厦门免费医学论文发表-低成本、多功能且高度可重复的微纳加工管道，可生成设计复杂的 3D 打印定制细胞培养设备

抽象

细胞培养设备，如微孔和微流控芯片，旨在增加基于细胞的模型的复杂性，同时保持对培养条件的控制，并已成为生物系统建模不可或缺的平台。从微形貌、微孔、电镀装置和微流体系统到更大的结构，如活体成像室载玻片，各种不同几何形状的培养装置已成为生物学实验室中不可或缺的。然而，尽管它们在生物项目中的应用呈指数级增长，但由于制造所需的技术、设备和工具以及必要的专业知识的结合，生物和生物医学实验室往往更倾向于依赖已经制造的设备。事实上，商业开发的设备可用于各种应用，但通常成本高昂，而且重要的是，缺乏每个实验室定制的潜力。最后一点非常关键，因为湿实验室的实验通常适应任何现有的设计，而不是设计和制造完全符合生物学问题的定制系统。这些因素的结合仍然限制了微加工定制设备在大多数生物湿实验室中的广泛应用。利用旨在解决这些问题的生物工程和微纳加工的最新进展，并利用低成本、高分辨率的桌面树脂 3D 打印机与 PDMS 软光刻相结合的优势，我们开发了一种优化的低成本和高度可重复的微纳加工管道。这是专门为没有该领域经验的生物医学和生物湿实验室考虑的，这将使他们能够以简单、快速、可重复的方式生成各种用于细胞培养和组织工程的可定制设备，而成本仅为传统微纳加工或商业替代品的一小部分。该协议专门设计为在这些技术方面专业知识有限的生物实验室提供资源，并能够制造跨μm到cm尺度的复杂设备。我们提供现成的管道，用于高效处理用于 PDMS 固化的树脂基 3D 打印结构，使用聚合步骤、洗涤和表面处理的组合。结合制造管道的广泛表征，我们展示了该系统在与生物实验相关的各种应用和用例中的应用，从细胞排列的微观形貌到复杂的多部分水凝胶培养系统。这种方法可以很容易地被任何湿实验室采用，无论先前的专业知识或资源可用性如何，并且将使定制的微加工设备在许多生物学领域得到广泛采用。

数字

表11表12表13表1图1图2图3图4图5图6Fig 7Fig 8Table 2Table 3Table 4Table 5Table 6Table 7Table 8Table 9Table 10表11表12表13表1图1图2

引文： Hagemann C， Bailey MCD， Carraro E， Stankevich KS， Lionello VM， Khokhar N， et al. （2024） 低成本、多功能和高度可重复的微纳加工管道，用于生成具有复杂设计的 3D 打印定制细胞培养设备。PLoS 生物学 22（3）： 编号：E3002503。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503

学术编辑： Chaitan Khosla，斯坦福大学，美国

收到： 2023年7月10日;接受： 2024年1月17日;发表： 3月 13， 2024

版权所有： ? 2024 Hagemann et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有数据和程序均可在论文中找到，其他信息和设计可作为本出版物和相关文件的一部分提供，也可从相应的 GitHub 存储库 （https://github.com/SerioLab/SOL3D） 下载。

资金： Serio 实验室感谢英国生物技术和生物科学研究委员会 （BBSRC） [BB/T014318/1] [BB/W006561/1] 和痴呆症研究所 （UKDRI） 的支持。F.S.T和A.S.是Horizon Europe“MAGIC”财团（101080690的一部分;www.magic-horizon.eu）;这项工作由英国研究与创新 （UKRI） 资助，根据英国政府的 Horizon Europe 资助保证拨款编号为 10080927、10079726、10082354 和 10078461。Tedesco实验室的工作也得到了欧洲研究委员会（759108），AFM-Telethon（21687），BBSRC（BB / M009513 / 1），CureCMD（576031），英国肌肉萎缩症和NIHR的支持（所表达的观点是作者的观点，不一定是国家卫生服务，NIHR或卫生部的观点）。这项研究全部或部分由惠康信托基金资助。我们要感谢弗朗西斯·克里克研究所（Francis Crick Institute）的科学技术平台“制造实验室”（Making Lab）设施;A.S.、A.I 和 FST 感谢弗朗西斯·克里克研究所的支持，该研究所的核心资金来自英国癌症研究中心、英国医学研究委员会 （MRC） 和惠康信托基金会 （CC0102）。KS 和 CDS 承认 Leverhulme Trust （RPG-2022-174） 的资助。C.D.S 通过惠康信托职业发展奖 （225257/Z/22/Z） 感谢慷慨的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

缩写： DBM的 胚状体;ECM， 细胞外基质;GS， 山羊血清;国际刑事法院， 免疫细胞化学;异丙醇， 异丙醇;iPSC， 诱导多能干细胞;锰 运动神经元;MNP， 运动神经元祖细胞;PDMS， 聚二甲基硅氧烷;SOL3D， 3D还原聚合模具上的软光刻

1. 引言

基于干细胞的模型是一种宝贵的资源，可以在体外研究几乎任何细胞类型[1–4]。细胞重编程的出现以及随后对患者来源的干细胞模型的访问也激发了它们作为研究健康和疾病细胞过程的理想工具的地位[5\u20129]。虽然干细胞模型可以显著控制培养细胞类型的身份，但用于它们的传统培养系统通常缺乏控制培养物本身关键参数的能力，这极大地影响了所分析的生物过程。这些参数包括培养细胞的相对位置、分组、细胞-细胞和细胞-材料相互作用以及许多其他参数，具体取决于所提出的生物学问题。尽管大量的商业设备允许在一定程度上控制培养条件，但它们通常是不可定制的，并且需要根据特定的设备特性调整生物实验参数，而不是更理想的相反。

已经开发了几种生物工程和制造策略来创建定制工程的培养环境，以指导细胞的环境[10,11]，它们带来了无数新的生物学见解。这些策略中的大多数包括 2 个关键部分：一种合适的材料，而不是一种可以使其具有生物相容性的材料，以及将其塑造成所需形式的方法。PDMS（聚二甲基硅氧烷）是一种生物相容性、光学透明的硅基弹性体，具有可调的刚度（800 kPa—10 MPa），与多种适用于细胞培养的化学修饰相容，是用于制造微流控装置和无数其他用于体外研究复杂细胞相互作用的培养平台的最广泛使用的材料，而生物相容性还取决于所使用的细胞类型和表面修饰[12，13]. 这些细胞培养设备和平台中的大多数具有从微米到几毫米不等的特征，具体取决于细胞的大小、所需的培养基体积和实验范式。能够制造微米级、毫米级和在某些情况下厘米级的定制设备为生物实验提供了无数的可能性，但这通常需要多种技术的组合，在某些情况下，还需要各种不同的专业知识和设备或资源，这在以生物为重点的实验室中并不常见。因此，对于湿实验室来说，对具有微观功能的细胞培养应用的用户可操作的宏观设备进行快速原型设计仍然具有挑战性。

利用生物工程和微纳加工领域旨在解决这些问题的最新重要进展，并利用低成本、高分辨率的方法，我们开发了一种优化的低成本和高度可重复的微纳加工管道，专门针对没有该领域经验的生物医学和生物湿实验室，这将使他们能够为细胞培养和组织工程生成各种可定制的设备，其特点是从 20/50 μm 到几厘米不等，使用 3D 还原聚合。

我们在这里提供了关于如何使用该管道的详细指南，用于生物和生物医学湿实验室，以及有关生物工程和微纳加工领域所涉及的技术的必要信息和背景以及几个应用示例。以下是相关技术的简短背景介绍，以简略形式，我们在补充指南（S1文本）中对可用系统进行了深入的解释和描述。

简而言之，传统的微纳加工通过光刻和软光刻方法的组合产生微米级和毫米级的特征。特别是光刻需要专门的设施和专业知识，并且通常只允许一次生成 1 尺度内的特征，因为它基于定义厚度范围从 1 μm 到通常最大 500 微米的光敏聚合物的连续沉积。虽然光刻对于创建许多流行的细胞培养设备至关重要，但专用设备、相对较长的时间尺度和所需的专业知识限制了定制微设备的更广泛采用[11]。

3D打印技术已成为一种易于访问且适应性强的工具，可用于快速原型制作和制造小型物体。随着3D打印机可用性的提高，3D打印机的快速技术进步导致了几个开源项目的开发，旨在使任何湿实验室都能创建和采用关键和创新的建模策略[14\u201219]。考虑到欠发达国家的实验室在采购设备或特定耗材方面所面临的挑战，或者一些实验室在从不同领域涉足细胞培养和生物学时遇到的有时遇到的陡峭的实际障碍，这一点尤为重要。

有多种不同的 3D 打印技术，从长丝沉积到树脂的还原聚合。这些技术大多是市售的，但随着时间的推移，已经开发了更复杂和复杂的方法，例如基于双光子的微纳加工[20\u201223]。尽管这些定制的高分辨率设置是重大的技术进步，但我们在这里重点关注还原聚合，因为它代表了最容易获得和最具成本效益的 3D 打印形式，具有微米级分辨率，并提供了有关其他技术的更多详细信息，作为补充指南 1 的完整概述（S1 文本).还原聚合是使用UV固化树脂作为材料，对复杂体积进行逐层结构。通过将紫外线照射在薄体积的树脂上，并在其旁边放置构建板来构建功能。树脂固化并附着在构建板上。然后，板移动并为新的树脂层提供空间，该树脂层从之前聚合到树脂层上。最终结构是使用类似于最终设计的图案化紫外线逐层打印的。

不幸的是，大多数市售的UV槽聚合树脂都具有细胞毒性，不能用于细胞培养应用[24]。此外，这些树脂的成分通常是专有的，生物相容性树脂的转化或生产需要的技能仅限于专门的化学实验室[25]。一些生物相容性树脂是市售的;然而，它们的售价往往比高分辨率树脂高得多，在某些情况下甚至比实际打印机还要高（例如，Phrozen sonic mini 4K 打印机 = 365 英镑 [26]，1L Zortrax Raydent Crown 和 Bridge 树脂 = 392 英镑 [27]——撰写本文时的价格，仅供参考），破坏了 3D SLA 打印用于细胞培养目的的适用性（S1 图）。此外，与PDMS和其他用于软光刻的硅基材料不同，树脂不具有可调的刚度，并且通常不具有光学透明性，这些因素阻碍了它们作为细胞培养或显微镜的合适基材的能力。

解决这些问题的一个可能方法是将PDMS与UV树脂桶聚合3D打印模具相结合，并有效地采用3D打印代替传统管道中的光刻。然而，在还原聚合树脂印刷品上固化PDMS可能具有挑战性，因为大多数市售树脂的成分会抑制PDMS聚合[28\u201231]。此外，这种固化抑制使脱模变得困难，并可能导致细胞毒性未固化的PDMS单体浸出到即使成功脱模设计的细胞培养基中[32]，使设备无法用于细胞培养应用。

