免费医学论文发表-放疗暴露后增强灌注：理论研究
抽象
肿瘤血管生成导致结构和空间异质的血管的形成。血液灌注不良，加上缺氧和氧异质性增加，会损害肿瘤对放疗的反应。增强肿瘤灌注的最佳策略尚不清楚，阻碍了其在联合疗法中的常规部署。在这项工作中，我们首先使用来自血管肿瘤的体内成像数据，确定了与放疗后增强灌注相关的血管结构特征。然后，我们提出了一种新的计算模型来确定这些结构特征与计算机中血液灌注之间的关系。如果将灌注定义为支持血流的血管比例，我们发现平均直径小且血管生成芽数较多的血管网络在生物和合成肿瘤的照射后灌注增加幅度最大。我们还发现了由于灌注不足的血管修剪而不是血液改道而导致灌注增加的病例。这些结果表明，在确定最佳辐照策略时，考虑网络组成非常重要。未来，我们的目标是利用我们的研究结果来识别适合灌注增强的肿瘤，并提高联合疗法的疗效。
作者摘要
失调的肿瘤脉管系统通常包含灌注不足的血管，这会抑制血源性抗癌疗法的输送。放射治疗用于治疗超过一半的癌症患者，对血管内皮细胞造成 DNA 损伤，优先影响较小的血管，导致其死亡和血管修剪。同时，测量辐照后肿瘤灌注变化的实验会产生不同的结果，因此，辐照诱导的血管修剪对网络规模灌注的影响仍不清楚。在这项研究中，我们使用最近的（体内）成像数据来识别影响照射后灌注变化的肿瘤血管结构的特征。然后，我们使用新开发的计算框架，直接由实验观察结果提供信息，以阐明放疗前的血管几何形状和拓扑结构与辐射引起的网络灌注变化之间的关系。我们发现，对于平均直径小和血管生成芽数较多的血管网络，灌注增加最为显著。我们的研究结果还区分了灌注增加的不同机制，并确定了血流改道导致先前灌注不足的血管被灌注的情况。我们的研究更清楚地说明了放疗对肿瘤血流的影响;这些见解可能有助于改善抗癌治疗。
数字
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引文： K?ry J， Narain V， Stolz BJ， Kaeppler J， Markelc B， Muschel RJ， et al. （2024） 暴露于放疗后的增强灌注：理论研究。PLoS 计算生物学 20（2）： 编号：E1011252。 https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252
编辑 器： 佩德罗·门德斯， 美国康涅狄格大学医学院
收到： 2023年6月9日;接受： 2024年1月23日;发表： 2月 16， 2024
版权所有： ? 2024 K?ry et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 实验数据 本研究中使用的实验数据可在 doi.org/10.15252/embr.202153221 找到。与这些脉管系统相关的后处理文件可从 Zenodo 数据库 （DOI doi.org/10.5281/zenodo.10113283） 获得。评估论文结论所需的所有其他实验数据都在手稿中。合成网络模拟 修改后的 Microvessel Chaste 源代码以及用于后处理的 Python 文件可以在 github.com/vedangnarain/enhanced-perfusion-following-exposure-to-radiotherapy.git 上找到。拓扑数据分析 本文中考虑的计算拓扑指标的后处理文件可以在 github.com/vedangnarain/enhanced-perfusion-following-exposure-to-radiotherapy.git 上找到。
资金： JK 感谢英国癌症研究中心 （CRUK） 的资助编号 C5255/A18085 和编号 C5255/A15935。VN 感谢英国癌症研究中心 （CRUK） 资助号 C2195/A31281 的支持。BJS和HMB是拓扑数据分析中心的成员，这项研究全部或部分由EPSRC EP/R018472/1资助。BJS还得到了欧莱雅-联合国教科文组织英国和爱尔兰女性科学新秀计划的进一步支持。HMB和PKM还要感谢剑桥大学艾萨克·牛顿数学科学研究所（Isaac Newton Institute for Mathematical Sciences， Cambridge）在“运动数学”（Mathematics of Movement）课程期间的支持和款待，该课程为完成本文所做的工作奠定了基础。这项工作得到了EPSRC资助号EP/R014604/1的支持。BM感谢欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）的人员计划（玛丽居里行动）的支持，根据REA拨款协议第625631号，医学研究委员会（MRC）- UKRI（拨款号：C5255 / A18085），英国癌症研究中心（CRUK）拨款号C5255 / A18085和C5255 / A15935，通过CRUK牛津中心和斯洛文尼亚研究机构（批准号：P3-0003，J3-2529）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
肿瘤细胞利用各种生物学机会来无视细胞外信号，这些信号通常会引导生物体的体细胞为了生殖细胞而牺牲自己[1]。其中一个机会是肿瘤能够以一种称为“肿瘤血管生成”的现象来刺激其自身血液供应网络的增长。肿瘤血管生成产生的脉管系统以无序的方式生长。因此，肿瘤的血液循环缓慢，导致灌注不良和缺氧。反过来，氧合不良会减弱主要肿瘤治疗的效果。放射治疗用于治疗超过一半的癌症患者，其疗效取决于活性氧的产生，这些活性氧会诱发无法修复的DNA损伤[2]。在氧气存在的情况下，放疗疗效增加的机制可以用“氧固定假说”来解释[3,4]。照射时，会产生介导辐照诱导损伤的自由电子，要么直接破坏大分子，导致DNA碱基丢失和DNA单链断裂（SSB），要么与氧相互作用形成过氧自由基，从而诱导DNA损伤，包括细胞难以修复的双链断裂（DSB）[5,6].在缺氧状态下，较低的氧气量会导致活性氧 （ROS） 的形成减少，包括过氧自由基。因此，DNA损伤较少，导致损伤修复能力更强，从而增加放射电阻。重要的是，肿瘤内缺氧的斑块对放疗的反应可能降低至3倍[7]。此外，对缺氧的适应可导致肿瘤表型具有增加的化疗耐药性和转移能力[8]。有关在缺氧条件下表现比在正常情况下表现更差的药物列表，参见[9]。
肿瘤生长主要是单调的，即在血管生成开关被触发后，肿瘤继续生长，肿瘤脉管系统也持续生长。因此，肿瘤血管没有自发消退，导致脉管系统混乱和紊乱，重塑和成熟有限。在正常血管的发育中，调节其复杂性和组织的重要机制之一是血管网络的修剪，称为“血管修剪”，这标志着生长中的脉管系统内微血管子集的生理退化[10\u201212]。在出生后小鼠视网膜血管网络中详细研究了这种现象，结果表明，出生后视网膜萌发前沿的血管密度明显高于成人视网膜的成熟血管网络。血管修剪的主要驱动因素是血管内皮生长因子 （VEGF） 和 VEGF 受体 （VEGFR） 信号传导。然而，由成纤维细胞生长受体2（FGF2）、血管生成素2（ANG2）、血小板衍生生长因子（PDGF）和δ样4（delta-like 4， DLL4）激活的其他信号通路已被证明独立于VEGF/VEGFR通路起作用[11]。抗血管生成疗法利用这些信号轴，可以引起肿瘤中血管修剪的短暂诱导，从而使脉管系统看起来更正常和更稳定。这被称为“血管正常化”，它不仅涉及形态学改善，还涉及功能改善：降低间质液压力（IFP），减少肿瘤缺氧，并改善大分子从这些血管的渗透，这显着提高了某些疗法的疗效，如放疗和化疗[10,13].最近研究表明，放疗也可以作为一种血管正常化疗法，优先修剪未灌注的小血管[14,15]。 重要的是，未灌注的血管和血流缓慢的血管也容易修剪血管，血流的变化是血管消退或成熟的调节剂。在小鼠视网膜中，血管收缩的药理学抑制或血管扩张的诱导导致血管稳定性降低，证实了血管修剪依赖于血流动力学作用力[16,17]。 然而，目前尚不清楚分子成分（如血管生成因素）或机械因素（如剪切应力）是与血流相关的血管消退的主要调节因子。
