厦门免费医学论文发表-细胞器膜接触位点的病毒调控
抽象
细胞器功能的核心在于它们形成动态细胞器-细胞器网络的能力和需求，这些网络驱动细胞内通讯和细胞通路的协调。这些网络由促进细胞器内和细胞器间通讯的膜接触位点 （MCS） 促进。鉴于MCS和形成MCS的多种功能，MCS和形成它们的蛋白质通常在感染过程中被病毒选择，以促进病毒复制。本文讨论了多种人类病毒在前病毒过程或宿主防御中调节MCS功能的机制。它还研究了用于在病毒感染背景下检查MCS的技术。
数字
图3图4表1图1图2图3图4表1图1图2
引文： Hofstadter WA、Tsopurashvili E、Cristea IM （2024） 细胞器膜接触位点的病毒调节。PLoS 生物学 22（3）： 编号：E3002529。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002529
发表： 3月 5， 2024
版权所有： ? 2024 Hofstadter et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
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利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
缩写： 克莱 相关光学和电子显微镜;数字万用表 电子显微镜;DRM的 内质网;DTM的 电子断层扫描;HCMV， 人类巨细胞病毒;丙型肝炎病毒， 丙型肝炎病毒;HIV-1， 人类免疫缺陷病毒-1;HRV， 人类鼻病毒;单纯疱疹病毒-1， 单纯疱疹病毒 1 型;MCS， 膜接触部位;门克， 线粒体-内质网包封;中东呼吸综合征， 中东呼吸综合征冠状病毒;定向刨花压定向刨花压 氧甾醇结合蛋白;解放军 邻近连接试验;PI4P， 磷脂酰肌醇-4-磷酸;PRM， 并联反应监测
介绍
真核细胞的一个决定性特征是细胞功能的区室化。真核细胞的亚细胞空间被分离成细胞器，每个细胞器都具有适合其特定细胞作用的独特结构和组成。传统上，细胞器被研究为相互独立运作的孤立实体。然而，过去20年显微镜的进步揭示了在互连网络中相关的细胞器的高度复杂情况，从而引发了膜接触位点（MCS）研究领域[1\u20125]。MCS 是 2 个或更多细胞器的紧密结合（约 15 至 30 nm），允许在不诱导膜融合的情况下快速进行细胞器间串扰。细胞器接触广泛存在于酵母、植物和动物细胞中，每个细胞器（包括无膜细胞器）都会形成MCS[6–8]。这些关联的标志性作用包括促进物质（如离子、脂质和代谢物）的非囊泡交换，微调细胞器的特性和动力学，以及调节囊泡运输[3]。
细胞器接触的形成和功能由几种不同类别的MCS蛋白控制，这些蛋白共同赋予每种MCS独特的特性[3]。也许最简单的是，MCS蛋白可以发挥结构作用，充当连接细胞器的系绳，或间隔物以保持细胞器膜之间的规定距离[9]。MCS蛋白还可以发挥更多的功能作用，促进脂质、离子或代谢物在细胞器之间的转移[10,11]。此外，MCS蛋白可以通过将其他MCS蛋白募集到接触点、改变MCS中存在的蛋白的活性或调整接触程度来调节给定MCS的身份和活性[12]。单一蛋白质也可以发挥上述几个作用。事实上，大多数功能性MCS蛋白也显示出一定的拴系能力[13]。
由于它们在细胞稳态中的重要作用，细胞器接触受到高度调节。因此，MCS失调是多种神经退行性疾病以及遗传和代谢疾病的标志[14–18]。同样，病毒感染可触发细胞器接触重组，以调节细胞器结构和功能，并建立成功的复制周期[19–27]。病毒是专性寄生虫，表明它们必须选择现有的细胞通路并调节其稳态功能以支持病毒复制。在这样做的过程中，病毒也必须是有效的，因为它们编码的蛋白质相对较少。因此，为了最大限度地提高这种有限的编码能力，病毒通常会失调MCS，因为MCS代表控制细胞器功能和分子转运的细胞通讯点。
