沈阳医学论文发表-促进造血干细胞休眠
莉莉娅·伊布涅耶娃，苏米特·帕尔·辛格，阿努帕姆·辛哈，塞玛·埃利夫·埃斯基，丽贝卡·韦纳，路易丝·鲁普，伊琳娜·科夫顿，胡安·阿尔贝托·佩雷斯-瓦伦西亚，亚历山大·格博莱特，苏珊娜·莱因哈特，曼贾·沃布斯，马尔特·冯·博宁，海梅·桑乔
抽象
深度静止的所谓休眠造血干细胞 （dHSC） 亚群位于造血层次结构的顶部，并作为 HSC 的储备库。休眠状态可保护 HSC 池在一生中不耗尽;然而，过度休眠可能会妨碍对血液学应激的有效反应。尽管 dHSC 具有重要意义，但维持其休眠的机制仍然难以捉摸。在这里，我们将 CD38 鉴定为一种新型且广泛适用的表面标记物，用于富集小鼠 dHSC。我们证明环磷酸腺苷核糖 （cADPR） 是 CD38 环化酶活性的产物，通过增加 Ca 的释放来调节转录因子 c-Fos 的表达2+来自内质网 （ER）。随后，我们发现c-Fos诱导细胞周期抑制剂p57的表达基普2以驱动 HSC 休眠。此外，我们发现邻近 CD38 阳性细胞的 CD38 胞外酶活性可以促进人 HSC 静止。Together, CD38/cADPR/Ca2+/c-Fos/p57基普2轴保持 HSC 休眠状态。该途径的药理学操作可以提供新的策略来提高干细胞移植的成功率和损伤或疾病后的血液再生。
数字
图7图8图9图1图2图3图4图5图6图7图8图9图1图2图3
引文： Ibneeva L， Singh SP， Sinha A， Eski SE， Wehner R， Rupp L， et al. （2024） CD38 促进造血干细胞休眠。PLoS 生物学 22（2）： 编号：E3002517。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517
学术编辑： Connie J. Eaves，加拿大卑诗省癌症机构
收到： 2023年7月11日;接受： 2024年1月24日;发表： 2月 29， 2024
版权所有： ? 2024 Ibneeva et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 大宗和单细胞RNA测序数据分别在GEO的登录号GSE196760和GSE196759下提供。与数字相关的所有数据都可以在 S1 数据中找到。
资金： 这项工作得到了 Deutsche Forschungsgemeinschaft （GR 4857/2-1） 对 T.G. 的资助，Deutsche Forschungsgemeinschaft （WI3291/5-1、12-1 和 13-1） 对 B.W. T.C. 的支持得到了 Deutsche Forschungsgemeinschaft（TRR332，项目 B4）的支持。S.P.S. 得到了国家科学研究基金会 （40005588 – MISU-PROL） 和 Jaumotte-Demoulin 基金会的支持，S.E.E. 得到了国家科学研究基金会 （40006730 – ASP） 的博士奖学金的支持。T.G.得到了Mildred-Scheel-Nachwuchszentrum奖学金的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析以及手稿的准备中没有作用。
利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
缩写： ADPR， 二磷酸腺苷核糖;cADPR， 环磷酸腺苷核糖;CMP， 普通髓系祖细胞;断血干， 休眠造血干细胞;DRM的 内质网;牛血清， 胎牛血清;GMP， 粒细胞-单核细胞祖细胞;GSEA， 基因集富集分析;hHSC， 人造血干细胞;HSC， 造血干细胞;LT-HSC， 长期造血干细胞;欧洲环保部， 巨核细胞-红细胞祖细胞;跨国公司， 单核细胞;MMP， 线粒体膜电位;NAD， 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸;铅 外周血;PBS， 磷酸盐缓冲盐水;隧道掘进机， 总骨髓;TGF-β1， 转化生长因子β1;TNFα， 肿瘤坏死因子α
介绍
造血干细胞 （HSC） 负责一生中所有血细胞的产生。大多数成年造血干细胞维持在静止状态;此外，大量研究表明，20%-30%的小鼠造血干细胞处于深度静止状态，因此被称为“休眠”造血干细胞（dHSC）[1]。dHSC的特征是代谢缓慢，核糖体生物发生减少和DNA复制[1]。使dHSC保持静止状态的机制不仅可以保护它们免受外部压力的影响[2,3]，还可以防止体细胞突变的积累，以防止其衰竭或恶性转化[1,4–6]。尽管dHSC处于休眠状态，但在移植试验中具有最大的长期再繁殖能力[1,7,8]。它们在稳态条件下不产生细胞，仅在干扰素、脂多糖和骨髓消融等严重应激信号时被激活[1,9]。因此，dHSCs在整个生命中都是干细胞的储备库。
然而，尽管休眠的 HSC 很重要，但由于缺乏已知的表面标记物来识别和分离它们，因此它们的详细表征一直具有挑战性。因此，对保存 dHSC 静止状态的过程知之甚少。最近，Cabezas-Wallscheid及其同事建立了Gprc5c（视黄酸诱导基因）报告小鼠品系，并证明视黄酸信号转导和透明质酸可以调节HSC休眠[8,10]。Fukushima及其同事使用另一种p27（Cdk抑制剂）报告小鼠品系揭示了HSC进入细胞周期是由Cdk4/6和高胞质Ca控制的2+浓度与HSC静止相关[11]。然而，为什么 dHSC 含有高胞质钙2+浓度，以及如何 Ca2+调节HSC休眠仍不清楚。在本研究中，我们将 CD38 确定为分离小鼠 dHSC 的表面标志物，并描述了由控制 HSC 休眠的 CD38 的体外酶活性驱动的以前未知的信号转导轴。在机制上，我们发现环磷酸二磷酸腺苷核糖 （cADPR） 是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NAD） 被 CD38 转化的产物，调节转录因子 c-Fos 的表达，从而驱动 p57 中的静止基普2-依赖方式。此外，我们发现邻近 CD38 阳性细胞的 CD38 体外酶活性促进了 CD38 阴性的人 HSC 静止。
结果
造血干细胞的伪时间分析揭示了增殖和休眠之间的过渡
为了捕捉静止和增殖之间的过渡，对来自年轻小鼠的 HSC 进行单细胞 RNA 测序，并在质量控制后，使用 1,613 个个体 HSC 的转录组图谱进行下游分析（图 1A、S1A 和 S2A）。为了识别活跃的循环细胞，我们使用Seurat[12]计算了单个HSC的细胞周期和休眠评分，该评分基于细胞周期和休眠基因的表达水平[13]（S1表）。我们观察到 S（图 1B）和 G2/M 期（图 1C）中的细胞聚集在一起，并且正如预期的那样，大多数 HSC 是静止的（图 1D）。此外，图1A与图1B-1D的比较表明，伪时间排序与从增殖到休眠的转变是一致的。接下来，我们应用伪时间排序（图1A）来鉴定与细胞周期动力学相关的基因表达模式（图1E），并根据与伪时间相关的峰值表达（图1E和S2表）鉴定了3个主要基因表达簇，即1—早期基因、2—中间基因和3—晚期基因。每个簇的功能注释显示，中间和晚期基因通常与细胞周期激活途径相关（图1F和S3表）。相比之下，早期基因包括具有高移植潜力的众所周知的造血干细胞标志物，即Vwf [14]、Procr [15]、Fgd5 [16,17]和细胞周期抑制剂Cdkn1c [18,19]（图1G、S1B和S1C）).值得注意的是，该簇的特征在于与肿瘤坏死因子α（TNFα）信号转导、干扰素γ和α反应、Stat3和Stat5以及转化生长因子β1（TGF-β1）信号转导相关的通路相关基因，TGF-β1是众所周知的HCS静止调节因子[20]（图1F和S3表）。接下来，我们尝试在与 HSC 休眠相关的晚期基因组（S2 表）中分离细胞表面标记物，并将 Cd38 确定为 dHSC 的推定标记物，因为它在休眠评分高的细胞中表达更高，并且与众所周知的长期 HSC （LT-HSC） 标记物的表达相对应（图 1G 和 1H）。
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图 1. 造血干细胞的单细胞转录组分析。
（A）. UMAP 表示，描绘了单个 HSC （LSK、CD48、CD150） 的转录谱。（B） 沿伪时间的 S 期评分。（C） G2/M 期沿伪时间的评分。（D） 沿伪时间的休眠评分。对于面板 A-D，每个点代表一个单元格。（E） 聚类热图，显示基因在伪时间上的表达。每列代表一个细胞，每行代表一个基因。（F） 显示了每个簇中前 5 个最显着富集的途径。（G） 选定基因沿伪时间的表达。（H） 显示 Cd38 表达的 UMAP 表示。每个点代表一个单元格。此图的基础数据可在 S1–S3 表中找到。HSC，造血干细胞;UMAP，均匀流形近似投影。-+