为了克服这些挑战并促进适用于细胞培养的复杂3D构建体的生产，已经尝试了几种成功的后处理和包被方法[33\u201235]。然而，这些方案通常涉及长时间的加热和洗涤剂处理[36]，这通常会导致印刷变形，或者昂贵的技术[37]，并非每个实验室都能使用。其他人则通过使用定制树脂来规避这个问题[38]。后者的一个例子是，用聚对二甲苯涂覆UV树脂桶聚合印刷品可以有效地创建可用的模具，并且足以克服PDMS的固化抑制[39]，但需要使用专门的设备，并增加了另一个潜在的技术挑战步骤来优化。

最初，我们自己在将微纳加工技术应用于棘手的生物学问题方面的经验，并受到不同团队最近许多技术进步的启发，我们的目标是创建一个优化且普遍有效的管道，其中包括使用低成本的商用打印机和材料在3D还原聚合模具（SOL3D）上进行生产和后处理协议。

为了证明该方法适用于几种不同的生物实验，并为其他没有微纳加工专业知识的实验室提供有效的即用型管道，我们演示了它用于开发可定制的培养设备，范围从μm到mm和cm，具有复杂的3D形状或微观地形。除了详细的实验方案外，我们还为所展示的每个设备提供设计，这些设计可以定制以满足不同的实验需求。

2. 结果

2.1 3D SLA打印模具上PDMS固化的优化

为了克服目前阻碍在生物实验室中将 3D 还原聚合集成到组织培养构建体的障碍，我们旨在优化一种易于实施且广泛适用的方案，以便使用市售设备在大桶聚合模具上实现高效的 PDMS 固化。因此，我们测试了各种市售树脂（表1），对不同制造商进行子采样，以及市售的高分辨率3D还原打印机（零售价为300至400英镑，Phrozen 4K Sonic Mini或Anycubic Photon S相当于约2批用于免疫染色的单克隆抗体）。

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表 1. 树脂。

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首先，我们验证了先前报道的每种树脂在常规后处理步骤（异丙醇洗涤、UV固化）后的细胞毒性，无论是在未经处理的状态下，还是在补充热处理、洗涤和紫外线灭菌的情况下，通过将树脂芯片与诱导多能干细胞（iPSC）衍生的运动神经元（MNs）共培养（S2图）.此外，我们还测试了用于牙科植入物的 2a 级生物相容性树脂。与该填料共培养 4 天后，尽管洗涤方案不同，但 iPSC 衍生的 MN 仍显示出毒性作用，并且与对照孔相比，碎片的视觉明显增加（S3 图）。由于没有一种树脂适合直接使用的细胞培养应用，因此我们专注于优化树脂模具的印后处理协议，在树脂清洗、印刷涂层和PDMS热处理固化3个主要步骤中测试不同的参数（图1A），以找到一种简单快捷的方法来克服PDMS固化抑制，因为没有标准化的后处理方案（图1B）).使用修改后的制造商对推荐打印机（Anycubic 或 Phrozen）的设置打印树脂（图 1C 和表 1）。我们在 6 个不同的时间点（2 小时、4 小时、6 小时、18 小时、22 小时、24 小时）测试了模具上的 PDMS 固化，并认为如果过程需要 30 小时以上，则样品条件不适合固化。

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图 1. 搪瓷漆涂层有助于在3D打印模具上快速固化PDMS。

（A） 在3D打印模具上建立PDMS固化协议的调查策略的示意图概述。（B） 从分类为已固化或未固化的印刷设备中取出的 PDMS 铸件的代表性图像。箭头突出显示液体 PDMS。（C） 3D打印模具的CAD的代表性图像，完成的打印以及层厚度和特征尺寸的表面光学轮廓。（D） 不同洗涤条件下按树脂类型划分的PDMS固化时间热图。（E） 不同PDMS固化温度（右y轴）和不同SLA印刷涂层下按树脂类型划分的PDMS固化时间热图。（F） 未涂漆（右）和搪瓷漆涂布印刷品（左）的代表性 SEM 图像，箭头突出显示油漆层。（G） 使用（黄色）和不使用（紫色）搪瓷涂层的优化制造、后处理和 PDMS 铸造协议的示意图概述。

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异丙醇洗涤步骤旨在去除印刷模具中多余的未固化树脂。我们测试了 2 种不同的去除、超声处理和搅拌方法，单独或组合，每种方法 10 分钟，发现孤立的印后洗涤条件对 PDMS 固化时间的影响不大，但组合处理是有益的。因此，所有后续实验均使用超声处理和洗涤（每个10分钟）进行。有趣的是，我们发现树脂选择对固化时间的影响比洗涤本身更大，树脂 A 和 F 表现最好（图 1D）。在大多数情况下，树脂 E 和 D 的洗涤是不成功的，因为印刷不当导致大量未固化的树脂粘附在印刷品上，如果可以进行固化，则对这些样品的 PDMS 固化进行后续分析会偏差固化时间。

有人认为，蒸发的丙烯酸酯单体[33]是大多数树脂的成分，在加热过程中释放到PDMS中，可以抑制树脂的固化抑制作用。我们的理由是，无论是阻断丙烯酸酯和PDMS之间的接触位点，还是在固化过程中减少树脂中丙烯酸酯的释放，都足以使PDMS在模具上有效固化。为了验证这些假设，我们使用市售的搪瓷涂料用喷枪系统均匀地涂覆水洗过的 3D 打印件，在 PDMS 和树脂之间形成保护屏障。然后，我们比较了涂布印刷品与未涂布印刷品在3种不同温度（60、75和90°C）下的PDMS固化时间，这使我们能够确定温度对丙烯酸酯释放和PDMS固化的作用。这些实验表明，搪瓷漆涂层不仅使PDMS固化在表面，而且在整个铸件中都固化，并缩短了所有树脂的PDMS固化时间。需要注意的是，树脂A是一个特例，因为它在有和没有涂层的情况下都表现出良好的PDMS固化性能（图1E），允许使用我们的后处理协议，有和没有搪瓷漆。这两种方案不仅在涂层上有所不同，而且在使用的固化温度上也有所不同，这会影响整个制造时间。非涂层协议中缺少油漆层的好处是，它允许制造详细的PDMS模具（特征<300μm）（图1G）。总体而言，较低的温度改善了PDMS在树脂上的固化时间，温度对涂层样品的影响变化可以忽略不计。此外，我们观察到高温（90°C）导致印刷品明显翘曲。这些不良反应在较低温度（60至75°C）下不太突出，但仍然足以有效治愈PDMS。

也有报道称，作为树脂成分的丙烯酸酯单体和光引发剂可以从树脂中浸出到PDMS中，从而影响浇注结构的生物相容性[32]。为了验证固化的PDMS样品没有树脂或搪瓷漆的渗滤液，我们使用拉曼光谱来表征每种后处理条件下样品的化学成分，并将其与固化和未固化的PDMS进行比较（S4图）。该光谱分析显示，树脂成分或涂料在浇注的PDMS中没有可检测到的残留物，并且树脂浇注与固化的PDMS具有高度相似性。测量在己烷中长时间膨胀的PDMS样品的渗滤液进一步表明，浸出是最小的，结果表明固化完成>97%（参见M&M）。类似的实验是将在我们的树脂模具中固化的PDMS样品在37°C的水性介质中孵育72小时，结果通过MALDI-TOF质谱分析评估了无法检测到的渗滤液水平（S5图），而用iPSC衍生的MN培养树脂印刷浇注PDMS底物在较长的培养期内显示出良好的生物相容性（S6图）。

由于在模具设备上引入一层搪瓷涂层可能会对精细特征尺寸产生负面影响，因此我们在含有树脂 A 的印刷模具上使用 SEM 成像来量化印刷尺寸和表面粗糙度是否受到显着影响。分析表明，与未涂布的印刷品相比，涂布印刷品表现出一层薄薄的油漆（30 至 50 μm 之间）和更高的表面粗糙度（S7 图）。这限制了该方法在任何维度上大于 100 μm 的特征的应用（图 1F）。

总体而言，我们建立了一个快速而强大的后处理管道，确定了合适的树脂，并为 3D 还原打印提供了即用型方案。我们提供 2 个有效后处理协议的修改版本，用于在 3D 还原聚合模具上进行 ft-l 分析，具体取决于设计和特征尺寸（图 1G）。

SOL3D 制造允许生成复杂的 3D 形状模板，以精确控制开放式孔内的细胞定位和分组

3D打印模板辅助干式电镀装置，用于控制标准孔板内的细胞位置和数量。

传统的开孔培养系统通常不能以简单且可重复的方式控制细胞位置、分组和数量，从而限制了体外建模实验的复杂性。有几种技术可以克服这些限制，并在培养容器内创建细胞的精确排列——从微流体设备到细胞生物打印——;然而，大多数依赖于创建分隔结构，以限制对开放式井系统授予的细胞的操纵。

一种不同的方法既可以增加传统培养容器的复杂性，又可以保持开孔系统，是模板状的电镀装置[40,41]。这些系统是临时结构，用于指导开放井内细胞的组织，尽管目前它们受到与上述策略相同的制造限制。此外，这种方法尤其受到光刻技术所决定的特征尺寸和纵横比的技术限制的影响，导致薄型设备难以处理且定制可能性有限（S8图）。

我们决定使用人诱导的多能干细胞衍生的MN作为细胞模型系统，对这些类型的设备进行建模，以初步验证我们优化的SOL3D方案，基于我们最近为MN培养物开发的工程平台，使用微图案底物促进轴突伸长[42]。

我们将该平台与我们的 SOL3D 成型方案相结合并进行了优化，以创建量身定制的电镀策略，用于研究 hiPSC 衍生的 MN 行为，并控制细胞位置和方向。我们设计了用于铸造PDMS模板孔装置的模具，矩形挤压特征和漏斗形介质储层作为复杂的3D特征，以简化细胞接种。这种优化的设计允许快速和方便的手动接种，因为细胞可以在适当体积的培养基中沉淀到微小孔中，以避免过度蒸发和细胞死亡（图 2A 和 2B）。

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图 2. SLA 3D 打印可以控制开放孔中的细胞位置和数量。

（A） 研究干镀策略的示意图概述，该策略将 3D 打印模具的 PDMS 铸件与 PDMS 微槽基板相结合，以控制细胞体位置和数量。孔径范围从 600 μm × 1,000 μm 到 50 μm × 1,000 μm，间隔为 50 μm。（B） 漏斗形状井的示意图，便于在微孔中手动接种。（C） 填充有预染色（硅罗丹明-微管蛋白）MN 祖细胞的模板装置的代表性图像，装置仍在原位（上）、装置移除后（中）和培养 7 天后固定后的轴突 β-III 微管蛋白（下）。（D） 通过倍数变化将模板去除后的种子细胞面积与 CAD 指定值进行比较。（E） 同时用 DAPI（第一张图像）、轴突 β-III 微管蛋白（第二张图像）和树突状 MAP-2（第三张图像）（第四张图像）染色的 2D 轴突伸长的 3D 聚集体的代表性图像。

