厦门免费医学论文发表-是一种突触后蛋白，通过液-液相分离调节突触后蛋白的缩合
抽象
突触后密度 （PSD） 的蛋白质组分析是兴奋性突触突触突触后膜下的一种蛋白质特化，已鉴定出数千种蛋白质。虽然具有可预测功能的蛋白质已经得到了很好的研究，但功能上未表征的蛋白质大多被忽视。在这项研究中，我们对 35 个 PSD 蛋白质组数据集进行了全面的荟萃分析，共包含 5,869 种蛋白质。采用排名方法，我们鉴定了 97 种仍未充分表征的蛋白质。从这个选择中，我们将详细分析集中在排名最高的蛋白质FAM81A上。FAM81A 与 PSD 蛋白相互作用，包括 PSD-95、SynGAP 和 NMDA 受体，并促进这些蛋白在培养细胞或体外液相分离。培养神经元中FAM81A的下调导致PSD-95点的大小和神经元放电频率的降低。我们的研究结果表明，FAM81A在促进PSD内蛋白质的相互作用和组装中起着至关重要的作用，它的存在对于维持正常的突触功能很重要。此外，我们的方法强调了进一步表征许多突触蛋白的必要性，这些突触蛋白仍然缺乏全面的理解。
数字
图9图1表1图2图3图4图5图6Fig 7Fig 8图9图1表1图2
引文： Kaizuka T， Hirouchi T， Saneyoshi T， Shirafuji T， Collins MO， Grant SGN， et al. （2024） FAM81A 是一种突触后蛋白，通过液-液相分离调节突触后蛋白的缩合。PLoS 生物学 22（3）： 编号：E3002006。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006
学术编辑： Eunjoon Kim，韩国基础科学研究所
收到： 2023年1月4日;接受： 2024年1月17日;发表： 3月 7， 2024
版权所有： ? 2024 Kaizuka et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。
资金： 这项工作得到了日本科学促进会 （JSPS） 和文部科学省 （MEXT）、日本医学研究与开发机构 （AMED） 的 KAKENHI（JP16H06316、JP16H06463、JP21H04813、JP23H04233 到 TT、JP18H05434、JP20K21462、JP22H04981 到 YH、JP16J04376、JP18K14830 到 TK）的支持，授权号为 JP21wm0425011 给 TT， 日本科学技术振兴机构 （JST） 的资助号为 JPMJMS2299，JPMJMS229B 给 TT，NCNP 的神经和精神疾病校内研究资助 （30-9），武田科学基金会，太州生命社会福利基金会给 TT，人类前沿科学计划 （RGP0020/2019） 给 YH。传统知识得到了JSPS研究员补助金（JP16J04376）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
缩写： 牛血清白蛋白， 牛血清白蛋白;DIV， 日体外;DMEM， Dulbecco 的改良 Eagle 培养基;牛血清， 胎牛血清;哈佛商学院， 汉克斯平衡盐溶液;印尼盾， 固有无序区域;LFQ， 无标记定量;有限责任合伙企业， 液-液相分离;膜乘， 多电极阵列;NGS， 正常山羊血清;NMDA， N-甲基-D-天冬氨酸;PSD， 突触后密度;SDS， 十二烷基硫酸钠;SDS-PAGE， 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳;聪明 简单模块化架构研究工具
介绍
神经元通过突触相互交流，形成复杂的神经元网络。在兴奋性突触的突触后末端，参与突触传递及其调节的蛋白质高度富集，形成突触后密度（postsynaptic density， PSD）[1–3]。最初在突触结构的电子显微镜分析中发现，PSD对去垢剂的相对抵抗力允许PSD组分的生化分离，这是该组分生化研究的来源[3\u20125]。已经对该组分进行了多项蛋白质组学分析，发现了许多参与突触结构和功能的蛋白质，包括递质受体、支架蛋白、细胞骨架蛋白和信号分子[6\u201225]。此外，使用特定PSD组分的酵母双杂交筛选、免疫沉淀、亲和纯化和邻近标记可提取直接和间接结合伴侣[26\u201234]。
随着蛋白质组分析技术的进步，在PSD组分中检测到的蛋白质数量增加并达到数千个数量级[35]。虽然许多是真正的PSD蛋白，但从其已知的功能和分布来看，其他的则是明显的污染（例如神经胶质细胞或突触前区室中的蛋白质）。此外，由于难以确定它们是污染物还是不可重复性，因此忽略了多种没有已知功能或定位的蛋白质，因此被排除在深入分析之外。
在这里，我们对在不同实验设置下获得的多个已发表的数据集进行了荟萃分析，假设在多个数据集中鉴定的那些蛋白质是真实的 PSD 蛋白质。然后，我们鉴定并深入表征了排名靠前的蛋白质FAM81A。我们的数据表明，FAM81A是一种功能上至关重要的突触后分子，可调节其他PSD蛋白的缩合。这种对多个蛋白质组数据集进行荟萃分析的方法将有助于识别样本中真正的蛋白质，否则这些蛋白质会被单个数据集所忽略。
结果
PSD蛋白质组数据集的Meta分析
我们通过定量分析多项调查的综合结果，对多组 PSD 蛋白质组研究进行了荟萃分析。我们分析了 35 个数据集，其中至少 30 种蛋白质（表 1），其中 20 种来自生化分离的 PSD 组分，然后进行质谱分析（无偏倚，图 1A），15 种通过免疫沉淀、下拉或近端标记已知 PSD 组分（基于候选物，图 1B）。在 1 个数据集中至少检测到 5,869 种蛋白质，其中 5,800 种蛋白质处于生化分离研究中，995 种蛋白质处于其他研究中（图 1C 和 S1 表）。总体而言，来自生化分馏研究的数据集显示鉴定的蛋白质高度重叠，尽管它们来自物种、大脑区域和纯化方案不同的各种样品。相比之下，免疫沉淀、下拉或近端标记数据集显示出相对较低的重叠。即使使用相同的起始蛋白（如GluN2B或PSD-95），也观察到低重叠，这表明这些方法的随机性。
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图 1. PSD 蛋白质组数据集的荟萃分析。
（A 和 B）在 35 个 PSD 蛋白质组数据集中检测到的蛋白质重叠。顶部面板中的“蛋白质复合物”表示 PSD 蛋白质复合物的 15 个数据集中包含的 995 种蛋白质。（C） 维恩图描述了 PSD 组分和 PSD 蛋白复合物的重叠。（D） 检测到的数据集数量的直方图。（E） 属于指定 GO 术语的蛋白质百分比。（F 和 G）对在 20 多个蛋白质组数据集中检测到的 123 种蛋白质进行 SynGO 富集分析。定位的结果（细胞成分;CC） （F） 和功能 （生物过程;BP） （G） 显示为 -log10 Q 值。PSD，突触后密度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.g001
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表 1. 本研究中提到的 35 个 PSD 蛋白质组数据集的列表。
第 1-20 号总结了生化纯化的 PSD 组分（无偏倚）的蛋白质组数据，第 21-35 号是 PSD 蛋白复合物的蛋白质组数据（基于候选）。描述了原始文章、样品和方法的信息以及每个数据集中检测到的蛋白质数量。请注意，蛋白质的数量可以少于原始文章中显示的数量，因为 ID 转换失败的蛋白质被消除了。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.t001
在 5,869 种蛋白质中，仅在 1-5 个数据集中检测到约 4,000 种蛋白质（图 1D 和 S1 数据）。这些蛋白质可能包括来自非 PSD 蛋白的污染物，因为根据 GO 注释，其中只有 1.2% 是已知的 PSD 蛋白（图 1E 和 S1 数据）。相比之下，在多个数据集中可重复检测到的蛋白质含有更高比例的已知 PSD 蛋白。当我们分析在20多个数据集中检测到的123种蛋白质时，我们发现其中约40%是基于GO注释的PSD蛋白，这表明PSD蛋白在该组中高度富集（图1E和S1数据）。使用 SynGO 对 123 种蛋白质的分析显示 PSD 蛋白以及突触后细胞骨架和突触前蛋白的富集（图 1F）。至于蛋白质功能，突触的结构成分和与跨突触信号相关的蛋白质被发现富含其中（图1G）。正如预期的那样，在更高数量（>25）的数据集中检测到的蛋白质可能更丰富的蛋白质由众所周知的核心PSD蛋白组成，包括MAGUK家族蛋白和谷氨酸受体亚基（S1图和S1数据）。我们对 PSD 蛋白质组数据集的荟萃分析，用于在多个数据集中反复检测到的蛋白质，成功鉴定了已知的核心 PSD 蛋白。