在临床环境中，通常无法避免对肿瘤周围的正常组织进行照射。为了降低放疗的正常组织毒性，将总辐射剂量分成几个部分。“常规分割”已经在诊所使用了几十年，它将总辐射剂量分成 1.8-2 Gy 分次，每周 5 天给药，总剂量为 40-70 Gy。这种类型的分割利用了肿瘤和正常组织之间的生物学差异，这通常会导致在相同程度的肿瘤控制下对正常组织的损伤较小[5]。与传统的低剂量分割疗法相比，大分割术描述了一种放射治疗，其中总剂量以较少数量的较大 （>2 Gy） 分数给药，从而缩短了总治疗时间。如果治疗以单剂量或少量分次给药，通常每分剂量为8-30Gy，则称为立体定向放射治疗（stereotactic body radiation therapy， SBRT）[18]。在过去十年中，SBRT的使用有所增加。这主要是由于图像引导和高度适形剂量递送方面的技术进步，允许将高剂量的辐射传递到肿瘤，同时保持对周围正常组织的可接受剂量[5,18]。
为测量肿瘤照射后肿瘤灌注变化而进行的实验记录了不同的结果。Park等人的一项综述发现，报告的结果不一致，在放疗的早期阶段，人类肿瘤血管系统的功能先改善后恶化[19]。相反，在人类肿瘤异种移植物或小鼠肿瘤中，照射会导致轻度至重度损伤，具体取决于剂量，从而减少血液灌注[19]。Kim等人发现，立体定向放射治疗可降低灌注[20]。另一方面，涩谷等人发现，在宫颈癌的情况下，照射后血流显着改善[21]。此外，Bussink等人的一项研究发现，辐照会导致灌注的快速变化，在辐照后不久观察到灌注增加，然后显着减少[22]。Kaeppler等人使用转基因CreERt2-tdTomato小鼠模型，其中<95%的内皮细胞被荧光标记，并结合体内活体多光子显微镜，使他们能够同时对灌注和非灌注的肿瘤脉管系统进行成像，以研究其对单剂量和分次放疗的反应[15].他们使用了两种肿瘤细胞系——一种是高度血管化的结肠腺癌（MC38）和一种血管化程度较低的黑色素瘤（B16F10），发现与后者相比，前者含有更大比例的灌注不足血管。此外，观察到较小直径的血管更有可能被灌注不足，也更有可能在照射后被修剪（即，它们的内皮细胞更容易凋亡）。因此，得出的结论是，照射后的肿瘤灌注取决于小血管（通常灌注不足）的密度。
提高对照射和灌注之间关系的理解将允许准确规划分次放疗。然而，目前尚不清楚为什么某些肿瘤在照射后表现出灌注的增加与减少。构成肿瘤脉管系统的血管具有异质的结构特征，呈现出一个对实验分析具有抵抗力的复杂系统。因此，需要计算工具来指导和补充实验研究。
从广义上讲，肿瘤血管结构已经通过反映生物学特征的合成网络在空间上建模，或者最近通过数字化真实肿瘤脉管系统的几何形状。Bernabeu等人利用从实验数据中收集的病理维度构建的规则分叉网络是高度有序的，因为它们是使用一组简单的确定性规则生成的，因此由此产生的几何形状（血管直径、长度和血管在网络中的排列）非常规则[23]。此外，这些网络表现出严格的层次结构，因为每个母血管都细分为两个子血管，它们比母体更短更薄。以前，非分层和有序的脉管系统被表示为具有重复六边形单元的网络，类似于在禽卵黄囊中观察到的网络[24]。Alarcón等人使用类似的网络在细胞内、细胞和组织尺度上耦合过程[25]。Owen等人使用六边形和无序网络来证明，通过修剪和血管生成的平衡可以实现血管重塑[26]。
合成网络通常也是通过模拟基于趋化梯度的毛细管尖端的随机迁移来生成的。Anderson和Chaplain开发了一种模型，该模型使用随机游走偏向于较高的TAF（肿瘤血管生成因子）水平，类似于体内血管生成网络[27]。Macklin等人和Shirinifard等人分别在2D和3D中采用了类似的偏置随机运动和萌芽形成模型[28,29]。 此外，Stepanova等人还采用了多尺度随机游走模型来研究内皮细胞动力学[30]。血管生成模型仍然是一个活跃的研究领域[31\u201233]。
虽然合成网络可以复制真实肿瘤脉管系统的许多特征，但一些研究更进一步，将实验获得的肿瘤脉管系统数字化。Grimes等人使用3D数字化网络来估计氧气分布[34]。Grogan等人使用类似的方法来比较2D和3D表示，而Sweeney等人则使用3D模型表明，使用逼真的脉管系统是模拟肿瘤流体动力学的关键[35,36]。 然而，这种模拟以了解边界条件为前提，并且直接观察单个容器中流动的方法有限（尤其是较小的微容器）[37]。
拓扑数据分析（TDA）是一个新兴的数学领域，它利用拓扑和几何方法来量化数据的“形状”[38,39]。 TDA 通过拓扑不变量（例如多个尺度上的连接组件和环路）来表征形状。TDA最突出的方法，即持久同源性，已成功应用于量化实验数据中血管网络的动态特征[40,41]，并在肿瘤诱导的血管生成的数学模型中区分由不同参数机制产生的合成血管网络[42].持久同源性跟踪整个过滤的拓扑特征，例如，嵌套的血管网络序列，并以条形码的形式输出有关这些特征在过滤中的持久性的信息[39]。条形码中包含的信息可以矢量化并与统计或机器学习工具集成[43,44]，也可以将其压缩为数据的单个拓扑描述符，例如，过滤过程中的环路数，如[41]。在实验数据中，放疗后血管网络中血管网络总环数随时间的变化显示，不同肿瘤相对于放疗当天（单剂量）存在很大差异[41]。然而，这项研究没有考虑灌注，特别是没有区分治疗前网络的不同初始结构特征，这些特征会影响它们对放疗的反应。最近，开发了一种新的加权有向图拓扑描述符[45]。对于加权有向图，例如，按血管直径或流动时间加权的血管网络以及流动方向给出的方向，该方法输出描述其结构的条形码。虽然这种拓扑描述符对有关此类网络的丰富信息进行编码，但它尚未应用于实际数据，是计算密集型的，并且需要大量压缩才能对多个网络进行可解释的比较。在这里，我们专注于结合简单的拓扑和几何信息来描述血管网络的结构，这些结构被解释为无向和无加权图，即忽略有关流动方向和血管直径的信息。然后，我们将这些结构特征与流动模拟与灌注变化联系起来，其中考虑了流动方向和血管直径。我们受到先前对肿瘤脉管系统的TDA研究[40–42]的启发，其中环的数量似乎反映了脉管系统的显着结构变化。与这些研究相比，我们没有应用持久同源性，而是关注网络中环路的总数作为连续时间点的拓扑描述符。这种拓扑描述符很容易通过欧拉特征进行计算（参见灌注的拓扑决定因素部分），不需要网络的嵌套性（与持久同调性相反），因此更适合于分析正在修剪的网络。以前的研究都没有直接探讨网络拓扑与辐照后改变的灌注之间的联系，据我们所知，没有实验动机的计算研究来研究辐照诱导剪枝对网络灌注的影响，同时考虑几何和拓扑结构特征。
