《厦门免费医学论文发表-自噬的药理诱导通过降解免疫蛋白酶体亚基来减少巨噬细胞中的炎症》期刊简介
厦门免费医学论文发表-自噬的药理诱导通过降解免疫蛋白酶体亚基来减少巨噬细胞中的炎症
抽象
有缺陷的自噬与促炎性疾病有关。然而，自噬限制炎症的机制仍然难以捉摸。在这里，我们发现泛FGFR抑制剂LY2874455有效地激活自噬并抑制脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞中促炎因子的表达。多重蛋白质组学分析将免疫蛋白酶体鉴定为通过选择性自噬降解的底物，它是 20s 组成型蛋白酶体的特异性亚型。SQSTM1/p62 被发现是一种介导这种降解的选择性自噬相关受体。自噬缺陷或p62敲低阻断了LY2874455的作用，导致免疫蛋白酶体的积累和炎症反应的增加。免疫蛋白酶体抑制剂可以逆转自噬缺陷巨噬细胞中促炎因子的表达，证实了免疫蛋白酶体周转在自噬介导的抑制促炎因子表达中的关键作用。在小鼠中，LY2874455可防止LPS诱导的急性肺损伤和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎，并导致低水平的促炎细胞因子和免疫蛋白酶体。这些发现表明，免疫蛋白酶体的选择性自噬是通过先天免疫系统进行信号传导的关键调节因子。
数字
图4图5图6图1图2图3图4图5图6图1图2图3
引文： 周 J， 李 C， 卢 M， 江 G， 陈 S， 李 H， et al. （2024） 自噬的药理诱导通过降解免疫蛋白酶体亚基来减少巨噬细胞的炎症。PLoS 生物学 22（3）： 编号：E3002537。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537
学术编辑： Hans-Uwe Simon，瑞士伯尔尼大学
收到： 2023年2月5日;接受： 2024年2月5日;发表： 3月 6， 2024
版权所有： ? 2024 周等人这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。
资金： 这项工作得到了中国国家重点研发计划（2017YFA0506300）和国家自然科学基金（32022020（K.L.）和81902997（H.L.）资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
缩写： BMDM， 骨髓来源的巨噬细胞;COVID-19， 2019冠状病毒病;DSS， 葡聚糖硫酸钠;gRNA， 引导RNA;IEM的 苏木西林霉素;炎症性肠病， 炎症性肠病;ICU， 重症监护病房;iNOS， 诱导型一氧化氮合酶;LMP2， 低分子量多肽;LPS， 脂 多糖;锦 鲤 一氧化氮;潘普， 病原体相关分子模式;帕塞夫， 并行累积连续碎片;PBS， 磷酸盐缓冲盐水;下午 腹膜巨噬细胞;qRT-PCR， 定量实时聚合酶链反应;ROS， 活性氧;SARS-CoV-2， 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2;TNF-α， 肿瘤坏死因子-α
介绍
炎症是一种重要的免疫反应，可在病原微生物感染或组织损伤期间存活[1,2]。各种外在和内在炎症刺激包括感染性微生物（如病毒和细菌）、癌细胞或死细胞[3–6]。虽然炎症是宿主健康免疫反应的重要组成部分，但猖獗的炎症会导致各种病症，如败血症、类风湿性关节炎、急性肺损伤、慢性呼吸系统疾病、炎症性肠病（inflammatory bowel disease， IBD）、癌症、衰老，甚至死亡[7–16]。炎症相关疾病的最新例子是 2019 年冠状病毒病 （COVID-19），它是由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 引起的。重症COVID-19与炎症有关，细胞因子风暴综合征更为突出[17–25]。SARS-CoV-2感染后不受控制的巨噬细胞和单核细胞活化导致随后的炎症反应猖獗，导致急性呼吸窘迫综合征和终末器官损伤，包括肺纤维化[20,26,27]。抗炎因子疗法已被用于抑制COVID-19患者细胞因子风暴的发生[28–32]。除病毒外，致病性细菌感染也是炎症和死亡的重要原因。ICU中约50%的患者发生由细菌感染引起的重度脓毒症，脓毒症患者的死亡率为29%[33-35]。死亡主要归因于脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）（内毒素）的细胞毒性作用，LPS是革兰氏阴性菌外膜的一种成分[36–39]。LPS刺激的巨噬细胞在体外和体外都大量诱导各种炎症因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6），以及高水平的细胞内活性氧（ROS）[40\u201244]。
免疫蛋白酶体是巨噬细胞和非免疫细胞等免疫细胞炎症的重要介质，其表达由炎症信号触发[45–57]。免疫蛋白酶体是 20s 组成型蛋白酶体的特异性亚型，通过将 20s 蛋白酶体的 β1、β2 和 β5 亚基替换为不同的对应物，称为 β1i（低分子量多肽 2，LMP2）、β2i（多催化内肽酶复合物样-1，MECL-1，也称为 LMP10）和 β5i（低分子量多肽 2， LMP7），同时可以形成由经典和免疫蛋白酶体亚基组成的混合蛋白酶体[45,46,50,58]。最初，免疫蛋白酶体被发现可以将蛋白质水解成肽，作为抗原加载到MHC-I复合物中[47,59,60]。除抗原加工外，还发现免疫蛋白酶体可促进巨噬细胞极化[61]、脑部炎症[62\u201264]、糖尿病肾病[65]、炎性细胞因子的产生[66\u201270]、早产相关的子宫肌层炎症[71]、饮食诱导的动脉粥样硬化[72]、各种炎症和自身免疫性疾病[66\u201268、73–78]、结肠炎和结肠炎相关癌症[79–82]、病毒感染[83–90]、淋巴细胞活化[91,92]和心脏肥大[93,94]。人们强调了减少过量免疫蛋白酶体的必要性，免疫蛋白酶体抑制剂已成为治疗各种疾病（如血液系统恶性肿瘤、自身免疫性和炎症性疾病）的有前途的候选药物[95–102]。然而，尚不清楚免疫蛋白酶体的降解是否以及如何实现。
巨自噬（缩写为自噬）是一种分解代谢途径，用于通过双层膜囊泡（自噬体）进行大量转运，并最终降解溶酶体中的细胞内成分[103–106]。自噬途径在真核生物中高度保守，在各种生理和病理条件下起着重要作用[107\u2012109]。自噬途径是一个动态过程，通过选择性和大量降解细胞增生货物（如有毒蛋白聚集体、不必要或受损的细胞器以及细胞内病原体）来维持细胞稳态[110–113]。自噬功能障碍与多种促炎性疾病有关[114–118]，如类风湿关节炎、狼疮和IBD[119–122]。人类自噬基因ATG16L1、NOD2、IRGM、ATG5和ATG7的变异与包括克罗恩病在内的慢性炎症性疾病有关[123–127]。
因此，重要的是要阐明自噬是否以及如何靶向免疫蛋白酶体进行降解，以及这种降解参与限制炎症。在本研究中，我们确定泛FGFR抑制剂LY2874455是一种通过激活自噬起作用的有效抗炎治疗方法。我们利用LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应作为功能筛选，并将泛FGFR抑制剂LY2874455确定为有效的炎症抑制剂。我们发现，LY2874455对自噬的刺激促进了LPS诱导的巨噬细胞中免疫蛋白酶体的自噬降解。LY2874455抑制AKT-mTOR轴激活自噬，免疫蛋白酶体的自噬降解由受体SQSTM1/p62介导。LY2874455激活的自噬显着抑制了炎性细胞因子的产生，用抑制剂、ATG7 敲除或受体 p62 敲除阻断自噬可逆转这种抑制。LY2874455诱导的免疫蛋白酶体自噬降解的保护作用通过LPS诱导的急性肺损伤或葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的IBD的体内小鼠模型验证。这些发现表明，免疫蛋白酶体的选择性自噬降解是先天炎症信号传导的关键调节因子。
结果
pan-FGFR抑制剂LY2874455有效抑制LPS刺激的巨噬细胞中促炎因子的表达
由于许多疾病是由猖獗的炎症引起的，因此我们在LPS处理的巨噬细胞系RAW264.7中筛选了对炎症具有潜在抑制作用的化学物质。测量一氧化二氮（NO）水平，因为炎症期间NO的产生水平升高[128]。RAW264.7 细胞在 96 孔板中培养，并用 LPS 处理，总共有 5,618 种化合物，包括 FDA 批准的药物库（MedChemExpress、Cat.HY-L022,2669 化合物）、PI3K/Akt/mTOR 化合物库（MedChemExpress、Cat.HY-L015,456 种化合物）和激酶抑制剂库（MedChemExpress，Cat.HY-L009,2493化合物）。以高通量方式测量培养上清液中的NO浓度，每种化合物有3个重复孔。我们通过测量 NO 水平发现 LY2874455 是最有效的抗炎化学物质（仅显示了包括 LY2874455 在内的 27 种化学物质，其他几种化学物质的效果较小）（S1A 和 S1B 图）。LY2874455（（R）-（E）-2-（4-（2-（5-（1-（3,5-二氯吡啶-4-基）乙氧基）-1H-吲唑-3基）乙烯基）-1H-吡唑-1-基）乙醇）（图1A）是一种新型泛FGFR抑制剂，在实体器官癌患者中显示出良好的耐受性和活性[129,130]。除了抑制LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中NO的产生而不影响细胞活力（图1B，S1C和S1D）外，LY2874455还降低了LPS刺激的RAW264.7细胞中的ROS水平（通过DCFH-DA染色显示）（图1C和1D）。RAW264.7巨噬细胞中促炎细胞因子的水平，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的水平被显著诱导，LY2874455完全逆转了这种作用（图1E-1H和S1E-S1H）。在从小鼠[131,132]和人THP-1单核细胞（S1S和S1T图）获得的腹膜巨噬细胞（PMs）（S1I–S1M Fig）和骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）（S1N–S1R图）中反复观察到LY2874455抑制促炎因子的表达).除了mRNA水平外，LPS治疗诱导的炎症因子的蛋白质水平也通过LY2874455处理降低（S1U和S1V图）。NF-κB信号转导是一种典型的促炎调节因子，可介导各种炎性细胞因子的诱导[133–136]。含有 IKK-α、IKK-β 和 IKK-γ 的 IκB 激酶 （IKK） 复合物可激活炎症转录因子 NF-κB。IKK-β磷酸化抑制性IκBα，促进其多泛素化和蛋白酶体降解，然后释放经典的p65/p50异二聚体转位到细胞核，介导NF-κB靶基因的转录，包括各种细胞因子。RAW264.7细胞中LPS诱导的IKK-β蛋白水平降低了LY2874455（图1I）。在LPS刺激的RAW264.7细胞中，p65的活化形式（磷酸化）及其向细胞核的易位也被LY2874455逆转（图1J和1K）。