从 PSD 蛋白质组数据集中鉴定表征不足的蛋白质
我们询问这种方法是否可以检测尚未作为PSD蛋白进行充分研究的蛋白质。我们首先根据克隆ID或染色体区域（FamXX和XXXX...Rik）[36,37]。此外，我们还检索了以特定结构域命名的蛋白质;Tmem用于跨膜结构域，Ccdc用于卷曲螺旋结构域，Cctm用于两者，Zfp用于锌指结构域[38\u2012422]。结果，从总共 5,869 种蛋白质中鉴定出 177 种蛋白质（S2 表）。其中，97 种蛋白质在至少 2 个数据集中检测到，21 种蛋白质出现在 8 个以上数据集中（图 2A 和 S1 数据）。我们重点研究了排名靠前的蛋白质FAM81A，该蛋白在21个数据集中检测到，包括15个PSD分离和6个其他研究（图2A和2B）。尽管先前的一项研究通过电子显微镜和免疫印迹证实了FAM81A在PSD中的存在[43]，但尚无关于其在PSD中的结构或功能作用的研究。
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图 2. FAM81A，一种在高等脊椎动物大脑中表达的PSD蛋白。
（A） 表征不佳的假设 PSD 蛋白。列出了在至少 8 个数据集中鉴定的蛋白质。蓝色和黄色条表示无偏和基于候选方法的数据集数量。蛋白质的名称被描述为小鼠基因的官方符号。（B） 21个PSD蛋白质组数据集，其中鉴定出FAM81A（FAM81A）。（C） FAM81A的同源物。红色和蓝色项目分别表示 FAM81A 和 FAM81B 的直系同源物。绿色项目表示 FAM81A 和 2 在两栖动物、鱼类和无脊椎动物中的共同直系同源物。系统发育树用Kalign（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/）描述。Hs：智人，Mm：Mus musculus，Gg：Gallus gallus，Pp：Paroedura picta，Xl：非洲爪蟾，博士：Danio rerio。Ci：肠蛾，Bl：披针枝口，Sp：紫癜圆线虫，Ac：加州蛾。（D） FAM81A和FAM81 B在人体组织中的表达模式。数据来源于NCBI Gene。RPKM：每百万映射读取的外显子的每千碱基读取数。（E） 小鼠 （Mm） 和斑马鱼 （Dr） 中人 FAM81A、FAM81B 和主要 PSD 蛋白的序列保守性。使用Gene2Function评估相同或相似残基的百分比。PSD，突触后密度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.g002
FAM81A 是一种高级脊椎动物特异性 PSD 蛋白
使用蛋白质 BLAST，我们发现了具有 35% 序列同一性的人 FAM81A 的单个旁系同源物 FAM81B。我们使用蛋白质BLAST和Gene2Function在脊椎动物和无脊椎动物物种中搜索FAM81A和FAM81B的直系同源物[44]。FAM81A和FAM81B的直系同源物均在哺乳动物（小鼠）、鸟类（鸡）和爬行动物（壁虎）中发现（图2C），而在两栖动物（西爪蛙）和鱼类（斑马鱼）中仅发现1个直系同源物（FAM81B）。至于无脊椎动物，我们在被囊动物（海鞘）、头脊索动物（柳叶刀）、棘皮动物（海胆）和软体动物（aplysia）中只发现了1个FAM81直系同源物，而在环节动物、节肢动物和刺胞动物中找不到任何FAM81同源物（图2C）。这表明FAM81在高等脊椎动物的进化过程中复制，产生2个直系同源物[45]。
使用简单模块化结构研究工具（SMART）对FAM81蛋白质结构域结构的分析表明，人FAM81A和FAM81B分别具有2个和4个卷曲螺旋结构域（S2图）。此外，我们发现它们包含预计为内在无序的区域（S2图）。
人FAM81A与其小鼠直系同源物具有90%以上的序列同一性，与其他主要PSD蛋白相当（图2D）。相比之下，人类 FAM81A 和 FAM81B 与斑马鱼 FAM81B 的序列同一性分别只有 34% 和 37%，而其他 PSD 蛋白与其斑马鱼直系同源物的序列同一性为 60% 至 80%（图 2D）。这些数据表明，与其他PSD蛋白相比，FAM81A序列在脊椎动物谱系中进化迅速。
对mRNA表达的分析表明，FAM81A和FAM81B分别在人类和小鼠的大脑和睾丸中仅表达（图2E和S3A以及S1数据）。相反，在两栖动物中，FAM81B在广泛的组织中表达，表明FAM81A和FAM81B表达的调节在脊椎动物进化过程中已经分化（S3B图和S1数据）。
FAM81A 分布在 PSD 上，并与 NMDA 受体部分共定位
为了证实先前显示FAM81A定位于PSD的研究，我们分析了突触提取物中的蛋白质表达。我们发现FAM81A在抗去污剂的PSD组分中富集，与真正的PSD蛋白PSD-95类似，而突触前蛋白突触素从该组分中耗尽，这与之前的报道一致（图3A）[43]。使用粗突触体组分对 PSD-95 进行免疫沉淀，显示 FAM81A 与 PSD-95 相互作用，证实了蛋白质组结果（图 3B）。然后，我们使用免疫组化检查了FAM81A蛋白在小鼠大脑中的定位模式。在大脑的大多数区域观察到FAM81A的信号（图3C）。FAM81A免疫染色脑切片的高倍成像显示，发现它在成人大脑中形成点状结构，类似于其他突触蛋白（图3D）。在出生后第7天，当PSD-95以非常低的水平表达时，也观察到FAM81A的点状结构（S4A和S4B图）[34,46]。这表明 FAM81A 的 PSD 定位独立于 PSD-95。由于FAM81A已在N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的蛋白质复合物中检测到[47]，我们想知道FAM81A是否与NMDA受体共定位。NMDA受体的FAM81A和GluN1亚基的共染色显示这些点之间有部分重叠（图3E），表明一些突触表达这些蛋白质中的一种或两种。
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图 3. FAM81A 是一种与 NMDA 受体部分共定位的 PSD 蛋白。
（A） FAM81A在PSD中的富集。S1组分和PSD-I组分均以成年小鼠的脑匀浆为原料制备。（B） FAM81A 与突触中 PSD-95 的相互作用。使用抗PSD-95抗体对成年小鼠前脑的粗突触体部分进行免疫沉淀。（C 和 D）FAM81A在大脑中的分布。对成年小鼠大脑的矢状切片进行FAM81A的免疫组织化学检查。（E） FAM81A和NMDA受体的共定位。对成年小鼠大脑切片进行FAM81A和GluN1的免疫组化。齿状回的底部用高放大倍率描述。（F 和 G）使用根据我们发表的蛋白质组学数据计算的iBAQ强度来估计小鼠PSD（F）和突触体组分（G）中单个蛋白质的相对丰度[19]。比例尺：2 mm （C）、10 μm （D） 或 5 μm （E）。NMDA，N-甲基-D-天冬氨酸;PSD，突触后密度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.g003
为了评估突触中FAM81A蛋白的相对丰度，我们重新分析了之前对小鼠突触体和PSD组分的蛋白质组学研究的MS数据[19]。我们使用 iBAQ 强度估计了该数据集中蛋白质的相对丰度，发现尽管 FAM81A 在小鼠突触体中的丰度不是很高（3,818 种蛋白质中的丰度排名为 2,674），但 PSD 中 FAM81A 的丰度更高（丰度排名 3,314 种蛋白质中的 304 种），类似于与突触体相比，PSD 制剂中其他真正 PSD 蛋白的富集（图 3F 和 3G 和 S1 数据).综上所述，这些数据表明FAM81A是一种主要的突触后蛋白，与NMDA受体部分共定位。
FAM81A在神经元中形成凝聚物
为了分析FAM81A的细胞内定位和动力学，我们接下来在培养的神经元中观察FAM81A。外源性表达的FAM81A-GFP和PSD-95-mCherry共定位在树突棘的顶端，表明FAM81A的PSD定位在原代海马神经元中（图4A）。然后，我们对 DIV（体外日）16 至 18 的海马神经元中表达的 FAM81A-GFP 进行了延时成像（图 4B 和 S1 视频）。随着神经元成熟并获得蘑菇状树突棘，FAM81A凝聚在结构中（图4C和4D和S1数据）。除了在树突棘处积累外，我们还在胞体和树突轴中发现了FAM81A的凝聚物（图4E-4G）。这些细胞质凝聚不会在同一位置停留 30 分钟，这与 PSD 上点的稳定定位相反（图 4E-4G）。这些结果表明，FAM81A不仅在PSD上积累，而且在细胞质中形成动态缩合物。