已知多种病毒利用MCS将细胞内过程（包括钙信号传导、脂质运输以及凋亡和先天免疫途径）转变为病毒的益处（表1）。为此，病毒控制MCS蛋白丰度、定位、翻译后修饰和蛋白-蛋白相互作用[27–30]。在本文中，我们探讨了 MCS 在病毒复制过程中可以发挥的几个核心功能，并提供了共享或引人注目的病毒诱导的 MCS 调节的具体示例。
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表 1. 多种病毒利用MCS蛋白来重塑接触。
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MCS 作为成功病毒感染的关键决定因素
用于研究MCS的工具的进步揭示了各种病毒如何依赖MCS调节来实现有效复制。虽然MCS可以发挥多种关键作用，但MCS在病毒复制过程中的一个共同功能是离子和脂质（如钙和胆固醇）的运动[20,59]。改变这些代谢物的通量可以影响病毒复制周期的每一步，包括进入、基因组复制、组装和出口。
许多DNA和RNA病毒依靠内吞作用进入细胞，随后通过内溶酶体系统运输以释放到细胞环境中，这些过程依赖于宿主MCS[60\u201262]。例如，最近涉及流行病的2种RNA病毒，即埃博拉病毒和中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus， MERS），需要内体定位的MCS蛋白才能释放到细胞中[24,48]。这些病毒依靠溶酶体的酸性环境来促进病毒粒子的脱壳和释放（图1A）。为了适当成熟为溶酶体，内体必须与内质网（endoplasmic reticulum， ER）保持接触[62]。为了诱导这种成熟，埃博拉病毒和MERS靶向MCS蛋白TPC1，该蛋白可促进钙通量[63]，以调节内体-内质网MCS（表1）。抑制TPC1会损害埃博拉病毒粒子和MERS病毒粒子通过内溶酶体系统传播的能力，这足以预防巨噬细胞感染埃博拉病毒并限制MERS感染性[24,48]。
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图 1. 整个病毒复制周期的 MCS 改变。
(A） 埃博拉病毒进入示意图，依赖于IP3R 和 TPC1 离子通道（切口）。（B） HRV 感染促进胆固醇通量进入高尔基体衍生的复制细胞器 （RO） 以促进基因组复制。这是通过 MCS 蛋白 OSBP 和 VAPB 完成的，它们介导来自高尔基体的 PI4P 与来自 ER 和 LD 的胆固醇的交换（切口）。（C）拉沙病毒打开细胞外钙通道，促进病毒排出。拉沙病毒蛋白诱导内质网释放钙 （Ca2+），刺激 STIM1 与 ORAI1 一起重新定位到内质网质膜 MCS，从而诱导细胞外钙输入（切口）。ER，内质网;HRV，人类鼻病毒;LD， 脂滴;OSBP，氧甾醇结合蛋白;RO， 复制细胞器。
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进入后，病毒必须复制其基因组并组装所有病毒粒子成分。病毒已经开发了许多不同的基因组复制和组装策略，具体取决于它们的基因组类型和病毒粒子结构。例如，大多数DNA病毒在宿主细胞核中复制，在那里它们可以选择现有的宿主复制机制[64]。或者，所有正链RNA（+RNA）病毒都在一个复杂的膜质区室网络中复制，这些膜室称为复制细胞器，富含有效基因组复制所需的病毒蛋白和宿主因子[65]。细胞器接触已成为关键的宿主因子，许多病毒利用这些因子来产生和调节复制细胞器[66]。这些病原体已经开发出将MCS蛋白重定向到靠近复制位点的细胞器接触的策略，以促进脂质通量，从而促进复制细胞器的生物发生和维持[20,66,67]。
