厦门免费医学论文发表-工程细菌共生体允许对蜜蜂肠道环境进行非侵入性生物传感
抽象
蜜蜂是探测宿主-肠道微生物群相互作用的强大模型系统，也是自然生态系统和农业的重要传粉媒介物种。虽然细菌生物传感器可以为宿主与其相关微生物群之间发生的复杂相互作用提供关键的见解，但缺乏对肠道内容物进行非侵入性采样的方法，以及设计共生体的遗传工具有限，迄今为止阻碍了它们在蜜蜂中的发育。在这里，我们建立了一个多功能的分子工具包来对共生体进行基因改造，并首次在蜜蜂中报道了一种对粪便进行采样的技术。我们将天然蜂肠道细菌 Snodgrassella alvi 重新编程为 IPTG 的生物传感器，其工程细胞稳定地定植在蜜蜂的肠道中，并通过荧光蛋白的表达以剂量依赖性方式报告暴露于这些分子。我们发现荧光读数可以在肠道组织中测量，也可以在粪便中无创测量。这些工具和技术将能够快速构建工程细菌，以回答宿主-肠道微生物群研究中的基本问题。
数字
图3图4图5图1图2表1图3图4图5图1图2表1
引文： Chhun A、Moriano-Gutierrez S、Zoppi F、Cabirol A、Engel P、Schaerli Y （2024） 工程细菌共生体允许对蜜蜂肠道环境进行非侵入性生物传感。PLoS 生物学 22（3）： 编号：E3002523。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523
学术编辑： Baojun Wang， 浙江大学， 中国
收到： 2023年6月30日;接受： 2024年1月26日;发表： 3月 5， 2024
版权所有： ? 2024 Chhun et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 本研究中开发的质粒已沉积在 Addgene 中，可通过以下登录号获得：pAC04 （#197400）、pAC06 （#197401）、pAC08 （#197402）、pAC09 （#197403）、pAC10 （#197404）、pAC11 （#197405）、pAC12 （#197406）、pAC13 （#197407）、pAC14 （#197408）、pAC23 （#197409）、pAC24 （#197410）、pAC25 （#197411）、pAC26 （#197412）、pAC17V5a （#197413） 和 pAC17V5b （#197414）。源数据在S1数据文件中随本手稿一起提供。用于对粪便样本中存在的细胞进行荧光定量的斐济宏量作为补充信息提供，可在 S1 文本中找到。
资金： 这项工作得到了洛桑大学、NCCR Microbiomes（国家研究中心）的支持，由瑞士国家科学基金会（资助号180575）资助给 P.E 和 Y.S.，以及 Marie Sk?odowska-Curie 奖学金 HarmHoney（资助号 892574）资助给 A.Ca。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
缩写： CFU， 菌落形成单位;磷酸 二 铵 二氨基庚二酸;DAPI， 4,6-二脒基-2-苯基吲哚;GFP， 绿色荧光蛋白;IPTG， 异丙硫基-β-半乳糖苷;MBM系列 溶原性肉汤;qPCR， 定量PCR;电信标准化局， 胰蛋白酶大豆汤
介绍
栖息在胃肠道中的微生物在人类健康和生理学中起着举足轻重的作用[1]。然而，深入了解宿主-微生物群的相互作用本质上是艰巨的，因为肠道环境并不容易获得，因为其含量只能通过肠道组织解剖、侵入性采样方法、可摄入采样装置或间接通过粪便采样或分析宿主的挥发性组来查询[2–5].此外，肠道中的化合物会被宿主或其相关微生物代谢，并且可能只出现在胃肠道内非常特定的时间和位置。因此，现有的微生物群研究方法往往无法捕捉到这些难以捉摸的动态，只能提供分辨率有限的快照视图，这限制了该领域的进展[6\u20128]。因此，非常需要开发工具来原位获取空间和/或时间信息，以解开微生物群内及其宿主之间发生的复杂和动态的相互作用。合成生物学有望通过将人类共生细菌设计为活的生物传感器来推动该领域朝着这个方向发展[9\u2012212]。例如，对小鼠大肠杆菌菌株进行了修饰，以检测小鼠肠道内的四硫酸盐（炎症的短暂副产物），以“记住”并报告暴露于粪便中的分子[13]。尽管这些新型生物传感器在检查肠道环境方面具有巨大潜力，但它们的利用它来加深我们对微生物群的了解仍然具有挑战性，因为这些群落通常非常多样化，并且包含许多棘手的物种。
与复杂的哺乳动物微生物群相比，在蜜蜂肠道中发现的微生物群落的组成非常简单[14]。其主要细菌成员易于在实验室中培养，并且可以很容易地获得微生物群耗尽的个体[15,16]。因此，蜜蜂代表了一个强大的模型，可以提高我们对控制肠道微生物群落组装和功能的基本原则的理解[17]。此外，蜜蜂是许多农作物和野花的主要传粉者，然而，蜜蜂的种群受到包括抗生素在内的多种人为应激因素的威胁[18\u201220]。使用细菌生物传感器研究蜜蜂将提供相当大的机会来扩展我们对健康和疾病下肠道微生物群生物学的了解。
然而，目前有几个挑战阻碍了它们在蜜蜂肠道环境中的应用。到目前为止，报道的细菌生物传感器几乎完全依赖于E菌株。大肠杆菌，这限制了它们在少数宿主中的使用，包括秀丽隐杆线虫和小鼠[21\u201223]。只有真正的蜜蜂本地共生体才能在它们的肠道中定殖，而对所研究的群落及其环境的改变最小[24]。此外，虽然利用细菌生物传感器检查肠道环境依赖于粪便取样和随后对回收细菌的分析，但粪便分析从未应用于蜜蜂，因为它们不会在实验室条件下排便[25]。更重要的是，蜜蜂肠道中的微生物群落直到最近才被正式描述[26,27]。5年前，关于这些细菌物种的功能性分子工具包的首次报道刚刚发表，后来它被显着地用于重新编程蜜蜂肠道共生体，以促进其宿主的健康，以及通过共生体介导的RNAi调节蜜蜂基因的表达[28\u201231]。最近，一种基于同源重组的新方法允许在蜜蜂肠道细菌中进行一步基因组敲除和敲入[32]。这些研究揭示了蜜蜂肠道微生物群领域的微生物工程潜力，但迄今为止可用的遗传部分的集合仍然有限。例如，该工具包包括一系列基于RSF1010复制子的质粒[28]。虽然有效，但这些载体存在缺点，因为复制子本身的大小（约6 kb）使克隆复杂化。缺乏其他功能复制子也阻止了在单个细菌细胞中使用多个相容质粒，这对于构建需要分配的复杂遗传回路是有利的[9,33]。
在这里，我们旨在设计一种蜜蜂肠道共生体，作为肠道环境中代谢物的第一个生物传感器。作为概念验证，我们将 Snodgrassella alvi（一种在蜜蜂近端肠道中发现的细菌）重新编程为一种非侵入性诊断工具，通过表达荧光报告基因来感知和报告糖衍生物异丙硫基-β-半乳糖苷 （IPTG） 的存在。为此，我们开发了一种收集蜂粪的方法，并率先将其用于体内工程细胞稳定性的纵向表征。我们还通过开发一系列可以稳定维持在 S 中的广泛宿主范围复制质粒，扩展了专用于天然蜜蜂肠道共生体的遗传工具集。alvi，以及 IPTG 诱导的启动子，用于遗传操纵这种非模型细菌物种。工程细胞对IPTG存在的反应是剂量依赖性的，可以从肠道组织和蜜蜂粪便中确定。
结果
通过粪便收集进行无创肠道微生物群采样
我们首先开发了一种电穿孔方案，将 DNA 常规转化为 S。alvi（参见方法部分），作为一种比该物种通常采用的夫妻转移更快、更简单的技术[28]。我们能够将先前描述的质粒pBTK570电穿孔到野生型细胞中[28]，从而产生耐大观霉素S。阿尔维。接下来，我们给微生物群耗尽的蜜蜂喂食了工程细胞的接种物，并允许肠道定植。然后，我们建立了一种非侵入性方案，以反复收集蜜蜂粪便并分析其随时间推移的细菌组成（图1）。通过轻轻按压一氧化碳的腹部2-被击晕的蜜蜂，可以取回大量的粪便（图1A）。每只蜜蜂的粪便体积平均为4.4±2.4μl（n = 18），提取成功率为90%（图1B）。为了确认收集的粪便可以回收工程细菌，并且它们是蜜蜂肠道细菌含量的信息代理，我们寻找了工程菌株S的存在。接种蜜蜂的粪便和肠道（即中肠、回肠和直肠）中的 alvi（图 1C）。