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图 4. FAM81A凝聚物在PSD和神经元细胞质处的形成。
（A） FAM81A 在培养神经元中 PSD 的定位。在 DIV19 处用 FAM81A-GFP、PSD-95-mCherry 和 BFP 转染原代小鼠海马神经元。两天后，将细胞固定并用共聚焦显微镜观察。（B-G）用 FAM81A-GFP 和 DsRed 转染的原代培养小鼠海马神经元 （DIV16-18） 的实时成像（30 分钟/帧）。（B） 观察到的神经元的概述。描述了在图 C、E、F 和 G 中放大的区域。另请参阅 S1 电影。（C 和 D）脊柱成熟时 FAM81A 在 PSD 上的积累。图 C 中所示的 2 个棘的信号强度被量化并绘制在图 D 中。 （E） PSD 上 FAM81A-GFP 的点。（F） FAM81A-GFP在体细胞处的点。（G） FAM81A-GFP在树突轴上的点状。比例尺：（A） 50 μm（白色）或 10 μm（黄色）。（B–G） 10 μm（白色）或 5 μm（黄色）。DIV， 日体外;PSD，突触后密度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.g004
缩合所需的FAM81A的畴结构
我们试图在异源系统中复制缩合物，发现它也可以在突触蛋白几乎不表达的异源表达系统中复制HEK293T。这表明FAM81A具有在没有其他突触分子的情况下缩合的倾向（图5A和S2视频）。为了检查对缩合很重要的FAM81A的分子结构，我们通过产生一系列缺失突变体并在HEK293T细胞中表达它们来要求缩合所需的序列基序（图5B和S5）。通过免疫印迹证实了GFP标记突变体的表达（S6A图）。尽管大多数突变体的表达水平与全长FAM81A相当，但C端半（C-half;188–364）显示出显著较高的表达水平（S6A和S6B图和S1数据）。因此，我们分析了以相似表达水平表达这些突变体的细胞（参见方法）。我们发现C-一半完全消除了点状体的形成，而N-末端的一半（N-half;1-187）仍然形成了点状体，表明N-末端的一半对于缩合是必不可少的（图5A和5C和S1数据）。对N端半部分较小缺失突变体的分析表明，所有这些突变体都导致点形成减少（图5A和5C以及S1数据）。特别是，Δ1-36 和 Δ107-157 的冷凝物数量减少了约 90%。Δ1-36 和 Δ37-74 突变体的点的大小和/或最大大小比全长 FAM81A 更大且更无定形，表明这些突变体形成聚集体（图 5A、5D 和 5E 以及 S1 数据）。Δ75–106、Δ107–157 和 Δ158–187 在扩大结构的形成中表现出缺陷，并且 Δ75-106- 和 Δ158-187 阳性结构的大小小于全长 FAM81A 的大小，表明这些区域有助于 FAM81A 液滴的形成。综上所述，这些结果表明，FAM81A的N端（1–36）和2个卷曲螺旋结构域（107–157）之间的序列对其缩合很重要，而N端区（1–74）对于避免聚集体形成很重要。
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图 5. 缩合所需的FAM81A的畴结构。
（A）FAM81A突变体的凝聚物形成。用指定的FAM81A突变体转染HEK293T细胞，24小时后，将细胞固定并用共聚焦显微镜观察。（B） 小鼠FAM81A的一级结构。使用 SMART 鉴定卷曲螺旋结构域（CC1 和 CC2）和 LCR。使用 ConSurf 分析进化守恒性。使用 IUPred2A 评估紊乱的可能性。底部描述的截短突变体用于（A）。（C-E）（A）中描述的FAM81A液滴的定量分析。每个电池的 FAM81A 冷凝物数量 （C） 和 FAM81A 冷凝物的大小。（D）描述了单个细胞（E）中FAM81A凝聚物的最大尺寸。表达全长 Δ1–36、Δ37–74、Δ75–106、Δ107–157、Δ158–187、N-half 或 C 半 FAM81A 的分析细胞数分别为 98、85、87、109、95、101、93 或 83。比例尺：50 μm（白色）或 10 μm（黄色）。*P < 0.05。LCR，低复杂度区域;SMART，简单的模块化架构研究工具。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.g005
凝聚介导的FAM81A定位扩大树突棘
为了测试突触积累是否需要凝聚，我们观察了在海马神经元中表达的凝聚缺陷FAM81A突变体Δ107-157的定位。结果显示，与全长FAM81A相比，PSD的弥漫性胞质定位和积累明显受损，表明FAM81A的缩合对其PSD定位至关重要（图6A）。我们想知道FAM81A的PSD定位是否会影响树突棘的大小。因此，表达全长FAM81A的神经元上的树突棘的大小大于表达Δ107-157突变体的神经元的大小（图6B和S1数据）。这表明 FAM81A 在 PSD 上的积累会扩大脊柱尺寸。为了测试FAM81A的凝聚物形成和PSD定位是否是通过与PSD-95的相互作用介导的，我们测试了凝聚物形成缺陷的FAM81A突变体是否也存在PSD-95结合缺陷。我们发现，当PSD-95-GFP在HEK293T细胞中过表达时，可以与FAM81A-FLAG共沉淀（图6C）。出乎意料的是，我们发现这里测试的所有缺失突变体，包括 Δ107-157 在相似程度上共沉淀 PSD-95-GFP，这表明 FAM81A 具有多个 PSD-95 结合位点（图 6C）。Δ107–157 突变体与 PSD-95 的相互作用表明，与 PSD-95 的结合不足以使其缩合和 PSD 定位。总之，这些结果表明，FAM81A在PSD上的定位需要其凝聚，而FAM81A在PSD上的积累会扩大树突棘。
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图 6. 凝聚介导的FAM81A在PSD上的定位扩大了树突棘。
（A） 凝聚缺陷 FAM81A 突变体的 PSD 定位受损。原代培养的小鼠海马神经元在DIV19位点与DsRed一起转染全长或Δ107-157 FAM81A突变体。两天后，将细胞固定并用共聚焦显微镜观察。（B） 通过FAM81A在PSD上的积累来扩大树突棘。量化了表达 Δ75–106 FAM81A 的神经元上 1,337 个树突棘和表达全长 FAM81A 的神经元上 560 个棘的直径。（C） FAM81A 突变体与 PSD-95 的相互作用。HEK293T细胞用PSD-95-GFP转染，并指示用FLAG标记的FAM81A突变体;24 小时后，裂解细胞，并用抗 FLAG 抗体进行免疫沉淀。然后，用抗GFP或抗FLAG抗体进行免疫印迹。比例尺：50 μm（白色）或 10 μm（黄色）。*P < 0.05。DIV， 日体外;PSD，突触后密度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.g006
FAM81A通过液-液相分离形成冷凝物
为了揭示FAM81A凝结水形成的机制，我们使用延时成像对冷凝水进行了更详细的观察。我们发现FAM81A点状结构呈现出柔韧的形状，并经历了融合和裂变（图7A–7C），表明这些点状FAM81A结构具有类液体性质，而不是固体聚集体。我们还观察到较大的结构，通常具有复杂的形状（图7D）。这种结构的形状随着时间的推移是稳定的，表明它们是刚性的蛋白质聚集体（图7D和S3视频）。这些观察表明，FAM81A通过液-液相分离（LLPS）机制形成这些冷凝物。为了验证这一点，我们研究了1,6-己二醇通过干扰疏水相互作用[48]来破坏LLPS对HEK293T细胞中FAM81A液滴的影响。尽管保留了大的聚集体样结构，但大多数点在孵育 10 分钟后消失，这与 FAM81A 经历 LLPS 的假设一致（图 7E）。然后，我们测试了FAM81A的多聚化是否与LLPS有关。我们发现GFP-FAM81A被HEK293T细胞中表达的FAM81A-FLAG共同沉淀，表明FAM81A相互多聚化，以驱动其LLPS（图7F）。
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图 7. FAM81A与核心突触分子的相互作用和共定位。