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图 1. LY2874455减轻了LPS刺激的巨噬细胞的炎症反应。
（A）LY2874455的化学结构。（B-K）用LPS（20ng / ml）刺激巨噬细胞RAW264.7细胞24小时，同时有或没有LY2874455（2μm）。（B） LY2874455 消除了 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞中 NO 的释放。测量培养上清液中的NO浓度，并与对照组相比显示为倍数变化。从3个独立的重复实验中获得了类似的结果。**P < 0.01，***P < 0.001。（C） LY2874455消除了LPS刺激的RAW264.7细胞中ROS的产生。用LPS或/和LY2874455处理后，洗涤RAW264.7细胞并用DCFH-DA（ROS探针）标记。通过流式细胞术对细胞DCFH-DA染色进行定量测量。从3个独立实验中获得了类似的结果。（D） 显示了一组代表性图像，显示了DCFH-DA探针对ROS的荧光染色。比例尺：10μm。（E-G）LY2874455抑制了LPS刺激的巨噬细胞中促炎细胞因子和NO合成酶的表达。qRT-PCR检测促炎细胞因子基因（IL-6、TNF-α）和NO合成酶（iNOS）的表达。（H-J）从 RAW264.7 细胞中提取总蛋白，用于蛋白质印迹分析 IL6、TNF-α、iNOS、IKK-β、p65 和磷酸化 p65 （p-p65） 的蛋白水平。对于免疫印迹显示的类似实验，进行了 3 个独立实验，并显示了代表性图像。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义（S1W-S1AE图）。（K） LY2874455抑制了LPS刺激的巨噬细胞中磷酸化p65的细胞核易位。用LPS（20ng / ml）刺激RAW264.7细胞2小时，有或没有LY2874455（2μm）。显示了 p65 和细胞核双重免疫染色 （DAPI） 的代表性图像。比例尺：10μm。*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，****：P < 0.0001，NS：无统计学差异。图中所示图表的基础数据可以在 S1 数据中找到。iNOS，诱导型一氧化氮合酶;LPS， 脂多糖;NO，一氧化氮;qRT-PCR，实时定量聚合酶链反应;ROS，活性氧。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.g001
综上所述，这些结果表明，泛FGFR抑制剂LY2874455有效抑制LPS刺激的巨噬细胞的炎症反应。
LY2874455抑制小鼠模型中的肺部和肠道炎症
在证明了LY2874455在细胞水平上对促炎因子产生的抑制作用后，我们分析了LY2874455是否会影响LPS诱导的急性肺损伤和败血症的炎症小鼠模型[137,138]或DSS诱导的IBD。对LPS刺激的小鼠肺部的组织学检查显示相当大的炎症细胞浸润，这是肺部炎症的典型症状（图2A）。值得注意的是，炎症细胞浸润减少了LY2874455（图2A）。LPS诱导的小鼠肺组织中高水平的促炎细胞因子IL-6也显着降低了LY2874455（图2B）。此外，还测量了LPS刺激的小鼠的存活分析，无论是否LY2874455治疗。对照组的存活率为100%，但LPS治疗组的存活率显著下降，而用LY2874455治疗的小鼠存活率显着增加（图2C）。这些结果表明，LY2874455抑制了LPS诱导的急性肺损伤和脓毒性脓毒症小鼠的炎症，并促进了LPS治疗小鼠的存活。
此外，DSS诱导的结肠炎模型小鼠用于分析LY2874455的潜在胃肠道保护作用（图2D和2E）。结果显示，LY2874455显着改善了DSS治疗小鼠结肠长度的减少（图2F）。为了确认LY2874455对肠道炎症和组织损伤的影响，对小鼠的结肠切片进行了组织学检查。DSS对肠绒毛粘膜造成严重损伤，LY2874455治疗有效减少了组织损伤（图2G和2H）。LY2874455处理的小鼠结肠组织中促炎细胞因子的表达水平降低（图2I-2L），这表明LY2874455对结肠炎模型小鼠炎症的抑制作用。LY2874455对炎症因子表达的抑制作用范围很广，因为它对polyI：C处理（S2A-S2C图）、细菌处理（S2D-S2F图）和H2O2处理（S2G-S2K图）。LY2874455还抑制了炎症小体介导的细胞因子（IL18）诱导（图2L），这与之前关于自噬调节炎症小体的研究一致。
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图 2. LY2874455抑制小鼠模型中的肺和肠道炎症。
（A） LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型LY2874455减少肺组织中的免疫细胞浸润。将两个月大的雄性C57BL / 6J小鼠进行LY2874455（1mg / kg）的胃内给药和/或LPS（10mg / kg）腹腔注射6小时（n = 6）。之后，采集右肺上叶进行HE染色，并显示代表性图像。比例尺：100μm。（B） LY2874455抑制LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型中炎性细胞因子IL-6的表达。2月龄雄性C57BL/6J小鼠按（A）处理，qRT-PCR分析肺组织（右肺下叶）IL-6的相对mRNA水平（n = 6）。（C）两个月龄的雄性C57BL / 6J小鼠用LY2874455（1mg / kg）进行胃内给药和/或腹腔注射LPS（35mg / kg）（n = 8）。生存测试结果以 Kaplan-Meier 生存曲线表示。LY2874455减少了DSS盐诱导的炎症性肠小鼠模型对肠道组织的炎症损伤。（D） 两个月龄的雄性 C57BL/6J 小鼠在胃内给药 3% DSS 7 天，从第三天开始用 LY2874455 （1 mg/kg） 给药 （n = 8）。（E） 记录和量化体重。（F） 冒号的长度由代表性图片和量化数据显示。（G） LY2874455 DSS诱发的结肠炎引起的肠损伤减少。对指定小鼠的结肠组织进行HE染色。显示了具有代表性的图像（n = 8）。比例尺：100μm。（H） 评估组织学评分。（I-L）LY2874455降低了DSS诱导的小鼠模型中诱导的炎性细胞因子基因的水平。通过qRT-PCR检查指定小鼠结肠中炎性细胞因子基因IL-17和TNF-α的表达（n = 8）。*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，****：P < 0.0001，NS：无统计学差异。图中所示图表的基础数据可以在 S1 数据中找到。DSS，硫酸葡聚糖钠;HE，苏木西林病素;LPS， 脂多糖;qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.g002
LY2874455降低了LPS刺激的巨噬细胞中免疫蛋白酶体的蛋白质水平
为了确定LY2874455抑制炎症反应的机制，对用LPS和LY2874455处理的RAW264.7巨噬细胞进行了基于质谱的蛋白质组学分析（S2表和图3A，上图）。改变的蛋白质的聚类表明免疫蛋白酶体特异性亚基通过LY2874455处理下调（图3A中下图中的箭头）。在LPS刺激等炎症条件下，免疫蛋白酶体特异性亚基β1i/LMP2、β2i/MECL-1/LMP10和β5i/LMP7取代了20s蛋白酶体的原始β1、β2和β5亚基，导致免疫蛋白酶体的形成（如图3B和3C所示）。免疫蛋白酶体抑制剂 ONX-0914 有效阻断 p65 的细胞核易位，证实了免疫蛋白酶体在 NF-κB 通路中的功能（S3A 图）。免疫蛋白酶体在NF-κB通路中的功能不是通过降解p-IκB-α（S3B图）。相反，免疫蛋白酶体可能通过调节促进 IκB-α磷酸化的上游信号转导步骤在 NF-κB 通路中发挥作用（S3C 图）。免疫蛋白酶体调节NF-κB通路的确切机制一直难以捉摸。我们通过分析NF-κB通路中的成分功能，分析了LY2874455或ONX-0914存在下的NF-κB通路。LY2874455 或 ONX-0914 导致 TRAF6 和 TAK1 蛋白水平降低（S3D 和 S3E 图）。这些结果表明，免疫蛋白酶体可能调控NF-κB通路中的TRAF6-TAK1期。此外，LY2874455 和 ONX-0914 的相同作用表明LY2874455通过免疫蛋白酶体抑制炎症途径。
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图 3. LY2874455降低了LPS刺激的巨噬细胞中免疫蛋白酶体特异性亚基的蛋白质水平。
（A）上图，基于质谱的蛋白质组学分析方法图，分析用LPS（20ng / ml）或/和LY2874455处理的RAW264.7细胞。原始质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴存储库存入ProteomeXchange联盟，数据集标识符为PXD038747。底部，蛋白酶体亚基蛋白质水平的热图。免疫蛋白酶体特异性亚基（箭头指向）的蛋白质水平通过LY2874455处理特异性降低。（乙、丙）20s组成型蛋白酶体和免疫蛋白酶体的特定亚基的图示和名称。（D） LY2874455降低了免疫蛋白酶体特异性亚基的蛋白质水平。在用 LY2874455 （2 μm） 和 LPS （20 ng/ml） 处理 24 小时的 RAW264.7 细胞中分析免疫蛋白酶体亚基 LMP2、LMP7、LMP10 和对照 GAPDH 的蛋白质水平。用密度值对印迹进行定量，并在 S3 图中分析统计显着性。（E） LY2874455对组成型蛋白酶体特异性亚基的蛋白质水平没有影响。分析组成型蛋白酶体亚基PSMB5、PSMB6、PSMB7和对照GAPDH的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（F） 获得 C57BL/6J 小鼠的 PM，并用 LPS （20 ng/ml） 和/或 LY2874455 （2 μm） 处理 24 h。提取总蛋白以检测免疫蛋白酶体亚基 LMP2、LMP7、LMP10 和 GAPDH 的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（G） 检测组成型蛋白酶体亚基 PSMB5、PSMB6、PSMB7 和 GAPDH 的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（H） 测定 RAW264.7 细胞中免疫蛋白酶体亚基 LMP2 和 LMP7 的酶活性。*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001。（一、日）LY2874455不能对具有抑制免疫蛋白酶体的巨噬细胞的炎症造成进一步的抑制。免疫蛋白酶体的特异性抑制剂 ONX-0914 抑制了 LPS 刺激的巨噬细胞中炎性细胞因子的表达。用LY2874455进行额外治疗不会引起进一步的炎症抑制。通过qRT-PCR检查用LPS，免疫蛋白酶体抑制剂ONX-0914（1μm）和LY2874455（2μm）处理24小时的RAW264.7细胞中炎性细胞因子基因（TNF-α和IL-6）的表达<。NS：无统计学差异。图中所示图表的基础数据可以在 S1 数据中找到。LPS， 脂多糖;PM，腹膜巨噬细胞;qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.g003