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来自这些 3D 模具的 PDMS 模板允许通过“干镀”进行接种，即将模板放置在干燥的传统组织培养塑料容器中，并将悬浮细胞手动移液到模板装置中，将细胞体与残余孔隔离并允许它们粘附在这些特定位置。固定细胞体后，可以移除模板装置，并用培养基填充整个孔，同时粘附的细胞保持在指定位置。对于这种“干镀”工艺，PDMS钢网孔周围需要强大的流体密封，需要钢网和下面的基板之间有一个平坦的表面。如果没有特定的步骤来调整打印件的表面粗糙度，3D打印模具的PDMS铸件本质上比用于铸造微加工PDMS器件的微图案硅晶圆的PDMS铸件更粗糙（S7和S9图）。因此，我们在PDMS固化之前实施了一个额外的夹紧步骤，使用硅烷化载玻片（参见M&M）覆盖与空气接触的PDMS表面，利用玻璃提供的平坦表面（S10A图）。我们评估了使用蓝色染料将夹紧固化的钢网流体密封放置在具有 10 × 10 μm 凹槽的 PDMS 微图案表面上时的效率。在所有使用附加夹紧固化的模板中实现了有效的密封，通过染料仅到达孔区域的微槽基材并在这些特定凹槽内扩散来表示。未夹紧的模板显示染料不受控制地扩散到整个设备，验证缺乏流体密封（S10B 图）。

然后，我们能够使用优化的模板设备来回答生物学问题，并研究在微沟上形成自组织的 3D 神经聚集体以进行轴突伸长所需的最小数量的 iPSC-MN，这一过程由趋化性和形貌决定。为了实现这一点，我们使用了上述带有漏斗形储层和矩形孔的模板，在 Y 维度上有所不同，以减小模板孔尺寸并控制细胞数量。孔尺寸均匀，并且忠实于CAD规范，整个打印尺寸低至50μm（S11图）。将这些PDMS模板孔器件放置在带有轴突引导槽的细胞外基质（ECM）涂层和干燥的微图案表面上[42]，并将iPSC衍生的MN细胞悬液手动移液到设备的干孔中。为了避免在较小的孔中出现潜在的气穴，这在非功能化PDMS中很常见，我们在电池“干镀”之前对模板进行了氧等离子体处理（S12图）。在接种过程中实现了尺寸减小的紧凑矩形“聚集体”（即通过从培养物中重新聚集单个细胞产生的 3D 细胞簇），并在移除设备后保持。在分化培养基中用 β-III-微管蛋白染色 7 天后发现，大小低至 150 μm 的孔为聚集体形成提供了合适的细胞数量。然而，2个最小的孔径没有为聚集体的形成提供环境，细胞在地形上迁移（图2C和2D）。随后用区室特异性标记物染色显示，在致密聚集体的开孔装置中，树突和轴突之间有明显的分离（图2E）。

总之，使用SOL3D浇注的模板孔设备可用于控制开放孔中的细胞位置，促进对同一设备中不同细胞数量的控制，并实现细胞室特定的研究。

使用定制的电镀装置对细胞间相互作用进行空间、时间和形态控制

接下来，我们探索了将SOL3D用于更复杂培养的潜力，包括不同的细胞类型和铺板时间点。

首先，为了在同一设备中铺板多个细胞群，我们试图利用PDMS的天然疏水性以及图2A所示的大型矩形孔设计和漏斗形孔剖面。培养基和疏水性PDMS之间的高接触角允许实现不同细胞悬浮液滴的限制，从而在包含不同细胞群的相邻孔之间产生完全的流体分离，即使使用手动接种也是如此。我们试图利用这种策略在PDMS设备的不同空间独立口袋中同时接种同一组织培养孔中的不同iPSC衍生的MN群体。为此，我们使用了荧光 RFP 和未转染的 MN，我们将它们手动接种在放置在 6 孔板的 ECM 包被孔上的同一装置中的相邻口袋中。在去除电镀装置之前，将不同的细胞群粘附2小时。在取出装置并进一步细胞培养 72 小时后，用硅罗丹明微管蛋白染料（此处以绿色表示用于可视化）对所有 MN 进行染色，以可视化所有神经突和细胞体。整个装置的折线图分析表明，所有孔都含有MN（RFP和RFP/微管蛋白），并且每隔一个孔中就存在RFP细胞（图3A和3B），这表明在单个设备内的有限预定空间组中进行多细胞类型接种。++-++

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图 3. 电镀装置能够对具有不同几何形状的细胞电镀进行时空控制，以构建复杂的神经回路。

（A） 在同一设备中交替接种 RFP 和非 RFP+ 运动神经元以及以下活细胞染色的示意图概述。（B） 整个孔中染色的代表性线剖图，显示单个群体分离到其指定孔中 - 仅在孔 1 和 3 中分离 RFP+，但在所有孔中 SiR-微管蛋白+（此处为绿色）（顶部）。染色的 RFP+/? 运动神经元的代表性荧光图像（底部）。（C） 使用 2 个模板设备和 3 种不同的细胞类型（MN、皮质和星形胶质细胞）构建神经回路的多设备协议的示意图概述，并在不同时间点进行接种。（D） 培养 19 天后完整回路的复合。GFP 转染的运动神经元 = 绿色，神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 可识别星形胶质细胞，β-III-微管蛋白可识别皮质神经元和 GFP+ 运动神经元中的微管蛋白。蓝色设备井形状叠加用于说明目的。（E） 结合现有微槽操纵骨料几何形状的协议示意图概述。（F） 第 2 天 SiR-微管蛋白活细胞染色的运动神经元聚集体的代表性图像。（G） CAD（蓝线）和 β-III-微管蛋白通道培养第 2 天之间按形状变化的聚集体纵横比折叠变化的箱线图（上图）。（H） CAD（蓝线）和 β-III 微管蛋白通道培养第 2 天之间按形状变化的聚集体区域折叠变化的箱线图。G 和 H 的数据点可以在 S1 Data 中的 3G-Data 和 3H-Data 文件中找到。

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然后，我们试图通过在同一孔内的不同时间点接种多种细胞类型来进一步提高体外培养的复杂性，利用我们的设备和培养板之间的高效和可逆的流体密封。为此，我们将 2 个矩形电镀装置放置在 2 个矩形电镀装置上，彼此相距约 2 mm，位于 6 孔板孔内的 ECM 涂层微图案表面上，如上所述。最初，一个装置用于以 1：1 的比例干燥 iPSC 衍生的皮质神经元 [43] 和星形胶质细胞 [44]，并在 24 小时后取出，而另一个装置保持空。然后将整个组织培养孔填充分化培养基并培养 9 天。在此期间，由微地形图引导的皮质轴突向空装置延伸，即使被介质包围，该装置仍保持其初始流体密封。在第 9 天，GFP MN 通过首先将孔内培养基的液位降低到电镀装置边缘以下，然后将 MN 直接接种在悬浮液中，从而在第二台装置中接种。在允许细胞附着后，第二个装置也被移除，用新鲜培养基重新填充孔，并将细胞再培养 9 天。然后使用星形胶质细胞 （GFAP） 和神经元（MN 和皮质神经元，β-III-微管蛋白）的免疫细胞化学 （ICC） 验证不同细胞类型的位置，因为皮质神经元可以通过 GFP 和 β-III-微管蛋白的重叠来识别。使用这些定制的可移动 SOL3D 生成的接种设备，我们能够在同一培养孔内的 2 个不同时间点轻松接种 3 种不同的细胞类型，从而创建复杂的神经回路，并以具有成本效益和高度适应性的方式展示对细胞接种的真正时空控制（图 3C、3D 和 S13).此外，我们还使用可用于构建大规模细胞和组织排列的大幅面“嵌套”电镀装置在同一孔内演示了多个时间点播种（S14图）。+

接下来，我们测试了使用我们优化的 SOL3D 方案进行原型设计的便利性是否可以研究和操作复杂的 iPSC 衍生的 MN 培养物的基本行为。研究表明，使用不同几何形状的细胞聚集对聚集体的信号环境和模式有影响[45]。因此，我们设计并制造了具有 3 种不同孔形状的 PDMS 模板模具：矩形、圆形和三角形，以创建几何约束的神经聚集体。凭借同时生产多尺度特征的优势，我们能够保留以前模具的漏斗储层和直井设计（图 3E）。使用这些多形状模板，我们像以前一样在微图案基质上接种运动神经元祖细胞 （MNP），并允许轴突延伸 11 天（图 3E）。在这里，MN 骨料在模板移除后的第 2 天保持了忠实的面积和纵横比，符合 CAD 规格。11 天后，这些组也保留了其特定的几何形状，尽管随着时间的推移，纵横比和面积略有变化（图 3F-3H）。接下来，我们在非图案化和未涂层的组织培养塑料上使用这些PDMS模板，以避免细胞粘附，指导聚集体样结构的自组织（S15A图）。在这里，我们在基质胶中接种皮质祖细胞，并且能够在 24 小时后产生由 SiR-微管蛋白活染料图像证明的不同形状的聚集体（S15B 图）。因此，SOL3D制造可以用作制造构建体的有效方法，用于控制2.5（即部分三维贴壁培养物）和3D非贴壁培养物（例如聚集体）的多种几何形状的复杂培养物中的细胞相互作用，具体取决于接种基质。

2.2 SOL3D制造允许生成微观形貌

在图 2 和图 3 所示的初始实验中，我们在传统光刻产生的微槽顶部采用了 SOL3D 制造的器件。由于这种方法并非适用于所有实验室，因此我们专注于在培养中实现相同级别的组织，但在完全基于SOL3D制造设备的平台上。虽然 3D 还原聚合打印机的分辨率不如光刻设备，但我们不能简单地重现 10 μm 的凹槽。

此外，在当前基于LCD的照明中，由于照明图案和光的衍射，彼此接近且接近最小分辨率的重复图案对3D还原聚合打印构成了挑战（参见S1文本中的补充指南第15页）。

然而，关键参数是生物组织而不是材料几何形状，因此，我们专注于获得一种既可以用SOL3D打印又能实现相同神经突取向的设计。我们开发了一种具有不同凹槽几何形状和尺寸的设计（图 4A），凹槽深度为 200 μm，宽度为 100 μm。3D打印件的光学轮廓显示，凹槽比CAD设计更浅，约为60μm，宽度较小（S16图）。尽管存在这些限制，我们还是测试了地形是否足以对齐轴突伸长率。我们按照“干电镀”方案在SOL3D制造的凹槽上将MN神经聚集体[42]电镀在SOL3D制造的凹槽上（图4B）。培养 7 天后轴突 （β-III-微管蛋白） 的可视化显示在整个轴突长度上与地形一致（图 4C 和 4D）。

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图 4. SOLID制造的凹槽引导轴突伸长和肌肉纤维的排列。

（A） 100 μm 宽、200 μm 深的三角形凹槽的 CAD 设计，中间有 75° 的三角形间距。（B） PDMS 模板设备中 3D 打印凹槽和轴突伸长的“干”神经聚集体播种的示意图概述。（C） 轴突 （β-III-微管蛋白） 在 SOLID 制造的凹槽上的代表性概述图像，轴突的放大倍数与近端（蓝色）和远端（橙色）隔室中的地形对齐。（D） 近端（左）和远端（右）隔室凹槽上轴突 （β-III-微管蛋白） 的代表性 3D 重建。给出了跨隔室轴突与地形的对齐。（E） SOLID沟上成肌细胞播种和分化的示意图。（F） 在分化第 3 天，与在非图案化表面培养的细胞（右）相比，肌管 （SiR-微管蛋白） 与给定的地形（左）对齐。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.g004