几个+RNA病毒家族，包括小核糖核酸病毒和鼻病毒，在ER-高尔基体界面重塑MCS以重定向脂质流动（图1B）。在未感染的细胞中，氧甾醇结合蛋白（oxysterol-binding proteins， OSBPs）控制胆固醇从内质网转移到高尔基体[68]。在此过程中，OSBP 还代谢了存在于高尔基体膜上的大部分磷脂酰肌醇 4-磷酸 （PI4P） 脂质。其中，鼻病毒依靠这种胆固醇-PI4P交换来产生富含胆固醇的病毒复制区室[50]（图1B和表1）。从广义上讲，这是通过首先通过磷脂酰肌醇 4 激酶之一增加高尔基体衍生的复制细胞器的 PI4P 水平来实现的。然后，OSBP 介导 PI4P 与胆固醇的交换，以将胆固醇输送到复制细胞器。为了维持内质网上的胆固醇池以转运到复制细胞器，其他 MCS 蛋白，包括 OSBP 样 （OSBPL） 蛋白，在病毒复制位点与内质网介导脂滴和/或内体 MCS。强调这些MCS衍生结构的重要性，敲除OSBP1或表达缺乏与PI4P结合能力的OSBP1突变体，阻止了几种人类鼻病毒（HRV）的复制[50]。虽然在+RNA病毒中最为普遍，但在一些细胞质复制DNA病毒（如牛痘病毒）中也观察到复制细胞器结构的形成[69]。
现在组装好了，成熟的病毒粒子必须通过一个称为出口的过程离开细胞。对于出口，病毒必须再次与质膜和内膜系统相互作用。因此，许多参与进入的MCS蛋白也可以被重新连接以促进病毒出口。例如，几种出血热病毒，包括负链RNA（?RNA）沙粒病毒和丝状病毒，调节MCS蛋白ORAI1和STIM1的出口[54]，与DNA病毒单纯疱疹病毒1型（HSV-1）进入所依赖的蛋白质相同（表1）[53]。对于出血热病毒，病毒基质蛋白刺激内质网钙释放，然后触发STIM1重新定位到质膜并与ORAI1接触，从而促进细胞外钙输入细胞（图1C）。然后，这种外部钙供应可以支持病毒复制的许多不同方面，包括促进膜融合以进入或退出[70]。在HSV-1感染期间，该通路的激活导致TRPC1重新定位到质膜，在那里它可以与HSV-1病毒粒子表面的病毒糖蛋白gD结合，并促进病毒进入[53]。或者，有许多特定于出口的策略。呼肠孤病毒感染会促进病毒包涵体的形成，病毒包涵体是病毒复制的膜状结构[71]。然后，这些病毒包涵体使用未知的MCS蛋白将成熟的病毒粒子转移到修饰的溶酶体中，称为分选细胞器，随后靶向质膜以进行非裂解性出口[71]。
MCS和内在免疫
虽然许多病毒已经开发出独特的方法来在整个复制周期中篡夺MCS，但重要的是要记住，宿主细胞并非毫无防御能力。一旦在宿主细胞内检测到病毒复制，几种内在免疫信号通路就进化出了关闭通常被颠覆的MCS蛋白的机制。宿主细胞做到这一点的一种方法是激活与病毒需求拮抗的 MCS 蛋白。例如，甲型流感病毒包膜RNA病毒需要在质膜上富集胆固醇才能组装病毒粒子，这一过程由MCS蛋白NPC1促进（表1）[45]。NPC1 的功能是将胆固醇从内体中调出并进入内质网，然后下游 MCS 蛋白可以将其转移到质膜上（图 2A）。为了抵消这种流动，宿主细胞使用MCS蛋白ANXA6，反而促进胆固醇在内体中的积累（表1）[42]。这是甲型流感感染的关键阶段，因为抑制NPC1活性或过表达ANXA6会阻止病毒组装[42,45]。同样，胆固醇负荷可以防止水疱性口炎病毒蛋白G向质膜运输[72]。因此，病毒除了选择MCS功能外，还必须破坏某些MCS蛋白的抗病毒活性。
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图 2. MCS在感染期间具有前病毒和抗病毒功能。
