厦门免费医学论文发表-开发针对 SARS-CoV-2 包膜蛋白的抑制肽

拉姆齐·贝克达什 ，吉田一重 ，马诺伊·奈尔（Manoj S.Nair），邱婷婷，乔纳森·阿杜特，

抽象

自 2019 年冠状病毒病 （COVID-19） 大流行开始以来，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 已影响约 8 亿人。由于SARS-CoV-2的诱变率很高，因此很难开发一种可持续的预防和治疗方法。Envelope （E） 蛋白在人类冠状病毒中高度保守。先前的研究报告称，SARS-CoV-1 E 缺乏症减少了病毒传播，这表明 E 抑制可能是 SARS-CoV-2 的有效治疗策略。在这里，我们报告了针对 SARS-CoV-2 E 蛋白的抑制肽，名为 iPep-SARS2-E。利用 E 诱导的哺乳动物细胞中质子稳态和 NFAT/AP-1 通路的改变，我们开发了筛选平台来设计和优化结合和抑制 E 蛋白的肽。使用 Vero-E6 细胞、人诱导的多能干细胞衍生的分支肺类器官和带有 SARS-CoV-2 的小鼠模型，我们发现 iPep-SARS2-E 显着抑制病毒出口并降低病毒在体外和体内的细胞毒性和繁殖。此外，该肽可针对其他人类冠状病毒（如中东呼吸综合征冠状病毒 （MERS-CoV））的 E 蛋白进行定制。结果表明，E蛋白可以成为人类冠状病毒的潜在治疗靶点。

数字

Fig 7图1图2图3图4图5Fig 6Fig 7图1图2图3

引文： Bekdash R， Yoshida K， Nair MS， Qiu L， Ahdout J， Tsai H-Y， et al. （2024） 开发针对 SARS-CoV-2 包膜蛋白的抑制肽。PLoS 生物学 22（3）： 编号：E3002522。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522

学术编辑： Frank Kirchhoff，德国乌尔姆大学医学中心

收到： 2023年9月18日;接受： 2024年1月25日;发表： 3月 14， 2024

版权所有： ? 2024 Bekdash et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。这些数据也可以通过西奈山伊坎医学院的数据管理和研究合规委员会访问。本研究中使用的所有材料和质粒构建体均由 Yazawa 博士的实验室维护，可根据要求提供。未来，这些构建体将被存放并可通过Addgene订购。

资金： 这项工作得到了哥伦比亚大学院长办公室基金和哥伦比亚大学转化治疗学（TRx）试点奖（M.Y.）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： M.Y.、R.B.、K.Y.、D.D.H.、M.S.N. 和 Y.H.（发明人）提交了与本手稿相关的专利（律师案卷编号：01001/00889-US0;状态：已提交，2022 年 4 月 13 日）。该专利用于使用靶向 SARS-CoV-2 包膜蛋白的合成肽来治疗 COVID-19 和相关人类冠状病毒。其余作者声明没有竞争利益。

缩写： 牛血清白蛋白， 牛血清白蛋白;COVID-19， 2019冠状病毒病;DMEM， Dulbecco 的 Modified Eagle Media;DMSO， 二甲基亚砜;ECL， 增强化学发光;DRM的 内质网;ERGIC， ER-高尔基体隔间;牛血清， 胎牛血清;罗斯福 错误发现率;HEK， 人类胚胎肾脏;吉隆坡， 锁孔 limpet 血蓝蛋白;中东呼吸综合征冠状病毒， 中东呼吸综合征冠状病毒;NCE， 归一化碰撞能量;美国国立卫生研究院， 美国国立卫生研究院;PBS， 磷酸盐缓冲盐水;聚合酶链反应（PCR）， 聚合酶链反应;PS， 青霉素/链霉素;聚氯乙烯（PVDF）， 聚偏二氟乙烯;SARS-CoV-2， 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2;SPS， 同步前驱体选择;TBS-T型， Tris缓冲盐水与0.1%吐温20;TMT， 串联质量标签

介绍

由SARS-CoV-2引起的2019冠状病毒病（coronavirus Disease 2， COVID-19）大流行[1–3]已影响全球约8亿人，而且还在不断增加。超过600万人因病毒感染而死亡。由于SARS-CoV-2基因（如Spike）的诱变率很高[4–6]，因此开发可持续的预防和治疗方法是一项挑战。虽然已经有几种新的疫苗和候选药物问世，但COVID-19感染和死亡人数仍在增加，并且有新的变异株被报道[7–10]。因此，如果我们能够靶向在 SARS-CoV-1 和 SARS-CoV-2 变体以及其他人类冠状病毒中高度保守的冠状病毒基因，那将是理想的选择。SARS-CoV-2和中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus， MERS-CoV）等人类冠状病毒表达一种包膜（E）蛋白，该蛋白形成病毒功能所必需的离子通道，称为病毒通道蛋白[11–17]。已知E蛋白通过许多不同的分子和信号通路诱导细胞毒性[12,16,18–23]，E蛋白也被认为参与宿主细胞中刺突蛋白的保护和成熟[20,24]。与其他分子相比，E蛋白在冠状病毒中高度保守：SARS-CoV-2 E（2E）蛋白的75个氨基酸残基与SARS-CoV-1 E蛋白具有高度同源性（约96%），具有相同的氨基（N）末端、跨膜和孔结构，而它们的羧基（C）末端略有不同[11,25–31]（图1A).先前的研究报告称，SARS-CoV-1 E基因的缺乏显著降低了病毒的传播[12]，这表明2E也可能在病毒功能中发挥重要作用，并可能成为COVID-19和未来变异株的潜在治疗靶点[10]。因此，在这项研究中，我们寻求开发筛选平台，并应用它们来识别针对2E的候选药物。此外，我们研究了我们靶向2E的治疗方法是否适用于其他人类冠状病毒的E蛋白。

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图 1. 在哺乳动物细胞的溶酶体 pH 成像上测试名为 MY18 的 SARS-CoV-2 包膜的氨基末端片段。

(A） SARS-CoV （SARS1-E） 和 SARS-CoV-2 （SARS2-E） 包膜的比对，显示了氨基酸（红色）、名为 MY18 的目标氨基末端区域（红色下划线）和推定的跨膜区域（黑色下划线，18-39）的差异。（B） 装载有 DND-189（一种溶酶体 pH 绿色荧光染料）并转染 MY18 肽构建体、空载体 （mock） 和融合 mKate2 红色荧光蛋白 （2E-mKate2） 的 SARS2-E 的 NIH 3T3 细胞的代表性共聚焦荧光和明场图像。比例尺，5μm。（C） 使用不含 （-， n = 36） 和 MY18 质粒 （+MY18， n = 30） 转染的 NIH 3T3 细胞中 DND-189 染料的相对荧光强度。具有Tukey多重比较检验的单因素方差分析（**** P < 0.0001;n.s. 不显著）。（D） 哺乳动物细胞中 MY18 肽摄取的细胞穿透肽候选物 6-Arg （6Arg）、TAT 和 Penetratin （Pen） 的序列。（E） 与 MY18 （10 μM， n = 93）、6Arg-MY18 （0.1 μM， n = 40; 1， n = 41; 10， n = 106）、TAT-MY18 （0.1 μM， n = 27; 1， n = 20; 10， n = 92） 和 Pen-MY18 肽 （0.1 μM， n = 27; 1， n = 32; 10， n = 68） 一起孵育的 NIH 3T3 细胞中 DND-189 染料的相对荧光强度 2E-mKate2 质粒转染。Mock （n = 116） 和未经处理的 2E-mKate2 （-， n = 139） 也作为对照进行了测试。在 1 μM 条件下，TAT-MY18 肽与模拟（蓝色突出显示）没有区别，而 6Arg 和 Pen 明显低于模拟。Dunnett多重比较检验的单因素方差分析（**** P < 0.0001;*** P < 0.001;** P < 0.01;n.s. 与模拟相比不显著）。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。图中所有图表均为SD的平均值±。 美国国立卫生研究院（NIH），美国国立卫生研究院（National Institute of Health）;SARS-CoV-2，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.g001

结果

既往研究报道了SARS-CoV-1 E和2E的寡聚结构和分子相互作用[25,26,32]。根据结果，我们假设高度保守的 N 端区域对寡聚化至关重要，并且 N 端片段可能能够破坏 2E 蛋白寡聚化和功能，因为 N 端可能在蛋白质低聚物中相互作用。由于我们之前的研究表明，2E的过表达会影响哺乳动物细胞中高尔基体和溶酶体等细胞内细胞器中的质子稳态[19]，因此我们使用哺乳动物细胞中的DND-189 pH荧光染料和MY18质粒转染检查了名为MY18（18个氨基酸，MYSFVSEETGTLIVNSVL）的N端片段对2E功能的影响。基于 DND-189 的 pH 荧光成像显示，MY18 在表达 2E 的哺乳动物细胞中共过表达可显着将 DND-189 荧光恢复到正常水平（图 1B 和 1C）。这些结果鼓励了进一步研究使用MY18作为抑制2E的肽。接下来，为了将 MY18 作为外源性合成肽应用，我们测试了 3 个细胞穿透氨基酸基序：精氨酸重复序列、TAT 和 Penetratin [33]（图 1D）。基于 DND-189 的 pH 成像表明，MY18 的 TAT 版本是细胞穿透肽候选物中最有前途的细胞穿透肽（图 1E）。

While DND-189-based pH fluorescent imaging is useful as a drug screening platform of live mammalian cells, the dynamic range of the dye is somewhat limited, the standard deviation of fluorescent readout is relatively large, and its throughput is not as high as that of an assay for screening. These limitations may give rise to difficulties in further optimizing the MY18 peptide using molecular biological approach with mutagenesis. To develop a higher-throughput screening platform, we overexpressed 2E in mammalian cells and explored other reliable and quantitative readouts. Interestingly, global proteomics results showed increases of various key signaling molecules such as JUN/AP-1 (Fig 2A). A follow-up experiment using quantitative RT-PCR (qPCR) confirmed that the expression of most of the genes including JUN transcript are significantly increased in 2E-expressing cells compared to mock (Figs 2B and S1). The transcript expression of a JUN-related molecule, NFATC4/NFAT3, is also up-regulated significantly (Fig 2C), though the increase of NFATC4/NFAT3 protein (approximately 120%) did not reach to significance in statistical analysis of the global proteomics results with the standard false discovery rate (FDR, 0.05, Fig 2A). Following these results, we decided to apply the NFAT response element of the human IL-2 gene where NFAT and JUN/AP-1 interact [34]. To obtain precise readouts, we used a dual luciferase reporter system containing NFAT Firefly luciferase reporter and pRL-TK-Renilla luciferase reporter as the transfection control using HSV TK, herpes simplex virus thymidine kinase, promoter [35] (Fig 2D). The luciferase assay result obtained using plasmid DNA co-transfection shows that 2E overexpression significantly increases the Firefly luciferase activity in mammalian cells and that MY18 co-expression significantly suppresses the effect of 2E on the NFAT/AP-1 pathway, though it does not fully restore it to mock levels (Fig 2E). These results suggest that MY18 is not sufficient to prevent 2E from altering the NFAT/AP-1 pathway completely, though we observed that MY18 restores proton homeostasis in DND-189-based pH fluorescent imaging (Fig 1). Looking to optimize MY18, we next examined whether deletion or extension of MY18 might improve the effect on interrupting 2E function using the luciferase reporter. We found that none of the constructs significantly improved the effect, as the majority reduced efficacy (Fig 2F). Next, we tested a variety of MY18 mutant constructs using mutagenesis, co-transfection and luciferase assay, and found that the substitution of glutamate to aspartate at seventh and eighth residues (EE7-8DD or 2ED) significantly improved MY18 (Fig 2G). We combined the mutant 2ED and TAT cell-penetrating motif (Fig 1D and 1E) and called TAT-MY18-2ED “iPep-SARS2-E” (inhibitory Peptide against SARS-CoV-2 Envelope). In addition, we confirmed that iPep-SARS2-E had the same rescuing effect on lysosomal pH phenotype in 2E-transfected mammalian cells as the plasmid construct did (S2A Fig).

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Fig 2. Mutagenesis of MY18 peptide to develop iPep-SARS2-E.

(A) Volcano plots of global proteomics of HEK 293S cells transfected with SARS2-E fused to mKate2 (2E-mKate2). Red plots demonstrate significant increases in 2E-mKate2 compared to empty vector (mock) (FDR: 0.05). (B and C) The expressions of JUN/AP-1 (B) and NFATC4 transcripts (C) significantly increased in HEK 293S cells transfected to 2E-mKate2 compared to mock. Unpaired Student’s t test was used (** P < 0.01; * P < 0.05, n = 3–4). (D) Schematic representation of dual luminescence reporter system using 4-repeated NFAT response element (RE) of human IL-2 gene and Firefly luciferase gene (NFAT-FLuc) and herpes simplex virus thymidine kinase (HSV TK) promoter-driven Renilla luciferase gene (TK-RLuc) as transfection control. (E) Relative NFAT-FLuc/TK-RLuc activity in HEK 293T cells transfected using empty vector (mock, n = 9) or 2E-mKate2 plasmid without (-, n = 9) and with MY18 plasmid (+MY18, n = 12). One-way ANOVA with Tukey’s multiple comparisons test was used (**** P < 0.0001). (F) Relative NFAT-FLuc/TK-RLuc activity in HEK 293T cells transfected using empty vector (mock, n = 9) or 2E-mKate2 plasmid without (-, n = 6) and with various sizes of SARS2-E amino-terminal constructs including MY18 (each, n = 6, inset). One-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons test was used (**** P < 0.0001; ** P < 0.01; * P < 0.05; n.s., not significant, compared to MY18). (G) Relative NFAT-FLuc/TK-RLuc activity in HEK 293T cells transfected using empty vector (mock, n = 3) or 2E-mKate2 plasmid without (-, n = 3) and with MY18 mutants (each, n = 3). One-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons test was used (**** P < 0.0001; ** P < 0.01; * P < 0.05; n.s., not significant, compared to MY18 wild-type, WT, n = 9). S-T switch, Ser and Thr replaced each other. The inset demonstrates the amino acid sequence of MY18-2ED (EE7-8DD, underlined) mutant, which significantly improves the inhibitory effect on SARS2-E-mediated NFAT-JUN/AP-1 activation. The data underlying this figure can be found in S1 Data. All the graphs in the figure are mean ± SD. FDR, false discovery rate; HEK, human embryonic kidney.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.g002

To characterize iPep-SARS2-E, we first produced a monoclonal antibody against the N-terminal region of 2E. Following previous studies of viral envelope topology, we believed that the N-terminus may be in the extracellular region of SARS-CoV-2 [25,36]. To produce the monoclonal antibody, we used a synthetic peptide composed of the first 18 amino acids of E protein (i.e., MY18) with keyhole limpet haemocyanin (KLH) as the antigen. Western blotting result reveals that a hybridoma produces a 2E monoclonal antibody (2E-N; clone, N2A5E8) that can recognize 2E proteins expressed in a mammalian heterologous expression system (S2B Fig). Next, we conducted an ELISA using the antibody to compare the affinity of our 2E-N antibody to our 2ED and wild-type peptides. We confirmed that the 2ED mutation reduces the binding affinity of the 2E antibody, which was produced using the wild-type MY18 peptide as the antigen (S2C Fig). Next, we used ELISA to examine how stable iPep-SARS2-E is in phosphate-buffered saline (PBS) at 37°C. We did not observe obvious peptide degradation in 24 h, though the peptide might become unstable after 48 h because the standard deviation became larger compared to earlier time points (S2D Fig). Using an apoptosis/necrosis assay with flow cytometry, we confirmed that iPep-SARS2-E does not cause cellular toxicity in mammalian cells in vitro (S2E–S2G Fig).

