厦门免费医学论文发表-甲基化依赖性开关的广泛流行，以激活细菌中的基本 DNA 损伤反应

抽象

DNA甲基化在各种细胞过程中起着核心作用，从复制过程中的纠错到细菌防御机制的调节。然而，某些异常的甲基化修饰可能会产生致命的后果。细菌检测和应对这种损害的机制仍不完全清楚。在这里，我们发现了一种高度保守但以前未表征的转录因子（Cada2），它在Caulobacter中协调甲基化依赖性适应性反应。这种反应独立于 SOS 反应起作用，控制对直接修复至关重要的基因的表达，并且对于甲基化诱导的损伤存活至关重要。我们对 Cada2 的分子研究揭示了一种半胱氨酸甲基化依赖性翻译后修饰 （PTM） 和作用方式，与大肠杆菌不同，这种性状在所有携带 Cada2 样同源物的细菌中都是保守的。我们的研究结果延伸到整个细菌王国，支持适应性反应转录因子及其相应的序列特异性DNA基序的分歧和协同进化的概念。尽管存在这种多样性，但适应性反应调节因子的普遍存在强调了由甲基化 PTM 介导的转录开关在驱动特异性和必需的细菌 DNA 损伤反应方面的重要性。

数字

图4图5图6图1图2图3图4图5图6图1图2图3

引文： Kamat A、Tran NT、Sharda M、Sontakke N、Le TBK、Badrinarayanan A （2024） 甲基化依赖性开关的广泛流行，以激活细菌中必需的 DNA 损伤反应。PLoS 生物学 22（3）： 编号：E3002540。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540

学术编辑： Lotte S?gaard-Andersen，马克斯·普朗克陆地微生物学研究所：德国马克斯-普朗克陆地研究所

收到： 2023年10月20日;接受： 2024年2月6日;发表： 3月 11， 2024

版权所有： ? 2024 Kamat et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 除RNA-seq、ChIP-seq和质谱数据外，所有相关数据均在论文及其支持信息文件中。ChIP-seq 和 RNA-seq 数据存放在 GEO 存储库中，登录号分别为 GSE246227 和 GSE246782。与质谱实验相关的原始数据可通过 ProteomeXchange 获得，标识符为 PXD049136。

资金： 这项工作得到了 AK（TIFR 研究生奖学金）和 AB 通过印度联盟中级赠款（赠款编号 IA/I/21/1/505630）和校内资金（赠款编号 03/3/2019/R&D-II/DAE/4749）的支持。这项工作还得到了李斯特研究所奖学金、惠康信托研究员资助221776/Z/2/Z（给TBKL）以及生物技术和生物科学研究委员会资助（BBS/E/J/000PR9791）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

缩写： 复员方案， DNA损伤反应;嗯 隐马尔可夫模型;彩信 甲烷磺酸甲酯;MSA， 多序列比对;PTM， 翻译后修饰;野良 蛋白胨酵母 ExtraC

介绍

有关生物过程的信息主要编码在生物体的基因组中。通过调节DNA的表观遗传状态，功能模式得到进一步增强[1–4]。例如，DNA的甲基化发生在生命所有领域的生物体中。在细菌中，N5-meC、N4-meC和N6-meA核苷酸位置的生理DNA甲基化发挥着多种功能，从防御作用（包括对侵入性遗传元件的免疫）到细胞周期和转录控制中的调节作用[2,5]。与这些生理修饰相反，某些类型的甲基化可能是异常的。O6-meG和O4-meT位点上的DNA甲基化是诱变的有效来源，而N3-meA、N1-meA和N3-meC可阻断DNA复制和转录[6–9]。

细菌通过引发 2 种 DNA 损伤反应 （DDR） 来应对这种异常甲基化的威胁。第一种反应是特征明确且普遍保守的SOS反应，由RecA和LexA2个调节单元组成[10]。转录阻遏蛋白 LexA 占据 SOS 基因启动子区域中存在的 lexA 框并抑制其表达。DNA损伤后，激活的RecA核蛋白丝触发LexA的自切割，导致SOS反应的去抑制[11\u201213]。这种反应有三个明显的特征：（a）它是在所有形式的DNA损伤下诱导的，并且不是单独甲基化损伤的特异性[14];（b）即使在没有损伤的情况下，反应也有泄漏的表达[15,16];（c）由于跨病变合成聚合酶的表达，反应可导致诱变[17]。因此，SOS响应诱导是其必要性和成本之间的权衡。

SOS反应是细菌对DNA损伤的主要反应。然而，最近的研究表明，SOS反应通常由SOS非依赖性DNA损伤反应通路补充[18]。PafBC反应是在结核分枝杆菌中发现的，对于诱导丝裂霉素C暴露下的大多数基因至关重要[19,20]。这种反应的诱导依赖于PafBC异二聚体，PafBC异二聚体被认为表现出与SOS反应相似的ssDNA依赖性激活[21]。Caulobacter的DriD反应也表现出类似的激活模式[22]。didA（属于DriD调节子）在DNA损伤下抑制细胞分裂的特征是很好的[23]。然而，最近的研究也表明，DriD可能在DDR通路激活之外发挥作用[24]。DriD和PafBC都属于WYL依赖性转录因子家族，在细菌中广泛保守[25]。这些通路似乎主要由DNA双链断裂诱导，但它们在甲基化DNA损伤修复中的作用仍有待发现[23,26]。

在大肠杆菌中，也有报道称，SOS反应后会出现暂时延迟的DDR，即甲基化损伤的适应性反应（或Ada反应）[27–29]。与SOS反应相比，这种反应表现出关键的区别特征：（a）它被激活，独立于SOS反应，并且仅对甲基化损伤具有特异性[30];（b） 反应是适应性的;即，暴露于亚致死剂量的甲基化损伤会编码记忆，使细胞能够适应并存活先前致命的DNA甲基化损伤水平[27,30];（c）反应表现出双稳定性[31]，即使在连续暴露于甲基化损伤的情况下，细胞亚群也不会诱导反应;（d）通过这种反应进行的修复是非致突变的[27,32]。

该DDR的主要调节因子是甲基转移酶EcAda，由其N端的AdaA结构域（与位于EcAda调节启动子上游的“A”和“B”DNA盒结合）和C端甲基转移酶结构域组成[28]。EcAda的表达受到严格调控，在没有损伤的情况下，细胞中仅存在0-2个Ada分子[31]。通过N-Ada中保守的半胱氨酸甲基化的翻译后修饰（PTM）对于激活EcAda作为转录因子至关重要[33\u201235]。一旦被激活，EcAda就会驱动其自身的表达以及参与甲基化病变直接修复的基因的表达。

甲基化损伤的风险有多普遍，这可能导致甲基化特异性 DDR 的演变？遇到甲基化DNA损伤的情况并不少见，细菌经常面临甲基化应激。内在因素，如隐匿的代谢副产物（如脂质过氧化）是DNA甲基化损伤的突出风险[9,28]。环境因素，包括细菌产生的卤代烃和甲基化剂，作为微生物间作战的工具，也会导致这种损害[36,37]。此外，受感染的哺乳动物细胞使入侵细菌受到甲基化应激[38]。最近，一些研究报道了生理DNA甲基转移酶（原本无害）错误地对基因组DNA造成甲基化损伤的情况[39]。因此，鉴于甲基化应激的普遍存在，许多细菌可能已经进化出独特的系统，例如Ada反应来保护它们的基因组。

有趣的是，尽管同时发现了对甲基化损伤的适应性反应和SOS反应[27,40]，但我们对这一途径的了解目前仅限于E。大肠杆菌范式。因此，基于甲基化的 PTM 在损伤特异性细菌 DDR 调节中的意义和保守性仍然未知。事实上，数量有限的计算研究表明，EcAda在整个细菌界中仅存在零星的保守性[41\u201243]，据报道，许多细菌（如新月形杆菌）完全缺乏诱导型适应性反应[44,45]。

在这项工作中，我们在新月形杆菌中发现了甲基化特异性 DDR，它展示了适应性反应的关键特征。该途径由保守但未表征的转录因子ccna_03845（以下简称“Cada2”）调节。详细的分子表征揭示了该蛋白质中一个新的序列特异性 DNA 结合域，以及以不同于其 E 的方式激活 Cada2 作为转录因子所需的基于甲基化的 PTM。大肠杆菌对应物。尽管 EcAda 和 Cada2 的机理特征截然不同，但我们观察到下游响应的定义特征具有显着的相似性。适应性反应调节蛋白的系统发育分布进一步揭示了它们在细菌界的广泛流行，甲基化依赖性激活所需的关键残基（以 EcAda 样或 Cada2 样形式）的普遍保守。总的来说，我们的工作强调了甲基化 PTM 介导的转录开关在激活细菌对甲基化 DNA 损伤的基本反应中的重要性。

结果

Caulobacter 中的甲基化特异性 DNA 损伤反应

我们采用了一种全面的转录组学方法来确定 Caulobacter 是否诱导甲基化损伤特异性的 SOS 非依赖性转录反应。为此，我们用主要诱导 1 种特定形式的 DNA 损伤的药物（甲基甲烷磺酸甲酯 （MMS），甲基化 DNA 损伤的病原体 [46]、诱导链内交联和单加合物的丝裂霉素-C （MMC） [47] 和诱导双链断裂的诺氟沙星 [48]）处理 Caulobacter 细胞。我们在损伤暴露后 0、20 和 40 分钟收集样本进行 RNA 测序（图 1A 和 S1A）。我们的分析揭示了在所有条件下（“普遍”）诱导的几个基因和一组在MMS治疗下特异性诱导的基因，但在其他破坏性条件下（甲基化特异性）都没有（S1A图）。