（A-D）用 FAM81A-GFP 转染的 HEK293T 细胞的实时成像。（A） 观察到的细胞的概述。描述了图 B 和 C 中放大的区域。另请参阅 S2 电影。（B 和 C）经历融合 （B） 和裂变 （C） 的点状结构的代表性电影图像。（D）扩大的刚性结构，形状稳定。另请参阅 S3 Movie。（E） 1,6-己二醇对FAM81A正性结构的影响。用FAM81A-GFP转染HEK293T细胞，24小时后，将培养基更换为新鲜培养基，包括指定浓度的1,6-己二醇。十分钟后，细胞被固定。（F 和 G）FAM81A 之间的相互作用或 FAM81A 与 PSD-95、SynGAP 或 GluN2B 的相互作用。用指定的质粒转染HEK293T细胞，24 小时后裂解细胞，并用抗 FLAG 抗体进行免疫沉淀。然后，用抗GFP或抗FLAG抗体进行免疫印迹。（H-J）FAM81A在SynGAP阳性液滴上的定位。用指定的质粒转染HEK293T细胞，24 小时后，固定细胞并用共聚焦显微镜观察。对于图 H 和 J，在观察前使用抗 FLAG 抗体对细胞进行免疫细胞化学。比例尺：（A-D）中为10μm（白色）或5μm（黄色），（E）中为50μm（白色）或10μm（黄色），（H-J）中分别为20μm（白色）或4μm（黄色）。PSD，突触后密度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.g007
FAM81A与核心突触蛋白相互作用并形成缩合物
然后，我们测试了FAM81A是否可以与其他主要的PSD蛋白相互作用。我们发现HEK293T细胞中表达的GFP-SynGAP和GFP-GluN2B可以与FAM81A-FLAG以及PSD-95-GFP共免疫沉淀（图7G）。FAM81A与非神经元细胞中这些蛋白质的相互作用，几乎不表达突触分子，表明FAM81A直接与PSD-95、SynGAP或GluN2B结合。
研究表明，PSD-95和SynGAP联合使用时会发生LLPS[49,50]。一致地，我们在共表达时在HEK293T细胞中复制了GFP-SynGAP和PSD-95-mCherry的凝聚（S7图）。鉴于 FAM81A 与 PSD-95 和 SynGAP 的相互作用，我们测试了 FAM81A 是否可以在HEK293T细胞中与 SynGAP 或 PSD-95 一起进行 LLPS。结果，GFP-SynGAP和FAM81A-FLAG凝聚在一起（图7H）。另一方面，与FAM81A-GFP共表达的PSD-95-mCherry呈弥漫性分布，与FAM81A-GFP的点状分布几乎不定位于（图7I）。然而，当所有 3 种共表达时，它们一起形成缩合物，表明 PSD-95 需要 SynGAP 才能与 FAM81A 缩合（图 7J）。这些结果表明，FAM81A与核心突触蛋白相互作用，并与SynGAP阳性液滴共定位。
为了测试FAM81A是否可以在体外与PSD-95、GluN2B和SynGAP一起进行LLPS，我们对这些蛋白质进行了细菌表达和纯化，合并并在显微镜下观察它们。结果，FAM81A 与 SynGAP、GluN2B 和 PSD-95（各 3 μM）组合形成冷凝物（图 8A）。为了检查FAM81A在形成缩合物中的作用，我们接下来将FAM81A的浓度降低到1或0μM，同时保持其他蛋白质的浓度。在降低FAM81A的浓度后，我们发现冷凝水尺寸减小，如PSD-95通道所示（图8A和8B以及S1数据）。这表明FAM81A可以通过组装和稳定组分蛋白来促进PSD蛋白的缩合物形成。
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图 8. FAM81A 在体外促进突触后蛋白的 LLPS。
（A） FAM81A 与 PSD-95、GluN2B 羧基尾部和 SynGAP1 的 LLPS 的共聚焦显微图像。将 iFluor 488 标记的 PSD-95、NirFP 标记的 GluN2B 和 iFluor 405 标记的 SynGAP1（各 3 μm）与浓度递增（0、1 和 3 μm）的 iFluor 568 标记的 FAM81A 混合。比例尺：5μm。（B）液滴粒径分布直方图。**P < 0.01，***P < 0.001，通过单因素方差分析 （ANOVA） 和 Tukey-Kramer 检验。LLPS，液-液相分离;PSD，突触后密度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.g008
FAM81A 影响 PSD 大小和神经元活性
为了研究FAM81A在神经元中PSD形成中的作用，我们在培养的海马神经元中进行了FAM81A的敲低实验。我们通过使用慢病毒载体表达了 2 种不同的针对 FAM81A 的 shRNA（shFAM81A #1 和 #2），这两种载体都将 FAM81A 的 mRNA 水平下调至 <10%（S8A 图和 S1 数据）。然后，我们分析了神经元上的PSD-95点，使用GFP可视化受感染神经元的树突（S8B图）。在表达 FAM81A 的 shRNA 的神经元中，PSD-95 点的大小减小（图 9A 和 9B 和 S1 数据），表明 FAM81A 在突触处稳定 PSD-95。为了测试FAM81A的生理作用，我们接下来使用多电极阵列（MEA）检查了神经元活动是否受到FAM81A下调的影响。我们发现FAM81A下调神经元的神经元放电频率显着降低，表明兴奋性突触传递减少（图9C和9D和S1数据）。这些结果表明FAM81A在兴奋性突触的结构和功能上具有重要意义。
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图 9. FAM81A 调节 PSD 大小和神经元活性。
原代培养的小鼠海马神经元在DIV14位点感染编码慢病毒的FAM81A shRNA。在 DIV21 时，神经元进行免疫细胞化学（A 和 B）或使用 MEA（C 和 D）进行电生理记录。（A 和 B）神经元被固定并用抗PSD-95抗体标记。描述了代表性的枝晶图像 （A） 和 PSD-95 点的平均大小 （B）。分析的神经元数量分别为 51 个 （mock）、47 个 （shFAM81A #1） 和 49 个 （shFAM81A #2）。（C 和 D）使用MEA对神经元进行细胞外电生理记录。描述了代表性信号（C）和尖峰频率（D）。比例尺：50 μm（A，白色）、10 μm（A，黄色）、10 s（C，x 轴）和 100 μV（C，y 轴）。*P < 0.05。DIV， 日体外;MEA，多电极阵列;PSD，突触后密度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.g009
讨论
PSD 的蛋白质组具有高度复杂性，由数千种蛋白质组成，表征它们的结构和功能相互作用对于理解 PSD 的复杂性最终如何控制神经元网络至关重要。为了了解 PSD 中那些仍然表征不佳的蛋白质，我们开发了一种荟萃分析方法，确定了一组 97 种蛋白质，其中 FAM81A 是其中的主要成员。对FAM81A表达、蛋白质相互作用和缩合特性以及电生理作用的深入分析表明，FAM81A对突触功能和神经元网络的维持很重要。
哺乳动物中的 FAM81 基因家族包括 2 个旁系同源物，FAM81A 和 FAM81B，而鱼类、两栖动物和一些无脊椎动物基因组包含单个 FAM81 基因。最简洁的解释是，FAM81在大约3亿到1亿年前在脊椎动物谱系的分支中经历了基因复制，导致哺乳动物。在重复事件之后，FAM81A 和 FAM81B 旁系同源物进化出不同的组织表达谱，其中 FAM81A 仅在大脑中表达，FAM81B 仅在睾丸中表达。由于斑马鱼中的FAM81直系同源物不在突触中表达[19]，因此FAM81A很可能进化出哺乳动物谱系中表达和与突触蛋白相互作用的能力。
LLPS 是一种现象，其中细胞或亚细胞区室内的蛋白质经历液-液相变，导致细胞内形成不同的液样或凝胶状区室。这些隔室通常被称为无膜细胞器或生物分子缩合物。我们发现 FAM81A 经历 LLPS 与 PSD-95、SynGAP 和 GluN2B 形成缩合物，PSD-95、SynGAP 和 GluN2B 是控制突触可塑性的关键蛋白。突触可塑性涉及突触大小的调节。我们发现FAM81A以剂量依赖性方式促进冷凝物的形成（图8），并且FAM81A表达的调节导致树突棘（图6A和6B）和PSD-95点的大小变化（图9A和9B）。这些发现表明，FAM81A与缩合物中其他突触蛋白的相互作用对突触可塑性很重要。此外，FAM81A与这些主要突触后分子的蛋白质-蛋白质相互作用和LLPS可能与FAM81A对神经元活动的影响有关（图9C和9D），因为有人提出突触活动通过PSD中的蛋白质-蛋白质相互作用和LLPS进行调节[51\u201255]，我们的研究结果现在表明FAM81A直接参与这些相同的机制。