我们证实了蛋白质组学结果，发现LY2874455确实降低了LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中免疫蛋白酶体亚基LMP2、LMP7和LMP10的蛋白质水平（图3D）。相比之下，LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中组成型蛋白酶体亚基（PSMB1、PSMB5、PSMB6和PSMB7）的蛋白质水平不受LY2874455的影响（图3E和S3G）。在从小鼠中分离的PM中也获得了类似的结果（图3F和3G）。此外，LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中免疫蛋白酶体亚基（LMP2、LMP7和LMP10）的催化活性也降低了LY2874455（图3H和S3F）。据报道，ONX-0914是免疫蛋白酶体的特异性抑制剂[71]。我们通过测量促炎细胞因子 TNF-α 和 IL-6 的表达，证实 ONX-0914 有效抑制了 LPS 刺激的 RAW264.7 巨噬细胞的炎症反应（图 3I 和 3J）。更重要的是，用LY2874455进行额外治疗不会进一步抑制ONX-0914处理的巨噬细胞中促炎因子的表达（图3I和3J）。该结果表明，LY2874455抑制了促炎因子的表达，据推测，促炎因子是通过降低免疫蛋白酶体的蛋白质水平来介导的。
LY2874455激活的自噬
然后，我们试图确定LY2874455降低免疫蛋白酶体亚基（相当于免疫蛋白酶体）蛋白质水平的机制。据报道，泛素-蛋白酶体和自噬-溶酶体系统是细胞增生降解的两种主要机制[139]。在 2 种细胞内降解途径（蛋白酶体途径和自噬途径）中，大底物通常以自噬降解为靶点。我们使用蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂氯喹（CQ）和wortmannin（靶向III类PI3K，VPS34，以PtdIns为底物产生PtdIns3P，一种用于自噬体形成的脂质材料[140,141]）阻断这2条降解途径，然后分析免疫蛋白酶体亚基的蛋白质水平。检查蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂CQ和wortmannin对细胞活力的影响，并使用不影响细胞活力的浓度（S4A图）。蛋白质印迹分析表明，MG132不能抑制LY2874455诱导的PM或RAW264.7中LMP2和LMP7表达的降低（图4A和S4B），而LY2874455诱导的降低被CQ或wortmannin显着逆转（图4B，4C和S4C）。因此，这一结果表明，LY2874455诱导的免疫蛋白酶体降解比泛素-蛋白酶体系统更依赖于自噬。
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图 4. LY2874455激活了自噬过程。
（A）蛋白酶体抑制剂MG132不能阻断LY2874455诱导的免疫蛋白酶体亚基的还原。分析用LPS（20ng / ml），LY2874455（2μm）和MG132（5μm）处理的RAW264.7细胞中LMP2，LMP7和GAPDH的蛋白质水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（乙、丙）自噬抑制剂阻断LY2874455诱导的免疫蛋白酶体亚基的减少。在用LPS（20ng / ml），LY2874455（2μm）和自噬抑制剂氯喹（CQ，20μm）或wortmannin（100nM）处理的RAW264.7细胞中分析LMP2，LMP7和GAPDH的蛋白质水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（D） LY2874455增强的自噬通量。用 mCherry-EGFP-LC3 转染的 RAW264.7 细胞用 LPS （20 ng/ml） 或/和 LY2874455 再刺激 24 小时，并在共聚焦荧光显微镜下固定后监测细胞中 LC3 的点。较高水平的 mCherry-LC3 信号和较低水平的 EGFP-LC3 信号（合并时显示红色）表示受刺激的自噬通量，而 mCherry-LC3 和 GFP-L3 的信号水平相似（合并时显示黄色）表示自噬通量受阻。显示了来自 3 个重复实验的代表性图像。比例尺：10μm。（E）LY2874455促进了自噬体的形成。用对照或LY2874455（2μm）处理24小时的RAW264.7细胞通过透射电子显微镜进行分析。用箭头指向自噬体，并显示来自 3 个重复实验的代表性图像。比例尺：1μm。（F）LY2874455促进底物受体p62的自噬降解。用LPS（20ng/ml）和LY2874455（0.5,2,4μm）处理RAW264.7细胞，有或没有巴弗洛霉素A1（20nM）24小时，并通过蛋白质印迹分析p62，LC3和GAPDH的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（G） 在用 LY2874455 （2 μm） 和 LPS （20 ng/ml） 处理 24 小时的 RAW264.7 细胞中，通过蛋白质印迹检测 p62 和 GAPDH 的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（H） 通过蛋白质印迹法检测 （G） 中处理的 C57BL/6J 小鼠 PM 中 p62 和 GAPDH 的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（I） 通过蛋白质印迹检测 （G） 中处理的 C57BL/6J 小鼠的 BMDM 中 p62 和 GAPDH 的蛋白质水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（J） LY2874455抑制AKT-mTOR信号转导。通过蛋白质印迹法检测 （G） 中处理的 RAW264.7 细胞中 p-mTOR （Ser248）、mTOR、p-AKT （Ser473）、AKT 和 GAPDH 的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，****：P < 0.0001，NS：无统计学差异。BMDM，骨髓来源的巨噬细胞;LPS， 脂多糖;PM，腹膜巨噬细胞。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.g004
这些发现还表明，LY2874455可以诱导自噬。通过测量融合蛋白mCherry-EGFP-LC3的点信号进行自噬通量测定[142]。GFP信号在自噬体-溶酶体融合时被淬灭，但mCherry信号不受影响，因此红色信号表示自噬激活。LY2874455诱导的高强度mCherry信号和低GFP信号表明LY2874455激活了自噬（图4D）。透射电子显微镜显示，与对照细胞相比，用LY2874455处理的RAW264.7巨噬细胞中的自噬体要多得多（图4E）。p62/SQSTM1是一种自噬受体，可将底物（通常是泛素化的底物）募集到自噬体中，在自噬体与溶酶体融合后，它与底物一起降解[143]。自噬底物p62的蛋白质水平随着LY2874455的加入而降低，而自噬体标志物LC3-II的水平通过LY2874455处理而增加（图4F）。自噬抑制剂巴弗洛霉素 A1 逆转了LY2874455的作用（图 4F）。这些结果表明，自噬被LY2874455激活。LPS刺激导致p62的积累（图4G），表明LPS阻断了自噬，这与LPS降低自噬通量的观察结果一致（图4D，LPS细胞中的黄色信号）。LY2874455有效地降低了LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中p62的蛋白质水平（图4G）。在从小鼠中分离的PM和BMDM中，LY2874455还降低了p62的蛋白质水平（图4H和4I）。这些结果证实了LY2874455在激活自噬中的作用。
FGFR是跨膜RTK，被FGF激活形成二聚体，导致下游FRS2复合物的激活，随后激活PI3K/AKT/mTOR信号通路[144–147]。mTOR靶向ULK1，但通过抑制性磷酸化抑制复合物的激活[141,148]。我们发现LY2874455降低了AKT-mTOR信号的水平，如LPS诱导的激活后mTOR和AKT磷酸化的低水平所示（图4J）。这种LY2874455介导的AKT-mTOR信号通路抑制进一步表明其通过抑制AKT-mTOR信号转导来支持激活的能力。LY2874455抑制FGFR活性和下游PI3K/AKT/mTOR信号通路，导致自噬的释放和激活（如S4D图所示）。在成纤维细胞中，LY2874455还降低了自噬底物p62的蛋白质水平，同时增加了自噬体标志物LC3-II的蛋白质水平（S4E图）。另一种FGFR抑制剂ADZ4547也降低了p62、LMP2和LMP7的蛋白水平，并抑制了炎症因子的表达（S4F-S4I图）。我们筛选的其他抑制LPS诱导的促炎因子表达的化学物质（S1B图）显示出对p62自噬降解的促进或抑制（S4J图），表明LY2874455对抑制促炎因子表达和自噬诱导的影响是特异性的。
LY2874455通过自噬和选择性受体p62促进免疫蛋白酶体的降解