缩略图 下载：

PPT的PowerPoint幻灯片

巴布亚新几内亚放大图像

TIFF的原始图像

图 1. Caulobacter 中的甲基化特异性 DNA 损伤反应。

（A） [左] 提供了RNA测序实验的总结示意图。将野生型和 ΔrecA（SOS 缺陷型）细胞暴露于 1.5 mM MMS 中 40 分钟。 [中] 代表差异表达基因的火山图，分别与暴露于野生型（顶部）和 ΔrecA（底部）细胞的无损伤细胞进行比较。野生型细胞中上调的基因（log2FC > 2 和 – log10(p值）>2）以蓝色突出显示，而红色突出显示的基因表示在野生型中上调但在ΔrecA细胞中下调的基因。[右]热图表示对数2MMS 暴露下野生型和 ΔrecA 细胞中诱导的单个基因的 FC 值。（B） 野生型 Pccna_00746-yfp 报告基因（示意图插图）分别暴露于 1.5 mM MMS 或 0.5 μg/ml MMC 2 小时。代表性细胞显示在左侧（比例尺：5μm，细胞边界用白色虚线轮廓标记，此处和所有其他图像）。小提琴图显示荧光强度分布归一化为单个细胞的细胞面积（n = 300，来自 3 个生物学重复）。基础数据在 S1 数据中可用。（C） [顶部] 通过延时显微镜比较 Caulobacter SOS 的诱导动力学和甲基化特异性反应的实验方案示意图。[底部]荧光强度归一化为细胞面积的 Pccna_00746-yfp and PsidA-yfp cells over 3 h of exposure to 1.5 mM MMS. The underlying data are available in S1 Data.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.g001

接下来，我们询问这些基因的表达是否与SOS反应无关。我们对recA缺失的细胞进行MMS处理，并在此背景下进行RNA测序。将野生型与recA缺失细胞进行比较，发现甲基化损伤特异性基因以不依赖recA的方式（SOS非依赖性）被诱导（图1A）。相比之下，在野生型背景中所有DNA损伤条件下诱导的基因在recA缺失细胞（SOS依赖性）中仍未诱导（图1A和S1A）。

在转录组分析中，我们发现ccna_00745甲基化损伤诱导率最高（图1A）。该基因与第二个基因ccna_00746共合，该基因也以甲基化 DNA 损伤特异性方式诱导（S1A 图）。ccna_00745生物信息学预测为 2-氧代戊二酸 Fe2+-依赖性双加氧酶，类似于E。大肠杆菌alkB，而ccna_00746则被预测具有Ada样甲基转移酶结构域（PF01035）[9]。

为了进一步证实RNA-seq的观察结果，我们构建了基于荧光的这些基因启动子活性读数（Pccna_00746-YFP）。在没有损伤的情况下，未检测到yfp的显著表达（图1B）。我们仅在用MMS处理的细胞中观察到该构建体的YFP表达，而没有其他DNA损伤剂MMC，诺氟沙星和羟基脲（胡）（图1B和S1B）。此外，我们还使用了第二种甲基化损伤剂链脲佐菌素（STZ），这是一种由无色链霉菌（Streptomyces achromogenes var. streptozoticus）产生的天然抗生素[36,37]。在这种情况下，我们也观察到来自甲基化损伤特异性启动子的YFP表达（S1B图）。这些观察结果与sidA启动子的荧光报告基因不同，sidA是一种已知的SOS依赖性基因[49]，据报道，sidA启动子在其他类型的DNA损伤下以RecA依赖性方式诱导[49,50]。此外，Pccna_00746-yfp 报告基因在缺乏 driD 转录因子的细胞中也表现出甲基化损伤依赖性诱导（S1C 图）。因此，Caulobacter 引发对甲基化损伤的转录反应，该反应独立于 SOS 以及 DriD 依赖性 DNA 损伤反应。

接下来，我们研究了甲基化特异性反应与SOS反应相关的时间动力学。为此，我们对携带 Pccna_00746-yfp 或 P西达-yfp 报告者在彩信曝光后。我们观察到，与 SOS 报告基因相比，甲基化损伤特异性启动子表达的 yfp 表达在时间上延迟（图 1C）。最后，我们测试了这种反应的感应动力学是否具有自适应性。为此，我们首先将启动子融合菌株暴露于低剂量（0.5 mM）的MMS中。这导致 P 的表达仅略有增加ccna_00746-yfp（S1C 图）。与“适应性”反应[51]一致，这些预处理的细胞能够诱导Pccna_00746与未处理的细胞相比，-yfp在暴露于更高剂量（1.5mM）的MMS时明显更快（S1C图）。总之，Caulobacter 甲基化损伤特异性反应展示了 E 中报道的对甲基化损伤的适应性反应的关键特征。大肠杆菌。基于这些观察结果，我们将这种反应称为对甲基化损伤的 Caulobacter 适应性反应。

Caulobacter adaptive response to methylation damage is regulated by Cada2

鉴于 Caulobacter 和 E 的适应性反应之间的惊人相似性。大肠杆菌，我们想知道Caulobacter反应是否受到EcAda样蛋白的调节[52]。虽然我们无法在 Caulobacter 中鉴定出任何 EcAda 样蛋白，但我们观察到 3 个适应性反应候选者（ccna_00746、ccna_03845 和 ccna_00725）在其 C 末端区域具有 Ada 样甲基转移酶结构域 （PF01035）（图 2A）。有趣的是，与 EcAda 蛋白的 N-Ada 相对应的结构域（与同源 Ada 启动子形成序列特异性相互作用所必需的）被拆分为 ccna_00746（具有 A 盒结合结构域）和 ccna_03845（具有 B 盒结合结构域）（图 2A）。因此，我们将这些基因注释为“cada”（Caulobacter adaptive response）基因cada1、cada2和cada3。

缩略图 下载：

PPT的PowerPoint幻灯片

巴布亚新几内亚放大图像

TIFF的原始图像

图 2. Caulobacter 对甲基化损伤的适应性反应受 Cada2 调节。

（A） EcAda、Cada1、Cada2 和 Cada3 蛋白的高置信度 Alphafold 结构模型及其结构域组织的比较分析。（B） [左] 显示 P 的代表性单元格ccna_00746-yfp 报告基因在野生型（来自图 1B）和 1.5 mM MMS 损伤下的 cada 基因的单个缺失菌株的诱导。[右]小提琴图显示荧光强度分布归一化为单个细胞的细胞面积（n = 300，来自 3 个生物学重复）。基础数据在 S1 数据中可用。（C） 日志热图21.5 mM MMS 处理后野生型、Δcada1 和 Δcada2 细胞中上调基因的 RNA-seq 实验的 FC 值。（D） 含和不含甲基化剂 （STZ） 的 cada 基因个体缺失的存活测定 （5 μg/ml）。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.g002

接下来，我们询问 Cada1、Cada2 或 Cada3 是否调节适应性反应。我们分别删除了所有 3 个 cada 基因，并评估了 P 的活性ccna_00746-YFP记者。我们发现只有缺乏cada2的细胞不能诱导Pccna_00746甲基化损伤下的-yfp（图2B）。作为支持，RNA测序分析显示，其他MMS特异性、RecA非依赖性基因在缺乏cada2的细胞中也没有被诱导，但在缺乏cada1的细胞中不受影响（图2C）。因此，含有 Cada1 的 A-box 在适应性反应下不驱动基因表达，而仅具有 B-box 结合域的 Cada2 是反应激活所必需的。接下来，我们测试了暴露于 MMS 和 STZ 后的细胞存活率。我们发现，在缺乏cada2的细胞中，特别是在STZ损伤下，存活率显着下降（图2D和S1E），这表明Cada2依赖性对甲基化损伤的适应性反应是Caulobacter中必不可少的DDR途径。两种甲基化剂之间的存活率差异可归因于STZ和MMS诱导的甲基化修饰的不同模式[53]。因此，必要性的程度可能是微妙的，并且取决于给定甲基化剂诱导的各种碱基修饰的比例。

Cada2 以序列特异性方式与适应性反应启动子结合

为了确定 Cada2 是否直接负责甲基化损伤下适应性反应基因的诱导，我们进行了 ChIP 测序实验（图 3A）。为此，使用了从其内源性启动子表达cada2-3x-标志的细胞。标记的菌株类似于野生型细胞在甲基化DNA损伤下的存活率，并通过蛋白质印迹检测Cada2的损伤依赖性表达（S2A和S2B图）。使用该菌株，我们在存在或不存在甲基化损伤的情况下进行了 ChIP-seq 实验（图 3A）。我们使用未标记的野生型细胞作为对照，估计了受损下整个 Caulobacter 基因组的 Cada2-3xFlag 富集。这使我们能够识别真正的 Cada2 结合位点。

缩略图 下载：

PPT的PowerPoint幻灯片

巴布亚新几内亚放大图像

TIFF的原始图像

图 3. Cada2 以序列特异性方式与适应性反应启动子结合。

（A） [左上] ChIP 测序方案示意图。[左下]展示 Cada2 调节子的表格。列出了基因名称和预测功能。[右上]在存在/不存在 1.5 mM MMS 损伤的情况下，Cada2-3X-Flag ChIP-seq 的归一化读长（以 rpm 为单位）代表 Cada2 调控子基因 CDS 周围 ±2.5 kb。[右下]RpoC-3X-Flag ChIP-seq 的数据以类似的方式表示。（B） Cada2 和 EcAda 的结合性共识基序，源自其调节子各自成分的启动子。（C） 显示 P 变体诱导的代表性细胞ccna_00746-yfp 报告基因（加扰/EcAda 样）与野生型相比，在 1.5 mM MMS 损伤下。[右下]半小提琴图显示，在存在（黑暗）和不存在损伤（光）的情况下，报告基因变体的单细胞的荧光强度分布归一化为细胞面积（n = 300，来自 3 个生物学重复）。野生型数据再次从图1B中表示。基础数据在 S1 数据中可用。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.g003

在损伤下，我们观察到Cada2在其自身启动子以及适应性反应的其他启动子上的富集（图3A，S2C和S2D）。这种自身表达的自动调节似乎是EcAda[54]和Cada2之间的保守特征。为了进一步评估这些基因的甲基化损伤依赖性转录，我们使用标记标记的 RNA 聚合酶亚基 C （RpoC-3xflag） 构建体进行了 ChIP-seq。在没有甲基化损伤的情况下，我们没有观察到 RpoC 定位到 cada2 相关启动子（图 3A、S2C 和 S2D）。暴露于损伤后，可以在cada2启动子以及其他适应性响应启动子处检测到RpoC信号（图3A，S2C和S2D）。ChIP-seq 结果与使用 RNA-seq 实验鉴定的 Cada2 依赖性上调基因显著重叠 （约 83%）。将 2 个数据集叠加使我们能够描述包含 6 个基因的 Cada2 调控子（图 3A），其中大多数似乎具有直接的修复相关活性。

