厦门免费医学论文发表-复合物协同维持基底体的 Cep290 并有助于纤毛发生起始。

抽象

纤毛在细胞信号转导和器官发育中起关键作用。纤毛功能缺陷会导致多种遗传性疾病。Cep290 是一种进化上保守的纤毛病蛋白，它桥接基体 （BB） 的睫状膜和轴突，并在纤毛生成和 TZ 组装的启动中起关键作用。Cep290 如何维持在 BB 位，以及轴突和睫状膜定位线索是否收敛以确定 Cep290 的定位仍然未知。在这里，我们报告了轴丝附近的 Cep131-Cep162 模块和靠近膜的 Cby-Fam92 模块协同控制 Cep290 的 BB 定位和随后果蝇纤毛生成的启动。同时删除 Cep131-Cep162 模块和 Cby-Fam92 模块的任何蛋白质会导致 BB 中 Cep290 的完全丢失，并在其起始阶段阻断纤毛生成。我们的研究结果表明，纤毛发生的第一步严格依赖于 Cep131-Cep162、Cby-Fam92 和 Cep290 之间的合作和追溯相互作用，这可能有助于 Cep290 相关纤毛病的复杂发病机制。

数字

图7图1图2图3图4图5图6图7图1图2图3

引文： Wu Z， Chen H， Zhang Y， Wang Y， Wang Q， Augière C， et al. （2024） Cep131-Cep162 和 Cby-Fam92 复合物协同维持基体的 Cep290 并有助于纤毛发生启动。PLoS 生物学 22（3）： 编号：E3002330。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330

学术编辑： Renata Basto，居里研究所，法国

收到： 2023年8月28日;接受： 2024年1月31日;发表： 3月 5， 2024

版权所有： ? 2024 Wu et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

资金： 国家自然科学基金（32070692年）授予Q.W.;中国博士后科学基金（2022M713288）和国家自然科学基金青年项目（32300564年）;国家研究署（ANR）向B.D.提供赠款（ANR-17-CE13-0023-01，Divercil）;资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

缩写： APF， 蛹形成后;BB， 基体;论坛， Bardet-Biedl综合征;IFT， 鞭毛内运输;JBTS， Joubert综合征;LCA， Leber先天性黑朦;MKS， 梅克尔-格鲁伯综合征;SLS， Senior-Loken 综合征;TZ， 过渡区;WT， 野生型

介绍

纤毛是基于微管的细胞器，从许多细胞类型的表面延伸出来，广泛存在于真核生物中。它们在人类各种器官的发育和维持中起着至关重要的作用[1–4]，其功能障碍与多种称为纤毛病的人类遗传疾病有关[5–7]。

纤毛的结构在整个进化过程中保持高度保守[8]。纤毛包括基体 （BB）、过渡区 （TZ）、轴突及其上覆膜。BB起源于母中心粒，通过来自母中心粒远端附属物的过渡纤维附着在膜上[9–11]。TZ位于过渡纤维的正上方[12]，其特征是连接轴突和睫状膜的Y-linker结构，作为控制纤毛蛋白进入的扩散屏障[9]。轴突形成纤毛骨架，由9倍阵列的双联微管组成，这些双联微管由BB微管模板化，并被睫状膜包围[5,8]。

纤毛的形成涉及两个主要过程：纤毛生成起始和轴突伸长。轴突的伸长依赖于鞭毛内运输（intraflagellar transport， IFT），这是一种在纤毛内进化上保守的运输机制[13,14]。纤毛生成的启动涉及BB的膜对接和纤毛芽的形成[10,15,16]。在哺乳动物中，BB的膜对接是由中心粒远端附肢/睫状过渡纤维介导的[17\u201221]。然而，在无脊椎动物模式生物果蝇中，过渡纤维蛋白对于BB膜对接是可有可无的[22]，这表明存在替代机制。睫状芽由TZ及其周围膜组成[10,23,24]。数十种蛋白质已被确定为TZ的组成部分，其中大多数蛋白质的突变会导致纤毛病[5]。研究将TZ蛋白分为3个功能模块：Meckel-Gruber综合征（MKS）模块、肾病（Nephronophthisis，NPHP）模块和Cep290[25]。睫状膜的形成依赖于膜转运调节因子小GTP酶Rab8相关信号级联[26\u201228]。最近发现Dzip1（DAZ相互作用的锌指蛋白1）及其近似旁系同源物Dzip1L在果蝇和哺乳动物的纤毛芽形成中发挥作用[24,29,30]。Dzip1/1L的下游、Rab8和Cby（Chibby）-Fam92（序列相似性为92的家族）模块共同调节睫状膜的形成[24,29,31]。

尽管人们已经推测睫状芽的形成一定是与TZ组装和睫状膜形成相匹配的协调事件[27,29]，但这两个看似独立的过程之间的详细分子联系在很大程度上仍然难以捉摸。使用果蝇模型，我们提供了证据，证明核心TZ蛋白Cep290在协调睫状膜形成和TZ组装中起关键作用[29]。我们证明，除了在TZ组装中的经典作用外，Cep290还作用于Dzip1的上游，在纤毛发生起始和纤毛芽形成中起着至关重要的作用[29]。Cep290是一种有趣的纤毛基因，与多种纤毛病相关[32]，包括Leber先天性黑朦（LCA）、Senior-Loken综合征（SLS）、Joubert综合征（JBTS）、MKS和Bardet-Biedl综合征（BBS）。在Cep290中已发现100多个纤毛病突变[32]。广泛的疾病突出了 Cep290 在纤毛中的关键作用。我们和其他人已经证明，Cep290的N末端与睫状膜结合，而其C末端与纤毛轴突连接，两者都对纤毛生成至关重要[29,33,34]。尽管如此，Cep290 如何靶向 TZ 以及轴丝衍生的信号和睫状膜定位线索是否收敛以确定 Cep290 的定位和稳定性仍然未知。

中心体蛋白131（Cep131）定位于哺乳动物的中心体中心粒卫星和纤毛TZ[35\u201237]，并已被证明是纤毛发生、中心粒扩增、基因组稳定性和癌症所必需的[35,36,38–40]。对模式生物果蝇和斑马鱼的研究表明，Cep131是一种进化上保守的BB蛋白[41,42]，Cep131的缺失导致纤毛形成异常，表明Cep131在纤毛发生中具有进化上保守的作用。但Cep131调节纤毛生成的确切机制在很大程度上仍然未知。在果蝇中，Cep131（在果蝇中也称为延期）已被证明定位于远端BB和TZ的管腔，在纤毛生成的启动中发挥作用[42,43]。有趣的是，尽管 Cep131 和 Cby 单突变体在纤毛组装方面都表现出轻度缺陷，但纤毛生成的启动被完全阻断，并且 Cep290 在 cep131 的基底体中完全不存在; CBY双突变体[43]。然而，Cep131 在纤毛发生启动中的分子功能在很大程度上仍然未知，并且 Cep131 与 Cby 遗传相互作用以调节 Cep290 定位的潜在机制仍不清楚。

在这里，我们报道 Cep131 招募 Cep162 来调节 Cep290 C 末端的 TZ 定位并促进纤毛发生。我们发现 Cep162 是一种 Cep131 相互作用蛋白，并在 Cep131 的下游起作用，介导 Cep290 C 末端与轴突微管的结合。此外，我们证明了 Cby-Fam92 模块调节了 Cep290 N 末端的 TZ 定位。两个模块合作在 TZ 上募集和稳定 Cep290，因为任何一个模块（Cep131-Cep162 或 Cby-Fam92）的联合丢失导致 Cep290 定位到 TZ 的完全失败，并最终阻止纤毛生成的启动。我们的研究结果揭示了Cep131在纤毛生成中的关键分子功能，并揭示了Cep131-Cep162和Cby-Fam92模块在纤毛生成启动过程中促进的Cep290的协同有序组装。因此，我们的工作定义了一个由 3 个模块组成的中心分子通路：Cep131-Cep162、Cep290 和 Dzip1-Cby-Fam92，它们协同调节纤毛组装的起始。