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.g001
CD38 LT-HSCs具有最高的繁殖能力+
我们分析了 CD38 在造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 上的表面表达，发现 CD38 由 LT-HSC 部分表达（Lin?c-Kit Sca-1 （LSK） CD48、CD150、CD34、CD201;36.6 ± 2.5%）、HSC（LSK CD48 CD150;12.4 ± 0.7%）和多能祖细胞 2（MPP2、LSK CD48 CD150;15.3 ± 1.8%），但不包括短期 HSC（ST-HSC、LSK CD48 CD150）或多能祖细胞 3/4（MPP3/4、LSK CD48 CD150）（图 2A-2B 和 S2A-S2B）。我们证明，在没有 CD38 敲除小鼠 （CD38KO） 的情况下，总骨髓 （TBM） 细胞可用于定义 CD38 部分（S2C 图），为轻松识别 CD38 细胞提供了内部阳性对照的可能性。接下来，我们根据CD38表面表达将HSC细分为CD38和CD38干细胞，并比较了定义最有效LT-HSCs的已知表面标志物的表达[1,21–25]，结果发现，与CD38 HSC相比，CD34、CD229和c-Kit的表面表达较低，而CD201、Sca-1和CD150的表面表达在CD38 HSC中较高（S2D图).与这些数据一致，与HSC的其他部分相比，CD38 HSCs中LT-HSCs的频率更高（图2C）。综上所述，这些数据表明CD38 HSC表现出最有效和最静止的LT-HSC的表型[1,21–25]。++-+-+-+++--+-+++--+++
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图 2. CD38 定义了具有最高长期再种群能力的 LT-HSC。+
（A） CD38KO（染色阴性对照）与wt小鼠中HSCs（LSK，CD48，CD150）和LT-HSC（LSK，CD48，CD150，CD34，CD201）上CD38表达的流式细胞术分析。（B） 各种 HSPC 群体中 CD38 细胞的频率，n = 7。使用 Brown-Forsythe 和 Welch 方差分析进行多组比较，然后使用 Dunnett 的 T3 多重比较检验。p < 0.001。（C） CD38 和 CD38 HSC 中不同 HSC 亚群的频率，n = 7。（D） CD38 和 CD38 LT-HSC（LSK、CD48、CD150、CD201、CD34）移植的设置，2 个独立实验，1Tx—n = 8,2Tx—n = 6 vs. 7。用 BioRender.com 创建。（E） 移植后供体来源的白细胞中的嵌合体。（F） 移植后供体来源的 PMN 中的嵌合体，PMN：Gr1 CD11b。 （G） 移植后 HSC 群体中的嵌合体。（H） 移植后 18-20 周供体来源的 PB 细胞中 T、B 和髓样细胞的频率。（I） CD38 或 CD38 LT-HSC 初次移植后 20 周供体来源的 HSC 中 CD38 的表面表达（将每组相同数量的细胞混合在一起并使用相同的抗体预混液在单个试管中染色，显示 1 个代表性实验，参见 S3C 图中第二个实验的数据）， 使用相同数量的 CD38 敲除 HSC 作为 CD38 染色的阴性对照。C， E-H—p值采用Mann-Whitney U检验计算，*p < 0.05，**p < 0.01。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。LT-HSC，长期造血干细胞;PB， 外周血;PMN，多形核中性粒细胞。-+-+-++-+-+-++-+++-
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.g002
只有一小部分 LT-HSC （（LSK） CD48， CD150， CD34， CD201） 表达 CD38。为了评估 CD38 表达是否与 LT-HSC 内优越的再繁殖能力相关，我们在竞争性环境中将 CD38 和 CD38 LT-HSC 移植到致命照射小鼠中（图 2D 和 S3A）。虽然 CD38 LT-HSC 在移植后 4 周产生更多短寿命的中性粒细胞，但 CD38 LT-HSC 在一期移植后 20 周和二次移植后更有效地重新填充 HSC 区室和外周血 （PB）（图 2E-2G）。此外，在 CD38 和 CD38 LT-HSC 的重建模式中未观察到谱系偏倚（图 2H 和 S3B）。这些结果表明，与 CD38 LT-HSC 相比，CD38 细胞具有优越的再繁殖和自我更新能力。-+-++--++-+-
为了了解 CD38 和 CD38 LT-HSC 之间的层次结构，我们比较了供体 HSC 后代中 CD38 的表达，发现虽然 CD38 LT-HSC 同时产生 CD38 和 CD38 HSC，但 CD38 细胞不能产生 CD38 HSC（图 2I、S3C 和 S3D）。综上所述，这些结果表明CD38 LT-HSC位于造血细胞层次结构的顶部。我们建议 CD38 表面标记物可用于 LSK、CD48、CD150、CD34、CD201 的成熟免疫表型之上，以定义最有效的 LT-HSC。+-+-+-++-+-+
高水平的表面 CD38 表达定义了富含 dHSC 的 LT-HSC 群体
我们进行了细胞周期分析、溴脱氧尿苷 （BrdU） 掺入和长期标记保留试验，以研究 CD38 表达是否与干细胞的休眠相关（图 3A-3E）。虽然 LT-HSC 标记物已经富集了更多的静止细胞，但 CD38 LT-HSC 在 G0 期含有比 CD38 LT-HSC 更高的细胞频率（图 3A）。因此，与CD38细胞相比，CD38 LT-HSCs在追逐130天后掺入BrdU的速度明显更慢，并保留了更高水平的H2B-GFP（图3B-3E），这表明CD38 LT-HSCs比CD38细胞更深地处于静止状态[26]。此外，CD38 LT-HSCs的线粒体膜电位（MMP）低于CD38干细胞，尽管线粒体质量没有差异（S3E和S3F图），这与先前的发现一致，即HSC静止与较低的代谢状态相关[8,27]。+-+-+-+-
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图 3. CD38 调节 LT-HSC 静止。
（A） CD38 和 CD38 LT-HSC 在细胞周期的 G0、G1 和 SG2M 期的频率，n = 9。（B） BrdU掺入测定。BrdU 后 14 天 CD38 和 CD38 LT-HSC 群体中 BrdU 细胞的频率，n = 5。（C） 建立长期标记保留测定法。（D） LT-HSC中H2B-GFP细胞的代表性图。 （E）CD38和CD38 LT-HSC中GFP细胞的频率，n = 4。（F） pIC 注射后 18 小时和 48 小时对 LT-HSC 进行细胞周期分析（n = 6–9,3 个独立实验）。（G） 5-FU 注射后 LT-HSCs 4d 和 8d 的细胞周期分析（n = 6–9,3 个独立实验）。对于面板 A、B、E，使用 Mann-Whitney U 检验。使用 Brown-Forsythe 和 Welch 方差分析进行多组比较，然后使用 Dunnett 的 T3 多重比较检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。图组 B 和 C 中的图形方案是使用 BioRender.com 创建的。LT-HSC，长期造血干细胞。-++-+++-+
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.g003
为了研究CD38 LT-HSCs响应造血应激的细胞周期激活，我们用polyI治疗小鼠：模拟病毒感染的polyC（pIC）[8]和清髓剂5-氟尿嘧啶（5-FU）。CD38 LT-HSC响应pIC迅速进入细胞周期，而CD38 LT-HSCs在pIC注射后仅48小时才开始循环（图3F）。在 5-FU 化疗模型中，CD38 和 CD38 LT-HSC 在 5-FU 注射后 4 天均活跃增殖（图 3G）。尽管 CD38 LT-HSC 在 5-FU 注射后 8 天趋于恢复静止状态，但 CD38 干细胞仍保持循环。因此，CD38 LT-HSCs需要更多的时间才能响应血液学应激进入细胞周期，同时比CD38细胞更快地恢复到静止状态。综上所述，我们得出结论，CD38可用于dHSC的富集[1,8]。+-+-++-+-
CD38酶活性调节HSC静止