我们对 Cada2 结合区域进行了 MEME 分析，以鉴定任何序列特异性 DNA 结合基序。这揭示了 2 个序列在 Caulobacter 适应性反应的所有启动子中一致（图 3B）。其中一个序列“GCAA”与EcAda的B-box结合域结合的B-box序列基序相同（图3B）。因此，在Caulobacter的情况下，我们也将其注释为B-box基序。我们没有检测到A-box序列基序（“AAT”，由EcAda A-box结合域结合）。相反，我们确定了第二个富含GC的复发基序（“CGG”）。我们将其注释为“X-box”序列主题。这 2 个序列基序由一个 3 碱基对间隔区隔开，该间隔区没有表现出重复保守的序列，但似乎始终富含 AT。我们一起注释了 B-box 和 X-box 基序，由富含 AT 的间隔物隔开，作为 Cada2 结合序列基序（图 3B）。

为了评估该序列是否是 Cada2 介导的调控所必需的，我们在 P 中打乱了完整的序列ccna_00746-YFP 报告器构造。我们发现，在甲基化损伤下，这种报告基因不再被诱导（图3C）。接下来，我们询问了由“A-box”而不是“X-box”DNA基序组成的EcAda样DNA结合基序是否可以驱动Cada2的启动子活性。在这里，我们也观察到携带 A 和 B 盒 DNA 基序的报告基因构建体对甲基化损伤没有反应（图 3C）。这表明新发现的 B+X-box 基序对于诱导 Caulobacter 适应性反应至关重要。

Cada2 样蛋白广泛存在，并编码一种新的 DNA 结合结构域

在 Cada2 的情况下，没有 A-box DNA 基序和 A-box 蛋白结构域，这导致我们假设 X-box DNA 基序可能在 Cada2 蛋白中具有同源 DNA 结合区。因此，我们对整个细菌界的所有 Cada2 样甲基转移酶进行了全面的计算搜索。为此，我们从Cada2样蛋白的多序列比对中构建了一个隐马尔可夫模型（HMM）[55]图谱。作为比较，我们遵循相同的过程来鉴定 EcAda 样 [28,35] 和 AdaA 样 [42] 蛋白。这些蛋白质在不同细菌物种的精选、非冗余数据库中的系统发育分布表明，它们在所有主要细菌门中都丰富且广泛分布（图 4A、S3D 和 S3E）。此外，Cada2样蛋白很少与EcAda样蛋白在同一基因组中共生（约7%，S3F图）。

缩略图 下载：

PPT的PowerPoint幻灯片

巴布亚新几内亚放大图像

TIFF的原始图像

图 4. Cada2 样蛋白广泛存在，并编码一种新的 DNA 结合结构域。

（A） EcAda 样蛋白（黑色）、Cada2 样蛋白（灰色）和 AdaA 样蛋白（棕色）在 4 个细菌门基因组中的属水平系统发育分布：变形菌门（红色）、厚壁菌门（黄色）、放线菌门（蓝色）和细菌门（绿色）。存在/不存在显示在基于 16S rRNA 的细菌基因组系统发育树上。（B） [顶部] 源自 1,000 个 EcAda 样蛋白的调节结构域的 MEME 基序。[底部]源自 1,000 个 Cada2 样蛋白的 MEME 基序揭示了调节域中的保守残基。（C） [左] 显示 P 的代表性图像ccna_00746-YFP 报告基因在野生型和 CADA2 突变体 （CADA2R68A型和 CADA2R114A型） 背景下 1.5 mM MMS 损伤。[右]半小提琴图显示，在存在（黑暗）和不存在损伤（光）的情况下，单个细胞的荧光强度分布归一化为细胞面积（n = 300，来自 3 个生物学重复）。野生型数据再次从图1B中表示。基础数据在 S1 数据中可用。（D） 比较野生型 Cada2、Cada2 的 ChIP-qPCRR68A型和 Cada2R114A型暴露于 1.5 mM MMS 后 CADA1 和 CADA3 启动子富集。在所有情况下，标记的蛋白质版本在高拷贝复制载体（在 Δcada2 背景中）上由木糖诱导启动子表达。条形图表示与野生型 cada2 相比的平均倍数富集（n = 3 个独立重复，误差条表示标准误差）。基础数据在 S1 数据中可用。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.g004

我们放大了 EcAda 和 Cada2 样蛋白的 DNA 结合（调节）区域，以确定保守和独特的特征。正如预期的那样，两类蛋白质都编码B-box结合域（由保守的“SPHFQR”氨基酸残基标记（图4B））。该区域可能与 EcAda 和 Cada2 调节子中都可以找到的 B-box DNA 基序有关。这 2 种蛋白质相对于 A 盒存在偏差，其中 A-box（以 4 个半胱氨酸残基为标志）在所有 EcAda 样蛋白中都是保守的（图 4B），但在所有 Cada2 样蛋白中都不存在。相反，在假定的 B 盒结合结构域近端，Cada2 样蛋白具有独特且高度保守的“RLHD”序列结构域（图 4B）。我们在这里强调，RLHD结构域的守恒甚至比B-box的守恒还要多。Cada2 蛋白的 AlphaFold [56,57] 模型预测该 RLHD 结构域属于类似于 B 盒结合结构域的螺旋-转-螺旋结构域（S3A 图）。

为了支持 Cada2 的这些假定 DNA 结合区域的重要性，两个结构域中保守的精氨酸（通常与 DNA 结合有关）突变为丙氨酸残基 （B-box cada2R68A型和 RLHD 基序 cada2R114A型） 废止 Pccna_00746-yfp 报告基因在甲基化损伤下的活性（图 4C）。当评估甲基化损伤下的存活率时，2 个突变体的表达没有受损，并且表型复制了 cada2 缺失（S3B 和 S3C 图）。两个突变体的启动子结合也受到损害，从属于 Cada2 调控子的基因启动子区域的 Cada2 结合实验中可以看出（图 4D）。我们得出结论，Cada2 蛋白上的 B-box 和新颖且保守的“RLHD”结构域使其能够以序列特异性方式与其启动子结合。

Cada2 是一种甲基化反应性转录因子

我们在 ChIP 图谱中注意到，即使在没有损伤的情况下，Cada2 在其自身的启动子上也适度富集（图 3A、S2C 和 S2D）。这与RNA聚合酶形成鲜明对比，RNA聚合酶仅在甲基化损伤的情况下观察到与cada2启动子区域结合（图3A，S2C和S2D）。事实上，Caulobacter 仅在暴露于 DNA 甲基化损伤时才诱导适应性反应（图 1B），并且来自木糖诱导启动子的 cada2 过表达不足以诱导 P 的表达ccna_00746-yfp 报告器（图 5A）。

缩略图 下载：

PPT的PowerPoint幻灯片

巴布亚新几内亚放大图像

TIFF的原始图像

图 5. Cada2 是一种甲基化依赖性转录因子。

（A） [顶部] 代表 cada2 过表达分析实验方案的示意图（详见正文）。[底部]P的代表性图像和归一化荧光强度ccna_00746-yfp 表达，其中 cada2 在存在/不存在 1.5 mM MMS 损伤的情况下从 Δcada2 背景中的木糖诱导启动子过表达（n = 300，来自 3 个生物学重复）。基础数据在 S1 数据中可用。（B） （左上角）Cada2 的 αfold 结构突出了甲基转移酶结构域的存在。（右上）由 1,000 个细菌 Cada2 蛋白产生的 MEME 表明“PCHR”基序在甲基转移酶结构域中的保守性。（底部）放大在 1.5 mM MMS 暴露下从 cada2 标志菌株中检测到的甲基化肽的质谱碎裂谱图。肽（插图）包括 Cada2 甲基转移酶结构域的保守“PCHR”基序。图中显示了 2 个生物学重复的 8 个片段的代表性谱图。在 8 个片段中的 6 个片段中检测到 Cys267 的甲基化修饰。（C） [左] 显示 P 的代表性单元格ccna_00746-yfp 报告基因在野生型（来自图 1B）和c ada2 中诱导C267G型在 1.5 mM MMS 损伤下的突变体。[右]小提琴图显示荧光强度分布归一化为单个细胞的细胞面积（n = 300，来自 3 个生物学重复）。基础数据在 S1 数据中可用。（D） cada2 的存活测定C267G型在存在和不存在链脲佐菌素（5和25μg/ ml）和丝裂霉素C（0.5μg/ ml）损伤的情况下突变。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.g005

我们询问了 Cada2 向启动子区域募集的 RNA 聚合酶是否是由 Cada2 和 RNA 聚合酶全酶之间的物理相互作用介导的，以及这一步是否可能具有甲基化依赖性。因此，我们进行了 Cada2 与各种 RNA 聚合酶全酶亚基（RpoA、RpoB、RpoC、RpoD 和 RpoZ）的细菌-双杂交相互作用分析。作为阳性对照，我们使用了解旋酶-核酸酶蛋白复合物组分AddA和AddB[58]。在甲基化损伤的存在下，我们观察到 Cada2 和 RNA 聚合酶亚基 A 之间的相互作用信号（S4A 图）。

甲基化损伤如何激活 Cada2 功能？在损伤下，EcAda的翻译后甲基化分别位于其A-box结合域和甲基转移酶（“PCHR”）结构域中的保守半胱氨酸残基处[59,60]。然而，它是Cys的甲基化38在A-box结合域中，通过调节EcAda的序列特异性DNA结合亲和力将其激活为转录因子[35]。虽然 Cada2 缺乏 A-box 结合结构域，但它确实具有甲基转移酶结构域（在其 C 末端）（图 5B）。因此，我们测试了 Cada2 在暴露于甲基化 DNA 损伤后是否被甲基化。

使用质谱法，我们鉴定了半胱氨酸残基（Cys267，Cada2 的“PCHR”甲基转移酶结构域的一部分）在经过甲基化损伤处理的细胞中，在没有损伤的情况下没有可检测到的甲基化（图 5B）。我们变异了Cys267残基到丙氨酸以破坏甲基化修饰。这个突变体，cada2C267A型，无法驱动感应Pccna_00746-yfp 报告基因和表型复制了链脲佐菌素处理下的 cada2 缺失（S4B 和 S4C 图）。值得注意的是，Cada2 （B-box cada2R68A型和 RLHD 基序 cada2R114A型）不影响Cada2作为甲基转移酶的能力，表明这种活性以DNA序列非依赖性的方式发生（S4D图），并且甲基化可能先于甲基化Cada2调节的转录反应。