(A）甲型流感感染需要在质膜上富集胆固醇才能有效复制。为了到达质膜，胆固醇必须首先从内体中运输出来并进入内质网，这一过程由 MCS 蛋白 NPC1 促进，但被 ANXA6 抵消。（B） 许多病毒利用OSBP将胆固醇通化到高尔基体或高尔基体衍生的膜中。抗病毒蛋白 IFITM3 的功能是胜过 OSBP 与其伴侣 VAPB 的结合，从而防止高尔基体的胆固醇富集。（C） RIG-I 识别胞质病毒 RNA，然后定位于 ER-线粒体 MCS 以激活 MAVS 和下游抗病毒信号转导。ER，内质网;MCS， 膜接触部位;OSBP，氧甾醇结合蛋白。
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或者，宿主细胞可以更直接地阻断前病毒MCS蛋白的功能。如前所述，胆固醇再分布是病毒感染的常见要求，因此是抗病毒信号通路的广谱靶标。IFITM3就是一个例子，IFITM3在应对多种病毒感染时被激活，并通过破坏前病毒MCS蛋白相互作用来发挥其抗病毒功能之一[28]。当受到刺激时，IFITM3 在与 VAPA 的结合方面优于 OSBP，从而导致胆固醇循环失调（图 2B）。由此产生的胆固醇积累将入侵的病毒粒子困在多泡体中，从而在病毒开始复制之前阻止病毒复制[73]。进一步表明，这一步骤是病毒复制中常见的关键，抗病毒信号通路还促进胆固醇的氧化，形成25-羟基胆固醇和27-羟基胆固醇等氧甾醇。这些化学物质通过改变膜脂质组成，从而抑制膜融合，对多种DNA、RNA、包膜和非包膜病毒具有广谱抗病毒活性[74,75]。
正如宿主细胞已经开发出抑制前病毒MCS功能的方法一样，病毒也已经开发出使用MCS来抑制抗病毒信号通路的方法。抑制抗病毒途径的一个常见靶点是线粒体，它除了是细胞的主要能量产生者外，还是许多免疫信号轴的中心枢纽。例如，宿主细胞可以通过细胞质传感器RIG-I检测RNA病毒，进而激活ER-线粒体MCS的MAVS，最终诱导免疫应答[29,76]（图2C）。在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus， HCV）感染期间，病毒蛋白NS4A特异性定位于内质网-线粒体MCS，以切割MAVS并阻碍该信号通路（表1）[27–29]。另外，在登革热病毒感染期间，病毒蛋白NS4B可阻止宿主线粒体裂变因子Drp1（人类DNM1L）的激活，导致线粒体和病毒诱导的复制细胞器之间的MCS增加（表1）[31]。这种调节导致内质网-线粒体MCS同时减少，从而抑制MAVS的激活[31]。相反，病毒蛋白可以直接抑制线粒体膜电位，这是MAVS激活所必需的[77]。大流行性甲型流感病毒株利用病毒蛋白PB1-F2在线粒体内膜和外线粒体膜之间形成MCS，导致渗透性过渡孔复合体的形成和随后的膜去极化[40,77]。对于快速复制且不需要线粒体产生能量的病毒来说，这是一种特别有用的策略。
病毒诱导的MCS失调重塑了细胞景观
MCS蛋白有助于赋予单个细胞器身份，同时也促进细胞器间的通讯。因此，病毒感染期间的MCS蛋白失调促进了许多观察到的细胞器景观变化，以及特定感染的许多标志性特征。
MCS诱导的细胞器重塑的一个突出例子是在感染人巨细胞病毒（HCMV;图3A）。这种大型 DNA 病毒在漫长的 120 小时内复制，在此期间，病毒蛋白必须完成双重作用，即为病毒复制产生足够的能量，并保持宿主细胞存活直到病毒粒子出口。为了实现这一点，HCMV感染在整个病毒复制周期中上调了几乎所有MCS蛋白丰度[27]，同时重塑了每个亚细胞器[26,78,79]。特别是，HCMV感染会重塑内质网-线粒体MCS，形成称为线粒体-内质网包膜（mitochondria-ER encapsulations， MENC）的结构[27]。MENCs由内质网小管对线粒体进行时间稳定、不对称的拔罐组成（图3B）。MCS蛋白VAPB和PTPIP51在感染期间定位于MENC，是有效病毒复制所必需的（表1）[27]。虽然这种接触的功能尚不清楚，但MENCs在促进钙[11,80]和脂质[81]交换或防止线粒体降解[82]以促进线粒体活性方面处于有利地位。