另一个受益于与地形对齐的过程是肌管的形成[46]。我们在SOL3D凹槽和平坦的控制表面上接种成肌细胞（图4E）。细胞分化 3 天，然后使用 SiR-微管蛋白进行可视化。与细胞随机定位的对照条件相比，在图案化表面上培养的成肌细胞显示出与形貌的对齐（图4F）。虽然细胞遵循给定的形貌，但与光刻图案相比，SOL3D 凹槽的大小和形状的差异可能会引起不同的相互作用和生物反应，使 2 个不同的组不完全可比，但 Sol3D 制造的凹槽提供了微加工凹槽的合适替代品，并在某些情况下提供指导和细胞对齐。作为一种资源，SOL3D凹槽为微加工凹槽提供了合适的替代品，并提供引导和单元对齐。结合SOL3D模板类器件，可以使用SOL3D生成整个片上平台。

2.3 可定制的SOL3D制造，作为标准化商用培养平台的定制替代方案

以快速、可靠和具有成本效益的方式创建适合细胞培养或其他生物实验的可定制设备和基质的能力，具有微米到厘米大小的特征，在任何湿实验室中都特别有用，可以独立于高成本、交货时间和等效商业产品的可用性，同时实现大量定制。例如，大多数细胞培养容器布局都是标准化的，不能根据单个实验室或特定细胞类型的需要进行定制，从而导致更高的成本和实验设置的潜在妥协。因此，我们旨在测试我们优化的SOL3D模具方案是否可用于复制和进一步定制流行的市售细胞培养产品的相关功能。这些结构可以针对个别实验目标在尺寸和/或形状上进行定制，同时保持成本效益，突出了我们系统的多功能性和可及性，以加强生物学研究。

用于腔室滑轨装置的PDMS键合

腔室载玻片系统和其他显微镜检查的混合培养设备是市售系统，允许细胞直接在盖玻片上在相邻孔内培养，以实现高分辨率成像，提供小孔尺寸和成像兼容设置，以实现高通量和便利性。为了确定我们的SOL3D协议是否可以用于模拟这些结构，我们设计了一种腔室载玻片系统，该系统可以使用氧等离子体处理或紫外线敏感树脂粘合剂永久粘合到成像盖玻片上。重要的是，我们的结构适用于UV树脂，使得该方法可用于没有等离子清洗系统的实验室（图5A）。我们的设计是使用 SOL3D 协议制造的，尺寸与 60 mm × 24 mm 显微镜盖玻片相匹配，该盖玻片具有 12 个具有漏斗形状的圆形孔。如上所述，我们在PDMS固化过程中通过用载玻片夹紧设备来隔离相邻的孔，从而产生了流体密封。这种极其平坦的PDMS表面允许使用氧等离子键合或简单应用UV粘合剂将PDMS熔合到载玻片上。需要注意的是，UV胶粘剂是基于树脂的，因此具有细胞毒性，不能用于任何中等面区域。然后将星形胶质细胞祖细胞以不同浓度接种到选定的孔中（图5B）。用活染料（SiR-微管蛋白）染色显示两个装置中都有完整的流体密封，液体保持在各自的孔中，并且有健康的星形胶质细胞祖细胞群。我们进一步证明了高分辨率成像兼容性（图5C），因为细胞接种在载玻片上。从表面上看，我们已经证明了氧等离子体和UV树脂都适用于腔室载玻片装置的PDMS粘合，并强调了3D打印以快速且具有成本效益的方式制造定制腔室载玻片的能力。随着最近发布的 Phrozen Mini 8k，分辨率有所提高，我们试图测试这款打印机和提供的树脂的协议。微流控设备价格昂贵，只能一次性使用，没有定制机会，同时它们需要平坦的表面和高等级的细节。我们使用了三腔室设计（S17A 图），其通道宽度为 100 μm，高度仅为 10 μm，即使优化了参数，4k Mini 也可以实现大麦的 z 层厚度。为了进一步证明印刷质量的进步，我们没有将载玻片夹在印刷品上以获得平坦的表面，而是直接使用印刷品表面。事实上，通道的高度为9.4μm，宽度约为110μm（S17B和S17C图）。氧等离子体处理后，将表面密封在载玻片上，并使用合适的管子和注射器流过荧光素溶液。延时图像清楚地显示通道已连接，溶液被冲入，没有泄漏（S17D-S17F图）。总体而言，我们确认我们的管道适用于下一代打印机，并且随着打印质量的提高，也可以在 z 轴上实现精细的细节，以及不需要玻璃夹持的平滑打印。

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图 5. 3D打印可以通过2种不同的PDMS键合方法创建具有复杂孔几何形状的完全可定制的成像室，适用于细胞培养。

（A） 具有大孔的腔室载玻片装置的设计和制造示意图，该装置具有 （1） 紫外线胶或 （2） 氧等离子体粘合到玻璃盖玻片上以密封孔。（B） 为了证明细胞培养的密封质量和活力，将星形胶质细胞祖细胞以不同密度接种在不相邻孔中，并在腔室载玻片装置中培养。SiR-微管蛋白活染料染色的星形胶质细胞祖细胞在用不同方法结合的腔室载玻片中接种 1 天后的代表性图像。（C） 在定制的 SOL3D PDMS 腔室中培养的星形胶质细胞 （GFAP） 和线粒体 （TOMM20） 的高分辨率成像。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.g005

用于胚状体形成的定制微孔阵列

我们为此目的测试的第一个设计是一系列金字塔形微孔（390 × 350 × 150 μm），我们使用优化的方案制造，没有涂层步骤，因为这种小特征尺寸（<500 μm）是必需的（图6A和6B）。这些微孔对于从iPSC诱导特异性细胞谱系和聚集研究至关重要[47,48]。这些孔最重要的功能之一是确保均匀的聚集体大小，以获得可重复的结果，例如，生成规则大小和形状的胚状体（EB）。我们使用模制的微孔阵列从iPSCs悬浮液中形成EB（图6C），并在设备上培养4天后定量其大小。在我们的微孔中，iPSCs形成了直径一致的EB，验证了我们的定制PDMS模具是否适合创建小的规则特征阵列（图6D）。因此，我们的方案产生的微孔适用于生成均质EB，其优点是以低成本对孔的形状和尺寸进行大量定制。

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图 6. 由3D打印设备铸造的PDMS基质允许正常大小的胚状体。

（A） 在微孔上设计、制造和接种IPSC的示意图。（B） 3D打印微孔装置的代表性光学轮廓，孔径为390μm长×350μm宽×150μm高。（C） IPSCs在微孔模具铸型中接种前的代表性SiR-微管蛋白活细胞染料图像。（D） 接种后（左）和 2 天培养（右）后，与平坦的 PDMS 底物相比，从 3D 打印微孔装置接种在 PDMS 上接种的 IPSC 的代表性 SiR-微管蛋白活细胞染料图像。（E） 在培养物中分离 4 天后分离（上图）和洗掉 PDMS 微孔底物（左下）后胚样体上融合胚体的代表性 SiR-微管蛋白图像。从微孔PDMS模具中分离的胚状体直径的定量表明胚状体的均匀大小（右下角）。数据点可以在 S1 Data 中的 6E-Data 文件中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.g006

设计复杂的大型组织工程设备

生成用于组织工程的复杂设备通常在大型结构中结合相对较小的特征，并且迄今为止已被证明在大多数实验室中实施具有挑战性，因为构建过程复杂且耗时，需要专门的专业知识。因此，大多数此类设备都来自市售供应商，定制的可能性有限且成本高昂。例如，组织工程化的3D肌肉结构使用各种装置，在培养过程中使用薄悬浮柱悬浮大细胞水凝胶[49,50]。它们由具有复杂形状端脚的小柱子组成，用于悬浮水凝胶结构并提供机械刚度以帮助分化。由于这些柱子很难制造，并且只有单一尺寸和形状的预制件，因此无法进行定制，例如小型化或改变基材刚度。然而，对于更小和更不复杂的肌肉岗位，已经成功地实现了3D适应，但3D SLA打印的生产难易程度较低[51]。

我们使用我们的 SOL3D 协议制造了一种用于悬浮 3D 肌肉培养的设备，具有可定制的柱子尺寸和整体尺寸。在这种情况下，挑战源于这样一个事实，即这些设备没有大的平面，它们呈现出薄而复杂的特征，理想情况下需要作为单个组件生产，以避免可能引入可变性的复杂装配步骤。在这种情况下，单个模具系统是不够的，因为缺乏与复杂形状接触的空气将阻止结构的成功脱模。我们使用SOL3D创建了一个由两部分组成的模具/注塑系统，在将PDMS倒入模具后，可以通过夹紧固化轻松组装。模具的优化表明，设计在两个部分（70/30）之间的不均匀分布有利于成功脱模，从而产生具有所需尺寸的可重复的单个设备，在这种情况下，其大小是商业替代品的两倍 - 与12孔板兼容的2厘米肌肉（图7A）。我们使用永生化的成肌细胞将我们的 12 孔板 3D 柱与市售的 24 孔适配等效物（参见 M&M，肌肉培养）进行了比较。

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图 7. 用于 PDMS 铸造的 3D 夹层模具，用于生成复杂的细胞培养设备。

（A） 3D夹层模具的设计和PDMS铸造策略示意图。然后，在PDMS柱子周围形成永生化的成肌水凝胶，分化并培养2周。（B） 在 20 mV 和 0.5 Hz 频率下对精心制作的 PDMS 柱子和市售柱子之间的差异化 3D 肌肉进行微刺激的比较收缩性分析。（C） 分化 2 周后 PDMS 柱和市售柱之间分化 3D 肌纤维纤维排列的方向性分析。（D） 分化 2 周后 PDMS 帖子和市售帖子上成肌细胞分化 （Titin） 和发育阶段 （MyHC） 的代表性图像。（E） 适用于 12 孔、24 孔或 48 孔板的不同尺寸的柱子图像（从左到右）。（F） 压缩 PDMS 以通过横向和旋转运动测量模量的图示。（G） 不同公式（1：10 或 1：20）的PDMS在变化角频率下的存储和损耗模量。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.g007