To investigate the interaction of MY18-2ED and 2E protein biochemically, we first conducted immunoprecipitation using 6xHis-tagged MY18-2ED (His-MY18) and 2E-YFP with Ni column. The western blotting using anti-GFP antibody, which can recognize 2E-YFP protein band, demonstrates that Ni column with His-MY18 can pull down 2E-YFP proteins (Fig 3A), suggesting an interaction between MY18-2ED and 2E protein, though there was no obvious difference in MY18-2E protein interaction between the wild-type and 2ED peptide constructs, according to the immunoprecipitation result (S2H Fig). To confirm this in situ, we co-expressed 2E-mKate2 with His-MY18 in NIH 3T3 cells using lipofection and anti-His tag antibody conjugated to Alexa Fluor 488 to examine whether MY18 peptide interacts 2E protein directly. The fluorescent imaging result reveals that His-MY18 are co-localized with 2E proteins in the mammalian cells (Fig 3B). To further investigate the molecular mechanism underlying the inhibitory effect of MY18-2ED, we next used our established electrophysiological recording [19] to examine whether MY18-2ED co-transfected with 2E has a direct effect on 2E channel activity. The result demonstrates that MY18-2ED significantly reduced 2E channel current in HEK cells (Fig 3C and 3D), suggesting that MY18-2ED may inhibit 2E function directly. Together, the results suggest that MY18-2ED might be integrated into 2E protein oligomers and inhibit 2E function.

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Fig 3. Characterization of iPep-SARS2-E.

(A) Immunoprecipitation of 2E protein using Ni column and HEK 293T cells transfected using 2E-YFP with or without 6xHis-MY18-2ED (His-MY18). Anti-GFP antibody was used to blot 2E-YFP protein bands. (B) Representative epi-fluorescence image of NIH 3T3 cells co-transfected with 2E-mKate2 (red) and His-MY18 plasmids. Anti-His tag antibody conjugated to Alexa Fluor 488 (green) and Hoechst 33258 dye (blue, nucleus) were used after cell fixation. White arrowheads, co-localization of red and green fluorescence. Scale bar, 5 μm. (C) Representative SARS2-E currents in 2E-PM-expressing HEK 293S cells mock-transfect and co-transfected with MY18-2ED peptide construct. (D) MY18-2ED significantly blocked 2E currents. Student’s t test was used (*** P < 0.001). (E) Representative immunoblot images of HEK 293T cells transfected with SARS2-E fused with YFP (2E-YFP) and 48 h treated with 10 μM TAT-MY18-2ED or MY18-WT peptides (negative control). Anti-GFP (for 2E-YFP, top) and GAPDH antibodies (as loading control, bottom) were used. Putative aggregates of 2E-YFP proteins (&) were observed even though Urea-based lysis buffer was used for the sample preparation. #, nonspecific bands around 40 and 50 kDa according to the YFP blotting (S3B Fig). The whole blotting image of GAPDH is shown in S3A Fig. (F and G) Quantification of 2E-YFP monomeric form (F) and aggregates (G) of HEK 293T cells transfected with 2E-YFP and treated using TAT-MY18-2ED (n = 4) or MY18-WT peptides (n = 4). Student’s t test was used (*** P < 0.001). (H) Representative immunoblot images of HEK 293T cells transfected with YFP plasmid and 48 h treated with TAT-MY18-2ED (10 μM, n = 3) and MY18-WT peptides (10 μM, n = 3, a negative control) and non-treated cells (n = 3, another negative control). Anti-GFP (for YFP, top) and GAPDH antibodies (as loading control, bottom) were used. The whole blotting images and quantification are shown in S3B and S3C Fig, respectively. (I) Schematic representation of the molecular mechanism underlying the effect of MY18 peptide on 2E protein and lysosomal function. The images are prepared using BioRender: Top, 2E induces deacidification in lysosome (Fig 1B and 1C); bottom, MY18 peptides binds 2E proteins (Fig 3A and 3B), resulting in 2E inhibition (Fig 3C and 3D) and restored lysosomal activity (Figs 1B, 1C and S2A) and 2E protein reduction (Fig 3E–3G). The data underlying this figure can be found in S1 Data. All the graphs in the figure are mean ± SD. HEK, human embryonic kidney; NIH, National Institute of Health.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.g003

To examine the effect of MY18-2ED on 2E protein, we incubated mammalian cells with iPep-SARS2-E and transfected them with 2E-YFP construct. Interestingly, iPep-SARS2-E significantly reduced 2E-YFP protein expression in mammalian cells. While we observed both monomeric and aggregate bands of 2E proteins, both forms were significantly decreased in the treated cells (Figs 3E–3G and S3A). As a control experiment, we used YFP-transfected cells with peptide treatment and did not observe any effect of iPep-SARS2-E on YFP protein expression (Figs 3H, S3B and S3C). The results indicate that iPep-SARS2-E does not affect lipofection but reduces 2E expression in mammalian cells. Based on the results obtained in the series of experiments, the suggested molecular mechanism underlying the inhibitory effect of iPep-SARS2-E is as follows (Fig 3I): the peptides might interact with 2E proteins (Fig 3A and 3B) and inhibit 2E channel function (Fig 3C and 3D), resulting in lysosomal pH restoration (Figs 1B–1E and S2A) and 2E protein degradation (Fig 3E–3G).

To examine the kinetics of peptide penetration into mammalian cells, we conjugated a fluorescent probe, Alexa Fluor 594, to the N- or C-terminus of iPep-SARS2-E. Fluorescent imaging in situ reveals that the C-terminal fused version exhibited faster cell-penetration than the N-terminal version in NIH 3T3 cells. We found that most cells can uptake the peptides in 2 h (S4A and S4B Fig). This result suggests that the N-terminal conjugation of Alexa Fluor 594 might slightly affect the function of the TAT motif in the peptide. To examine the off kinetics, we next treated cells with iPep-SARS2-E fluorescent peptide (C-terminal version, TAT-MY18-2ED-Alexa Fluor 594) for 24 h, washed out the culture medium, and then monitored the red fluorescence (S4C Fig). The in situ imaging suggests that the peptide is not reduced or degraded for 96 h; however, the peptide might become unstable and aggregated after 72 h at 37°C in the live cells, since larger fluorescent puncta were observed compared to earlier time points (S4D Fig). In addition, we tested the C-terminal version in another mammalian cell line, Vero-E6, which has been commonly used in virological studies using SARS-CoV-2. We confirmed that the peptides can penetrate into these cells as well (S5A and S5B Fig).

To examine the effect of iPep-SARS2-E on SARS-CoV-2 infection, as a proof-of-concept experiment in vitro, we conducted a cytopathic assay using a mammalian cell line, Vero-E6, and SARS-CoV-2 (WA1 strain, Fig 4A). We used the wild-type MY18 peptide (non-TAT version, MY18-WT) as a negative control in the assay because MY18-WT does not have any cell-penetrating motifs or effect on 2E in the pH imaging in NIH 3T3 cells (Fig 1E). The cytopathic assay result demonstrates that iPep-SARS2-E significantly inhibits viral toxicity in vitro (Fig 4B: IC50iPep-SARS2-E，约400 nM）。根据这些结果，我们接下来进行了时程实验，以阐明iPep-SARS2-E对病毒功能的抑制作用的机制（图4C）。qPCR结果表明，SARS-CoV-2核衣壳（N）基因表达没有差异，表明iPep-SARS2-E对病毒转录和进入没有影响（图4D）。另一方面，在感染后 24 小时取样的 PBS 处理对照的培养上清液与 iPep-SARS2-E 处理的细胞在 SARS-CoV-2-N 基因检测方面存在显着差异（图 4E），表明 iPep-SARS2-E 处理的细胞的病毒释放显着减少。重要的是，我们发现 iPep-SARS2-E 可以显着恢复 JUN/AP-1 的表达（图 4F），我们在这项研究中将其用作 SARS2-E 细胞毒性的报告基因，以优化 MY18 肽系列（图 2）。根据之前的一项研究，电子显微镜显示，在PBS处理的细胞的大液泡中可以观察到病毒颗粒（图4G和4H），这些液泡可能被脱酸并破坏溶酶体[37]。然而，在iPep-SARS2-E处理的细胞中没有发现含有多种病毒颗粒的液泡，而在内质网和核膜中发现了小颗粒（图4I和S6A）。这表明这些颗粒可能是病毒粒子，尽管目前尚不清楚病毒粒子是否在iPep-SARS2-E处理的细胞中成熟。因此，我们接下来通过用于定量细胞内病毒颗粒的终点滴定法（S6B图）[38–40]，检查了来自iPep-SARS2-E处理的细胞的细胞内颗粒的传染性。我们发现，与PBS处理的对照细胞相比，iPep-SARS2-E处理的细胞样本的病毒滴度略有降低<，但iPep-SARS2-E处理的细胞样本的细胞内颗粒仍然具有传染性（S6C图）。

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图 4. iPep-SARS2-E体外测试。

(A） 在体外使用 SARS-CoV-2 WA1 病毒 （MOI， 0.10） 和 Vero-E6 细胞进行 iPep-SARS2-E （TAT-MY18-2ED） 测试的实验设计。（B） 抑制 iPep-SARS2-E 对 SARS-CoV-2 WA1 病毒对 Vero-E6 细胞的细胞病变作用。MY18-WT（非TAT）用作对照。（C） 使用 SARS-CoV-2 WA1 病毒 （MOI， 0.10） 和 Vero-E6 细胞的体外时程实验设计。（D） PBS 和 iPep-SARS2-E （10 μM） 处理的 Vero-E6 细胞的 SARS2-CoV-2 核衣壳 （SARS2 N） 表达的时程 qPCR。N 基因的表达被归一化为管家基因 GAPDH。在每个时间点使用学生的 t 检验（n.s.，不显著）。（E） 感染后 24 小时 PBS 和 iPep-SARS2-E （10 μM） 处理的 Vero-E6 细胞培养上清液 （sup） 的 SARS2 N 表达的 qPCR。采用学生 t 检验 （**** P < 0.0001）。（F） 与未感染细胞相比，PBS 和 iPep-SARS2-E （10 μM） 处理的 Vero-E6 细胞的 JUN/AP-1 表达的 qPCR。将JUN的表达归一化为GAPDH。采用单因素方差分析与Tukey多重比较检验（* P < 0.05;n.s.，不显著）。（G） 感染后 24 小时 PBS 处理的 Vero-E6 细胞的代表性电子显微镜 （EM） 图像。比例尺，500 nm。（H） 感染后 24 小时 PBS 处理的 Vero-E6 细胞的 EM 图像的更高放大倍率（图 4G 所示的框）。比例尺，100 nm。（I） 感染后 24 小时经 iPep-SARS2-E 处理的 Vero-E6 细胞的代表性 EM 图像。箭头，病毒样颗粒积聚在内质网中。另一个EM图像也显示在S6A图中。比例尺，500 nm。（J） 感染后 24 小时用 PBS 或 iPep-SARS2-E 处理的 Vero-E6 细胞的代表性共聚焦荧光图像。SARS2 N 抗体（红色）和 Hoechst 33258 染料（蓝色，用于细胞核）与亚细胞器标志物（绿色）的抗体一起使用：BiP 用于内质网 （ER）、ERGIC-53 用于内质网高尔基体间室 （ERGIC） 和 LAMP1 用于溶酶体。比例尺，5μm。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。图中所有图形均为SD±均值。 EM，电子显微镜;ER，内质网;ERGIC，ER-高尔基体隔室间;PBS，磷酸盐缓冲盐水;qPCR，定量聚合酶链反应;SARS-CoV-2，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.g004

E protein is thought to be involved in Spike protein protection and maturation [20,24]. Therefore, we examined the effect of iPep-SARS2-E on Spike protein expression. The western blotting result demonstrates significant reductions of Spike protein expression (S6D Fig). Immunocytochemistry confirms that, in iPep-SARS2-E-treated cells, N proteins are co-localized to BiP/GRP78 (a marker of endoplasmic reticulum, or ER), and to ERGIC-53 (a marker of ER-Golgi inter-compartment, or ERGIC); in PBS-treated cells, N proteins were more highly and broadly expressed, and co-localized to LAMP1 (a lysosomal marker) (Fig 4J).