结果

Cep131 是 Cep290 C 末端基底体定位所必需的

为了了解 Cep131 在纤毛生成中的功能，我们生成了 cep1311使用CRISPR-Cas9系统（S1A-S1C图）的（C末端缺失）突变果蝇。与报道的 cep131 突变体 [42] 类似，我们的 cep1311苍蝇表现出与睫状体缺陷相关的典型症状，并且在行走和飞行过程中严重不协调。与先前的报道一致，cep131单突变果蝇在纤毛发生起始方面存在轻度缺陷[42]，我们观察到大约33.6%的cep1311精母细胞中心粒显示由 CG6652：：GFP 标记的微管异常伸长（S1D 图），CG6652：：GFP 是一种果蝇精母细胞特异性表型，与 BB 对接和 TZ 膜帽形成缺陷相关。与这一观察结果一致，纤毛发生起始调节因子 Cep290、Dzip1 和 Cby 以及 TZ 标记物 Mks1 的信号在 cep131 精母细胞的基底体上显着降低1突变体，尽管它们仍然可以检测到（图1A）。

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图 1. Cep131 是 Cep290-C 末端的 BB 定位所必需的。

（A） WT果蝇和cep131突变体精母细胞纤毛中各种TZ蛋白的定位以及相应相对荧光强度的定量。在 cep131 突变体中，与 WT 相比，Cep290、Dzip1、Cby：：GFP 和 Mks1：：GFP 的信号显着降低。 重要的是，Cep290-C：：GFP 信号在 cep131 突变体中几乎完全丢失。BB标有γ-微管蛋白（红色）。误差线表示 SD ±的平均值，n = 30。（B） WT果蝇和cep131突变体听觉纤毛中各种TZ蛋白的定位。与我们在精母细胞纤毛中观察到的类似，Cep290、Dzip1 和 Cby：：GFP 的信号显着降低，并且 Cep290-C：：GFP 在感觉纤毛的底部完全丢失。21A6（蓝色）标记纤毛基部，肌动蛋白（红色）标记纤毛区域。误差线表示平均值± SD，n = 30。比例尺：2 μm （A）、5 μm（B，左侧的全尺寸图像）、1 μm（B，右侧区域的插图或放大）。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。BB， 基体;TZ， 过渡区;WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330.g001

Cep290是果蝇纤毛生成起始中已知的最上游蛋白[29,30]。在苍蝇和哺乳动物细胞中的研究表明，Cep290桥接睫状轴突和膜，其C端与微管双峰相关，N端与膜相关[29,33,34]。此前，我们已经证明果蝇Cep290的N端截断（Cep290-N，aa 1–650）和C端截断（Cep290-C，aa 1385至1978年底）都能够相互独立地定位到TZ[29]。3D-SIM显微镜显示，Cep290-C：：GFP位于轴突附近，而Cep290-N：：GFP位于膜附近，直径明显更大[29]。鉴于 Cep131 定位于 TZ 的管腔 [43]，我们假设 Cep131 可能在调节 Cep290 C 末端的定位中发挥作用。正如预期的那样，我们发现Cep290-C：：GFP信号在cep131突变体的精母细胞纤毛中几乎完全丢失，而Cep290-N：：GFP的信号强度与野生型（WT）相似（图1A）。有趣的是，我们注意到内源性 Cep290 N 末端（由抗 Cep290 抗体在其 N 末端针对 aa 292-541 标记）和 cep131 突变体中 Cep290-N：：GFP 的直径均显着小于 WT，表明 cep131 突变体中 Cep290 构象的潜在交替（图 1A 和 S1E).总的来说，我们的结果表明，Cep131 特异性调节精母细胞纤毛中 Cep290 C 末端的定位。

为了确定我们的观察结果是否特定于精母细胞纤毛，我们专注于感觉纤毛，这是果蝇中的另一种纤毛。与我们在精母细胞中的观察结果类似，Cep290、Cep290-N、Dzip1、Cby 和 Mks1 的信号强度受到轻度影响，而 Cep290-C：：GFP 几乎完全从 cep131 突变体的听觉纤毛的基底体中丢失（图 1B）。因此，Cep131 还促进 Cep290 C 末端与感觉纤毛中轴突的结合。

Cep162 桥接 Cep131 和 Cep290

接下来，我们想知道 Cep131 是否直接与 Cep290 相互作用。然而，在我们的酵母双杂交 （Y2H） 测定中未观察到 Cep131 和 Cep290 之间的相互作用（S2A 图），这表明其他蛋白质可能介导 Cep131 和 Cep290 之间的功能相互作用。据报道，在哺乳动物细胞中，Cep162定位于中心粒远端，并与Cep290相互作用，促进其与微管的结合[44]。使用 NCBI 蛋白-蛋白 BLAST 进行蛋白质同源性搜索，将 CG42699 确定为果蝇中 Cep162 的唯一同源物（S3 图）。与哺乳动物细胞中的报道一致，Y2H测定显示CG42669与果蝇Cep290相互作用（S2A图）。有趣的是，我们的Y2H测定还显示CG42699与果蝇Cep131相互作用（图2A和2B）。具体来说，CG42699的 C 端半部分（aa 448 到 897 的末端）与 Cep131 相互作用，而 N 端半部则不相互作用。 GST pull-down 试验进一步证实了 Cep131 和 Cep162 C 末端之间的直接相互作用，并表明 Cep162 C 末端与 Cep131 的 N 端半（aa 1-549）和 C 端半（aa 550 至 1114 末端）相互作用（S2B 图).随后使用 Y2H 的分析表明，Cep162 C 末端不与 Cep131 的中间区域 （aa 481-781） 相互作用，但它确实与 N 末端 （aa 1-480） 和 C 末端（aa 782 至 1114 末端）相互作用（S2C 图），表明 Cep131 中存在 2 个 Cep162 结合位点。

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图 2. Cep131 与中心粒尖端和 TZ 相互作用并招募 Cep162。

（甲、乙）Cep131 直接与 Cep162 相互作用。（A） 用于 B 中相互作用测定的全长 （Cep162-FL） 或截短 （Cep162-N， Cep162-C） Cep162 蛋白的示意图。 （B） Cep131 与 Cep162-FL 和 Cep162-C 相互作用，但在 Y2H 测定中不与 Cep162-N 相互作用。上图显示了 Y2H 质粒的存在，如 SD-Leu-Trp 平板上的菌落生长所证明的那样。下图显示了 Cep131 和 Cep162 之间的正相互作用，如 SD-Ade-Leu-Trp-His 平板上的菌落生长所证明的那样。（C） cep131突变体精母细胞纤毛中Cep162：：GFP（绿色）的免疫染色。睫状骨基底 Cep162 信号强度的定量如右图所示。γ-微管蛋白（红色）标记中心粒/基底体。误差线表示平均± SD，n = 30。（D） WT 或 cep131 突变体中听觉纤毛或嗅纤毛中 Cep162：：GFP（绿色）、肌动蛋白（红色）和 21A6（蓝色）的免疫染色。睫状骨基底 Cep162 信号强度的定量如右图所示。误差线表示 SD ±的平均值，n = 30。（E） 精子发生过程中外源性Cep162：：GFP的亚细胞定位。从精原细胞到晚期精母细胞，Cep162 位于中心粒/基底体的顶端。在圆形精子细胞中，随着鞭毛伸长并且睫状帽远离 BB，Cep162 与由 γ-微管蛋白（箭头）标记的环中心粒一起迁移，并且在 BB 处没有信号（箭头）。在随后的精子细胞鞭毛伸长过程中，Cep162信号从用Fbf1（一种过渡纤维蛋白，红色）标记的睫状帽基底消失。γ-微管蛋白（红色）标记中心粒/基底体，轴丝用Ac-Tub（洋红色）标记，细胞核用DAPI（蓝色）标记。（F） GFP 标记的 Cep162 N 端 （1-447 aa） 和 C 端 （448-897 aa） 在精母细胞中的定位。γ-微管蛋白用于标记BBs（红色）。（G） 用针对 Dzip1 的抗体（红色）共免疫染色的 Cep131：：GFP、Cep162：：GFP、Cep290-C：：GFP 或 Cep290-N：：GFP 共免疫染色的 3D-SIM 图像。信号强度图分别显示在右侧。（H） 显示 Cep131、Cep162、Cep290-N 和 Cep290-C 径向直径的图表。（一）Cep131和Cep162在TZ横截面上的定位模式示意图。比例尺：5 μm （C， D）， 2 μm （F）， 500 nm （G）， 缩放， 1 μm （D， E）.该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。BB， 基体;TZ， 过渡区;WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330.g002