多价蛋白-蛋白相互作用和内在无序区（intrinically disordered regions， IDR）是驱动LLPS的两个重要因素[56]。我们发现，蛋白质C端半部分FAM81A的IDR对LLPS不是必需的（图5）。相反，我们发现 2 个卷曲结构域 （107-157） 和 N 末端结构域 （1-36） 之间的区域对 LLPS 至关重要，可能是因为它们的多价蛋白质-蛋白质相互作用受损。
除突触分子外，还有几种主要的神经元蛋白发生LLPS，包括TDP-43、FMRP和CTTNBP2[57–59]。海马神经元和HEK293T细胞质中FAM81A凝聚物的延时成像显示，其动态变化与TLS/FUS观察到的变化相似[60]，TLS/FUS是相分离领域中第一个鉴定和表征最好的RNA结合蛋白[59]。虽然我们目前没有直接证据表明FAM81A缩合物含有RNA颗粒，但FAM81A可能在突触和树突之间的信号传导中发挥作用。FAM81A的轴定位凝聚物表明，除了突触功能外，它们还可以调节局部翻译以响应各种刺激，包括突触传递[58,61]，如TLS/FUS [62]或FMRP[63]。
许多遗传学研究指出，编码兴奋性突触蛋白的基因是与精神分裂症和自闭症等神经精神疾病相关的基因。我们发现FAM81A的常见变体已在GWAS目录中注册[64]。FAM81A 的这些变体（rs28890483 和 rs10519005）位于 FAM81A 基因的 5' 侧，这可能会影响 FAM81A 的表达水平。它们可能会增加双相情感障碍和精神分裂症的风险（rs28890483 P = 9 × 10?6，OR = 1.3904）或酒精依赖（rs10519005 P = 5 × 10?6，或 = 1.26）。此外，据报道，FAM81A是与抑郁易感性相关的枢纽基因之一[65]，表明可能影响神经元活性的FAM81A的表达水平与神经精神疾病有关，包括重度抑郁症。
总之，除了揭示FAM81A的新特性外，我们的研究结果还提供了大量的PSD蛋白，这些蛋白在表征后还可能揭示突触的重要结构和功能作用。
方法
PSD 蛋白质组数据集和荟萃分析
以下论文中发表的35个数据集被引用[9–18,21,22,24–30,47,66,67]。未使用由少于 30 种蛋白质组成的数据集。使用bioDBnet的db2db将每份报告中描述的蛋白质ID转换为小鼠Entrez基因ID[68]。未能进行 ID 转化的蛋白质从列表中被删除。热图是在 R 软件中使用 gplots 包中的 heatmap.2 函数生成的。
小 鼠
在日本进行的动物实验得到了理化学研究所动物研究委员会（许可号：W2019-2-42）和神户大学机构动物护理和使用委员会（许可号：A220510）的批准，并按照日本科学委员会的机构规定和指南进行。在英国进行的动物程序由爱丁堡大学生物服务主任批准，并按照1986年《动物（科学程序）法》和英国内政部条例（项目许可证：PF3F251A9）进行。使用从日本SLC购买的ICR小鼠或爱丁堡大学的C57BL / 6J小鼠进行实验。宫颈脱位后，从小鼠身上取出大脑，用冰冷的HBSS（Hanks平衡盐溶液）短暂冲洗，用液氮冷冻，并储存在-80°C下，然后用于生化实验。
PSD组分的制备
PSD-I组分的制备根据先前描述的方案进行，并进行了微小的修改[4]。简而言之，从成年（12周龄）ICR小鼠获得的3个大脑在溶液A（0.32M蔗糖，1mM NaHCO）中用玻璃 - 聚四氟乙烯匀浆器匀浆3，1毫米氯化镁2,0.5毫米氯化钙2和 cOmplete 不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物）。将匀浆在 4°C 下以 1,400 g 离心 10 分钟，以获得沉淀和上清液。将沉淀重悬于溶液 A 中，并在 4°C 下以 700 g 离心 10 分钟。 将第一次和第二次离心的上清液合并为 S1 级分，随后在 4°C 下以 13,800 g 离心 10 分钟。 将所得沉淀（P2级分）用溶液B（0.32M蔗糖和1mM NaHCO）重悬3），并在蔗糖密度梯度（0.85/1.0/1.2M）中以82,500g离心2小时。从 1.0/1.2 M 边界收集突触体，并用溶液 B 稀释两次。通过加入等体积的溶液C（1%TX-100,0.32M蔗糖，12mM Tris-HCl（pH 8.1））并在4°C下旋转15分钟来裂解突触体。将样品在 4°C 下以 32,800 g 离心 20 分钟，以获得 PSD-I 作为所得沉淀。
质 粒
pCI-EGFP-NR2b wt （GFP-GluN2B） （质粒 #45447）、EBFP2-N1 （BFP） （质粒 #54595）、pLKO.1 - TRC 克隆载体 （质粒 #10878）、psPAX2 （质粒 #12260） 和 pMD2.G （质粒 #12259） 购自 Addgene。GFP-SynGAP由Yoichi Araki和Richard Huganir（约翰霍普金斯大学）赠送。MG3C-SynGAP（Zeng及其同事）由Mingjie Zhang（南方科技大学）赠送。pβActin空载体pβActin-DsRed（DsRed）和pβActin-PSD-95-GFP（PSD-95-GFP）由Shigeo Okabe（东京大学）赠送。从小鼠脑的cDNA中克隆全长FAM81A cDNA（NM_029784.2），并插入pEGFP-C1（GFP-FAM81A）和pEGFP-N1（FAM81A-GFP）中。为了构建GST-FAM81A，将FAM81A cDNA插入pGEX-6P-3中。为了构建FAM81A-FLAG，将FAM81A cDNA和3xFLAG序列插入到pβActin载体中。通过反向PCR或PCR扩增靶序列构建FAM81A的截短突变体。为了构建 PSD-95-mCherry，将大鼠 PSD-95 序列（从 pβActin-PSD-95-GFP 扩增）和 mCherry 序列插入到 pβActin 载体中。为了构建pLKO.1-GFP，去除了嘌呤霉素抗性基因，并将EGFP序列插入同一位点。为了构建 shRNA 质粒，使用 Invitrogen Block-iT RNAi Designer （https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/） 设计 shRNA 序列。根据说明书（http://www.addgene.org/protocols/plko/），将寡核苷酸插入pLKO.1-TRC克隆载体和pLKO.1-GFP中。寡核苷酸的序列如下：shFam81a #1 F：CCGGgcaactgaatcgggatattgaCTCGAGtcaatatcccgattcagttgcTTTTTG，R：AATTCAAAAAgcaactgaatcgggatattgaCTCGAGtcaatatcccgattcagttgc。shFam81a #2 F： CCGGgctcctggacactaaatttaaCTCGAGttaaatttagtgtccaggagcTTTTTG.R：AATTCAAAAAgctcctggacactaaatttaaCTCGAGttaaatttagtgtccaggagc。
细胞培养
HEK293T细胞和Lenti-X 293T细胞（Takara，632180）使用常规培养基（Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM;Nacalai Tesque，08458-45），10%胎牛血清（FBS;Gibco， 10270） 和青霉素/链霉素 （Nacalai Tesque， 26253–84）） 溶于 5% CO 中2孵化器。对于1,6-己二醇处理，使用含有10%1,6-己二醇（Sigma-Aldrich，240117-50G）的常规培养基。
海马神经元的原代培养