为了进一步验证LY2874455通过自噬促进免疫蛋白酶体降解的作用，在RAW264.7细胞中敲除自噬中必不可少的基因ATG7，导致自噬受阻，p62增加和LC3（LC3-II）活化形式的缺乏（S5A图）。然后，分析免疫蛋白酶体亚基LMP2和LMP7的蛋白水平。在 ATG7 敲除 （ATG7-KO） RAW264.7 细胞中，LMP2 和 LMP7 的蛋白水平与 WT 细胞相比增加（图 5A）。虽然 LMP2 和 LMP7 的蛋白水平在 WT 细胞中降低了 LY2874455，但在 ATG7-KO 细胞中这种作用被消除（图 5B 和 5C）。我们检查了自噬体和免疫蛋白酶体的定位。结果显示，自噬体标记物（LC3 点）与 LMP2 和 LMP7 共定位（图 5D）。总的来说，这些结果表明，LY2874455通过自噬诱导免疫蛋白酶体的选择性捕获和降解。
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图 5. LY2874455通过自噬和选择性受体p62促进免疫蛋白酶体的降解。
（A）自噬缺陷导致免疫蛋白酶体亚基水平升高。通过蛋白质印迹法检测 WT 或 ATG7 敲除 （ATG7-KO，通过 CRISPR-CAS9 方法） RAW264.7 细胞中 LMP2、LMP7 和 GAPDH 的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（乙、丙）LY2874455不能降低自噬缺陷巨噬细胞中免疫蛋白酶体亚基的蛋白质水平。用LPS（20ng / ml）单独或与LY2874455（2μm）一起处理WT或ATG7-KO RAW264.7细胞24小时。通过蛋白质印迹法分析 LMP2、LMP7、p62 和 GAPDH 的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（D） 与自噬体标志物 LC3 共定位的免疫蛋白酶体亚基。用LPS（20ng / ml）和LY2874455（2μm）刺激表达mCherry标记的LC3和GFP标记的LMP2或LMP7的RAW264.7细胞24小时。共聚焦荧光显微镜观察GFP-LMP2/GFP-LMP7与mCherry-LC3的共定位。比例尺：10μm。（E） LY2874455降低了选择性自噬受体p62的蛋白质水平。用LPS（20 ng/ml）和LY2874455（2 μm）处理RAW264.7细胞24 h，Western blot检测NBR1、Tollip、p62和GAPDH蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（F） 敲低 p62 导致免疫蛋白酶体亚基的蛋白质水平增加。在用LPS（20 ng/ml）和LY2874455（2 μm）处理24 h的对照shRNA或靶向p62的shRNA转染RAW264.7细胞中，通过蛋白质印迹检测LMP2、LMP7和GAPDH的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（G） 免疫蛋白酶体亚基泛素化。表达GFP-LMP2或GFP-LMP7的RAW264.7细胞用LY2874455（2μm）处理24小时。然后，用抗GFP亲和微珠对等量的蛋白质裂解物进行免疫沉淀，并用抗GFP和抗泛素抗体通过蛋白质印迹分析。（H， I） p62 通过其泛素结合 UBA 结构域与免疫蛋白酶体亚基相互作用。对表达 GFP-LMP2、GFP-LMP7 和 Flag 标记的全长 p62 或截短的 p62（泛素结合结构域 UBA 缺失）的 RAW264.7 细胞进行抗 GFP 亲和微球免疫沉淀，然后用抗 GFP 和抗 Flag 抗体通过蛋白质印迹进行分析。*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，****：P < 0.0001，NS：无统计学差异。LPS， 脂多糖;WT，野生型。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.g005
通常，底物选择性靶向自噬体是由将货物连接到自噬体的受体介导的，并且在自噬转移到溶酶体后与底物一起降解。然后，我们分析了 3 个先前报道的受体，发现 p62 在 RAW264.7 细胞中的行为与 LMP2 和 LMP7 相似，通过 LPS 处理增加，并通过进一步LY2874455处理降低（图 5E）。RAW264.7 细胞中 p62 的敲除导致 LMP2 和 LMP7 的蛋白水平升高（图 5F 和 S5B 图）。这些结果表明，p62是免疫蛋白酶体自噬降解的受体蛋白。底物泛素化是自噬受体 p62 选择性靶向所必需的。事实上，LMP2 和 LMP7 被泛素化（图 5G）。此外，LMP2 和 LMP7 可以与 p62 相互作用，并且这种相互作用被证明依赖于 p62 的 UBA 结构域（泛素结合的泛素相关结构域）（图 5H 和 5I）。因此，这些结果表明p62是介导免疫蛋白酶体自噬降解的受体。
LY2874455通过自噬途径抑制促炎因子的表达
既然我们已经证明LY2874455诱导了免疫蛋白酶体的自噬降解，那么我们就检查了LY2874455对促炎因子表达的抑制作用是否通过自噬途径发生。LY2874455消除了 RAW264.7 细胞中 LPS 诱导的 ROS 水平升高（由 DCFH-DA 探针显示）;然而，这种消除被自噬抑制剂wortmannin阻断（图6A）。此外，与LY2874455处理的RAW264.7细胞（图6B和6C）、小鼠分离的原代巨噬细胞（图6D和6E）和BMDM（S6A和S6B图）相比，在wortmannin处理的RAW264.7细胞中观察到iNOS和IL-6的mRNA水平增加。这些结果表明，LY2874455通过诱导自噬抑制促炎因子的表达。ATG7敲除或p62敲除导致LPS和LY2874455存在下iNOS和IL-6水平升高的观察进一步证实了这一发现（图6F和6G）。LY2874455抑制对NF-κB通路的影响也显示出依赖于自噬和受体p62，如在自噬（S6C-S6F图）或p62缺陷（S6G和S6H图）巨噬细胞中，LY2874455不能抑制NF-κB通路。自噬抑制剂逆转了LY2874455的作用（S6J和S6K图），进一步表明LY2874455通过自噬抑制促炎因子的表达。
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图 6. LY2874455通过自噬途径抑制炎症。
（A）自噬抑制剂逆转了LY2874455对LPS刺激的巨噬细胞ROS减少的影响。RAW264.7细胞在用LPS（20ng / ml），LY2874455（2μm）和wortmannin（100nM）处理24小时后用ROS探针DCFH-DA染色。通过流式细胞术对细胞ROS进行定量测量。（乙、丙）自噬抑制剂逆转了LY2874455在LPS刺激的巨噬细胞中的作用。通过qRT-PCR检查治疗为（A）的RAW264.7细胞中炎性细胞因子基因（iNOS和IL-6）的表达。（D、E）通过qRT-PCR检查PM中炎性细胞因子IL-6和iNOS的表达，如（A）所示。（F）自噬缺陷逆转了LY2874455在炎性巨噬细胞中的作用。用LPS（20ng / ml）和LY2874455（2μm）处理WT或ATG7敲除（ATG7-KO）RAW264.7细胞24小时。通过qRT-PCR检查iNOS和IL-6的表达，并表示为与WT细胞中的值相比的倍数变化。（G） 敲低 p62 逆转了LY2874455在炎性巨噬细胞中的作用。对照（sh-CTL，对照shRNA）或p62敲低（sh-p62，p62靶向shRNA）RAW264.7细胞用LPS（20ng / ml）和LY2874455（2μm）处理24小时。通过qRT-PCR检查iNOS和IL-6的表达，并表示为与对照细胞中的值相比的倍数变化。（H-J）免疫蛋白酶体抑制剂ONX-0914抑制了自噬缺陷巨噬细胞中促炎因子的增强产生。用LPS（20ng / ml）和ONX-0914（1μm）处理的WT或ATG7敲除（ATG7-KO）RAW264.7细胞。qRT-PCR检测iNOS和炎性细胞因子基因（IL-6和TNF-α）的表达。*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，****：P < 0.0001，NS：无统计学差异。图中所示图表的基础数据可以在 S1 数据中找到。iNOS，诱导型一氧化氮合酶;LPS， 脂多糖;PM，腹膜巨噬细胞;qRT-PCR，实时定量聚合酶链反应;ROS，活性氧;WT，野生型。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.g006
这些结果与LY2874455诱导免疫蛋白酶体自噬降解的数据一起表明，自噬缺陷细胞中促炎因子表达的增加可能是由自噬底物免疫蛋白酶体的积累引起的。然后使用免疫蛋白酶体特异性抑制剂ONX-0914处理ATG7-KO RAW264.7细胞，并分析iNOS和促炎细胞因子IL-6和TNF-α的表达水平。结果表明，免疫蛋白酶体抑制剂ONX-0914显著降低了自噬缺陷细胞中促炎因子的表达（图6H-6J和S6I图），表明自噬缺陷细胞中活化的免疫蛋白酶体诱导了促炎因子的表达。在 LMP7 敲低细胞中，ONX-0914 不抑制炎症因子的表达水平（S6L 和 S6M 图），表明 ONX-0914 对免疫蛋白酶体的特异性作用。
因此，这些结果表明，LY2874455对促炎因子表达的抑制作用取决于免疫蛋白酶体自噬降解的诱导。
讨论
研究发现，自噬的破坏会导致具有炎症成分的疾病，包括感染、自身免疫和代谢紊乱[149–153]。自噬通过靶向炎症介质（包括炎症小体、STING和MAVS）来识别胞质病原体相关分子模式（cytosolic pathori-associated molecular pattern， PAMP）[154–162]。在本研究中，我们揭示了泛FGFR抑制剂LY2874455抑制促炎因子产生的作用和机制。在LPS刺激的巨噬细胞中，诱导免疫蛋白酶体，然后触发NF-κB介导的炎症反应，导致促炎细胞因子ROS和NO的强力表达和产生。在LY2874455存在下，自噬途径被激活并捕获免疫蛋白酶体，这种作用是由识别免疫蛋白酶体上泛素信号的选择性受体p62介导的。这种自噬降解降低了免疫蛋白酶体的丰度，从而阻断了NF-κB的活性，并最终抑制了炎症。我们在这里的工作揭示了一种自噬抑制炎症的新机制，这可能大大有助于开发炎症性疾病的新治疗方法。
目前尚不清楚免疫蛋白酶体的诱导和自噬降解是如何协调的。我们假设 LPS 等炎症刺激可能会诱导免疫蛋白酶体的表达、组装和丰度增加，而 LPS 抑制自噬途径，如受体 p62 的蛋白质水平增加所示（图 4F-4I）。这一结果表明，LPS不仅诱导免疫蛋白酶体的产生，而且还禁止其自噬降解，从而导致免疫蛋白酶体的积累并最终导致猖獗的炎症。高水平的免疫蛋白酶体诱导的炎症提供了有效的信号，提醒宿主注意有毒刺激，从而激活宿主反应[57]。然而，宿主受益于强烈的炎症诱导信号，同时遭受炎症诱导的损伤，尤其是在严重/急性或慢性炎症条件下。因此，中度和可控炎症之间的平衡对于维持宿主健康至关重要。在这里，我们提出了一种机制来解释自噬如何发挥作用来打破猖獗的炎症。巨噬细胞中免疫蛋白酶体的选择性自噬降解抑制了促炎因子的产生（S6R图）。