在本文中，我们旨在描述放疗引起的血管几何形状变化（例如，修剪小血管）可能导致血管灌注增加的程度。我们确定了关键的几何和拓扑描述符，这些描述符表征了血管修剪后增强灌注的脉管系统，以及这种增强可能发生的机制。虽然[15]提供了广泛的分析，比较了两种肿瘤细胞系在各种放疗方案下，但我们注意到，即使在单剂量放疗下，即使在一个细胞系（MC38）内，一些肿瘤的灌注增加，一些肿瘤的灌注减少。因此，我们将只关注单剂量放疗下的 MC38，旨在评估照射前的某些结构特征是否可以用作预测放疗灌注反应的代理。
这项工作的结构总结在图1中。在介绍了本研究的生物学和计算背景之后，我们接下来在实验动机部分描述了激发和告知我们模型的体内实验研究。在本节中，我们还强调了某些建筑（几何和拓扑）指标与辐照后灌注变化之间的关键相关性。在模型概述一节中，我们介绍了计算模型的关键方面，包括初始网络的拟议架构、修剪规则以及灌注的测量方式。然后，我们使用我们的模型来研究潜在的因果关系，并在结果部分提出了灌注改善的两种机制。最后，我们将我们的研究结果置于背景中，并在讨论部分讨论其含义。完整的实验程序和模型描述可以在材料和方法部分找到。
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图 1. 总结本研究关键组成部分的图表。
左下角的面板显示了从第 0 天（照射前）开始包含灌注（黄色）和灌注不足（紫色）血管的代表性血管区域，其中一个肿瘤的辐照诱导的血管修剪导致灌注减少（肿瘤 6;顶部）和一个导致灌注增加的肿瘤（肿瘤 1;底部）。请注意，后者的脉管系统包含许多灌注不足的钝端血管，而前者包含更多的环。右下角的面板显示了修剪后的合成（分叉）网络，它们表现出与灌注（红色）和灌注不足（蓝色）血管相似的特性。
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实验动机
直接流动模拟中的不确定性
理想情况下，人们可以通过对从显微镜图像中提取的网络进行直接血流模拟来评估放疗诱导的血管修剪对网络灌注的影响。但是，有关哪些网络节点用作入口和出口的信息通常是有限的或不存在的。即使有了这些信息，仍然很难确定是否应该在入口处施加恒定压力或恒定流速，以及这些压力或流速应该采取什么值才能获得与体内血流测量的定量一致性。尽管近年来受到科学界的更多关注，但在边界节点上可靠地分配适当条件的问题仍未得到解决。在[37]中，开发了一种算法，通过该算法，可以拟合边界条件，以便将微容器中的压力和壁面剪切应力与适当选择的目标值的偏差降至最低。近年来，该方法已被用于寻找脑血流动力学以及肿瘤灌注模拟的合适边界条件[46,47]。 然而，由于动态肿瘤微环境的复杂性，对流动边界条件的可靠估计仍然是一个活跃的研究领域。在这项工作中，我们选择了不同的策略。首先，在“了解对放疗的灌注反应及其决定因素”一节中，我们确定了关键的全局几何和拓扑指标，这些指标可用于确定辐照诱导的血管修剪是否改善或损害从肿瘤中提取的血管网络的灌注。然后，在接下来的章节中，我们提出了合成网络中网络灌注和血管修剪的理论研究。在此过程中，我们旨在确认新提出的指标在区分放疗后灌注增加或减少的肿瘤血管网络方面的效用。
了解对放疗的灌注反应及其决定因素
暴露于放疗会导致内皮细胞中的DNA损伤，这被发现在较小的灌注不足的血管中优先诱导细胞凋亡，并导致较大血管中的细胞周期停滞，从而保持血液流动的功能性通道[15,48]。 无论驱动细胞死亡的确切机制如何，我们都认为辐射诱导的DNA损伤是血管修剪的主要原因，并且强烈偏爱小血管，我们忽略了发育性血管网络中发现的灌注不足血管的优先消退[17,49]。
我们如[15]中那样定义灌注和灌注不足的血管（另请参阅实验程序的实验程序和数据预处理部分，以及模拟中最小差异流速的灌注阈值部分），并类似地使用灌注分数（PF）来量化网络灌注。灌注分数是灌注血管数与血管总数的比值，即：
(1)
灌注部分与时间有关，因为由于修剪，血管总数和灌注血管数量都会随时间变化（参见图 2 中的代表性示例）。对照射肿瘤的实验观察表明，血管修剪的时间尺度从几小时到几天不等[15,48,51]。 因此，我们专注于放疗后前四天的短期反应（图3）。我们将所研究的肿瘤从 1 编号到 7。首先，我们注意到，在所研究的肿瘤中，从照射（图 3 中的第 0 天）到观察到血管数量减少（血管修剪）的第一天之间的时间各不相同。虽然大多数肿瘤（1、2、3 和 4）在第 1 天表现出血管数量减少，但其他肿瘤（5 和 6）在此期间血管数量略有增加。我们进一步注意到，在放疗时，对于血管数量相对较少且（同时）平均血管直径较大的肿瘤，观察到了血管数量的延迟减少（见表1）。我们推测，这些肿瘤仍在进行广泛的血管生成，并且在放疗时尚未形成功能齐全的肿瘤微血管系统。
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图 2. 我们实验中的代表性血管结构[15]。
向肿瘤提供单剂量的 15 Gy X 射线，并在 4 天内监测其血管结构的变化（转载自 [50]）。在第一行中，内皮细胞呈青色，而灌注血管 （qDot705） 呈红色。每个面板都是 3D 图像的 2D 表示，以大约 300 μm 高的 Z 形堆栈的形式。单个 Z 切片的景深为 2 μm。中间和底行分别显示内皮细胞和灌注血管的黑白图像。比例尺对应于 100 μm。
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图 3. 放疗后的前四天（第 0 天是照射日）。
（A） 容器计数 N 的时间演变V（B） [15] 中研究的 7 种肿瘤的灌注分数。
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表 1. 第 0 天肿瘤脉管系统的关键几何和拓扑特征。
请注意，所有长度均以 μm 为单位，所有几何电阻（总电阻、平均电阻和每环路电阻）均以 μm 为单位?3，以及所有粘度在 cP?μm 的电阻?3，其中 cP（厘泊）是动态粘度的单位，等于 mPa?s）。
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我们还注意到，肿瘤 7 的血管计数在第 4 天（包括第 4 天）有所增加。该肿瘤的脉管系统每个大小的连接组件数量最多，并且其最大连接组件的大小在所有肿瘤中最小（参见 S1 附录中的表 A）。这些数据表明该肿瘤的图像处理存在问题，因此，我们将其排除在我们的分析之外。其次，血管数量减少的天数因肿瘤而异：对于某些肿瘤（1 和 3），减少仅持续一天，而对于其他肿瘤（2、4、5 和 6），减少持续两天。这种可变性可能是由于肿瘤微环境的复杂性和血管修剪时间尺度的不确定性。修剪阶段之后是血管数量显着增加的时期，可能是由于血管生成。基于上述观察结果，我们将肿瘤分为 A 组和 B 组，因此如果肿瘤的灌注分数在修剪阶段分别增加或减少，则肿瘤属于 A 组或 B 组，我们将其定义为从第 0 天到血管数量减少的最后一天的时期， 在血管生成开始之前。为了进行更定量的比较，我们还定义了修剪诱导的灌注差异及其相对对应物，如下所示：
(2)
如果 ，灌注增加，如果 减少。在表 2 中，我们总结了这些数量，并根据 PF 的相对变化（由 测量）对肿瘤进行排名。
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表 2. 第 0 天和修剪阶段最后一天的灌注分数、修剪诱导的灌注差异及其对 6 个研究肿瘤的相对对应物。
肿瘤的顺序是根据 PF 的相对变化（由 测量）。