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图 1. 一种对蜜蜂肠道进行无创取样的新方法。
（a） 提取蜜蜂粪便的照片。（b） 箱形图表示从n = 18只蜜蜂中提取的粪便的中位数。（c） 点图显示了工程 S 的细菌载量。在粪便和肠道匀浆中发现Alvi。数据点之间的虚线表示匹配的样本（即粪便和肠道来自同一只蜜蜂）。标明了实验的取样蜜蜂数量（n）和定植率（r）。（d） 粪便收集不会显著降低蜜蜂的适应性。Kaplan-Meier图显示了蜜蜂在进行粪便提取（FE处理;实线）时与对照蜜蜂（对照;虚线）相比随时间推移的生存概率。粪便收集的时间用箭头表示。对数秩检验，对于 n = 44 只蜜蜂，p 值 = 0.112 时不显著 （ns）。该图的基础数据可以在 S1 数据文件、工作表“图 1B”、“图 1C”和“图 1D”中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.g001
为此，在接种后一周收集粪便，然后直接解剖这些个体的肠道组织。工程S的浓度。通过将细菌菌落分离到选择性培养基上来估计粪便和肠道样品中存在的 Alvi。有趣的是，在粪便中发现了转基因细菌，平均细菌载量为1.3 10?5每μl粪便的菌落形成单位（CFU）（图1C）。它表明，通常定植在近端肠道的肠道共生体仍然可以在粪便中大量发现。此外，我们发现 S 的量之间存在正相关关系。粪便中的 alvi 与肠道（Pearson 相关系数 R = 0.3963，p 值 < 0.05; S1 图）。不仅细菌负荷相关，而且粪便中没有细菌表明蜜蜂没有定植（即肠道组织中没有细菌;图1C）。总而言之，我们的数据表明，蜜蜂粪便是细菌肠道定植水平的可靠指标。
最后，我们检查了所建立的粪便提取程序是否可以在不损害蜜蜂健康的情况下进行。结果显示，与未处理的个体相比，每周收集粪便对纵的蜜蜂的生存概率没有显着影响（图1D）。现在能够通过粪便提取无创地探测蜜蜂的肠道内容物，从而可以进行纵向研究以及使用细菌生物传感器。
用于蜜蜂共生体的功能性广泛宿主范围质粒
为了扩大可用于基因操纵蜜蜂肠道细菌的分子工具范围，我们构建了可以在 S 中稳定复制的广泛宿主范围的质粒。阿尔维。虽然RSF1010复制子先前已被证明可以在蜜蜂肠道共生体中繁殖[28]，但我们在文献中发现了其他候选的宽宿主范围复制子，即RK2 [34,35]、pBBR1 [36,37]、pVS1 [38,39]和pTF-FC2 [40,41]（表1).它们是根据它们被证明发挥作用的物种范围和它们的小尺寸来选择的。在携带荧光蛋白和抗生素耐药性标记物（即 E2-crimson/specR、GFP/ampR 或 E2-crimson/ampR）的不同组合的标准化载体中克隆每个复制起点，从而收集 11 个广泛宿主范围的质粒（图 2 和 S2）。
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图 2. 本研究中开发的广泛宿主范围质粒的集合。
（a） 示意图，显示复制来源和带有抗生素标记物（ampR、specR）和荧光报告基因（crim、gfp）的标准化片段的不同可用组合。（b） 标明相应质粒的名称。详细的质粒图谱可在 S2 图中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.g002
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表 1. 在 S 中测试的宽主机范围复制子的主要特征。alvi 和 B.API。
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在 S 中对质粒进行电穿孔。因此，我们能够从除RK2以外的所有测试复制子中获得稳定的细胞系，证实了它们在该物种中复制的能力（表1）。此外，我们还考虑了我们的广泛宿主范围质粒是否可以用于蜜蜂肠道群落的其他成员。作为初步证据，我们转化了顶尖巴尔通体中的载体，巴尔通体是一种与S不同类别的变形杆菌。alvi [27]，发现 RK2、pBBR1 和 pTF-FC2 在 B 中稳定复制。api（表 1）。
我们通过估计每个复制子的拷贝数、蛋白质表达水平和 S 中的共相容性，进一步表征了每个复制子以及RSF1010。alvi（图 3）。通过定量PCR（qPCR;S3 图）在 S 中。alvi 表明，载体传播到不同的拷贝数，范围从中等拷贝数（RSF1010每个细胞约 23 个拷贝）到高拷贝数（pBBR1 每个细胞约 906 个拷贝;图3A）。还通过流式细胞术评估携带不同复制子的单个工程细胞的荧光（图3B）。除了 S。携带RSF1010复制起点的alvi，有趣的是，它表现出最高的荧光信号，同时原则上含有最低量的质粒，携带其他复制子的细胞产生与确定的质粒拷贝数一致的荧光水平（图3A和3B）。这些差异转化为适度的动态范围，最高和最低平均绿色荧光蛋白 （GFP） 信号（即 pTF-FC2 和 RSF1010;图3B）。更重要的是，通过成对地共转化 S 中的不同质粒。因此，我们观察到 pTF-FC2 复制子与所有其他测试的复制来源兼容，并允许稳定的双载体传播（图 3C）。在B中也进行了相同的分析。api，并导致了大致相似的结果（S4图）。综上所述，质粒集合的表征说明了其多功能性，因为它提供了各种具有不同特性的共兼容表达载体，从而允许遗传电路的分布和其输出的微调。
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图 3. 蜜蜂肠道共生体 S 中功能性宽宿主范围复制子的表征。阿尔维。
（a） 宽宿主范围的质粒在 S 中具有不同的拷贝数。阿尔维。箱形图显示了通过qPCR从3个独立实验中获得的质粒拷贝数的中位值，每个实验有5个生物学重复（总n=15）。中位拷贝数显示在相应的箱形图上方。（b）质粒拷贝数的差异导致S中不同的蛋白表达水平。阿尔维。图显示了 GFP 荧光的平均值± 5 个生物学重复的标准偏差。每个重复代表通过流式细胞术测量的至少 9,000 个细胞的平均荧光。用于 S 中 panel a 和 b 的质粒。alvi 分别为 pAC08、pAC14、pAC13 和 pAC12，分别携带 RSF1010、pTF-FC2、pVS1 和 pBBR1 的复制来源。（c） 一些复制子是兼容的，可以在 S 中共变换。阿尔维。矩阵表表示兼容（带复选标记的绿色框）和不兼容（带十字标记的红色框）复制子。在S中通过电穿孔成功共转化后，发现载体是相容的。阿尔维。该图的基础数据可以在 S1 数据文件、工作表“图 3A”和“图 3B”中找到。
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肠道定植稳定性随时间推移的工程 S。阿尔维
在扩展了一组质粒以设计蜜蜂肠道共生体后，我们验证了这种质粒在体外以及体内当工程细胞存在天然肠道微生物群落时的维持，以及在没有可能破坏天然微生物群的抗生素的情况下（图4）。为此，我们选择测试提供壮观霉素耐药性（crimson/specR）的载体集，因为它们可以防止通常在CFU估计时使用氨苄西林选择获得的非耐药性卫星菌落的生长。我们首先进行了体外实验，其中 S.携带不同相应广泛宿主范围载体的Alvi在液体培养物中生长，有或没有抗生素选择。达到固定相后，将两种条件下的细胞分离到非选择性固体培养基上，允许有质粒和无质粒的细菌生长，并测量荧光标记的细菌菌落的比率作为质粒维持的替代物（图4A）。不同条件的样品也被接种到选择性培养基上，所有细菌都表现出荧光，证实了在非选择性培养基上观察到的未标记细胞生长是质粒丢失的结果，而不是导致荧光团丢失或失活的突变。最终，发现 pBRR1、RSF1010 和 pTF-FC2 复制子在实验时间范围内稳定维持，因为在没有选择压力的情况下孵育时携带载体的细胞的平均百分比保持在约 89%。相反，pVS1的繁殖显得非常弱，在实验结束时，只有不到3%的细菌种群仍然携带质粒，因此即使对于包含用抗生素生长的细胞的对照条件也是如此。我们假设这是由于实验设置的伪影，其中质粒稳定性如此之低，以至于尽管所有与抗生素一起孵育的单细胞在斑点到非选择性培养基上时都携带载体，但产生的大菌落没有显示荧光，因为细菌在整个细胞分裂过程中迅速丢失质粒。因此，报告的“+Ab”条件（即<80%）的低维持值在绝对值上并不准确，但仍然是质粒增殖非常微弱的指标。