一项I期临床研究显示，LY2874455是一种新型泛FGFR抑制剂，在实体器官癌患者中具有良好的耐受性、吸光度和活性[130]。因此，LY2874455可能是炎症相关疾病（如败血症和克罗恩病）的良好治疗候选药物。
除了调节急性炎症外，自噬还被证明可以积极缓解慢性炎症相关的神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病和抑郁症[163,164]。绝大多数研究将神经元中的自噬与退行性疾病联系起来;然而，只有零星的炎症通过自噬的暗示。最近，研究表明LPS可以损害自噬并缓解小胶质细胞（中枢神经系统中一种特殊类型的巨噬细胞）炎症机制的自噬抑制[165–167]。自噬缺陷型小胶质细胞的吞噬能力受损，促炎细胞因子过多产生，可导致突触功能障碍、神经元死亡和神经发生抑制[168]。研究免疫蛋白酶体的自噬降解是否在小胶质细胞中显示出抗炎作用，以及这种失调是否以及在多大程度上导致神经退行性疾病将是有趣的。
谨慎地，虽然在某些情况下，有缺陷的自噬会导致过度炎症，从而导致疾病病理学，但在某些情况下，炎症升高会促进模型动物的存活。例如，髓系特异性敲除自噬基因（RB1CC1、ATG5、ATG7或ATG14）可增加肺部炎症，并促进动物对流感病毒感染的耐药性[169]。此外，在疱疹病毒感染的动物中，髓系特异性敲除几种自噬基因（RB1CC1、Beclin1、ATG3、ATG5、ATG7、ATG14或ATG16L）会导致炎症升高，并阻止病毒因潜伏期而重新激活[170]。我们假设，对于诱导正常（略高于基线）炎症的病原体，自噬缺乏会导致炎症升高，这有利于宿主识别和对入侵病原体的反应，而对于诱导高水平炎症的病原体，自噬缺乏会进一步增加炎症，并且这种炎症会导致对宿主的损害。也就是说，尽管我们表明自噬介导的免疫蛋白酶体减少对LPS诱导的肺损伤和DSS诱导的炎症性肠损伤的动物有益，但在某些情况下，免疫蛋白酶体的自噬降解可能会削弱宿主对病原体的适当反应。因此，需要专门研究免疫蛋白酶体的自噬降解是否以及如何在衰老、癌症、心血管疾病、神经退行性变和感染等炎症相关疾病中发挥作用。
在各种条件下，选择性自噬的功能是通过受体发生的，这些受体特异性识别某些类型的底物，并同时与驻留在自噬体膜中的脂质化LC3/Atg8相互作用[171,172]。底物的降解主要表明自噬的特定作用[173]。自噬底物的性质因细胞类型和刺激信号而异[110,174]。在我们的案例中，通过自噬选择性靶向免疫蛋白酶体解释了自噬对巨噬细胞炎症的抑制作用。自噬阻断诱导免疫蛋白酶体的积累并伴有强烈的炎症反应，免疫蛋白酶体抑制剂可以完全逆转，这一结论得到了加强（图6H-6J）。这一发现表明，至少在这项工作所研究的背景下，免疫蛋白酶体的自噬降解是自噬在炎症抑制中的作用的主要原因。
介导免疫蛋白酶体自噬降解的受体是 p62，但不是 NBR1 或 Tollip，如本研究所示。关于自噬中受体功能的一个有趣问题是为什么存在这么多受体。例如，p62、NBR1、Tollip 和 OPTN 在聚集性（蛋白质聚集体的自噬）中发挥作用;BNIP3L、FUNDC1、BNIP3、AMBRA1、BCL2LI3、FKBP8、CHDH、DISC1、PHB2 和线粒体自噬（线粒体自噬）中的心磷脂功能;FAM134B、Sec62、RTN3、CCPG1、ATL3 和 TEX264 在内质网（内质网自噬）中发挥作用;p62、NBR1和PEX3在自噬（过氧化物酶体自噬）中发挥作用[110,143,174,175]。受体的冗余可能反映了多细胞生物体内自噬的特异性和细致的调控和功能。换句话说，某些受体在特定类型的细胞中起作用。阐明自噬功能的位置（细胞类型）、时间（激活或抑制）以及如何（底物靶向）可以提高我们对自噬作为动态和多功能过程的内在性质的了解。免疫蛋白酶体亚基是多泛素化的，并且它们与 p62 的结合依赖于 62 的泛素结合域，这表明泛素链是自噬体靶向免疫蛋白酶体的信号。鉴定负责免疫蛋白酶体泛素化的泛素连接酶可能有助于确定泛素连接酶如何直接或间接促进 p62 对免疫蛋白酶体的特异性识别。有趣的是，已发现p62和其他受体介导的自噬是构成蛋白酶体自噬降解的原因[176–178]。
自噬不仅具有降解途径的功能，还具有促进细胞外分泌的功能[179]。在对软骨细胞的研究中[180]，作者发现生长板软骨细胞诱导自噬并调节II型胶原（Col2）的分泌。我们推测，在生长条件下的软骨细胞中，自噬被激活并且是细胞分泌某些因子所必需的。
因此，自噬在不同类型的细胞中的功能不同。有趣的是，FGF信号传导（FGF18和FGFR4）激活软骨细胞中的自噬，而在我们的案例中，FGF信号传导抑制（FGFR抑制剂LY2874455治疗）激活自噬。FGF信号转导的主要功能下游激酶可能在不同类型的细胞中不同，例如软骨细胞中的JNK，而巨噬细胞中的AKT和mTOR可能不同（图4J和S4D）。
总之，我们的研究结果描述了在巨噬细胞异常炎症的背景下免疫蛋白酶体的选择性自噬降解，并支持通过选择性自噬调节炎症的新机制（S6R图）。本研究探讨了选择性自噬与炎症之间的串扰，这对建立炎症性疾病的有效疗法具有重要意义。
材料和方法
抗体和试剂
从Abcam获得以下抗体：抗SQSTM-1/p62（ab109012）、抗LMP2（ab3328）、抗LMP7（ab3329）、抗泛素（ab7780）、抗NBR1（ab55474）、抗ATG7（ab133528）、抗Mtor（ab87540）、抗LMP10（ab183506）、抗PSMB5（ab90867）、抗GAPDH（60004-1-Ig）、抗p65（10745-1-AP）。抗 PSMB1 （11749-1-AP） 和抗 PSMB2 （15154-1-AP） 购自 Proteintech。抗LC3（2775S）、抗磷酸化AktSer473（4060S）、抗磷酸化mTORSer2448（2971S）、抗p70S6K（9202S）、抗磷酸化-p70S6KThr421/Ser424（9204S）、抗Akt（4685S）和抗TNF-α（11948S）的抗体均来自Cell Signaling Technology。phospho-NF-kB p65 （Ser536） （bs-0982R） 抗体和抗 IL6 （bs-0782R） 购自 Bioss。抗磷酸化IκB-α （Ser32） （AP0707）、抗TRIF抗体（A1155）、抗MYD88 （A0980）、抗TRAF6抗体（A16991）、抗TAK1 （A19077）、抗TAB2抗体（A9867）均来自ABclonal Technology。抗IL1β （ab216995） 和抗 IL18 （ab207323） 抗体来自 Abcam。二抗 HRP 偶联的抗兔 （D-110058） 和 HRP 偶联的抗小鼠 （D-110087） 来自 BBI Life Sciences。荧光偶联（488 和 594）二抗购自 Invitrogen。LY2874455、多米芬（溴化物）、十六烷基吡啶（氯化物一水合物）、芬替康唑（硝酸盐）、AZD4547和ULK1-IN-2来自MCE，溶于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。LPS（E.大肠杆菌，血清型 055：B5）购自 Sigma。H型2-2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯 （DCFH-DA） （S0033S） 和 NO 检测试剂盒 （S0021S） 购自碧洋泰。蛋白酶抑制剂混合物购自Sigma（罗氏11697498001）。聚肌苷-聚胞苷酸 （Poly（I：C）） （HY-107202） 购自 MCE。
巨噬细胞培养和分离
RAW264.7巨噬细胞在RPMI-1640（Sigma）中与10%胎牛血清（Gibco）一起培养，并维持在湿润的5%CO中2从C57BL/6J小鼠中分离PM和BMDM，在小鼠处死和BMDM分离之前，向6至8周龄的小鼠注射3%巯基乙酸盐。将从腹水中分离出来的细胞接种在含有RPMI-1640培养基的细胞板中，并使其粘附4至6小时。将来自骨髓的细胞接种在用含有 M-CSF（10 ng/ml，Sigma）的完全培养基孵育RPMI1640细胞板中，并使其粘附 7 天。贴壁细胞被认为是BMDM。
质粒构建和DNA转染
将靶基因p62、LMP2、LMP7分别克隆到pEGFP-C1载体中。将靶基因p62和p62△UBA分别克隆到pFlag-CMV2载体中。将靶基因LC3克隆到pLVX-mCherry-C1载体中。将靶向p62的sh-RNA序列（CCGGGTCTCTCTACAGATGCCAGAATCCTCGAGGATTCTGGCATCTGTAGAGACTTTTTG）克隆到PLKO.1载体中。将靶基因ATG7的引导RNA（gRNA）序列（TCTGCCCACCCGCTTGACGT）克隆到PX330载体中。将靶基因敲除位点的上游（800 bp）和下游（800 bp）序列和选择标记（puro）克隆到pUC19载体中。根据制造商推荐的方案 （Polyplus），使用 jetprime 试剂将无内毒素的质粒转染到细胞中。
ROS检测
对于细胞内ROS测量，用LY2874455和/或LPS处理24小时的细胞用PBS洗涤3次，并在37°C下在黑暗中与10μmH 2-DCFH-DA一起孵育30分钟。然后，将细胞洗涤 3 次并通过刮擦收集。将收集的细胞重悬于PBS中，并立即在Becton Dickinson FACS上读取其与细胞内DCFH-DA水平相对应的荧光强度。DCFH-DA信号也使用荧光显微镜（Zeiss Apotome）可视化，并用Image J进行量化。
一氧化氮 （NO） 浓度测量
根据试剂盒的手册（Beyotime），通过Griess反应测定培养基中NO衍生物亚硝酸盐的水平。反应后，用多功能酶标仪（Biotek）在540nm处测量上清液中的信号。
实时荧光定量聚合酶链反应分析（qRT-PCR）
使用Fast Pure cell/Tissue Total RNA Isolation Kit （Nanjing Vazyme Biotek）从细胞系、原代细胞或组织中提取总RNA。使用 Superscript II 逆转录酶试剂盒 （Nanjing Vazyme） 从 1 μg RNA 中逆转录 cDNA。根据制造商推荐的方案，使用SYBR Green试剂（南京Vazyme）将生产用作定量实时聚合酶链式反应（PCR）的模板。用于PCR扩增的引物序列如S1表所示。GAPDH作为内部归一化控制。
蛋白酶体活性分析