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似乎可以通过肿瘤最初是否高度灌注来预测对放疗的反应。最初高度灌注的肿瘤（例如，4 和 6）往往在放疗后灌注受损，而最初灌注不足的肿瘤在放疗后灌注往往有所改善（例如，1 和 2）。然而，即使在我们的小型数据集中，我们也可以找到一个反例：肿瘤 5 在第 0 天经历了较低的灌注分数，而修剪后的值甚至更低。灌注部分的特定值（在实验的任何一天）预计将在很大程度上取决于入口容器的数量、位置和强度，而这些容器通常是未知的。然而，在没有此类信息的情况下，如果入口血管没有被修剪，仍然可以预测肿瘤脉管系统对放疗的灌注反应（通过灌注分数的相对变化来衡量）基于脉管系统的几何和拓扑特征在第 0 天（即，就在照射之前）。接下来，我们仔细研究第 0 天肿瘤脉管系统的关键特征与灌注反应之间的关系。
网络规模（船只数量）。
一般来说，血管网络的流动阻力随着血管数量的增加而增加。因此，人们可能会天真地期望，大型网络中的修剪血管应始终增加其灌注，因此，辐照应以与网络中血管数量成正比的速度改善灌注。我们的大多数网络都符合这一原则。然而，尽管肿瘤 4 具有较大的网络，但 PF 在照射后会降低（见表 1）。我们得出结论，仅靠血管计数不足以预测对放疗的灌注反应。
灌注的几何决定因素。
现在，我们考虑单个容器中流动阻力的几何决定因素。通常假设流经圆柱形容器的流速 Q 在其长度 L 上受到压降 Δp 的影响，满足 Poiseuille 定律：
(3)
其中 d 表示容器直径和μ伊芙是血液的有效粘度[23,52]。 该参数以非线性方式取决于血管直径和血细胞比容（参见[53]）。由于入口位置和强度的不确定性，对描述红细胞比容分裂的功能形式缺乏共识（这仍然是一个活跃的研究领域[23,54–56]），以及血细胞比容和血流的高度耦合和非线性性质，因此确定网络内的血细胞比容分布具有挑战性。因此，为了提高计算效率，我们在所有网络中施加了均匀的红细胞比容 H = 0.45（变化 H 的影响记录在 S1 附录的 S1.5 节中）。将该值代入[53]中获得的标准公式（参见方程（17）–（19）），我们得出了一个关系，描述了有效血液粘度如何取决于血管直径（也称为F?hr?us-Lindqvist效应）[57,58]。请注意，为了与现有的数学模型[53]保持一致，方程（17）–（19）中的所有长度尺度都是相对于1μm的无量纲。将这种关系代入方程（3），我们得到了长度为L和直径为d的容器中电阻的显式表达式。为了进一步简化，我们建议将商作为仅涉及关键几何参数的容器阻力的最简单代理。在网络尺度上，我们定义了以下网络总电阻度量：
(4)
其中总和是所有网络船舶 I.最后，我们定义了以下平均血管阻力的代理：
(5)
由于电阻对直径的四次方依赖性，我们预计网络中的平均容器直径将强烈影响其电阻。表 1 证实了这一点：平均直径较小的网络通常具有较高的平均电阻（和 ）。此外，平均直径和平均电阻似乎是放射治疗反应的良好预测因子：平均直径的低值（平均电阻的高值）对应于 A 组，反之亦然。我们注意到，平均长度和总阻力（忽略了网络大小，并且在修剪血管时减小）都无法区分两组肿瘤。总之，对于所研究的 6 个肿瘤，平均直径和平均阻力区分了两组，A 组的血管平均比 B 组更薄（更高阻力）。
灌注的拓扑决定因素。
我们使用贝蒂曲线[59,60]来跟踪放疗诱导的血管修剪过程中血管网络中的环数。 贝蒂数字β0和β1分别指网络中连接的组件数量和环路数量。通过欧拉-庞加莱公式[60,61]，网络的欧拉特征，由其边（容器）数N给出V和节点 NN，即 ，直接连接到其 Betti 数：。鉴于β0、NV和 NN、β1因此可以计算为 [60]：
(6)
要获得 β 的 Betti 曲线1，我们跟踪网络上整个修剪过程的循环数。
与上一节一样，我们还引入了按船舶数量归一化的指标，即：
(7)
我们从表1和表A（后者在S1附录中）中注意到β0、 和 β1不区分两组肿瘤（A 和 B），而（我们称之为每根血管环路）在两组之间提供了（弱）区别：每条血管环数较少的肿瘤属于 A 组。为了阐明为什么第 0 天每个血管的环路可能会影响灌注反应，我们使用方程 （6） 和 （7） 来写：
(8)
在下文中，我们考虑一个包含 N 的网络I/O/ST的1 级淋巴结（尚未吻合的血管生成芽的入口、出口和尖端）和 NB度数为 3 的节点（分岔点）。为简单起见，我们忽略了 2 级（细分为段的容器）、4 级（三叉）和更高的节点，因为这些节点很少出现在我们的网络中。然后我们有 NN = NI/O/ST的 + NB并且，通过遍历所有网络节点对船只进行两次计数，我们有 NV = (NI/O/ST的+ 3牛顿B)/2.利用这些关系，方程（8）可以简化为：
(9)
其中表示 Degree-1 节点的归一化数量。我们看到，小值是由大量度数为 1 的节点产生的，反之亦然。由于节点的程度与其连通性有关，因此与 1 度节点相邻的血管不太可能在网络灌注中发挥重要作用，因此修剪此类血管是可取的。此外，虽然其中一些是入口或出口节点，但大多数可能代表尚未吻合的血管生成芽（钝端）的尖端。因此，相关血管灌注不足。修剪这些芽只需减少方程（1）中的分母即可增加灌注分数，而修剪连接分叉点（度= 3）的容器可能会断开先前连接的网络部分。这在图 1 的左下角图中得到了证实：PF 增加的脉管系统（肿瘤 1;底部）在第 0 天包含更多的血管生成芽（即，相互连接较少，较低），而不是 PF 降低的脉管系统（肿瘤 6;顶部）。综上所述，这些结果为为什么低的肿瘤增加PF提供了可能的解释，反之亦然。
结合几何和拓扑的指标。
目前仍缺乏对网络灌注决定因素的充分认识。它需要更详细地了解网络内的直径和长度分布及其连通性。血液流变学的复杂性（非线性）使情况进一步复杂化。单个测量值（几何或拓扑）不太可能包含有关灌注分数的完整信息。为了评估放疗对灌注分数的影响，需要考虑从网络中修剪的高阻力和低阻力环的分布。为此，受上述观察的启发，我们现在提出了新的指标，将网络拓扑与其几何属性相结合，形式如下：
(10)
表 1 显示，这些指标可以区分两组肿瘤（特别是 ，这解释了粘度对血管直径的依赖性）。据我们所知，这些是第一个将血管网络的几何形状和拓扑结构相结合的全球指标。
综上所述，我们的分析表明，含有大量高阻力血管和血管生成芽的网络可能会在放疗后增加其PF。换句话说，我们假设辐照诱导的血管修剪将增加包含大量薄端和钝端血管的血管网络的PF - 我们接下来将使用合成网络来测试这一假设。
模型概述
我们对实验的分析表明，血管结构影响了修剪的结果：平均血管直径（）较低且每根血管环（）较少的肿瘤在照射时表现出灌注（）的增加。然后，我们使用我们的计算模型来更好地了解血管网络的结构特性与其放疗后灌注变化之间的因果关系（图 4）。简而言之，我们构建了多个网络来复制生物数据集所表现出的感兴趣的特征（和）。然后，我们模拟了通过网络的血流，并测量了连续修剪血管时灌注的变化。该模型的设计详见下文，参数见 S1 附录的 S1.8 节。
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图 4. 总结模型组件的流程图。
使用Microvessel Chaste进行模拟[62,63]。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252.g004
网络设计