Following these results, we conducted in vitro experiments using iPep-SARS2-E at a later time-point to examine its effect further. qPCR shows that there is a significant decrease in SARS-CoV-2 N and E gene expression in iPep-SARS2-E-treated Vero-E6 cells at 48 h post-infection compared to the PBS-treated control cells (S6E and S6F Fig). In addition, iPep-SARS2-E significantly restores the expression of JUN/AP-1 (S6G Fig). Importantly, detection of SARS-CoV-2 genes in the culture supernatant harvested at 48 h post-infection is significantly reduced in iPep-SARS2-E-treated cells compared to PBS-treated control cells (S6H Fig), demonstrating that iPep-SARS2-E suppresses virus release. Immunocytochemistry shows that the majority of infected Vero-E6 cells became round and apoptotic-like in the PBS-treated group, while iPep-SARS2-E-treated cells exhibited moderate expression of viral N and normal cellular morphology (S6I Fig). This is consistent with the results of the cytopathic assay (Fig 4B).

Next, to validate the inhibitory effect of iPep-SARS2-E further, we conducted a preclinical experiment in vivo using iPep-SARS2-E intravenous (i.v.) injection to Balb/c mice infected with a mouse-adapted strain of SARS-CoV-2 (MA10, [41–43]). First, we conducted i.v. injection of the C-terminal fluorescent version of iPep-SARS2-E (TAT-MY18-2ED-Alexa Fluor 594) to mice and confirmed that the peptide can permeate and is detectable in mouse lung tissues 2 h after administration (Fig 5A). Following this result, we next injected iPep-SARS2-E post-infection. The mice were sacrificed 4 days after MA10 viral infection, and their lungs were harvested for viral titer, qPCR, and histology (Fig 5B). The results show no difference in body weight between the groups, but a significant reduction of viral propagation in iPep-SARS2-E-treated mouse lungs compared to the control (Fig 5C and 5D). qPCR also confirms the inhibitory effect of iPep-SARS2-E on the viral propagation in vivo (Fig 5E). Lung histology reveals no immune infiltration or alveolar damage in iPep-SARS2-E-treated mouse lungs, while minimal interstitial infiltrates with patchy lymphoid aggregates and protein accumulation were observed in the non-treated control group (Fig 5F).

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Fig 5. iPep-SARS2-E in vivo preclinical study.

(A) Representative fluorescent and bright field images of lung tissues isolated from mice administrated i.v. with PBS or Alexa594-conjugated iPep-SARS2-E peptide (TAT-MY18-2ED-A594, 300 μM, 2 h and 24 h). After isolating the tissues, the samples were washing using PBS 3 times, and the fluorescent and bright field images were taken by a fluorescent stereoscope. Scale bar, 2 mm. (B) Experimental design using the iPep-SARS2-E i.v. injection in vivo. (C) There is no difference in body weight between PBS control (n = 11) and iPep-SARS2-E-treated mice (n = 7). (D) There is a significant reduction of lung viral titer in iPep-SARS2-E-treated mice compared to the control. Student’s t test was used (* P < 0.05; n.s., not significant). Median TCID is normalized to lung wet weight (g) measured before tissue homogenization to isolate the virus. (E) iPep-SARS2-E significantly reduced the transcript expression of SARS2 N in MA10-infected Balb/c mouse lung tissues (PBS, n = 11; iPep-SARS2-E, n = 7, normalized to mouse Gapdh expression). Student’s t test was used (** P < 0.01). (F) Representative images of hematoxylin and eosin (HE) staining of mouse lung tissues of PBS control and iPep-SARS2-E-treated mice at 4 days post-infection. Protein accumulation (x) and immune cells (arrowheads) are indicated. Scale bar, 50 μm. The data underlying this figure can be found in S1 Data. All the graphs in the figure are mean ± SD. HE, hematoxylin and eosin; PBS, phosphate-buffered saline; TCID, tissue culture infection dose.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.g005

To examine whether iPep-SARS2-E could be applied for prevention of SARS-CoV-2 infection, we conducted another experimental series in vivo using iPep-SARS2-E intranasal administration to Balb/c mice infected with MA10 virus. First, we administrated the C-terminal fluorescent version of iPep-SARS2-E to mice intranasally and confirmed that the peptide can permeate and is detectable in mouse nasal tissues 2 h after administration (S7A and S7B Fig). Next, we conducted a safety study in vivo (S7C Fig) using intranasal administration to Balb/c mice to examine the effect of iPep-SARS2-E on body weight and inflammation markers, comparing to non-treated and PBS-administrated groups. We did not find any significant differences in body weight, Cxcl12 and C5a among iPep-SARS2-E-, PBS-, and non-treated groups (S7D–S7F Fig). Following the results using intranasal administration, we applied iPep-SARS2-E intranasal administration to Balb/c mice infected with MA10 virus (S7G Fig). We found that iPep-SARS2-E significantly prevents the body weight loss and suppresses 2E protein expression in infected mouse lungs in vivo (S7H–S7K Fig). These results using in vivo experiments demonstrate that SARS2-E inhibition can be a novel strategy to prevent SARS-CoV-2 toxicity and propagation in vivo.

To validate iPep-SARS2-E further, we continued to conduct control experiments, preparing an additional negative control and experimental conditions. When we examined the effect of deletion on MY18 constructs using the luciferase reporter, we had found that none of the constructs significantly improved the effect: the majority did not reduce its efficacy significantly, but deletion at the 5th and 17th/18th residues significantly reduced the inhibitory effect of MY18 on 2E-mediated NFAT/AP-1 pathway alteration (Fig 2F). Following the results, we introduced Ala-substitution, targeting these amino acids of MY18 (S8A Fig). NFAT/AP-1 Luc assay and DND-189 imaging results demonstrate that the mutagenesis significantly reduced the inhibitory effect of MY18, although NFAT/AP-1 Luc assay result suggests that it was not sufficient to fully counteract the effect of MY18 (S8B and S8C Fig). After further mutagenesis, we found that the addition of an L12A substitution was able to negate the inhibitory effect of MY18 against 2E. We confirm using qPCR, that, like PBS, the mutant peptide cannot reduce SARS-CoV-2 N expression in Vero-E6 cell culture supernatant (S8D Fig). In the following experiments, we used this mutant peptide as a new negative control.

The qPCR results using Vero-E6 cell culture supernatant and lysate samples at 24 h post-infection with SARS-CoV-2 (Fig 4C–4E) suggest that iPep-SARS2-E may not have any effect on the virus entry. However, this time-course transcription profiling may not be sufficient as a readout of the virus entry. To address this concern, we conducted an experiment using pseudo virus containing SARS-CoV-2 Spike, Membrane, E proteins, and YFP reporter with the negative control peptide and iPep-SARS2-E because pseudo virus is useful to examine the effect of drug candidates on the virus entry [44]. The pseudo virus infection resulted in no difference in YFP-positive cell number between the negative control peptide- and iPep-SARS2-E-treated cells, revealing no effect of iPep-SARS2-E on the virus entry (S8E and S8F Fig).

To validate the inhibitory effect of iPep-SARS2-E peptide further, we conducted in vitro experiments using human pluripotent stem cell-derived branching lung organoids and WA1 virus (Fig 6A and 6B). We found that there is a significant reduction in SARS-CoV-2 N transcript of the culture supernatant at 24 h post-infection between the negative-control peptide- and iPep-SARS2-E-treated organoids but not in the organoid lysate (Fig 6C and 6D), suggesting that virus egress is blocked by iPep-SARS2-E. Immunocytochemistry allows us to observe higher expression of SARS-CoV-2 N in the negative control peptide-treated organoids compared to iPep-SARS2-E-treated organoids (Fig 6E). The results using the lung organoids are consistent with the results using Vero-E6 cells at 24 h post-infection (Fig 4). Our results in monolayer cells and in human 3D lung organoids reveal a new strategy to prevent SARS-CoV-2 propagation using iPep-SARS2-E, which inhibits 2E activity and virus egress.

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Fig 6. iPep-SARS2-E and its negative control peptide test using in vitro human lung organoid model.

(A） 在体外使用 SARS-CoV-2 WA1 病毒 （MOI， 0.10） 和人多能干细胞衍生的分支肺类器官进行 iPep-SARS2-E 测试的实验设计。图像是使用 BioRender 制备的。（B） 人类多能干细胞衍生的分支肺类器官的代表性相差图像。比例尺，50μm。（C 和 D） 阴性对照突变肽 （neg. Ctrl， S8 Fig） 和 iPep-SARS2-E （10 μM） 处理的类器官培养上清液 （sup， C） 和细胞 （D） 的 SARS2 N 表达的 qPCR 感染后 24 小时。使用学生 t 检验 （* P < 0.05; n.s.， 不显著）。（E）具有代表性的共聚焦荧光和负离子处理的人肺类器官明场的合并切片图像。感染后 24 小时按 Ctrl 或 iPep-SARS2-E。使用 SARS2 N 抗体（红色，箭头）、EpCAM 抗体（绿色）和 Hoechst 染料（蓝色，用于细胞核）。比例尺，20μm。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。图中所有图表均为SD的平均值±qPCR，定量聚合酶链反应;SARS-CoV-2，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.g006

Next, we conducted another in vivo mouse study (S8G Fig) using a single intranasal administration to Balb/c mice to examine the effect of iPep-SARS2-E and the negative control peptide on body weight, SARS-CoV-2 titer, and N transcript in the mouse lungs. We found that iPep-SARS2-E could significantly prevent their body weight loss while the negative control did not (S8H Fig). The viral titer and qPCR results confirm the inhibitory effect of iPep-SARS2-E in vivo (S8I and S8J Fig). These in vivo results demonstrate that SARS2-E inhibition using a single intranasal dose of iPep-SARS2-E can be useful to prevent SARS-CoV-2 toxicity and propagation in vivo.

Next, we hypothesized that this peptide design and strategy could be customized and applied to other human coronaviruses because coronavirus E proteins are highly conserved (Figs 7A and S9). Therefore, following iPep-SARS2-E development, we designed inhibitory peptide constructs against E proteins from each of the other human coronaviruses: MERS-CoV, HCoV-NL63, -OC43, -HKU1, and -229E (Fig 7B). First, we found that the overexpression of MERS-CoV and HCoV-NL63 E proteins significantly increased NFAT/AP-1 luciferase reporter activity in mammalian cells while the E proteins of HCoV-OC43, -HKU1, and -229E do not have an effect on NFAT/AP-1 pathway (Fig 7C). Following these results, we focused our testing to MER-CoV and HCoV-NL63 MY18 WT peptide constructs using the NFAT/AP-1 luciferase reporter assay. The reporter assay results demonstrate that MERS-CoV and HCoV-NL63 MY18 WT could significantly reduce the effect of each E protein on NFAT/AP-1 reporter while substitution of Glu/E to Asp/D or Asp/D to Glu/E does not improve the MY18 constructs for MERS-CoV and HCoV-NL63, respectively (Fig 7D and 7E). To improve each MY18 further, we conducted mutagenesis of MERS-CoV MY18 and HCoV-NL63 MY18 constructs. We found that HCoV-NL63 MY18 2DE and N9D and MERS-CoV MY18 R8H are the best to inhibit the effect of HCoV-NL63 and MERS E proteins on NFAT/AP-1 pathway in mammalian cells, respectively (Fig 7D and 7E). Next, using DND-189 pH imaging, we found that the overexpression of MERS-CoV, HCoV-NL63, and -HKU1 E proteins significantly reduced DND-189 fluorescence in mammalian cells while the E proteins of HCoV-OC43 and -229E do not have a significant effect on lysosomal proton homeostasis (Fig 7F). Following these results, we focused on testing MY18 constructs on MERS-CoV, HCoV-NL63, and -HKU1 and found that MERS-CoV MY18 R8H, HCoV-NL63 MY18 2DE and N9D, HCoV-HKU1 MY18 D8E peptide constructs could significantly rescue the phenotypes in proton homeostasis in mammalian cells caused by the respective E proteins (Fig 7F). The results of this experiment reveal that the MY18 peptides can be applicable for not only SARS-CoV-2 but also some of the other human coronaviruses such as MERS-CoV, HCoV-NL63, and HCoV-HKU1, demonstrating that E protein can more broadly be a potential therapeutic target for human coronaviruses.

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Fig 7. MY18 peptide application for other human coronaviruses.