为了测试 Cada2 的甲基化是否足以激活其，我们突变了 Cys267甘氨酸残基（CADA2C267G型).EcAda的A-box中的这种突变导致其作为转录因子的组成型激活[35]。与消除cada2活性的丙氨酸突变体相反，我们发现cada2C267G型表现出完整的 Cada2 调节子的组成型表达（S4E 图）。与此一致，Pccna_00746-yfp 报告基因即使在没有甲基化损伤的情况下也显示出稳健的表达（图 5C）。此外，cada2C267G型未显示与 CADA2 缺失或 CADA2 相关的生长缺陷C267A型在甲基化损伤下（图5D和S4C）。因此，Cada2 很可能通过甲基转移酶结构域中保守的半胱氨酸甲基化而被激活为考洛班菌适应性反应的调节分子 （PF01035）。

鉴于 cada2 中的适应性反应是组成型 ONC267G型细胞，我们询问这些细胞在甲基化损伤下的表现是否比野生型更好（因为它们类似于“启动/适应”甲基化损伤的细胞）。事实上，与野生型细胞相比，cada2C267G型突变体在甲基化损伤下具有显着的生长优势，并且在未经处理的条件下似乎没有生长缺陷（图5D）。然而，尽管有这种生长优势，但对 Cada2 样蛋白中“PCHR”结构域的序列分析表明，在自然界中未发现该蛋白的组成型“ON”版本（图 5B，分析了 1,000 个非冗余基因组）。因此，我们想知道是否存在这种反应必须继续受到压制的增长条件。为了测试这一点，我们进行了野生型和cada2C267G型突变细胞接受 MMC 治疗，这是一种不相关的 DNA 损伤条件，其中 Cada2 活性不是必需的，通常处于“关闭”状态。与甲基化损伤下的生长优势相反，我们观察到cada2C267G型当暴露于MMC（诱导单加合物和链内交联）时，与野生型相比，细胞的生长受到很大影响（图5D）。而 Cada2 在甲基化损伤下激活的分子机制以及 cada2 的串扰C267G型突变体需要进一步研究，这些观察结果支持了 Cada2 的甲基化特异性调节很重要的可能性，因为与这种反应相关的拮抗作用在其他应激条件下被错误调节。

Cada2 的调控特征在细菌中是保守的，与 EcAda 范式不同

综上所述，以下调控特征构成了 Caulobacter 适应性反应：（a） 该调控子下基因的启动子区域携带 B 盒基序 （GCAA） 和 X 盒基序 （CGG）。（b） Cada2 蛋白 N 末端编码 B-box 结合和 RLHD 结构域，使其能够以序列特异性方式与启动子区域相互作用。（c） Cada2 蛋白 C 末端编码甲基转移酶结构域。该结构域中保守半胱氨酸的甲基化激活了 Cada2 作为转录因子，可能是通过与 RNA 聚合酶的相互作用来实现的。

我们询问了这些观察结果在细菌物种中的可外推性。为此，我们整理了一组携带 EcAda 样或 Cada2 样蛋白的细菌（包括密切相关和不相关的）是否存在上述特征（图 6A）。令我们惊讶的是，我们发现每个编码EcAda样蛋白的生物体都携带E的所有相关调控特征。大肠杆菌样适应性反应（图6A），而具有Cada2样蛋白的生物体在Caulobacter适应性反应的情况下具有调节特征（图6A）。

缩略图 下载：

PPT的PowerPoint幻灯片

巴布亚新几内亚放大图像

TIFF的原始图像

图 6. Cada2 的调控特征在细菌中是保守的，与 EcAda 范式不同。

（A） 调节性 Ada 甲基转移酶，如 EcAda 和 Cada2 是自动调节的;如示意图所示，这些蛋白质调节其自身启动子的活性（以甲基化依赖性方式）。这使我们能够预测其各自启动子中是否存在调控特征。该表表示已鉴定的 EcAda 样和 Cada2 样蛋白的蛋白质（A、B 或 RLHD 氨基酸序列）和同源启动子序列（A、B 或 X Box DNA 基序）中调控特征的保守性。存在（灰色）或不存在特征（空白）与蛋白质序列百分比一起显示。（B） 来自粘球菌的 Cada2 （粘液卡达2）可以驱动Pccna_00746-yfp 诱导 Δcada2 响应 MMS 损伤，但不能驱动 EcAda 启动子的 yfp 表达。相反，来自 E.大肠杆菌可以激活 EcAda 启动子的 yfp 表达，但不能激活 P 的ccna_00746促进。基础数据在 S1 数据中可用。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.g006

蛋白质和启动子序列在 Cada2 样蛋白上的保守性促使我们测试这些蛋白质在功能上是否可互换。为此，我们表达了一种来自黄粘球菌（Cada2粘质） 在 Caulobacter 中缺乏自己的 cada2。卡达2粘质对 Caulobacter Cada2 蛋白的总体同一性较低 （44%）;然而，它在保守的调控特征方面具有很高的相似性（图6A）。作为对照，我们在相同的背景下表达 EcAda，以评估 EcAda 是否可以补充 Cada2 的缺失。我们发现 Cada2粘质能够完全补充甲基化损伤下 Caulobacter cada2 的缺失，通过细胞存活率和 P 的启动子活性进行评估ccna_00746-yfp（图 6B 和 S5A）。相比之下，EcAda无法补充cada2缺失表型（图6B）。这种在 Caulobacter 中表达的蛋白质完全擅长以甲基化依赖性方式驱动携带 EcAda DNA 结合序列的启动子表达 yfp（图 6B）。然而，Cada2粘质显示出 Cada2 特异性活性，不能诱导 EcAda 报告基因的 yfp 表达（图 6B）。总之，这些数据说明了已确定的调节特征在控制细菌适应性反应方面的特异性、充分性和必要性。

讨论

在这项研究中，我们鉴定了 Cada2，这是一种新型甲基化损伤特异性转录因子，在所有主要细菌门中都是保守的。我们进一步暗示了基于PTM的这类细菌转录因子激活的关键和保守作用，尽管作用机制不同（Cada2与EcAda）。我们假设在适应性反应途径的调节因子中观察到的组织多样性可能是对细菌生理特征的适应。然而，下游自适应响应对这种变异性是稳健的。

机制多样，功能统一

Cada2 和 EcAda 之间的机制差异表明响应动力学也不同。Cada2 和 EcAda 使用不同的 DNA 结合结构域与其同源启动子结合（分别是 B-box 和 “RLHD” 结构域与 A 和 B-box 结合结构域 [35]）。这两种蛋白质也以非重叠方式被激活为转录因子：在EcAda的情况下，序列特异性DNA结合A-box结构域内半胱氨酸残基的甲基化将其激活为转录因子[59,61]。相反，Cada2 激活通过其甲基转移酶结构域中半胱氨酸的 PTM 发生，该结构域位于序列特异性 DNA 结合结构域的远端。此外，与 EcAda 不同，未甲基化的 Cada2 似乎与其自身的启动子形成序列特异性相互作用（图 3A 和 S2A）。静电排斥的存在（如在EcAda中）会阻碍这种相互作用。这表明 Cada2 通过另一种非静电机制起作用。

然而，尽管存在这些对比，但两种生物之间的反应动力学是不变的。Caulobacter 的适应性反应受到严格调控，在没有甲基化 DNA 损伤的情况下表现出低水平的表达 （Ada OFF）。暴露于甲基化剂后，Caulobacter 细胞也会在 SOS 反应之后引发延迟的适应性反应。类似于 E。大肠杆菌Ada反应[31]，Caulobacter反应表现出双稳定性，即使在DNA甲基化损伤的情况下，其细胞亚群也类似于Ada OFF细胞的表达。有趣的是，在过表达Cada2的菌株中，OFF群体被消除，这与EcAda的观察结果[31]一致（图1B和5A）。影响反应调节因子作用机制差异的因素，同时保留反应本身的定义特征，是未来研究的重要和令人兴奋的途径。

细菌甲基化损伤特异性反应的要求

对甲基化损伤的适应性反应有多普遍？我们的计算分析表明，调节性 Ada 甲基转移酶是广泛保守的，但它似乎具有不同的结构域组织（S3D 和 S3E 图）。鉴于这些结构域的明显模块化（S3D和S3E图），人们很容易推测，这种多样化的组织是由于共同祖先蛋白的结构域洗牌而产生的[62\u201264]。尽管它们很普遍，但多个调节因子很少出现在同一个基因组上。一个典型的例子是 EcAda 和 Cada2 之间的比较。我们只能检测到大约7%的基因组具有这两种蛋白质。编码 EcAda 和 Cada2 的基因组显示出多种独特的调控回路，包括自动调控和交叉调控（S3F 图）。

是什么推动了观察到的多样性？EcAda 和 Cada2 的比较可能提供一个令人信服的假设。EcAda 和 Cada2 在其同源启动子中共享 B-box 基序。然而，Cada2 与富含 GC 的 X-box 基序结合，而不是在 EcAda 调节基因的启动子中观察到的富含 AT 的 A-box 基序。这与编码这些蛋白质的基因组的GC含量密切相关。E 的 GC 含量。大肠杆菌基因组约为 50%（低），而 Caulobacter 基因组的 GC 含量约为 67%（高）。这一假设与先前的研究一致，这些研究也表明基因组GC含量与特定DNA修复途径的存在/不存在相互依赖[65\u201268]。

因此，区分细菌的生理特征很可能保证调节性 Ada 甲基转移酶的组织适应和结构域重组。然而，无论在调节水平上观察到的多样性如何，适应性反应样通路似乎保留了前面强调的某些特征。在这种情况下，我们强调了激活和调节反应所需的基于 PTM 的转录开关。与这种响应相关的成本（例如，图5D）或适应性优势可能成为制约因素，使该系统对监管机构组织的变化具有鲁棒性，但又推动了关键监管特征的保留。总之，细菌适应性反应机制的保守，尽管具有不同的调控形式，强调了对专用甲基化特异性DNA损伤反应的基本要求。

材料和方法

细菌菌株和生长条件

本研究中使用的所有菌株、质粒和寡核苷酸分别列在 S1–S3 表中。在 30°C 下在蛋白胨酵母提取物 （PYE） 培养基（0.2% 蛋白胨、0.1% 酵母提取物和 0.06% MgSO）中培养新月形杆菌细胞4），并根据需要补充适当浓度的抗生素或诱导剂。为了诱导cada2表达，除非另有说明，否则将0.3%木糖引入培养物中。