为了了解CD38是否直接参与dHSCs的维持，我们比较了野生型（wt）和CD38KO LT-HSCs的长期再繁殖和自我更新能力。我们没有发现稳态PB或骨髓的组成有任何差异（S4A-S4F图）。尽管在wt小鼠中只有约40%的LT-HSC表达CD38，但我们发现CD38KO LT-HSC的长期再繁殖和自我更新能力低于wt细胞（图4A-4E）。与这一发现一致，与wt TBM相比，CD38KO TBM细胞的长期再繁殖能力降低（图4F-4J）。虽然对 LT-HSC 群体的分析未发现 wt 和 CD38KO 之间的任何细胞周期差异（图 4K），但 CD38 LT-HSC 比 CD38KO 对应物更静止（图 4L）。为了研究 BM 生态位可能对 LT-HSC 细胞周期的调控，我们将 CD38KO 细胞移植到 wt 和 CD38KO 受体中。然而，来自BM微环境的CD38不影响CD38KO HSCs的细胞周期（S4G图）。综上所述，这些结果表明 CD38 支持 LT-HSC 的功能。+
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图 4. CD38KO小鼠LT-HSCs的再繁殖能力降低。
（A）从wt和CD38KO小鼠移植LT-HSCs的实验装置，2个独立实验，1个代表性实验。（B） 初次移植后受者 PB 中供体来源的 WBC 和 PMN （Gr1 CD11b） 嵌合体 （n = 5–6）。（C） 二次移植后受者 PB 中供体来源的 WBC 和 PMN 的嵌合体 （n = 8）。（D） 移植后 16 周骨髓中供体来源的 HSC 嵌合体。（E） 移植后 16 周供体来源的白细胞中髓系、B 和 T 细胞的频率。（F） wt 和 CD38KO 小鼠 （1Tx—n = 7， 2Tx—n = 5–6） 移植 TBM 的实验装置。（G） 供体来源的 WBC 的嵌合体和 （H） PMN （Gr1 CD11b） 在原次和二次移植后受者 PB 中的嵌合体。（I） 一次和二次移植后骨髓中供体来源的造血干细胞嵌合体。（J） 移植后 21-22 周供体来源的白细胞中髓样、B 和 T 细胞的频率。（K） LT-HSCs在细胞周期的G0、G1和SG2M期的频率（wt n = 5，CD38KO n = 8）。（L） 在细胞周期的 G0、G1 和 SG2M 期 （wt n = 5， CD38KO n = 7） 中来自 wt 的 CD38 和 CD38 LT-HSC 以及来自 CD38KO 的 LT-HSC 的频率。使用 Mann-Whitney U 检验计算 P 值，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。面板 A 和 F 中的图形方案是使用 BioRender.com 创建的。LT-HSC，长期造血干细胞;PB， 外周血;TBM，全骨髓。+++++-
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.g004
CD38是一种多方面的NAD分解代谢胞外酶，可将NAD及其前体（烟酰胺单核苷酸-NMN和烟酰胺核苷-NR）代谢为二磷酸腺苷核糖（ADPR）和环-ADPR（cADPR）[28];78c 是一种特异性 CD38 抑制剂，可抑制 CD38 的水解酶和 ADP-核糖基环化酶活性 [29]。为了研究CD38的酶活性是否调节LT-HSCs的静止状态，我们进行了单细胞示踪实验，其中跟踪了LT-HSC在78c存在下的分裂（图5A-5C和S5A-S5C）。与我们之前的数据（图3A-3E）一致，CD38细胞比CD38 LT-HSCs更静止，而78c抑制CD38加速了CD38的第一次分裂，但不加速CD38 LT-HSCs或CD38KO小鼠的LT-HSCs（图5A-5C和S5A-S5C）。根据这一发现，用78c处理激活了体外CD38 HSC的细胞周期入口（S5D图），并延迟了体内5-FU处理后CD38 LT-HSC静止的恢复（图5D）。总之，我们的数据支持CD38酶活性有助于维持LT-HSC静止的观点。+-+-++
人造血干细胞 （hHSC） 定义为 CD38瞧/-细胞[30]。此外，我们发现 CD38 的低表面表达与 Lin CD34 CD38 中的低细胞内 CD38 水平相关-+瞧/-hHSC（S6A和S6B图）。正如预期的那样，抑制CD38酶活性不影响CD38瞧/-hHSC细胞周期活化（S8C-S8E图）。我们假设邻近 CD38 阳性细胞的 CD38 体外酶活性可能调节 hHSC 静止。我们培养了hHSCs（Lin，CD34，CD38-+瞧/-）与CD38肿瘤细胞系或CD38祖细胞（图5E和S6E）一起发现，78c抑制剂（S6D图）抑制CD38酶活性导致hHSCs的细胞周期进入（图5E和S6E）。此外，我们分析了健康的人骨髓，并表明 Ki67 静态 hHSC 比 Ki67 活性 hHSC 更靠近 CD38 细胞（图 5F）。因此，我们得出结论，CD38 可以以旁分泌方式调节 hHSC 静止状态。++-++
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图 5. CD38 酶活性调节 LT-HSC 从静止状态退出。
（A） 将单个 CD38 和 CD38 LT-HSC 分选并在含有或不含 CD38 抑制剂 78c 的液体培养基中培养。（B） 给出了在孵育期间完成第一次分裂的 LT-HSC 的频率（3 个独立实验）。（C） 图 B 中数据的 AUC 定量。 （D） 5-FU 和 78c 注射后 CD38 和 CD38LT-HSC 8d 的细胞周期分析。（E） hHSCs（Lin CD34、CD38-++--+瞧/-） 来自健康成人供体和 MOLM-13 在 CD38 抑制剂 78c 存在下 24 小时。分析了 hHSC 的细胞周期 （n = 7）。（F） CD34（品红色）、CD38（青色）、Ki67（绿色）和DAPI（灰色）健康人骨髓多重免疫荧光染色的代表性图片。比例尺表示 10 μm。分析了 Ki67 CD34 CD38 和 Ki67 CD34 CD38 到最近的 CD38 细胞之间的距离 （n = 98 Ki67， 100 Ki67）。白色箭头表示 CD34 CD38 细胞。对于图 C 和 E，使用配对 t 检验。对于面板 D，使用 Mann-Whitney U 检验。对于面板 F，使用非配对 t 检验计算 P 值。*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。面板 A 和 E 中的图形方案是使用 BioRender.com 创建的。AUC，曲线下面积;hHSC，人造血干细胞;LT-HSC，长期造血干细胞。-+-++-+-++-
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.g005
cADPR 支持高细胞质 [Ca2+] CD38 HSC 中的水平+
CD38 酶活性的两种产物，即 ADPR 和 cADPR，都会增加胞质钙2+浓度 （[Ca2+]c）在几种细胞类型[31–33]（图6A）和高细胞质Ca中2+已被证明支持造血干细胞的静止状态[11]。我们一致地表明 [Ca2+]c当使用 Ca 测量时，CD38 LT-HSC 中的确实高于 CD38 或 CD38KO 细胞+-2+-指示染料，Fluo-8AM和Indo-1（图6B和6C）。此外，在用 8-溴-ADPR（一种阻断 ADPR 依赖性 Ca 的细胞渗透性拮抗剂）处理细胞时2+释放）也没有影响[Ca2+]c或 HSC 的细胞周期活性（S7A 和 S7B 图），阻断 cADPR 依赖性 Ca2+8-溴-cADPR拮抗剂从内质网（ER）释放减少[Ca2+]c在 HSC 中（图 6D）并促进其细胞周期进入（图 6E）。此外，8-溴-cADPR拮抗剂在与CD38祖细胞共培养中激活了hHSC细胞周期的入口（S6E图）。确认 CD38 真正调节 [Ca+2+]c在 HSC 中，我们使用了抑制 Ca 的 thapsigargin （TG）2+从细胞质转运到内质网。正如预期的那样（图6F），[Ca2+]c与 CD38 细胞相比，CD38 HSC 的增加速度显着更快（图 6G 和 6H），并且这种差异通过用 CD38 抑制剂 78c 处理（图 6I）消除，表明 Ca+-2+CD38 HSC 中 ER 的释放由 CD38 介导。有趣的是，我们没有观察到 CD38 和 CD38KO HSC 之间的钙积累时间存在显着差异（S5E 图）。这可能是由于CD38KO小鼠在生物体水平上的代偿机制。先前的研究报道，CD38KO小鼠免受高脂肪饮食诱导的葡萄糖不耐受，并且在稳态条件下增加能量消耗，这表明wt和CD38KO小鼠之间的代谢存在很大差异[34]。总之，这些数据表明 CD38 依赖性 cADPR 而不是 ADPR 的产生有助于高 [Ca++2+]cCD38 HSCs中的浓度，保持其静止状态。+
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图 6. CD38 酶活性调节细胞质 [Ca2+].