(A) Alignment of the N-terminal region of human coronavirus Envelope (E) of SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, and HCoV-HKU1. Glu (red), Asp (blue), and other amino acid residues (purple) are targeted for further mutagenesis to customize MY18 inhibitory peptides for each viral E. (B) MY18 peptide design for each human coronavirus E of SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, and HCoV-HKU1. Glu and Asp are replaced (red), following iPep-SARS2-E. (C) Relative NFAT-FLuc/TK-RLuc activity in HEK 293T cells transfected using mock (n = 17), SARS2-E (n = 10), and the other coronavirus E (each, n = 8). One-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons test was used (**** P < 0.0001; * P < 0.05; n.s., not significant, compared to mock). (D) Relative NFAT-FLuc/TK-RLuc activity in HEK 293T cells transfected using mock (n = 9), NL63-E without (n = 12), and with NL63-MY18 constructs (WT, n = 12; 2DE, n = 3; the other mutants, n = 6). One-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons test was used (**** P < 0.0001; *** P < 0.001; n.s., not significant, compared to mock). (E) Relative NFAT-FLuc/TK-RLuc activity in HEK 293T cells transfected using mock (n = 9), MERS-E without (n = 12), and with MERS-MY18 constructs (WT, n = 12; E7D, n = 3; the other mutants, n = 6). One-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons test was used (**** P < 0.0001; ** P < 0.01; n.s., not significant, compared to mock). (F) Relative fluorescent intensity of DND-189 dye in NIH 3T3 cells transfected with mock (n = 78) and the other human coronavirus E-mKate2 constructs: OC43 (n = 74), 229E (n = 66), MERS (n = 63), NL63 (n = 65), and HKU1 (n = 78). Each MY18 mutant construct was also tested: MERS-MY18 (R8H, n = 36), NL63-MY18 (2DE and N9D, n = 37), and HKU1-MY18 (D8E, n = 31). One-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons test was used (**** P < 0.0001; n.s., not significant, compared to mock). The data underlying this figure can be found in S1 Data. All the graphs in the figure are mean ± SD. HEK, human embryonic kidney; MERS-CoV, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus; SARS?CoV?2, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.g007

Discussion

我们应用了 pH 荧光染料 DND-189 来鉴定 TAT-MY18 作为针对 E 蛋白的治疗候选药物（图 1）。然而，染料的摄取可能取决于细胞活力和细胞内细胞器功能，因为 DND-189 是一种单一的绿色荧光染料。因此，荧光变化可能不是由于E蛋白的直接作用，而是次要作用。除了 DND-189 染料外，我们还应用了 NFAT/AP-1 荧光素酶报告基因检测作为更高通量筛选平台，以使用分子生物学方法优化 MY18 肽（图 2）。然而，NFAT/AP-1 的改变可能是哺乳动物细胞中 E 蛋白过表达的其他分子表型诱导的继发性后果。因此，免疫沉淀、免疫细胞化学和电生理记录有助于验证MY18肽对E蛋白功能的抑制作用（图3）。

体外和体内的对照安全性实验表明，iPep-SARS2-E在体外和体内没有明显的毒性（S2E-S2G和S7C-S7F图）。iPep-SARS2-E在体外和体内均对SARS-CoV-2有效（图4-6和S6-S8）。细胞病变检测结果表明，MY18-WT在使用NIH 3T3细胞（图1E）的DND-189成像中被验证为阴性对照，对Vero-E6细胞中的病毒也具有中等抑制作用（图4B），尽管不存在细胞穿透基序。这表明非 TAT 版本可能通过内吞作用自发地被吸收到 Vero-E6 细胞中。或者，我们使用诱变生成并验证了另一种阴性对照肽（图 6 和 S8）。

iPep-SARS2-E显著降低哺乳动物细胞中2E-YFP蛋白的表达，而对YFP和GAPDH蛋白没有影响（图3E-3H和S3A-S3C）。2E引起的溶酶体pH值改变可能导致保护作用，使病毒蛋白从蛋白水解中隔离，并促进病毒组装和释放，正如其他病毒所报道的那样[19,37]。因此，iPep-SARS2-E 诱导的 2E 抑制可能会恢复溶酶体 pH 值，使溶酶体恢复正常活性并导致 2E 和刺突蛋白的蛋白水解（图 3E-3G 和 S6D）。重要的是，体外研究表明，iPep-SARS2-E可能抑制病毒出口，因为iPep-SARS2-E处理的细胞培养上清液中的病毒转录本检测率明显低于PBS处理的对照（图4E）。另一方面，我们发现 iPep-SARS2-E 和对照组在 SARS-CoV-2 N 转录本表达和假病毒感染方面没有差异（图 4D、S8E 和 S8F），表明 iPep-SARS2-E 对病毒进入和转录没有影响。稍后时间点的细胞病变测定表明，细胞内颗粒在 iPep-SARS2-E 处理的细胞中仍然具有传染性（S6B 和 S6C 图），尽管 iPep-SARS2-E 的稳定性在 48 小时内仍不清楚（S2D 和 S4D 图）。蛋白质印迹结果表明，iPep-SARS2-E 显著降低了 WA1 感染细胞中刺突蛋白的表达（S6D 图）。结果与先前报道的E蛋白参与刺突蛋白表达和保护的研究一致[20,24]。总之，这些结果表明了 iPep-SARS2-E 抑制作用的分子机制如下：肽与 2E 蛋白相互作用并抑制 2E 通道功能，导致溶酶体 pH 恢复和 2E- 保护作用降低，这对于病毒蛋白（如 Spike）从蛋白水解中隔离并促进病毒出口至关重要。

E蛋白被认为是药物靶标[45–50]。与抑制E蛋白的小分子相比，iPep-SARS2-E可能更适合每种人类冠状病毒E蛋白（图7）及其未来的变体，因为它是基于肽的，尽管每个变体都需要进一步优化MY18肽。这种氨基酸残基大小的差异（即 Glu 与 Asp）可能对人类冠状病毒 E 寡聚化至关重要。2DE突变可用于HCoV-NL63版本和N9D，而ED突变对MY18肽的MERS-CoV版本有负面影响（图7D和7E）。在我们之前对细菌乳酸结合蛋白LldR的研究中，E103D突变体显著增加了LldR对乳酸的亲和力和特异性[51]。虽然 E 与 LldR 是不同的分子，但 E/D 和 D/E 取代可能是肽和蛋白质工程的有用策略。

总之，我们利用我们在蛋白质组学、成像和人类细胞建模方面的专业知识，使用溶酶体pH荧光成像和NFAT/AP-1发光报告系统建立并应用了2个筛选平台[52\u201254]，以确定针对人类冠状病毒E蛋白的新型候选治疗药物。我们的抑制肽可以定制，不仅可以靶向 SARS-CoV-2 的 E 蛋白，还可以靶向其他冠状病毒，如 MERS-CoV、HCoV-NL63 和 HCoV-HKU1，更广泛地证明 E 蛋白是人类冠状病毒的潜在治疗靶点。由于对病毒出口的独特作用，iPep-SARS2-E可能被证明是一种有前途的抗SARS-CoV-2候选治疗药物，特别是如果与其他候选治疗药物（如蛋白酶和聚合酶抑制剂）联合使用，则会产生协同效应。

方法

道德声明

哥伦比亚大学是美国国立卫生研究院 （NIH） 实验室动物福利办公室的保证机构 （ID#， D16-00003/A3007-01），该机构遵守了 NIH 公共卫生服务政策并遵守实验动物护理和使用指南中的标准。该动物研究已获得哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会的批准（协议#，AC-AABP2571）。这项使用 SARS-CoV-2 的病毒研究已获得哥伦比亚大学 ADARC 委员会和 BSL3 设施委员会的批准。

细胞培养

将人胚胎肾 （HEK） 293S 细胞（ATCC，Cat#CRL-3022）培养在 Dulbecco 的改良 Eagle 培养基营养混合物 F-12（DMEM/F-12，Thermo Fisher Gibco # 11320033）和 HEK 293T 细胞（ATCC，Cat#CRL-3216）、NIH 3T3 细胞（ATCC，Cat#CRL-1658）和 Vero-E6 细胞（Cat# CRL-1586）中培养，并在 DMEM （Thermo Fisher/Gibco #10313021） 中培养。两种培养基均补充有 GlutaMax-I 和青霉素/链霉素 （PS） 和 10% 胎牛血清（FBS，未热灭活，HyClone，#SH30071.03，Thermo Fisher），常氧 （20% O）2，5% 一氧化碳2，在 37°C 时）。每 2 至 3 天使用胰蛋白酶-EDTA （0.25%，Thermo Fisher， # 25200–056） 传代一次细胞系。使用我们正常的人诱导多能干细胞系 [52] 和成熟的分化培养基试剂盒 （STEMCELL Technologies， #100-0195/0528） 制备人分支肺类器官。

分子生物学结构

使用限制性内切酶 （New England BioLabs）、DNA 连接酶 （MightyMix、TaKaRa Bio/Clontech） 和聚合酶链反应 （PCR） 和 Phusion 聚合酶 （Thermo Fisher） 的标准方法生成质粒 DNA 构建体。合成用于这些实验的构建体插入片段（Integrated DNA Technologies，IDT）并亚克隆到pcDNA3载体（Life Technologies）中。使用 pcDNA3 空载体进行模拟转染。

成像实验和pH测量

对于图 1 和图 7 中的成像实验，将 NIH 3T3 细胞以 2.5 × 10 的细胞密度接种5细胞/毫升。第二天，使用 Lipofectamine 3000 试剂 （Thermo Fisher， # L3000001） 转染细胞，并将 4 μg 质粒混合到 125 μl 无血清 OptiMEM 和 5 μl P3000 试剂中。然后将其添加到另外 125 μl 含有 7.5 μl Lipofectamine 3000 的无血清 OptiMEM 中。质粒/P3000-脂质ect胺复合物在室温下孵育15分钟，然后加入板中。转染后 20 至 24 小时更换培养基，并加入 1 μM Lysosensor Green DND-189 （Thermo Fisher， L7535）。将细胞在 37°C、5% CO 中孵育 30 分钟2孵化器。在成像前最后一次更换培养基。活细胞成像是在定制/自动荧光显微镜（Ti-E，尼康）上进行的，使用环境室（TOKAI HIT）和培养基以维持正常的细胞培养条件（37°C，5%CO2， 20% O2).通过对显示 mKate2 红色荧光的细胞进行计数来估计转染效率，通常在 25% 到 35% 之间。使用 ImageJ 软件和 Prism 7/8/9 （GraphPad） 进行荧光定量和分析。代表性图像也收集在徕卡DMi8共聚焦显微镜上。以下肽（纯度>95%）由赛默飞世尔/皮尔斯定制肽团队合成：

MY18：MYSFVSEETGTLIVNSVL

6-arg （arg）-MY18：RRRRRR-MYSFVSEETGTLIVNSVL

TAT-MY18：GRKKRRQRRRPPQ-MYSFVSEETGTLIVNSVL

渗透素（笔）-MY18：RQIKIWFQNRRMKWKK-MYSFVSEETGTLIVNSVL

质谱法的全局定量蛋白质组学

对于使用 Lipofectamine 2000 （Invitrogen 11668027） 和 pcDNA3-SARS-CoV-2 包膜 （WT）-mKate2 转染的 HEK 293S 的全局定量蛋白质组学，使用基于串联质量标签 （TMT） 的定量蛋白质组学。简而言之，通过在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 9 M 尿素和 200 mM EPPS （pH 8.5） 中打珠裂解冷冻细胞。用 5 mM 三（2-羧乙基）膦还原样品，并用 10 mM 碘乙酰胺烷基化，并用 10 mM 二硫苏糖醇淬灭。总共 100 μg 蛋白质被氯仿-甲醇沉淀。在 200 mM EPPS （pH 8.5） 中复溶蛋白质，并用 Lys-C 消化过夜和胰蛋白酶消化 6 小时，两者均以 1：50 的蛋白酶肽比消化。使用Nanodrop在280nm处定量消化的肽，并使用10-plex TMT试剂盒用400μgTMT试剂标记每个样品的50μg肽[53]。检查TMT标记，将每个样品0.5 μg合并，脱盐，采用短同步母离子选择（SPS）MS3法进行分析，并使用归一化因子，在所有通道上以1：1的比例散装混合样品，使用500 μg散装混合样品进行总蛋白质组分析。

将混合TMT标记的样品真空离心，并用C18 Sep-Pak（100 mg）固相萃取柱脱盐。使用BPRP色谱法对脱盐样品进行分馏。在Water X-bridge C18色谱柱（3.5μm颗粒，内径4.6mm，长度250mm）上，肽在10 mM碳酸氢铵（pH 8）中以0.6ml/min的流速从5%到42%乙腈进行50分钟的线性梯度。将肽混合物分馏成总共 96 个馏分，这些馏分合并为 28 个馏分。随后用 1% 甲酸酸化馏分，真空离心至接近干燥，并通过 SDB-RP StageTip 脱盐。

对于总蛋白质组分析，将 28 个脱盐馏分溶解在使用 SPS-MS3 注射的 10 μl 3% 3% 乙腈/0.1% 甲酸中。使用 UltiMate 3000 UHPLC 系统 （Thermo Fisher） 和 EASY-Spray PepMap RSLC C18 50 cm × 75 μm 内径色谱柱 （Thermo Fisher） 与 Orbitrap Fusion （Thermo Fisher） 联用，以 250 nl/min 的流速在 45 分钟内分离具有 5% 至 30% 乙腈梯度的 0.1% 甲酸中的分馏肽。每次梯度后，用90%缓冲液B洗涤色谱柱10分钟，并用98%缓冲液A（0.1%甲酸，100%HPLC级水）重新平衡40分钟。在 Orbitrap Fusion Tribrid 质谱仪 （Thermo Fisher） 中以 120,000 的分辨率采集了完整的 MS 谱图。选择10个最强的MS1离子进行MS2分析。隔离宽度设置为0.7 Da，通过CID以35%的归一化碰撞能量（NCE）对分离的前驱体进行碎裂，并使用“涡轮”扫描速度在离子阱中进行分析。采集每个 MS2 光谱后，对 MS2 光谱中前 10 个最强离子进行 SPS-MS3 扫描。SPS-MS3前驱体在NCE为65%时通过高能碰撞诱导的解离进行碎裂，并使用Orbitrap进行分析。

使用 Proteome Discoverer 2.4 分析原始质谱数据，以进行数据库搜索和 TMT 报告离子定量。赖氨酸残基和肽N末端（+229.163 Da）上的TMT标签以及半胱氨酸残基的脲甲基化（+57.021 Da）被设置为静态修饰，而蛋氨酸残基（+15.995 Da）的氧化，天冬酰胺和谷氨酰胺上的脱酰胺（+0.984）被设置为可变修饰。在肽谱匹配和蛋白质水平为 1% FDR 的 UniProt 人中搜索数据。对每种蛋白质的信噪比 （S/N） 测量值进行归一化，以便每个通道中所有蛋白质的信号总和等效于相等的蛋白质负载。使用Perseus统计包[54]进一步分析了从PD2.4获得的结果，该软件包是MaxQuant分布的一部分。通过方差分析测定蛋白质丰度的显着变化，P < 0.05（基于排列的 FDR 校正）。使用独创性 IPA （Qiagen） 进行通路分析。