亚基选择性荧光肽底物用于通过监测底物随时间变化的水解速率来测量单个催化亚基的催化活性。简而言之，使用被动裂解缓冲液（25 mM Tris（pH 7.5），100 mM Nacl，5 mM ATP，0.2%NP40,20%甘油）制备蛋白质裂解物，并在20S蛋白酶体测定缓冲液（20 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，0.035%SDS（pH 8.0））中稀释。通过添加蛋白酶体底物引发酶反应。底物和浓度如下：Ac-ANW-AMC（β5i，100μm），Ac-PAL-AMC（β1i活性，100μm）和Ac-Arg-Leu-Arg-AMC（β2i活性，100μm）。将混合物在 37°C 下孵育 2 小时。使用多功能酶标仪 （Biotek） 分别在 345 nm 和 445 nm 的激发和发射波长下测量荧光信号。
免疫印迹
用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞或组织（Roche 11697498001）。根据制造商推荐的方案，通过BCA蛋白检测试剂盒（Sigma）对蛋白质进行定量。定量后，对蛋白质沉淀物进行SDS-PAGE处理。将蛋白质转移到 PVDF 膜上，并在室温下用 0.1% 吐温-20 （TBST） 在 Tris-HCl 缓冲盐水 （TBS） 中封闭在 5% 脱脂牛奶中 1 小时，然后将一抗 （S1 Table） 在 4°C 下孵育过夜。 然后，将膜与二抗（S1表）在室温下孵育1小时。使用 Chemidoc MP 成像系统 （Bio-Rad） 获取信号。
免疫沉淀
在含有 0.25% TX-100、1% NP-40、50 mM Tris-HCl （pH 8）、150 mM NaCl 和 1 mM EDTA 的缓冲液中裂解细胞。将裂解物调节浓度为 1 至 2 mg/ml 和体积，并与 GFP-Beads（深圳运动生活科技公司）在 4°C 下孵育过夜。然后，将样品在 4°C 下以 2,000 rpm 离心 3 分钟。用洗涤缓冲液A（50mM tris-HCl（pH 7.5），100mM氯化钠和2mM EDTA）洗涤沉淀5次。在RIPA缓冲液（50 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、0.1% SDS、1% TritonX-100 和 0.5% 脱氧胆酸钠）中收集结合蛋白，并将沉淀的蛋白进行 SDS-PAGE。
免疫荧光
将盖玻片上生长的细胞用 4% 多聚甲醛在 PBS 中固定 10 分钟，然后用 0.1% TritonX100 透化 10 分钟，并在室温下用 3% BSA 孵育 1 小时。然后将细胞与一抗一起孵育，然后进行 PBS 洗涤，并与二抗（驴抗小鼠和抗兔 Alexa Fluor 488 或 594）一起孵育。DAPI用于对DNA进行染色。图像是使用蔡司LSM 880拍摄的。
基于质谱的蛋白质组学分析
原始质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴存储库存入ProteomeXchange联盟，数据集标识符PXD038747，截至发布之日已公开提供。
蛋白质提取。使用高强度超声处理器 （Scientz） 在裂解缓冲液（8 M 尿素、1% 蛋白酶抑制剂混合物）中对样品在冰上超声处理 3 次。通过在 4°C 下以 12,000 g 离心 10 分钟除去剩余的碎片。最后，收集上清液，并根据制造商的说明用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。
胰蛋白酶消化。为了消化，将蛋白质溶液在 56°C 下用 5 mM 二硫苏糖醇还原 30 分钟，并在室温下在黑暗中用 11 mM 碘乙酰胺烷基化 15 分钟。然后通过加入 100 mM TEAB 至尿素浓度小于 2 M 来稀释蛋白质样品。最后，在第一次消化过夜时以 1：50 的胰蛋白酶与蛋白质质量比加入胰蛋白酶，在第二次 4 小时消化时以 1：100 的胰蛋白酶与蛋白质质量比加入胰蛋白酶。
LC-MS/MS分析。将胰蛋白酶肽溶于溶剂A（0.1%甲酸，0.1%乙腈/水溶液）中，直接上样到自制的反相分析柱（25 cm长，内径75/100 μm）上。在70分钟内以6%至24%溶剂B（0.1%甲酸的乙腈溶液）的梯度分离肽，在14分钟内以24%至35%的梯度分离肽，并在3分钟内攀升至80%，然后在最后3分钟内保持80%，所有这些都在纳米洗脱UHPLC系统（Bruker Daltonics）上以450 nL/min的恒定流速进行。对肽进行毛细管源，然后进行 timsTOF Pro（布鲁克道尔顿）质谱分析。施加的电喷雾电压为 1.75 kV。在TOF检测器上分析前体和碎片，MS/MS扫描范围为100至1,700 m/z。timsTOF Pro 在并行累积串行分片 （PASEF） 模式下运行。选择电荷状态为0至5的前驱体进行碎裂，每个周期采集10次PASEF-MS/MS扫描。动态排除设置为 30 秒。
数据处理协议。使用MaxQuant搜索引擎（v1.6.6.0）处理生成的MS/MS数据。根据与反向诱饵数据库连接的Mus_musculus_10090_SP_20191115（17,032 个条目）搜索串联质谱图。胰蛋白酶/P 被指定为切割酶，允许多达 2 个缺失的裂解。在第一次搜索中，母离子的质量容差设置为20 ppm，在主搜索中设置为20 ppm，碎片离子的质量容差设置为0.02 Da。 Cys上的脲甲基被指定为固定修饰，蛋白质N端的乙酰化和Met上的氧化被指定为可变修饰。FDR调整为<1%。
细胞老化诱导
NIH3T3 细胞在补充有 10% FBS 的 DMEM 中培养。将 NIH3T3 细胞胰蛋白酶化并悬浮于磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 中，并用 H2O2（400μm在PBS中）在37°C下45分钟。2O2用 PBS 洗涤 3 次终止治疗。然后，将 NIH3T3 细胞用完全培养基培养 3 天。
动物实验
所有涉及动物的手术均按照相关指南和规定进行，并经四川大学华西医院伦理委员会批准（批准文号20220406005）。
诱导 ALI（急性肺损伤）
将8周龄雄性小鼠随机分为3组（对照组，LPS（10mg/kg）组，LPS（10mg/kg）+LY2874455（1mg/kg）组，每组6只）。小鼠在注射LPS的同时用生理盐水或LY2874455（1mg / kg）进行胃内给药（10mg / kg）。注射LPS六小时后，小鼠被杀死并切除肺部。随后将肺组织用于实时荧光定量PCR测定和苏木西林霉素（HE）染色。
脓毒症的诱导
将8周龄的雄性小鼠随机分为3组，每组8只。为了评估LY2874455对小鼠存活的影响，通过单次腹腔注射细菌内毒素（LPS，35 mg / kg）诱导内毒素血症，例如在注射LPS前2小时给予LY2874455（1mg / kg）。未接受LY2874455的小鼠接受了用生理盐水作为对照的模拟注射。在LPS攻击后96小时内监测动物的存活率。
结肠炎的诱发
通过添加3%DSS（m.w.36,000至50,000;MP Biomedicals， Solon， Ohio， United States of America）到饮用水，从第 0 天开始。在DSS治疗的第三天，用生理盐水或LY2874455（1mg / kg）对小鼠进行胃内给药5天。此后，给小鼠定期饮水。在整个实验过程中，每天测量体重。在第 9 天，小鼠被杀死并取出肠子。随后使用肠组织进行实时荧光定量PCR测定、蛋白质印迹测定和HE染色。
Poly （IC） 型号
将聚肌苷-聚胞苷酸（聚（I：C））（50μg/ ml）和LY2874455（2μm）施加BMDM24小时，并分析炎症细胞因子的表达水平qRT-PCR。
透射电子显微镜
巨噬细胞用0.1M磷酸盐缓冲液洗涤3次，持续15分钟，然后固定在2%四氧化锇水溶液中1小时，然后用去离子水洗涤3次，每次洗涤15分钟。然后用 2% 醋酸铀酰染色样品 30 分钟，并通过分级醇（50% 至 100%）和 100% 丙酮各脱水 15 分钟。之后，将样品包埋EPON 812树脂中，分别在37°C、45°C、60°C下固化24 h。通过超薄切片机（Leica）获得超薄（70 nm）切片，并用2%醋酸铀酰和0.3%柠檬酸铅染色。使用Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜（FEI公司）拍摄样品的电子显微镜图像。显示了至少 3 个独立重复实验的代表性图像。
统计分析
本研究中显示的所有数据都是来自至少 3 个独立重复实验的代表性结果。Shapiro-Wilk 检查数据以分析正态分布。定量数据表示为至少 3 个生物重复± SD 的平均值。使用 Prism5 进行统计分析。采用普通的单因素或双因素方差分析与土耳其多重比较检验，或双尾配对或非配对学生t检验，或Dunn's非参数检验（用于多组比较）和Mann-Whitney检验（2组比较）确定统计学意义（*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，NS：无统计学差异）。
支持信息
LY2874455抑制了LPS刺激的巨噬细胞的炎症。
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S1 图一个BRAW264.7型051015相对 amount 为 NOLPS + 化合物5 ： LY2874455***********32104+++---LY2874455LPS系列下午IL6型相对 mRNA 表达******下午TNF型-α64208相对 mRNA 表达******+++---LY2874455LPS系列1:FRAX48610：十六烷基吡啶（氯化物一水合物）19：芬替康唑（硝酸盐）2：氯醌酮11：伏立康唑20：茴香二酮3：卢立康唑12：己基间苯二酚21：OSI-9304：SKLB100213：硝基喹啉22：小白菊内酯5：LY287445514：TCS-PIM的-1-4一个23：粘菌素（硫酸盐）6：沙美特罗（辛那福酸）15：氯己定24：联苯苄唑7：磺康唑（硝酸盐）16：卡洛芬25： 一个419259（三盐酸盐）8：多米芬（溴化物）17：卡泊芬净（醋酸纤维）26：氯喹醛醇9：异丙酸-318：泊沙康唑278 秒-萘基PP1LPS系列LY2874455++-00.511.5相对论E细胞活力++++0.20.5125(微米)NO 的相对量LPS系列LY2874455++-0++++0.20.5125(微米)12345--*********CD我JRelative mRNA 表达01020304050我六楼********+++---LY2874455LPS系列（CTL：肌动蛋白）TNF型-αRelative mRNA 表达012345********+++---LY2874455LPS系列（CTL：肌动蛋白）iNOS的Relative mRNA 表达0103040300600********+++---LY2874455LPS系列（CTL：肌动蛋白）20400500β-肌动蛋白+++---LY2874455LPS系列（千达）37IL6型TNF型-α2525iNOS的150KLiNOS的加普德哈+++---LY2874455LPS系列下午10008006004002000下午下午iNOS的相对 mRNA 表达******+++---LY2874455LPS系列加普德哈iNOS的+++---LY2874455LPS系列BMDM的******BMDM的IL6型604020080相对 mRNA 表达+++---LY2874455LPS系列BMDM的TNF型-α501015相对 mRNA表达******+++---LY2874455LPS系列相对 mRNA表达BMDM的iNOS的300002000010000040000******+++---LY2874455LPS系列EFGH**+-LY287445501234相对expres蛋白质的离子（ratio 为 GAPDH）++LPS系列iNOS的***--下午NOPQM
