA 和 bas 基因的 RT-qPCR 测量。对在LB中生长至指数中期的细胞进行RT-qPCR分析，然后在MOPS最小培养基中生长3小时。用于qPCR的引物和引物效率列在S3表中。显示具有标准差的平均值。，p < 0.0001;p < 0.001，n.s.，通过双向方差分析和 Tukey 事后分析不显著。图 3G 的基础数据可在 S3 数据中找到。（H） 铁在BasS-3Flag和ArnA-3Flag表达中的作用。BPS用于螯合MOPS介质中的铁，从LB转换后。在 3 小时时间点，如上所述提取和分析蛋白质。（I） ΔphoB 突变体对 ArnC-3Flag 的表达。在MOPS饥饿后，从指定的菌株中提取蛋白质并如上所述进行分析。显示的图像代表了 ≥3 实验的结果。PPK，多磷酸激酶;RT-qPCR，逆转录酶定量PCR。

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L-Ara4N和pEtN修饰共同降低了外膜的净负电荷，并减少了与阳离子抗菌肽（如多粘菌素）的相互作用[46]。正如我们在图 1D 中发现的 ArnC-3Flag 和 ArnB-3Flag 一样，与野生型对照相比，Pkk 突变体中 EptA-3Flag 的表达降低（图 3B）。其他 Arn 蛋白要么未通过质谱法检测到，要么不符合严格的临界值以允许通过 t 检验进行分析（即图 1B），但我们使用蛋白质印迹来确认 ArnA-3Flag 和 ArnT-3Flag 的相同趋势（图 3C 和 3D）。重要的是，Arn蛋白水平可以通过其内源性启动子的基于质粒的ppk表达来恢复（pPPK，S2图）。事实上，与具有空载体对照的野生型菌株相比，在野生型或 Δppk 突变背景中表达 pPPK 的细胞具有更高水平的 Arn 蛋白（S2 图）。我们推测，由于质粒的多个拷贝，PPK在两种菌株背景中都有些过表达，并且Arn表达与总PPK水平成正比。

接下来，我们询问从 LB 到 MOPS 介质的切换是否触发了 Arn 表达式。正如预期的那样，在LB的生长过程中，野生型和Δppk突变体的Arn蛋白都很低，只有在MOPS的长时间生长期间，它们在野生型细胞中的水平才会增加（S3A图）。这导致我们检查调控是否依赖于 BasRS 双组分系统，该系统位于 arnBCADTEF 操纵子和 eptA 基因的上游，并对各种应激做出反应（图 3E）。在 E.大肠杆菌（BasS膜蛋白）在高浓度铁和锌的作用下自磷酸化，随后反式磷酸化转录因子BasR，促进arnBCADTEF和eptA的转录，后者与basS和basR位于同一操纵子中[47–50]。同时，在低镁条件下激活的PhoPQ双组分系统通过PmrD促进BasR活化（图3E）[51,52]。我们发现，与野生型细胞相比，在饥饿期间，Δppk突变细胞中BasS-3Flag和BasR-3Flag的表达均降低（图3F）。相比之下，我们发现 PhoP 和 PhoQ-3Flag 蛋白水平基本保持不变（S3B 和 S3C 图），并且 ArnC-3Flag 表达的诱导不会因包含过量镁而改变（S3D 图）。因此，虽然我们不能排除其他调控点，但我们的数据支持一个模型，其中 MOPS 饥饿期间的 Arn 和 EptA 表达取决于 BasRS 双组分系统的上游 PPK 和/或 polyP 依赖性调控。事实上，qPCR分析表明，MOPS处理诱导了野生型细胞中Arn、BasS和BasR编码基因的转录，而这种反应在Δppk突变体中是有缺陷的（图3G）。有趣的是，ppk 的缺失对 arnB 表达的影响不如 arnA 和 arnC 的显著影响，即使它们编码在同一个操纵子中（图 3G）。同样，我们没有观察到野生型和 ppk 突变体在 eptA 表达方面存在显着差异（图 3G），尽管它在蛋白质水平上受到调节。这表明 PPK 和/或息肉可能在多个水平上发挥其功能。重要的是，先前已经记录了单个操纵子内基因表达的差异，并且可能源于其他启动子元件或mRNA加工导致的转录起始变化[53]。最后，有几篇关于稳态相位sigma因子RpoS调节BasR和BasS的报道[54,55]。然而，我们发现 Δppk 突变体在 MOPS 饥饿期间的 RpoS 蛋白水平与野生型细胞相似（S3E 图），这表明还有其他作用模式。

据我们所知，这是对 E 的第一次描述。大肠杆菌MOPS培养基诱导EptA和Arn蛋白，其作用机制尚不清楚。在LB培养基中，BasRS转录回路在高铁水平（>200μm）的情况下诱导Arn表达和下游修饰[47,56]，但MOPS中的铁浓度相当低（10μm）。尽管如此，我们仍然对铁的作用感到好奇，因为之前的一份报告称MOPS诱导的息肉可以结合铁来抑制Fenton反应，从而减少活性氧的产生[15]。与BasS活化中对铁的要求一致，用铁螯合剂BPS处理可钝化在MOPS中生长的野生型细胞中Arn-3Flag蛋白的表达（图3H）。然而，我们注意到，在用高铁处理的LB培养基中，ppk的丢失并不影响Arn-3Flag蛋白的表达（S3F图）。因此，虽然铁对 LB 和 MOPS 中的 BasRS 诱导都很重要，但 Δppk 的影响是 MOPS 独有的。我们推断，PPK 对 BasRS 的调节可能取决于 polyP 积累，这发生在 MOPS 中（S1A 图），但不发生在用铁处理的 LB 中（S3G 图）。为了验证这一观点，我们分析了ΔphoB突变体中的Arn蛋白诱导，即使在MOPS培养基中，这些突变体也缺乏polyP积累（S3H图）[4,25]。此外，与野生型细胞相比，PhoB 在 Δppk 突变体中下调（图 1B 和 S1 表）。令我们惊讶的是，ΔphoB 细胞的 Arn-3Flag 表达水平与野生型对照相当（图 3I），这表明 polyP 合成之外的其他 PPK 活性可能有助于本文描述的分子表型（见讨论）。