按照我们生成3D生物工程肌肉的方案[50,52]，我们首先通过在3D打印的矩形垫片周围填充液体琼脂糖来创建一个浇注模具，该垫片在琼脂糖凝固后被移除（S18图）。随后，将成肌细胞接种在琼脂糖模具内的纤维蛋白水凝胶中，并将SOL3D制造的柱子（或Maffioletti及其同事使用的市售设备[53]）插入仍在沉降的纤维蛋白构建体中[50]。分化 2 周后，我们在 20 mV 和 0.5 Hz 频率下对两种结构进行电微刺激以测量肌肉收缩力——这是成功培养 3D 肌肉培养的标志（图 7B），这显示了 SOL3D 和对照设备的周期性收缩。肌肉组织的免疫染色显示两种构建体中都存在终末分化的肌球蛋白重链 （MyHC） 和 titin 阳性多核纤维。方向性分析表明，肌纤维优先沿柱子排列（图7C和7D）。在证明了我们的 3D 贴片适用于肌肉细胞培养后，我们专注于贴片的小型化，以便能够用更少的材料获得相同的生物学结果。为此，我们使用 SOL3D 协议设计和制造了用于 24 孔和 48 孔板的嵌件（图 7E）。然而，除了改变尺寸外，我们还通过改变单体和固化剂之间的比例，利用了PDMS可调刚度的优势，同时保持光学透明并保留其大部分表面特性。在这里，我们使用了 24 孔板格式模具和聚合 PDMS，其标准配方 （1：10） 和固化剂的较低比例 （1：20）。固化剂与PDMS的比例越低，材料就越软，为了确认我们也可以在3D Sol3D模具中使用更软的PDMS，我们使用压缩测量了肌肉装置的模量（图7F）。正如预期的那样，与1：20公式相比，1：10 PDMS的存储和损耗模量更高（图7G）。

总之，我们的协议允许在PDMS中轻松塑造复杂和可扩展的特征，并在设计的各个方面进行定制，以改善3D工程肌肉组织的功能。

2.4 完全由SOL3D制造的水凝胶成型、培养和成像系统

水凝胶培养物为体外 3D 建模提供了绝佳的机会，因为它们易于生产，可以针对特定应用进行定制，并提供具有复杂结构和更符合特定组织的机械性能的类似体内的环境。低刚度是神经元培养的一个特殊优势，因为大脑是人体中最柔软的物质之一，但它也给处理这些水凝胶培养带来了挑战。生物打印机可用于直接形成具有凝胶内细胞特定形状和位置的水凝胶培养物;然而，由于复杂性和所需的工程工作，许多实验室的可访问性受到限制。此外，3D培养物的使用也给传统培养容器和培养板适应水凝胶结构的具体情况带来了挑战。

我们试图为水凝胶提供一种 3D 培养系统，该系统易于处理和培养水凝胶，完全可定制且具有成本效益，只需要实施 SOL3D 所需的设备。

我们首先设计和制造用于塑造水凝胶的PDMS模具。该模具使用SOL3D协议和我们的夹紧系统制造，用于平坦的底面，以便模具保持在所需位置。放置后，将水凝胶移液到模具中并手动接种MN祖细胞（图8A）。为了进一步避免凝胶从模具中分离并控制介质流向结构，我们开发了一种腔室系统，可以与模具一起放置在水凝胶的顶部。该设计包括一个用于水凝胶和模具的腔室，该腔室与顶部的储液器的漏斗相连。这限制了水凝胶的运动，同时提供了从顶部提供培养基的机会（图8B）。该腔室有 2 个圆形开口，可提供来自井相应一侧的介质流动（图 8C）。我们还将腔室的大小与 6 孔板的大小相匹配，这允许从设备的两侧和顶部添加不同的培养基（图 8D）。我们在定制的水凝胶中使用IPSC衍生的MNs，并将构建体培养7天（图8E）。水凝胶中轴突生长的可视化需要具有更高放大倍率的荧光成像。水凝胶结构的大小限制了成像方法的简单性，通常需要更复杂和昂贵的设置。我们设计了一个成像支架，该支架可根据水凝胶模具的尺寸进行定制。轴突（β-III-微管蛋白）染色后，去除水凝胶室，并且含有凝胶的模具可以很容易地转移到支架上。由于定制尺寸，只需要少量的封片剂即可覆盖样品，然后在支架顶部放置盖玻片（图 8F）。这导致样品的安装非常紧密，其中MN靠近载玻片，并且对样品本身的干扰最小，从而保持了复杂的结构（图8G）。低放大倍率（4×）的荧光成像显示了MN聚集体的整体结构，更高分辨率的图像（20×）显示MN在水凝胶结构中延伸长轴突（图8H）。这种 SOL3D 制造的水凝胶成型、培养和成像系统提供了一种简单且廉价的系统，该系统不仅限于水凝胶，而且可以适用于任何 3D 系统。

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图 8. 完全由SOL3D制造的水凝胶成型和培养室系统，带有定制的成像室。

（A） 用于水凝胶成型和 MN 晶种的 PDMS 模具生成示意图概述。将细胞手动移液到在SOL3D制造的PDMS模具中模制的预制水凝胶中。（B） 使用SOL3D的PDMS腔室制造过程示意图。该腔室设计复杂，结构内呈漏斗形状，并有多个开口。我们采用了两部分设计，以便于脱模。（C）组合水凝胶的示意图，MN放置在模具（A）中，并在构建体（B）周围放置扩散室，箭头表示介质的流动。（D） 可选的介质隔间，使用食用色素（蓝色、红色）和 PBS（顶部）突出显示。（E） SOL3D 腔室系统 （Brightfield） 的代表性图像，其中 MNs （SiR-微管蛋白） 在 6 孔板中培养。（F） 用于荧光成像的复杂水凝胶样品的安装过程示意图。SOL3D制造的支架允许在不受干扰的情况下转移整个结构，并安装在盖玻片附近进行成像。（G） 支架内水凝胶的示意图。PDMS模具位于孔的底部，水凝胶和细胞位于顶部。样品被封固剂包围，并用薄玻璃盖玻片覆盖以进行成像。由于采用了定制的支架系统，样品和玻璃之间的距离被最小化，从而可以进行荧光成像。（H） 在 SOL3D 水凝胶室系统中培养 7 天并安装在 SOL3D 室中的 MN 的代表性荧光图像。接种在水凝胶中的MNs（β-III-微管蛋白）扩展了许多轴突过程。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.g008

3. 讨论

在这项研究中，我们开发了一种快速、高分辨率且具有成本效益的方案，以快速构建高度通用的细胞培养兼容设备原型，这些设备可应用于一系列不同的应用，从活细胞成像到微流体，甚至先进的组织工程，我们称之为使用大桶聚合 （SOL3D） 的 3D 树脂模具进行软光刻。这种方法允许任何实验室，即使是那些在该领域具有非常少的专业知识或没有专门资源的实验室，也可以有效地建立完整的微纳加工原型系统，并以最小的支出生产适合其特定生物实验的培养设备。

3D打印的广泛商业化导致了分辨率和可访问性的重大发展，伴随着免费的存储库和软件包，大大降低了采用该技术的门槛。由于这种快速发展以及大量新的树脂和打印机的出现，很难获得适合特定应用的合适方案和材料的概述。因此，使用任何市售产品的印刷和制造的通用协议是非常可取的。

我们利用这些技术和社区的发展，通过开发和测试用于 3D 还原聚合、后处理和 PDMS 铸造的强大制造管道，克服了以生物学为重点的实验室中复杂微纳加工的主要障碍之一，无需进一步建立或优化即可完全定制任何细胞培养设备。我们测试了来自不同制造商的树脂，并确定了一种适用于PDMS铸造和高分辨率打印的树脂。特别是，其中一种树脂组合物在不应用油漆层的情况下表现最佳，用于高分辨率打印。此功能使用户能够充分发挥高分辨率打印的潜力，使小细节的油墨涂层变得多余[35]。有趣的是，这种树脂最初是为高分辨率打印而开发的，其粘度明显低于我们测试的其他树脂，这是在评估该方法的不同树脂成分时要考虑的参数。然而，如果没有将PDMS与模具隔离的涂层，封闭的打印件（如大型组织培养结构）（图7）仍然无法充分固化。我们还使用另一台市售的中价SL打印机测试了Resin A，发现在打印质量、PDMS固化或生物相容性方面没有明显的差异，表明树脂的优化参数很容易转移到多个打印机系统和设计。

在考虑用于生物实验的微加工设备时，特别是细胞培养和其他体外设置时，人们可能想要添加的拓扑特征大致包括亚细胞尺度（<5μm，例如纳米压痕[54]和其他纳米结构[55]）、细胞尺度（10至100μm，例如微槽[56]和其他微孔[57]）、多细胞（200至1,000μm、 例如，微流体通道[58]）或组织规模（>1mm，例如，聚集培养装置[59]）。在绝大多数微纳加工管道中，细胞尺度和多细胞尺度之间的界面存在实际差距，因为传统的光刻技术主要适用于较小尺度上的精确特征，而不太适合多细胞尺度。此外，跨秤有效地组合多个制造轮次有时具有挑战性、耗时且容易出错。取而代之的是，SOL3D等方法能够在同一轮制造中同时结合细胞、多细胞和组织尺度的特征，有效地填补了目前可用潜在工具包的空白。

这里的另一个优点是SOL3D不依赖于任何特定的打印机或树脂，因此可以用于任何组合（我们已经在3种不同的打印机上测试了几种树脂），并且随着更高分辨率打印机的出现，这种差距将变得明显缩小。我们还通过成功开发针对广泛应用的不同设计的细胞培养设备，证明了我们产品线的多功能性，这些设备为传统培养系统赋予了新的能力（例如，在精确的时空关系上轻松接种多种细胞类型）或定制生物工程培养系统。

虽然许多研究已经提出了类似的方案（例如，热固化[60]、紫外光[61]、微金刚石涂层[62]），但它们通常都倾向于具有相当低的分辨率，或者在某些情况下需要使用非常昂贵的专业设备的强制性步骤，而大多数生物实验室通常无法获得这些设备。此外，与这里介绍的管道相比，其中一些工艺中使用的化学品和材料需要更高程度的培训和专业知识，不需要危险的工艺或化学品，而只需要无毒且易于处理的组件，因此可以在实验室中实施而没有风险。

在最起码的实现中，SOL3D只需要一台高分辨率（约50μm）的台式大桶聚合打印机、合适的树脂、PDMS和日常细胞培养以及显微镜组件。所有这些资源都可以以低于 2 瓶单克隆抗体成本的初始投资获得，并且估计每年的运行成本为 300 <，用于生产常规的中型批量设备，这对于任何对细胞培养耗材有持续预算的实验室来说都是负担得起的。就上下文而言，市售的一次性 8 孔腔室载玻片适用于具有固定尺寸且无法定制的活体显微镜，价格在 10 到 15 美元之间，而单个微流控设备的成本在 50 到 120 美元之间，两者都可以很容易地被 SOL3D 取代。此外，SOL3D树脂模具与传统的硅晶圆PDMS母版一样，可以有效地重复使用几次，而复制品的整体保真度变化最小（S9图），同时在同一设备中提供不同规模的更广泛的功能。在此用例中，重复使用（超过 20/30 次）可能会在模具内产生翘曲;然而，由于树脂模具相对便宜且生产速度更快，它们仍然为大规模/长期实验提供了一条潜在的更可持续的途径。

由于PDMS的特性而不是制造过程，该方法的能力受到限制，需要注意的是，虽然可以在没有任何专用设备的情况下创建复杂的设备来有效地使用较小的特征（图2），但氧等离子体处理的步骤是必要的。然而，等离子体蚀刻机并非适用于所有实验室，这可能会限制该协议的适用性。Wang及其同事测试了PDMS的血浆处理的替代方案，这些PDMS渗透了足以用于Caco-2细胞的纤连蛋白[63];因此，血浆处理可能不是所有细胞类型都需要的，必须单独评估。