CG42699/Cep162在fly中的作用尚不清楚。我们在其内源性启动子的控制下构建了表达Cep162：：GFP的转基因苍蝇菌株，以检查其在睾丸和纤毛感觉神经元中的亚细胞定位。我们观察到Cep162定位于所有类型纤毛中的BB（图2C-2E），表明Cep162在果蝇中的亚细胞定位是保守的。有趣的是，我们发现 Cep162 的 BB 信号在 cep131 突变体中完全丢失（图 2C 和 2D），表明 Cep131 在招募 Cep162 中起关键作用。值得注意的是，使用表达包含氨基酸 448–897 的 Cep162 （Cep162-C：：GFP） 的 GFP 标记 C 末端片段的转基因果蝇，我们观察到 Cep162 C 末端单独能够靶向 BB（图 2F）。相反，包含氨基酸 1–447 的 GFP 标记的 N 末端片段 Cep162-N：：GFP 未能定位于 BB。这些结果表明，Cep162 的 C 末端对 BB 靶向至关重要。这一特征在哺乳动物中是保守的，因为之前有报道说，哺乳动物Cep162的中心体定位也取决于其C末端[44]。

在精母细胞纤毛中，Cep162：：GFP位于基体的尖端（图2E）。为了更准确地确定 Cep162 的定位，我们进行了 3D-SIM 并检查了其相对于其他 BB 蛋白的空间分布。如图 2G 所示，Cep131：：GFP 和 Cep162：：GFP 都被 TZ 蛋白 Dzip1 包围。值得注意的是，荧光图谱显示Cep162的分布是双峰的，而Cep131的分布是单峰的。与这一观察结果一致，Cep162信号的平均径向直径大于Cep131形成的径向直径（图2G和2H），表明Cep162围绕着Cep131（图2I）。此外，我们计算了Cep290-C：：GFP和Cep290-N：：GFP信号的平均径向直径，发现Cep290-C：：GFP接近Cep162，并且形成的直径域比Cep290-N形成的直径更小（图2G–2I）。综上所述，我们的 3D-SIM 空间分布数据支持 Cep162 在介导 TZ 的 Cep131 和 Cep290 C 末端之间连接中的作用。

在圆形精子细胞中，TZ开始沿着生长的轴突迁移。Cep162：：GFP也随着γ-微管蛋白标记的环中心粒从BB迁移，但其信号逐渐降低，最终在伸长的精子细胞中从睫状帽基底（由Fbf1标记）中完全消失（图2E）。这种行为与Cep131相似，但与其他TZ蛋白不同[43]。Cep131 和 Cep162 的这种独特的时间定位模式表明在纤毛发生的起始阶段具有特定作用，但不是作为成熟 TZ 的组成成分。此外，我们注意到，与其他 TZ 蛋白不同，Cep162 定位于精原中中心粒的远端（图 2E），这表明它在纤毛形成之前就被募集到中心粒。

Cep162 作用于 Cep131 的下游以调节纤毛生成

为了阐明 Cep162 在苍蝇纤毛发生中的作用，我们设计了 2 个 gRNA 来使用 CRISPR-Cas9 系统敲除 Cep162。我们获得了一个缺失突变系cep1621（c.981-1306Del），其中Cep162的C末端由于缺失引起的读码偏移而丢失（图3A，S4A和S4B）。CEP162型1突变体是有活力的，但在运动和听觉等纤毛相关行为上表现出缺陷，这可以通过表达Cep162有效挽救（图3B）。对听觉器官纤毛形态的检查表明，在cep162突变体中，约有20.2%的纤毛缺失或非常短（图3C）。此外，透射电镜分析显示，在cep162睾丸的囊肿中经常观察到精子细胞缺失（图3D）。因此，Cep162确实是果蝇纤毛发生的关键成分。值得注意的是，我们的 TEM 图像显示 cep162 精子细胞中明显的线粒体异常，一些轴突显示出非常小或完全丢失的线粒体衍生物（如图 3D 所示）。此外，cep162突变体中线粒体衍生物的大小各不相同，与WT中观察到的整体均匀大小形成鲜明对比。Cep162如何影响线粒体动力学尚不清楚。有趣的是，Bauerly及其同事最近的一项研究报道了果蝇精子发生过程中纤毛相关基因对线粒体动力学的影响[45]。动力蛋白相关纤毛基因中的突变体表现出次要线粒体衍生物的缺失或尺寸减小。因此，纤毛相关基因对线粒体的影响并不是单一的。虽然其潜在机制目前尚不清楚，但需要进一步研究。

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图 3. CEP162 突变体模仿 CEP131 突变体的表型。

（A） cep162缺失突变体的产生。示意图显示了 Cep162 的基因组（上图）和蛋白质（下图）结构，以及 cep162 的预测蛋白产物1突变体（Cep1621_p.（Glu327_Met436delfsTer24））。箭头指向 2 个 gRNA 靶向位点。CEP162型1突变体的 cDNA 从 nt 981 到 1306 缺失，导致阅读帧移位和 C 末端丢失。（B）cep162突变体的听觉和负性趋向性分析。CEP162型1苍蝇表现出轻度听力缺陷。回缩指数表示幼虫对 1k Hz 音调的反应。该框显示中位数和四分位数范围;n = 25。cep162 的百分比1通过8 cm高鳞片的苍蝇明显低于WT苍蝇。误差线表示平均± SD，n = 50。（C） WT蝇和cep162突变蛹触角听觉器官纤毛形态的活体图像。感觉神经元由nompC-Gal4/UAS：：GFP（绿色）标记，纤毛位于树突的顶端。感觉纤毛在 cep162 的部分感觉神经元（白色星号）中丢失1突变体。右图显示了具有睫状体缺陷的感觉神经元的百分比。（D） WT 和 cep162 突变体中伸长精子细胞囊肿的代表性 TEM 图像。WT 中每个囊肿有 64 个精子细胞，而 cep162 突变体中每个囊肿的精子细胞数量减少。（E） WT 或 cep162 中 Cep131、Cep290、Dzip1、Cby、Mks1 和 Mks6 的免疫染色1睾丸。TZ蛋白强度的定量如下图所示。与其他 TZ 蛋白不同，Cep131 在 TZ 中的定位是正常的。误差线表示 SD 的平均值±n = 30。比例尺，5μm（C），1μm（D），2μm（E）。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。TZ， 过渡区;WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330.g003

在 cep162 突变体的精母细胞纤毛中，与 cep131 突变体类似，Cep290、Dzip1、Cby 和 TZ 蛋白 Mks1 和 Mks6 的信号强度显着降低（图 3E）。此外，我们在 12.6% 的精母细胞中心粒中观察到异常扩展的 CG6652：：GFP 信号（S4C 图），表明 cep162 突变体中的 BB 对接受损。BB和质膜之间连接的实时成像进一步证实了BB在一些圆形精子细胞中的缺陷（S4D图）。重要的是，我们发现 Cep131 的 BB 定位在 cep162 突变体中是正常的（图 3E）。总的来说，我们的数据表明 cep162 和 cep131 突变体表现出相似的表型，其中 Cep131 是招募 Cep162 所必需的，而相反则不然。

Cep162 是正确定位 Cep290 的 C 末端所必需的

然后，我们询问 Cep162 是否是 Cep131 的下游蛋白，负责调节 Cep290 C 末端定位到 TZ。事实上，与WT相比，cep162突变体精母细胞中过表达的Cep290-C：：GFP信号显著降低（图4A），但仍可观察到一定量的信号。值得注意的是，这种残留的Cep290-C：：GFP信号比在cep131突变体中观察到的信号强得多（图1A和3E）。哺乳动物Cep290 C端片段先前被证明与自身或Cep290 N端片段相互作用，形成同源二聚体或异源二聚体[46]。作为内源性 Cep290 的一部分，仍然能够定位于 cep162 突变体中的 TZ，因此我们推测过表达的 Cep290-C：：GFP 可能与剩余的内源性 Cep290 结合。为了排除这种可能性，我们生成了 cep162 和 cep2901双重突变体。之前，我们已经证明 TZ 组装被完全阻断，并且中心粒/基底体微管在 cep290 中异常延伸1突变体[29]。有趣的是，我们观察到 Cep162-FL：：GFP 和 Cep162-C：：GFP 都位于 cep290 中异常延伸的微管上1单个突变体（图 4B），表明 Cep162 可以独立于 Cep290 识别微管。有趣的是，在 cep290 中1单个突变体 Cep290-C：：GFP 在异常延伸的微管上显示出与 Cep162：：GFP 相似的定位模式（图 4A），表明 Cep290-C：：GFP 不需要全长 Cep290 即可靶向轴突。此外，Cep290-C：：GFP信号在cep162的精母细胞中显著降低; cep2901双突变体（图4A），尽管在这些双突变体中Ac-tub（S4E图）指示异常微管延伸持续存在。这一观察结果表明，Cep162 调节 Cep290 C 末端与精母细胞纤毛中微管之间的关联。总的来说，我们的结果表明，Cep290-C到轴突的定位是由Cep162介导的，而在cep162突变体中，内源性Cep290仍然可以保留。在感觉纤毛中也观察到类似的结果，其中 Cep290 的缺失不影响 Cep162-FL 或 Cep162-C 靶向感觉神经元中的睫状体基底（图 4C），但 cep162 的 TZ 中缺少 Cep290-C：：GFP; CEP290型1感觉神经元（图4D）。