pEtN 和 L-Ara4N 修饰在 Δppk 突变体中下调

接下来，我们直接检查了依赖于 Arn 和 EptA 表达的脂质 A 修饰，即 L-Ara4N 和 pEtN 添加。在这些实验中，我们使用了W3110菌株（K-12）背景，该菌株已广泛用于脂质A分析[57,58]。作为对照，这些菌株在 MOPS 培养基中显示出 Arn-3Flag 蛋白的 PPK 依赖性表达，类似于我们在用于其他测定的 MG1655 背景中观察到的（S4A 图）。蛋白质表达的时间过程表明，在野生型细胞中，ArnC-3Flag 在 MOPS 培养基中 3 小时后可检测到，并在实验期间保持上调（S4B 图）。相比之下，在MOPS培养基中6小时后，ArnC-3Flag在Δppk突变体中检测不到，仅在过夜生长后观察到（S4B图）。因此，我们选择 6 小时（Arn 上调后 3 小时）作为时间点，使用放射性标记和薄层色谱 （TLC） 测量脂质 A 修饰。事实上，与野生型突变体相比，我们发现 Δppk 突变体在使用 pEtN 和 L-Ara4N 修饰单独或双重修饰的脂质 A 物种的积累方面存在缺陷（图 4A）。通过引入pPPK质粒，该缺陷被完全挽救（图4A）。因此，Arn 和 EptA 蛋白水平的差异转化为野生型和 Δppk 突变体之间脂质 A 修饰的变化。

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图 4. ppk 突变体中 LPS 失调的后果。

（A） 脂质 A 修饰（右）和脂质 A 谱（左）突变或表达 ppk 的菌株的示意图。所述菌株在LB中生长至对数中期，然后转移到补充有32P 6 小时，按照材料和方法中的描述分离脂质 A，并在磷化之前通过 TLC 进行分析。32P 标记的脂质 A 物种标记在图像的右侧。在 LB 生长过程中，大部分脂质 A （LA） 被六酰化和双磷酸化 （6-LA-2P） 和 ~1/3RD路用额外的磷酸基团 （6-LA-3P） 修饰。在 BasRS 刺激后，6LA-2P 用作 EptA 和 ArnT 的底物，以生成 pEtN 和 L-Ara4N 修饰的脂质 A 物种。请注意，单独修饰的 6-LA-Ara4N 物种不是从 6-LA-3P 物种中分离出来的。“双重修饰”是指携带 2 个部分（总）pEtN 和/或 L-Ara4N 的脂质 A 物种。所示图像代表了 ≥3 次生物学重复的结果。（B） Δppk突变体的多粘菌素生长表型。在指定培养基上以 10 倍的连续稀释液点样指示菌株，并在成像前在 37°C 下孵育 2 天。所示图像代表了 ≥3 次生物学重复的结果。（C） 来自野生型和 Δppk 突变型 UPEC 菌株的 PolyP 提取物。将细胞在LB培养基中生长至中指数期，然后切换到MOPS最小培养基3小时。从指定菌株中提取 PolyP，并在用甲苯胺蓝染色的 TBE-尿素凝胶上进行分析。显示了长度为 ~130 个磷酸盐残基 （p130） 的链迁移。（D） UPEC 中 PPK 依赖的 ArnA-3Flag、ArnB-3Flag 和 ArnC-3Flag 表达。使用SDS-PAGE分离提取的蛋白质样品，转移到PVDF中，并使用抗Flag抗体进行检测。显示的图像代表了 ≥3 实验的结果。LPS， 脂多糖;TLC，薄层色谱。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.g004

PPK促进多粘菌素耐药性

带正电荷的L-Ara4N和pEtN修饰在对阳离子抗菌肽的耐药性中发挥作用，阳离子抗菌肽会改变膜通透性和结构[59\u201261]。为了研究破坏脂质A修饰的PPK依赖性调节的表型后果，我们重点研究了多粘菌素抗生素，该抗生素既局部用于治疗革兰氏阴性菌感染，也作为临床上的最后手段抗生素全身使用[62]。在这些实验中，我们使用了多粘菌素抗性菌株（WD101），该菌株携带组成型活性的basR等位基因（basRC），导致脂质A被L-Ara4N和pEtN严重修饰[63]。该菌株在其他方面与W3110同基因[63]。重要的是，与野生型细胞相比，Arn-3Flag 蛋白在携带该等位基因的 Δppk 突变体中表达降低，如之前在其他背景中观察到的那样（S4A 图）。使用稀释测定法，我们确认 basRC与在 MOPS 上生长的野生型 W3110 对应物相比，菌株对多粘菌素具有抗性（S4C 图），这种抗性需要 ArnA（S4D 图）。ppk 的缺失降低了 basR 中的多粘菌素耐药性C菌株（图4B和S4C），这种作用可以通过引入pPPK质粒来逆转（图4B）。这些实验表明 ppk 有助于 basRC-饥饿条件下介导的多粘菌素抗性。最后，我们有兴趣测试ppk在Arn表达中的作用在致病性E中是否保守。大肠杆菌。为此，我们使用了泌尿病原体E。大肠杆菌 （UPEC） 菌株 （UTI89）。我们发现UPEC在MOPS饥饿期间也积累了多磷酸盐（图4C），并且这些菌株中的Arn-3Flag蛋白表达依赖于ppk（图4D）。我们推测，在UPEC中靶向PPK可能是一种策略，使细胞在获得多粘菌素耐药性后对药物治疗敏感。