蛋白质的相对表达（与GAPDH的比率）0246810IKK （IKK）-β*******LY2874455LPS系列+++---******05101520瑞拉tive exp电阻的 prote在（比率 to GAPD的H)LY2874455LPS系列+++---p-第65页纳西纳西蛋白质的相对表达（与GAPDH的比率）0.00.51.51.02.0LY2874455LPS系列+++---第65页0.00.10.20.3-0.3-0.2-0.1***+++---LY2874455LPS系列皮尔逊的R++10620LY2874455LPS系列+---蛋白质的相对表达（与GAPDH的比率）iNOS的48********0123蛋白质的相对表达（与GAPDH的比率）TNF型-α**++LY2874455LPS系列+---相对 expre蛋白质的sion（比率GAPDH）0.51.01.52.02.5***0伊利诺伊州-6++LY2874455LPS系列+---********02468瑞拉tive expProtei的ressionn（比率β-肌动蛋白）伊利诺伊州-6++LY2874455LPS系列+---***00.51.01.52.02.5p 的相对表达式罗汀（比率β-肌动蛋白）++LY2874455LPS系列+---TNF型-α********6024810蛋白质的相对表达（比率β-肌动蛋白）++LY2874455LPS系列+---iNOS的四氢百科-1IL6型+++PMA的LPS系列LY2874455-++---+--150100500200相对 mRNA 表达ssion******相对 mRNA 表达四氢百科-1TNF型-α501015+++PMA的LPS系列LY2874455-++---+--************LY2874455LPS系列-+++--IL6型（PG型/毫升）300040006000********010203040505000LY2874455LPS系列（pg/毫升）500010000150002000025000********0+++---TNF型-α******雷拉特ive 表达式 oF 蛋白（与 GAPDH 的比率)0246810iNOS的+-LY2874455++LPS系列--BMDM的RSTUVWXYZ机 管 局血型交流广告自动曝光自动对焦量化图1H量化图1H量化图1H量化的图。S1H系列量化的图。S1H系列量化的图。S1H系列量化图1I量化图1J量化图1J量化图 1KS1 图
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S1 图。 LY2874455抑制了LPS刺激的巨噬细胞的炎症。
（A） 将 RAW264.7 细胞与 27 种化学物质一起孵育并用 LPS （20 ng/ml） 刺激 24 小时，测量培养上清液中的 NO 浓度并显示为倍数变化。（B） 27种化学品的名称。（C、D）对LPS（20 ng / ml）处理的RAW264.7细胞施加不同浓度的LY2874455，并测量细胞活力和NO水平。（E-G）用LY2874455（2 μm）和LPS（20 ng/ml）处理24 h的qRT-PCR检测促炎基因（IL-6，TNF-β α α）和iNOS的表达。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（I-K）通过qRT-PCR检查用LY2874455（2μm）和LPS（20 ng / ml）处理24 h的PM中促炎基因（IL-6，TNF-α）和iNOS的表达。 （L）在PM中通过蛋白质印迹检测iNOS和GAPDH的蛋白水平。 （M）用密度值定量印迹，并分析统计学意义。（N-P）采用qRT-PCR检测LY2874455（2 μm）和LPS（20 ng/ml）处理24 h的BMDMs中促炎基因（IL-6、TNF-α）和iNOS的表达。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（小号、小号）通过qRT-PCR检查用LY2874455（2μm）和LPS（20ng / ml）处理24小时的人THP-1单核细胞中促炎基因（IL-6和TNF-α）的表达。佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）用于诱导THP-1单核细胞产生巨噬细胞。（U，V）ELISA在用LY2874455（2μm）和LPS（20 ng/ml）处理24 h的RAW264.7细胞中检测IL-6和TNF-α的细胞因子α。（Z-AB）采用密度值定量S1H Fig中IL-6、TNF-α和iNOS的蛋白表达，并分析统计学意义。（交流）用密度值定量图1I中IKK-β的蛋白表达，并分析统计学意义。（AD-AE）用密度值定量图1J中p65和p-p65的蛋白表达，并分析统计学意义。（AF）p65的免疫荧光显微照片在图1K中定量。*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，****：P < 0.0001，NS：无统计学差异。图中所示图表的基础数据可以在 S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.s001
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S2 图。 LY287445抑制了病毒感染和衰老引起的炎症。
（A-C）LY2874455抑制了病毒感染引起的炎症。将聚肌苷-聚胞苷酸（聚（I：C））（50μg/ ml）和LY2874455（2μm）施加BMDM24小时，并分析炎症细胞因子的表达水平qRT-PCR。（D-F）LY2874455抑制细菌（E.大肠杆菌）感染诱发的炎症。将大肠杆菌和LY2874455（2μm）施加到BMDM中24小时，并分析炎症细胞因子的表达水平qRT-PCR。（G-K）LY2874455抑制H2O2-诱导细胞衰老。NIH3T3细胞用H2O2（400μm，2小时）用于诱导细胞老化，然后进行LY2874455（2μm）处理。显示细胞β-GAL染色的代表性图像（G），并通过qRT-PCR分析p16（H）和炎性细胞因子（I-K）的表达水平。（L） Western blot检测IL1β、IL18和GAPDH蛋白表达。用密度值对蛋白质表达进行定量，并分析统计学意义。*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，****：P < 0.0001，NS：无统计学差异。图中所示图表的基础数据可以在 S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.s002
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S3 图。 免疫蛋白酶体在 LPS 诱导的 NF-κB 因子上游炎症中发挥作用。
（A）免疫蛋白酶体抑制剂ONX-0914抑制核 NF-κB 因子 p65 在 LPS 刺激的巨噬细胞中的易位。用LPS（20ng / ml）刺激RAW264.7细胞2小时，有或没有ONX-0914（1μm）。显示了 3 个独立重复的代表性图像。比例尺：10μm。（B）NF-κB炎症信号通路示意图。（C） 从用 LPS （20 ng/ml） 和 ONX-0914 （1 μm） 处理的 RAW264.7 巨噬细胞中提取总蛋白，并用于磷酸化 IκB-α （p-IκB-α） 蛋白水平的蛋白质印迹分析。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（D、E）从用LPS（20ng / ml）和ONX-0914（1μm）或LY2874455（2μm）处理的RAW264.7巨噬细胞中提取总蛋白，并用于蛋白质印迹分析NF-κB信号通路上游指示因子功能的蛋白质水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（F） 在RAW264.7细胞中测定免疫蛋白酶体亚基LMP10的酶活性。：P < 0.001。（G） 从 LPS （20 ng/ml） 和 LY2874455 （2 μm） 处理的 RAW264.7 巨噬细胞中提取总蛋白，用于蛋白质印迹分析 PSMB1 和 GAPDH 的蛋白水平。（H） 用密度值定量PSMB1 in的蛋白表达，并分析统计学意义。（I） 用密度值定量LMP2、LMP7和LMP10的蛋白表达，并分析统计学意义。（J） 对图3E中PSMB6、PSMB7和PSMB5的蛋白表达量进行密度定量分析，并分析统计学意义。（K） 用密度值定量图3F中LMP2、LMP7和LMP10的蛋白表达，并分析统计学意义。（L） 对图3G中PSMB6、PSMB7和PSMB5的蛋白表达进行定量，并分析统计学意义。（M） 对 S3A 图中 p65 的免疫荧光显微照片进行定量。（北-南）采用密度定量值定量S3D Fig中p-IκB-α、TAK1、MyD88、TAB2、TRIF和TRAF6的蛋白表达，并分析其统计学意义。（T-X）采用密度值定量S3E Fig中p-IκB-α、TAK1、MyD88、TAB2、TRIF和TRAF6的蛋白表达，并分析统计学意义。*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，****：P < 0.0001，NS：无统计学差异。图中所示图表的基础数据可以在 S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.s003