（A） CD38酶活性示意图。（B） 游离细胞质钙2+（[钙2+]c） 使用 Fluo-8AM 染料 n = 7 和比例 Indo-1 染料 n = 3（右）分析的 CD38 和 CD38 LT-HSC 中的相对浓度。（C） 游离细胞质钙+-2+（[钙2+]c） 使用 Fluo-8AM 染料分析的 CD38KO 中 CD38 wt 和 LT-HSC 的相对浓度，n = 4。（D） 5 × 10+4来自 Ki67 的 LSKRFP询价将报告小鼠分选并在cADPR拮抗剂（Br-cADPR）存在下培养24小时，进行2个独立实验。相对 [Ca2+]c用Br-cADPR处理24小时的HSCs浓度，n = 3。两个独立实验和 （E） 在 Br-cADPR 处理后 24 小时循环 Ki67-RFP HSC 的频率，n = 3,2 个独立实验。（F） 建议的[Ca]+2+]c调制。大体时间I：在稳态条件下，Ca2+被释放到细胞质中并泵回内质网。 CD38 HSC释放更多的钙+2+来自内质网的 CD38 细胞由于 cADPR，CD38 酶活性的产物。大体时间二：阻断 Ca-2+-ATPase pumping Ca2+进入 ER 的 TG 导致 [Ca2+]cCD38 HSCs的浓度比CD38对应物高。大体时间 III：过度 [Ca+-2+]c从细胞质中去除。（七）[钙2+]cCD38 和 CD38 HSC 的动力学。 （H） 峰值时间 [Ca-+2+]c在添加 TG 后的 CD38 和 CD38 HSC 中，n = 3。（一）峰值时间[Ca-+2+]c在CD38抑制剂存在下加入TG后的CD38和CD38 HSC中，n = 3。使用配对 t 检验计算 P 值;对于面板 E，使用未配对的 t 检验。*p < 0.05，**p < 0.01。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。面板 A 和 F 中的图形方案是使用 BioRender.com 创建的。cADPR，环磷酸腺苷核糖;ER，内质网;LT-HSC，长期造血干细胞。-+
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.g006
c-Fos 调节 CD38 LT-HSC 的静止状态+
阐明 CD38/cADPR/Ca 如何2+轴调节 HSC 休眠，我们对 CD38 和 CD38 LT-HSC（LSK、CD48、CD150、CD34、CD201）进行了批量转录组 RNA 测序，发现 CD38 LT-HSC 中有 205 个基因显着下调，225 个基因上调（图 7A 和 S4 表）。基因集富集分析 （GSEA） 显示，与 CD38 细胞相比，CD38 LT-HSC 中与造血干细胞分化程序、线粒体呼吸链复合物组装和 NADH 脱氢酶复合物相关的基因显着下调。同样，控制钙离子反应、细胞外基质相互作用和 TGF-β1 反应的基因集在 CD38 LT-HSC 中上调（图 7B 和 7C）。HSC相关基因，如Hoxb9、H19、VwF、Clu和Sele[14,35–38]，以及与HSC休眠相关的基因，即Gprc5c、Meis2[8]和Neo1[39]，在CD38 LT-HSC中上调（图7D）。我们没有发现 Cdk2、Cdk4、Cdk6 和 CyclinD1 表达的显着差异，但 CD38 LT-HSC 的细胞周期抑制剂 Cdkn1a 和 Cdkn1c 的表达水平高于 CD38 LT-HSC（图 7E）。有趣的是，转录因子Fos的表达以前与细胞周期激活相关[40]，是CD38 LT-HSC中上调最显著的基因之一。与 CD38 对应物相比，AP-1 复合物响应基因在 CD38 LT-HSC 中富集，这一事实进一步证实了这一观察结果（图 7F）。此外，CD38 LT-HSCs显示出比CD38和CD38KO LT-HSCs更高水平的转录活性磷酸化c-Fos（苏氨酸232，p-c-Fos）[41]（图8A和S8A）。+--+-+++-+++-++-+-
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图 7. c-Fos 在 CD38 LT-HSC 中上调。+
（A） 与 CD38 细胞相比，CD38 LT-HSC 中差异表达基因的火山图。（B） 与 CD38 干细胞相比，CD38 LT-HSC 中下调基因的 GSEA。（C） 与 CD38 细胞相比，CD38 LT-HSC 中上调基因的 GSEA。（D） 描述在 CD38 和 CD38 LT-HSC 中表达的 dHSC 和细胞周期相关基因的热图。 （E） CD38 与 CD38 LT-HSC 中 Cdkn1a 和 Cdkn1c 的标准化表达。 使用配对 t 检验计算 P 值，*p < 0.05。（F） 与 CD38 细胞相比，CD38 LT-HSC 中 AP-1 通路相关基因的 GSEA。此图背后的数据可以在 S4 表和 S1 数据中找到。GSEA，基因集富集分析;LT-HSC，长期造血干细胞。+-+-+-+-+-+-
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相应地，单细胞跟踪分析显示，使用特异性抑制剂T-5224[42]阻断c-Fos与DNA的相互作用可诱导CD38 LT-HSC的分裂，但不能诱导CD38细胞的分裂（图8B和8C）。此外，对小鼠施用 T-5224 导致 CD38 HSC 部分失去静止，但在 CD38 对应物中没有（图 8D）。这些数据表明，c-Fos 转录活性是 CD38 介导的 HSC 静止所必需的。由于抑制 c-Fos 的转录活性会影响 CD38 LT-HSC 的细胞周期入口，但不影响 CD38 细胞的周期入口，我们假设 CD38 通过 CD38/cADPR/Ca 调节 c-Fos 表达+-+-+-2+ (图8E）。事实上，用 CD38 抑制剂或 cADPR 拮抗剂 （Br-cADPR） 治疗 HSC 可降低活性 p-c-Fos 的水平（图 8E-8G 和 S8B），支持 CD38/cADPR/Ca 的观点2+轴调节 CD38 LT-HSC 中的 c-Fos 水平。+
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图 8. c-Fos 通过 p57 维持 CD38 LT-HSC 静止状态+基普2.