不幸的是，大多数UV树脂与细胞培养实验的相容性低，也限制了该方法和一般还原聚合的潜在应用。我们已经表征了几种不同的市售树脂，发现它们都处于处理或未处理状态，都具有细胞毒性（S2图）。市场上有一些生物相容性替代品（尽管牙科植入物所定义的生物相容性可以直接应用于干细胞培养物和其他更敏感的生物系统需要验证）可以克服 3D 还原聚合的这一基本限制，但价格远高于任何标准树脂。此外，树脂组合物通常是专有的，这一事实限制了最终用户可以实现的定制。一些供应商最近开始公布他们的树脂组合物以及由一些研究小组产生的定制树脂，这些树脂可以重新创建，尽管在大多数情况下，采用这些独特配方的负担可能会阻止它们的使用[64\u201266]。或者，将PDMS修改为可打印会导致打印分辨率降低，从而破坏了使用树脂进行微纳加工的高分辨率打印机的强大优势[67]。对于众所周知的树脂模具和PDMS固化抑制问题，我们实施的解决方案是首先通过多步骤制备（见图1）完全提取和固化树脂，然后用一层搪瓷涂层进一步屏蔽PDMS。

PDMS在细胞培养实验中的应用有着悠久的历史，我们在细胞和显微镜应用方面拥有数十年的经验;但是，它也有一些潜在的缺点。特别是，一些研究小组报告说，PDMS可以保留有机分子并吸附其他物质，这在特定情况下会严重影响生物和生化实验[32,68\u201270]。然而，这种设置的一个优点是它可以用于任何软光刻材料，例如，聚合物，如Flexdym、聚偏丙烯酸甲酯或聚（DL-丙交酯-共乙交酯），以及任何水凝胶或温度低于70度的固化材料。

通过该系统，我们的目标是使任何实验室，无论其能力、资源或先前的专业知识如何，都可以创建定制的微设备，其功能针对其特定的生物实验量身定制，并在设计时考虑到他们的生物学问题，这将大大降低任何领域微纳加工和组织工程应用实验的门槛。

4. 材料与方法

细胞培养

如上所述，对照hiPSC运动神经元和皮质神经元祖细胞来源于多个供体[71]（表2）。这些细胞在基质胶（康宁）包被的平板上培养，基础培养基由 50% NeuroBasal （Gibco）、50% 高级 DMEM （Gibco）、补充有 B27 和 N2 （gibco）、100 μg/ml Pen-Strep （Gibco） 和 2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽 （Gibco） 组成。为了扩增祖细胞，将FGF（20ng/ml）（Gibco）加入到基础培养基中。除非另有说明，否则使用含有化合物 E （Enzo） （0.1 μm） 和生长因子 BDNF （10 ng/ml） 和 GDNF （10 ng/ml） 的基础培养基实现 MN 祖细胞的分化。星形胶质细胞是使用Hall及其同事[71]描述的修改方案从iPSC产生的。将衍生的星形胶质细胞祖细胞在含有 FGF （20 ng/ml） （Gibco） 和 EGF （20 ng/ml） （Thermo） 的神经元基础培养基中培养。为了分化，星形胶质细胞在没有生长因子补充剂的基础培养基中培养。所有细胞均在37°C的湿润气氛中用5%CO 2培养（表3）。

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表 2. 细胞系。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.t002

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表 3. 细胞培养。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.t003

MNP的转染

对于细胞转染，使用基于质粒的 Piggybac 转座子系统，在实验室中克隆了 pgK-Puro-CMV-GFP 和 pPb-CAG-RFP-Hygro 构建体以及含有转座酶的 PiggyBac 载体。MNP 在 24 孔板上稀疏培养，传代后 1 天使用 Mirus LT1 （Mirus Bio） 转染试剂转染。在200μl无Pen-Strep生长培养基中加入每孔总0.5μg的质粒（含有GFP / RFP +转座酶）。在加入还含有200μl无Pen-Strep培养基的孔之前，将该溶液轻轻混合。24 h后，将含有转染试剂的培养基与生长培养基交换。将细胞培养至汇合，然后汇集到 6 孔板中进一步扩增。

制造

3D打印。

使用Fusion 360 [72]和Tinkercad [73]计算机辅助设计软件设计3D打印模具，然后将as.stl（立体光刻）文件导出到Chitubox或Photon车间切片软件。这些软件用于定义打印参数，例如每种树脂的层厚度、层紫外线照射时间和提升/缩回速度。所有树脂、打印机和打印设置都可以在表 1 和表 4 中找到。有关如何实现打印管道的深入详细指南，请参阅支持信息（S1 文本）。本文中描述的所有设备的设计都可以在我们的实验室 GitHub 页面 （https://github.com/SerioLab/SOL3D） 上下载和修改。

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表 4. 3D打印机制造。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.t004

后处理

打印后，使用超声波清洗剂和搅拌洗涤槽（Anycubic）在新鲜异丙醇（IPA）中洗涤构建体。作为协议建立的一部分，洗涤方法和时间是不同的。为确保公平比较，在给定的洗涤条件下，对每种树脂的洗涤 IPA 进行过滤，以去除先前洗涤中的树脂成分。洗涤后，将所有印刷品在市售固化室（Anycubic）中固化60分钟。然后，使用业余喷枪系统（Timbertech）选择性地涂上一层搪瓷涂料（Plastikote），按照制造说明用水以70：30稀释。在PDMS铸造之前，将涂漆铸件在室温下在工作台上干燥至少一个小时（表5）。

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表 5. 后处理。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.t005

使用软光刻技术对图案化基板进行微纳加工

如前所述，微槽衬底由使用光刻技术图案化的硅母版制成[74]。简而言之，SU-8 2002 （Kayaku） 在旋涂机 （Polos） 上以 1,000 rpm 的速度在硅晶圆上纺纱 40 秒，并在 95°C 下预烘烤 2 分钟。在 CleWin5 中设计的微凹槽图案包含 10 × 10 μm 凹槽，每 5 mm 有 250 μm 平台，然后通过紫外线曝光和与设计对齐的光掩模（Kiss MA6 掩模对准器）蚀刻到 SU-8 中。用PEGMA清洗过量的SU-8，然后在95°C下软硬烘烤5分钟，然后用三氯硅烷（C8H4氯3F13Si）在真空室中1小时。然后用 100% 丙酮从母带上洗掉多余的硅烷。未图案化的硅晶圆用于平坦衬底。为了比较 3D 打印铸件和微加工基板之间的表面粗糙度，使用 MicroWriter ML3（Durham Magneto Optics）通过单个光刻步骤实现蚀刻，以形成旨在模拟 3D 打印在微纳加工中的潜在能力的图案。在光刻步骤之后，将PDMS铸件（如上制备）制成扁平或微图案硅晶片，在旋涂机（Polos）上以300rpm的速度旋涂40秒以确保厚度均匀，并在100°C的热板上固化5至10分钟（表6）。

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表 6. 微纳加工。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.t006

PDMS系统

Sylgard-184有机硅弹性体试剂盒PDMS预聚物与固化剂以10：1 w/w的比例充分混合（5分钟），然后使用数字天平（Sartorius BP610）进行真空干燥和在不同温度（60至90°C）下浇铸。

生物功能化

PDMS基材和3D打印模具的铸件的生物功能化是使用氧等离子体处理（30 s，50%，7sccm - 除非另有说明）（Henniker Plasma）实现的。使用聚-D-赖氨酸 0.01% （PDL） （Gibco） 涂层 15 分钟和层粘连蛋白 （Sigma） 过夜（除非另有说明），实现了微图案化 PDMS 底物的额外生物功能化以促进细胞附着（表 7）。

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表 7. PDMS软光刻和生物功能化。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.t007

PDMS溶胀实验

在我们的Sol3D模具（约2g）上固化的PDMS样品被预先称重，然后在室温下在密封的玻璃瓶中在正己烷（10ml）中孵育24小时。在此之后，取出样品，在空气中干燥，并再次记录溶胀后的质量。将正己烷上清液真空蒸发，并记录残留物的质量。实验一式三份进行，误差以±标准偏差表示。样品质量变化：?0.0076 ± 0.0005 g;浸出残渣：+0.0076 ± 0.0005 g。

细胞接种

使用 Accutase（干细胞技术）将细胞从培养物中分离出来，并接种在氧等离子体处理的 PDMS 构建体中，这些构建体由 3D 打印模具铸造，这些模具与组织培养塑料、扁平 PDMS 或微图案 PDMS 基质结合。将细胞浓缩至每分离孔 300 μl，并接种在含有化合物 E （Milipore） 的分化培养基中。初始接种后，将细胞在构建体中沉淀 2 小时。然后用 PBS 洗涤细胞 2×，以从装有补充有化合物 E 的分化培养基的载体和孔中去除未连接的细胞，并保留载体。培养 24 小时后，用 PBS 洗涤细胞并在 1：100 基质胶加标前去除构建体 >2 小时，并在补充有化合物 E 的分化培养基中培养细胞（如上所述）7 天（或如上所述）。对于长期实验，根据实验选择性地补充额外的BDNF和GDNF生长因子的培养基。

免疫染色

染色前，将细胞固定在4%PFA（Boster）中15分钟（除非另有说明），并用PBS洗涤3×。然后用 0.1% Triton-X 透化细胞 10 分钟，并在室温下用 3% 山羊血清 （GS） （Sigma） 封闭 30 分钟（除非另有说明）。然后使用在 0.05% Triton-X 和 1.5% GS 的 PBS 中稀释的抗体对细胞进行染色，以获得感兴趣的标志物。抗体及其浓度见表8。将一抗在室温下在黑暗中孵育 1 小时，然后用 PBS 洗涤 3×。然后将二抗在室温下在黑暗中孵育 30 分钟，然后用 PBS 洗涤 3×。所有二抗均以 2 μg/ml 的终浓度孵育（表 9）。对于一些实验，然后使用FluorSave（Millipore）将染色的细胞安装在载玻片上。否则，将细胞保存在 4°C 的 PBS 中直至成像。对于活细胞成像，将细胞与 1：10,000 （100 nM） 硅罗丹明微管蛋白 （SiR） 活细胞染料 （Spirochrome） 孵育 1 小时，然后去除染料并成像（表 10）。

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表 8. 一抗/染色。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.t008

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表 9. 二抗。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.t009

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表 10. 免疫细胞化学。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.t010

显微术

使用包裹的尼康日食TE2000-E荧光显微镜对细胞进行成像，该显微镜运行Micromanager软件，具有4×、20×LWD和20×SWD物镜，冷却LED pE-4000 16 LED光源和Prior控制载物台。LED驱动器Arduino控制的光源为明场成像提供照明。为了进行纵向和实时成像，将显微镜室加湿并用5%CO加热至37.0°C2使用CAL3300培养箱温度调节器 （Solent Scientific） 和 CO2调节器（Okolab）。湿度，CO2通过将板进一步包裹在带有加湿 CO 的密封定制 3D 打印腔室中来调节平衡和温度2入口（表 11）。