我们使用分叉和六边形网络分别表示分层和非分层脉管系统（表 3）。然后，我们模拟了通过网络的血流。使用简单的对称几何形状可以让我们隔离所考虑的不同几何和拓扑因素（例如，容器直径、长度和网络环路）的影响。虽然网络的几何形状很简单，但它们反映了生物脉管系统的几个特性。在这里，我们描述了分叉网络，因为它们构成了我们结果的焦点。六边形网络的设计可以在 S1 附录的 S1.3 节中找到。在分叉网络中，每个容器分为两个子容器，直到产生 7 代（将入口容器计为第 0 代）。在第七代（第六代）之后，网络对称地融合到一个出口容器中。改变世代数的影响记录在 S1.6 附录的 S1.6 节中。请注意，在整个工作中，为简单起见，我们将任何直线段视为一个单独的容器（而不是通过其两个端点即分叉节点、入口、出口或钝端来定义容器）。
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表 3. 分层网络和非分层网络中的异质性都由单个参数调制。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252.t003
容器尺寸。
两个子容器的直径（d一个和 dB） 与母体血管的直径 （d父母）通过默里定律[64]：
(11)
因此，进气口直径d入口调节所有后续血管的厚度。根据 [23]，我们假设容器长度 L 与容器直径 （d） 成正比，因此：
(12)
根据实验数据中的平均血管长度与平均直径的比值，我们固定 λ = 4。分岔处的分支角度由其组成血管的 y 范围决定。第 i 代≥ 1 中容器的 y 范围是其投影到 y 轴 （V 我）对网络的空间范围施加以下限制[23]：
(13)
我们设置 V1= 0.9升1我们的模拟允许网络沿 y 轴延伸到足够程度，符合 [23]。如果我们进一步规定任何母船的两个子船必须具有相同的直径（d一个 = dB），则完全指定网络几何。这构成了我们的参考网络（图 5）。我们的参考网络必须进行修改，以反映生物网络中感兴趣的属性（和）。因此，我们抵消了合成网络的平均血管直径，以匹配在生物脉管系统中观察到的最小值、最大值和平均值（有关我们如何这样做的详细信息，请参见 S1 附录的 S1.2 节）。在我们的直径变化中，所有容器长度和分支角度都与参考网络相同。因此，方程（12）不适用于这些情况。的变化不会导致网络内的变化。因此，我们在修剪分叉网络时进行了跟踪，并测量了灌注的相应变化。实际上，我们认为每一次船只移除都是生成具有不同 .
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图 5. 血液从左向右流经分叉网络中的单个入口和单个出口。
L我和 V我分别表示第 I 代中容器的长度和 y 范围。请注意，我们对网络异构性的实现导致网络顶部的容器在其生成过程中最厚，而底部的容器最薄。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252.g005
网络异构性。
为了确保网络中的异质直径，我们固定了两个子容器之一的直径（d一个） 在每个分叉处比另一个分岔 （d ） 厚 α 倍 （α > 1）B):
(14)
在均质情况下 （α = 1.0），两个子血管具有相同的直径。任何一代的容器直径都可以计算为：
(15)
其中 d我是第 I 代中容器在具有 n 的路径上的直径厚源自直径为 D 的入口容器的厚容器入口.由于路径上粗血管和薄血管的每种排列都存在于网络中，因此在每个分叉处，哪个子容器的厚度比另一个子容器厚 α 倍没有区别。我们选择从分叉向上延伸的容器比下部容器更厚。因此，网络顶部的血管是其生成过程中最厚的，而底部的血管是最薄的（图5）。
修剪
放疗优先修剪较小的血管，修剪程度随剂量的增加而增加[14,15]。 因此，我们通过按直径增加的顺序单独移除血管来模拟剂量的增加幅度（图 6）。回想一下，常数 λ 决定了分叉网络中容器长度和直径之间的比率。因此，按直径修剪也可以有效地按长度修剪，但提供的数据点比分叉网络中存在的 7 个不同长度更多。一次去除一个容器使我们能够以比实验获得的更大的时间分辨率来检查修剪。如果两个容器的直径相同，则按照其容器 ID 的顺序修剪容器，详见 S1 附录的 S1.2 节。同时修剪多个直径相等的血管的效果记录在S1附录的S1.7节中。由于缺乏层次结构，孤立的血管在修剪过程中可能会保留在六边形网络中。请注意，我们的模型只能用于在相对较短的时间尺度上模拟单剂量放疗的效果，因为在数周内进行分次放疗的可靠模型需要考虑显着的血管生成生长和血管重塑。
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图 6. 修剪的一个例子。
对分叉网络架构的更改，因为 （A） 0 个容器、（B） 50 个容器、（C） 100 个容器和 （D） 200 个容器被修剪。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252.g006
灌注阈值
我们不是根据荧光来识别血管是否灌注，而是直接跟踪流量并引入灌注阈值（Q最小值）作为最小流速，等于或高于哪些血管被认为是灌注，低于哪个血管被认为是“灌注不足”。该阈值代表了我们的实验设备可以检测来自灌注血管的信号的灵敏度。在分叉网络中，我们设置这个阈值的值 Q最小值成为 3 × 10?12m3s?1对于默认模型参数和最小异构网络 （α = 1.0） 的三种偏移方案，其初始 PF 为 0.24（最小值）、0.50（平均值）和 1.00（最大值）。通过这种方式，我们涵盖了几乎跨越整个区间 （0， 1） 的大范围初始 PF，这在真实脉管系统中也观察到（初始 PF 范围从 0.14 到 0.97）。同样，我们将 Q最小值= 3 × 10?13m3s?1对于六边形网络。该值使我们能够覆盖足够大范围的初始 PF。
灌注分数
我们使用实验公式（方程（1））计算PF。在方程（2）的指导下，我们通过引入修剪过程中达到的最大值和PF的最大百分比变化来量化合成网络灌注的改进，其中：
(16)
在方程（16）中，分别表示修剪过程中PF的初始值和最大值。
结果
根据我们对实际肿瘤的分析，我们发现我们的合成血管网络中PF的最大增加与较低的值和有关。此外，我们确定了两种可以影响照射后灌注积极变化的机制。体内发生的血管重塑使得很难分离每种机制的影响。相比之下，合成网络没有这样的分析障碍。我们将在以下小节中详细介绍我们从这些模拟网络中得出的推论。
虽然我们的分叉网络本质上是分层的，但在失调的肿瘤血管系统中可能不存在相同（高）水平的秩序。为了深入了解层次结构所起的作用，我们还研究了建模为六边形网络的非分层结构的影响以及直径异质性的影响。我们发现层次有利于灌注增强，异质性导致反应增加和持续。有关完整讨论，请参阅 S1 附录的 S1.4 节。
两种机制可以增加照射后的灌注分数
从方程（1）可以推断出，灌注分数（）不仅在修剪后灌注血管数量增加时会增加，而且如果灌注不足的血管数量减少，灌注分数（）也会增加（图7）。我们得出结论，两种机制可以增加修剪灌注不足的血管时的价值：
机制 1：当血管被修剪时，血流可能会改变路线，导致一个或多个灌注不足的血管被灌注并增加灌注血管的数量（图 8）。
机制 2：去除灌注不足的血管会增加灌注血管的比例，但不会增加灌注血管的数量。
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图 7. 增加的两种机制。