（A） CD38 和 CD38 HSC 中细胞内 p-c-Fos 的 MFI，使用配对 t 检验计算 P 值;*p < 0.05。（B） 将单个 CD38 和 CD38 LT-HSC 分选并在含有或不含 c-Fos 抑制剂 T-5224 的液体培养基中培养。给出了在孵育过程中完成第一次分裂的LT-HSCs的频率（3个独立实验）。（C） 对面板 B 中数据的 AUC 进行量化，使用配对 t 检验计算 P 值。（D） 注射 T-5224 后 24 小时 HSC 的细胞周期分析（使用抗 Ki67 和 DAPI 染色），n = 8 vs. 9,2 个独立实验。使用 Mann-Whitney U 检验计算 P 值。（E） F 和 G 的实验设置。 （F） 16 小时后 CD38 LT-HSC 的 p-c-Fos 免疫荧光，体外有或没有 78c（n = 247—veh，223 - 78c，2 个独立实验）。（G） 体外有或无 Br-cADPR 24 小时后 HSC 的 p-c-Fos 免疫荧光（n = 164—veh，219—Br-cADPR，2 个独立实验）。（H） 总 p57 的代表性最大投影共聚焦图像+--++基普2以及单个 CD38 和 CD38 HSC 中的 DAPI（左）。p57 MFI 的定量-+基普2免疫荧光如右图所示（n = 181—CD38,122—CD38,2个独立实验）。（I） 总 p57 的代表性最大投影共聚焦图像-+基普2和个体CD38 LT-HSC中的DAPI在体外使用或不使用Br-cADPR（左）。p57 MFI 的定量+基普2免疫荧光如右图所示（n = 696—veh，1211—Br-cADPR）。（J） 总p57的代表性最大投影共聚焦图像基普2和 24 小时后个体 HSC 中的 DAPI，体外有或没有 c-Fos 抑制剂（上图）。p57 MFI 的定量基普2显示免疫荧光（n = 72- veh，n = 61 —T-5224,2个独立实验）。（K） 总 p57 的代表性最大投影共聚焦图像基普2和 CD38 wt 与 CD38KO LT-HSC 中的 DAPI 在体外使用 24 小时后（左图）。p57 MFI 的定量+基普2免疫荧光如右图所示（WT VEH/WT 78C/KO VEH/KO 78C，分别为2个独立实验，N = 78/68/72/97）。比例尺为5μm。E–K—使用非配对 t 检验计算 P 值。*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。面板 B 和 D 中的图形方案是使用 BioRender.com 创建的。AUC，曲线下面积;LT-HSC，长期造血干细胞。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.g008
CD38 对照品 p57基普2通过 c-Fos 表达
为了深入了解 CD38 和 c-Fos 如何调节 HSC 休眠，我们分析了 CD38 LT-HSC 中上调的干细胞相关基因调控区域中 c-Fos 结合基序的存在（图 7D 和 7E），并发现几个基因，包括 Cdkn1c，一种著名的 HSC 静止调节因子 [19]，具有 c-Fos 结合基序（S5 表）。因此，c-Fos 可能通过 Cdkn1c 表达阻断 HSC 的细胞周期入口。事实上，我们不仅证实了 Cdkn1c 基因的表达（图 7E），还证实了其基因产物 p57 的表达+基普2蛋白质，在 CD38 LT-HSC 中高于 CD38 细胞（图 8H）。此外，用 cADPR 拮抗剂或抑制 c-Fos 或 CD38 酶活性处理导致 p57 降低+-基普2蛋白质表达（图 8I–8K），从而支持我们的假设，即 CD38 通过 c-Fos 激活 CD38 LT-HSC 中的 Cdkn1c 表达。+
讨论
在我们的研究中，单个造血干细胞的基因表达谱显示，它们的异质性主要由与细胞周期相关的基因决定，这与之前的研究结果一致[43]。有趣的是，与静止状态相关的簇以及与定义功能最强大的 HSC（Fgd5、Procr 和 vWF）的标志物相关的簇包括与肿瘤坏死因子 α 激活、干扰素 γ 和 α 反应上调、Stat5 和 Stat3 通路相关的通路。我们的研究结果与之前的论文[8]一致，该文献表明，在稳态条件下，HSCs中干扰素反应基因的内在表达赋予了对成人HSC的抗病毒耐药性，类似于人类胎儿HSCs和其他干细胞类型的抗病毒耐药性[44]。该簇中TNFα信号转导的上调与其他发现一致，表明TNFα信号转导在HSC中具有促生存作用[45]。与功能最强的 HSC 相关的簇中 Stat5 信号转导的上调与先前的出版物一致，这些出版物显示了 Stat5 在 HSC 自我更新 [46] 和静止支持中的重要作用 [47]。Stat3信号转导对HSC功能（调节自我更新、细胞凋亡、DNA修复、ROS和内部IFN信号转导）的重要性在最近的其他研究中得到了证实[48]。
尽管CD38与不同成熟细胞（如T细胞[49]、神经元细胞[50]和成纤维细胞[51]）的细胞增殖有关，但我们发现HSC中的Cd38表达与细胞周期激活剂的表达呈负相关，但与细胞周期抑制剂Cdkn1c和其他定义最静止LT-HSC的已知基因呈正相关， 如VwF、Procr、Fgd5和Gprc5c [8,14,15,17]。与先前的研究报道只有来自成年小鼠的CD38 HSPCs室含有LT-HSCs相比[52,53]，我们证明使用现代表面标记物组合分离LT-HSCs，虽然CD38和CD38这两个群体都可以归类为LT-HSC，但只有CD38 LT-HSCs显示出休眠HSCs的特征[1].也就是说，我们的结果表明，CD38 LT-HSCs位于造血层次结构的顶端，它们在连续移植时具有最高的再繁殖能力，并且它们是稳态条件下最静止的干细胞。因此，CD38代表了一种标记物，有助于规避长期标记保留试验的局限性[1,7,26,54]，甚至否定报告小鼠[8,11]研究HSC休眠机制的必要性。+-+++
有趣的是，低细胞外钙2+已被证明支持离体HSC维持[55]。然而，我们认为，这种效应可能来自在常氧条件下（约 20% O）长时间（2 周）培养的 HSC 的生物学差异2）与HSCs在其天然缺氧BM生态位内的生理学形成鲜明对比（约1%至4%O2 [在Luchsinger及其同事[55]的研究中，[Ca2+]c低与[Ca2+]c高造血干细胞。然而，当考虑到该小组以前的研究时，这项工作的结论似乎是矛盾的。在早期的研究中，他们认为CD150蛋白水平较高的HSC与较高的[Ca2+]c [57]，而结果显示 CD150你好与 CD150 相比，HSC 具有更强的再繁殖能力负造血干细胞[22]。然而，当仅 dHSC 而不是散装 HSC 根据其 [Ca2+]c水平分为 2 组进行移植，较高 [Ca2+]c并发现了增加的dHSC重建潜力[11]。这与我们的数据一致，即 CD38 LT-HSC 是移植时最有效的 HSC，同时保持更高的 [Ca+2+]c有趣的是，最近的研究表明，升高 [Ca-2+]c的HSCs对于在5-FU或LPS诱导的应激下触发HSCs的细胞周期进程很重要[11,58,59]。因此，高 [Ca2+]c可能在不同的细胞周期阶段发挥不同的作用，可能是由于不同的 [Ca2+]c阈值水平。综上所述，我们的结果以及这些发现表明，虽然高 [Ca2+]c使 HSC 在静止期保持休眠状态，较高 [Ca2+]c提示 HSC 在细胞周期阶段取得进展。总之，研究 Ca 如何对该领域非常感兴趣2+调控未来研究中dHSCs的命运决定。
此外，我们发现 CD38 环化酶活性是导致高 [Ca2+]c在 LT-HSCs 中以及 Fos 基因表达和磷酸化 c-Fos 蛋白的上调。一般来说，Fos被认为是在受刺激细胞中瞬时表达的早期基因之一，导致细胞周期进程[60,61]，并且是髓系分化的正调节因子[62]。此外，c-Fos是一种致癌基因，其表达在血液系统恶性肿瘤中经常上调，例如在慢性和急性髓系白血病中[63,64]。在我们目前的工作中，我们首次证明了c-Fos在生理条件下调节HSC休眠，揭示了c-Fos如何受CD38酶活性的调节，并发现p57基普2是 c-Fos 的目标。因此，c-Fos可以以细胞类型特异性的方式激活多个转录程序，其在造血调控中的作用需要进一步研究。
此外，我们发现邻近细胞上的 CD38 酶活性调节了 CD38 阴性 hHSC 的增殖。在人BM中，有几种细胞类型表达CD38：多能和限制性造血祖细胞、浆细胞、活化的T淋巴细胞和B淋巴细胞以及NK细胞[65]。因此，其中一些 CD38 细胞可以成为 hHSC 的邻居。有趣的是，一些血液系统恶性肿瘤（慢性粒细胞白血病、急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤）CD38表达水平较高[66]。我们假设富含CD38体外酶活性产物的肿瘤微环境可能使健康的HSCs保持在静止状态，从而导致癌症相关的全血细胞减少症[67]，并且可能保持癌症干细胞的休眠状态，从而导致疾病持续存在。因此，需要更好地了解控制人类造血干细胞休眠的机制，以支持血液系统恶性肿瘤患者的健康造血，并制定更强大的癌症根除策略。+
综上所述，我们发现 CD38/cADPR/Ca2+/c-Fos/p57基普2轴调节 HSC 休眠。在机制上，我们证明CD38本身通过穿梭细胞内[Ca2+]c以 CD38/cADPR 依赖性方式，导致随之而来的 c-Fos 增加和细胞周期抑制剂 p57 的表达基普2 (图9）。操纵该轴可以潜在地刺激 dHSC 扩增及其对造血应激的有效反应。
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图 9. 具有代表性的调查结果摘要。
使用 BioRender.com 创建。cADPR，环磷酸腺苷核糖;HSC，造血干细胞;NAD，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.g009