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图 4. 广泛宿主范围质粒和工程化 S 的维持。随着时间的流逝，阿尔维。
每个宽主机范围向量在 S 中都有不同的维护级别。Alvi 细胞，如体外 （A） 和体内 （C） 所示。箱形图表示 n 个生物重复的质粒维持中位值。质粒维持率通过测量在（+Ab）或不（-Ab）添加（-Ab）或不（-Ab）大观霉素生长3天后，接种到从（a）液体培养物（体外）获得的样品的非选择性培养基上的荧光集落形成单位（CFU）的百分比来估计质粒维持;或 （c） 从连续喂食补充有 （+Ab） 或不含 （-Ab） （-Ab） 壮观霉素的糖水的蜜蜂肠道单定植后 7 天（橙色）和 14 天（红色）收集的粪便（体内）。仅考虑在接种粪便材料时检测到细菌菌落的样品。（b） 估计工程 S 的体内实验示意图。Alvi 定植维护。箭头表示粪便取样的 2 次。（d） 工程化 S 的细菌负荷。在粪便中发现的 alvi 细胞在蜜蜂肠道单定植后 7 天（橙色）和 14 天（红色）收集，连续喂食补充有 （+Ab） 或不含 （-Ab） 大观霉素的糖水。我们不同 S 的浓度。还分析了从与自然肠道群落共同定植的蜜蜂粪便中分离出的 alvi 菌株，这些菌株喂食了不含大观霉素 （+Gc） 的糖水。这些CFU值是通过将稀释的粪便接种到选择性培养基（即补充大观霉素）上获得的。我们没有检测到工程细菌的蜜蜂被认为是非定植个体。提供了定植蜜蜂的比率 （r） 和采样的蜜蜂数量 （n）。仅定植蜜蜂的相应中位数由具有四分位距的彩色水平条表示。用于 S 中所有panel的质粒。alvi 分别为 pAC10、pAC04、pBTK570 和 pAC11，分别携带 pVS1、pBBR1、RSF1010 和 pTF-FC2 的复制来源。该图背后的数据可以在 S1 数据文件、表“图 4A”、“图 4C”和“图 4D”中找到。
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此外，我们通过用 S 单定植 4 组微生物群耗尽的蜜蜂来表征体内质粒维持。Alvi 携带不同的宽宿主范围质粒。每组蜜蜂被分成2个亚组，分别喂食正常（-Ab）或补充抗生素（+Ab）的糖水。然后，我们通过每周对14天的粪便进行采样，对他们的微生物群进行了纵向分析（图4B）。使用从收集的粪便中分离的细胞计算每个复制子的质粒维持，与体外样品的质粒维持类似（图4C）。与体外数据一致，基于pVS1的载体在体内传播较差，因为整个S。从未经处理的蜜蜂中恢复的Alvi种群在接种后一周不再携带质粒。有趣的是，在笼养蜜蜂的平均寿命（即约3周）的尺度上[42]，即使没有抗生素，其他复制子也表现出从短期到长期不等的明显稳定性特征。例如，基于 pBBR1 的质粒迅速丢失，一周后携带质粒的细菌种群的中位数为 28%，然后在 14 天后急剧下降到 0%。上述 2 个快速丢失的向量在 S 中具有最高的拷贝数。alvi（图3A），这可能表明它们复制产生的代谢负荷显着影响它们在细胞内的维持。相比之下，基于低拷贝RSF1010和 pTF-FC2 的载体随着时间的推移显示出强大的增殖，分别有 55% 和 86% 的细菌种群在 2 周后仍携带质粒，没有选择压力。已知 pTF-FC2 质粒编码维持系统，该系统可能参与其在我们的细胞中的稳定繁殖（参见讨论）。
最后，由于与异源遗传物质复制相关的潜在适应成本，我们想知道使用广泛宿主范围的质粒是否会影响工程细胞在天然微生物群存在下随着时间的推移在蜜蜂肠道中定植和持续存在的能力。为了回答这个问题，我们将微生物群耗尽的蜜蜂与改良的S共存。Alvi 菌株携带不同的载体和自然肠道群落 （+Gc），其中包括野生型 S。alvi（图 4B）。从这些定植的蜜蜂中取样粪便，并与收集的粪便一起分析，以测量质粒稳定性。最终通过分离工程 S 检查来自 3 个处理组（即 +Ab、?Ab 和 +Gc）的粪便样本。alvi 到选择性固体培养基上，使我们能够确定肠道定植随时间的变化水平（图 4D）。就 S 而言。用基于 pVS1 的质粒转化的 alvi，它们在 14 天内以大约 10 的浓度一致地检测到4每μl粪便的细胞，但仅来自喂食抗生素的蜜蜂。这进一步表明，图4A中“+Ab”条件的低质粒维持值确实是由于实验设置的伪影，并且维持pVS1的复制起点可能不利于细胞的适应性，并且肠道的稳定定植需要增加选择压力。另一方面，S.携带 pBBR1、RSF1010 和 pTF-FC2 复制子的 alvi 能够建立不受抗生素存在的限制的持久性群落，检测到大约 103至 105在整个实验过程中每μl粪便的工程细胞。每种菌株的细菌浓度和定植成功率也与本研究中建立的不同程度的质粒维持一致。例如，携带基于pTF-FC2的质粒的白链球菌的中位值为2.7 1042 周后每 μl 粪便的细胞数，而维持频率较低的载体 pBBR1 导致粪便细菌种群小 18 倍。这些观察结果也与非抗生素处理的蜜蜂被每种菌株成功定植的比率一致，因为平均有50%、61%和76%的蜜蜂被S定植。alvi 分别用 pBBR1、RSF1010 和 pTF-FC2 复制子转化。
更重要的是，S.除pVS1外，使用广泛宿主范围载体进行基因改造的alvi菌株在与本地肠道群落竞争时能够在蜜蜂肠道环境中定植，尽管成功程度不同（图4D）。例如，携带 RSF1010 和 pTF-FC2 质粒的细胞均以大约 10 的浓度检测到4不同采样时间每μL粪便的细胞数，但它们的平均定植率不同，分别为52%和75%。然而，广泛宿主范围的质粒施加的代谢负担使工程细胞能够作为蜜蜂微生物群的一部分定居，而不会被野生型质粒所超越。这是相关的，因为它证实了它们在原位用于肠道环境及其微生物群落的生物传感的潜力。
重新编程的 S。alvi细胞作为IPTG的原位生物传感器
细菌生物传感器的工程依赖于启动子，这些启动子在暴露于目标分子时被特异性诱导，随后驱动专用报告基因的表达。迄今为止，蜜蜂肠道微生物群成员唯一报道的功能诱导系统是基于先前描述的pBTK552载体，该载体携带荧光蛋白，其表达取决于广泛使用的糖衍生物IPTG的存在[28]。然而，诱导的功效仅在体外得到证明。此外，在 S.Alvi，我们无法在实验条件下保持质粒的完整性，因为该系统显示出高度的遗传不稳定性，导致GFP基因频繁缺失（S5图）。因此，我们使用我们的工具包在不同的基因排列中构建了IPTG生物传感器的几种变体，并获得了3个稳定的基因构建体。其中两项基于双质粒系统，其中电路分布在 2 个兼容且稳定维持的宽宿主范围质粒（即 RSF1010 和 pTF-FC2;S6A图）。在对不同结构进行表征后，我们选择了pAC17V5电路来继续我们的工作，因为它在响应IPTG时显示出最佳的动态范围（S6B图）。简而言之，pAC17V5 系统由第一个基于 pTF-FC2 的质粒组成，该质粒带有组成型表达的 lacI 基因 （pAC17V5b） 和第二个基于 RSF1010 的载体，该载体携带 gfp，在组成型启动子的控制下，直接在下游具有 Lac 操作子 （lacO） 序列 （pAC17V5a;图5A）。当在 S 中一起转换时。alvi，质粒使细胞在体外对IPTG有反应，GFP表达增加了7倍（图5B）。此外，我们想知道其他种类的蜜蜂肠道微生物群是否也可以被设计成对IPTG的反应。我们在来自蜜蜂的 2 种γ变形菌 Gilliamella apicola wkB7 和 Gilliamella ap ESL0169 is 以及另一种 S 菌株中测试了 3 种遗传稳定的构建体。从无刺蜜蜂中分离出的alvi（S7图）。我们发现，使用我们的单质粒系统 pAC17V3 （S6A 图） 设计的所有 3 种细菌都能够对体外 IPTG 的存在做出反应（S7 图）。