从E16.5小鼠胚胎中解剖海马体，并使用神经元解离溶液（Wako，291-78001）解离。使用 TC20 自动细胞计数仪 （Bio-Rad） 对神经元进行计数，然后将 24 孔板铺在带有盖玻片（Matsunami，C013001）、60 mm 培养皿、35 mm 玻璃底培养皿（Matsunami，D11130H）或 6 孔 MEA 培养皿（多通道系统，60-6 孔 MEA200/30iR-Ti-tcr）上，这些培养皿先前在 0.1 M 硼酸盐缓冲溶液中涂有 0.01% 聚-L-赖氨酸;4 × 104细胞（用于 24 孔板），4 × 104细胞（用于 60 毫米培养皿），1.8 × 105细胞（用于 35 mm 玻璃底培养皿），或 1.6 × 105将细胞（用于MEA培养皿）接种在铺板培养基（神经元培养基加5%FBS）中。2 至 14 小时后，将培养基更换为神经元培养基（Neurobasal （Thermo Fisher Scientific， 21103049）、1× B-27 Supplement （Thermo Fisher Scientific， 17504–044）、1× GlutaMAX-I （Thermo Fisher Scientific， 35050–061） 和青霉素-链霉素 （Nacalai Tesque， 26253–84））。在DIV4时，D，L-（-）-2-氨基-5-磷酸戊酸（D，L-APV;将SIGMA，A5282）加入到终浓度为200μm的培养基中。随后，将一半的培养基更换一次（对于24孔板和60-mm培养皿）或每周两次（对于MEA培养皿）。
海马神经元的实时成像
使用配备60×物镜的CellVoyager CV1000（横河电机）观察接种在35mm玻璃底培养皿（Matsunami，D11130H）上的细胞。在活体成像过程中，将培养皿置于腔室中以在 37°C 下用 5% CO 保持孵育条件2.分别以 30 分钟或 5 秒的间隔获取海马神经元或HEK293T细胞的双色延时图像。在对海马神经元的观察中，获得了 20 μm 范围的 Z 堆栈图像（21 个切片，2 μm）。对于HEK293T细胞，采集了 2 μm 范围的 Z 堆图像（3 个切片，1 μm）。图和视频中显示了最大强度投影图像。
免疫沉淀
对于过表达的FAM81A的免疫沉淀，HEK293T在10cm培养皿上以约50%汇合度培养的细胞转染7.5μgFAM81A-FLAG和7.5μgGFP标记的PSD-95，SynGAP或GluN2B使用PEI Max（Polysciences，24765-1），转染后24小时，用冰冷的PBS洗涤细胞，离心收集（5,000rpm，2分钟4°C）， 并用裂解缓冲液（1% Triton X-100、50 mM Tris-HCl （pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、15 mM NaF、2.5 mM Na）重悬3配音4含不含 EDTA 的 cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物）。将裂解物在冰上保持 10 分钟，然后在 4°C 下用 15,000 g 离心 15 分钟。 使用20μlANTI-FLAG M2亲和凝胶（Sigma-Aldrich，A2220-5ML）对上清液进行免疫沉淀。在 4°C 下孵育 90 分钟后，使用裂解缓冲液洗涤样品 5 次，用样品缓冲液（62.5 mM Tris-HCl （pH 6.8）、4% 十二烷基硫酸钠 （SDS）、10% 甘油、0.008% 溴酚蓝和 25 mM 二硫苏糖醇）重悬，然后煮沸 5 分钟。对于内源性PSD-95的免疫沉淀，首先从成年小鼠前脑中制备P2组分，如上所述。用含有1%脱氧胆酸钠（DOC）和0.4%SDS的裂解缓冲液重悬沉淀。将裂解物在冰上保存 10 分钟，然后与 2 种抗 PSD-95 抗体 （NeuroMab， 75–028） 或对照 IgG （Santa Cruz， sc-2025） 在 4°C 下孵育 90 分钟。然后将样品与蛋白 G 琼脂糖珠 （Amersham， 17-0618-01） 混合，并在 4°C 下孵育 30 分钟。然后使用含有 1% DOC 钠和 0.4% SDS 的裂解缓冲液洗涤样品 5 次，用样品缓冲液重悬，煮沸 5 分钟。
免疫印迹
在大多数实验中，样品与分子量标记物（Bio-Rad，1610373）一起进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。将蛋白质转移到 Immobilon-FL 聚偏二氟乙烯膜上（Millipore，IPFL00010）。在室温下将膜封闭在封闭缓冲液（含 0.1% 吐温 20 （TBST） 的 Tris 缓冲盐水和 5% 脱脂牛奶）中封闭，然后在 4°C 下与指定的一抗在封闭缓冲液中孵育过夜。 用TBST洗涤膜3次，然后在室温下与相应的二抗在封闭缓冲液中孵育1小时。用TBST洗涤膜5次。Immobilon Crescendo （Millipore WBLUR0500） 或 Chemi-Lumi One Super （Nacalai 02230–14） 用作化学发光底物。使用ImageQuant800（AMERSHAM）分析信号。小鼠抗FLAG抗体（SIGMA，F3165）、兔抗GFP抗体（Thermo Fisher Scientific，A-6455）、兔抗FAM81A抗体Ab1（Novus，NBP2-33295）、兔抗PSD-95抗体（Abcam，ab18258）、兔抗突触素抗体（Cell Signaling Technology，#4329）或小鼠抗β-肌动蛋白抗体（SIGMA，A1978）作为一抗。过氧化物酶山羊抗兔IgG（Jackson Immuno Research，111-035-003）或HRP抗小鼠IgG（Amersham，NA9310）用作二抗。对于内源性PSD-95免疫沉淀的实验（图3B），使用以下试剂和仪器：分子量标记物（NEB，P7719S），小鼠抗PSD-95抗体（NeuroMab，75-028），兔抗FAM81A抗体Ab2（MERCK，HPA065797），SuperSignal West Femto（Thermo Fisher Scientific，34096），ODYSSEY Fc（LI-COR）。抗 FAM81A 抗体 Ab1 针对人 FAM81A 的氨基酸 86–225 升高，Ab2 针对氨基酸 262–368 升高。与之前的报道一致[43]，两种抗体在小鼠脑裂解物中检测到超过40 kDa的主条带（图3A和3B），其预期大小为FAM81A蛋白，表明这些抗体成功检测到内源性FAM81A。
免疫细胞化学和共聚焦荧光显微镜
用PBS洗涤在盖玻片上生长的HEK293T细胞或海马神经元，并在室温下分别使用4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液固定10分钟或4%PFA和4%蔗糖的PBS溶液15分钟。对于内源性PSD-95的免疫细胞化学，将海马神经元与封闭溶液（2%正常山羊血清（NGS），0.2%Triton X-100，PBS）在室温下孵育1小时。用 PBS 洗涤细胞两次，然后与抗 PSD-95 抗体（Millipore，MABN68）一起在抗体溶液（2% NGS、0.2% Triton X-100、PBS）中在 4°C 下孵育过夜。 用 PBS 洗涤细胞 3 次，并与含有 Alexa Fluor 568 偶联的抗小鼠 IgG 抗体（Molecular Probes，A-11019）的抗体溶液在室温下孵育 1 小时。用PBS洗涤细胞4次，并用封固剂（Vectashield，H-1000）包埋。使用配备 40× 物镜（Olympus，N2246700）、60×物镜（Olympus，N1480700）或 100× 物镜（Olympus，N5203100）的 FV3000 共聚焦显微镜（奥林巴斯）观察细胞。60×和100×镜头分别使用浸油（奥林巴斯，IMMOIL-F30CC）或硅油浸油（奥林巴斯，SIL300CS-30CC）。
免疫组化
通过腹膜内注射戊巴比妥并经心灌注 PBS 对小鼠进行完全麻醉，然后用 4% PFA 灌注 PBS。将大脑解剖并在含有 4% PFA 的 PBS 中于 4°C 孵育 3 小时，然后在含有 30% 蔗糖溶液的 PBS 中孵育，并在 4°C 下孵育 48 至 72 小时。将样品与OCT包埋基质（CellPath，KMA-0100-00A）包埋在塑料模具（Sigma-Aldrich，E6032-1CS）内，置于含有异戊烷的烧杯中，并在液氮上冷冻。冷冻的大脑在-80°C下储存直至使用。使用低温恒温器（Leica CM3050 S）切割厚度为18μm的冷冻脑样品以获得矢状切片。将切开的脑切片放在Superfrost Plus载玻片（Epredia，J1800AMNZ）上，并在室温下在黑暗中干燥过夜。在PBS中孵育10分钟后，将切片与5%牛血清白蛋白（BSA）和0.5%Triton X-100在室温下在Tris缓冲盐水（TBS）中孵育1小时。然后将切片与兔抗 FAM81A 抗体 （MERCK， HPA065797） 或小鼠抗 GluN1 抗体 （NeuroMab， 75–272） 在 TBS 中用 3% BSA 和 0.5% Triton X-100 在 4°C 下孵育过夜。用含有 0.5% Triton X-100 的 TBS 洗涤 3 次后，将切片与 Alexa Fluor 568 偶联的抗兔 IgG 抗体（Thermo Fisher Scientific，A-10040）或 Alexa Fluor 488 偶联的抗小鼠 IgG1 抗体（Thermo Fisher Scientific，A-21121）一起孵育 2 小时。然后用含有0.5%Triton X-100的TBS洗涤切片3次，使用MOWIOL 4-88（Calbiochem，475904）溶液进行封片，并用盖玻片（VWR，631-0153）覆盖。使用配备 4× 物镜（尼康，MRD00045）或 100× 物镜（尼康，MRD01902）的 ECLIPSE Ti2 共聚焦显微镜（尼康）观察切片。浸油（蔡司，Immersol 518 F）用于 100 ×镜头。