材料和方法
道德声明
动物实验是根据德国动物福利立法进行的，并获得了“萨克森州”的批准（TVV16/2017、TVV48/2022、TVV91/2017）。对人类细胞的研究获得了德累斯顿工业大学（EK263122004，EK114042009）的批准。
试剂和资源
S6 表列出了使用的所有试剂。
小 鼠
C57BL/6N (B6), B6.SJL-Ptprc一个Pep3b/BoyJ （SJL） 购自杰克逊实验室。C57BL/6N （B6） 和 B6.SJL-PTPRC一个Pep3b/BoyJ （SJL） 小鼠杂交产生 F1 后代 （CD45.1/CD45.2） 用于移植实验。研究 HSC 的分裂历史，R26rtTA的/ Col1A1H2B-GFP型使用小鼠[7];H2B-GFP表达的诱导如[26]所述进行。编号：B6.129P2-CD38tm1Lnd/J （CD38KO） 小鼠购自 Jaime Sancho 博士和 Frances Lund 博士。Ki67系列RFP询价敲入小鼠之前已有报道[68,69]。所有小鼠均在德国德累斯顿工业大学医学理论中心的动物设施中在特定的无病原体条件下饲养和维持。除非另有说明，否则使用8至16周龄的两种性别小鼠进行实验。
细胞分离和流式细胞术
通过在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中压碎 5% 胎牛血清 （FBS） 中的骨骼并通过 40 μm 过滤器，从胫骨、股骨、骨盆和椎骨中分离细胞。使用 ACK 裂解缓冲液裂解红细胞。为了计算细胞的数量，从 2 个胫骨和 2 个股骨分离的细胞用 0.1 μg/ml 的 DAPI 染色，并使用 MACSQuant 分析仪 （Miltenyi Biotec） 对 DAPI 阴性细胞进行计数。对于排序，用 c-Kit bio 抗体对细胞进行染色，并使用 LS 色谱柱加入抗生物素微珠以富集 c-Kit 细胞。HSC 定义为 Lin（B220、CD3ε、CD19、NK1.1、Gr1、Ter119 和 CD11b 阴性）Sca1 c-Kit （LSK） CD48 CD150 细胞。LT-HSC：LSK CD48、CD150、CD34、CD201、MPP2：LSK CD48、CD150、MPP3/4：LSK CD48、CD150 和 ST-HSC：LSK、CD48、CD150。粒细胞-单核细胞祖细胞 （GMP） 定义为 Lin Sca1 c-Kit （LK） CD16/32、CD150、前巨核细胞祖细胞、PreMeg：LK CD16/32、CD41、CD150、集落形成单位红系、CfuE：LK CD16/32、CD41、CD105、CD150、集落前形成单位-红系、PreCfuE：LK CD16/32、CD41、CD105、CD150、巨核细胞-红系祖细胞，MEP：LK CD16/32 CD41 CD105 CD150，常见髓系祖细胞，CMP：LK CD16/32 CD41 CD105 CD150。所有分析均在BD LSR II、BD FACSAria II、BD LSRFortessa X-20或BD FACSCanto II（BD Bioscience）上进行。使用FlowJo软件10.7.1（BD Bioscience）分析数据。+-++-+-+-++++-----++--++--+---++---+----
单细胞 RNA 测序和 10 倍基因组学和分析
将来自 4 只 B6 小鼠的 LT-HSC（LSK CD48 CD150,3,000 个细胞）分选到含有 5 μl PBS 和 0.04% BSA 的 BSA 包被管中。所有细胞均与逆转录混合物仔细混合，然后将它们加载到10x Genomics Chromium系统[70]上的Chromium单细胞A芯片中，并按照Chromium单细胞3′RNA-seq文库v2的10x Genomics用户手册的指南进行进一步处理。简而言之，直接对液滴进行逆转录，破坏乳液并使用硅烷珠纯化cDNA。用 12 个循环扩增 cDNA 后，用 0.6 体积的 SPRI 精选珠进行纯化。经过质量检查和定量后，使用 20 μl cDNA 制备单细胞 RNA-seq 文库，包括片段化、dA-拖尾、接头连接和基于制造商指南的 13 个循环的索引 PCR。定量后，在Illumina Nextseq500系统上以26 bp/57 bp（分别用于read1和2）的双端模式对两个文库进行测序，从而产生约50至80 mio。平均转录组文库的片段。从Cell Ranger流水线生成的原始计数数据是按照标准流水线使用Seurat v3.1 [12]处理的。根据质量指标（基因数量、UMI 总数、线粒体基因百分比）过滤细胞。随后，使用 Seurat 3 的“FindIntegrationAnchors”功能合并过滤后的数据。为了进一步分析，合并的数据被对数归一化，根据文库大小和线粒体基因的百分比进行回归，并按比例进行缩放。使用来自Seurat包的G2M和S期基因以及休眠相关基因[8]（见S1表）并使用Seurat 3的“AddModuleScore”功能计算细胞周期和休眠评分。对于伪时间轨迹分析，使用Monocle 2的标准流水线[70]，并使用Monocle 2的“reduceDimension”函数进行降维，参数如下：num_dim = 10，norm_method = “log”，reduction_method = “tSNE”。对于单元格的无监督聚类，我们使用了 clusterCells（） 函数。为了可视化显示相似动力学趋势的基因模块，使用“plot_pseudotime_heatmap”函数来解释沿伪时间（q 值 < 0.05）显示差异表达显着分数的基因列表，并将作为伪时间函数而变化的基因分为 3 个簇。-+
基因本体分析
使用Enrichr[71]进行GO项分析。使用“crisp 基因集”获得每个簇的完整基因列表。为了便于可视化，从前 5 条通路中选择了具有统计显著性（p 值< 0.05）的项（参见 S3 表）。
LT-HSCs移植
对于初次移植，将 50 个 CD38 或 CD38 LT-HSC（LSK、CD48、CD150、CD34、CD201）与 5 个× 10 个一起进行分选和移植-+-+-+5BM竞争细胞总数。对于二次移植，5 × 106将CD45总BM细胞移植到致命照射的受体中。+
对于LT-HSCs的初次移植，将50 wt或CD38KO LT-HSCs（LSK、CD48、CD150、CD34、CD201）与5× 10-+-+5BM竞争细胞总数。对于二次移植，将供体造血干细胞（LSK CD48 CD150）与5×10一起进行分选和移植-+5将 BM 竞争细胞总数转化为致命照射的受体。对于 TBM 初次移植，1 × 106将wt或CD38KO小鼠的CD45总BM细胞与1×10只一起移植+6BM竞争细胞总数。对于二次移植，5 × 106将CD45总BM细胞移植到致命照射的受体中。+
用于 CD38KO 移植，7 × 106将来自CD38KO小鼠的CD45总BM细胞移植到wt或CD38KO致死性照射受体中。+
对所有受体小鼠进行致命照射（9 Gy），并静脉注射细胞。
细胞周期分析
如前所述，使用Ki67和DAPI染色分析细胞周期[72]。在同一天分析每种特定处理的小鼠组（ctrl 与不同时间点的治疗），使用相同数量的细胞、相同的抗体预混液以及相同的 FACS 机器和设置来比较 ctrl 与治疗小鼠。为了标记 dHSC，小鼠注射 1 mg BrdU ip，并在处死前在饮用水中每 1 ml 中保持 0.8 mg BrdU 14 天。每 3 天换一次水。如前所述，使用抗BrdU抗体进行BrdU掺入分析[21]。
体内给药
为了研究c-Fos抑制的作用，在分析前18小时以30mg / kg /小鼠腹腔注射载体中的T-5224（2%DMSO + 30% PEG300 + 2%吐温80的ddH 2 O溶液）。对照小鼠注射相应量的载体。为了模拟病毒感染，在分析前 18 或 48 小时以 5 mg/kg 的剂量腹腔内注射 pIC。为了研究 HSC 对化疗的反应，在分析前 4 或 8 天以 150 mg/kg 的剂量腹腔注射 5-FU，并在 5-FU 后第 3 至 7 天以 20 mg/kg/小鼠的剂量腹腔注射 78c。
血细胞计数
使用Sysmex XT-3000 Vet自动血液分析仪测量血细胞计数。
细胞内钙染色和通量
通过流式细胞术估计钙染色和通量。将细胞在室温下与 0.3 μm Fluo-8 AM 孵育 1 小时，或在 37°C 下与 2 μm Indo-1 AM 和 0.02% Pluronic F-127 在 HBSS 中孵育 30 分钟，洗涤并重悬于 HBSS 中。使用405±20 nm（紫色发射）和530 ± 30 nm（450 LP滤光片，蓝色发射）的波长滤光片来观察Caa2+分别通过流式细胞术进行结合和未结合染料的比率。记录基线钙后，将thapsigargin（TG，1mM）加入样品中以诱导Ca2+通量。或者，在TG前5分钟将78c（1μm）加入细胞中。计算结合/未结合的Indo-1（405 nm/485 nm发射）的平均比值R。
线粒体膜电位和质量
在 50 μm 维拉帕米存在下，在 37°C 下 20 分钟，将细胞置于 250 nM 四甲基罗丹明乙酯 （TMRE） 中以测量 MMP 或 100 nM Mitotracker Green 以测量线粒体质量。洗涤细胞并通过流式细胞术进行分析。
单细胞LT-HSC体外培养
将单个长期 HSC 分选到含有 10 ng/ml SCF、10 ng/ml THPO、20 ng/ml IGF2 和 10 ng/ml FGF1 的 StemSpan 培养基的 96 孔板中，联合或不联合 1 μm/4 μm c-Fos 抑制剂 T-5224、0.1 μm CD38 抑制剂 78c，并在 37°C 下用 5% CO 培养 3 天2.在光学显微镜下每天监测两次每孔的细胞数量。
HSPCs的体外治疗