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图 5. 工程 S.alvi 在体内感知 IPTG，并报告肠道组织和粪便中的暴露情况。
（a） IPTG诱导型双质粒系统pAC17V5示意图。（b） S.用 pAC17V5 设计的 alvi 细胞在体外对 IPTG 暴露有反应。箱形图表示 5 个生物学重复的 GFP 荧光中值。每个重复值基于至少 9,000 S 的平均荧光。通过流式细胞术测量的alvi细胞，这些细胞在含有（+）或不含（?）IPTG的液体中生长。（c） 使用重新编程的 S 进行体内实验的示意图。alvi 在原位感知 IPTG。（d） 用工程 S 定植的蜜蜂肠道的共聚焦显微镜图像。带有 pAC17V5 的 alvi 电池。S的生物膜。图中显示了肠道隐窝内的 Alvi。用补充有 1 mM IPTG 的糖水喂养蜜蜂。蓝色通道显示宿主和细菌细胞的DAPI染色。绿色通道显示GFP荧光。（e） S.用 pAC17V5 设计的 alvi 在体内显示出对 IPTG 暴露的剂量反应，这可以从肠道组织中测量。该图显示了表示 S 的 GFP 荧光中值的箱形图。从喂食补充有 0、0.1 或 1 mM IPTG 的糖水的蜜蜂肠道成像的 alvi 生物膜。针对每种情况分析了五只蜜蜂，并从每个肠道的 3 个不同部分取平均荧光值。Tukey HSD 检验，* 在 q 值 < 0.05 时显著。（f） 蜂粪的共聚焦显微镜图像，从喂食补充有 1 mM IPTG 并用 S 定植的糖水的个体中收集。带有 pAC17V5 的 alvi 电池。绿色通道显示GFP荧光。（g） S.用 pAC17V5 设计的 alvi 显示出对体内 IPTG 暴露的剂量反应，这可以从粪便中测量。箱形图表示单个 S 的 GFP 荧光的中值。从喂食补充有 0、0.1 或 1 mM IPTG 的糖水的蜜蜂粪便中成像的 alvi 细胞。针对每种情况至少分析了 8 只蜜蜂。指示每个条件分析的细胞的累积数 n。Tukey HSD 检验，* 在 q 值 < 0.05 时显著，在 q 值 < 0.001 时 *** 显著。该图的基础数据可以在 S1 数据文件、“图 5B”、“图 5E”和“图 5G”中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.g005
然后，我们希望确定基因是否重新编程了S。alvi 还可以在肠道环境中感知和响应 IPTG。为此，我们用 S 将微生物群耗尽的蜜蜂单定植。alvi 携带 pAC17V5 双质粒系统，然后将它们分成 3 组，分别喂食补充有 0、0.1 或 1 mM IPTG 的糖水。然后从蜜蜂身上收集粪便和肠道组织，并收集 S 的荧光。分析了每种样品类型中存在的alvi细胞（图5C）。在整个胆量中，S。发现alvi形成位于回肠肠隐窝中的生物膜（图5D）。随后对这些生物膜的图像分析表明，工程细胞表现出对IPTG的剂量反应，其中测量的荧光信号的强度随着定植蜜蜂食物中存在的IPTG浓度的增加而增加（图5E和S8）。
最后，转基因 S。还可以从粪便中所含的浮游生物形式来监测alvi（图5F）。通过为本研究开发的斐济宏（S1文本）自动定量粪便共聚焦显微镜图片中的细胞荧光，该宏允许在每种条件下分析数千个细菌。获得的数据进一步表明，S.alvi 可以感知肠道中不同浓度的 IPTG，并以剂量依赖性荧光输出做出相应的反应（图 5G）。综上所述，进行的体内实验证实了本地蜜蜂肠道共生体S。Alvi 可以进行基因重编程，作为肠道环境的原位生物传感器。此外，细胞对暴露于检测到的分子的反应可以在局部、直接在肠道组织中以及在蜜蜂粪便中进行非侵入性评估。
讨论
我们在这里证明，本地蜜蜂肠道细菌S。Alvi 可以作为肠道环境的生物传感器进行基因重编程，通过荧光蛋白的表达以剂量依赖性方式报告暴露。为此，我们开发了一系列广泛的宿主范围质粒，具有多种维持性和相容性，扩展了可用的遗传工具箱[28]，并将促进蜜蜂微生物群领域的进一步细菌工程。我们发现，重新编程的共生体可以稳定地定植在肠道中，即使在原生群落存在的情况下，它们的荧光输出也可以直接从肠道组织中记录下来。此外，我们首次在蜜蜂中报告了一种收集蜜蜂粪便的非侵入性方法，允许重复监测来自工程共生体的荧光读数，这些共生体可以告知肠道内容物。总而言之，我们的工作为共生动力学的纵向研究以及肠道在其不同微环境中的物理化学特性的研究铺平了道路。
细菌生物传感器的一个显着优势是，它们可以无创、无损地检查肠道内容物及其相关的细菌群落。在不到十年的时间里，技术的发展对像E这样的人类共生体进行了重新编程。大肠杆菌作为生物传感器已经取得了令人振奋的进展，从使用基于转录调节因子的遗传回路来感知简单的化学物质[9]，到应用CRISPR使细菌在其基因组中记录它们通过肠道时发生的转录变化[43]。例如，研究表明，人类共生拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）可以被基因重编程，以感知和响应定植小鼠食物中补充的阿拉伯半乳聚糖[10]。同样，益生菌E。大肠杆菌Nissle 1917被设计为同时检测小鼠胃肠道中的硫代硫酸盐和硝酸盐，作为肠道炎症的生物标志物[11]。虽然蜜蜂肠道微生物群是研究宿主-微生物相互作用的特殊模型[17]，但专门用于该系统的细菌生物传感器的开发尚未进行。
我们的研究提供了一系列广泛的宿主范围质粒，这些质粒可以在 2 种流行的蜜蜂共生体 S 中稳定复制。alvi 和 B.api（图 2 和表 1）。它们对 S 的成功工程至关重要。Alvi 作为生物传感器。事实上，我们观察到该物种的几种遗传结构具有高度的遗传不稳定性（而在 E 中保持稳定）。大肠杆菌），导致电路功能丧失（例如，pBTK503 和 pBTK552;S5 图）。该设计导致了 S 中稳定且功能性的 IPTG 诱导型启动子。Alvi 依赖于将电路分配到本研究中表征的 2 个相容质粒上。更一般地说，测序技术的出现揭示了从各种环境中分离出的大量新的未驯化细菌物种，目前尚无已知的复制质粒来对它们进行基因操纵[44,45]。在这方面，我们收集的广泛宿主范围质粒代表了标准化载体的有用资源，可以很容易地在任何非遗传上可处理的目标物种中进行测试。
此外，随着时间的流逝，宽宿主范围载体在细胞内的维持中表现出多功能性，可用于不同的应用。例如，基于pVS1的质粒在S中的繁殖非常差。非选择性条件下的alvi（图4）。由于 pVS1 在 E 中实际上不起作用。大肠杆菌，使传统的克隆工作变得不可能，p15A复制子先前被添加到质粒中，因此它有效地携带了2个复制起点[39]。我们假设这 2 个复制子的存在以及质粒的高拷贝数（即每个细胞约 500 个拷贝）可能导致其非常快的丢失。这对转基因生物的潜在应用很有意义，因为转基因生物的维持应保持短暂的。例如，以前曾报道过 S.Alvi可以被设计为一种益生菌，以促进蜜蜂对畸形翼病毒和瓦螨的抵抗力[29]。这种转基因细菌在改善菌落健康方面具有巨大的潜力，但其应用需要开发强大的生物防护方法，以防止其扩散到环境中。这仍然是设计任何转基因微生物的核心概念，这些微生物旨在在密闭的实验室条件之外使用，其中菌株被设计为杀伤开关或成为营养不良生物，因此它们不会在超出预期用途的情况下存活[21,46,47]。因此，在没有抗生素选择的情况下，pVS1质粒的快速丢失可能是一个有价值的特征，可以重新利用，以便工程细胞仅短暂地携带转基因信息。另一方面，基因重编程细菌的一些应用，如生物传感，需要基因回路的长期功能，这在某些系统中已被证明具有挑战性。例如，高达 65% 的工程 L.副干酪菌在大鼠肠道中丢失了重组质粒[48]。相反，我们的一些广泛宿主范围的质粒，如pTF-FC2，被证明可以稳定地维持在S中。alvi，并且可以在体内细胞群中繁殖长达 2 周（图 4C）。这些工程细胞能够在蜜蜂肠道中稳健地定植并持续存在，同时与天然微生物群竞争（图4D），突出了我们广泛宿主范围的质粒收集在体内应用中的价值。然而，我们质粒的维持水平可能与这里测试的基因（即E2-crimson）是特异性的，并且当表达导致更高代谢负荷或对细胞有毒的基因时，这些值可能会有所不同。此外，在我们修饰的 S 之间发生潜在的水平基因转移。在+Gc实验条件下，alvi和野生型细胞可能夸大了报告的细菌负荷。然而，我们认为自发偶联对报告值的影响是最小的，因为所有测量的细菌浓度都与在体外和体内用+/-Ab条件确定的质粒维持水平一致。有趣的是，低拷贝数的pTF-FC2载体具有在复制子本身内自然编码的毒素/抗毒素系统，这无疑有助于这种持久的质粒维持[49]。基于 3 个小尺寸（约 700 bp）的基因，该系统可以很容易地移植到其他质粒上，因此可以潜在地调节它们的繁殖和维持。