荧光素酶测定

HEK 293T 细胞以 0.5 × 10 接种5细胞/孔在涂有聚鸟氨酸 （Sigma-Aldrich） 的 24 孔板（康宁）中。第二天，用编码目标 Envelope 蛋白的 DNA、NFAT Firefly Luc （NFAT-FLuc） 报告基因（使用来自人 IL-2 基因的 4× NFAT 位点）和 pRL-TK-Renilla Luc 报告基因（TK-RLuc，使用 HSV TK 转染对照报告基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶）对细胞进行转染，启动子）使用 Lipofectamine 2000 试剂。包膜蛋白：NFAT-FLuc：TK-RLuc的标准转染比为：0.3μg：0.3μg：0.03μg。将目标肽以0.1μg的量加入到该混合物中。然后将细胞在 37°C 的 CO 中孵育过夜2孵化器。第二天，用 1 μM 佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 （Sigma-Aldrich， P1585） 在 CO 中 37°C 处理细胞 8 小时2孵化器。然后按照制造商的说明，使用双荧光素酶检测试剂盒和 Veritas 96 孔光度计 （Promega， E1910） 检测 Luc 活性水平。根据荧光素酶结果，Thermo Fisher/Pierce 定制肽团队合成了 TAT-MY18-2ED 肽（纯度>95%）：

TAT-MY18-2ED：GRKKRRQRRRPPQ-MYSFVSDDTGTLIVNSVL （M.W. = 3,662.2416）。

蛋白质印迹

使用标准方法进行蛋白质印迹实验。简而言之，将 HEK 293T 细胞接种在 6 孔培养皿中以 1 × 10 的比例接种6细胞/孔密度。接受iPep-SARS2-E肽（10μm）的细胞样品在转染前用肽处理24小时，并在转染过程中刷新肽。转染时，将 4 μg 质粒混合到 125 μl 无血清 OptiMEM 中，将 5 μl Lipofectamine 2000 加入另外 125 μl 无血清 OptiMEM 中。将 2 个罐合并并在室温下孵育 15 分钟。第二天，在细胞裂解缓冲液 （10×， Cell Signaling Technology， #9803） 中用 1% 蛋白酶抑制剂混合物 （Sigma-Aldrich/Millipore-Sigma） 裂解细胞。感染的 Vero-E6 细胞也使用相同的裂解缓冲液进行处理和灭活。使用 2× SDS 样品缓冲液（8 M 尿素、40 mM Tris-Cl （pH 6.8）、2% SDS、10% 2-巯基乙醇）对样品进行变性，并在 95°C 下煮沸 5 分钟。 使用含有 10% 丙烯酰胺双 （Fisher Scientific）、4% 至 20% 梯度或 16% 预制凝胶 （Novex、Thermo Fisher） 的自制凝胶进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 然后将其转移到聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜上。抗 Spike S2（R&D，MAB10557100,1/5,000 稀释）、抗 GFP（MBL#598,1/8,000 稀释）和抗 GAPDH（兔重组单克隆抗体，ab181602,1：10,000 稀释，Abcam）的一抗。使用二抗α小鼠（Thermo Fisher，#31430,1/8,000 稀释度）或α兔（Thermo Fisher，#31460,1/8,000 稀释度）和 5% 脱脂牛奶在含 0.1% 吐温 20 （TBS-T） 的 Tris 缓冲盐水中封闭 PVDF 膜。Pierce 增强化学发光 （ECL） 蛋白质印迹底物 （Thermo Fisher， #32209） 用于与薄膜或 ChemiDoc MP 成像系统 （Bio-Rad） 的化学发光反应。

单克隆抗体生产

动物免疫：将合成的 SARS2-E N 项肽 （Thermo Fisher） 与 PBS 中的 50% 二甲基亚砜 （DMSO） 和佐剂完全弗伦 （BD， #263810） 混合均匀，使最终肽浓度为 1 mg/ml 来制备乳液。根据我们的动物方案（AC-AABC3508），从Charles River Laboratories（美国马萨诸塞州）购买的8周龄WKY / NCrl雌性大鼠在左右尾基部肌肉注射100μl乳液（总200μg肽/大鼠）。除第 14、17 和 20 天使用佐剂不完全 Freund （BD， #963910） 代替完全 Freund 外，使用相同的方法进行了 3 次加强注射。

淋巴细胞收获：作为伴侣细胞，使用小鼠骨髓瘤细胞系NS-1（P3 / NS1 / 1-Ag4.1，Sigma-Aldrich，#85011427-1VL）。NS-1 细胞用 NS-1 培养基（含 20% FBS、1× GlutaMax 补充剂和 1× PS 的 DMEM;Gibco #10313–021、HyClone #SH30071.03、Gibco #35050–061 和 Gibco #15140–122），温度为 37°C，5% CO2.最后一次抗原注射两天后，对大鼠实施安乐死，无菌取髂内侧淋巴结，放入1mlNS-1培养基中，用无菌手术刀片切成小块。在轻柔移液以将淋巴细胞与其他组织分离后，使用 100 μm 孔细胞过滤器 （Falcon， #352360） 过滤淋巴细胞。计数后，将淋巴细胞冷冻在含有10%DMSO的NS-1培养基中，并保存在液氮中储存。

细胞融合：淋巴细胞在融合前一天开始，并在NS-1培养基中培养。将 1500 万个淋巴细胞和 3000 万个 NS-1 细胞混合并以 500xg 旋转 2 分钟。用 HBSS （Gibco， #14175095） 洗涤后，将细胞沉淀重悬于融合培养基（0.3 M 甘露醇和 0.1 mM CaCl2和 MgCl2).然后将混合物放入熔融室并使用电熔方法（NAPA GENE，#ECFG21，用于对齐;30V 20 秒。用于融合;350 V 持续 30 μsec 3 次，间隔 0.5 秒）。然后从融合室中收集混合物并以500xg旋转2分钟。然后将融合沉淀重悬于第一培养基（新鲜NS-1培养基与等体积NS-1培养的条件培养基混合×1 Hymax Hybridoma Fusion & Cloning Supplement（Antibody Research Corporation，Missouri，USA，#113004））中，并接种在96孔板上。通过HAT切片培养基选择杂交瘤，使用NS-1培养基和1× HAT培养基添加剂（Sigma-Aldrich，#H0262）和1× Hymax添加剂，然后使用NS-1培养基和1×HT培养基添加剂（Sigma-Aldrich，#H0137）和1× Hymax溶液进行HT维持培养。

筛选：使用表达质粒转染的 NIH 3T3 细胞通过免疫细胞化学进行初步筛选。将细胞以 15,000 个细胞/孔的密度接种在 Nunc Lab-Tek II 腔室载玻片 （Thermo Fisher， #154534） 上，并按照制造商的方案使用 Lipofectamine 3000 （Invitrogen， #L3000001） 转染质粒。20 小时后，使用 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定细胞。用PBS洗涤3次后，将细胞与杂交瘤培养上清液与0.5%NP-40在室温下孵育1小时。用 PBS 洗涤 3 次后，将细胞与与 Alexa Fluor 594（1：2,000 稀释度，Abcam，#ab150160）偶联的抗大鼠 IgG 二抗在室温下孵育 30 分钟。将阳性克隆扩增至24孔板。达到 80% 汇合度后，进行蛋白质印迹作为二次筛选。对于蛋白质印迹制备，按照制造商的方案，使用 Lipofectamine 2000 将 SARS2-E-YFP 质粒转染到 10 cm 培养皿中的 HEK 293T 细胞中。24 小时后，使用裂解缓冲液（Cell Signaling，#9803S）裂解细胞并旋转以收集上清液。将上清液与相同体积的 2× SDS-尿素样品缓冲液混合，并在 95°C 下煮沸 5 分钟。在使用 10% 双丙烯酰胺凝胶进行 SDS 页面后，通过电印迹将蛋白质转移到 PVDF 膜上。在TBS-T中用5%牛奶封闭1小时后，将膜纵向切成0.5厘米宽的条带。将条带与杂交瘤培养上清液在室温下孵育1小时。用 TBS-T 洗涤 3 次后，将条带与与 HRP 偶联的抗大鼠 IgG 二抗（Invitrogen， #31470）在室温下孵育 30 分钟。经过 3 次洗涤后，按照制造商的协议使用 ECL 溶液进行开发。抗GFP抗体作为阳性对照。如果呈阳性，则使用限制稀释法进行单细胞克隆，并完成另一轮免疫细胞化学和蛋白质印迹以确认结果。在对单个克隆杂交瘤进行免疫细胞化学和蛋白质印迹确认后，用逐渐降低浓度的 Hymax 补充剂（1/2、1/4、1/10，最后不使用 Hymax）传代阳性克隆，直到杂交瘤可以通过含有 1× HT 溶液的 NS-1 培养基维持。使用大鼠同种分型试剂盒（Bio-Rad，#RMT1）进行杂交瘤分型。

抗体纯化：收集 50 ml 杂交瘤培养上清液，然后使用 0.22 μm 过滤器过滤。将培养上清液与等体积的 20 mM 磷酸钠溶液 （pH 7.0） 混合，同时加入 NaCl（150 mM，最终浓度）和 Tween-20（0.02%，最终浓度），并加入 0.25 ml 蛋白-G 琼脂糖 （Thermo Fisher， #20399） 并在室温下轻轻摇动 1 小时。使用开柱法将蛋白-G琼脂糖包装在柱中，并用20ml 20mM磷酸钠溶液（pH 7.0）洗涤;使用100 mM甘氨酸-Cl溶液（pH 2.7）作为洗脱缓冲液，洗脱的溶液立即用1/10体积的1 M Tris-HCl溶液（pH 8.0）中和。浓缩中和的抗体溶液，并使用Amicon Ultra-4过滤器（大小为3K，Millipore，#UFC800396）将缓冲液更换为含有0.25M NaCl溶液的20mM磷酸钠。使用大鼠IgG ELISA试剂盒（Abcam，#ab189578）测量抗体浓度。

电生理记录

如前所述，SARS2-E-PM-mKate2构建体在HEK 293S细胞中与pcDNA3-MY18-2ED或pcDNA3空载体共表达[19]。使用 MultiClamp 700B 膜钳放大器（Molecular Devices）和配备微分界面光学元件（Nikon、Ti-U）的倒置显微镜对转染的 mKate2 阳性细胞进行全细胞膜片钳记录。使用硼硅酸盐玻璃（Sutter Instrument，BF150-110-10）和微量移液器拉拔器（Sutter Instrument，型号P-97）制备玻璃移液器。使用含有 140 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl 的正常 Tyrode 溶液组成的细胞外溶液进行电压钳测量2， 10 mM 葡萄糖， 1.8 mM CaCl2和10 mM HEPES（pH 7.4，NaOH，25°C）使用移液器溶液：120 mM K D-葡萄糖酸盐，25 mM KCl，4 mM MgATP，2 mM NaGTP，4 mM Na2-磷酸化肌酸，10 mM EGTA，1 mM CaCl2和 10 mM HEPES（pH 7.4，KCl 在 25°C 下）。使用在37°C加热的细胞外溶液进行记录。 使用 pClamp 10 和 Clampfit 10.4 （Molecular Devices） 采集和分析膜片钳数据。

免疫沉淀

使用 Lipofectamine 2000 将 pcDNA3-SARS2-E-YFP 与 pcDNA3-6xHis-MY18-2ED 或 pcDNA3 空载体共转染给 HEK 293T 细胞。转染后 24 小时，用 PBS 洗涤细胞一次，然后用细胞裂解缓冲液（细胞信号转导技术）处理。使用我们之前所述的成熟方法对含有 Ni Sepharose 6FF （Sigma-Aldrich/Cytiva， #17-5318-01） 的 His 标记构建体进行标准纯化方法 [51]。

肽渗透性测定

肽（纯度>95%）由赛默飞世尔/皮尔斯定制肽团队合成。肽在水中分离，并以 2.5 mM 储备液浓度储存。对于渗透性测定，将 NIH 3T3 和 Vero-E6 细胞以 1 × 10 的密度接种在 35 mm 培养皿上5细胞/ml。 ON 动力学：将肽以 10 μM 的浓度加入细胞培养基中，并在常氧条件下孵育直至成像时间点。OFF动力学：将肽以10μM的浓度加入细胞培养基中，并在常氧条件下孵育。24小时后，更换培养基（不添加新肽）。然后在确定的时间点对细胞进行成像。对于所有成像，用Tyrode溶液（140 mM NaCl，5.4 mM KCl，1 mM MgCl2， 10 mM 葡萄糖， 1.8 mM CaCl2和 10 mM HEPES，用 NaOH 缓冲 pH 至 7.4）。

两种类型的 Alexa Fluor 594 偶联 MY18-2ED 肽：

Alexa Fluor 594-TAT-MY18-2ED-：

Alexa Fluor 594-[C]G-GRKKRRQRRRPPQ-MYSFVSDDTGTLIVNSVL

TAT-MY18-2ED-Alexa Fluor 594：

GRKKRRQRRRPPQ-MYSFVSDDTGTLIVNSVL-L[C]-Alexa Fluor 594

多肽的稳定性测定

肽由 Thermo Scientific/Pierce 合成，在水中以 2.5 mM 储备液浓度分离，并在 ?80°C 下分装储存。 将肽在冰上解冻，并使用PBS稀释至40μg/ ml。样品在 37°C 下孵育。 使用用 37°C 预热的 PBS 稀释的新鲜解冻肽测量基线水平。将样品以 50 μl/孔的速度转移到 EIA/RIA 板 （Corning， #3591） 中，并在 4°C 下孵育过夜以包被。 第二天，用100μl/孔的PBS-T洗涤板3次。在室温下使用3%牛血清白蛋白（BSA，Sigma-Aldrich）在PBS-T中用250rpm振荡将板封闭1小时。在此之后，使用PBS-T洗涤板3次。然后将一抗溶液在室温下以 50 μl/孔（N2A5E8,0.45 μg/ml）加入 1 小时，振荡 250 rpm，然后用 PBS-T 洗涤 3 次。然后加入抗大鼠IgG二抗HRP偶联溶液（1：10,000）在室温下振荡250rpm1小时，然后用PBS-T洗涤3次。开发步骤是按照制造商手册使用 TMB 解决方案（Thermo Fisher，#34021）完成的。使用 SpectraMax iD3 酶标仪（分子设备）检测 OD600 值。使用GraphPad Prism软件进行统计分析。该过程是一式三份完成的。