荧光显微镜和图像分析

成像是在落射荧光宽视场显微镜（Eclipse Ti-2E，尼康）上进行的，该显微镜带有60×/1.4 NA油浸物镜和电动载物台。pE-4000 （CoolLED） 用作 LED 激励源。所有 yfp 样品 （λ = 490nm） 的曝光时间为 500 ms，曝光保持在 LED 功率的 50%。图像是使用滨松逆戟鲸闪光灯 4.0 相机拍摄的。通过基于红外线的完美对焦系统（尼康）确保对焦。样品的制备详见[69]。对于时程显微镜检查，在不同时间点分装 1 ml 培养物，沉淀并重悬于适当体积的生长培养基中，并将 2 μl 重悬细胞点样在 1% 琼脂糖（Invitrogen 超纯）垫上并成像。对于延时显微镜，在补充有PYE培养基和1.5mM MMS损伤的1.5%低熔点GTG琼脂糖垫上发现2μl培养物。在整个时间流逝期间，样品在保持在30°C的OkoLab培养箱中生长，并定期成像。通过Oufti软件进行细胞分割和荧光强度分析[70]。

RNA测序

样品采集。

将 Caulobacter 细胞的过夜培养物反稀释至 0.025 OD600并在 30°C 下生长 3 小时。当 OD600培养物约为 0.1，引入 DNA 损伤（MMS （1.5 mM）/MMC （0.25 μg/ml）/诺氟沙星 （8 μg/ml））。收集 4 个生物重复样品，用于无损伤条件，2 个生物重复样品，收集 2 ml Caulobacter 细胞并以 10,000 g 旋转 5 分钟。然后弃去上清液，用液氮快速冷冻细胞沉淀并储存在–80°C，直到样品得到进一步处理。在 DNA 损伤暴露后 0、20 和 40 分钟收获细胞。

RNA提取。

根据先前的一项研究，从细胞沉淀中提取RNA[58]。在 65°C、2,000 rpm 的热混合器中使用 400 μl 预热的 Trizol 裂解细胞。将裂解的细胞转移到–80°C至少30分钟，然后在4°C下离心。 小心地将上清液转移到等体积的100%乙醇中。然后通过Direct-zol RNA MiniPrep（Zymo，货号R2052）试剂盒中提到的方案提取RNA。然后对提取的RNA进行DNAse处理，以从样品中去除任何基因组DNA。使用RNA Clean & Concentrator-25（Zymo，货号R1018）试剂盒纯化样品中的总RNA。使用生物分析仪测试RNA的完整性。使用 RiboMinus 试剂盒（Thermo，货号 K155004）从总样品中分离 mRNA，并在 NCBS 下一代测序设施中提交进行 RNA-seq。S4表总结了用于RNA文库制备的试剂盒和用于RNA-seq实验的测序平台的详细信息。

RNA测序分析

测序结果的原始读数以 fastq 文件的形式获得。新月花杆菌NA1000菌株（登录号：NC_011916.1）的参考基因组序列（.fna）和注释（.gff）文件从NCBI文件传输协议（ftp）网站（“ftp.ncbi.nlm.nih.gov”）下载。使用 FastQC 软件（版本 0.11.5）检查原始读取质量。Burrows-Wheeler Aligner （BWA）（版本 0.7.17-r1188）用于索引参考基因组。使用 BWA aln -q 选项将原始读长质量 > = 20 的读段与索引基因组比对。Samtools（版本 0.1.7）用于过滤掉多映射读取。使用Bedtools（版本2.26.0）通过注释文件（.bed）[71]计算每个基因的reads计数。使用edgeR[72]对具有重复样本的样本进行归一化和差异基因表达分析。将样本与其同源生物学重复组合在一起。为了估计差异基因表达，应用了准似然 F 检验，将无损伤样品与暴露于 DNA 损伤的样品的归一化读取值进行比较。对于 cada2C267G型数据，通过计算每千碱基每百万映射读数 （RPKM） 以及相应的野生型对照对样品进行归一化。cada2 的折数变化C267G型通过将RPKM值与野生型对照（在没有损伤的情况下）进行比较来计算样品。根据 2 个阈值将基因定义为上调;在某种条件下，如果日志2基因的倍数变化（与对照组相比）大于或等于 1（即，在这种情况下，基因含量增加了一倍），并且重复的误发现率小于 0.05。同样，在这种情况下，如果基因的对数，则该基因下调2与对照组相比的倍数变化小于?1，重复重复的错误发现率小于0.05。DGE 分析是使用 R 版本 4.2.3 （2023-03-15） 的 Google Colab 完成的。

蛋白质印迹

蛋白质印迹法的进行与既往研究所述[73]。简而言之，将PYE培养基中的过夜培养物反稀释至0.025 OD600并在 30°C 下生长 3 小时。在大约 0.1OD 时600，向培养物中加入1.5 mM MMS;引入 DNA 损伤后 0、2 和 4 小时，细胞对应于 0.6 OD600被收割了。将培养物沉淀，然后弃去上清液。将沉淀的细胞重悬于 200 μl 裂解缓冲液 [500 mM Tris-HCL （pH 6.8）、8% SDS、40% 甘油、2-巯基乙醇和足量的溴酚蓝] 中，并在 95°C 下加热 3 分钟。接下来是 2 轮 30 秒的涡旋旋转，每轮然后是短旋转。将重悬的细胞再次加热至95°C，然后将样品加载到10%SDS-PAGE凝胶上并进行电泳。然后将分离的蛋白质条带到 PVDF 膜上，并用抗标志抗体探测以估计 Cada2 水平。还用抗RpoA抗体探测了相同的样品，以验证样品的均匀上样。使用SuperSignal West PICO PLUS化学发光底物显影。

质谱

样品采集。

过表达标记的野生型 cada2 或其突变体 （cada2R68A型、镉2R114A型）来自Δcada2背景中的木糖诱导启动子。在含有庆大霉素的PYE培养基中生长的过夜培养物反稀释至0.025OD600并在 30°C 下生长 3 小时。在大约 0.1OD 时600，将1.5 mM MMS和0.3%木糖加入培养物中，培养体积对应于0.6 OD600处理4 h后收集。将培养物沉淀，然后弃去上清液。将沉淀的细胞重悬于 200 μl 裂解缓冲液 [500 mM Tris-HCL （pH 6.8）、8% SDS、40% 甘油、2-巯基乙醇和足量的溴酚蓝] 中，并在 95°C 下加热 3 分钟。随后是 30 秒的涡旋旋转，然后是短暂的旋转。上述 2 个步骤重复两次。将重悬的细胞再次加热至95°C，然后将样品加载到10%SDS-PAGE凝胶上并进行电泳。将凝胶适当分离并用考马斯染料染色。从凝胶中切除与Cada2-3x-Flag大小（约37 kDa）相对应的条带，重悬于milliQ水中，并提交给NCBS质谱设施进行进一步处理。

样品制备和质谱分析。

首先用LC-MS水柱洗涤切除的凝胶碎片三次，并弃去上清水。接下来，将凝胶片切碎，然后用 1：1 100 mM 碳酸氢铵 （TEAB） 和 100% 乙腈 （ACN） 脱色。脱色后，弃去上清液。然后加入约200μl100%乙腈，并将样品保持在室温下，直到凝胶碎片收缩，然后弃去上清液。第二次重复添加 ACN 的上一步。将凝胶片在室温下干燥几分钟。接下来，将凝胶悬浮在至少 500 ng 胰蛋白酶和 100 至 200 μl 100 mM TEAB 中。然后将样品在 37°C 下保存过夜胰蛋白酶消化，然后将 100 μl 含 0.1% 甲酸的 100% 乙腈引入消化的样品中，并将消化的样品超声处理 5 分钟。然后将上清液收集到新管中。第二次重复消化后步骤。然后使用SpeedVac真空浓缩器干燥收集的上清液，并在0.1%甲酸中复溶。随后进行脱盐后，将样品注入 Orbitrap Fusion Tribrid 质谱仪，与 Thermo EASY nanoLC 1200 色谱系统联用，用于质谱分析。使用PeakStudio 8.0分析结果，以鉴定肽片段及其相关的PTM（如果有）。

染色质免疫沉淀测序 （ChIP-Seq）

将 50 ml PYE 用过夜的 Caulobacter crescentus 培养物亚接种至 OD600的 0.025，培养物在 30°C 下再生长 3 小时，以 250 rpm 振荡直至达到 OD600的 0.1。然后加入MMS（终浓度为1.5mM），培养物再生长2或4小时，然后用甲醛固定。也包括了无MMS治疗的对照。将细胞在室温下用甲醛（终浓度为1%）固定30分钟，然后在室温下用0.125M甘氨酸淬灭15分钟。用 1× PBS（pH 7.4）洗涤细胞 3 次，并重悬于 1 ml 裂解缓冲液 [20 mM K-HEPES （pH 7.9）、50 mM KCl、10% 甘油和不含 Roche EDTA 的蛋白酶抑制剂] 中。ChIP-seq的实施与Tran及其同事之前所述[74]。简而言之，使用 Soniprep 150 探针型超声仪（11 个循环，15 秒开启，15 秒关闭，设置 8）在冰上对细胞悬液进行超声处理，以将染色质剪切至 1 kb 以下，并通过离心清除细胞碎片（在 4°C 下以 13,000 rpm 的速度 20 分钟）。然后将上清液转移到新的2ml管中，并将缓冲液条件调节至10mM Tris-HCl（pH 8），150mM NaCl和0.1%NP-40。将 50 微升上清液转移到单独的试管中进行控制（输入部分）并储存在 -20°C。 同时，在加入上述上清液之前，将抗体偶联的微珠从储存缓冲液中洗掉。α-M2 FLAG 抗体与琼脂糖微珠（Merck，英国）偶联用于 Cada2-FLAG 和 RpoC-FLAG 的 ChIP-seq。简而言之，通过在IPP150缓冲液[10mM Tris-HCl（pH 8），150mM NaCl和0.1%NP-40]中重复离心和重悬，将100μl α-FLAG珠从储存缓冲液中洗掉。然后将微珠引入清除的上清液中，并在 4°C 下轻轻摇动孵育过夜。然后用 1 ml IPP150 缓冲液在 4°C 下洗涤 5 次，每次 2 分钟，然后在 1× TE 缓冲液 [10 mM Tris-HCl （pH 8） 和 1 mM EDTA] 中在 4°C 下洗涤 5 次，每次 2 分钟。然后从珠子中洗脱蛋白质-DNA复合物两次，首先将珠子与150μl洗脱缓冲液[50mM Tris-HCl（pH 8），10mM EDTA和1%SDS]在65°C下孵育15分钟，然后用100μl1X TE缓冲液+ 1%SDS在65°C下再孵育15分钟。 然后将上清液（ChIP 部分）从微珠中分离出来，并在 65°C 下进一步孵育过夜，以完全逆转交联。通过在 65°C 下与 200 μl 1X TE 缓冲液 + 1% SDS 孵育过夜，将输入部分去交联。然后根据制造商的说明使用 PCR 纯化试剂盒 （Qiagen） 纯化 ChIP 和起始组分的 DNA，然后在 40 μl 水中洗脱。然后使用NEXT Ultra II文库制备试剂盒（NEB，英国）将纯化的DNA制备到适合Illumina测序的文库中。在塔夫茨大学基因组学设施的Illumina Hiseq 2500上对ChIP文库进行测序。