来自 Ki67 的 LSK 细胞RFP询价对小鼠进行分选培养（5×10只4每孔）在含有 10 ng/ml SCF、10 ng/ml THPO、20 ng/ml IGF2 和 10 ng/ml FGF1 的 StemSpan 培养基中，伴或不伴 25 或 100 μm 8-Br-cADPR 或 25–100 μm 8-Br-ADPR 或 4 μm T-5224;24 小时后，用抗 CD48、CD150、Kit、Sca-1 抗体和 0.3 μm Fluo-8 AM 对细胞进行染色。对于图 8G 和 8J 中的实验，使用 eBioscience 试剂盒固定表面染色细胞，并在载玻片上对 HSC 进行免疫荧光染色。对于图 8F、8I 和 8K 中的实验，将 CD38 LT-HSC 分选并在含有 10 ng/ml SCF、10 ng/ml THPO、20 ng/ml IGF2 和 10 ng/ml FGF1 的 StemSpan 培养基中培养，含或不含 0.1 μm 78c 或 25 μm 8-Br-cADPR;16 或 24 小时后，使用 eBioscience 试剂盒固定细胞，并放在载玻片上进行免疫荧光染色。+
免疫荧光染色
在载玻片上分选的HSC用于免疫荧光染色。在室温下用 20% 马血清在 1X 透化缓冲液 （eBioscience） 中封闭细胞 30 分钟，用兔抗磷酸化 c-Fos 或兔抗 p57 抗体染色 2 小时，洗涤，然后与二抗兔 AlexaFluor 488 抗体孵育 30 分钟。使用含DAPI的封固剂封固细胞并密封。使用蔡司观察者Z.1（ApoTome II）（蔡司）或徕卡TCS SP5共聚焦显微镜（徕卡显微系统）使用40×或63×物镜拍摄图像。每张图像拍摄6-8个z-stack，并使用Fiji分析荧光[73]。
人造血干细胞体外培养
骨髓干细胞单采物是从卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯大学医院德累斯顿骨髓移植中心的健康供体中收集的。捐献者符合骨髓捐献标准（例如，没有艾滋病毒、乙肝病毒和严重疾病），被告知并给予批准。MOLM-13 是从 ATCC 获得的。将 BM 抽吸物分层在 Ficoll-Paque PLUS 培养基上，并在 20°C（制动关闭）下以 800g 离心 20 分钟，然后从 Ficoll 梯度中间的血沉棕黄层馏分中分离单核细胞 （MNC）。对 MNC 进行表面 hHSC 标记物染色：谱系（CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56）、CD34 和 CD38。造血干细胞（Lin-CD38瞧/-将 CD34） 分选到 96 孔板中，放入补充有 2.5% FBS、人 FLT3L、人 SCF 和人 IL-3（均为 2.5 ng/ml）的 CellGenix TM GMP SCGM 培养基中，并在 37°C 下培养 5% CO+2;将50,000个细胞以相同的条件一式三份接种到上述培养基中，使用或不使用4μm 78c或100μmBr-cADPR。第二天，用抗CD34、CD38抗体对细胞进行染色，固定，用eBioscience试剂盒透化，并用抗Ki67抗体和5 μg/ml DAPI染色。或者，将 MNC 与抗 CD34 MicroBeads 一起孵育，并使用 LS 柱和 3,000 个 HSC （CD38瞧/-将CD34）分选到96孔板中，放入补充有2.5%FBS、人FLT3L、人SCF和人IL-3（均为2.5 ng/ml）的CellGenix TM GMP SCGM培养基中，其中含有1×10+5MOLM-13 细胞，并在 37°C 下培养 5% CO2一式两份，有或没有 1 μm 78c。第二天，用抗CD34、CD38抗体对细胞进行染色。使用 Ki67 和 DAPI 染色分析细胞周期。
人骨髓免疫染色
如前所述，在Ventana Ultra仪器（Ventana Medical Systems，Arizona，United States of America）上进行免疫组织化学染色[74]。使用Vectra 3自动成像系统（Akoya Biosciences）采集多光谱图像。数据分析是在Imaris 9软件中完成的。
人体细胞的免疫荧光染色
用eBioscience试剂盒固定后，将Lin CD34、CD38/Lin CD34、CD38、CD38细胞分选在载玻片上，用于免疫荧光染色。在室温下用 Duolink 封闭溶液 （Sigma） 封闭细胞 30 分钟，在 Duolink 抗体稀释剂 （Sigma） 中用抗 hCD38 APC 染色 3 小时，用 1X 透化缓冲液 （BD） 洗涤 3×。使用含DAPI的封固剂封固细胞并密封。使用蔡司Observer Z.1（ApoTome II）（蔡司）使用63×物镜拍摄图像。每张图像拍摄5-7个z-stack，并使用Fiji分析荧光[73]。-+--++--++
CD38环化酶活性
根据[75]测量CD38环化酶活性，变化很小。在含有 10 mM Tris/HCl （pH 7.4）、0.25 M 蔗糖、20 mM NaF、1 mM DTT、5 mM EDTA、1 mM PMSF（所有来自 Sigma-Aldrich 的化学物质）和蛋白酶抑制剂混合物（凝乳酶抑制剂、亮肽素、抗痛药和胃蛋白酶抑制剂;Santa Cruz Biotechnology， sc-24948A）。含有 1 × 10 的反应混合物的荧光 （ex = 300 nm， em = 410 nm）6记录裂解的MOLM-13,200μm烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸钠盐（NGD）和0至1.28μm78c1小时。为了生成剂量-反应曲线，将 1 h 时的归一化相对荧光强度与 log 78c 浓度作图。
单细胞hLT-HSCs体外培养
对人 MNC 进行表面 LT-HSCs 标记物染色：谱系（CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56）、CD34、CD38、CD90、CD45RA。和单个人 LT-HSC （Lin CD38-瞧/-将 CD34、CD90、CD45RA） 分选到 96 孔板中，放入补充有 2.5% FBS、人 FLT3L、人 SCF 和人 IL-3（均为 2.5 ng/ml）的 CellGenixGMP SCGM 培养基中，含或不含 8 μm T-5224 或 4 μm 78c，并在 37°C 下培养 5% CO++-2.每天使用光学显微镜监测每个孔的细胞数量。
批量RNA测序
共分选 2,000 个 CD38 或 CD38 的 LT-HSC（LSK、CD48、CD150、CD34、CD201）（每个样品 10 只小鼠的混合细胞）。如前所述进行批量RNA测序[72]。Illumina测序在Nextseq500上完成，平均样本测序深度为6000万个读长。-+-++-
转录组作图
使用Illumina fastq滤光片（http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter/）去除低质量核苷酸。使用cutadapt进一步对reads进行衔接子修剪[76]。使用STAR Aligner [77]使用以下参数将读段与小鼠基因组进行比对：“—runMode alignReads—outSAMstrandField intronMotif—outSAMtype BAM SortedByCoordinate—readFilesCommand zcat。小鼠基因组版本GRCm38（释放M12 GENCODE）用于比对。HTSeq-0.6.1p1 [78] 用于计数映射到比对样本文件中基因的读长。读取量化使用以下参数执行：“htseq-count -f bam -s reverse -m union -a 20”。用于读取定量的GTF文件（gencode.vM12.annotation.gtf）是从Gencode下载的[79]。
差异表达分析
使用DESeq2_1.8.1进行以基因为中心的差异表达分析[80]。火山图是使用 ggplot2_1.0.1 [81] 创建的。使用R/Bioconductor的ComplexHeatmap软件包[82]生成热图。
基因富集分析
使用GSEA进行通路和功能分析[83]。GSEA是一个带有GUI的独立软件。为了运行 GSEA，通过取 p 值的 -log10 并将其与倍数变化的符号相乘，创建了基于 DESeq2 的计算中所有基因的排名列表。然后针对 MsigDB [84] 查询了这个排名列表。
转录因子结合位点预测
使用JASPAR2020数据库对基因的3Kb上游区域运行“memes”https://bioconductor.org/packages/memes 包（来自R）的“runFimo”命令[85]。
数据
作者确认，研究结果所依据的所有相关数据都在论文及其支持文件中。大宗和单细胞RNA测序数据分别在GEO的登录号GSE196760和GSE196759下提供。与数字相关的所有数据都可以在 S1 Data 中找到。
统计学
数据以 SEM ±平均值表示。 除非另有说明，否则使用 Mann-Whitney U 检验计算显着性。所有统计分析均使用GraphPad Prism 8.2.1 for Windows（GraphPad Software，La Jolla，California，USA;www.graphpad.com）。
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造血干细胞的单细胞转录组分析。
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S1 图。 造血干细胞的单细胞转录组分析。