讨论

我们的研究是E中的第一个全蛋白质组分析。大肠杆菌在允许polyP合成的条件下将野生型细胞与Δppk突变体进行比较。我们的工作将为对PPK和息肉如何控制蛋白质稳态以及更广泛地说，细菌细胞如何对饥饿做出反应感兴趣的研究人员提供资源。我们发现，Δppk突变细胞在饥饿期间仍然准备生长，但代价是上调营养构建块（如氨基酸）的生物合成途径。我们进一步阐述了 PPK 在调节保守的 BasRS 双组分系统和参与脂质 A 修饰的蛋白质的下游表达方面的关键作用。最后，我们发现有证据表明脂质 A 修饰的 PPK 依赖性差异有助于多粘菌素敏感性。总之，我们的研究结果阐明了PPK在脂质A修饰和抗生素耐药性中以前未被探索的作用。

对我们的数据最简单的解释，如图 S5 所示，是 PPK 和/或 polyP 促进 BasS 传感器蛋白及其同源转录因子 BasR 的表达或激活。反过来，BasR 的作用是刺激自身和编码 EptA 和 Arn 蛋白的基因的转录。为了支持BasRS-Arn回路受polyP调控的观点，与PPK不同，我们只观察到polyP合成到高水平的MOPS培养基中Arn蛋白表达的缺陷。在补充有铁的LB培养基中，没有息肉，野生型菌株和Δppk突变体之间的Arn蛋白表达没有差异。然而，我们注意到，由于观察到 ΔphoB 菌株以与野生型细胞相似的水平表达 ArnC-3Flag 蛋白，尽管它们在很大程度上缺乏 polyP 积累，因此 polyP 的拟议作用变得复杂。基于这一发现，PPK的未知活性可能是本文描述的分子和细胞表型的基础。或者，先前在ΔphoB菌株中检测到非零水平的polyP[4]，并且这种polyP池，或至少其周期性合成和破坏，可能足以驱动Arn表达。在这种情况下，polyP 可以作用于上游并直接与 BasS、BasR 或未知的转录调节因子相互作用，以促进 eptA-basR-basS 操纵子的转录。

PPK 的影响也可以从直接发生在 eptA-basR-basS 的转录活性中去除几个步骤。在这里，特别相关的是，在MOPS饥饿期间激活BasRS转录程序的触发因素是未知的。野生型细胞在铁螯合剂 BPS 存在下未能上调 Arn 表达表明存在铁依赖性反应。然而，鉴于 Arn 蛋白表达的诱导在 3 小时后突然发生，我们推测需要额外的时间依赖性变化。在培养基转换实验中，我们发现，从诱导ArnC-3Flag表达的野生型细胞中孵育“用过的”MOPS培养基在野生型或Δppk突变体中均不能快速触发ArnC-3Flag表达（S6A和S6B图）。这一观察结果反对培养基成分的变化是 MOPS 中 BasS 活化的唯一贡献者，并且可能需要细胞内特定代谢物的耗竭或副产物的积累。找到BasS激活的触发因素将为PPK的未知功能提供重要线索，并为脂质A修饰的调节提供新的见解。

总的来说，我们的研究结果强调了调节 E 修饰的途径。大肠杆菌LPS和抗生素耐药性的相关变化与营养物质的可用性密切相关。在宿主感染的情况下，PPK作为使细菌对阳离子肽（如多粘菌素）敏感的靶标的有效性可能取决于感染部位的细菌是否暴露于激活PPK的条件。有趣的是，有证据表明，在致密生物膜中心定植的细菌会经历饥饿，同时对抗生素的敏感性降低[64–66]。我们认为PPK可能在这方面发挥重要作用。值得注意的是，在任何类型的应激下激活PPK的直接分子事件仍不清楚[26,67\u201269]。我们的工作预测，编码PPK激活剂的基因也可能在多粘菌素耐药性中发挥作用。

一般来说，参与LPS修饰的酶，包括pEtN和L-Ara4N修饰，在革兰氏阴性菌中是高度保守的[59]。然而，某些物种在调控细节上存在重要差异，例如双组分系统之间的串扰[51,70]。因此，必须测试PPK和polyP是否会影响其他细菌的这些修饰。我们预计，比较和对比PPK在多个物种中的作用将有助于阐明控制抗生素敏感性和耐药性获得的分子机制。