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图 4. Cep162 是 Cep290 C 末端的 BB 定位所必需的。

（A） WT、cep162、cep290精母细胞纤毛中Cep290-C：：GFP（绿色）的免疫染色1和 CEP162; CEP2901苍蝇，其相应相对荧光强度的量化如右图所示。Cep290-C：：GFP 在 cep162 和 cep290 中完全失去 TZ 定位1双突变精母细胞。中心粒/基底体标有 γ-微管蛋白（红色）。误差线表示平均± SD，n = 50。（B） WT或cep290中Cep162-FL：：GFP（绿色）和Cep162-C：：GFP（绿色）的免疫染色1精母细胞纤毛。卡通显示了 WT 或 Cep290 中的 Cep162 信号1.中心粒/基底体标有 γ-微管蛋白（红色）。（C） cep290 中的 Cep162 信号大致正常1突变触角。21A6（蓝色）标记纤毛基部;肌动蛋白（红色）标记纤毛区域。（D） WT、cep162、cep290 中 Cep290-C：：GFP（绿色）的免疫染色1和 CEP162; CEP2901触角，以及它们相应的相对荧光强度的量化如右图所示。值得注意的是，cep290-C：：GFP 信号在 cep162 中显着降低;CEP290型1双重突变体。21A6（蓝色）标记睫状骨基部;肌动蛋白（红色）标记纤毛区域。误差线表示平均± SD，n = 50。比例尺，4 μm （A， B），5 μm （C， D），缩放，1 μm （C， D）。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。BB， 基体;WT，野生型。

Cep162 与 Cby-Fam92 模块发生基因相互作用以启动纤毛发生

由于 cep131 和 cby 双突变体的纤毛发生起始被完全消除 [43]，我们推测 cep162 和 cby 双突变体应该具有相似的表型。事实上，cep162;CBY果蝇表现出比任何一个突变体更严重的纤毛相关缺陷。cep162; cby 苍蝇严重不协调，无法行走和飞行。听力试验表明，双突变体的听力完全丧失（图5A）。听觉纤毛的形态学检查显示听觉器官未能形成纤毛（图5B）。在精母细胞中，CG6652标记的中心粒微管异常延伸的百分比从cep162单突变体的12.6%或cby单突变体的47.6%增加到cep162的81.1%; CBY双突变体，表明纤毛生成的起始存在强烈的合成缺陷（图5C）。此外，与cep131相似;cby双突变体，cep162中的精子鞭毛;cby精子细胞受到严重影响，在TEM分析中几乎没有观察到轴突（图5D）。与这一观察结果一致，Cep290、Dzip1、Mks1 和 Mks6 的信号从双突变体的 BB 尖端完全丢失（图 5E 和 5F）。所有这些结果都表明，cep162;CBY突变体模仿CEP131的表型;CBY双突变体先前报道。

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图 5. Cep162 与 Cby-Fam92 模块发生基因相互作用以启动纤毛发生。

（一）cep162;CBY苍蝇完全失去了听力和负面的地理趋向性。（B） WT果蝇蛹触角听觉神经元纤毛形态的活图像; CBY突变体。纤毛在cep162中完全丢失; CBY突变体。感觉神经元由 nompC-Gal4/UAS：：GFP（绿色）标记，纤毛位于树突的尖端。（C）与WT或CBY单突变体相比，在cep162; CBY突变体中，具有CG6652信号异常延伸的精母细胞纤毛的百分比显着增加。基体标有γ-微管蛋白（红色）。（D） 与每个精子囊肿中有 64 个鞭毛的 WT 相比，在 cep162 的精子细胞囊肿中观察到的正常鞭毛很少; CBY突变体。（E） cep162 的 TZ 中不存在 Cep290、Dzip1、Cby 和 Mks1; CBY突变精母细胞。右图显示了相应相对荧光强度的定量。中心粒/基底体标有 γ-微管蛋白（红色）。误差线表示平均值± SD，n = 30。（F） cep162 的 TZ 中不存在 Cep290、Dzip1、Cby 和 Mks1; CBY突变感觉神经元。右图显示了相应相对荧光强度的定量。21A6（蓝色）标记睫状骨基部;肌动蛋白（红色）标记纤毛区域。误差线表示平均± SD，n = 30。比例尺，5 μm（B，C，F），2 μm（D，E），缩放，1μm（F）。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。TZ， 过渡区;WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330.g005

由于 Cby 和 Fam92 在一个模块中共同调节纤毛生成 [30,47,48]，我们推测 Cep162 与 Fam92 的联合突变也可能导致合成纤毛缺陷。事实上，正如预期的那样，cep162; fam92 果蝇在行走和苍蝇中表现出比单独使用任何一个突变体更严重的缺陷，并且 Cep290 在双突变体的精母细胞纤毛中也完全丢失（S5 图）。

Cby-Fam92 模块是 Cep290 的 N 末端与膜结合所必需的

在 Cep162/Cep131 和 Cby/Fam92 双突变体中观察到的合成缺陷可能归因于 BB 处 Cep290 信号的完全丧失。考虑到Cep131-Cep162模块是Cep290 C末端定位所必需的，且Cep290 N末端的定位模式与Cby在膜附近的定位模式相似，我们推测Cby-Fam92模块可能在促进Cep290 N末端的BB定位中发挥作用。为了排除Cep290 C末端对我们分析的影响，我们合并了Cep290 C末端（cep290ΔC型），并检查过表达的 Cep290-N：：GFP 的定位。事实上，Cep290-N：：GFP的TZ信号在cby中几乎完全丢失; CEP290ΔC型双突变体与CBY或CEP290的比较ΔC型单个突变体（图6A），表明Cby确实在将Cep290 N末端靶向TZ中发挥作用。值得注意的是，与Cep290-N：：GFP不同，Cep290-C：：GFP仍然能够定位到CBY的基底体尖端; CEP290型ΔC型双突变体（图6B），表明Cby在Cep290-N：：GFP的定位中具有特定作用。

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图 6. Cby-Fam92 模块是 Cep290 N 末端的 BB 定位所必需的。

（A） WT、cby、cep290精母细胞纤毛中外源性Cep290-N：：GFP（绿色）的免疫染色ΔC型、CBY; CEP290ΔC型睾丸和相应相对荧光强度的定量如右图所示。Cep290-C：：GFP的信号在cby中心粒的顶端几乎丢失; cep290ΔC型双重突变体。中心粒/基底体标有 γ-微管蛋白（红色）。误差线表示 SD ±均值，n = 60。（B） WT和cby精母细胞纤毛中外源性Cep290-C：：GFP（绿色）的免疫染色; CEP290型ΔC型睾丸。Cep290-C：：GFP 定位于 cby 中的轴突; CEP290型ΔC型突变 体。中心粒/基底体标有 γ-微管蛋白（红色）。（C） WT、cby、cep290 中内源性 Cep290 的免疫染色ΔC型和 CBY; CEP290ΔC型睾丸和相应相对荧光强度的定量如右图所示。C 端截短的 Cep290 形式无法定位到 cby 中中心粒的尖端; CEP290型ΔC型精母细胞。中心粒/基底体标有 γ-微管蛋白（红色）。误差线表示 SD 的平均值±n = 30。（D） 内源性Cep290 C端截短形式无法定位到CBY触角听觉神经元的纤毛基部; CEP290型ΔC型天线。右图显示了相应相对荧光强度的定量。21A6（蓝色）标记纤毛基部;肌动蛋白（红色）标记纤毛区域。误差线表示 SD ±均值，n = 60。（E） 在 cby 中; cep290ΔC型突变体中，CG6652信号异常延伸的精母细胞纤毛百分比达到约79.8%。Axoneme 标有 CG6652。中心粒/基底体标有 γ-微管蛋白（红色）。误差线表示 SD 的平均值±n = 30。（F） dzip1 和 Mks1 在 cby 的精母细胞纤毛中不存在; CEP290型ΔC型突变 体。中心粒/基底体标有 γ-微管蛋白（红色）。误差线表示 SD 的平均值±n = 30。（G） Dzip1 和 Mks1 无法定位到 cby 触角听觉神经元的纤毛基部; CEP290型ΔC型天线。21A6（蓝色）标记纤毛基部;肌动蛋白（红色）标记纤毛区域。比例尺，2 μm（A、C、F）、5 μm（B、D、E、G），缩放，1 μm（D、G）。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。BB， 基体;TZ， 过渡区;WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330.g006