使用肽进行细胞凋亡/坏死测定

将 Jurkat 细胞（ATCC，#TIB-152，克隆 E6-1）培养并用 10 μM iPep-SARS2-E 肽 （TAT-MY18-2ED） 处理 48 小时或用 10 μM （S）-（+）-喜树碱处理 3 小时（阳性对照组，Sigma-Aldrich，#C9911）。处理后，按照制造商的手册收集细胞进行 Annexin-V 测定（Thermo Fisher/Invitrogen，#V13241）。数据由ZE5细胞分析仪（Bio-Rad Laboratories）收集，并使用FlowJo软件（BD Biosciences）进行分析。该过程是一式三份完成的。

病毒感染的体外和样品处理

在Vero-E6细胞中使用WA10病毒（MOI，0.10）进行细胞病变测定，与之前的研究一样，使用标准方法[5]。使用含有 4% 多聚甲醛 （Electron Microscopy Sciences） 和 2% 蔗糖 （Sigma-Aldrich） 的 PBS 固定溶液、封闭/渗透性溶液（2% BSA 和 0.25% NP-40，Sigma-Aldrich，PBS 溶液）和 ERGIC/p58 抗体 （Sigma-Aldrich， E1031）、LAMP1 （Abcam， ab24170）、BiP/GPR78 （Abcam， ab21685） 和 SARS-CoV-2 核衣壳 （Thermo Fisher， PIMA17404） 进行免疫细胞化学。使用山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 594抗体（Abcam，ab150116）和山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488抗体（Abcam，ab150077）。对于电子显微镜，使用 2% 多聚甲醛、2% 戊二醛（电子显微镜科学）和 2 mM CaCl 固定受感染的 Vero-E6 细胞2（Sigma-Aldrich）在100mM二甲胂酸缓冲液（pH 7.4，电子显微镜科学）中。对于人分支肺类器官，使用 EpCAM 抗体 （Abcam. ab223582）。

RT-PCR定量

使用TRIzol Plus RNA纯化试剂盒和PureLink DNase套装（Thermo Fisher）制备Vero-E6细胞和小鼠肺组织的RNA样品，而使用RNeasy Mini试剂盒和无RNase的DNase套装（Qiagen）制备HEK 293细胞。使用 SuperScript III RT–PCR 第一链合成系统 （Thermo Fisher） 合成 cDNA。使用FAST或Power SYBR Green PCR预混液和QuantStudio 3/7实时荧光定量PCR系统（Thermo Fisher）和StepOne软件（2.3版，Life Technologies）或CFX Opus 96实时荧光定量PCR系统（Bio-Rad）使用以下引物组进行qPCR。

SARS-CoV-2 qPCR N 正向引物：CTCTTGTAGATCTGTTCTCTCTAAACGAAC

SARS-CoV-2 qPCR N 反向引物：GGTCCACCAAACGTAATGCG

SARS-CoV-2 qPCR E 正向引物：CTCATTCGTTTCGGAAGAGACAG

SARS-CoV-2 qPCR E 反向引物：AGACCAGAAGATCAGGAACTCTAG

小鼠Gapdh qPCR正向引物：CTTCACCACCATGGAGAAGG

小鼠Gapdh qPCR反向引物：TGAAGTCGCAGGAGACAACC

猴qPCR GAPDH（用于Vero-E6）正向引物：GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC

猴qPCR GAPDH（用于Vero-E6）反向引物：TCGTTGTCATACCAGGAAATGAGC

人NFATC4 qPCR正向引物：CTTCTCCGATGCCTCTGACG

人NFATC4 qPCR反向引物：CGGGGCTTGGACCATACAG

人JUN/AP-1 qPCR正向引物：ACTCGGACCTTCTCACGTC

人JUN/AP-1 qPCR反向引物：GGTCGGTGTGTAGTGGTGATGT

人GAPDH qPCR正向引物：GATGACATCAAGAAGGTGGTGA

人GAPDH qPCR反向引物：GTCTACATGGCAACTGTGAGGA

体内病毒感染和样品处理

Balb/c 小鼠（8 至 11 周龄，雄性和雌性，Charles River）鼻内感染 5 × 10 只4SARS-CoV-2 （MA10） 的 PFU，最终体积为 50 μl（单剂量），使用模拟 （PBS）、阴性对照肽或 iPep-SARS2-E 处理，在异氟烷镇静后。病毒感染后，每天监测小鼠的体重、体温和食物。小鼠的初始体重减轻了>20%，被定义为达到实验终点，并在第4天之前人道地安乐死。根据先前的一项肽相关研究，静脉内提供肽（静脉注射，2 mM，150 μl的PBS溶液，pH 7.0，用NaOH调节，单剂量）[9]。在单剂量鼻内给药的情况下，将肽iPep-SARS2-E和阴性对照突变肽与异氟烷镇静下的感染一起使用（2.5mM，50μl在PBS中，pH 7.0用NaOH调节）。在终点（感染后 4 天）收集肺组织样本，用于 RNA 制备、肺组织学和/或肺病毒滴度，使用标准方法 [9] 以及我们优化的 SARS2-E 蛋白印迹方法（如下一节所述）。

肺组织蛋白质印迹

为了灭活病毒，将MA10感染的小鼠肺在室温下在PBS中的0.5%SDS中孵育1小时。在被塑料捣碎机捣碎后，将样品混合物旋转以收集上清液。将上清液与相同体积的 2× SDS-尿素样品缓冲液混合，并在 95°C 下煮沸 5 分钟。在使用 20% 双丙烯酰胺凝胶进行 SDS 页面后，通过电印迹将蛋白质转移到 PVDF 膜上。在 TBS-T 中用 5% 脱脂牛奶封闭 1 小时后，将膜与一抗溶液（N2A5E8,0.2 μg/ml 在 TBS-T 中）在 4°C 下孵育过夜。 用TBS-T洗涤3次后，将膜与与HRP偶联的抗大鼠IgG二抗在室温下孵育1小时。经过 3 次洗涤后，按照制造商的协议使用 ECL 溶液进行开发。

小鼠组织的荧光立体成像

在异氟醚麻醉下鼻内提供与 C 末端 Alexa594 偶联的 iPep-SARS2-E 肽 （TAT-MY18-2ED-A594,10 μM，20 μl） 或 PBS。两小时后，使用一氧化碳对小鼠实施安乐死2.头骨被切开，中间有矢状面，然后取出鼻中隔。在PBS中洗涤3次后，在荧光立体镜（Leica，M165 FC）上对鼻腔外侧进行成像。关于静脉注射方法，在处死24小时或2小时前，通过尾静脉注射TAT-MY18-2ED-A594肽（300μM，50μl）iPep-SARS2-E组小鼠。对照小鼠在处死2小时前注射PBS。使用CO处死后2和宫颈脱位，全身灌注 15 ml PBS 以洗掉其血液中的肽。收获的组织，如肺，用PBS短暂洗涤，并在荧光立体镜上进行成像。

细胞因子/炎症阵列

细胞因子炎症检测组合是根据制造商的小鼠细胞因子阵列试剂盒 A （R&D SYSTEMS， Cat# ARY006） 的方案进行的。从血液中收集使用的血清样品，在 65°C 下热灭活 30 分钟（以灭活任何可能的病毒），并以 15,000 rpm 的速度旋转 10 分钟。使用约50μl血清样品进行测定。使用变性血液样本在阵列中检测 Cxcl12、C5a、MCSF 和 CD54。

伪病毒设计与生产

根据之前的一项研究[44]，我们使用转染了pCMV-SARS-CoV-2 Spike（delta变体）和pcDNA3-M-P2A-E、pCMV-dR8.2 dvpr包装质粒（Addgene，#8455）和表达YFP报告基因的HEK 293T细胞设计和生产了假病毒，这些质粒使用标准PCR和LV-Cre-SD（#12105，Addgene不再提供）以及EcoRI和XhoI克隆位点生成，以亚克隆YFP。使用0.45μm注射器过滤病毒，然后加入Vero-E6细胞（MOI，约0.05）。使用落射荧光显微镜（尼康，TS100F）在感染后 48 小时进行 YFP 成像。

统计和可重复性

每个图形使用的统计数据已在相应的图形图例中标明。学生的 t 测试（配对和未配对）是使用 Microsoft Excel 软件中的 t 测试函数进行的。学生的 t 测试是双尾的。使用 GraphPad Prism 6/7/8/9 软件进行 Tukey、Sidak、Bonferroni 或 Dunnett 事后多重比较分析的单因素方差分析。所有数据均符合统计检验的假设。本研究中使用的所有样品都是生物重复，而不是技术重复。除肽-抗体结合测定的ELISA外，所有实验均使用至少2种独立的实验材料/队列进行，以重现类似的结果。在本研究中，没有样本被排除在分析之外。图中的所有图表均为平均值±标清。

支持信息

SARS2-E过表达对哺乳动物转录本的影响。

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S1 无花果 |SARS2-E过表达对哺乳动物转录本的影响。根据图 2A 所示的全局蛋白质组学结果，使用qPCR检查基因转录本的表达。HSPA6 （一个）、DAGLB （B）， IP6K2 （C）、AGAP3 （D） 和 RELB成绩单 （E与模拟细胞相比，转染至 2E-mKate2 的 HEK 293S 细胞中显着增加。其他基因TNC的表达(F）、CALU （G）、PKLR （H）、NOLC1 （我） 和 ATF3 （J），在转染的HEK 293S细胞中没有显着增加，尽管所有基因转录略有增加。未配对学生t-test 被使用 （***P< 0.001;**P< 0.01;*P< 0.05;n.s.，不显著，n=6）。底层数据这个数字可以在 S1 数据中找到。图中的所有图表均为平均值±标准差。01234跨国公司新星012345卡卢新星05001,0001,5002,0002,500HSP的答601234NOLC1型新星0246810ATF3型新星0246AGAP3系列02468IP6K2防护等级02,0004,0006,000DAGLB的051015雷布0246810PKLR的新星模拟2E型相对表达式（归一化为 GAPDH & mock）模拟2E型相对表达式（归一化为 GAPDH & mock）模拟2E型相对表达式（归一化为 GAPDH & mock）模拟2E型相对表达式（归一化为 GAPDH & mock）模拟2E型相对表达式（归一化为 GAPDH & mock）模拟2E型相对表达式（归一化为 GAPDH & mock）模拟2E型相对表达式（归一化为 GAPDH & mock）模拟2E型相对表达式（归一化为 GAPDH & mock）模拟2E型相对表达式（归一化为 GAPDH & mock）模拟2E型相对表达式（归一化为 GAPDH & mock）**********一个BDECFG我JH

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S1 图。 SARS2-E过表达对哺乳动物转录本的影响。

根据图2A所示的全局蛋白质组学结果，使用qPCR检查基因转录本的表达。与模拟细胞相比，转染至 2E-mKate2 的 HEK 293S 细胞中 HSPA6 （A）、DAGLB （B）、IP6K2 （C）、AGAP3 （D） 和 RELB 转录本 （E） 的表达显著增加。其他基因TNC（F）、CALU（G）、PKLR（H）、NOLC1（I）和ATF3（J）在转染的HEK 293S细胞中表达未显著增加，但所有基因转录均略有增加。使用未配对学生 t 检验 （*** P < 0.001; ** P < 0.01; * P < 0.05; n.s.，不显著，n = 6）。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。图中的所有图表均为平均值±标准差。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.s001

（PDF格式）

S2 图。 iPep-SARS2-E的原位和体外表征。

(A） 使用空载 （n = 32） 或 2E-mKate2 质粒转染的 NIH 3T3 细胞中 DND-189 染料的相对荧光强度，不含 （-， n = 27） 和 TAT-MY18-2ED 肽孵育 24 小时孵育 （10 μM， n = 50）。具有Tukey多重比较检验的单因素方差分析（**** P < 0.0001;n.s. 不显著）。（B） 转染 SARS2-E 与 YFP （2E-YFP） 的 HEK 293T 细胞的代表性免疫印迹图像。使用抗SARS2-E（2E-N，克隆，N2A5E8，左）、GFP（右）和GAPDH抗体（作为上样对照，底部）。以锁孔血红素 （KLH） 偶联的 MY18 肽为抗原，制备大鼠单克隆抗体（2E-N mAb，克隆 N2A5E8）。（C） ELISA 测定，用于比较抗 SARS2-E 单克隆抗体与野生型 （WT） 和 2ED （EE7-8DD） 突变体 TAT-MY18 肽的结合能力。（D） 使用具有抗 SARS2-E 抗体的相同 ELISA 测定法对 iPep-SARS2-E （TAT-MY18-2ED） 进行稳定性测试。将肽在 37°C 下在磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 中孵育。（E-G）使用Jurkat细胞和流式细胞术与细胞凋亡/坏死测定对iPep-SARS2-E（TAT-MY18-2ED，10μM，48小时）进行毒性试验。对健康细胞（E，%）、凋亡细胞（F）和死亡/坏死细胞（G）进行计数。喜树碱（10μM，3小时）用作阳性对照。采用单因素方差分析与Dunnett多重比较检验（**** P < 0.0001;与未处理相比，n.s.不显著）。（H） 使用 Ni 柱对 2E 蛋白进行免疫沉淀，并使用 2E-YFP 转染 6xHis-MY18-2ED （2ED） 或 6xHis-MY18 野生型构建体 （WT） 的 HEK 293T 细胞。抗GFP抗体用于印迹2E-YFP蛋白条带。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。图中除 S2C Fig 外的所有图形均为 SD ±均值。 S2C Fig 使用单样本数据集。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.s002

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S3 图。 iPep-SARS2-E对SARS2-E表达的影响。

(A） 转染与 YFP （2E-YFP） 融合的 SARS2-E 并用 10 μM TAT-MY18-2ED 或 MY18-WT（阴性对照）处理的 HEK 293T 细胞的代表性 GAPDH 免疫印迹图像。图3E中使用了30至40 kDa之间的图像。（B） 用 YFP 质粒转染并用 10 μM TAT-MY18-2ED 或 MY18-WT（阴性对照）处理 48 小时的 HEK 293T 细胞的代表性免疫印迹图像。使用抗GFP（用于YFP，上图）和GAPDH抗体（作为上样对照，下图）。显示短曝光和长曝光的胶片图像。#，在细胞裂解物中发现约 40 和 50 kDa 的非特异性条带。图3H中使用了波段图像。（C） 使用未经处理的 YFP 质粒 （n = 3） 转染并用 TAT-MY18-2ED （n = 3） 或 MY18-WT 肽 （n = 3） 处理的 HEK 293T 细胞的 YFP 蛋白表达的定量。使用单因素方差分析和 Tukey 的多重比较检验（n.s.，不显著）。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。图中的图形是平均值±标清。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.s003