材料和方法

细菌菌株、培养基和生长

本工作中使用的所有细菌菌株和质粒及其来源均列在 S3 表中。试剂列在 S4 表中。

使用λ-red介导的位点特异性重组，分别通过pKD46 [71]和pSIM6 [72]质粒表达的阿拉伯糖或热休克诱导系统产生标记和缺失菌株。分别从pKD4 [71]和pSUB11 [73]扩增卡那霉素缺失和C末端3Flag-卡那霉素标记盒。在特定病例（S3表）中，使用pCP20表达的FLP重组酶活性切除耐药标志物[74]。适当时加用抗生素：卡那霉素（50μg/ml）和氨苄西林（100μg/ml）。为了重组遗传转化，使用前面描述的方案使细胞具有电感受态并转化[75]。质粒也通过电穿孔引入细菌中。

营养降档。

所有菌株均在 37°C 的 LB 培养基中生长，除非携带在 30°C 下生长的 pSIM6 和 pKD46 质粒。 对于营养降档实验，将LB培养基中生长的过夜培养物稀释至0.1OD600第二天在LB中生长到中指数期（约0.6OD600).然后用 1xPBS 洗涤细胞两次，并重悬于补充有 0.1 mM K 的 MOPS 最小培养基 （Teknova） 中2HPO公司4，0.4%葡萄糖 - 除非另有说明，否则此配方用于饥饿。细胞在最小培养基中生长3小时，然后在冰上收获。使用干冰快速冷冻细胞沉淀，并储存在-80°C。

其他生长条件。

在指示的情况下，将指数增长的 LB 培养物切换到含有酪蛋白氨基酸 （Bacto） 的 MOPS 最小培养基，终浓度为 0.05% 和 0.5%。在指示的情况下，使用 0.2 mM 巴汤啉二磺酸二钠盐水合物 （BPS） 螯合 MOPS 培养基中的铁。BPS在营养降档开始时被添加到MOPS培养基中。在有指征的情况下，当过夜培养物稀释至 0.1 OD 时，LB 培养基补充 0.2 mM 硫酸铁600.在收获细胞之前，将 LB 减铁和正铁培养物在 37°C 下生长至指数中期（约 1.5 小时）。在指示的情况下，将指数增长的 LB 培养物切换到含有 1 mM 氯化镁或 1 mM 氯化钙的 MOPS 最小培养基中，并在收获前在 37°C 下生长 3 小时。

质谱

细胞生长。

从新鲜条纹平板中为每种野生型和 ppk 菌株制备 5 个过夜培养物 （n = 5）。第二天，将过夜培养物稀释在100ml LB中并生长至中指数期，用1xPBS洗涤2次，然后如上所述切换到不含氨基酸的MOPS最小培养基3小时（方法：营养物质降档）和60OD600和 5 OD600分别收获细胞体积的当量进行质谱分析和polyP提取。

蛋白质提取和沉淀。

采用三氯乙酸（TCA）沉淀法制备蛋白质提取物。将细胞沉淀在冰上解冻并重悬于700μl质谱级裂解缓冲液（5%SDS，100mM四乙基溴化铵（TEAB），Roche cOmplete蛋白酶抑制剂混合物片剂）中。细胞悬液在功率水平 3 下在冰上超声处理 30 秒，中间休息 1 分钟，共 3 次。然后将细胞裂解物以 13,000 rpm、4°C 离心 15 分钟。将上清液转移到新管中，再次离心10分钟，然后收集。

通过在细胞裂解物中加入 2.8 ml 15% TCA 丙酮溶液（使 TCA 的终浓度达到 10%），通过倒置并在 -20°C 下孵育过夜来沉淀蛋白质。第二天，将样品以最大速度离心，4°C离心10分钟，旋转后立即弃去上清液。将沉淀风干30分钟，然后重悬于溶出缓冲液（5%SDS，100mM TEAB）中，然后进行BCA定量和冻干。冻干样品被送往加州大学戴维斯分校蛋白质组学核心进行质谱分析。

样品制备。

以下方案（3-5）由加州大学戴维斯分校蛋白质组学核心提供，略有改动。

将冻干蛋白溶解在50μl溶解缓冲液中，缓冲液由5%SDS，50mM碳酸氢铵三乙基铵组成，pH 7.5。对所有样品进行双叉子酸测定，然后使用每个样品的 100 μg 总蛋白通过悬浮捕集装置 （S-Trap） （ProtiFi） 进行蛋白质消化。用二硫苏糖醇还原二硫键，并在 50 mM TEAB 缓冲液中用碘乙酰胺烷基化。酶消化包括在37°C下以1：100的酶：蛋白质（wt/wt）添加胰蛋白酶4小时，然后使用相同的wt/wt比在37°C下添加胰蛋白酶进行过夜消化。 然后通过连续应用100 mM TEAB、0.5%甲酸和50%乙腈、0.1%甲酸的洗脱缓冲液从S-Trap中洗脱肽。洗脱的胰蛋白酶在真空离心机中干燥，然后用0.1%三氟乙酸重新配制。这些样品进行了液相色谱联用串联质谱（LC-MS/MS）分析，如下所述。

液相色谱。

使用 PepMap 75 μm × 25 cm C18 色谱柱（粒径为 2 μm）（孔径为 100 ?），加热至 40°C，在 Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 RSLC 系统上分离肽。 进样终体积为5μl，相当于1μg总肽，使用流动相A：水/0.1%甲酸和B：80%乙腈/0.1%甲酸，在90分钟的总运行时间内以200μl/min的流速进行分离。梯度洗脱从10%到8%B超过3分钟，从8%到46%B超过66分钟，从46%到99%B超过3分钟，在99%B下保持2分钟后，在0.5分钟内下降到2%，然后平衡15分钟。

Mass spectrometry.