为了提供定植动态的纵向读数，以及监测体内构建的质粒和工程共生体的稳定性，我们必须首先开发一种无创和重复收集蜜蜂粪便的方法（图1）。最初尚不清楚是否设计了 S。Alvi细胞可以从粪便中分离出来，如果这些细胞能可靠地反映肠道定植的水平。事实上，共生体在胃肠道中占据着不同的生态位，像 S 这样的物种。已知Alvi在近端肠道（即回肠）形成生物膜，而其他ALVI主要存在于保留粪便的远端肠道（即直肠）[50]。在这里，我们展示了 live S。随着时间的推移，alvi可以在蜜蜂的粪便中以高浓度持续分离（图4），这表明通常沉积在近端肠道的细菌也会积聚在直肠中，这可能是由于肠道组织的脱落[51]。此后，我们小组进行的另一项研究证实了这一点，该研究表征了蜜蜂的粪便微生物群，并表明肠道微生物群的所有主要属也存在于粪便中[52]。考虑到笼养的蜜蜂不会排便，实验室饲养的个体的直肠中的细菌积累可能会加剧。这是相关的，因为迄今为止，所有关于笼养蜜蜂肠道微生物群的研究都专门检查了整个肠道组织，以确定远端肠道中细菌定植的水平，从而防止了实际定植微生物（即形成持久性生物膜）与那些只是在管腔中以浮游生物形式通过和/或存活的微生物。在未来的研究中，通过系统分析笼养个体的粪便细菌含量来考虑保留在笼养个体直肠中的细菌，从而促进对蜜蜂肠道定植的更明确理解。总体而言，与哺乳动物肠道微生物群类似[53\u201255]，随时间推移的粪便取样和随后的分析有望提高我们观察和理解蜜蜂微生物群中发生的时间动态的能力。我们的实验还表明，重复收集粪便不会显着影响蜜蜂的健康状况，因为未处理和治疗的蜜蜂之间的存活率没有统计学上的显着差异。然而，我们观察到一种趋势，即接受治疗的个体可能比未经治疗的蜜蜂更早死亡，这很可能是因为在粪便收集过程中处理引起的中等压力。因此，可能需要进一步研究粪便收集对蜜蜂健康的确切影响。此外，虽然我们提供了实验证明粪便采样可以成为监测笼养蜜蜂肠道微生物群随时间推移的有效技术，但应进行进一步的工作以评估这种方法在野生或蜂巢蜜蜂纵向研究方面的潜在局限性。
最后，我们设计了一个基于2个相容复制子的遗传稳定的诱导系统。作为概念验证，我们用它来重新编程 S。alvi 原位感知 IPTG，因此提供了第一个证据，证明普遍存在的蜜蜂共生体可以被设计为生物传感器（图 5）。然而，在我们的系统中观察到的倍数变化诱导是适度的，对于轻松评估目标化合物浓度可能不实用。因此，应进一步优化未来生物相关分子的生物传感器的动态范围。我们还测试了我们开发的一组IPTG诱导电路是否可用于重新编程其他共生体，包括来自Gilliamella属的菌株，以及另一种S菌株。从无刺蜜蜂的微生物群中分离出的alvi（S7图）。虽然不幸的是，双质粒系统pAC17V5不能以目前的设计在这些物种中稳定地维持，很可能是因为复制子不相容，但基于RSF1010质粒pAC17V3允许细胞在体外对IPTG做出反应。这些初步数据有望将共生体工程推广为蜜蜂肠道环境的生物传感器。然而，由于肠道微生物群由不同且不密切相关的物种组成，很明显，大多数遗传工具（包括质粒复制子）不会在其所有成员中普遍起作用。这证明了对这些环境未驯化的共生体进行基因工程的困难[56]，并且需要更多的工作来推广肠道细菌物种的生物传感器开发。更重要的是，未来的研究工作应侧重于开发专门用于更多生物相关化学信号的生物传感器，例如氧气、pH值、杀虫剂或短链脂肪酸。事实上，大多数小分子在肠道中的分布要么是极其局部的，要么是瞬时的。在这里，使用共聚焦显微镜成像，我们可以确定全肠样品生物膜内工程细胞的荧光水平。通过利用共聚焦显微镜获取这种生物膜的连续光学切片的能力，使用细菌生物传感器可以同样允许检测肠道深处任何目标分子的浓度差异。再加上我们通过粪便取样反复探测肠道内容物的新能力，工程生物传感器代表了一个令人兴奋的前景，可以收集有关蜜蜂胃肠道中化学信号分布的高分辨率空间和时间信息，从而有助于揭示共生体与肠道环境之间的复杂相互作用。
结论
据我们所知，我们的工作为蜜蜂天然共生体的进一步工程铺平了道路，以告知它们在胃肠道内相应生态位的物理化学特性。原则上，如果存在响应性细菌启动子，则基因重新编程细菌的诊断能力几乎可以针对任何感兴趣的信号进行定制，并且使用这种细菌生物传感器应该提高我们对蜜蜂及其肠道微生物群的理解。
材料和方法
细菌菌株和质粒
该类型应变为 S。阿尔维 wkB2T（ATTC编号BAA-2449）和B。蜜蜂属PEB0122T（DSM No. 29779）常规生长在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB，Bacto BD）和哥伦比亚肉汤中，分别补充了5%的除纤维化羊血（CBA，Difco BD）。将细胞在 34°C 下在 5% CO 内的微需氧环境中孵育2培养箱，适当时进行轨道振荡（170 rpm）。此外，E.大肠杆菌NEB 5-α （New England Biolabs） 用于克隆，而二氨基庚二酸 （DAP）-营养素 E.大肠杆菌JKE201菌株[57]与B偶联。API。两者 E.需要时，将大肠菌菌株在 37°C 的溶原肉汤 （LB） 中正常气氛中培养，并进行轨道振荡 （220 rpm）。通过向适当的培养基中补充 30 至 60 μg ml 来实现集落选择和质粒维持?1大观霉素 （S.阿尔维/B.apis—E。大肠杆菌），30 至 100 μg ml?1氨苄西林（S.阿尔维/B.apis—E。大肠杆菌）和 60 μg ml?1DAP，必要时。
载体 pDR401 由 Shelly Deane 博士（南非斯泰伦博斯大学）慷慨提供。质粒pME6012由Jan van der Meer教授（瑞士洛桑大学）友情提供。载体pSEVA1213S（Addgene质粒编号122095）和pBMTBX-2（Addgene质粒编号26073）分别由Pablo Ivan Nikel博士和Ryan Gill教授赠送。质粒 pBTK552（Addgene 质粒编号 110618）、pBTK503（Addgene 质粒编号 110616）和 pBTK570（Addgene 质粒编号 110615）是 Jeffrey Barrick 教授的礼物。
广泛宿主范围和诱导型载体的构建
为了构建宽宿主范围的质粒，我们将不同的复制子与带有 （a） 氨苄青霉素抗性标记物和 CP25 启动子驱动的 GFP 的标准片段一起克隆，（b） 大观霉素抗性标记物与由 PA3 启动子驱动的 E2-深红色荧光蛋白，或 （c） 氨苄青霉素抗性标记物与由 PA3 启动子驱动的 E2-深红色荧光蛋白。因此，每个复制子被有效地克隆为 3 个版本：GFP/ampR、E2-crimson/specR 或 E2-crimson/ampR。后者的产生是为了允许质粒在 B 中的共转化。API 来评估复制子的相容性，因为发现表达 GFP 的质粒在该物种中遗传不稳定。pVS1 复制子，未在 B 中复制。因此，apis没有与E2-crimson/ampR片段克隆。