当分叉网络 （α = 1.1， μm） 被修剪时，当血流从修剪的血管重新路由到其他血管时，灌注 （） 可以通过机制 I 增加，如 （B） 所示，其中灌注血管的数量增加，灌注不足的血管数量减少。相反，灌注（）也可以增加，如（A）所示，当修剪灌注不足的血管时，灌注（）也可以通过机制II增加，灌注血管的数量没有任何净增加，如（B）所示，灌注血管的数量恒定。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252.g007
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图 8. 流量重新路由。
当在（A）和（B）之间修剪单个容器（标有星号的原始位置）并且流速在四个灌注不足的容器（蓝色）中流速增加到灌注的程度（红色）时，在分叉网络（α = 1.1，μm）的这一部分中重新路由流量。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252.g008
图 9 显示了这两种机制在修剪过程中如何作用于网络。在原始的、未修剪的网络中，一些灌注不足的血管的血流率接近灌注阈值，而其他血管的血流率远低于灌注阈值。当灌注最少的血管被修剪时，它们的流量被重新路由，其余血管（其中几个以前灌注不足）中的流速增加到灌注阈值以上。仅低灌注血管数量的减少就相当于放疗后网络变得更加有效。然而，这并不一定对应于氧气分布的改善。
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图 9. 分析灌注反应。
图（A）显示了单个分叉网络（α = 1.2，μ m）的灌注响应。 考虑到该网络的中心部分，图（B）–（G）显示了修剪过程中流动分布的进展，并指出颜色图的最大值设置为等于灌注阈值（即，非深红色的血管灌注不足）。修剪 （B） 20 个最薄的血管后，该网络包含成对的子血管，这些子血管的流速略低于灌注阈值 （Q最小值= 3 × 10?12m3s?1).修剪这样一对血管中的一个血管不仅可能导致 （C） 灌注不足的血管减少，而且由于流动改道，灌注血管也更多。在 （D） 和 （E） 之间以及 （F） 和 （G） 之间，我们主要修剪钝端，这通过机制 2 增加了灌注分数 （）。在 （E） 和 （F） 之间，由于灌注路径被破坏，因此急剧减少。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252.g009
平均血管直径决定了两种灌注改善机制的相对贡献
在确定了两种可以增加灌注分数的机制后，我们接下来研究了未修剪网络中的平均血管直径 （） 如何影响灌注分数 （） 的百分比变化。与生物实验一样，我们发现较低的值会产生较大的增加和较高的值（图10）。然而，我们还研究了隔离中的两种改善机制，发现较高的值有利于流动重新路由，而较低的值倾向于通过机制 2 改善。
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图 10. 平均直径和直径异质性对灌注响应的影响。
系列图（A-I）显示了分叉网络的平均直径（）和未修剪网络的直径异质性（α）对修剪过程中灌注（）变化的影响。灌注血管数量的增加是血流被改道进入先前灌注不足的血管的证据。灌注血管的增加而没有增加是机制 2 的证据。机制 1 主要处于活动状态的区域以灰色突出显示。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252.g010
低会导致增加，原因有两个。首先，较薄的网络比较厚的网络具有更低的起始灌注分数（）（图11）。因此，相对于网络的初始 . 在较薄的网络中较低，因为它们对血流的阻力更大（图 12）。其次，较薄的网络具有更大比例的灌注不足的血管，可以在修剪任何灌注血管之前对其进行修剪。在这些网络中，由于仅修剪灌注不足的血管，可以增加更大的交易。
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图 11. 灌注反应由下式测量。
初始灌注分数 （） 取决于血管结构 （A-C）。请注意，对于给定的直径异质性 （α），所有平均直径 （） 的灌注分数 （） 在修剪的后期阶段收敛，此时网络仅包含较厚（低阻力）的血管。图 （D） 显示了 for α = 1.2（147 个修剪容器）的所有值共有的阶段的修剪结构。在这里，我们观察到所有剩余的血管要么被灌注，要么有钝端（没有流动）。在灌注不足的血管中不会发生血流改道。因此，后续的修剪会产生相同的变化，而不管初始 .请注意，容器颜色表示局部流速，调整颜色条的范围，使灌注容器为深红色，而流量很少或没有流量的容器为深蓝色。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252.g011
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图 12. 网络阻力。
由于血管电导率取决于平均网径的四次方（参见方程（3）），因此无论α（A-C）如何，较薄的分叉网对血流的阻力（）都要大得多。 在修剪过程中单调减少，因为血管按直径增加的顺序被移除。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252.g012
另一方面，高血管结构更容易受到血流改道增加的影响（图 10）。对于这些结构，修剪（灌注不足）血管中的流速更接近灌注阈值。因此，这些血管需要较小的血液供应增加（通过改变路线）才能将它们变成灌注血管。一旦修剪开始，这些血管对血液的抵抗力也会降低，血液会重新进入其中。
袢比例的下降先于灌注的增加
到目前为止，我们已经比较了在初始未修剪架构方面有所不同的网络。由于修剪会产生钝端（从而改变环路的数量，如灌注的拓扑决定因素一节中所述），修剪后的网络可以作为最初包含不同比例的血管生成芽的网络的代理。将每个容器的环数 （） 与灌注分数的变化 （） 进行对比，我们观察到两个不同的结果（图 13）。
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图 13. 循环的比例。
每个容器的环数 （） 下降先于叉网络 （μm） 中灌注分数 （） 在所有α值 （A–C） 中的正变化。异质性之间会出现细微的差异，因为α通过改变血管的直径来改变修剪的顺序。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252.g013
在修剪的早期阶段（较少辐射诱导的细胞死亡），通常无论 .在这个阶段，修剪会去除最薄的血管，这些血管往往构成灌注不足的环或钝端。因此，通过两种改进机制增加。然而，在修剪的后期阶段（更多的辐射诱导的细胞死亡），中的峰值和谷值与 中的峰值和谷值相对应。特别是，减少 通常先于 增加 。当修剪分隔两个环路的容器时，环路合并为一个环路，环路总数减少。在修剪的血管部位，可能会产生钝端。随后的修剪有利于去除这个钝端，因为它的直径很小，因为它以前连接到最小的血管（回想一下默里定律，方程（11））。修剪钝端容器不会改变环的总数。然而，它增加了环 （） 的比例，并且由此导致的灌注不足血管计数的减少导致 .因此，减少表明网络现在包含更大比例的钝端（反之亦然）。因此，我们发现当具有低值 的网络被修剪时，它会增加。我们还推断，这表明何时看到的改善是由修剪没有流动的钝端血管引起的，而不是通过重新布道引起的。