在 Orbitrap Fusion Lumos（赛默飞世尔科技）质谱仪上分析肽。喷雾电压设置为1.8 kV，射频透镜电平设置为46%，离子传输管温度设置为275°C。 质谱仪以数据相关采集模式运行。在 Orbitrap 中以 60,000 的分辨率（200 m/z 时）采集了全扫描质谱（从 m/z 375 到 1,600）。MS1的自动增益控制（AGC）目标设置为4e5，离子填充时间设置为50毫秒。在3 s周期内分离出n=15个电荷态+2、+3的最丰度母离子，隔离窗口宽度为1.2 m/z，使用碰撞诱导解离（CID）碎裂，碰撞能量为30%，并通过IonTrap进行检测，扫描速率设置为Rapid。MS/MS的AGC目标设定为5e3，离子填充时间设定为35 ms。动态排除设置为 50 秒，质量窗口为 10 ppm（百万分之一）。

质谱生物信息学分析

蛋白质鉴定。

使用Trans-Proteomic Pipeline（TPP v5.2.0）[76]处理质谱RAW数据。使用 ProteoWizard [77] （v3.0.22088） 的 msconvert 工具将质谱运行中的文件转换为 mzML 文件。Comet [78] （v2018.01.04） 用于根据 UniProt [79] E 搜索文件。大肠杆菌蛋白序列数据库（UP000000625已下载2021-08-04），以及所有蛋白质序列逆转的靶标诱饵策略。数据库检索以胰蛋白酶为消化酶进行，最多允许漏掉 3 个裂解，并考虑半胰蛋白酶消化。肽质量容差设置为 20 ppm。半胱氨酸的脲甲基化被设定为固定修饰，考虑的可变修饰是天冬酰胺和谷氨酰胺的脱酰胺化，以及蛋氨酸的氧化。使用ProteinProphet[80]评估蛋白质鉴定的概率，FDR<1%鉴定的蛋白质被认为是有把握的。

差异表达分析。

来自可靠鉴定蛋白质的光谱计数用于下游分析。通过随机抽取整个数据集中最低 20% 的非零光谱计数来估算给定实验中光谱计数为零的蛋白质，以考虑缺失值。所有光谱计数均由给定实验中的光谱计数总数归一化。假设方差不相等，使用双尾、双样本 Student t 检验在归一化光谱计数上评估差异表达。在两种实验条件下，对在插补前的 5 次重复中至少有 3 次非零光谱计数的蛋白质进行 t 检验，并使用 Benjamini-Hochberg [81] 程序调整多假设检验的 p 值。FDR 调整的 p 值< 0.05 的蛋白质被认为具有显着差异表达。最后，在一种病症的所有重复中鉴定出的蛋白质和在另一种病症的任何重复中未鉴定的蛋白质没有进行t检验，但仍反映出显着的表达差异。因此，这些蛋白质被命名为“全有或全无”蛋白质，并被报道为具有差异表达。

基因本体富集分析。

Ontologizer [82] （v2.0） 用于鉴定在一组不同表达的蛋白质（FDR 调整的 p 值 < 0.05）和“全有或全无”蛋白质中显着富集的 Gene Ontology [30] 注释。富集是在用质谱法鉴定的所有蛋白质的背景下进行的（在FDR<1%下可靠鉴定）。分析中使用的OBO本体文件和GAF注释文件于2023-02-13从 http://geneontology.org/ 下载。使用 Benjamini-Hochberg 程序调整 p 值，并且使用调整后的 p 值 < 0.05 富集的 GO 项被认为显着富集。

基因集富集分析。

（2023-05-24）进行了GSEA [31]（v4.1.0）鉴定了整组蛋白质中富集的GO术语集（在FDR<1%时可靠地鉴定）。基因集由GO项及其注释蛋白构建，GSEA排除了注释超过1,000个蛋白质或少于3个蛋白质的GO项，以去除一般和高度特异性项，并使用1,000个基因集排列来估计富集分数。使用“meandiv”参数对富集分数进行归一化，以便更准确地比较跨基因集的富集分数。q值<0.05的基因集被认为显著富集。

聚磷酸盐提取

多磷酸盐提取。

按照指示生长细胞，并如前所述进行息肉提取[83]。为清楚起见，此处使用类似的语言来描述协议。五外径600将沉淀细胞的当量在冰上解冻，在 4°C 下重悬于 400 μl LETS 缓冲液（100 mM LiCl、10 mM EDTA、10 mM Tris-HCl、0.2% SDS）中，然后转移到含有 600 μl 室温中性苯酚 （pH 8） 和 150 μl 无 RNase 水的管中。将试管涡旋20秒，加入600μl氯仿。接下来，将试管再次涡旋20秒，然后以13,000g离心2分钟。将顶部600μl层转移到含有600μl氯仿的新管中，然后涡旋20秒并以13,000g离心2分钟。将顶部 400 μl 层转移到新管中，并用 2 μl 10 mg/ml RNaseA 和 DNaseI 在 37°C 下处理 1 小时。 接下来，将混合物转移到含有 1 ml 100% 乙醇和 120 mM 乙酸钠 （pH 5.3） 的预冷管中，并在 ?20°C 下放置过夜以沉淀。第二天，样品在 4°C 下以 13,000 g 离心 20 分钟，离心 20 分钟。 弃去上清液，加入 500 μl 70% 乙醇，然后在 4°C 下以 13,000 g 离心 5 分钟。 再次弃去上清液，将沉淀风干以除去痕量乙醇。将半透明的polyP沉淀重悬于30μl无菌水中，并储存在-80°C。