（A） 均匀流形近似投影 （UMAP） 表示，描绘了单个 HSC （LSK、CD48、CD150） 的转录谱，基于细胞周期相关基因的聚类。（B） 选定细胞周期相关基因沿伪时间的对齐动力学曲线。（C） 选定 HSC 休眠相关基因随伪时间的动力学曲线对齐。该图的基础数据可在 S1 表中找到。-+
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S2 图。 CD38 和 CD38 HSPC 的表征。+-
（A）小鼠HSPCs分析的设门策略。 （B）流式细胞术分析HSPCs区室中CD38表达（MPP3/4：Lin Sca-1 Kit（LSK）CD48 CD150，MPP2：LSK，CD48 CD150，ST-HSCs：LSK，CD48，CD150，HSCs：LSK，CD48，CD150）。CD38KO 的 HSPC 被用作门控的阴性对照。（C） 使用总 BM 细胞定义 CD38 组分的门控策略。（D） CD38 和 CD38 HSC 上特定标志物表面表达的 FACS 分析。-+++-++---++-+
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S3 图。 CD38 和 CD38 LT-HSC 的比较。+-
（A）. 用于移植实验的分选 LT-HSC 的再分析。（B） 在一期和二次移植后不同时间点供体来源的白细胞中 T、B 和髓样细胞的频率（图 2D-2H）。（C 和 D）CD38 或 CD38 LT-HSC 初次移植后 20 周供体来源的 HSC 中 CD38 的表面表达，来自记录的 fcs 文件中供体 HSC 群体中含有 >60 细胞的个体小鼠的数据，2 个独立实验。（E） HSC线粒体膜电位分析（n = 5）。（F） 在维拉帕米存在下使用 MitoTracker Green （MTG） 分析 HSC 中的线粒体质量 （n = 4）。（G） 区分 LT-HSC 细胞周期 G0、G1 和 SG2M 期的代表性 FACS 图。 使用配对 t 检验计算 P 值，*** p < 0.001。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。+-
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（TIF）
S4 图。 CD38KO小鼠的分析。
（A） 用于分析限制性髓系祖细胞的门控策略。（B） wt 和 CD38KO （KO） 小鼠外周血中红细胞的数量。（C） wt和CD38KO小鼠外周血血小板（PLT）数。（D） wt和CD38KO小鼠PB中的WBC数。（E） wt和CD38KO小鼠骨髓中限制性祖细胞的数量。（F） wt 和 CD38KO 骨髓中 HSPC 的数量。对于面板 B–F，n = 6 wt，8 KO。（G） 将 TBM 从 CD38KO 小鼠移植到 wt 和 CD38KO 的实验装置。用 BioRender.com 创建。移植后 8 周使用 Ki67 和 DAPI 染色 （n = 5 wt， 4 KO） 对供体 HSC 进行细胞周期分析。使用 Mann-Whitney 检验计算 P 值。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。
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（TIF）
S5 图。 CD38 在激活 LT-HSC 增殖中的作用。
（A） 单细胞分裂示踪实验的设置。将来自 wt 的单个 CD38 LT-HSC 和来自 CD38KO 小鼠的 LT-HSC 分选并在含有或不含 78c 的液体培养基中培养。使用 BioRender.com 创建。（B） 介绍了在孵育期间完成第一次分裂的 LT-HSC 的频率（4 个独立实验）。（C） B.（D）对Ki67-RFP报告小鼠的CD38 HSC进行分选，并在有或没有78c（n = 3）的情况下孵育。24 小时后分析 RFP 细胞的频率。（E） wt 和 CD38KO HSC 的钙通量测定。 HSC 中峰的时间 [Ca+++2+]c添加 TG 后，n = 4 vs. 5。使用配对 t 检验计算 P 值，*p < 0.05。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.s005
（TIF）
S6 图。 CD38 调节 hHSC 分裂。
（A） 分离人 HSC 和 LT-HSC 的门控策略。 （B） 人细胞的代表性免疫荧光细胞内染色和 CD38 综合荧光强度的定量（CD38、CD34、CD38、CD38、CD34 分别为 n = 43/63/31）。（C） CD38 在 MOLM-13 上的表面表达。左-同种型 ctrl，右-抗 CD38 抗体。（D） MOLM-13 裂解物对 CD38 抑制剂的反应环化酶活性的剂量反应曲线 （n = 3）。对乙状结肠标准曲线进行插值，显示 95% 置信区间。（E） 将 Lin CD34 人细胞分选并孵育 24 h，有或没有 Br-cADPR 和 78c，CD38 细胞周期-+++++--+瞧/-使用 Ki67 染色分析 CD34 细胞。图形方案是使用 BioRender.com 创建的。使用非配对 t 检验计算 P 值，*p < 0.05。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。+
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（TIF）
S7 图。 ADPR 不影响 HSC 的细胞周期。
（A） 来自 Ki67 的 LSKRFP询价将报告小鼠分选并在ADPR拮抗剂（8-Br-ADPR）存在下培养24小时。相对 [Ca2+]c用 0–100 μm 8-Br-ADPR 处理的 HSC 中的浓度，（n = 4）。（B） 用 0–100 μm Br-cADPR 处理 24 小时后 Ki67-RFP HSC 的频率，（n = 4）。使用 Brown-Forsythe 和 Welch 方差分析进行多组比较，然后使用 Dunnett 的 T3 多重比较检验。（C） CD38 和 CD38 HSC 中细胞内 p-c-Fos 的代表性直方图。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。+-+
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.s007
（TIF）
S8 图。 抑制小鼠和人造血干细胞中的 c-Fos 活性。
（A） 来自 wt 的 LT-HSC 和来自 CD38KO 的 LT-HSC 中 p-c-Fos MFI 的定量 （n = 247—wt， n = 268—CD38KO）。（B） 在有或没有 78c （n = 40—wt， n = 54—CD38KO） 的 CD38KO LT-HSC 培养 24 小时的 p-c-Fos MFI 的定量。A， B—使用非配对 t 检验 ****p < 0.0001 计算 P 值。（C）建立单细胞示踪实验。将人单个 LT-HSC 分选到平板中，并在 c-Fos （T-5224） 或 CD38 （78c） 抑制剂存在下孵育。检测到孔中的细胞数量。用 BioRender.com 创建。（D） 显示了 1 个供体在孵育期间完成第一次分裂的 LT-HSC 的频率。（E） 对 3 个捐助者的图 D 中数据的曲线下面积 （AUC） 进行量化。使用 Brown-Forsythe 和 Welch 方差分析进行多组比较，然后进行 Dunnett 的 T3 多重比较检验。该图背后的数据可以在 S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.s008
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S1 表。 细胞周期和休眠基因。
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S2 表。 沿伪时间成簇的基因。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.s010
（XLSX）
S3 表。 沿伪时间的基因簇的通路分析。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.s011
（XLSX）
S4 表。 CD38+ 与 CD38-LT-HSC 中表达不同的基因。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.s012
（XLS）
S5 表。 CD38+ LT-HSC中上调干细胞相关基因中的c-Fos结合基序。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.s013
（XLSX）
S6 表。 试剂和资源。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.s014
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S1 数据。 所有主要数字和支持数字的数值。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517.s015
（XLSX）
确认
图形方案是使用 BioRender.com 创建的。我们感谢 Anja Krüger 和 Robert Kuhnert 的技术援助、德累斯顿工业大学医学院细胞成像核心设施以及德累斯顿概念基因组中心的深度测序设施。英语语言和内容编辑由 Vasuprada Iyengar 提供。
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