讨论
在本文中，我们使用计算模型来研究血管结构对辐射诱导修剪结果的影响。根据[15]，我们根据PF定义的整体网络灌注来衡量这些结局（方程（1））。在我们的实验数据中，我们发现灌注通常在平均直径较低 （） 和每根血管环较少 （） 的血管网络中得到改善。在排除血管生成的模型中，在切除血管后，网络灌注增加似乎有悖常理。然而，我们的合成网络反映了我们对实验数据的观察。我们通过假设修剪从最小到最大直径的血管进行来模拟放射治疗的影响。使用我们的计算机模型，我们阐明了灌注反应的机制，包括 PF 改善的两种机制。我们还表明，不同的架构特征容易受到PF中不同改进机制的影响。特别是，我们发现平均直径较低的网络往往通过减少灌注不足的血管来改善PF，而平均直径较大的网络更容易改变路线（参见平均血管直径部分决定了两种灌注改善机制的相对贡献）。在前者中，大剂量的放疗（即修剪更多的血管）似乎可以改善PF，而在后者中，使用较小剂量的放疗似乎会发生改道（图10）。
因此，我们的模型代表了理解文献中发现的不同灌注反应的第一步，一些研究报道了辐照后灌注增加，而另一些则没有[19]。此外，我们对PF改善的不同机制的阐述可以解释为什么Bussink等[22]观察到肿瘤灌注增加后减少。Bussink等人将灌注的增加归因于血液的重新分布和以前无功能的血管的重新填充（与我们的模型预测一致）。
虽然我们不知道任何放射治疗诱导修剪的实验性计算模型，但一些研究已经模拟了由于低壁剪切应力导致的血管修剪效果。例如，在对血管生成进行建模时，Owen等人发现，灌注不良的血管往往会被修剪，而新的血管是通过“窃取”其他血管的血流而形成的[26]。尽管我们按照增加血管直径的顺序修剪了合成网络，但我们注意到最薄的血管可能具有最低的血流量。此外，我们的模型还表现出流动重新路由，以前灌注不足的血管在血管修剪后变得灌注。Stéphanou等人基于流速模拟血管修剪，以研究药物摄取率[65]。随机修剪血管有时会改善血流改道，并增加药物摄取[65]。另一方面，修剪低流量血管并不能改善药物摄取，但随着钝端血管的去除，可以提高药物的递送速度[65]。在我们的研究中，去除钝端也不太可能导致氧合的改善，尽管将进行全面研究是为了未来的工作。
实验意义
我们的研究结果对用于研究辐射诱导修剪的实验方法也有一些启示。首先，我们在“两种机制可以增加照射后灌注分数”部分的结果表明，PF不是肿瘤灌注的理想指标，因为它无法解释修剪的灌注不足的血管。此外，PF 没有迹象表明血管网络在组织中充分输送氧气的能力。从理论上讲，一个区域可能具有单个灌注血管，PF 为 1，尽管该血管可能没有覆盖足够的面积或携带足够的红细胞来维持常氧环境。通过实验，Bussink等人发现灌注和缺氧之间存在差异[22]。仅监测PF并不能告诉我们在修剪过程中哪种机制（如两种机制可以增加辐照后的灌注分数一节所述）。辨别机制很重要，因为它告诉我们剩余血管中的血流是否得到改善。未来的实验可用于验证该模型的发现。例如，如果血管网络的平均直径较低且每根血管的环数较低，则我们的研究表明，该网络在照射后可能会显示出灌注的改善。为了避免使用灌注分数指标的缺陷，将流量测量为总血流率或常氧氧张力下的组织面积会很有用。
在灌注增加之前环路比例下降一节中，我们表明每个血管的环数可以通过减少灌注不足的血管来改善 PF。在表 1 中，我们根据固定日期将生物肿瘤分为 A 组和 B 组。然而，在我们的模拟中，非单调响应意味着这种分类受采样点的影响（表4）。换句话说，一个网络属于A组或B组，这取决于从中修剪的血管数量。有趣的是，对于任何固定α，平均直径越低，人们就越经常观察到PF的增加。
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表 4. 分叉网络分为 A 组和 B 组的分类因采样点而异，即测量时修剪了多少容器。
单元格已阴影为绿色或红色，表示 的正值或负值。
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我们还计算了分叉网络的复合度量，该度量在结合几何和拓扑的度量部分中讨论：每个环路的电阻。正如方程（10）所预期的那样，在修剪过程中，的趋势与修剪的趋势相反（图13和图14）。然而，它也对平均直径的信息进行编码（通过电阻），从而使我们能够区分不同平均直径的网络。与真实脉管系统一致，我们观察到最初较高的网络表现出更大的灌注改善潜力，测量如下（与图 10 相比）。这导致我们提出未来研究的指标作为灌注改善的预测指标，尤其是在单独给出相互矛盾的预测时很有用。例如，这可能与具有低平均直径和大比例环的脉管系统有关，即使这种特征组合并未发生在这里研究的小肿瘤样本中。这些猜测需要通过未来的工作来证实，并且还必须辨别改进的机制。
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图 14. 每个回路的电阻。
对于所有α值 （A–C），每个环路 （） 的阻力遵循与观察到的每容器环路 （） 的趋势相反，但也可以区分不同平均直径的网络。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252.g014
虽然这项研究的重点是对增强灌注的机制见解，但我们注意到，我们模型的临床意义受到当前血管成像技术的限制。高分辨率方法，如本研究中使用的多光子显微镜，被限制在大约1 mm的穿透深度，需要使用窗室[66]。在临床环境中，血管化肿瘤可能位于该深度以下。另一方面，MRI和CT等技术以前曾用于研究人类的血管功能，但仅限于100微米的分辨率，而我们的模型显示，血流的重定向在较小的血管中很普遍[67]。因此，我们从合成网络中做出的预测需要临床成像技术取得长足的进步，然后才能评估其对人类的预后价值。
今后的工作
在这项工作中，我们使用分叉和六边形网络来说明层次结构在血管结构中的作用。然而，这两种网络类型都是规则的（即对称的），可能无法充分代表失调的肿瘤脉管系统的所有特征。下一步，应该考虑不规则网络，例如由平面区域的Voronoi镶嵌产生的网络[68,69]。 此外，已知肿瘤脉管系统包含许多渗漏和曲折的血管，这些血管也需要在模型中加以考虑。
我们在血流比容（由红细胞组成的血液部分）均匀分布在所有血管中的假设下进行了血流模拟。然而，在现实中，红细胞比容在血管交界处的扩散更为复杂。每个血管中的红细胞比容会影响其流速（方程（17））以及其携带氧气的能力。此外，我们的同事假设，用更大比例的小血管照射肿瘤可能更有可能通过改变红细胞比容分裂的比例来改善灌注[15]。因此，对比文献中不同的红细胞比容分裂规则非常重要[23,70,71]。不同的分裂规则会在组织中产生不同的氧气分布。这些分布是标准肿瘤治疗（如化疗）疗效的关键决定因素，化疗也可以在Microvessel Chaste中建模[62,63]作为化学运输过程。 放疗或化疗引起的肿瘤细胞死亡会降低净耗氧量，从而进一步增加组织氧水平。纳入与活组织细胞局部密度成正比的耗氧量项将是组织氧灌注精确建模的重要下一步。我们已经强调，PF 是描述组织氧合状态的不精确指标。一旦我们明确地模拟了氧气扩散，我们将需要采用和开发新的空间指标来更好地描述氧气的扩散。有了氧合模型，我们将考虑脉管系统灌注的组织的动态性质。构成组织的细胞将具有不同的摄取率，并且会根据它们可用的氧气量分裂和死亡。