ChIP-seq 分析

ChIP-seq 结果的原始读取以 fastq 文件的形式获得。BWA用于将reads与Caulobacter基因组比对，类似于RNA-seq数据的分析。使用 Bedtools 的 bamtobed 选项将 .bam 格式的对齐读取转换为 a.bed 文件格式。使用 Bedtools genomecov 命令计算每个核苷酸位置的覆盖率。随后，使用自定义 python 脚本绘制这些覆盖率文件中的 ChIP-seq 图谱。使用Numpy计算cada2标志和rpoC标志的ChIP-seq谱之间的Pearson相关性[75]。Peakzilla用于鉴定真正的富集峰[76]，并将MMS暴露下cada2 3xflag或rpoC 3xflag ChIP-seq的bed文件与在相同条件下处理的未标记野生型细胞进行比较。

ChIP 和定量 PCR 分析

为了在 ChIP 实验中对 cada1 和 cada3 启动子富集进行定量 PCR （q-PCR） 分析，将来自起始量和 ChIP 组分的纯化 DNA 在水中以 1：4 的比例稀释，并使用 SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix（CAT S4438，Merck，UK）和 BioRad CFX96 仪器进行 1 μl 进行 qPCR。使用比较 Ct 方法 （ΔΔCt） 计算倍数富集，并表示与作为阴性对照的 rpoD DNA 相比，cada1 和 cada3 启动子 DNA 的相对丰度。所有倍数富集值均代表 3 个生物学重复的平均值。

以下寡核苷酸用于qPCR反应：

cada1 （fw， TAGGACGCGACTGCTGA， rv， TCCTTTCGTGAGGAGACCA）

cada3 （fw， ATCGCCCGCATGGAATAC， rv， AGAAGGAAGCTACTACCGGAT）

rpoD （fw， TCAGGCCAAGAAGGAAATGG， rv， GCCTTCATCAGGCCGATATT）.

存活试验

将 Caulobacter 菌株的过夜培养物反稀释至 OD6000.1. 将培养物在 30°C 下孵育 3 小时。然后将所有培养物归一化至0.3 OD600并以 10 倍的增量连续稀释（10?1–10?8），并在含有适当化学物质（DNA损伤剂/抗生素/诱导剂）的PYE平板上发现每种稀释液的6μl。将板在 30°C 下孵育 48 小时，通过计数斑点数来确定相应菌株的存活率。

通过 AlphaFold 对蛋白质结构进行计算预测

EcAda、Cada1、Cada2和Cada3的三维结构预测由ColabFold（AlphaFold2与Google Colaboratory上托管的MMSeq2相结合）进行[56,57]。使用每种蛋白质的一级序列作为查询序列。默认参数用于其他设置。本文中显示的结构模型是具有最高 pLDDT 分数的模型。

蛋白质保护的计算分析

所有关于大约6000种细菌的“完整”和“最新”（assembly_summary.txt）基因组信息文件都是使用全基因组序列（.fna）、蛋白质编码核苷酸序列（.fna）、RNA序列（.fna）和蛋白质序列（.faa）的内部脚本从NCBI ftp网站下载的。所有生物都根据KEGG分类（https://www.genome.jp/kegg/genome.html;截至2018年5月）被分配了各自的门。

为了鉴定 Ada 结构域和 Ada 变体，使用来自大肠杆菌 MG1655 的 EcAda 的 4 个蛋白质结构域序列中的每一个作为针对 UniprotKB 数据库的查询序列运行初始 blastp，E 值截止值为 0.0001。Ada 的 4 个结构域包括 A-box、B-box、RNAse-like 和 repair。所有 4 个域的前 1,000 个全长序列命中都是从 UniProt 下载的。使用 phmmer–A 选项进行域多序列比对 （MSA），将前 1,000 次命中作为序列数据库和 E。大肠杆菌域序列作为查询。使用在上一步中获取的 MSA 的 hmmbuild 命令构建了 hmm 配置文件。为了查找域同源物，使用E值截止值为0.0001的hmmsearch命令和hmmm配置文件作为对5,973个细菌基因组序列数据库的查询。这些同源物搜索是使用 HMMER 软件包 v3.3 完成的。根据 Ada 结构域的不同组合对同一蛋白质的分配，鉴定出不同的 Ada 变体。

使用16S rRNA序列构建系统发育物种树。每个基因组一个序列是从多法斯塔文件中提取的。MSA 是使用 muscle v3.8.31 和默认选项构建的，然后使用 BMGE v1.12 进行对齐修剪。使用 IQTREE v1.6.5，使用 ModelFinder 选择的最佳模型（-m MF 选项）针对其他 285 个模型构建了基于最大似然的系统发育。使用 1,000 个超快 bootstrap 近似值（-bb 1,000 –bnni 选项）和类似 SH 的近似似然比检验（-alrt 1,000 选项）评估分支支持。最终的可视化树被修剪为包含 4 个主要门——变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门。使用在线工具Itol [77]进行可视化，并将EcAda和Cada2的存在/缺失叠加在系统发育上。

为了鉴定 Cada2 和 EcAda 的基本调控基序，对 EcAda 或 Cada2 的编码序列进行蛋白质原始测试，对照 UniprotKB 数据库进行蛋白质原始测试，E 值截止值为 10。从UniProt下载了两种蛋白质的前1000个全长序列命中，并提交给MEME发现计划，以鉴定保守的特征。

支持信息

Caulobacter 中的甲基化特异性 DNA 损伤反应。

显示 1/11： pbio.3002540.s001.tif

跳到无花果分享导航

https://ndownloader.figstatic.com/files/44977722/preview/44977722/preview.jpg

1 / 11

下载

无花果分享

S1 图。 Caulobacter 中的甲基化特异性 DNA 损伤反应。

（A） 日志热图2MMS、MMC 或诺氟沙星治疗后野生型细胞中上调基因的 FC 值。（B） [左] 显示 P 的代表性单元格ccna_00746-YFP 报告基因在暴露于 STZ、MMC、诺氟沙星和 胡 时诱导。[右]小提琴图显示荧光强度分布归一化为单个细胞的细胞面积（n = 300，来自 3 个生物学重复）。基础数据在 S1 数据中可用。（C） [左] 显示 P 的代表性单元格ccna_00746-yfp 报告基因在 1.5 mM MMS 损伤下的 ΔdriD 背景诱导。[右]小提琴图显示荧光强度分布归一化为单个细胞的细胞面积（n = 300，来自 3 个生物学重复）。基础数据在 S1 数据中可用。（D） [Top] 用于测试 Caulobacter 甲基化特异性损伤反应的适应性的实验方案示意图。P 培养物ccna_00746-yfp 细胞暴露于 0.5 mM 的亚致死剂量，无论是 MMS（适应）还是无 MMS（非适应）。随后将细胞暴露于补充有PYE培养基的琼脂糖垫上的更高剂量的1.5mM MMS。[底部]在致死性 MMS 暴露 3 小时内通过延时显微镜测量归一化荧光强度动力学。虚线（深色）表示感应动力学的平均时间迹线，而阴影区域（浅色）表示相应条件下所有时间迹线的标准偏差（此处和所有其他延时数据）（n = 25）。基础数据在 S1 数据中可用。（E） 有和没有 MMS 暴露的 cada 基因个体缺失的存活测定 （1.5 mM）。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.s001

（TIF）

S2 图。 Cada2 以序列特异性方式与适应性反应启动子结合。

（A） 在存在或不存在 STZ 损伤 （5 μg/ml） 的情况下 cada2-3x 标志菌株的存活测定。（B） Western 印迹显示 1.5 mM MMS 暴露后 0、2 和 4 小时的 Cada2-3x 标志水平。作为加载控制，对 RpoA 进行探测。（C） 野生型（对照）、Cada2-3x-Flag 或 RpoC-3x-Flag ±2.5 kb 的 ChIP-seq 谱，在暴露于 1.5 mM MMS 之前（无损伤）和之后（+损伤）在 cada2 CDS 周围。（D） Cada2-3x-Flag 和 RpoC-3x-Flag ±2.5 kb 在暴露于 1.5 mM MMS 之前和之后的放大 ChIP-seq 谱。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.s002

（TIF）

S3 图。 Cada2 样蛋白广泛存在，并编码一种新的 DNA 结合结构域。

（A） （Top） 显示了 Cada2 和 EcAda 的结构域组织和预测的 Alphafold 结构。（底部）EcAda 和 Cada2 调控结构域的特写显示，Cada2 B-box 结合域（具有“SPFHQR”氨基酸序列）和新鉴定的 Cada2 序列特异性结合域（具有“RLHD”氨基酸序列）是类似于 EcAda 的 B-box 结合域的螺旋-转-螺旋结构域的一部分。这些保守图案的位置在模型的整体丝带表示中被突出显示并标记为球和棍。（B） 标记的 Cada2 突变体的蛋白质印迹 （Cada2R68A型和 Cada2R114A型） 在经 MMS 损伤处理的木糖诱导启动子的 Δcada2 菌株中过表达。（C） cada2的存活测定R68A型和 CADA2R114A型有或没有 STZ 损坏。（D） [左] 在属水平上分析了从精心策划的、非冗余的细菌基因组数据库中估计的 EcAda 样蛋白、Cada2 样蛋白和 AdaA 样蛋白的流行率。数字代表这些蛋白质在主要细菌分支中的存在。[右]这里分析的相应适应性反应调节蛋白的结构域组织。（E） [左] 如（D）所示，用于物种水平的细菌基因组的精选非冗余数据库。[右]在物种水平上分析了从精心策划的非冗余细菌基因组数据库中估计的其他适应性反应甲基转移酶的流行率。（F） 表格表示 EcAda 样蛋白和 Cada2 样蛋白的存在和不存在及其共现情况。在 Cada2-EcAda 共现的实例中，显示了通过识别其同源启动子中的 Cada2 和 EcAda 结合基序来预测的潜在调节电路。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.s003