鉴于 Cby 影响 Cep290 N 末端的定位，我们推断内源性截短的 Cep290 可能无法靶向 cby 中的 TZ; cep290型ΔC型双重突变体。因此，我们使用我们的 Cep290 抗体检查了精母细胞中的 Cep290 信号。在cby单突变体中，Cep290信号略有降低。在 cep290 中ΔC型如前所述，单个突变体Cep290 N-末端的表达水平较低[29]，但仍保留在BB的顶端。然而，与我们的假设一致，剩余的 Cep290 截短形式的 TZ 信号在 cby 的精母细胞中完全丢失; CEP290型ΔC型双突变体（图6C）。在感觉纤毛中也观察到类似的结果，其中Cep290信号在cby中也完全丢失; CEP290ΔC型双突变体（图6D）。同样，我们证明了 Cep290 信号在 fam92 中也完全丢失; cep290ΔC型双突变体（S5图）。这些结果表明，Cby-Fam92模块特异性地促进了锚定Cep290 N-末端到膜上。

由于 Cep290 在 cby 中从 BB 中完全丢失; cep290ΔC型，纤毛生成的起始应像CBY、CEP131或CBY、CEP162双突变体一样被完全阻断。事实上，正如预期的那样，CG6652在中心粒尖端的异常延伸比例达到约79.8%，表明大多数BB没有锚定在质膜上（图6E）。此外，在两种纤毛细胞类型中，Dzip1 和 Mks1 从 BB 的尖端完全丢失（图 6F 和 6G）。所有这些结果都表明，cby; cep290ΔC型突变体模仿 CEP290 无效突变体的表型。

讨论

TZ蛋白Cep290连接睫状膜和轴突微管，其N端靠近膜，C端靠近轴突微管[33,34]。我们和其他人先前的研究表明，Cep290 的 N 末端作用于 Dzip1-Cby-Fam92 模块的上游，对果蝇的纤毛发生起始和纤毛芽形成至关重要 [29]。在这里，我们发现 Cep131-Cep162 模块在 Cep290 的上游起作用，并调节 Cep290-C 末端与轴突微管的结合以启动纤毛发生。综上所述，我们提出果蝇精母细胞纤毛发生的初始过程如下（图7A和7B）：在精原细胞中，Cep131定位于中心粒的远端，并将Cep162募集到中心粒;当中心粒开始在精母细胞中生长纤毛时，Cep162募集Cep290并促进Cep290-C与轴突的结合;随后，Cep290的构象由闭合状态变为开放状态，Cep290的N端募集Dzip1-Cby-Fam92模块，开始早期睫状膜形成和睫状芽形成。另一方面，Cby-Fam92介导的睫状膜形成对促进Cep290 N端与睫状膜的结合具有正反馈作用。鉴于在感觉纤毛中观察到类似的结果，这种有序模型并非精母细胞纤毛所独有。此外，参与该有序通路的所有蛋白质（Cep131、Cep162、Cep290、Cby、Fam92）都是保守的，并在哺乳动物的TZ组装中起关键作用[24,37,44,48]，这表明该模型在哺乳动物中具有潜在的保守性。然而，应该注意的是，Cep290已被证明在不同物种中具有不同的特性[9]，并且某些携带与患者相关突变的动物模型表现出较轻的症状[49,50]，不能排除Cep290的组织和物种特异性功能。

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图 7. 果蝇纤毛发生起始模型和 CEP290 定位机制。

（A） 果蝇纤毛发生起始模型。（1）在精原细胞中，Cep131定位于中心粒的远端并募集Cep162。（2）当中心粒开始在精母细胞中生长纤毛时，Cep162募集Cep290并促进Cep290-C与轴突的结合。（3）随后，Cep290的构象由闭合态变为开放态，Cep290的N端募集Dzip1-Cby-Fam92模块;（4）然后开始早期睫状膜形成和睫状芽形成。（B） Cep290定位的合作模式。Cep131-Cep162 模块与 Cby-Fam92 模块一起调节 Cep290 在 TZ 的定位。在机制上，Cep131 募集 Cep162，Cep162 介导 Cep290 的 C 末端与微管的结合。Cep290的N端募集Dzip1-Cby-Fam92模块开始早期睫状膜形成和睫状芽形成，而Cby-Fam92介导的睫状膜形成对促进Cep290 N端与睫状膜的结合具有正反馈作用。TZ，过渡区。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330.g007

此前，Drivas及其同事提出了Cep290在纤毛发生过程中的构象变化模型[33]。根据他们的模型，Cep290最初被其N和C末端维持在封闭和抑制状态[33]。在纤毛发生过程中，Cep290 发生构象变化，从闭合状态过渡到开放状态。这种构象变化使 Cep290 的膜结合和微管结合结构域变得可及，从而能够招募额外的相互作用伙伴来启动纤毛发生。这种构象变化模型的有效性得到了 2 条证据的支持。首先，在脊椎动物中发现Cep290的N端片段与Cep290的C端片段相互作用[46]，为两者的关联提供了证据。其次，Cep290的N和C末端均在哺乳动物和果蝇中Cep290的定位和功能中发挥调节作用[29,33]。有趣的是，我们观察到 cep131 突变体中 Cep290-N：：GFP 的直径明显小于 WT 中的直径（S1E 图），这表明 Cep290 的构象在 cep131 突变体中可能仍然是封闭的，这意味着 Cep131 参与了 Cep290 的构象变化。然而，目前缺乏Cep290构象变化的直接结构证据。研究这方面并探索Cep131在其中的作用将是未来一个有前途的研究方向。

值得注意的是，Cep290具有自己的微管结合结构域和膜结合两亲性α螺旋基序[33];因此，Cep131-Cep162 和 Cby-Fam92 模块的作用可能只是促进和提高 Cep290 与轴突和膜连接的效率。鉴于在没有 Cep131 或 Cep162 的情况下纤毛生成的部分缺陷，我们推测 Cep290 的微管结合能力可能足以在没有 Cep131 或 Cep162 的情况下构建 TZ。我们建议，只要 Cep290，即使是有限的数量，最初能够定位到 BB，然后可以通过 Cep290 和 Dzip1-Cby-Fam92 模块的相互募集来启动纤毛发生。我们之前的观察结果支持了这一点，即即使单独使用Cep290的N末端，如果定位得当，也可以促进纤毛发生启动[29]。该模型为与 Cep290 突变相关的各种病理表型提供了可能的解释，从孤立失明到致死，这使得建立明确的基因型-表型相关性具有挑战性。我们预计，特定的发育和细胞环境，或遗传修饰剂的存在可能会通过影响稳定 TZ Cep290 所需的各种复合物来引入纤毛组装或功能的变异性。

我们的研究不仅揭示了Cby-Fam92模块和Cep131-Cep162模块在Cep290募集和纤毛发生启动中合成相互作用的分子机制，而且揭示了Cep131在纤毛生成中的新分子功能，它募集Cep162以促进Cep290的C末端与轴突的结合。我们证明了 Cep131-Cep162 模块促进 Cep290 C 末端与轴丝的结合，而 Cby-Fam92 模块促进和稳定 Cep290 N 末端在膜上的定位，因此，这两个模块的并发突变共同导致 Cep290 无法定位到 TZ 并阻断纤毛生成的启动。Cep290 是一种有趣的纤毛病基因。目前已鉴定出130多种突变，但它们的相关表型可能存在显著差异，这表明其表型的发展可能涉及遗传修饰因子[32,51]。因此，修饰基因的鉴定已成为了解Cep290相关纤毛病发病机制的重要因素。虽然Cep131和Cby尚未与纤毛病相关，但据报道，Cep162和Fam92A突变与人类纤毛相关疾病有关[52,53]。我们对 cby 中纤毛发生起始合成缺陷的观察; CEP290ΔC型双突变体表明 Cby 或 Fam92 可能是 Cep290 C 末端疾病突变的遗传修饰因子。同样，Cep131 或 Cep162 可能作为 Cep290 N 末端疾病突变的遗传修饰剂。