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S4 图。 iPep-SARS2-E的渗透性。

(A） 孵育开始后，在 NIH 3T3 细胞中使用 Alexa Fluor 594（A594） 偶联的 iPep-SARS2-E 肽、A594-TAT-MY18-2ED（氨基末端偶联，N 端，10 μM，底部）和 TAT-MY18-2ED-A594（羧基末端，C 端，10 μM，顶部）进行时程细胞穿透试验的代表性荧光和明场图像。比例尺，50μm。（B） 定量用 A594 偶联肽处理的红色荧光阳性细胞的肽细胞穿透“on”动力学（平均值 ± SD）。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。（C）肽稳定性、“关闭”动力学、定量的实验设计。（D） NIH 3T3 细胞中 A594 偶联的 TAT-MY18-2ED 肽（C 项版本）洗脱后的代表性荧光和明场图像。白色箭头，荧光点。比例尺，50μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.s004

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S5 图。 iPep-SARS2-E肽在Vero-E6细胞中的细胞渗透。

(A） 用 TAT-MY18-2ED-AlexaFluor594（C 项偶联版本，10 μM）孵育的 Vero-E6 细胞的代表性红色荧光和明场图像。比例尺，50μm。（B） 定量用 AlexaFluor594 偶联肽（C 项偶联版本）处理的红色荧光阳性 Vero-E6 细胞，用于测量肽细胞穿透的“开启”动力学（平均值 ± SD）。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.s005

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S6 图。 iPep-SARS2-E体外验证。

(A） 感染后 24 小时经 iPep-SARS2-E 处理的 Vero-E6 细胞的电子显微镜图像。箭头，在核包膜中发现的小颗粒。比例尺，1μm。（B） 检查细胞内颗粒在用 iPep-SARS2-E 处理的 Vero-E6 细胞中是否具有传染性的实验设计。（C） 用于定量 PBS 和 iPep-SARS2-E （10 μM） 处理的 Vero-E6 细胞的细胞内病毒颗粒的定量终点滴定测定结果。iPep-SARS2-E的传染性显着降低，但仍具有传染性。每个孔（细胞铺板24小时，将2,500个收获的细胞放在4×10个孔上4前一天晚上播种的每孔未感染的新鲜细胞）根据与病毒对照的传染性进行比较进行评分，0 表示无感染，100 表示完全感染 （CPE）。使用学生 t 检验 （**** P < 0.0001）。（D） 在感染 SARS-CoV-2 WA1 后 24 小时（MOI，0.10,24 小时）的 PBS 和 iPep-SARS2-E （10 μM） 处理的 Vero-E6 细胞中 Spike 和 GAPDH 蛋白的蛋白质印迹，表明 iPep-SARS2-E 对 Spike 表达和/或稳定性的影响。感染后 48 小时，与未感染细胞 （n = 6） 相比，PBS （n = 6） 和 iPep-SARS2-E （10 μM， n = 6） 处理的 Vero-E6 细胞的 SARS-CoV-2 N （E）、E （F）、JUN/AP-1 表达 （G） 的 （E–H） qPCR。这些基因的表达被归一化为管家基因 GAPDH。采用单因素方差分析与Tukey多重比较检验（**** P < 0.0001;*** P < 0.001;** P < 0.01;n.s.，不显著）。（H） 感染后 48 小时处理的 PBS （n = 6） 和 iPep-SARS2-E （10 μM， n = 6） 处理的 Vero-E6 细胞培养上清液 （sup） 的 SARS2-CoV-2 N 表达的 qPCR。采用学生 t 检验 （**** P < 0.0001）。使用TRIzol Plus RNA纯化试剂盒、PureLink DNase套装和SuperScript III制备细胞的cDNA样品和细胞培养物，然后使用UltraPure蒸馏水稀释（1/5）进行qPCR。（I） 感染后 48 小时用 PBS 或 iPep-SARS2-E 处理的 Vero-E6 细胞的代表性共聚焦荧光图像。SARS-CoV-2 N 抗体（红色）和 Hoechst 33258 染料（蓝色，用于细胞核）与亚细胞器标志物（绿色）的抗体一起使用：BiP 用于内质网 （ER）、ERGIC-53 用于内质网高尔基体间室 （ERGIC） 和 LAMP1 用于溶酶体。比例尺，5μm。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。图中的所有图表均为平均值±标准差。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.s006

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S7 图。 使用鼻内给药的 iPep-SARS2-E 体内测试。

(A） 小鼠鼻内给药 iPep-SARS2-E 的示意图。红框表示为以下荧光成像而收获的鼻组织区域。图像来自BioRender软件。（B） 用 PBS 或 Alexa594 偶联的 iPep-SARS2-E 肽 （TAT-MY18-2ED-A594,10 μM，2 小时） 鼻内给药的小鼠分离的鼻组织的代表性荧光和明场图像。分离组织后，用PBS洗涤样品3次，用荧光立体镜拍摄荧光和明场图像。比例尺，1 mm。 （C） iPep-SARS2-E 体内安全性测试的实验设计。（D） iPep-SARS2-E 处理组 （n = 6）、未处理组 （n = 5） 和 PBS 处理的 Balb/c 小鼠组 （n = 5） 对体重的影响没有显着差异。每天使用带有Tukey多重比较的单因素方差分析。（E、F）iPep-SARS2-E处理（n = 5）、未处理（n = 4）和PBS处理的小鼠（n = 4）的Cxcl12（E）和C5a（F）无显著差异。使用具有Tukey多重比较的单因素方差分析（n.s.，不显著）。（G） 使用鼻内给药的体内 iPep-SARS2-E 测试的实验设计。（H） iPep-SARS2-E 可防止 SARS-CoV-2 MA10 感染的 Balb/c 小鼠（5.0 × 10^4 PFU/小鼠）的体重减轻。每天使用学生 t 检验 （** P < 0.01; * P < 0.05）。（一、日）使用 PBS 或 iPep-SARS2-E 处理的 SARS-CoV-2 MA10 感染小鼠肺组织中 SARS-CoV-2 E （2E， I） 和小鼠 Gapdh 蛋白 （J） 的代表性免疫印迹。（K） iPep-SARS2-E 肽显著降低 MA10 感染的 Balb/c 小鼠肺组织中 2E 的蛋白表达 （PBS， n = 4; iPep-SARS2-E， n = 4）。采用学生t检验（*P<0.05）。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。图中的所有图表均为平均值±标准差。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.s007

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S8 图。 iPep-SARS2-E和阴性对照肽在体外和体内进行测试。

(A） 使用 MY18 缺失构建体（图 2F）和诱变结果后，对 MY18 WT 和突变候选序列（MT、靶氨基酸、下划线）进行比对。（B） 在模拟或 2E 转染的 HEK 293T 细胞中使用 NFAT/AP-1 测定法测试 iPep-SARS2-E 阴性对照（阴性 Ctrl）突变体构建体。Tukey 多重比较检验的单因素方差分析（**** P < 0.0001;* P < 0.05;n.s.，不显著）。（C） 使用不含 （-） 和 neg 的 2E-mKate2 质粒转染的 NIH 3T3 细胞中 DND-189 染料的相对荧光强度。Ctrl 肽构建体。采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析（**** P < 0.0001;*** P < 0.001;n.s.，不显著）。（D） SARS2 N表达阴性的qPCR。Ctrl 突变肽、iPep-SARS2-E 和 PBS 处理的 Vero E6 细胞培养上清液。将所有肽（10μM）使用过夜（约18小时），然后在SARS-CoV-2 WA1感染前洗涤。采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析（** P < 0.01; n.s.，不显著）。（E） 使用 iPep-SARS2-E 处理 （10 μM） 的 SARS2 Spike、E、M、dR8.2 和 YFP 报告基因产生的假病毒 （MOI， 0.05） 感染假病毒 （MOI， 0.05） 的 Vero-E6 细胞的代表性图像。否定。使用Ctrl突变肽（10μM）作为阴性对照。比例尺，20μm。（F） iPep-SARS2-E和阴性细胞在YFP阳性细胞中无显著差异。Ctrl，表明 iPep-SARS2-E 对病毒进入没有影响。使用学生的 t 检验（n.s.，不显著）。（G） iPep-SARS2-E鼻内给药的实验设计。Ctrl 突变肽作为体内阴性对照。（H）小鼠组的体重变化。采用学生t检验（*P<0.05）。（I） 与阴性相比，iPep-SARS2-E 处理的小鼠的肺病毒滴度显着降低。 中位组织培养感染剂量 （TCID） 标准化为在组织匀浆分离病毒之前测量的肺湿重 （g）。（J） iPep-SARS2-E 显著降低 MA10 感染的 Balb/c 小鼠肺组织中 SARS-CoV-2 N 的转录表达。采用学生 t 检验 （**** P < 0.0001; ** P < 0.01）。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。图中的所有图表均为平均值±标准差。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.s008

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S9 图。 人类冠状病毒包膜蛋白的比对。

SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43 和 HCoV-HKU1 的包膜蛋白序列比对。CLUSTALW 2.1多序列比对软件用于获得比对。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.s009

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S1 数据。 实验的原始数据集。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.s010

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S1 原始图像。 蛋白质印迹原始图像。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002522.s011

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确认

我们感谢 N. Harrison、R. Katz、M. Rahmany、C. Y.l. Sobolevsky、M.V. Yelshanskaya、C. Aston、E. Passague 和 J. Stein（哥伦比亚大学）的有益支持和讨论;Y. Tomono 和 K. Yamamoto（日本 Shigei 医学研究所）为大鼠单克隆抗体生产提供有用的建议;C. Castagna、Y. Luo、S. Sozomenu、A. Matveyenko 和 M.H. Blumenkrantz（哥伦比亚大学）和 A. Poddar（新泽西州佩迪高中）提供了有用的帮助。

引用

1.Sanyaolu A， Okorie C， Hosein Z， Patidar R， Desai P， Prakash S， et al. COVID-19 的全球大流行：截至 2020 年 6 月 9 日的情况报告。感染 Dis （Auckl）。2021;14:1178633721991260.Epub 格式 2021/02/19.PMID：33597811;PubMed 中心 PMCID：PMC7863149。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

2.朱倭， 张彦， 王婉， 李旭， 杨斌， 宋杰， 等.来自中国肺炎患者的新型冠状病毒，2019 年。N Engl J Med. 2020 年;382(8):727–33.格式 2020/01/25.PMID：31978945;PubMed 中心 PMCID：PMC7092803。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

3.周 P， 杨XL， 王旭， 胡 B， 张玲， 张伟， 等.与可能来自蝙蝠的新型冠状病毒相关的肺炎爆发。自然界。2020;579(7798):270–3.格式 2020/02/06.PMID：32015507;PubMed 中心 PMCID：PMC7095418。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

4.Liu L， Iketani S， Guo Y， Chan JF， Wang M， Liu L， et al.SARS-CoV-2 的 Omicron 变体表现出惊人的抗体逃避。自然界。2022;602(7898):676–81.格式 2022/01/12.PMID：35016198。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

5.Wang P， Nair MS， Liu L， Iketani S， Luo Y， Guo Y， et al.SARS-CoV-2 变体 B.1.351 和 B.1.1.7 的抗体耐药性。自然界。2021;593(7857):130–5.格式 2021/03/09.PMID：33684923。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

6.Harvey WT、Carabelli AM、Jackson B、Gupta RK、Thomson EC、Harrison EM 等 SARS-CoV-2 变体、刺突突变和免疫逃逸。Nat Rev 微生物。2021;19(7):409–24.格式 2021/06/03.PMID：34075212;PubMed 中心 PMCID：PMC8167834。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

7.Andrews N， Stowe J， Kirsebom F， Toffa S， Rickeard T， Gallagher E， et al. Covid-19 疫苗对 Omicron （B.1.1.529） 变体的有效性。N Engl J Med. 2022 年。格式 2022/03/07.PMID：35249272;PubMed 中心 PMCID：PMC8908811。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

8.Krause PR、Fleming TR、Longini IM、Peto R、Briand S、Heymann DL 等人。 SARS-CoV-2 变体和疫苗。N Engl J Med. 2021 年;385(2):179–86.格式 2021/06/24.PMID：34161052;PubMed 中心 PMCID：PMC8262623。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

9.de Vries RD、Schmitz KS、Bovier FT、Predella C、Khao J、Noack D 等。鼻内融合抑制脂肽可防止雪貂中的直接接触性 SARS-CoV-2 传播。科学。2021;371(6536):1379–82.Epub 格式 2021/02/19.PMID：33597220;PubMed 中心 PMCID：PMC8011693。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

10.阿巴西 J.关于最新的 SARS-CoV-2“感兴趣的变体”EG.5 的知识。贾马。2023. Epub 格式 2023/08/18.PMID：37594886。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

11.Chai J， Cai Y， Pang C， Wang L， McSweeney S， Shanklin J， et al.SARS-CoV-2 包膜蛋白识别人细胞连接蛋白 PALS1 的结构基础。纳特公社。2021;12(1):3433.Epub 格式 2021/06/10.PMID：34103506;PubMed 中心 PMCID：PMC8187709。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

12.Castano-Rodriguez C、Honrubia JM、Gutierrez-Alvarez J、DeDiego ML、Nieto-Torres JL、Jimenez-Guardeno JM 等。严重急性呼吸系统综合症冠状病毒病毒通道蛋白 E、3a 和 8a 在复制和发病机制中的作用。MBio的。2018;9(3).Epub 格式 2018/05/24.PMID：29789363;PubMed 中心 PMCID：PMC5964350。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