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表 11. 显微镜硬件。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.t011

表面表征

光学轮廓测量。

使用 Sensofar S Neox 光学轮廓仪测量 X 和 Y 的特征以及层厚，实现了 3D 打印模具尺寸、表面粗糙度和像素尺寸的量化。使用 20×尼康 EPI 物镜和表面变化扫描模式，在重叠率为 25% 的拼接区域上捕获多图像 z 堆栈。为了分析3D打印模具和硅母版的图案化硅母版特征尺寸和PDMS铸件表面粗糙度，使用20×尼康DI物镜和共聚焦扫描模式捕获了重叠率为25%的拼接区域的多图像z-stack。使用内置分析工具对特征进行分析。对所有图像进行平面校正，以减少成像ROI中的偏差。

扫描电镜。

使用 Quorum Q150R 涂布机对涂覆和未涂覆的 3D 打印模具样品进行溅射涂覆 10 nm 厚的铂层，并通过 Phenom ProX 桌面 SEM （Thermo Scientific） 在 10 kV 的加速电压下成像（除非噪声太高，则使用 5 kV）。捕获印刷品的表面和横截面图像，以研究涂料的厚度并识别表面粗糙度/形貌的变化。图像在ImageJ FIJI[75]中处理（表12）。

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表 12. 表面表征。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.t012

图像分析

除非另有说明，否则所有图像分析均在ImageJ FIJI软件中进行，使用R进行处理，并使用R或超级数据图应用程序[76]呈现。

折线图分析。

为了量化同一器件/多个器件内的细胞分离，调整了阈值荧光强度以提高信噪比。然后在感兴趣的细胞上绘制一个矩形区域，并获得每个点的荧光强度图。

面积和纵横比。

将种子细胞面积和纵横比的测量值与 CAD 规格或 3D 打印模具特征尺寸进行比较。使用微管蛋白标记物硅-罗丹明微管蛋白（活的）和βIII-微管蛋白（固定的）从聚集体的边界进行细胞测量。使用SensoScan软件内置分析工具获得3D打印的模具尺寸。

树脂生物相容性

使用 50 μm 层厚打印机设置（表 4）打印的 6 种树脂中的每一种的切屑，并按上述方式进行后处理（20 分钟超声处理和洗涤，60 分钟紫外线固化），无需搪瓷涂层。然后用UV灭菌15分钟，或在75°C下烘烤4小时，在50°C下在PBS中洗涤72小时，UV灭菌15分钟，然后加入用SiR-微管蛋白细胞骨架活染料预染的MNP培养物中。在成像前将与未经处理的芯片一起孵育的细胞放置48小时。用处理过的树脂芯片孵育的细胞在培养物中前 24 小时进行活成像，然后在 48 小时再次用不含任何树脂的对照孔进行活成像。对 Ortho 牙科透明树脂的研究是在圆柱形树脂印刷品上进行的，这些树脂印刷品可用作组织培养孔的嵌入物。树脂打印件使用我们的 SOL3D 协议或制造商建议的洗涤协议进行处理。然后将处理过的树脂管插入含有已知数量的 iPSC 衍生 MN 的孔中，并共培养 4 天。

微孔阵列

重复 400 μm × 400 μm × 150 μm 金字塔的微孔阵列以 10 μm 层厚（表 4）进行 3D 打印，并按上述方式进行后处理（20 分钟超声处理和洗涤，60 分钟紫外线固化），无需搪瓷涂层。PDMS（如上制备）被铸造并保持非生物功能化，以通过PDMS疏水性增强EB的形成。然后将用SiR-微管蛋白活染料预染的单个IPSC接种在E8 flex培养基（Thermo）中的微孔阵列或平面PDMS上，并以100rpm离心1分钟，以将细胞沉降到微孔中。将细胞培养 4 天，接种后直接成像，并在培养的第 2 天和第 4 天进行成像。在第 4 天成像后，将常规 EB 从微孔中分离并成像以测量其大小。

腔室滑轨

制造。

在Phrozen Sonic mini 4K上用树脂A以50μm层厚（表4）进行3D打印，在Phrozen Sonic mini 4K上进行3D设计，其中12个孔具有直径为5 mm的漏斗和直径为3 mm，直径为1 mm的直孔（表4），并进行了后处理（20分钟超声处理和洗涤，60分钟UV固化），并涂有搪瓷涂层。PDMS（如上制备）铸件由阵列制成，并用 2 种方法粘合到玻璃盖玻片上。

PDMS键合。

氧等离子体。来自3D打印模具和玻璃盖玻片的PDMS铸件的表面经过氧等离子体处理（30 s，50%，7sccm）（Henniker Plasma），密封在一起，并在75°C下烘烤15分钟。

UV胶。来自3D打印模具的PDMS铸件的表面被密封在玻璃盖玻片上，并在PDMS的外部涂上透明的光聚合树脂。通过目视检查，我们验证了胶水仅涂在设备外部，不会物理泄漏到孔中。通过腔室设备上的活细胞成像验证了这一点，紫外线树脂对细胞有剧毒，会导致立即细胞死亡。树脂通过使用 365 nm 紫外线火炬 （Alonefire） 暴露 1 分钟来固化。

生物功能化。然后用UV灭菌15分钟（Analytik Jena紫外光），并用聚-D-赖氨酸0.01%（PDL）（Gibco）涂层生物官能化15分钟，并在每个孔中过夜。

播种。然后将用SiR-微管蛋白活染料预染的对照3星形胶质细胞祖细胞接种（如方法部分-细胞接种中所定义）浓缩（在400μl培养基中1个汇合孔）在扩增培养基中，密度降低在室载玻片装置的交替孔中。将细胞接种在50μl，25μl，12.5μl，6.25μl浓缩细胞原液的馏分中，静置10分钟，然后加入其他培养基。像以前一样培养细胞（方法-细胞培养），并在 24 小时后成像以定性评估不同密度下的活力。

微流控。在Fusion360中准备设计，并使用Phrozen 8k Mini打印机在8k树脂中打印。使用SOL3D协议处理打印后，进行洗涤和固化。PDMS被浇铸在印刷品上并剥离。然后，将直径为 1.5 毫米的孔打入相应的位置。载玻片和微流控装置以 50% 的功率进行氧等离子体处理 30 秒，立即压在一起进行永久粘合。对于最终键合，将组装好的设备加热至100°20分钟。冷却后，将直径为 1.6 mm 的管子插入冲孔中。然后，使用注射器将荧光素溶液送入微流控装置，同时在EVO显微镜上成像。

3D工程肌肉

准备、分化和培养。

如前所述制备3D肌肉结构[50,52]。在制备凝胶前 2 小时将浓度为 10 μm 的岩石抑制剂（细胞引导系统）加入细胞中，并将 106使用人永生化成肌细胞（系 AB1190，由法国巴黎肌学研究所的 Myoline 平台友情提供）细胞的总体积为 120 μl，包括 3.5 mg/ml 人纤维蛋白原 （Baxter， TISSEELDUO 500）、3 U/ml 凝血酶 （Baxter， TISSEELDUO 500）、10% 基质胶 （Corning， 356231） 和灭活成肌细胞培养基（56°C 下 20 至 30 分钟）（PromoCell 骨骼肌细胞生长培养基， C-23060）。将混合物移液到含有柱子的琼脂糖模具中，并置于 37°C、5% CO22小时，使水凝胶聚合。这些模具在使用2%UltraPure琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，16500500）的12孔板中制备。将一个环放置在柱子的臂下方并插入 12 孔板上，以确定柱子可以向下推入琼脂糖的距离。然后将DMEM（Sigma，D5671）加入到构建体中，并将含有肌肉构建体的柱子从琼脂糖模具中取出，并放入新的12孔板中，其中含有33μg/μl抑肽酶（Sigma，A3428），温度为37°C，5%CO2.48小时后，将肌肉结构置于分化培养基（含有0.01mg / ml胰岛素（Sigma，10516）和33μg/ μl抑肽酶的DMEM）中;介质每隔一天更换一次。人类细胞的工作是在NHS卫生研究局研究伦理委员会（参考编号13/LO/1826）和综合研究应用系统（IRAS）项目（ID编号141100）的批准下进行的。

收缩力分析。

工程肌肉的收缩性[77]是通过一对高压灭菌起搏碳电极（EHT技术）安装在含有3D肌肉的孔中，轻轻浸入培养基中来实现的。该激励器设置为以 0.5 Hz 频率提供 5 ms 的 20 mV 双极性方波。在刺激期间，通过安装在每个设备柱子下方的 DinoLite Edge 显微镜 （DinoLite） 记录肌肉收缩和柱子支架运动 5 秒。使用 MuscleMotion 插件在 Imagej 中对镜头进行分析（表 13）。

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表 13. 微刺激硬件。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.t013

免疫细胞化学。

收缩力记录后，将肌肉结构固定在 1% PFA 中过夜，然后从柱子上取下。然后将构建体在 TBS 0.05 M （1×） pH 7.4、10% FBS、1% BSA、0.5% Triton X-100 中在 4°C 下透化并封闭 6 小时。 在 4°C 下在 TBS 0.05 M （1×） pH 7.4、1% BSA、0.5% Triton X-100 中与 Titin 和 MyHC 一抗（表 8）孵育过夜之前。第二天，将构建体在 PBS 中洗涤 6 次，然后在 4°C 下与二抗和 DAPI 在 TBS 0.05 M （1×） pH 7.4、1% BSA、0.5% Triton X-100 中孵育过夜。最后，在成像之前，将构建体安装在带有 Fluoromount G （Thermo） 的品牌腔载玻片上。

差异化和方向性分析。

使用倒置蔡司共聚焦和 40 ×物镜拍摄 3D 肌肉结构的图像。Z 堆栈在结构中获取并使用 ImageJ 中的 SUM 函数进行投影。使用ImageJ中的方向性插件从titin信号中分离出单个图像并测量方向性。

流变分析

PDMS 1：10 和 1：20 流变特性在 75°C 固化 60 分钟后，使用 Discovery HR20 流变仪（TA 仪器）进行测量。样品在室温 （25°C） 下使用 8 mm 板几何形状进行分析，频率扫描为 1，角频率为 25.12–0.1 rad/s。 测量整个期间的存储 （G'） 和损耗 （G“） 模量。杨氏模量（E）的计算公式为[78]。

其中 G′ 是储能模量，v 是泊松比 （0.5）。

水凝胶培养系统

水凝胶组合物。

制备步骤从测量神经元培养基（4ml）并与基质胶（Corning）（1ml）均匀混合开始。将来自Sigma Aldrich的透明质酸（5mg / ml）混合在上述溶剂中，并在环境温度下搅拌过夜（12小时）。随后加入来自Sigma Aldrich的纤维蛋白原（45mg / ml），并在室温下搅拌5小时。作为最后一步，将来自Sigma Aldrich的海藻酸盐（5%（w / v））加入到上述混合物中，并使其搅拌过夜以获得均匀的水凝胶基质。在PBS中使用EDTA从6孔板中解离MNP，并通过轻轻地上下移液与水凝胶基质（4至500万个细胞/ml）轻轻混合，使细胞均匀分布在整个水凝胶中，这导致了生物墨水的形成。这种生物墨水由氯化钙 （CaCl2）（1.5%（w / v））和凝血酶（25U / ml在0.1%BSA溶液中）。允许生物墨水在室温下交联15分钟。交联后，用PBS溶液洗涤生物墨水3次。随后，用补充有化合物 E 的神经元培养基轻轻地将孔淹没在细胞板壁中，并保持在 37°C 和 5% CO 的培养箱中2.