（TIF）

S4 图。 Cada2 是一种甲基化依赖性转录因子。

（A） 细菌双杂交测定，用于测试 Cada2 和 RNA 聚合酶亚基之间的相互作用。测试了 T18-Cada2 与 T25-RNA 聚合酶全酶亚基的相互作用，有和没有 1.5 mM MMS。红色菌落的存在表明正相互作用。作为阳性对照，使用AddA（T18）和AddB（T25），空载体（T18和T25）作为阴性对照。显示了来自 2 个独立重复的代表性图像。（B） [左] 显示 P 的代表性单元格ccna_00746-YFP 报告基因在野生型和 CADA2 中的诱导267一个1.5 mM MMS 损伤下的突变背景。[右]小提琴图显示，在存在（黑暗）和不存在损伤（光）的情况下，单个细胞的荧光强度分布归一化为细胞面积（n = 200，来自 2 个生物学重复）。野生型数据再次从图1B中表示。基础数据在 S1 数据中可用。（C） cada2突变体（cada2C267A型或者 cada2C267G型） 有和没有 STZ 损伤 （5 μg/ml）。（D） [上图]表表示与Cada2甲基转移酶结构域相对应的肽，该结构域具有质谱法鉴定的“PCHR”基序。在没有MMS的情况下，对应于野生型Cada2标志的肽是未甲基化的。在暴露于MMS损伤后，对应于野生型的肽以及突变体Cada2-3x-Flag在Cys处表现出甲基化267残留。[下]上表中肽的代表性质谱碎裂模式。在野生型（无损伤）的情况下，显示了来自 2 个生物重复的 3 个片段的代表性光谱。Cys无甲基化修饰267被检测到。在 Cada2 的情况下R68A型图中显示了 2 个生物学重复的 4 个片段的代表性光谱。Cys的甲基化修饰267在 4 个片段中的 3 个中检测到。在 Cada2 的情况下R114A型图中显示了 2 个生物学重复的 7 个片段的代表性光谱。Cys的甲基化修饰267在 7 个片段中的 5 个片段中检测到。（E） 热图表示对数2野生型和cada2中Cada2调控基因的FC值C267G型MMS 暴露下的细胞。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.s004

（TIF）

S5 图。 Cada2 的调控特征在细菌中是保守的，与 EcAda 范式不同。

（A） 过表达cada2的Δcada2菌株存活试验考洛或者 CADA2粘质（来自木糖诱导的启动子）在甲基化损伤（5μg/ ml STZ）下。将这些菌株的存活率与由Δcada2背景中的空载体组成的对照菌株进行比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.s005

（TIF）

S1 表。 本研究中使用的菌株。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.s006

（DOCX）

S2 表。 本研究中使用的质粒。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.s007

（DOCX）

S3 表。 本研究中使用的寡核苷酸。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.s008

（DOCX）

S4 表。 用于制备RNA文库的试剂盒和用于RNA-seq实验的测序平台。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.s009

（DOCX）

S1 数据。 主要和补充图中所示的图形和绘图基础的数值数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.s010

（XLSX）

S1 原始图像。 S2B 和 S3B 图中蛋白质印迹的未裁剪图像。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002540.s011

（PDF格式）

确认

我们感谢Asha Joseph博士对RNA测序实验的贡献，感谢Kaustav Mitra进行最初的细菌双杂交实验。我们感谢 AB 实验室成员的有益意见和讨论。我们感谢NCBS质谱设施和下一代测序设施对关键实验的支持。

引用

1.Moore LD， Le T， Fan G. DNA甲基化及其基本功能.神经精神药理学。2013;38:23–38.PMID：22781841

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

2.Seong HJ， Han S-W， Sul WJ.原核DNA甲基化及其功能作用。J微生物学。2021;59:242–248.PMID：33624263

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

3.罗伯逊KD，宾夕法尼亚州琼斯。DNA甲基化：过去、现在和未来的方向。发生。2000;21:461–467.PMID：10688866

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

4.Mattei AL， Bailly N， Meissner A. DNA 甲基化：历史视角。趋势基因。2022;38:676–707.PMID：35504755

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

5.Sánchez-Romero MA， Cota I， Casadesús J. 细菌中的 DNA 甲基化：从甲基到甲基组。Curr Opin 微生物。2015;25:9–16.PMID：25818841

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

6.Bignami M， O'Driscoll M， Aquilina G， Karran P. 揭开杀手的面纱：DNA O6-甲基鸟嘌呤和甲基化剂的细胞毒性。2000年《Mutat Res/Rev Mutat Res.》;462:71–82.

查看文章Google 学术搜索

7.烷化剂诱变：含有 3-甲基胞嘧啶的聚 （dC） 模板的 DNA 聚合酶的编码特性。生物化学。1982;64:637–641.PMID：6814512

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

8.Larson K， Sahm J， Shenkar R， Strauss B. 甲基化诱导的体外 DNA 复制阻断。Mutat Res/Fund Mol Mech 诱变。1985;150:77–84.PMID：4000169

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

9.Sedgwick B. 修复 DNA 甲基化损伤。Nat Rev Mol 细胞生物学 2004;5:148–157.PMID：15040447

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

10.小JW，盖勒特M.SOS调控系统：通过RecA蛋白酶的水平控制其状态。分子生物学杂志 1983;167:791–808.PMID：6410076

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

11.吉斯 KC、米哈洛夫斯基 CB、小 JW。LexA 二聚体的 RecA 依赖性裂解。分子生物学杂志 2008;377:148–161.PMID：18234215

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

12.Kova?i? L、Pauli? N、Leonardi A、Hodnik V、Anderluh G、Podlesek Z 等。对 LexA-RecA* 相互作用的结构洞察。核酸研究 2013;41:9901–9910.PMID：23965307

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

13.小 JW、埃德米斯顿 SH、帕切利 LZ、芒特 DW。recA 蛋白酶裂解大肠杆菌 lexA 蛋白。美国国家科学院院刊，1980 年;77:3225–3229.

查看文章Google 学术搜索

24 分钟西蒙斯洛杉矶、福蒂 JJ、科恩 SE、沃克 GC。SOS 监管网络。EcoSal Plus的。2008;3：PMID：25325076

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

25 分钟Jaramillo-Riveri S， Broughton J， McVey A， Pilizota T， Scott M， El Karoui M. 大肠杆菌 DNA 损伤反应的生长依赖性异质性。分子系统生物学 2022;18：E10441。

查看文章Google 学术搜索

16.Jones EC， Uphoff S. 大肠杆菌中 LexA 降解的单分子成像阐明了 SOS 反应的调控机制和异质性。Nat微生物。2021;6:981–990.PMID：34183814

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

27 分钟Fuchs RP， Fujii S. 原核生物中的跨病变 DNA 合成和诱变。冷泉 Harb Perspect Biol. 2013;5：A012682。PMID：24296168

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

28 分钟Kamat A， Badrinarayanan A. SOS 非依赖性细菌 DNA 损伤反应：多种机制，统一功能。Curr Opin 微生物。2023;73:102323.

查看文章Google 学术搜索

19.Olivencia BF， Müller AU， Roschitzki B， Burger S， Weber-Ban E， Imkamp F. 耻垢分枝杆菌 PafBC 参与 DNA 损伤反应的调节。科学代表 2017;7：13987。

查看文章Google 学术搜索

10 分钟Müller AU， Imkamp F， Weber-Ban E.分枝杆菌 LexA/RecA 非依赖性 DNA 损伤反应由 PafBC 和幼崽蛋白酶体系统控制。细胞代表 2018;23:3551–3564.PMID：29924998

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

11 分钟Müller AU， Kummer E， Schilling CM， Ban N， Weber-Ban E. 通过西格玛适应对分枝杆菌 DNA 损伤反应的转录控制。科学研究 2021;7：eabl4064。PMID：34851662

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

12 分钟Gozzi K， Salinas R， Nguyen VD， Laub MT. Schumacher MA.ssDNA 是 C 的变构调节因子。新月形SOS 非依赖性 DNA 损伤反应转录激活剂 DriD。基因开发 2022;36:618–633.

查看文章Google 学术搜索

13 分钟Modell JW、Kambara TK、Perchuk BS、Laub MT。DNA 损伤诱导的、不依赖 SOS 的检查点调节新月形考洛杆菌的细胞分裂。PLoS 生物学 2014;12：E1001977。

查看文章Google 学术搜索

24.Gozzi K， Tran NT， Modell JW， Le TBK， Laub MT. 噬菌体样基因转移剂在静止期促进新月形杆菌存活和 DNA 修复。PLoS 生物学 2022;20：e3001790。

查看文章Google 学术搜索

15 分钟凯勒 LM， 韦伯-班 E.细菌中一类新兴的核酸敏感调节因子：含有WYL结构域的蛋白质。Curr Opin 微生物。2023;74:102296.PMID：37027901

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

16 分钟Adefisayo OO， Dupuy P， Nautiyal A， Bean JM， Glickman MS. SOS 和 PafBC 在分枝杆菌 DNA 修复和诱变中的分工。核酸研究 2021;49:12805–12819.PMID：34871411

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

17 分钟萨姆森 L， 凯恩斯 J.大肠杆菌DNA修复的新途径。自然界。1977;267:281–283.

查看文章Google 学术搜索

18 分钟Mielecki D， Grzesiuk E. Ada 反应——一种修复细菌中烷基化 DNA 的策略。FEMS 微生物学杂志 2014;355:1–11.PMID：24810496

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

19 分钟Uphoff S. 诱变的实时动态揭示了单细胞中 DNA 修复和损伤耐受反应的年表。美国国家科学院院刊 2018;115：E6516–E6525。PMID：29941584

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

30.杰戈 P， 德法斯 M， 萨姆森 L， 申德尔 P.E 的适应性反应。大肠杆菌与低水平烷化剂：与先前表征的 DNA 修复途径的比较。Molec Gen Genet。1977;157:1–9.