13.涅托-托雷斯 JL、德迭戈 ML、Verdia-Baguena C、希门尼斯-瓜尔德诺 JM、雷格拉-纳瓦 JA、费尔南德斯-德尔加多 R 等。严重急性呼吸系统综合症冠状病毒包膜蛋白离子通道活性促进病毒适应性和发病机制。PLoS 病态。2014;10（5）：e1004077.格式 2014/05/03.PMID：24788150;PubMed 中心 PMCID：PMC4006877。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

24 分钟Nieva JL、Madan V、Carrasco L. 病毒通道蛋白：结构和生物学功能。Nat Rev 微生物。2012;10(8):563–74.Epub 格式 2012/07/04.PMID：22751485;PubMed 中心 PMCID：PMC7097105。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

15.涅托-托雷斯 JL、德迭戈 ML、阿尔瓦雷斯 E、希门尼斯-瓜尔德诺 JM、雷格拉-纳瓦 JA、略伦特 M 等。严重急性呼吸系统综合症冠状病毒包膜蛋白的亚细胞位置和拓扑结构。病毒学。2011;415(2):69–82.格式 2011/04/29.PMID：21524776;PubMed 中心 PMCID：PMC4726981。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

26 分钟DeDiego ML、Nieto-Torres JL、Jimenez-Guardeno JM、Regla-Nava JA、Alvarez E、Oliveros JC 等。严重急性呼吸系统综合症冠状病毒包膜蛋白调节细胞应激反应和细胞凋亡。PLoS 病态。2011;7（10）：e1002315.格式 2011/10/27.PMID：22028656;PubMed 中心 PMCID：PMC3197621。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

27 分钟索拉布 K， 索洛夫丘克 M， Sheu TW.通过 SARS-CoV-2 E 蛋白离子通道的离子转运的详细研究。纳米级。2022;14(23):8291–305.格式 2022/06/02.PMID：35648036。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

28 分钟Zheng M， Karki R， Williams EP， Yang D， Fitzpatrick E， Vogel P， et al. TLR2 感知 SARS-CoV-2 包膜蛋白以产生炎性细胞因子。Nat免疫。2021;22(7):829–38.格式 2021/05/09.PMID：33963333;PubMed 中心 PMCID：PMC8882317。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

19.卡布雷拉-加西亚 D、贝克达什 R、雅培 GW、矢泽 M、哈里森 NL。SARS-CoV-2 的包膜蛋白增加高尔基体内 pH 值并形成受 pH 值调节的阳离子通道。生理学杂志 2021;599(11):2851–68.格式 2021/03/13.PMID：33709461;PubMed 中心 PMCID：PMC8251088。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

20.玻色子 B， 莱格罗斯 V， 周 B， 西雷特 E， 马蒂厄 C， 珂赛 FL， 等.SARS-CoV-2 包膜蛋白和膜蛋白调节刺突蛋白的成熟和保留，从而允许病毒样颗粒的组装。生物化学杂志 2021;296：100111.格式 2020/11/25.PMID：33229438;PubMed 中心 PMCID：PMC7833635。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

21.Mehregan A、Perez-Conesa S、Zhuang Y、Elbahnsi A、Pasini D、Lindahl E 等。SARS-CoV-2 E 蛋白对膜曲率和细胞内钙的探测作用。Biochim Biophys Acta Biomembr.2022;1864(10):183994.格式 2022/06/21.PMID：35724739;PubMed 中心 PMCID：PMC9212275。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

22.Vann KR、Acharya A、Jang SM、Lachance C、Zandian M、Holt TA 等。SARS-CoV-2 包膜 E 蛋白与人 BRD4 的结合对于感染至关重要。结构。2022;30（9）：1224–32 E5。Epub 格式 2022/06/19.PMID：35716662;PubMed 中心 PMCID：PMC9212912。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

23.Tang Z， Xu Y， Tan Y， Shi H， Jin P， Li Y， et al. CD36 介导 SARS-CoV-2 包膜蛋白诱导的血小板活化和血栓形成。纳特公社。2023;14(1):5077.格式 2023/08/22.PMID：37604832。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

24.韦斯特贝克 JW，Machamer CE。传染性支气管炎冠状病毒包膜蛋白会改变高尔基体的pH值，以保护刺突蛋白并促进传染性病毒的释放。J 维罗尔。2019;93(11).格式 2019/03/15.PMID：30867314;PubMed 中心 PMCID：PMC6532078。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

25.Mandala VS， McKay MJ， Shcherbakov AA， Dregni AJ， Kolocouris A， Hong M. 脂质双层中 SARS-CoV-2 包膜蛋白跨膜结构域的结构和药物结合。Nat Struct Mol Biol. 2020;27(12):1202–8.格式 2020/11/13.PMID：33177698;PubMed 中心 PMCID：PMC7718435。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

26.Pervushin K， Tan E， Parthasarathy K， Lin X， 江 FL， Yu D， et al.SARS冠状病毒包膜蛋白离子通道的结构和抑制。PLoS 病态。2009;5（7）：e1000511.格式 2009/07/14.PMID：19593379;PubMed 中心 PMCID：PMC2702000。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

27.Surya W， Torres J. SARS-CoV-2 包膜蛋白中的寡聚化依赖性 β 结构形成。国际分子科学杂志 2022;23(21).格式 2022/11/12.PMID：36362071;PubMed 中心 PMCID：PMC9658050。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

28.Yang R， Wu S， Wang S， Rubino G， Nickels JD， Cheng X. 通过分子动力学模拟在类天然环境中细化 SARS-CoV-2 包膜蛋白结构。前分子生物科学。2022;9:1027223.格式 2022/10/28.PMID：36299297;PubMed 中心 PMCID：PMC9589232。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

29.Kuzmin A， Orekhov P， Astashkin R， Gordeliy V， Gushchin I. SARS-CoV-2 包膜蛋白单体的结构和动力学。蛋白质。2022;90(5):1102–14.Epub 格式 2022/02/05.PMID：35119706。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

30.Pezeshkian W、Grunewald F、Narykov O、Lu S、Arkhipova V、Solodovnikov A 等。通过综合建模了解 SARS-CoV-2 包膜的分子结构和动力学。结构。2023;31（4）：492–503 E7。格式 2023/03/05.PMID：36870335。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

31.Li Y， Surya W， Claudine S， Torres J. 冠状病毒包膜蛋白中保守的高尔基复合物靶向信号的结构。生物化学杂志 2014;289(18):12535–49.格式 2014/03/29.PMID：24668816;PubMed 中心 PMCID：PMC4007446。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

32.Surya W， Li Y， Torres J. LMPG 胶束中 SARS 冠状病毒 E 通道的结构模型.Biochim Biophys Acta Biomembr.2018;1860(6):1309–17.Epub 格式 2018/02/24.PMID：29474890;PubMed 中心 PMCID：PMC7094280。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

33.Patel SG、Sayers EJ、He L、Narayan R、Williams TL、Mills EM 等。不同细胞系中绿色荧光蛋白的细胞穿透肽序列和修饰依赖性摄取和亚细胞分布。科学代表 2019;9(1):6298.格式 2019/04/20.PMID：31000738;PubMed Central PMCID：PMC6472342。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

34.Macian F， Lopez-Rodriguez C， Rao A. 转录合作伙伴：NFAT 和 AP-1。基因。2001;20(19):2476–89.格式 2001/06/13.PMID：11402342。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

35.Morikawa K， Furuhashi K， de Sena-Tomas C， Garcia-Garcia AL， Bekdash R， Klein AD， et al. 用于体内小鼠应用的光活化 Cre 重组酶 3.0。纳特公社。2020;11(1):2141.Epub 格式 2020/05/03.PMID：32358538;PubMed 中心 PMCID：PMC7195411。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

36.Duart G， Garcia-Murria MJ， Grau B， Acosta-Caceres JM， Martinez-Gil L， Mingarro I. 真核膜中的 SARS-CoV-2 包膜蛋白拓扑。Open Biol. 2020;10(9):200209.Epub 格式 2020/09/09.PMID：32898469;PubMed 中心 PMCID：PMC7536074。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

37.Ghosh S， Dellibovi-Ragheb TA， Kerviel A， Pak E， Qiu Q， Fisher M， et al. β-冠状病毒使用溶酶体而不是生物合成分泌途径进行出口。细胞。2020;183（6）：1520–35 e14。Epub 格式 2020/11/07.PMID：33157038;PubMed 中心 PMCID：PMC7590812。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

38.Kruglova N， Siniavin A， Gushchin V， Mazurov D. SARS-CoV-2 细胞间和无细胞感染模式对恢复期血清的不同中和敏感性。病毒。2021;13(6).Epub 20210612.PMID：34204732;PubMed 中心 PMCID：PMC8231521。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

39.奈尔女士、黄莹女士、王女士、韦瑟斯 PJ。SARS-CoV-2 omicron 变体在体外对青蒿热水提取物敏感。民族药理学杂志。2023;308:116291.Epub 20230218。PMID：36804200;PubMed 中心 PMCID：PMC9937997。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

40.Thompson RE、Edmonds K、荷兰 RE。人偏肺病毒磷蛋白C末端结构域中的特定残基对于病毒复制中心的形成和病毒聚合酶复合物功能的调节是必不可少的。J 维罗尔。2023;97（5）：e0003023.Epub 20230424。PMID：37092993;PubMed 中心 PMCID：PMC10231248。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

41.Leist SR、Dinnon KH 3rd、Schafer A、Tse LV、Okuda K、Hou YJ 等。小鼠适应的 SARS-CoV-2 在标准实验室小鼠中诱导急性肺损伤和死亡。细胞。2020;183（4）：1070–85 E12。格式 2020/10/09.PMID：33031744;PubMed 中心 PMCID：PMC7510428。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

42.Owen DR、Allerton CMN、Anderson AS、Aschenbrenner L、Avery M、Berritt S 等。用于治疗 COVID-19 的口服 SARS-CoV-2 M（pro） 抑制剂临床候选药物。科学。2021;374(6575):1586–93.格式 2021/11/03.PMID：34726479。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

43.Dinnon KH 3rd， Leist SR， Okuda K， Dang H， Fritch EJ， Gully KL， et al. SARS-CoV-2 感染在小鼠中产生慢性肺上皮和免疫细胞功能障碍并伴有纤维化。Sci Transl Med. 2022;14（664）：EBO5070.格式 2022/07/21.PMID：35857635;PubMed 中心 PMCID：PMC9273046。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

44.Wang HI， Chuang ZS， Kao YT， Lin YL， Liang JJ， Liao CC， et al. 小结构蛋白 E 和 M 使 SARS-CoV-2 假病毒更具传染性，并揭示了天然病毒变体的表型。国际分子科学杂志 2021;22(16).Epub 20210823.PMID：34445789;PubMed 中心 PMCID：PMC8396568。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

45.桑托斯-门多萨 T.SARS-CoV-2 的包膜 （E） 蛋白作为药理学靶标。病毒。2023;15(4).Epub 格式 2023/04/28.PMID：37112980;PubMed Central PMCID：PMC10143767。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

46.王莹， 方岛， 吴彦， 程旭， 张立， 沈旭， 等.发现SARS-CoV-2-E通道抑制剂作为抗病毒候选药物。Acta Pharmacol Sin.2022;43(4):781–7.Epub 格式 2021/07/24.PMID：34294887;PubMed 中心 PMCID：PMC8295639。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

47.Abdullah Alharbi R. SARS-CoV-2 开放状态包膜蛋白的结构见解，并通过 Withania somnifera 阿育吠陀药用植物的活性植物化学进行抑制。沙特生物科学杂志 2021;28(6):3594–601.Epub 格式 2021/03/25.PMID：33758570;PubMed 中心 PMCID：PMC7970802。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

48.Breitinger U、Ali NKM、Sticht H、Breitinger HG。类黄酮和经典病毒通道蛋白抑制剂抑制SARS CoV包膜蛋白。前微生物。2021;12:692423.格式 2021/07/27.PMID：34305855;PubMed 中心 PMCID：PMC8297954。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

49.Oh CK， Nakamura T， Beutler N， Zhang X， Pina-Crespo J， Talantova M， et al.ACE2 的靶向蛋白 S-亚硝基化可抑制 SARS-CoV-2 感染。Nat Chem Biol. 2023;19(3):275–83.格式 2022/09/30.PMID：36175661;PubMed 中心 PMCID：PMC10127945。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

50.Strakova P、Bednar P、Kotoucek J、Holoubek J、Fortova A、Svoboda P 等。单线态氧光生苝化合物对 SARS-CoV-2 的抗病毒活性：与病毒包膜的相互作用和光动力病毒粒子失活。病毒研究 2023;334：199158。Epub 格式 2023/06/21.PMID：37339718;PubMed 中心 PMCID：PMC10307035。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

51.Bekdash R， Quejada JR， Ueno S， Kawano F， Morikawa K， Klein AD， et al. GEM-IL：一种高反应性荧光乳酸指示剂。细胞代表方法。2021;1(7):100092.Epub 格式 2022/04/28.PMID：35475001;PubMed Central PMCID：PMC9017230。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

52.Song L， Park SE， Isseroff Y， Morikawa K， Yazawa M. 抑制 CDK5 可缓解 Timothy 综合征的心脏表型。干细胞代表 2017;9(1):50–7.格式 2017/06/27.PMID：28648896;PubMed 中心 PMCID：PMC5511105。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

53.纳瓦雷特-佩雷亚 J、Yu Q、Gygi SP、保罗 JA。简化的串联质量标签 （SL-TMT） 方案：使用串联质量标签-同步前驱体选择-MS3 进行定量（磷酸化）蛋白质组分析的有效策略。J 蛋白质组研究 2018;17(6):2226–36.Epub 格式 2018/05/08.PMID：29734811;PubMed 中心 PMCID：PMC5994137。

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

54.Tyanova S、Temu T、Sinitcyn P、Carlson A、Hein MY、Geiger T 等。Perseus 计算平台，用于对（蛋白质）组学数据进行全面分析。Nat 方法。2016;13(9):731–40.Epub 格式 2016/06/28.PMID：27348712。

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