支持信息

将 3D 还原聚合、打印和光刻的成本与所有必需的设备和材料进行比较，但不包括人员培训成本。

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图 S1：3D 还原聚合打印和光刻成本与所有所需成本的比较设备和材料，但不包括人员培训费用。

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S1 图。 将 3D 还原聚合、打印和光刻的成本与所有必需的设备和材料进行比较，但不包括人员培训成本。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s001

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S2 图。 SLA树脂本身在预处理和不预处理的情况下都是有毒的。

（A） 将 6 个树脂的芯片加入到用 SiR-微管蛋白活染料预染的运动神经元祖细胞培养物中，在成像前孵育 48 小时。与2个对照孔相比，在用树脂培养48小时后SiR活染料染色的运动神经元的代表性图像。（B） 6 个树脂的芯片用额外的处理步骤处理以提高生物相容性，在 75°C 下烘烤 4 小时，在 PBS 中洗涤 72 小时，在 50°C 下洗涤 72 小时，紫外线灭菌 15 分钟，然后加入用 SiR-微管蛋白细胞骨架活染料预染的运动神经元祖细胞培养物中，在成像前孵育 48 小时。与 2 个对照孔相比，在用处理过的树脂培养 48 小时后 SiR 活染料染色的运动神经元的代表性图像。（C） 与 2 个对照孔相比，在用处理过的树脂芯片培养的前 24 小时内 SiR 活染料染色的运动神经元的代表性延时视频。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s002

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S3 图。 与生物相容性填料共培养对 iPSC 衍生的 MN 的影响。

iPSC 衍生的 MN 以相同的密度接种。然后，将一个3D打印的正透明树脂圆柱体加入孔中，并孵育4天，以确定生物相容性树脂的毒性作用。树脂要么按照推荐的制造商方案进行预处理，要么按照我们的管道进行预处理。对细胞进行 β-3-微管蛋白和 DAPI 染色。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s003

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S4 图。 在3D打印模具上定量PDMS固化。

（A） 用 6 种市售树脂制造的 3D 打印模具的 PDMS 铸件光谱相似性的树状图，在 5 种条件下洗涤（S + W = 超声处理 10 分钟，洗涤 10 分钟，S10 = 超声处理 10 分钟，S20 = 超声处理 20 分钟，W10 = 洗涤 10 分钟，W20 = 洗涤 20 分钟），未经处理或涂有喷枪 （AB） 并在 3 种不同温度下固化 （60， 75 和 90），与未固化和固化的 PDMS 样品相比。复制并打印每个条件的编号 （RxPx）。（B） 通过观察从“固化”、“部分固化”、“未固化”、“损坏”等范围观察，从 3D 打印模具中 PDMS 铸件固化的异质性。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s004

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S5 图。 SOL3D PDMS设备渗滤液的MALDI-TOF分析。

将SOL3D模具中制造的PDMS设备在37°C的水中孵育72小时后采集的样品光谱，以模拟生物实验的条件，与在同一培养箱内在37°C下保持72小时的水组成的对照组和仅使用MALDI基质进行分析的技术对照进行比较。比较表明，使用SOL3D PDMS设备孵育的水中没有可检测到的渗滤液，其特征与在仅水对照中观察到的渗滤液基本相当。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s005

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S6 图。 在3D打印模具中铸造的PDMS与细胞（延时摄影和长轴突）的生物相容性。

（A） 代表性的 β-III 微管蛋白染色的分化运动神经元在平坦的基质上培养。（B） 分化运动神经元的明场图像，其中 PDMS 是从培养基中的 3D 打印模具铸造的。（C） β-III 微管蛋白染色的运动神经元长轴突接种在 PDMS 微加工基质上。（D） 在 3D 打印模具中铸造的 PDMS 底物上 SiR-微管蛋白活染料染色的运动神经元分化的 60 小时延时快照。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s006

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S7 图。 分析漆层厚度和表面粗糙度。

（A） 树脂的代表性 SEM 图像 A 用喷枪搪瓷颜料打印。（B）分析3D大桶打印模具上的油漆层厚度。（C-F）用珐琅涂漆的 3D 打印 （C） 的光学轮廓显示表面粗糙度在 3 μm 左右变化 （D） 扁平硅晶圆显示纳米尺度的可变性 （E， F） 非上漆 3D 打印显示基于屏幕像素尺寸的微小变化，可变性为 1 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s007

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S8 图。 使用光刻技术制造的PDMS模板设备。

（A） 带有光刻的模板状装置的尺寸。（B）使用模板状装置的播种策略示意图。（C）带有用于细胞接种的口袋的模板状装置的代表性图像（箭头）。（D） 使用食用色素作为“单细胞悬浮液”进行细胞接种的演示。液体被手动移液到设备的口袋上（箭头）。可以使用有限的体积。（E）使用光刻制造的模板装置接种的单个运动神经元的代表性明场图像，以及显示接种过程以及细胞位置的示意图。（F）使用SOL3D制造的电镀装置接种的单个运动神经元的代表性明场图像，以及显示接种过程以及细胞位置的示意图。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s008

（DOCX）

S9 图。 3D打印的表面很粗糙。

（A） 从单个喷枪 3D 打印模具和单个微加工模具脱模的 PDMS 铸件的代表性光学轮廓。（B） 用于量化 PDMS 铸件表面粗糙度的 5 ROI 选择的表示。（C） 在喷枪 3D 打印模具和微加工模具之间，同一设备（25 个同时铸造）的 PDMS 铸件表面粗糙度随时间推移的量化。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s009

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S10 图。 用于电镀装置的流体密封。

（A） 将器件放置在PDMS微槽基板上时确保流体密封的夹紧方法的示意图（上图）和代表性图像（下图）。（B） 使用染色液在具有不同孔尺寸和形状的PDMS微槽基板上，夹紧策略（上）与开式固化（下）的液封完整性比较。成功密封带有玻璃盖的铸造设备（绿色变焦）。染料使用开放式固化（红色缩放）扩散到整个设备和凹槽中。箭头突出显示液体扩散。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s010

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S11 图。 3D打印尺寸是均匀的。

（A） 将 3D 打印结构的 X 和 Y 尺寸与单个设备中的 CAD 规格进行比较的图表，孔尺寸范围为 600 μm × 1,000 μm 至 50 μm × 1,000 μm。（B） 将 3D 打印结构上 300 μm × 1,000 μm 特征的 X 和 Y 尺寸与在两台 3D 打印机上打印的 6 种市售树脂的 CAD 规格（制造商默认设置下层厚度为 50 μm）进行比较的图表。（C） 将 3D 打印结构的实际层厚度与 CAD 规格进行比较的图表，该图将 6 种市售树脂在 2 台 SLA 3D 打印机上打印，在制造商默认设置下以 50 μm 层厚进行打印。所有图形的数据点都可以在 S11 数据中的文件 S11A–S11C 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s011

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S12 图。 非等离子体设备不能用于微孔中的种子。

（A） 在 600 μm × 1,000 μm 至 50 μm × 1,000 μm 的微孔中接种的运动神经元祖细胞的代表性 SiR-微管蛋白图像。颜色的差异表示焦平面的深度，其中细胞没有到达下面的微图案基质。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s012

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S13 图。 对开放孔中细胞接种的时空控制。

（A） 星形胶质细胞和皮质祖细胞的代表性 SiR 微管蛋白活细胞染料荧光图像。图像是在设备移除后 2 天拍摄的。（B） 培养 19 天后完整电路的通道分裂。GFP 转染的运动神经元 = 绿色，神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 可识别星形胶质细胞，β-III-微管蛋白可识别皮质神经元和 GFP+ 运动神经元中的微管蛋白。蓝色设备井形状叠加用于说明目的。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s013

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S14 图 电镀装置可在同一孔、装置或多个装置中手动分离接种不同细胞类型。

（A） 来自 3D 打印设备的多个 PDMS 铸件可以接种在同一孔中，并在不同的时间点接种不同的细胞类型。用于在同一孔中 3 个设备的不同时间点接种 GFP 和非 GFP+ 运动神经元的多设备协议的示意图概述。（B） 细胞 GFP+ 运动神经元的代表性荧光图像，这些细胞接种在 3 个装置的内环和外环中，并在装置剥离后（右）和内环中接种第二个非 GFP+ 运动神经元后成像。成像细胞荧光的代表性线谱，显示单个群体与其指定环的分离。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s014

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S15 图。 电镀装置可在 2D 和 3D 中对聚集体培养物进行几何操作。

（A） 结合现有微槽和平板基板操纵骨料几何形状的协议示意图概述。（B） 培养第 2 天（上图）和 β-III 微管蛋白染色后 SiR-微管蛋白活细胞染色的运动神经元聚集体的代表性图像（下图）。（C） CAD（蓝线）和 β-III-微管蛋白通道培养第 2 天之间按形状变化的聚集体长宽比折叠变化的箱线图（顶部）。（D） CAD（蓝线）和 β-III 微管蛋白通道培养第 2 天之间按形状变化的聚集体区域折叠变化的箱线图。（E） 接种后和 24 小时后在不同几何形状的模板装置中 SiR-微管蛋白染色的皮质聚集体的代表性图像，圆形（左）、三角形（中）和矩形（右）。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s015

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S16 图。 SOLID制造的三角形凹槽的光学轮廓的代表性图像。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s016

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S17 图。 用于微流控装置的3D打印模具。

（A） 设计一个3室装置。（B） 带有指示测量位置的光学轮廓仪图像（红色圆圈，蓝色三角形）。（C） 通道两岸的尺寸剖面图（B中的蓝线），并测量深度和宽度。（D-F）荧光溶液在设备中扩散的延时图像。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s017

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S18 图。 使用来自 3D 打印模具的 PDMS 结构进行 3D 肌肉培养的优化和方案。

（A） 图像显示了 3 种不同的模具尺寸，经过测试，以优化水凝胶混合物的侧视图和底视图的体积。（双-三）从不同角度显示带（黄色箭头）和不带凹槽的模具的图像。（Biv）图像显示了去除霉菌后琼脂糖的俯视图。（Ci-ii）图像从正面和俯视图显示了手臂下方有和没有环的柱子。环设计为与 12 孔板的 1 孔大小相匹配。（Ciii） 从板下方的侧视图和底视图显示柱插入琼脂糖模具的图像，环允许柱插入特定高度。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s018

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S1 文本。 补充指南。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s019

（DOCX）

S1 数据。 图 3G、3H、6E 和 S11A–S11C 的数据点。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002503.s020

（邮编）

确认

人类永生化成肌细胞由法国巴黎Myologie研究所的Myoline平台慷慨地提供给Tedesco实验室。

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