凝胶分析。

使用15.8%TBE-尿素凝胶（5.25g尿素，7.9ml 30%丙烯酰胺，3ml 5xTBE，150μl10%APS和15μlTEMED）观察提取的polyP。将提取的 polyP 与上样染料（10 mM Tris-HCl （pH 7）、1 mM EDTA、30% 甘油和溴酚蓝）以 1：1 的比例混合，并将 10 μl 上样到凝胶中。将凝胶在 100 V 下在 1xTBE 中电泳 1 小时和 45 分钟作为电泳缓冲液。使用三微升 RegeneTiss polyP 标准品 p14 （20 mM）、p60 （6.5 mM） 和 p130 （2.5 mM）。将凝胶在含有甲苯胺蓝（25%甲醇、5%甘油和0.05%甲苯胺蓝）的固定液中染色15分钟，并用脱色液（不含甲苯胺蓝的固定液）洗涤数次，然后放置过夜以完全脱色。

蛋白质印迹

细胞如图例所示生长，并在“细菌菌株和生长条件”部分中描述。细胞沉淀（3 OD600将在-80°C下冷冻的细胞当量在冰上解冻并重悬于100μl样品缓冲液（800μl样品缓冲液，100μl1M DTT，100μl1.5M Tris-HCl（pH 8.8））中。将样品在 100°C 下煮沸 10 分钟，然后以 13,000 rpm 离心 2 分钟，并将上清液转移到新管中。仅制备ArnT和EptA膜蛋白样品而不煮沸，以防止蛋白质聚集，这是含有跨膜结构域的蛋白质的典型特征[84]。将重悬于100μl样品缓冲液中的细胞沉淀在功率水平1下超声处理12秒，然后以13,000rpm离心2分钟，并将上清液转移到新管中。将蛋白质样品上样到指定百分比的SDS-丙烯酰胺凝胶上。将蛋白质转移到PVDF膜上。使用含有 5% 牛奶的 TBST 摇动封闭膜 20 分钟，并在与一抗和二抗孵育后用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟。将印迹暴露在Thomas Scientific的放射自显影胶片中。抗体使用条件可在 S4 表中找到。扫描的图像在 Photoshop 中打开。在大多数情况下，会进行小的线性亮度和对比度调整以减轻图像背景。在整个显示的图像上均匀地进行调整。

液体生长曲线

将每种菌株的三个生物学重复在LB培养基中培养过夜。过夜稀释至0.1 OD600在LB中生长到中指数期（约0.6OD600).电池（0.5 OD600当量），然后用1xPBS洗涤两次，并重悬于50μlMOPS培养基（1xMOPS，0.4%葡萄糖，0.1mM K）中2HPO公司4）不含氨基酸。将25微升的细胞悬液转移到不含0.05%或0.5%氨基酸的1ml MOPS中（最终OD约为0.1OD600).以 3 次的技术重复移液 200 微升细胞，并使用设置在 37°C 并连续摇动的 BioscreenC 酶标仪监测生长。每15分钟收集一次波长为600nm的光密度测量值，振荡停止后5 s，持续24 h。对于分析，从每个时间点减去每个条件（0%、0.05% 和 0.5% 氨基酸）的背景 OD 值。有关原始数据，请参阅 S2 数据。

生长曲线分析

生长速度 （OD600/min）、滞后时间（min）和最大OD600使用Macintosh OS X的GrowthRates 6.2 [85]和Bare Bones Software文本编辑器计算每孔的测量值。GrowthRates 使用严格的算法运行，增长率相关系数设置为 r >0.99。对于分析，输入文件采用标准格式，程序在每个时间点自动补偿背景 OD。有关原始数据，请参阅 S2 数据。统计分析使用具有多重比较的双向方差分析，并使用 Tukey 检验（GraphPad Prism 版本 9.1.2）对多重假设检验进行校正。

逆转录酶定量PCR（RT-qPCR）

在LB或MOPS培养基中培养每种菌株的5个生物学重复进行qPCR分析。从每种条件下，通过离心收集 1 ml 细胞，并立即重悬于 500 μl RNA 溶液中，稍后在 4°C 下短期储存。 在RNA提取之前。RNA后溶液被除去。按照制造商的说明使用 GeneJET RNA 纯化试剂盒 （Thermo Scientific） 提取 RNA，并通过 NanoDrop 评估 RNA 完整性/浓度。按照 Invitrogen Ambion DNase I（无 RNase）方案，通过 DNase 处理从 RNA 提取物中去除基因组 DNA 污染。如前所述，使用苯酚-氯仿提取去除DNase[86]。通过NanoDrop测量最终RNA浓度。按照制造商的说明（25°C 10 min、50°C 10 min、85°C 5 min）使用 SuperScript V VILO 试剂盒 （Thermo Fisher） 逆转录 1 μg RNA。然后将 cDNA 稀释 1/10，分装到 15 μl 工作溶液中，并储存在 ?80°C 下。 我们发现，这种 cDNA 稀释对于获得我们感兴趣的基因的 Cq 值大于 20 是最佳的。根据制造商的方案，在以下条件下，使用 iQ Sybr Green Supermix 以 3 次和 10 μl 最终体积的技术重复进行定量 PCR：95°C 3 分钟和 39 次 95°C 15 秒、63°C 30 秒和 72°C 30 秒。在每次运行结束时进行熔解曲线分析，并使用连续稀释的 gDNA（使用 One-4-All Genomic DNA MiniPreps Kit （BioBasic） 提取）进行标准曲线以评估引物效率。所有引物和引物效率均在 S3 表中报告。将基因表达归一化为yqfB，以前在息肉诱导条件下使用[69]，并使用ΔΔC计算表达变化T使用 Bio-Rad CFX Maestro 2.3 版本 5.3.002.1030 软件的方法。统计分析使用具有多重比较的双向方差分析，并使用 Tukey 检验（GraphPad Prism 版本 9.1.2）对多重假设检验进行校正。有关原始数据，请参阅 S3 数据。