查看文章Google 学术搜索

31.Uphoff S， Lord ND， Okumus B， Potvin-Trottier L， Sherratt DJ， Paulsson J. DNA 损伤反应的随机激活会导致细胞间突变率变化。科学。2016;351:1094–1097.PMID：26941321

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

32.Friedberg EC、Walker GC、Siede W、Wood RD、Schultz RA、Ellenberger T. DNA 修复和诱变。ASM出版社;2005.

33.Nakabeppu Y， Sekiguchi M. 响应烷化剂诱导修复酶合成的调节机制：ada 蛋白充当转录调节因子。美国国家科学院院刊，1986年;83:6297–6301.PMID：3529081

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

34.Sakumi K， 五十岚 K， 关口 M， 石滨 A.Ada 蛋白是大肠杆菌的 I 类转录因子。细菌学杂志. 1993;175:2455–2457.

查看文章Google 学术搜索

35.何C， 胡斯J-C， 孙丽杰， 周 P， 诺曼 DPG， D?tsch V， 等.甲基化依赖性静电开关通过 E 控制 DNA 修复和转录激活。大肠杆菌艾达。摩尔细胞。2005;20:117–129.

查看文章Google 学术搜索

36.阿卜杜拉希 M，侯赛尼 A. 链脲佐菌素。在毒理学百科全书（第三版）中。Wexler P，编辑。学术出版社;2014 年，第 402–404 页。

37.Ng TL、Rohac R、Mitchell A、Boal AK、Balskus EP。N-亚硝化金属酶构建链脲佐菌素的药效团。自然界。2019;566:94.PMID：30728519

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

38.Poncin K、Roba A、Jimmidi R、Potemberg G、Fioravanti A、Francis N 等。细胞内病原体流产布鲁氏菌中烷基化应激的发生和修复。纳特公社。2019;10:4847.PMID：31649248

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

39.Ro?i? S、Amouroux R、Requena CE、Gomes A、Emperle M、Beltran T 等。进化分析表明，DNA烷基化损伤是胞嘧啶DNA甲基转移酶活性的副产物。纳特·热内特。2018;50:452–459.PMID：29459678

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

40.威特金EM。大肠杆菌 B 的辐射敏感性：与细丝形成和噬菌体诱导有关的假设。美国国家科学院院刊，1967 年;57:1275–1279.

查看文章Google 学术搜索

41.Mielecki D， Wrzesiński M， Grzesiuk E. 微生物中烷基化 DNA 的诱导修复。2015年Mutat Res/Rev Mutat Res.;763:294–305.PMID：25795127

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

42.Morohoshi F， Hayashi K， Munakata N. 枯草芽孢杆菌 ada 操纵子编码两种 DNA 烷基转移酶。核酸研究 1990;18:5473–5480.

查看文章Google 学术搜索

43.Mielecki D， Saumaa S， Wrzesiński M， Maciejewska AM， ?uchniewicz K， Sikora A， et al. 恶臭假单胞菌 AlkA 和 AlkB 蛋白包含不同的防御系统，用于修复 DNA 的烷基化损伤——体内、体外和计算机研究。PLoS 一号。2013;8：e76198。PMID：24098441

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

44.科伦比 D，戈麦斯 SL。alkB 基因同源物在 Caulobacter crescentus 细胞周期中差异转录。细菌学杂志. 1997;179:3139–3145.

查看文章Google 学术搜索

45.Sedgwick B， Vaughan P. 对微生物中环境甲基化剂的广泛适应性反应。1991年《禁止令》;250:211–221.PMID：1944338

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

46.贝拉内克 DT.甲基和乙基加合物在用单官能烷基化剂烷基化后分布。1990年《反政府法》;231:11–30.PMID：2195323

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

47.Bargonetti J， Champeil E， Tomasz M. 丝裂霉素 C. J 核酸 DNA 加合物的差异毒性。2010;2010:698960.PMID：20798760

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

48.诺氟沙星诱导的DNA旋转酶切割复合物阻断大肠杆菌复制叉，导致体内双链断裂。分子微生物。2005;56:1416–1429.

查看文章Google 学术搜索

49.Modell JW、霍普金斯 AC、劳布 MT。Caulobacter crescentus 中的 DNA 损伤检查点通过与 FtsW 的直接相互作用来抑制细胞分裂。 基因开发 2011;25:1328–1343.

查看文章Google 学术搜索

50.Joseph AM、Nahar K、Daw S、Hasan MM、Lo R、Le TBK 等。C8连接的吡咯苯二氮卓类单体介导的DNA损伤修复的机制见解。RSC Med Chem. 2022;13:1621–1633.PMID：36561066

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

51.Lagage V， Chen V， Uphoff S. 适应延迟导致对氧化应激有反应的细菌发生突变。EMBO 代表 2023;24：e55640。PMID：36397732

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

52.Nakabeppu Y， Kondo H， Kawabata S， Iwanaga S， Sekiguchi M. 大肠杆菌 K12、O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶完整 Ada 调节蛋白的纯化和结构。生物化学杂志 1985;260:7281–7288.

查看文章Google 学术搜索

53.Singer B， Grunberger D. 诱变剂和致癌物的分子生物学。施普林格科学与商业媒体;2012.

54.莱莫特 PK，沃克 GC。ada的诱导和自动调节，ada是调节大肠杆菌K-12对甲基化剂反应的正向作用元件。细菌学杂志。 1985;161:888–895.

65 分钟Eddy SR. 加速配置文件 HMM 搜索。PLoS Comput Biol. 2011;7：e1002195。PMID：22039361

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

56.Jumper J、Evans R、Pritzel A、Green T、Figurnov M、Ronneberger O 等。使用 AlphaFold 进行高度准确的蛋白质结构预测。自然界。2021;596:583–589.

57.Mirdita M、Schütze K、Moriwaki Y、Heo L、Ovchinnikov S、Steinegger M. ColabFold：让所有人都能进行蛋白质折叠。Nat 方法。2022;19:679–682.PMID：35637307

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

58.Badrinarayanan A， Le TBK， Spille J-H， Cisse II， Laub MT. 双链断裂处理的全局分析揭示了解旋酶-核酸酶复合物 AddAB 的体内特性。PLoS遗传学。2017;13：e1006783。PMID：28489851

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

69 分钟McCarthy TV， Lindahl T. 烷基化 DNA 中的甲基磷酸三酯被 E 的 Ada 调节蛋白修复。大肠杆菌。核酸研究 1985;13:2683–2698.

查看文章Google 学术搜索

60.Olsson M， Lindahl T. 大肠杆菌中烷基化 DNA 的修复。甲基从O6-甲基鸟嘌呤转移到蛋白质半胱氨酸残基。生物化学杂志 1980;255:10569–10571.

查看文章Google 学术搜索

61.Takano K， Nakabeppu Y， Sekiguchi M. 大肠杆菌 Ada 调节蛋白的功能位点：通过氨基酸取代分析。J Mol Biol. 1988;201:261–271.

查看文章Google 学术搜索

62.Iyer LM， Koonin EV， Aravind L. DNA 病毒转录调节因子的广泛结构域洗牌及其对真菌 APSES 转录因子起源的影响。基因组生物学 2002;3：研究0012.1。PMID：11897024

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

63.Kupferschmied P， Péchy-Tarr M， Imperiali N， Maurhofer M， Keel C. 传感器蛋白中的结构域洗牌有助于植物有益假单胞菌蛋白原中昆虫致病性的进化。PLoS 病态。2014;10：e1003964。PMID：24586167

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

64.Cheatle Jarvela AM，欣曼 VF。转录因子的进化是改变后生动物发育基因调控网络的机制。EvoDevo的。2015;6:3.PMID：25685316

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

65.Joseph AM， Badrinarayanan A. 可视化诱变修复：细菌跨病变合成的新见解。FEMS 微生物学修订版 2020;44:572–582.PMID：32556198

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

66.沙尔达 M、巴德里纳拉亚南 A、塞沙萨伊 ASN。细菌非同源末端连接修复的进化和比较分析。基因组生物学卷。2020;12:2450–2466.PMID：33078828

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

67.Weissman JL， Fagan WF， Johnson PLF. 将高 GC 含量与原核基因组中双链断裂的修复联系起来。PLoS遗传学。2019;15：e1008493。PMID：31703064

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

68.吴晖， 张志， 胡 S， 于杰.关于真细菌基因组GC含量变异的分子机制.生物直接。2012;7:2.PMID：22230424

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

59 分钟Chimthanawala A， Badrinarayanan A. DNA 损伤下 Caulobacter crescentus 中 RecN 的活细胞荧光成像。在SMC复合物中：方法和协议。Badrinarayanan A，编辑。斯普林格;2019 年，第 239–250 页。

70.Paintdakhi A、Parry B、Campos M、Irnov I、Elf J、Surovtsev I 等。Oufti：用于高精度、高通量定量显微镜分析的集成软件包。分子微生物。2016;99:767–777.PMID：26538279

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

71.Quinlan AR，大厅 IM。BEDTools：一套灵活的实用程序，用于比较基因组特征。生物信息学。2010;26:841–842.PMID：20110278

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

42 分钟罗宾逊医学博士、麦卡锡 DJ、史密斯 GK。edgeR：用于数字基因表达数据差异表达分析的 Bioconductor 软件包。生物信息学。2010;26:139–140.PMID：19910308

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

73.Chimthanawala A， Parmar JJ， Kumar S， Iyer KS， Rao M， Badrinarayanan A. SMC 蛋白 RecN 驱动 RecA 细丝易位和重塑，用于体内同源性搜索。2022.

查看文章Google 学术搜索

74.Tran NT、Stevenson CE、Som NF、Thanapipatsiri A、Jalal ASB、Le TBK。Caulobacter crescentus 染色体上着丝粒结合蛋白 ParB 的允许区。核酸研究 2018;46:1196–1209.

查看文章Google 学术搜索

75.Harris CR、Millman KJ、van der Walt SJ、Gommers R、Virtanen P、Cournapeau D 等。使用 NumPy 进行数组编程。自然界。2020;585:357–362.PMID：32939066

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

76.Bardet AF， Steinmann J， Bafna S， Knoblich JA， Zeitlinger J， Stark A. 从 ChIP-seq 数据中以高分辨率鉴定转录因子结合位点。生物信息学。2013;29:2705–2713.PMID：23980024

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

47 分钟Letunic I， Bork P. 交互式生命之树 （iTOL）：用于系统发育树显示和注释的在线工具。生物信息学。2007;23:127–128.PMID：17050570

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索