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S4 图。 LY2874455诱导巨噬细胞的自噬。
（A） 使用不同浓度的抑制剂 MG132、氯喹或沃特曼宁来分析它们在剂量和时间依赖性细胞死亡试验中对巨噬细胞活力的影响。（B）组成型蛋白酶体抑制剂MG132不能阻断LY2874455诱导的免疫蛋白酶体亚基的还原。用LPS（20ng/ml）、LY2874455（2μm）和蛋白酶体抑制剂MG132（5μm）处理RAW264.7细胞。Western blot检测LMP2、LMP7和GAPDH的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（C）自噬抑制剂wortmannin阻断LY2874455诱导的免疫蛋白酶体亚基的还原。在用LPS（20ng / ml），LY2874455（2μm）和自噬抑制剂wortmannin（100nM）处理的RAW264.7细胞中分析LMP2，LMP7和GAPDH的蛋白质水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（D）LY2874455对自噬激活作用的模型方案。FGFR是跨膜RTK，被FGF激活形成二聚体，导致下游FRS2复合物的激活，随后激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。激活的 mTOR 然后磷酸化并抑制自噬，引发 ULK1 激酶复合物，导致自噬抑制。LY2874455抑制FGFR活性和下游PI3K/AKT/mTOR信号通路，导致自噬的释放和激活。（E） 用 LPS （20 ng/ml） 和 LY2874455 （0.2， 0.5， 1， 2， 5 μm） 处理 NIH3T3 细胞 24 h，并通过蛋白质印迹分析 p62、LC3 和 GAPDH 的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（F） FGFR抑制剂AZD4547用于检测对自噬和免疫蛋白酶体的影响。用LPS（20 ng/ml）和ADZ4547（10,50,100 nM）处理RAW264.7细胞24 h，并通过蛋白质印迹分析p62，LC3和GAPDH的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（G-I）AZD4547对RAW264.7细胞的炎症抑制也有影响。用LPS（20 ng/ml）和ADZ4547（100 nM）处理RAW264.7细胞24 h，qRT-PCR检测IL-6、TNF-α、IL1β和iNOS的表达。（J）使用化学品（芬替康唑、多米芬和十六烷基吡啶）检测其对自噬活化的影响。RAW264.7 细胞用芬替康唑、多米芬和十六烷基吡啶 （0.5、1、15 μm） 处理 24 小时，并通过蛋白质印迹分析 p62 和 GAPDH 的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（千米至米）用密度值定量图4A–4C中LMP2和LMP7的蛋白表达，并分析统计学意义。（N） LC3点的数量在图4D中定量。（O）用LY2874455处理的巨噬细胞中自噬体的定量，结果如图4E所示。（P） 用密度值定量图4F中p62的蛋白表达和LC3II/LC3I的比值，并分析统计学意义。（问-秒）用密度值定量图4G–4I中p62的蛋白表达，并分析统计学意义。（T-W）采用密度定量值定量图4J中p-mTOR（Ser248）、mTOR、p-AKT（Ser473）、AKT的蛋白表达分析了统计学意义。（X-AA）采用密度值定量S4B和S4C图中LMP2和LMP7的蛋白表达，并分析统计学意义。（AB-交流）采用密度值定量S4E图中p62的蛋白表达和LC3II/LC3I的比值，并分析统计学意义。（自动对焦）采用密度值定量S4F图中LMP2、LMP7和p62的蛋白表达，并分析统计学意义。（AG-AI）用密度值定量S4J图中p62的蛋白表达，并分析统计学意义。*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，****：P < 0.0001，NS：无统计学差异。图中所示图表的基础数据可以在 S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.s004
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S5 图。 LY287445通过自噬诱导免疫蛋白酶体亚基的降解。
（A） 确认巨噬细胞中 ATG7 基因敲除。通过CRISPR-CAS9检测在RAW264.7细胞中缺失ATG7基因。培养基因缺失细胞的克隆，检测 p62、LC3、ATG7 和内在对照 GAPDH 的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（B） 确认 p62 敲低 RAW264.7 细胞中 p62 蛋白水平的降低。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（C） 用密度值定量图5A中LMP2和LMP7的蛋白表达，并分析统计学意义。（D） 用密度值定量图5B中LMP2、LMP7和p62的蛋白表达，并分析统计学意义。（E） 用密度值定量图5C中LMP2、LMP7和p62的蛋白表达，并分析统计学意义。（F） 图 5D 中的免疫荧光显微照片通过 ImageJ 定量。（G） 用密度值定量图5E中NRB1、Tollip和p62的蛋白表达，并分析统计学意义。（H） 用密度值定量图5F中LMP2和LMP7的蛋白表达，并分析统计学意义。*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，****：P < 0.0001，NS：无统计学差异。图中所示图表的基础数据可以在 S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.s005
（PDF格式）
S6 图。 LY287445通过自噬抑制炎症。
（甲、乙）自噬抑制剂 wortmannin 逆转了 LPS 刺激的巨噬细胞中LY2874455的作用。BMDMs用LPS（20ng / ml），LY2874455（2μm）和wortmannin（100nM）处理24小时。qRT-PCR检测iNOS和炎性细胞因子基因IL-6的表达。（C） RAW264.7 细胞，用于蛋白质印迹分析 p65、磷酸化 p65 （p-p65） 和 IKK-β 的蛋白质水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（D） 用LPS（20ng / ml）刺激RAW264.7细胞2小时，有或没有LY2874455（2μm）。显示了 p65 和细胞核双重免疫染色 （DAPI） 的代表性图像。比例尺：10μm。（D、F）自噬因子 ATG7 或受体 p62 的缺乏导致抑制 NF-κB 因子 p65（磷酸化和细胞核易位）的LY2874455功能受阻。（E、G）从 ATG7 敲除或 p62 敲低 RAW264.7 细胞中提取总蛋白，用于蛋白质印迹分析 p65、磷酸化 p65 （p-p65） 和 IKK-β 的蛋白质水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（女、女）用LPS（20ng / ml）刺激ATG7敲除或p62敲低RAW264.7细胞2小时，有或没有LY2874455（2μm）。显示了 p65 和细胞核双重免疫染色 （DAPI） 的代表性图像。比例尺：10μm。（I）免疫蛋白酶体抑制剂ONX-0914抑制了自噬缺陷巨噬细胞的炎症能力增强。用LPS（20ng / ml）和ONX-0914（1μm）处理的野生型（WT）或ATG7敲除（ATG7-KO）RAW264.7细胞。检查iNOS和炎性细胞因子基因（IL-6和TNF-α）的蛋白水平。用密度值对印迹进行定量，并分析统计学意义。（J，K）自噬抑制剂（ULK1-IN-2 和氯喹 （CQ））逆转了 LPS 刺激的巨噬细胞中LY2874455的作用。RAW264.7细胞在用LPS（20ng / ml），LY2874455（2μm）和ULK1-IN-2（5μm）或氯喹（20μm）处理24小时后收获。qRT-PCR检测RAW264.7细胞中炎性细胞因子基因（iNOS和IL-6）的表达。（L） siRNA用于敲低lmp7的表达。qRT-PCR检测lmp7的基因表达。（M） RAW264.7 细胞用 siRNA 转染 48 小时，然后用 ONX-0914 处理 24 小时。qRT-PCR检测IL6基因表达。（N） 用密度值定量S6C Fig中p65、磷酸化p65（p-p65）和IKK-β蛋白表达，并分析统计学意义。（O） 采用密度值定量S6D图中p65、磷酸化p65（p-p65）和IKK-β蛋白表达，并分析统计学意义。（P） 采用密度值对S6G图中p65、磷酸化p65（p-p65）和IKK-β蛋白表达进行定量，并分析统计学意义。（Q） 采用密度值定量S6I图中iNOS、TNF-α和IL-6的蛋白表达，并分析统计学意义。（R） 免疫蛋白酶体选择性自噬抑制炎症调节的示意图。*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，****：P < 0.0001，NS：无统计学差异。图中所示图表的基础数据可以在 S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.s006
（PDF格式）
S1 表。 本研究中使用的抗体的引物和稀释液。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.s007
（PDF格式）
S2 表。 通过质谱分析用 LPS 和 LY2874455 处理的 RAW264.7 巨噬细胞中的蛋白质。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.s008
（XLSX）
S1 数据。 所有数字背后的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.s009
（XLSX）
S1 原始图像。 本文中所有相关数字的未裁剪图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002537.s010
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我们感谢四川大学影像中心提供成像。
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