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图 3. HCMV 通过选择 MCS 来调节细胞器结构和功能。
(A） HCMV在感染期间几乎重塑了所有细胞器，包括线粒体（橙色）、细胞核（蓝色）、过氧化物酶体（绿色）、内质网（浅蓝色）和高尔基体/内体（紫色）。（B） PTPIP51 和 VAPB 介导的 MENC 在 HCMV 感染晚期成为主要的 ER-线粒体 MCS。（C） HCMV 还使用 MCS 蛋白 ACBD5 和 VAPB 促进扩大和不规则形状的过氧化物酶体子集的形成。ER，内质网;HCMV，人巨细胞病毒;MCS， 膜接触部位;MENC，线粒体-内质网封装。
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VAPB与许多不同的MCS蛋白建立细胞器间的拴系，在内质网和不同的细胞器之间形成接触。例如，HCMV还利用VAPB通过与过氧化物酶体蛋白ACBD5的相互作用促进内质网与过氧化物酶体的接触[27]（图3C和表1）。ACBD5和VAPB有助于协调缩醛磷脂的合成[83]，该脂质在过氧化物酶体中起始并在内质网中最终确定，并促进过氧化物酶体增大[27]。因此，在整个HCMV感染过程中，浆醛磷脂合成增加，同时形成一个增大且形状不规则的过氧化物酶体亚群[84]。同样，ACBD5与HCV复制细胞器中形成扩大的过氧化物酶体有关（表1）[58]。缩醛磷脂是HCMV病毒粒子组装过程中次级包膜所必需的[84]，并在HCMV病毒粒子的包膜中富集[85]。令人惊讶的是，ACBD5过表达和敲低都会降低HCMV的复制效率[27]。这一发现强调了病毒在其复制周期中暂时调整MCS蛋白丰度的必要性。
虽然HCMV是重新连接MCS以提高宿主细胞生产力的病毒的一个很好的例子，但许多其他在较短时间内复制的病毒反而使用MCS来诱导宿主细胞死亡。脊髓灰质炎病毒、人类免疫缺陷病毒-1（human immunodeficiency virus-1， HIV-1）和甲型流感病毒通过调节钙通道的丰度来促进宿主细胞死亡（表 1）[39,40,86]。所有这些病毒都通过MCS蛋白VDAC刺激钙从内质网突然流入线粒体[59]。钙的快速流入导致线粒体塌陷和随后内在细胞凋亡途径的激活。鉴于这种机制在多个病毒家族中是保守的，并且病毒诱导的细胞死亡有助于发病机制，阻断病毒蛋白和VDAC之间的相互作用可能导致有效的广谱抗病毒反应[39]。有趣的是，许多病毒蛋白在促进线粒体功能障碍之前首先定位于内质网-线粒体MCS[33,87]。这进一步说明了MCS如何充当调节许多不同细胞器功能的控制中心。
病毒感染期间 MCS 表征的方法改进
技术进步使我们能够以比以往任何时候都更高的精度识别、量化和表征许多新的膜接触。1956年，电子显微镜（EM）是第一个允许MCS可视化的技术[88]。从那时起，EM和电子断层扫描（electron tomography， ET）的进步使研究人员能够直接可视化细胞器之间的MCS，并量化细胞器接触的几个参数，例如膜之间的距离、接触次数和接触长度[3,89,90]。EM还被用于识别涉及MCS的病毒感染的许多标志性特征，包括复制细胞器的形成，例如冠状病毒感染期间形成的双膜囊泡[91]。