使用引物 AC_09/10 分别从 pAC08、pBTK570 和 pAC09 载体中扩增片段 GFP/ampR、E2-crimson/specR 和 E2-crimson/ampR。复制子RK2、pBBR1、pTF-FC2和pVS1分别来自质粒pSEVA1213S、pBMTBX-2、pDR401和pME6012。使用引物 AC_16/17 （pSEVA1213S）、AC_11/12 （pBMTBX-2）、AC_48/49 和 AC_50/51 （pDR401） 以及 AC_46/46 和 AC_45/47 （pME6012） 将复制子扩增为 1 或 2 个片段。同样，pAC17V5a 是通过将 pBTK552 质粒线性化为 2 个片段来构建的，使用引物 AC_59/AC_114 和 AC_60/AC_70，然后将它们组装在一起，有效地去除 lacI 基因。pAC17V5b载体是用引物AC_115/AC_116扩增pBTK552的lacI基因，用pTF-FC2复制起点克隆成2个片段，引物AC_36/AC_50和AC_48/AC_49。最终，所有片段均按照制造商指南，使用 NEBuilder HiFi DNA 组装试剂盒通过 Gibson 组装克隆进行组装。有关克隆引物的详细信息，请参见 S2 表。所得的广泛宿主范围和诱导质粒列在S1表中，完整的质粒图谱在S2和S6图中描述。
电穿孔
为了制备电感受态细胞，S.Alvi 用于接种 TSB 培养基的 5 ml 液体培养物。将细胞在 34°C 下生长至早期静止期 2 至 3 天，并在 5% CO 中进行轨道振荡 （170 rpm）2孵化器。然后将培养物在 50 ml 新鲜 TSB 中以 1：50 稀释，并在相同条件下再次孵育 24 小时，以使细胞达到指数中期 （OD ≈ 0.3）。然后用 1：1 （v/v） 冰冷的无菌 10% 甘油溶液洗涤细胞两次。为此，将细胞在 4°C 下以 2,916g 离心 10 分钟，随后将沉淀重悬于甘油溶液中。然后将洗涤的细胞重悬于50μl无菌10%甘油溶液中，并用于一次转化。细胞可以新鲜转化，也可以储存在-80°C。
使用 2.5 kV（电容 10 μF，电阻 600 Ω）的 Eppendorf Eporator 在 0.2 cm 间隙电穿孔比色皿中加入 0.25 μg 质粒 DNA，对细胞进行电穿孔。将细胞重悬于 1 ml TSB 中，并在 34°C 下在 5% CO 中通过轨道振荡 （170 rpm） 恢复 2 小时2孵化器。将回收的细胞离心（2,916g，室温下 5 分钟）并重悬于 100 μl 新鲜 TSB 中，然后接种到选择性 TSA 培养基上。将板在 34°C 下与 5% CO 一起孵育2大气层。成功转化的细胞产生的菌落通常在 3 至 4 天后出现，转化效率平均为 6.6 103± 1.92 103CFU微克?1的DNA。
共轭
将宽宿主范围的质粒转移到 B 中。通过共轭的 API。为此，收件人 B。通过在 CBA 固体培养基上划线获得 api，以便在孵育 3 至 4 天后生长小细菌草坪。使用无菌塑料环轻轻地将细胞从板上刮掉，并重悬于500μl新鲜CBA中。供体菌株 E。大肠杆菌用相关质粒转化的JKE201在3ml LB中生长过夜。然后将液体培养物以 1：100 （v/v） 稀释到 5 ml 新鲜 LB 中，在此阶段之前使用的培养基酌情补充 DAP 和抗生素。将细胞生长约 4 小时至中指数期（OD = 0.4 至 0.6），然后用新鲜 LB 洗涤 3 次以除去抗生素。将供体细胞重悬于不含抗生素的 500 μl LB 培养基中。
对于细胞交配，将供体细胞和受体细胞混合，以 2,916g 离心 5 分钟沉淀，重悬于 50 μl 无菌 LB 肉汤中，最后，将 10 μl 斑点等分到补充有 DAP 的固体 CBA 培养基上。将细胞在 34°C 下在 5% CO 内的微需氧环境中孵育过夜2允许交配的培养箱。为了选择外缀合物，使用塑料环将细胞从平板上刮下并重悬于1ml无菌CBA中。然后将细菌以 2,916g 离心 5 分钟，并在 100 μl 新鲜 CBA 中匀浆，以确保去除残留的 DAP。最后，将细胞接种到选择性 CBA 板上，将其与 5% CO 在 34°C 下孵育2大气层。成功偶联产生的菌落通常在 3 至 4 天后出现。
流式细胞术
使用LSR Fortessa流式细胞仪（BD）仪器和BD FACSDiva采集软件（9.0版，BD）进行细胞荧光测量。使用分析软件FlowJo（版本10.8.1）处理收集的数据。S的单个菌落。alvi 和 B.将携带不同广泛宿主范围质粒的API接种到液体肉汤中并如上所述孵育，直到细胞达到指数期晚期。然后在流式细胞术分析之前，将样品在无菌 PBS 中以 1：10 稀释。通过双重鉴别门控策略检测荧光细胞，如下所示：首先在 FSC-H/SSC-H 图上对细胞群进行门控，然后在 FITC-H（例如 488 nm–em. 494 nm）/SSC-H 或 AlexaFluor700-H（例如 633/40 nm–em. 696 nm）/SSC-H 图上分别用于 GFP 和 E2-crimson 分析（S9 图).根据至少 9,000 个细胞的测量平均荧光值计算每个样品报告的平均荧光信号。
通过qPCR测量质粒拷贝数
分别使用Fast Pure Bacteria DNA分离小量试剂盒（Vazyme）和QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen）提取基因组DNA和质粒。使用 Qubit 设备 （Qubit 3.0） 和 Qubit dsDNA BR 检测试剂盒 （Invitrogen） 测量 DNA 浓度。根据已知浓度的连续稀释 S 生成标准曲线。alvi 和 B.apis基因组DNA，以及pBTK570载体的小量制备（S3图）。用于检测宽宿主范围质粒的qPCR引物为AC_24/25，可扩增E2-crimson基因的100 bp。S的引物alvi 和 B.apis基因组DNA检测分别为AC_28/29和AC_30/31。有关qPCR引物的详细信息，请参见S2表。每次反应一式三份进行，并在每次运行中加入无模板对照，以确认反应混合物未被污染。通过熔解曲线分析和琼脂糖凝胶上的扩增子观察，证实了qPCR引物产生特异性PCR产物（S3图）。生成的标准曲线用于计算qPCR效率E（值在90%至110%之间）和线性R2扩增（S3图）。
质粒拷贝数是从细菌裂解物中测定的。为此，S的单个菌落。alvi 和 B.将携带不同广泛宿主范围质粒的API接种到液体肉汤中并如上所述孵育，直到细胞达到指数期晚期。在这些培养物中，将 1 ml 放入无菌的 1.5 ml Eppendorf 管中，在 100°C 下在干块热混合器 （Eppendorf） 中煮沸 10 分钟，并在 -20°C 下储存直至样品处理。将获得的裂解物在冰上解冻，通过短暂的涡旋匀浆，并使用 1 μl 样品作为 qPCR 反应的模板，其总体积为 10 μl，包括 5 μl 2X SYBR Select 预混液 （Thermo Fisher）、3.6 μl MiliQ 水和 0.2 μl 适当的 10 μM 引物。使用 QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统 （Thermo Fisher） 进行扩增，条件如下：在 50°C 下 2 分钟，在 95°C 下 2 分钟，然后在 95°C 下进行 40 次循环，每次 15 秒，在 60°C 下进行 1 分钟。通过将质粒数量除以每个样品的基因组DNA量来计算每个质粒的每个细胞的拷贝数，这些量是从生成的标准曲线确定的。将基因组DNA的拷贝标准化为相应细菌基因组的16S rRNA位点的数量（即S的4个和2个拷贝）。alvi 和 B.API）。报告的拷贝数值来自 3 个独立实验，每个实验有 5 个生物学重复。