重组FAM81A蛋白的制备
重组FAM81A蛋白的制备方法如下。大肠杆菌菌株 BL21（DE3）-codonPlus-RIL （Aligent， 71136） 用 GST-FAM81A 转化。培养细菌至OD 600达到约0.8，然后加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（最终0.03mM）。将它们在 16°C 下进一步培养 18 小时，在 4°C 下以 1,800 g 离心 30 分钟，然后在冰上用超声仪裂解（裂解缓冲液：50 mM Tris （pH 8.0）、1,000 mM NaCl、10 mM 咪唑、3 mM 2-巯基乙醇、10% 甘油、50 mM L-精氨酸、50 mM、L-谷氨酸、10 mM 甜菜碱、 5%海藻糖和0.2mM PMSF）。将样品在 4°C 下以 100,000 g 离心 60 分钟。 使用谷胱甘肽琼脂糖珠（GST 可接受，Nacalai-Tesque）拉下 GST-FAM81A，并在裂解缓冲液中用还原谷胱甘肽 （Nacalai Tesque， 17050–14） 洗脱。在缓冲液（25 mM Tris （pH 8.0）、100 mM NaCl、5 mM DTT、10% 甘油、50 mM L-精氨酸、50 mM L-谷氨酸、10 mM 甜菜碱、2.5% 海藻糖）中透析时，加入 3C 蛋白酶以除去 GST，然后用减法谷胱甘肽琼脂糖分离裂解的 GST 标签，并在含有 25 mM HEPES （pH 8.0） 的尺寸排阻柱缓冲液中纯化， 100 mM NaCl，0.5 mM Tris-2-carboxyethyl phosphine （TCEP），使用 HiLoad 26/600 Superdex 200 pg 尺寸排阻柱。将馏分（纯度>95%）合并、浓缩、分装，并在液氮中速冻，并储存在-80°C下直至需要。如前所述制备重组PSD-95、SynGAP和GluN2B[49,53]。
纯化蛋白LLPS的标记和观察
如前所述，FAM81A蛋白由iFluor 488-或iFluor 568-琥珀酰亚胺酯（AAT Bioquest）标记[53]。将PSD蛋白在相缓冲液（50mM Tris（pH 8.0），100mM NaCl，1mM TCEP，0.5mM EGTA，5mM MgCl）中稀释2和 2.5 mM ATP）。将蛋白质混合物（5μl）注入自制成像室中，并通过共聚焦显微镜观察（FLUOVIEW FV1200，奥林巴斯）。使用Fiji软件的分析颗粒功能分析iFluor488阳性液滴的数量和大小。
慢病毒的产生和感染
使用 Lipofectamine LTX 和 PLUS 试剂 （Thermo Fisher Scientific， 15338–100） 与 pLKO.1 慢病毒质粒、psPAX2 和 pMD2.G 共转染 Lenti-X 293T 细胞。孵育过夜后，将培养基换成新鲜培养基，转染后 60 至 72 小时，收集上清液并通过 0.45 μm 过滤器过滤（Millipore，SLHV033RS）。使用Lenti-X浓缩器（Clontech，631231）浓缩病毒，用二十分之一体积的PBS重悬，并在使用前储存在-80°C。对于培养神经元的感染，在神经元培养基中加入百分之一体积的病毒溶液，感染后8 h，将培养基更换为新鲜培养基。对于模拟感染，pLKO.1空载体被用作慢病毒质粒。
实时荧光定量PCR
使用RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN，74134）从6 cm培养皿上的皮质神经元中提取RNA，并使用SuperScript II（Thermo Fisher Scientific，18064–022）进行逆转录。使用引物（Fam81a：F cttagccaggctgttcttgg、R ccagcgtctttaaggcagaa、Actb：F cgtgcgtgacatcaaagagaa、R tggatgccacacaggattccat）、Power SYBR Green PCR 预混液（Thermo Fisher Scientific，4367659）和 QuantStudio3（Thermo Fisher Scientific）进行实时荧光定量PCR。
定量图像分析
使用ImageJ分析了共聚焦显微镜获得的1,024×1,024像素图像。为了定量HEK293T细胞中的FAM81A-GFP阳性结构，使用Find Maxima（噪声容差：120）通过二值化提取信号。在选择单个细胞后，使用分析粒子分析每个细胞中信号的数量和大小。分析中避免了不健康（萎缩）的细胞、信号强度过高（饱和）或过低（不可见）的细胞以及边界不清晰的聚集细胞。首先对图像进行盲法分析，以量化表达GFP的神经元中的PSD-95阳性结构。然后，选择具有单个神经元的图像。PSD-95阳性结构通过使用Find Maxima（噪声容限：120）的二值化提取。消除超过50像素的结构，以避免非突触结构的滞留。为了评估树突长度，使用NeuronJ追踪GFP信号[69]。使用SynapCountJ[70]提取沿树突（直径在25像素以内）的PSD-95点。计算单个神经元的平均点大小和每个树突长度的点数。使用 R 软件将结果可视化为箱线图。采用学生t检验进行统计学分析。
多电极阵列 （MEA）
将接种在 6 孔 MEA 培养皿的每个孔中的海马神经元培养至DIV21。将培养基与不含 D、L-APV 的新鲜神经元培养基交换，培养基交换后 30 分钟，使用 MEA2100（多通道系统）和 MC_Rack 4.6.2 版本分析神经元活性。输入电压范围和采样频率分别设置为±19.5 mV和20,000 Hz。记录神经元活动2分钟，重复3次。电压超过5个标准差被用作检测尖峰的阈值。未使用通过3次重复未检测到任何加标的电极数据进行分析。
数据库和生物信息学工具
DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）[71]和SynGO（https://www.syngoportal.org/）[72]用于分析PSD蛋白亚群中突触蛋白的富集。NCBI基因（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）被用于检查人类和小鼠的基因表达。Xenbase（http://www.xenbase.org/entry/）[73]被用于检查青蛙的基因表达模式。Protein BLAST （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 用于鉴定蛋白质的直系同源物。Gene2Function（https://www.gene2function.org/）[44]也被用于在无脊椎动物和单细胞生物中寻找直系同源物。SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）[74]用于分析领域架构。D2P2（http://d2p2.pro/）[75]用于评估无序区域。ConSurf[76]用于评估进化守恒性。MARRVEL（http://marrvel.org/）[77]被转介来寻找罕见的变异。GWAS目录（https://www.ebi.ac.uk/gwas/home）[64]被引用来检索常见变体。
质谱数据分析