细胞环境本质上是拥挤和复杂的，这使得很难识别 EM 图像中的特定结构。为了解决这个问题，可以使用相关光学和电子显微镜（CLEM）。CLEM是通过用光学显微镜和EM对荧光标记的样品进行成像，然后整合这两种图像，以利用光学显微镜的特异性和EM的分辨率来实现的[63,92]。这种技术在病毒感染期间特别有用，其中亚细胞景观被显着重塑，可以消除未感染细胞中常见的标志。此外，CLEM可以利用光学显微镜的能力来可视化MCS的功能。例如，CLEM用于表明，在HCV感染期间，病毒蛋白NS5A与MCS依赖性胆固醇通量位点共定位，这些位点用于形成复制细胞器[44]。另外，机器学习和人工智能的进步使得自动识别、分割和量化EM图像中的MCS成为可能[93,94]。
虽然光学显微镜无法与电镜的分辨率相媲美，但这种技术更容易、更经济，同时还支持活细胞的成像。此外，新技术已经突破了光学显微镜的极限，使这种技术成为一种有吸引力的选择。例如，光谱成像的进步使研究人员能够同时监测十几个荧光探针。随后，光谱成像可用于在单个样本中筛选许多不同的MCS[95]。超分辨率显微镜的无数进步也使MCS的可视化成为可能，同时提高了时间和空间分辨率[96,97]。在最近的一项研究中，3D超分辨率显微镜与深度学习相结合，以探索寨卡病毒蛋白如何重塑细胞器。病毒蛋白NS4B被证明可以破坏内质网和线粒体之间的MCS，有助于破坏宿主的内在免疫信号传导[98]。
显微镜的内在定性性质得到了定量固定和活体样品中MCS频率的补充。例如，在邻近连接试验（PLA）[99]中，如果添加到固定细胞中的抗体非常接近（<40 nm），则会产生特异性荧光信号。这允许量化 MCS 中存在的内源性蛋白质-蛋白质相互作用的定位和频率。因此，虽然光学显微镜可能没有分辨率来确定 2 个细胞器是否在 15 至 30 nm 的定义 MCS 范围内，但 PLA 可以确认这一点，并确定导致该 MCS 的特定蛋白质。在HCMV感染期间应用了这种强大的工具，以确认ER-过氧化物酶体和ER-线粒体MCS的增加[27]。或者，分裂荧光蛋白可用于定量活细胞中的MCS[100]。在该测定中，设计了 2 个质粒，每个质粒都具有针对特定目标细胞器的定位信号，以及分裂荧光蛋白（如 GFP）的互补半部分。因此，当这些构建体非常接近时，荧光蛋白的重整会产生可量化的信号。
除了量化 MCS 的丰度和定位外，鉴定给定 MCS 中存在的不同蛋白质以更好地确定其功能也非常有意义。回答这个问题的一个有效工具是拆分BioID方法，称为ContactID[101]。BioID是一种工程化的生物素连接酶，可使附近的蛋白质生物素化[102]。然后可以提取生物素化蛋白质并通过蛋白质组学进行表征。通过分裂 BioID，生物素连接酶仅在 2 个目标细胞器非常接近的位点被激活，其方式与分裂荧光系统类似。在感染的情况下，ContactID 还能够识别病毒蛋白如何与给定的 MCS 相互作用。
上述许多检测的缺点是，它们需要先验地了解样品中感兴趣的 MCS 蛋白。此外，许多 MCS 蛋白的丰度较低，并且缺乏用于分析它们的良好/负担得起的抗体。靶向质谱可用于分析整个感染过程中所有 MCS 蛋白的丰度，以确定哪些接触点和蛋白质值得研究。鉴于MCS蛋白丰度可用作接触程度的指标[103]，该测定法是在系统水平上识别MCS改变的有力工具。最近，开发了一种使用平行反应监测（PRM）靶向质谱方法的测定方法，可以同时定量人类细胞中几乎所有已知MCS蛋白的丰度[27]。该方法用于监测 HCMV、HSV-1、甲型流感和冠状病毒 OC43 感染中的 MCS 蛋白。当与显微镜和功能测定相结合时，该分析[27]表明，这些不同的病毒在颗粒和细胞尺度上对MCS进行差异调节。