蜜蜂饲养和肠道定植
如前所述，微生物群耗尽的蜜蜂Apis mellifera carnica来源于洛桑大学（VD，瑞士）的户外蜂群[58]。总之，新出现的蜜蜂是通过将成熟的蛹（即有色素的眼睛和浅灰色角质层）从育雏架转移到消毒的塑料盒中获得的。将蛹在 35°C 和 75% 湿度下饲养 3 天，新生的成年蜜蜂可以获得无菌 1：1 （w/v） 蔗糖水源。一天前，将每个蛹盒中2只新出现的蜜蜂的后肠解剖并在1ml无菌1X PBS中匀浆，以检查受污染的蜜蜂。为此，将肠道匀浆接种到 NA、CBA 和 MRSA 固体培养基上，并分别在正常气氛、微需氧和厌氧环境中孵育。丢弃在相应测试蜜蜂的盘子上观察到细菌生长的蛹盒。
通过单独喂食5μlS溶液来对微生物群耗尽的蜜蜂进行肠道单定植。OD 的 alvi 细胞600的 0.1 重悬于 1：1 （v/v） 1X PBS：蔗糖水中，平均为 1.9 104± 1.89 103每个接种物的细菌。对于 S 的殖民化。Alvi 与天然微生物群，通过等体积地混合 5 只蜂巢蜂的匀浆后肠来获得肠道匀浆库存。然后通过混合 S 制备用于喂养蜜蜂进行定植的溶液。alvi 细胞到最终 OD6000.1 的 1：10 （v/v） 稀释的肠道匀浆原液在 1：1 （v/v） 1X PBS：蔗糖水中。将定植的蜜蜂保持在32°C，湿度为75%的无菌杯笼中，加入灭菌花粉和蔗糖溶液，后者补充30μgml?1大观霉素，必要时。蜜蜂用工程 S 单聚。携带IPTG诱导pAC17V5质粒的alvi菌株同样用灭菌花粉和蔗糖溶液喂养，但后者补充了30μgml?1大观霉素，30μgml?1氨苄西林和 0.1 或 1 mM IPTG（视情况而定）。在整个实验过程中，每 3 天用新鲜制备的试管替换补充的蔗糖溶液（即大观霉素和 IPTG），以确保相应分子的恒定浓度。
通过粪便取样评估细菌载量和质粒维持
为了对蜜蜂的粪便进行采样，首先使用一氧化碳对杯笼中的定殖蜜蜂进行电晕2并在 4°C 下固定在冰上。用手轻轻按压睡着的蜜蜂的腹部，从腹部底部开始向毒刺方向移动，直到排便进入无菌的1.5ml Eppendorf管的盖子。排便后2秒，施加在蜜蜂腹部的压力得到缓解，平均产生约4μl的粪便（图1B）。样品保持在冰上，直到取样程序结束。
为了评估从获得的粪便中获得的细菌负荷，粪便物质要么直接在无菌 1X PBS 中以 1：10 （v/v） 的比例连续稀释，如果液体足以移液，或者如果太难移液，则在连续稀释之前首先重悬于 4 μl 无菌 1X PBS 中。然后将稀释的粪便接种在补充有或没有60μgml的TSA固体培养基上?1大观霉素，视情况而定。工程 S 的 CFU。然后在孵育 3 至 4 天后对 Alvi 细胞进行计数。为了评估质粒维持，将荧光CFU与非荧光菌落区分开来，并使用Fusion FX（Vilber Lourmat）设备（高灵敏度，8孔径，F-740滤光片）通过EPI荧光拍摄的板图像进行计数。对 69.5 个菌落的中位值进行计数和分析，以获得每个样品的质粒维持百分比。
蜜蜂存活试验
为了测量粪便提取对蜜蜂健康的影响，我们饲养了 2 组蜜蜂，其中一组每周进行粪便提取（如上所述），另一组未进行操作。为了解释笼子效应，每个队列包括 2 个独立的笼子，每个笼子至少有 10 只蜜蜂。在22天的时间里，每天监测蜜蜂的存活情况，在此期间，死去的个体也被移走。
肠道和粪便显微镜分析
为了制备用于显微镜检查的样品，在接种工程 S 一周后解剖蜜蜂的后肠。alvi 并立即转移到 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液中，并在 4°C 下旋转固定过夜。然后将固定样品在 PBS 中洗涤 3 次，持续 30 分钟。将后肠在4°C下透化并在黑暗中用5μgml旋转染色过夜?14,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI;例如359 nm–em. 457 nm）在PBS中的1%Triton X-100中。然后用PBS从固定样品中洗涤多余的染料，并解剖染色内脏的回肠，安装在PBS中，并用盖玻片（编号#1.5）覆盖。激光扫描共聚焦显微镜使用倒置的蔡司LSM 980 Airyscan 2显微镜（Carl Zeiss AG，德国耶拿）进行。使用512×512像素格式尺寸（134.6873×134.6873μm，深度为1.8400μm）采集图像，平均4张图像和63×油物镜。
对于强度测量，所有回肠都以相同的激光强度和检测器上的主增益成像。对每个回肠的三个不同切片进行成像。文件名被随机化以进行盲强度量化。在斐济，每张图像被分成DAPI和GFP通道，并使用自由形式工具根据DAPI通道绘制每个回肠切片的3个密集定植区域。宿主细胞被排除在感兴趣区域之外。然后将选定的区域复制到GFP通道的相应图像中。使用的强度测量值是减去背景后每个指定区域的单位面积平均强度。对每张图像的 3 个选定区域的归一化强度进行平均，从而得出每个回肠切片的单个值。最后，每个肠道报告的 GFP 强度是从成像的相应 3 个回肠切片获得的平均信号的平均值。为了确保GFP荧光的差异是由于IPTG而不是分析偏差造成的，在相同的选定图像区域上对DAPI信号进行了类似的定量，结果显示不同IPTG处理之间的DAPI信号没有显着差异（S8图）。
定量 S 的 GFP 荧光。从粪便样本中，首先从接种一周后用工程细菌定植的蜜蜂中收集粪便，并立即在无菌PBS中以1：10稀释。在用上述相同的显微镜设置对蜜蜂内脏进行成像之前，将5至10μl稀释的粪便覆盖在盖玻片上。对每个粪便样本的七个不同区域进行成像。细胞的荧光定量通过为本研究开发的斐济宏自动进行（参见代码可用性部分）。Macro 是使用 Fiji 软件（ImageJ2，版本 2.9.0）运行的。简而言之，根据 GFP 荧光阈值对细胞进行计数和分割，并且对每张图像的平均所有细胞区域的 GFP 信号。最后，每只蜜蜂报告的平均GFP强度（即每个粪便样本）是从相应的7个成像样本区域获得的平均信号的平均值。
支持信息
研究中显示的图基础源数据。
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一个
1 粪便量 （μl）
2 9
3 7
4 0
5 4
6 0
7 2
8 2.8
9 3.5
10 5.5
11 5
12 5.3
13 6.8
14 2
15 4
16 2.8
17 4.7
18 6.7
19 6.5
20 6.8
21 2.7
图1b图1c图1d图3a图3b图4a图4c图4d图5b图5e图5g补充图1补充图3a补充图3b补充图3c补充图4a补充图4b补充图5a补充图6b补充图7补充图8
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S1 数据。 研究中显示的图基础源数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.s001
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S1 图。 粪便中的细菌载量是肠道定植水平的指标。
散点图显示了工程 S 的细菌浓度值的线性回归。在粪便和肠道匀浆的匹配样本中发现Alvi（即粪便和肠道来自同一只蜜蜂）。提供了 n = 22 时的 Pearson 相关系数 R 和 p 值。该图的基础数据可以在 S1 数据文件的“补充图 1”表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.s002
（PDF格式）
S2 图。 本研究中开发的宽宿主范围载体的质粒图谱。
宽宿主范围的复制子来源于 pSEVA1213S、pBMTBX-2、pME6012 和 pDR401 质粒（顶行）。携带抗生素标记物和荧光蛋白的标准片段来自基于RSF1010的载体pBTK570 [28]、pAC08和pAC09（左列）。在这些研究中，RSF1010被不同的宽宿主范围复制子所取代，从而产生了11个新的载体。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.s003