材料和方法

苍蝇库存

Cby：：GFP、Cep131：：GFP、Cep290-N：：GFP、Cep290-C：：GFP、CG6652：：GFP、Mks1：：GFP、Mks6：：GFP和nompC-Gal4的转基因果蝇;UAS：：GFP既往报道[29]。本文生成了Cep162：：GFP、Cep162-N：：GFP和Cep162-C：：GFP转基因果蝇。中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所果蝇资源与技术核心设施将Cep162或Cep162 C末端的cDNA及其内源启动子插入PJFRC2载体中，利用质粒构建转基因果蝇。

w1118苍蝇被用作野生型。CEP290型ΔC型、CEP290型1，CBY和FAM92突变果蝇之前已有报道[29]。所有实验均在25°C下进行。

果蝇缺失突变体的产生

cep131 和 cep162 突变体的产生与先前报道相同 [29]。简而言之，Cep131 和 Cep162 的突变体是由 CRISPR/Cas9 介导的基因靶向系统产生的。使用PCR将靶向序列插入PU6-BbsI-chiRNA载体中，从而产生gRNA表达质粒。为了提高产生片段缺失突变体的效率，促进突变体鉴定，将 2 个 gRNA 一起注射到表达 Cas9 的胚胎中。

用于构建gRNA载体的引物：

免疫荧光

对于触角或睾丸的IF染色，在蛹形成（APF）后36至48小时，收集蛹，并在PBS中用镊子解剖它们的触角或睾丸。将触角或睾丸转移到盖玻片的中心，然后用盖玻片上的载玻片轻轻覆盖。将载玻片浸入液氮中30秒，并立即用刀片取出盖玻片。然后用甲醇（-20°C）固定样品15分钟，然后用丙酮（-20°C）固定10分钟。为了阻断非特异性结合，将标本在封闭缓冲液（0.1%Triton X-100,3%牛血清蛋白的PBS溶液）中孵育1小时。将一抗在4°C的湿气室中施加过夜，然后在室温下施加二抗3小时。

抗体

使用的一抗如下：YOUKE Biotech、兔抗GFP（1：500，ab290，Abcam）、小鼠抗GFP（1：200,11814460001，Roche）、小鼠抗Ac-tub（1：500，T6973，Sigma-Aldrich）、小鼠抗γ-微管蛋白（1：500，T5326，Sigma-Aldrich）和小鼠抗-21A6（1：200，AB528449，DSHB）产生兔抗Dzip1（aa 451-737）、兔抗-Cep290（aa 292-541）和兔抗-Fbf1（aa 1-336）抗体。使用以下二抗：山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488 （1：1,000， A-11001， Invitrogen）、山羊抗兔 Alexa Fluor 594 （1：1,000， A1000701， Invitrogen）、山羊抗兔 Alexa Fluor 488 （1：1,000， A-11006， Invitrogen）、山羊抗小鼠 IgG1 Alexa Fluor 488 （1：1,000， A-21121， Invitrogen）、山羊抗小鼠 Alexa Fluor 594 （1：1,000， A-11007， Invitrogen）、山羊抗小鼠 Alexa Fluor 647 （1：1,000， A-21242， Invitrogen）。

显微镜和图像分析

对于IF染色，在荧光显微镜（Nikon Ti）和100×（1.4 NA）油浸物镜上，或共聚焦显微镜（Leica Stellaris 5）和63×（1.4 NA）油浸物镜上拍摄图像，或Delta Vision OMX SR（GE Healthcare）和60×（1.42 NA）油浸物镜。使用 xzy 扫描模式以 Z 轴堆栈（Z 步长为 0.5 至 0.8 μm，步长为 3 至 5 μm）获取共聚焦图像。以 0.125 μm Z 步长（20 步）采集 3D-SIM 图像的切片，并使用 softWoRx 软件（GE Healthcare）重建原始数据。使用 ImageJ（美国国立卫生研究院）对图像进行像素密度量化。为了量化像素密度，使用相同的显微镜设置拍摄图像。像素密度值的计算方法是，定义区域中的像素密度总值减去靠近定义区域的区域中的像素密度总值。所有图像都使用 Photoshop（CS5、Adobe）组装成图形。

透射电子显微镜

如前所述，制备样品进行电子显微镜检查[54]。简而言之，将样品在2.5%戊二醛/ 0.2M磷酸盐缓冲液中在冰上孵育24小时，后缀在2%OsO中4/0.1 M磷酸盐缓冲液在冰上，用乙醇脱水，并包埋在环氧树脂中。使用超薄切片机对选定的区域进行切片。用醋酸铀酰和柠檬酸铅对超薄切片进行染色，并在 80 kV 下用 Hitachi H-7650 透射电子显微镜进行检查。

阴性地质趋向性测定

收集处蝇并在新鲜培养基中培养 3 至 5 天。将总共 50 只苍蝇分装到 5 个量瓶中，每个量瓶 10 只，然后将苍蝇敲击到小瓶底部，并计算在 10 秒内爬过 8 厘米高栏杆的苍蝇数量。每组重复3次。

幼虫听力测定

将3龄幼虫分成5组，每组5只，置于喇叭上方的琼脂平板上，每30 s用1k Hz声音刺激一次，统计刺激后1 s内头部或身体有收缩反应的幼虫数量。每组重复 5 次。

酵母双杂交检测

将 Cep131-FL （1–1114 aa）、Cep131-N1 （1–480 aa）、Cep131-M1 （481–781 aa）、Cep131-C1 （782–1114 aa）、Cep162-N （1–447 aa）、Cep162-C （448–897 aa）、Cep290-N （1–887 aa） 和 Cep290-ΔN （888–1978 aa） 引入 pGBKT7 或 pGADT7 载体中。将 pGADT7 和 pGBKT7 中的克隆转化为酵母菌株 AH109 （Takara Bio）。酵母在 30°C 的 SD-Leu-Trp 平板上生长。 孵育 3 至 4 天后，挑选 2 个独立的阳性菌落并用 TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA （pH 7.5））稀释，然后转移到含有 3-氨基-1,2,4-三唑的 SD-Ade-Leu-Trp-His 或 SD-Leu-Trp-His 板中，并在 30°C 下孵育 5 天。

GST 下拉式检测

为了生成 His-Cep162-N （1–447 aa）、His-Cep162-C （448–897 aa）、His-Cep131-N （1–549 aa）、His-Cep131-C （550–1114 aa） 的细菌表达质粒，通过 PCR 扩增编码指定氨基酸的 cDNA 片段并将其亚克隆到 pET28a 或 pGEX-4 T-1 载体中。使用 BL21 （DE3） E 表达蛋白质。大肠杆菌。用IPTG诱导菌株，并用谷胱甘肽-琼脂糖珠或镍树脂（Yeasen）纯化。将纯化的 His-Cep131 截断与固定的 GST 或 GST-Cep162 截断在结合缓冲液（pH 7.4 下的 25 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.5% Triton X-100、1 mM 二硫苏糖醇、10% 甘油和蛋白酶抑制剂）中在 4°C 下孵育 4 小时。孵育后，用洗涤缓冲液（与20mM咪唑结合缓冲液）洗涤珠子3次，然后在1×SDS上样缓冲液中煮沸10分钟。然后用SDS-PAGE凝胶分离蛋白质样品，并转移到PVDF膜上，用His抗体（Invitrogen）进行免疫印迹或用Ponceau S染色，一抗的稀释度为1/1,000，二抗的稀释度为1/2,000。所有未裁剪的图像都可以在 S1 Raw Image 中找到。

统计学

使用Microsoft Excel或Graphpad Prism对数据进行分析和绘制。除非另有说明，否则所有误差线均表示均值的标准差 （SD），并且使用未配对的双尾学生 T 检验评估数据之间的统计显着性。当 P ≤ 0.05 时，数据之间的差异被认为具有统计学意义。