使用MaxQuant版本1.6.10.43 [25]重新处理我们之前对小鼠突触体和PSD组分组成的蛋白质组学研究[19]的原始LC-MS/MS文件（PRIDE合作伙伴存储库数据集标识符PXD005630）。使用以下搜索参数根据人类 UniProt 参考蛋白质组（2020 年 5 月下载）检索数据：酶设置为胰蛋白酶/P（2 个错误切割）、蛋氨酸氧化和 N 末端蛋白乙酰化作为可变修饰、半胱氨酸脲甲基化作为固定修饰。基于诱饵数据库搜索策略，蛋白质 FDR 为 0.01，肽 FDR 为 0.01，用于鉴定水平临界值。进行无标记定量 （LFQ） 并计算突触体和 PSD 组分中鉴定的蛋白质的 iBAQ 值，从而允许蛋白质按其估计的相对丰度进行排序。
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在多个数据集中检测到的蛋白质包括核心 PSD 蛋白。
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图S102040符号 蛋白质Sptbn1 βII-血影蛋白卡姆克2a CaMKIIADLG4 PSD-95型Grin2b GluN2BBaiap2 BAIAP2Dlg1 SAP-97咧嘴笑1 GluN1DLG2 PSD-93型Dlg3 SAP-102Syngap1 SynGAPPrkcg PKCγ卡尔恩·加里林-7Dlgap1 GKAPIqsec1 IQSEC1Iqsec2 IQSEC2Gria2 GluA2咧嘴笑2a GluN2ANefl NF-L型咕噜卡姆克2b CaMKIIBGria1 GluA1Gria3 GluA3Dnm1 DNM1Ppp3ca PPP3CA刀柄3 刀柄3艾卜利姆1 阿利姆1刀柄2 刀柄2# 数据集
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S1 图。 在多个数据集中检测到的蛋白质包括核心 PSD 蛋白。
显示数据集数量最多的前 27 种蛋白质列表。蓝色和黄色条表示无偏和基于候选方法的数据集数量。列出了在至少 26 个数据集中检测到的蛋白质。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s001
（PDF格式）
S2 图。 FAM81A/FAM81A同源物的结构域结构。
SMART 检测到的卷曲线圈区域和 IUPred2A 预测的无序区域。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s002
（PDF格式）
S3 图。 FAM81A和FAM81B在小鼠和青蛙中的基因表达模式。
（A 和 B）FAM81A和FAM81B在小鼠（A）和青蛙（B）组织中的基因表达模式。小鼠数据和青蛙数据分别来自NCBI Gene和Xenbase。RPKM：每百万映射读取的每千碱基外显子读取次数;TPM：每千碱基百万的转录本。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s003
（PDF格式）
S4 图。 FAM81A 在出生后第 7 天小鼠大脑的分布。
（A 和 B）FAM81A在大脑中的分布。对出生后第7天小鼠脑矢状切片进行FAM81A的免疫组化。比例尺：2 mm （A） 和 10 μm （B）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s004
（PDF格式）
S5 图。 哺乳动物、鸟类和爬行动物中 FAM81A 直系同源物的蛋白质序列。
使用 Kalign 对指定物种的 FAM81A 同源物序列进行比对，并使用 MView 进行可视化。序列上的数字表示小鼠FAM81A的氨基酸数。突出显示与人FAM81A相同的残基。字符的颜色代表氨基酸的分类：疏水性（浅绿色）、大疏水性（深绿色）、阳性（红色）、小醇（浅蓝色）和极性（紫色）。哺乳动物：人类（智人）、大鼠（Rattus norvegicus）和小鼠（Mus musculus）。鸟类：鸡（Gallus gallus）和斑胸雀（Taeniopygia guttata）。爬行动物：甲鱼（Pelodiscus sinensis）和壁虎（Paroedura picta）。小鼠FAM81A的卷曲螺旋结构域（CC1和CC2）和低复杂度区域（LCR）用黑条标记。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s005
（PDF格式）
S6 图。 HEK293T细胞中GFP标记的FAM81A突变体的表达检查。
（A） 24 小时后用 FAM81A-GFP 或其突变体转染 HEK293T 细胞，裂解细胞并定量蛋白浓度，并使用抗 GFP 或抗 β-肌动蛋白抗体对 30 μg 蛋白进行免疫印迹。（B） 使用 ImageJ 量化的面板 A 数据的相对能带强度。*P < 0.05，未配对学生 t 检验。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s006
（PDF格式）
S7 图。 PSD-95 和 SynGAP 的缩合物。
用指定的质粒转染HEK293T细胞，24 小时后，固定细胞并用共聚焦显微镜观察。比例尺：20 μm（白色）或 4 μm（黄色）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s007
（PDF格式）
S8 图。 用慢病毒shRNA敲低FAM81A。
（A） 原代培养的小鼠皮质神经元感染了编码 FAM81A shRNA 的慢病毒 DIV4。在 DIV16 时，收获神经元以提取 mRNA。制备cDNA后，进行实时荧光定量PCR。描述了相对表达水平。（B） 原代培养的小鼠海马神经元在 DIV14 时感染 pLKO.1-GFP 模拟质粒慢病毒。在 DIV21 时，神经元被固定并使用抗 PSD-95 抗体进行免疫细胞化学。比例尺：100μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s008
（PDF格式）
S1 表。 PSD 蛋白质组数据集中包含的 5,869 种蛋白质的列表。
蛋白质被描述为小鼠 Entrez 基因 ID，0 和 1 分别表示未检测到和检测到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s009
（XLSX）
S2 表。 PSD 蛋白质组数据集中尚未完全表征的 177 种蛋白质列表。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s010
（XLSX）
S1 电影。 海马神经元中的FAM81A液滴。
用 FAM81A-GFP 和 DsRed 转染小鼠原代海马神经元。每 30 分钟获取一次图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s011
（MPEG格式）
S2 电影。 HEK293T细胞中的FAM81A液滴。
用 FAM81A-GFP 转染 HEK293T 个细胞。每 5 秒获取一次图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s012
（MPEG格式）
S3 电影。 FAM81A在HEK293T细胞中的聚集样结构。
用 FAM81A-GFP 转染 HEK293T 个细胞。每 5 秒获取一次图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s013
（MPEG格式）
S1 数据。 图 1–6、8、9、S1、S3、S6 和 S8 的基础数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s014
（XLSX）
S1 原始图像。 图 3、6、7 和 S6 的原始凝胶图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002006.s015
（PDF格式）
确认
感谢 Y. Araki、R. Huganir、M. Zhang 和 S. Okabe 提供质粒;以及 A. Okuda、K. Morishima、M. Sugiyama、T. Imasaki 和 R. Nitta 进行了有益的讨论。我们感谢 T. Otani、C. Noguchi、S. Yoshida、S. Fujima 和 J. Tharaux 的技术援助，以及 Takumi 实验室制备实验试剂的所有技术人员。我们感谢 J. Griffiths 对手稿的校对。
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