（PDF格式）
S3 图。 qPCR引物和标准曲线的验证。
通过在琼脂糖凝胶上显示扩增子（左图）和生成熔解曲线（中图）来确认引物特异性。使用连续稀释的 （a） S 基因组 DNA 生成标准曲线。阿尔维，（b）B。apis，或 （c） pBTK570 的 miniprep。该图所依据的数据可在 S1 数据文件、“补充图 3A”、“补充图 3B”和“补充图 3C”中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.s004
（PDF格式）
S4 图。 蜜蜂肠道共生体 B 中功能性广泛宿主范围复制子的表征。API。
（a） 宽宿主范围的质粒在 B 中具有不同的拷贝数。API。箱形图显示了通过qPCR从3个独立实验中获得的质粒拷贝数的中位值，每个实验有5个生物重复（总n=15）。中位拷贝数用相应的箱形图表示。（b）质粒拷贝数的差异导致B中不同的蛋白表达水平。API。图显示了 E2-深红色荧光的平均值± 5 个生物学重复的标准偏差。每个重复代表通过流式细胞术测量的至少 9,000 个细胞的平均荧光。用于 B 中 panel a 和 b 的质粒。API 分别为 pBTK570、pAC06、pAC11 和 pAC04，分别携带复制的 RSF1010、RK2、pTF-FC2 和 pBBR1 来源。（c） 一些复制子是相容的，可以在B中共转化。API。矩阵表表示兼容（带复选标记的绿色框）和不兼容（带十字标记的红色框）复制子。在B中通过共轭成功共转化后，发现载体是相容的。API 细胞。该图所依据的数据可在 S1 数据文件“补充图 4A”和“补充图 4B”中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.s005
（PDF格式）
S5 图。 质粒 pBTK552 在我们的实验条件下遗传不稳定。
（a） 图表显示了细菌群 GFP 阳性的平均±标准差百分比。对每个构建体进行了三个生物学重复测试。每个重复值基于至少 9,000 S 的平均荧光。通过流式细胞术测量的alvi细胞，在具有（+）或不具有（?）IPTG的3ml TSB中生长3天。作为参考，S.alvi 携带组成型表达 GFP 和 S 的 pAC08 质粒。还分析了携带我们的 pAC17V5 双向量系统的 alvi。（b） CP25 区域间从 pBTK552 中删除。显示了pBTK552载体的质粒图谱（上图），其中包含在不稳定区域（下图）获得的频繁缺失的代表性Sanger测序。虚线表示删除的位置。该图背后的数据可以在 S1 数据文件的“补充图 5A”表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.s006
（PDF格式）
S6 图。 测试S中不同的IPTG诱导结构。阿尔维。
（a） 本研究中构建的 IPTG 诱导质粒图谱。（b） S.使用我们的诱导质粒设计的 alvi 细胞在体外对 IPTG 暴露有反应。该图显示了代表每个测试构建体的 5 个生物学重复的 GFP 荧光中位值的箱形图。每个重复值基于至少 9,000 S 的平均荧光。通过流式细胞术测量的alvi细胞，这些细胞在含有（+）或不含（?）IPTG的液体中生长。作为参考，野生型 S。阿尔维，S.alvi 携带组成型表达 GFP 的 pAC08 质粒和 S。还分析了携带先前构建的 pBTK552 载体 [28] 的 alvi。指示未诱导和诱导细胞之间平均荧光的倍数变化。该图的基础数据可以在 S1 数据文件的“补充图 6B”表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.s007
（PDF格式）
S7 图。 IPTG 诱导构建体 pAC17V3 允许蜜蜂和无刺蜂肠道共生体感知和响应 IPTG。
Snodgrassella alvi（阿尔维斯诺德格拉斯菌）ESL0693，用诱导质粒 pAC17V3 改造的 Gilliamella apicola wkB7 和 Gilliamella apis ESL0169细胞对体外 IPTG 暴露有反应。图表显示了代表每种条件下 5 个生物学重复的 GFP 荧光中值的箱形图。每个重复值基于作为细菌草坪生长到补充有（+）或不（?）1 mM IPTG的固体培养基（TSA）上的细胞的荧光。指示未诱导和诱导细胞之间平均荧光的倍数变化。荧光是根据 EPI 荧光使用 Fusion FX （Vilber Lourmat） 设备（16 光圈，F-740 滤光片）拍摄的图像和条件之间的相同曝光时间确定的。使用Fiji软件（ImageJ2，版本2.9.0）进行分析。使用的强度测量是减去细胞和培养基自发荧光后细菌草坪每单位面积的平均强度。根据从相应野生型细胞（即不携带pAC17V3质粒）的细菌草坪测量的强度获得每种菌株的自发荧光值。该图的基础数据可以在 S1 数据文件的“补充图 7”表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.s008
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S8 图。 来自肠道组织的DAPI测量。
图显示了代表 S 的 DAPI 荧光中值的箱形图。从喂食补充有 0、0.1 或 1 mM IPTG 的糖水的蜜蜂肠道成像的 alvi 生物膜。针对每种情况分析了五只蜜蜂，并从每个肠道的 3 个不同部分取平均荧光值。单因素方差分析检验，不显著 （ns），q 值> 0.5。该图背后的数据可以在 S1 数据文件的“补充图 8”表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.s009
（PDF格式）
S9 图。 用于流式细胞术分析的细胞门控。
图形显示了用于 S 门控的伪彩色图。Alvi细胞。象限限是根据携带 （a） 空骨架 pAC07（无荧光）、（b） pAC08（单独 GFP）或 （c） pBTK570（单独 E2-深红色）的参考细胞的测量荧光确定的。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.s010
（PDF格式）
S1 表。 本研究中使用的质粒。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.s011
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S2 表。 本研究中使用的引物。
大写字母表示启动序列，小写核苷酸表示 Gibson 组装的同源区域作为引物突出部分。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.s012
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S1 文本。 斐济宏观。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002523.s013
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确认
我们感谢 Estelle Pignon、Emanuele Boni 和 Morin Chhun 在整个项目中进行的有益的科学讨论。我们感谢保罗·拉查特（Paul Lachat）对实验室的支持。我们还要感谢 Théodora Steiner 在启动与蜜蜂肠道共生体合作方面的指导。此外，我们感谢伊斯梅尔·托雷斯·罗梅罗博士在编写斐济宏观方面提供的帮助。
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