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cep131突变体的鉴定和表型分析。

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S1 图。 cep131突变体的鉴定和表型分析。

（A） cep131突变体生成的示意图。示意图显示了 Cep131 的基因组（上图）和蛋白质（下图）结构，以及 Cep131 的预测蛋白产物1突变体（Cep1311_p.（His480_Leu708delfsTer61））。两个箭头代表 gRNA 靶位点。CEP131型1，移码线，cDNA 从 nt 1439 到 2123 缺失，导致阅读移码和 C 末端丢失。（B） 使用 PCR 对 cep131 突变体进行基因分型。PCR扩增产物长度为1471 bp，持续w1118CEP131 苍蝇的长度为 603 bp。（C） cep131突变体缺失的序列确认。用于测序的引物用橙色框标记。用于突变体生成的 2 个 gRNA 的位置用黑色下划线下划线。红色和蓝色框标记突变体中缺失 cep131 的边界。（D） CG6652在WT或cep131精母细胞纤毛中的免疫染色1睾丸。CG6652（绿色）标记睫状轴丝。在 cep131 中1，一些中心粒具有过长的 CG6652 信号（箭头）。中心粒/基底体标有 γ-微管蛋白（红色）。比例尺，5μm。（E） Cep290或Cep290-N径向距离的量化。在 cep131 突变体中，与 WT 相比，Cep290 或 Cep290-N 的径向距离显着降低。误差线表示平均± SD，n = 60。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330.s001

（TIF）

S2 图。 酵母双杂交测定 Cep290 和 Cep162 或 Cep131 之间的相互作用。

（A） 在 Y2H 测定中，Cep290 与果蝇中的 Cep162 相互作用 （CG42699），但不与 Cep131 相互作用。LW：选择性培养基 SD-Leu-Trp 板。LWH：选择性培养基 SD-Leu-Trp-His 板。LWHA：SD-Ade-Leu-Trp-His 板。（B） GST pull-down 试验证实了 Cep131 和 Cep162 在体外的直接相互作用。GST、GST-Cep162-N 和 GST-Cep162-C 重组蛋白用 His-Cep131-N 或 His-Cep131-C 蛋白进行拉低。（C） 在 Y2H 测定中，Cep162 与 Cep131-N1 和 Cep131-C1 相互作用，但不与 Cep131-M1 相互作用。LW：选择性培养基 SD-Leu-Trp 板。LWH：选择性培养基 SD-Leu-Trp-His 板。LWHA：SD-Ade-Leu-Trp-His 板。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330.s002

（TIF）

S3 图。 人 Cep162、小鼠 Cep162 和果蝇 CG42699 C 末端的蛋白质序列比对。

CG42699是搜索果蝇黑腹果蝇中人或小鼠 Cep162 蛋白同源性时唯一一个重要的比对序列。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330.s003

（TIF）

S4 图。 Cep162 是 BB 对接精母细胞质膜所必需的。

（A） cep162突变体缺失的序列确认。用于测序的引物用橙色框标记。用于突变体生成的 2 个 gRNA 的位置用黑色下划线下划线。红色和蓝色框标记突变体中缺失 cep162 的边界。（B） 使用PCR对cep162果蝇进行基因分型。WT的扩增产物为881 bp，突变体的扩增产物为555 bp。（C） WT或cep162精母细胞纤毛中CG6652的免疫染色1睾丸。CG6652（绿色）标记睫状轴丝。在 cep162 中1，一些中心粒具有过长的 CG6652 信号（箭头）。（D） WT 果蝇和 cep162 突变体中睫状帽和质膜之间连接的实时成像。质膜（PM）用CellMask标记，BBs用UNC-GFP标记。在cep131的一些精子细胞中观察到BB和膜之间的连接缺陷1突变体（箭头）。（E） 精母细胞在 cep162 的中心粒/BB 中显示异常的乙酰化微管蛋白延伸; cep290型1突变 体。比例尺，5μm（C，E），10μm（D）。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330.s004

（TIF）

S5 图。 Cep290 定位的合成缺陷 在 CEP162、FAM92 或 FAM92、CEP290 中定位ΔC型突变 体。

cep162 精母细胞中的 TZ 中不存在 Cep290;fam92 或 fam92;cep290ΔC型突变 体。BB用γ-微管蛋白（红色）标记。误差线表示 SD 的平均值±n = 30。比例尺，2μm。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330.s005

（TIF）

S1 原始图像。 蛋白质印迹的全面扫描。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330.s006

（TIF）

S1 数据。 原始数据是这些数字的基础。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002330.s007

（XLSX）

确认

我们感谢清华大学的张炜博士提供菌株。我们感谢果蝇资源与技术（SIBCB、CAS）的核心设施、共聚焦成像核心设施（SIAT、CAS）和EM核心设施（SIPPE、CAS）的技术支持。

引用

1.Anvarian Z， Mykytyn K， Mukhopadhyay S. 初级纤毛在发育、器官功能和疾病中的细胞信号传导。Nat Rev Nephrol。2019;15:199–219.PMID：30733609

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

2.Sreekumar V，诺里斯 DP。纤毛和发育。Curr Opin Genet Dev. 2019;56:15–21.PMID：31201996

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

3.Goetz SC，安德森 KV。初级纤毛：脊椎动物发育过程中的信号中心。Nat Rev Genet。2010;11:331–344.PMID：20395968

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

4.Mill P， Christensen ST， Pedersen LB. 初级纤毛作为发育和疾病中的动态和多样化的信号枢纽。Nat Rev Genet。2023;24:421–441.PMID：37072495

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

5.Reiter JF， Leroux MR. 支持纤毛病的基因和分子途径。Nat Rev Mol 细胞生物学 2017;18:533–547.PMID：28698599

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

6.Hildebrandt F、Benzing T、Katsanis N. 纤毛病。N Engl J Med. 2011 年;364:1533–1543.PMID：21506742

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

7.Wallmeier J， Nielsen KG， Kuehni CE， Lucas JS， Leigh MW， Zariwala MA， et al. 运动纤毛病。Nat Rev dis 引物。2020;6:77.PMID：32943623

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

8.Carvalho-Santos Z， Azimzadeh J， Pereira-Leal JB， Bettencourt-Dias M. 进化：追踪中心粒、纤毛和鞭毛的起源。细胞生物学杂志 2011;194:165–175.PMID：21788366

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

9.Garcia-Gonzalo FR，Reiter JF。芝麻开门：过渡纤维和过渡区如何控制纤毛组成。冷泉Harb Perspect Biol.，2017 年;9：A028134。PMID：27770015

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

10.Sorokin S. 中心粒和成纤维细胞和平滑肌细胞形成基本纤毛。细胞生物学杂志 1962;15(2):363–377.PMID：13978319

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

11.魏秦， 玲玲， 胡 J.过渡纤维在纤毛环境中的重要作用。Curr Opin 细胞生物学 2015;35:98–105.PMID：25988548

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

12.吉卢拉 NB， 萨蒂尔 P.纤毛项链。睫状膜专业化。细胞生物学杂志 1972;53:494–509.PMID：4554367

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

13.佩德森 LB，罗森鲍姆 JL。鞭毛内运输 （IFT） 在纤毛组装、吸收和信号传导中的作用。Curr Top Dev Biol. 2008 年;85:23–61.PMID：19147001

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

14.Pigino G. 鞭毛内运输。Curr Biol. 2021 年;31：R530-R536。PMID：34033785

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

15.哺乳动物肺中中心粒形成和纤毛发生的重建。细胞科学杂志 1968;3:207–230.PMID：5661997

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

16.Reiter JF， Blacque OE， Leroux MR.纤毛的基底：过渡纤维和过渡区在纤毛形成、维持和区室化中的作用。EMBO 代表 2012;13:608–618.PMID：22653444

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

17.Schmidt KN， Kuhns S， Neuner A， Hub B， Zentgraf H， Pereira G. Cep164 在纤毛生成的早期步骤中介导囊泡与母中心粒的对接。细胞生物学杂志 2012;199:1083–1101.PMID：23253480

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

18.Tanos BE， Yang HJ， Soni R， Wang WJ， Macaluso FP， Asara JM.中心粒远端附肢促进膜对接，导致纤毛萌发。基因开发 2013;27:163–168.PMID：23348840

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

29 分钟Ye X， Zeng H， Ning G， Reiter JF， Liu A. C2cd3 对哺乳动物的中心粒远端附肢组装和睫状囊泡对接至关重要。美国国家科学院院刊 2014;111:2164–2169.PMID：24469809

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

10 分钟Joo K， Kim CG， Lee MS， Moon HY， Lee SH. 睫状囊泡与母中心粒对接需要 CCDC41。美国国家科学院院刊，2013 年;110:5987–5992.PMID：23530209