综合使用时，这些工具使研究人员能够识别、量化和分配新 MCS 的功能，以及表征不同疾病状态下的 MCS 扰动。虽然本文提供了病毒介导的 MCS 改变的几个例子，但鉴于病毒病原体和 MCS 的丰富性，在这个不断发展的领域中仍有很多东西有待发现。因此，我们提出了一种工作流程，用于在任何病毒感染期间鉴定和表征感兴趣的 MCS（图 4）。首先，可以使用筛选方法来识别感兴趣的MCS（图4A）。MCS-PRM 是一种有效的方法，用于在整个病毒复制周期中同时监测大多数 MCS 和组成它们的蛋白质。如果对质谱仪的访问受到限制，则可以使用针对不同细胞器的分离式荧光探针与光谱成像相结合来同时监测MCS。其次，应采用更高分辨率的成像来可视化第一步中确定的MCS（图4B）。作为MCS-PRM的后续行动，这一点尤为重要。接下来，PLA可用于鉴定介导目标MCS的蛋白质-蛋白质相互作用（图4C）。最后，可以利用结合质谱的分离式 TurboID 系统来鉴定目标 MCS 中存在的蛋白质，这可以告知 MCS 的功能，并可能识别负责调节它的病毒蛋白。该工作流程有助于扩大对感染诱导的细胞器-细胞器接触重塑以及 MCS 在病毒复制和宿主防御中可能的协调功能的理解。
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图 4. 建议的 MCS 识别和表征工作流程。
(A） MCS 可以首先使用 MCS-PRM 进行鉴定，MCS-PRM 使用靶向质谱法来量化病毒复制过程中的 MCS 蛋白丰度。或者，可以使用多种分离荧光探针或光谱成像来同时监测MCS的形成。（B） MCS 应以高分辨率可视化，使用超分辨率共聚焦显微镜技术、EM/断层扫描，或者理想情况下，将两者结合起来进行 CLEM。（C） 形成目标 MCS 的蛋白质-蛋白质相互作用可以使用 PLA 可视化，而分裂 TurboID 系统 （ContactID） 可以识别定位于 MCS 的蛋白质。 CLEM，相关光学和电子显微镜;EM，电子显微镜;MCS， 膜接触部位;PLA，近距离连接试验;PRM，平行反应监测。
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结论和未来方向
尽管可用于研究 MCS 的技术多种多样，并且这些系绳在病毒感染背景下的重要性，但该领域的许多方面仍未得到探索。传统上，MCS是根据先验知识选择用于病毒感染期间的表征，例如关于细胞器重塑事件（例如，复制细胞器形成）或小分子通量改变（例如，钙信号传导）。实施无偏倚研究，例如使用质谱方法（例如，MCS-PRM），可以扩大在整个病毒感染过程中监测的 MCS 的范围。值得考虑的是，许多以前用于研究MCS的强大技术，如ContactID[101]，尚未应用于病毒感染研究。这种方法有可能揭示病毒复制策略的机制见解，特别是考虑到关于病毒蛋白如何特异性诱导观察到的 MCS 变化的信息仍然有限。病毒蛋白调节MCS的一种未被探索的方法是直接与宿主MCS蛋白结合以形成新的系绳。这可以通过分析病毒蛋白质组来进一步探索MCS蛋白中发现的常见相互作用基序，例如促进与VAPA/VAPB相互作用的FFAT结构域[104]。
出于多种原因，鉴定感染期间靶向的 MCS 和 MCS 蛋白至关重要。首先，鉴于MCS是许多病毒感染的关键，并且不同的病毒靶向相似的MCS进行复制，因此筛查受影响的接触者有可能指向新的药物靶点和可能的广谱抗病毒治疗干预措施。其次，自病毒最初被发现以来，对病毒的研究已经导致了许多关于基础生物学的基本发现[105]。这在今天仍然是正确的，包括病毒感染期间的MCS研究。关于未感染细胞中MCS的形成、功能和调控，还有很多东西有待发现。鉴于病毒调节现有的宿主基础设施，病毒感染有可能放大MCS的正常细微特征，揭示它们在感染环境内外的重要性。因此，对病毒感染期间MCS改变的持续研究有望为理解病毒和宿主生物学提供重要视角。
确认
我们要感谢 Katelyn Cook 博士的宝贵见解。我们还要感谢该领域不断推动生物学领域的新前沿和创新。
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