多粘菌素敏感性

将指示菌株在LB或LB-卡那霉素（质粒携带菌株）平板上划线，并在37°C下生长过夜。 第二天，将每个菌株的单个菌落重悬于100μl无菌水中，并在无菌水中连续稀释10倍。将每种稀释液的 5 微升点在指定平板上，这些平板在使用当天新鲜制备。在成像前，将板在 37°C 下孵育 2 天（对于 MOPS 板）干燥。在Photoshop中进行的线性亮度和对比度调整在整个显示的图像中均匀进行。

脂质分析

将过夜培养物在新鲜的LB培养基中以1：50稀释。在OD下收获细胞6000.6，并用1xPBS洗涤。将细菌重悬于补充有 0.4% 葡萄糖、0.1 mM K2HPO4 和 2.5 μCi/ml 的 1xMOPS 培养基中32圆周率。标记的细胞在 37°C 下生长，并在 6 小时后收获。用1xPBS洗涤沉淀。32如前所述，使用温和的酸水解提取P-脂质A[87]。然后通过TLC在由氯仿、吡啶、88%甲酸和水（分别为50：50：16：5，体积/体积）组成的溶剂系统中分离脂质A物质。将板暴露于荧光屏中，并使用Amersham Typhoon磷化成像仪系统观察放射性标记的脂质。在Photoshop中进行了线性亮度和对比度调整，以明确pEtN和L-Ara4N的修改。在整个所示图像中均匀地进行线性调整。

数据库

为本研究开发的质谱蛋白质组学数据通过PRIDE[89]合作伙伴存储库存入ProteomeXchange联盟[88]，数据集标识符为PXD043566。

支持信息

野生型 E。大肠杆菌在 MOPS 最小培养基中积累 polyP，而 Δppk 突变体则不会。

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S1 图。 野生型 E。大肠杆菌在 MOPS 最小培养基中积累 polyP，而 Δppk 突变体则不会。

来自野生型和 Δppk 突变体培养物的 PolyP 提取凝胶，用于质谱样品制备。将过夜培养物在LB培养基中生长至指数中期，然后转移到MOPS最小培养基中3小时以诱导饥饿和息肉积累。PolyP提取物在TBE-尿素凝胶上运行，并用甲苯胺蓝染色。显示了长度约为 700 个磷酸盐残基 （p700） 的链的迁移。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s001

（TIF）

S2 图。 Arn 表达在 MOPS 饥饿期间是 PPK 依赖性的。

（A） 在 MOPS 培养基中 3 小时后挽救 Arn 表达。使用SDS-PAGE分离提取的蛋白质样品，转移到PVDF中，并使用抗Flag抗体进行检测。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s002

（TIF）

S3 图。 PPK对Arn和EptA蛋白表达的分子控制。

（A） 从 LB 切换到 MOPS 培养基时 ArnC-3Flag 表达的诱导。将指示的菌株在LB培养基中生长至对数中期，并转移到MOPS培养基中3小时。在转移到PVDF膜之前，通过SDS-PAGE提取和分离蛋白质。使用抗 Flag 抗体检测标记的蛋白质。（B） PhoP在野生型细胞和Δppk突变体之间的表达。在蛋白质提取、SDS-PAGE分离并用针对PhoP的抗体检测之前，将指定的菌株在MOPS培养基中饥饿3小时。ΔphoP 突变体（用于验证抗体的对照）中的背景条带 （*） 受 PPK 调节，这使得评估 PhoP 蛋白表达的变化变得困难。无论如何，PPK对PhoP的调节似乎是微乎其微的。（C） PhoQ-3Flag 在野生型细胞和 Δppk 突变体之间的表达。将指示的菌株在MOPS培养基中饥饿3小时，并使用针对Flag的抗体分析蛋白质，如（B）所述。（D） 镁（Mg）的影响2+） 在 MOPS 介质中的 ArnC-3Flag 表达上。将细胞在LB中生长至中指数期，然后在不存在或存在1mM氯化镁或氯化钙（对照）的情况下转移到MOPS最小培养基中3小时。使用SDS-PAGE分离提取的蛋白质样品，转移到PVDF中，并使用抗Flag抗体进行检测。显示的图像代表了 ≥3 实验的结果。（E） 野生型细胞和 Δppk 突变体之间 RpoS 的表达。在蛋白质提取、SDS-PAGE分离和用针对RpoS的抗体检测之前，将指定的菌株在MOPS培养基中饥饿3小时。ΔrpoS 突变株用于验证抗体。（F） 野生型和Δppk突变体在补充铁的LB中BasS-3Flag、BasR-3Flag和ArnA-3Flag的表达。在LB或LB +铁（200μmFeSO）中生长的指示菌株4）在蛋白质提取之前1.5小时，通过SDS-PAGE分离，转移到PVDF中，并用抗Flag抗体检测标记的蛋白质。（G、H）铁 （G） 和 phoB 突变 （H） 对 polyP 积累的影响。从LB或LB +铁（200μmFeSO）中生长的指定菌株中提取PolyP4）从LB转移后1.5小时或在MOPS中3小时，并在用甲苯胺蓝染色的TBE-尿素凝胶上进行分析。注意：用于 S2F 的相同 BasR 标记菌株用于 S2G polyP 提取，用于 3I 的相同 ArnC 标记菌株用于 S3H 中所示的 polyP 提取。显示的图像代表了 ≥3 实验的结果，但 S3G 和 S3H 中的 polyP 提取除外，它们代表了 2 个独立的重复。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s003