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

11 分钟Kanie T、Love JF、Fisher SD、Gustavsson AK、Jackson PK。组织初级纤毛的远端附属物组装的分层途径。生物Rxiv。2023;2023.2001.2006.522944.PMID：36711481

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

12 分钟Hou Y， Zheng S， Wu Z， Augière C， Morel V. 果蝇过渡纤维对 IFT 依赖性睫状伸长至关重要，但对基底体对接和睫状出芽不是必需的。Curr Biol. 2023;33：727-736.e726。PMID：36669498

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

13 分钟Lapart JA， Billon A， Duteyrat JL， Thomas J， Durand B. DZIP1-CBY-FAM92 过渡区复合物在基体膜附着和纤毛出芽中的作用。Biochem Soc Trans. 2020;48:1067–1075.PMID：32491167

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

14 分钟Wang C， Li J， Takemaru KI， 江 X， Xu G. 中心体蛋白Dzip1l结合Cby，促进纤毛芽形成，并与Bromi冗余作用以调节小鼠的纤毛生成。发展。2018;145（6）:d ev164236。PMID：29487109

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

25.舒特登 C， 塞尔瓦斯 D， 帕尔菲 M， 达默曼 A.纤毛过渡区在细胞粘附中起作用，但对于秀丽隐杆线虫的轴丝组装是可有可无的。细胞生物学杂志 2015;210:35–44.PMID：26124290

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

26.Wu CT， Chen HY， Tang TK. 肌球蛋白-Va是纤毛发生过程中睫状前囊泡转运到母中心粒所必需的。Nat Cell Biol. 2018;20:175–185.PMID：29335527

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

17 分钟Lu Q， Insinna C， Ott C， Stauffer J， Pintado PA.初级纤毛组装的早期步骤需要 EHD1/EHD3 依赖性睫状囊泡的形成。Nat Cell Biol. 2015 年;17:228–240.PMID：25686250

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

18 分钟Kn?dler A， Feng S， Zhang J， Zhang X， Das A. Rab8 和 Rab11 在初级纤毛生成中的配位。美国国家科学院院刊，2010 年;107:6346–6351.PMID：20308558

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

29.Wu Z， Pang N， Zhang Y， Chen H， Peng Y. CEP290 对于睫状过渡区组装的启动至关重要。PLoS Biol. 2020;18：e3001034。PMID：33370260

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

30.Lapart J-A、Gottardo M、Cortier E、Duteyrat J-L、Augière C. Dzip1 和 Fam92 在果蝇中形成具有细胞类型特异性作用的纤毛过渡区复合物。生命。2019;8：e49307。PMID：31821146

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

31.Zhang B， Zhang T， Wang G， Wang G， Chi W. GSK3beta-Dzip1-Rab8级联调节有丝分裂后的纤毛生成。PLoS 生物学 2015;13：e1002129。PMID：25860027

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

32.Coppieters F， Lefever S， Leroy BP， De Baere E. CEP290，一个具有多面的基因：CEP290碱基的突变概述和呈现。嗡嗡声。 2010;31:1097–1108.PMID：20690115

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

33.Drivas TG， Holzbaur EL， Bennett J. CEP290 微管/膜结合域的破坏导致视网膜变性。J 临床投资。2013;123:4525–4539.PMID：24051377

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

34.Jana SC， Mendonca S， Machado P， Werner S， Rocha J. 过渡区和中心粒蛋白的差异调控有助于纤毛碱基多样性。Nat Cell Biol. 2018;20:928–941.PMID：30013109

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

35.斯台普斯 CJ、迈尔斯 KN、贝弗里奇 RD、帕蒂尔 AA、李 AJ。中心粒卫星蛋白 Cep131 对基因组稳定性很重要。细胞科学杂志 2012;125:4770–4779.PMID：22797915

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

36.Kim DH， Ahn JS， Han HJ， Kim HM， Hwang J. Cep131 过表达通过调节 Plk4 稳定性促进中心体扩增和结肠癌进展。细胞死亡疾病 2019;10：570.PMID：31358734

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

37.Hall EA， Keighren M， Ford MJ， Davey T， Jarman AP. 哺乳动物 Azi1/Cep131 的急性与慢性缺失导致不同的睫状表型。PLoS 基因。2013;9：e1003928。PMID：24415959

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

38.Li X， Song N， Liu L， Liu X， Ding X. USP9X 调节中心体复制并促进乳腺癌发生。纳特公社。2017;8:14866.PMID：28361952

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

39.Wang J， Yang X， Han S， Zhang L. CEP131 敲低通过抑制非小细胞肺癌中的 ERK 和 AKT 信号通路来抑制细胞增殖。Oncol Lett. 2020 年;19:3145–3152.PMID：32218865

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

40.威尔金森 CJ、卡尔 M、哈里斯 WA。Cep70 和 Cep131 有助于斑马鱼胚胎的纤毛发生。BMC 细胞生物学 2009;10：17。PMID：19254375

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

41.Chamling X、Seo S、Searby CC、Kim G、Slusarski DC。中心粒卫星蛋白 AZI1 与 BBS4 相互作用并调节 BBSome 的纤毛运输。PLoS 基因。2014;10：e1004083。PMID：24550735

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

42.马 L， Jarman AP. Dilatory 是一种与 AZI1 （CEP131） 相关的果蝇蛋白，位于睫状基部，是纤毛形成所必需的。细胞科学杂志 2011;124:2622–2630.PMID：21750193

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

43.Vieillard J， Paschaki M， Duteyrat JL， Augiere C， Cortier E. 过渡区组装及其对果蝇雄性生殖细胞轴丝形成的贡献。细胞生物学杂志 2016;214:875–889.PMID：27646273

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

44.Wang WJ， Tay HG， Soni R， Perumal GS， Goll MG. CEP162 是一种轴丝识别蛋白，促进纤毛基部的纤毛过渡区组装。Nat Cell Biol. 2013 年;15:591–601.PMID：23644468

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

45.Bauerly E， Akiyama T， Staber C， Yi K， Gibson MC. 果蝇精子发生过程中纤毛相关基因对线粒体动力学的影响.开发生物学 2022;482:17–27.PMID：34822845

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

46.Sch?fer T， Pütz M， Lienkamp S， Ganner A， Bergbreiter A. NPHP5 和 NPHP6 基因产物之间的遗传和物理相互作用。嗡2008;17:3655–3662.PMID：18723859

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

47.布雷斯洛 DK、豪根道 S、Kopp AR、摩根斯 DW、Vu BK。基于 CRISPR 的 Hedgehog 信号转导筛选提供了对纤毛功能和纤毛病的见解。纳特·热内特。2018;50:460–471.PMID：29459677

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

48.Li FQ， Chen X， Fisher C， Siller SS， Zelikman K. 含有 BAR 结构域的 FAM92 蛋白与 Chibby1 相互作用以促进纤毛生成。Mol Cell Biol. 2016 年;36:2668–2680.PMID：27528616

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

49.Hynes AM、Giles RH、Srivastava S、Eley L、Whitehead J. Murine Joubert 综合征揭示了刺猬信号缺陷是肾病的潜在治疗靶点。美国国家科学院院刊 2014;111:9893–9898.PMID：24946806

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

50.Minella AL， Narfstr?m Wiechel K， Petersen-Jones SM. CEP290 突变猫的选择性剪接导致比 LCA（CEP290） 患者更温和的表型。兽医眼科。2023;26:4–11.PMID：36495011

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

51.Mytlis A， Kumar V， Qiu T， Deis R， Hart N. 受精卵纤毛控制减数分裂染色体花束和生殖细胞形态发生。科学。2022;376：EABH3104。PMID：35549308

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

52.Nuzhat N， Van Schil K， Liakopoulos S， Bauwens M， Rey AD. CEP162 缺陷导致人类视网膜变性，并揭示了纤毛发生和神经发生中的双重作用。J 临床投资。2023;133：e161156。PMID：36862503

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

53.Schrauwen I， Giese AP， Aziz A， Lafont DT， Chakchouk I. FAM92A 是人类非综合征性轴后多指症的基础，也是小鼠肢体和手指骨骼表型异常的基础。J Bone Miner Res. 2019 年;34:375–386.PMID：30395363

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索

54.Vieillard J， Duteyrat JL， Cortier E， Durand B. 果蝇纤毛成像。方法 Cell Biol. 2015;127:279–302.PMID：25837397

查看文章PubMed/NCBI的Google 学术搜索