（TIF）

S4 图。 W3110 和 WD101 中 PPK 对 Arn 蛋白表达和多粘菌素耐药性的调节 （basRC） 背景。

（A） W3110 和 WD101 中 PPK 依赖性 Arn-3Flag 表达 （basRC） 菌株。指示的菌株在LB至对数中期生长，然后转移到MOPS3小时。在转移到PVDF膜上并用抗Flag抗体检测之前，通过SDS-PAGE提取和分离蛋白质。（B） 从LB到MOPS介质转变后ArnC-3Flag表达的时间过程。在所示时间点分析指定菌株的表达。使用12%SDS-PAGE凝胶分离蛋白质样品，转移到PVDF膜上，并使用抗Flag抗体检测蛋白质。（C） ppk在多粘菌素耐药中的作用。ppk对W3110和basR先天多粘菌素抗性的影响C株。在指定培养基上以 10 倍的连续稀释液点样指示菌株，并在成像前在 37°C 下孵育 2 天。（D） basR中多粘菌素耐药性的Arn依赖性C株。菌株被稀释并生长如C所述，所示图像代表了≥3实验的结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s004

（TIF）

S5 图。 PPK在调节脂质A修饰和多粘菌素耐药性中的作用。

当从 LB 切换到 MOPS 培养基时，PPK 合成的 PolyP 通过自磷酸化触发 BasS 活化。激活 BasS 然后转磷酸化 BasR 以诱导 arnBCADTEF 操纵子和 EptA 基因的下游转录。这导致 Arn 和 EptA 蛋白水平升高，并上调相应的 L-Ara4N 和 pEtN 修饰。虚线箭头表示修饰的脂质A（LPS的关键结构成分）通过LPS转运系统转运到外膜的额外步骤。这降低了外膜的净负电荷并导致多粘菌素 B （PMB） 耐药性。目前尚不清楚的是 polyP 是否直接在 BasS 激活中起作用，以及 PPK 是否具有独立于 polyP 合成的作用。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s005

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S6 图。 来自野生型培养物的用过的 MOPS 培养基不诱导幼稚细胞的 Arn-3Flag 表达。

（甲、乙）培养基开关实验示意图（A）和蛋白质印迹（B）。将细胞在 LB 培养基中生长至中指数期，然后转移到 MOPS 培养基中 3 小时以诱导 Arn 表达（泳道 1 和 2）。在MOPS中3小时后，将来自野生型培养物的用过的培养基离心以除去细胞并用于培养基切换。培养物的其余部分再生长一个小时（泳道 5 和 6）。对于培养基转换，将LB中指数生长的细胞沉淀、洗涤并重悬于野生型培养物的用过的MOPS培养基中。将这些培养物生长 1 小时，以测试用过的培养基是否含有诱导 Arn 表达所需的触发器（泳道 3 和 4）。对于蛋白质印迹，使用SDS-PAGE分离提取的蛋白质样品，转移到PVDF中，并使用抗Flag抗体进行检测。所示图像代表了 ≥2 实验的结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s006

（TIF）

S1 表。 质谱鉴定的蛋白质和差异表达分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s007

（XLSX）

S2 表。 Varas及其同事与Baijal及其同事质谱数据集之间的重叠比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s008

（XLSX）

S3 表。 用于这项工作的细菌菌株、质粒和qPCR引物。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s009

（XLSX）

S4 表。 用于这项工作的试剂和抗体条件。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s010

（XLSX）

S1 数据。 火山图、全有或全无蛋白质气泡图和 GO 项分析的原始数据如图 1B、1C 和 1E 所示。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s011

（XLSX）

S2 数据。 生长曲线和生长曲线分析的原始数据如图2A-2D所示。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s012

（XLSX）

S3 数据。 qPCR分析的基础数据如图3G所示。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s013

（XLSX）

S1 原始图像。 未裁剪和未经调整的蛋白质印迹、ponceau S、polyP 凝胶、脂质 A 谱和斑点测试图像。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002558.s014

（PDF格式）

确认

我们感谢唐尼实验室的成员对手稿的批判性评价。我们感谢加州大学戴维斯分校蛋白质组学核心，特别是Gabriela Grigorean博士提供的方法细节。我们还要感谢 Michael Gray 博士提供的 WT 和 Δppk 亲本菌株以及 pPPK 质粒，以及 Ursula Jakob 博士提供的 UPEC WT 和 Δppk 菌株。最后，我们感谢 Lionello Bossi 博士和 Donald Court 博士在这项工作中使用的标记和重组辅助质粒。

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