如果发现血管直径与其修剪概率之间存在可靠的关系，并且可以修改修剪规则以反映该区域缺氧时的辐射电阻，也可以随机进行修剪。让我们注意到，现有的模型也可以进行调整，以更好地表示在发育性血管网络中观察到的灌注不足的血管的消退，方法是按增加流速的顺序修剪血管[17,49]。由于脉管系统本身也是动态的，未来的模型必须考虑结构适应和血管生成因子的分泌。肿瘤血管生成的随机萌发模型可能有用[72]。渗流模型也可以很好地表示肿瘤中发现的无血管空间的统计分布[73]。此外，渗流模型已被用于复制小鼠肿瘤异种移植物中观察到的氧合条件[73]。此类研究还可能涉及修改血细胞比容分裂规则以包括更高阶分裂，因为肿瘤脉管系统不仅限于分叉[23]。
最后，我们可以利用我们从合成网络中获得的见解，并将其应用于通过[35]中概述的方法获得的真实生物网络。如果可以识别具有适当边界条件的入口和出口血管，我们就可以在图像衍生网络中模拟血流和血管修剪。然而，由于与单个肿瘤细胞系相关的实验数据集相对较小，这项研究的影响仍然有限。因此，这项工作中确定的趋势将需要使用不同的癌症和生物学模型进行测试。
材料和方法
实验程序和数据预处理
道德声明。
如前所述，所有动物实验均根据经修订的《1986年英国动物（科学程序）法》（2012年修订条例[SI 2012/3039]）进行，在英国内政部项目许可证（PPL 30/2922和PCDCAFDE0）的授权下进行，并获得牛津大学动物福利和伦理审查小组的当地伦理批准[15]。
实验程序。
腹部影像学窗植入术。该过程基于先前描述的方法[74]。在手术单元中制备在C57Bl/6背景的内皮细胞中表达荧光蛋白tdTomato的转基因小鼠，并给予吸入麻醉和术前镇痛药。在整个手术过程中监测体温和呼吸频率。沿着胸骨下方约 5 毫米的腹部中线切开 1 厘米的切口，然后在切口周围进行钝性解剖，将结缔组织与皮肤分开。在皮肤下安装了定制的成像窗框（牛津大学肿瘤学系的工作室）。使用连续缝合线将皮肤固定在窗框上。约 2.5 × 105将 MC38 细胞（小鼠结肠腺癌细胞）稳定表达 eGFP 的 5 μL 中，含有 30% 的基质胶和 10% 的 Evan 蓝色染料，注射到结缔组织下方和腹部肌肉层上方。然后用水冲洗腔室，通过渗透冲击裂解未注射的细胞，用无菌棉签擦干并用生理盐水淹没。粘在房间盖上的盖玻片被固定在窗框上。然后将动物放在热垫上进行术后恢复，并通过目视检查监测它们的健康和肿瘤生长。
治疗方案。肿瘤约为 100 毫米的动物3在窗室中生长的植物进行了放射治疗。在放射治疗之前，用异氟烷吸入麻醉小鼠，并将其置于成像引导的小动物辐射研究平台（SARRP）辐照器（Xstrahl Ltd）中。获得每只小鼠的锥形束 CT 扫描（计算机断层扫描），并使用 Muriplan （Xstrahl Ltd） 计划治疗。SARRP 用于以每分钟 2 Gy 的速度向肿瘤提供 15 Gy 的 X 射线（220 kVp 铜滤光束，HVL 为 0.93 mmCu）。照射器的剂量测定如前所述[75]。我们将治疗的开始称为第 0 天。
活体双光子成像。在放射治疗后用配备呼吸监测系统的蔡司LSM 880显微镜对小鼠进行7天成像。舞台和气氛被加热到37°C。 为了标记灌注血管，使用电动泵以 0.84 μL?min 的速率静脉输注 Qtracker705 血管标记物（0.2 μM，ThermoFisher Scientific）?1.使用调谐到 920 nm 的锁模 MaiTai 激光器同时激发 eGFP、tdTomato 和 Qtracker705。Qtracker705 信号通过带有非去扫描检测器的 BP700/100 滤波器采集。GaAsP检测器用于采集BP 650/45滤波器选择的tdTomato信号和BP525/50滤波器选择的eGFP信号。在Z-stack瓦片扫描中获取图像，像素大小为0.823 μm，每个瓦片的图像大小分别为512×512×x、y和z。使用用于UV-VIS-IR透射的水浸20×物镜，数值孔径为1.0。图2显示了我们实验中血管网络的代表性示例。
数据预处理。
生物网络是通过多光子活体3D成像获得的[76]，由肿瘤血管图像的3D堆栈组成。通过结合两个分割模型并取它们的几何平均值，从成像数据中提取骨架文件。然后对骷髅进行修剪（完整描述见参考文献[77]，第165页）。我们使用 Python 代码包 unet-core [78] 中 unet_core.vessel_analysis 中的 VesselTree 方法从骨架文件中提取血管网络。提取的网络由代表网络节点的容器分支上的点（每个容器分支的多个点，包括分支点）和连接它们的容器组成，这些容器构成了网络的边缘。VesselTree还使我们能够提取网络特征，例如容器直径和长度。
模拟方法
血流。
我们假设长度为 L 且直径为 d 的血管中的血流速率 Q 由 Poiseuille 定律（方程 （3））确定。根据[23,53]，式（3）中的有效血液粘度表示为：
(17)
其中 H 是分泌物红细胞比容，d 是血管直径，μp是等离子体的粘度，
(18)
和：
(19)
如灌注的几何决定因素一节所述，我们假设血细胞比容在网络内均匀分布（H = H 入口= 0.45），则产生线性流动问题。带符号流速 Q我对于每个血管 I（即连接到节点的每个边缘），我们还在每个网络分叉节点处施加血液守恒：
(20)
在每个（未修剪的）网络中，最左边的节点用作入口，所有其他具有一个分离节点的容器用作出口。为入口节点分配压力（p入口） 为 3333 Pa （≈ 25 mmHg），而出口节点被分配压力 （p出口）为2000Pa（≈15mmHg）[79]。
软件开发和后期处理。
我们使用 Microvessel Chaste（3.4.3 版）进行模拟，它是开源模拟包 Chaste（2020.1 版）[62， 63] 的附加组件。我们在 Microvessel Chaste 的基本版本中添加了自定义功能，包括新的网络生成器和修剪功能。我们生成了上面详述的合成网络，并按照增加血管直径的顺序逐个容器修剪它们。在每个修剪步骤中，我们更新了流速分布，并以 .vtk 格式导出灌注部分和网络本身，考虑了所有尚未修剪的容器。我们使用 Python 脚本从 .vtk 文件生成按容器直径和容器长度加权的邻接矩阵，从中我们计算了关键的几何指标，例如平均直径和平均几何阻力。基于MATLAB软件包[80]，我们编写了Python脚本，从上面导入邻接矩阵，使用方程（6）计算每个修剪阶段的环数和每个容器的环数，最后将平均阻力除以后者。
支持信息
第 S1.1-S1.8 节“暴露于放疗后的增强灌注：理论研究”。
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放疗暴露后灌注增强：a理论研究S1 附录雅各布·科里1,2一个?韦当纳兰2一个伯纳黛特·斯托尔茨2,3雅各布·卡普勒4博斯蒂安·马克尔茨4,5露丝·穆舍尔（Ruth J.Muschel）4菲利普·迈尼2乔·皮特-弗朗西斯6海伦·伯恩21格拉斯哥大学数学与统计学院，英国格拉斯哥2牛津大学数学研究所，英国牛津3拓扑学与神经科学实验室，?洛桑理工学院 F ?ed ?erale de Lausanne，瑞士洛桑4英国癌症研究中心和MRC牛津放射肿瘤学研究所，系英国牛津大学肿瘤学5卢布尔雅那肿瘤研究所肿瘤学系，卢布尔雅那，斯洛文尼亚6牛津大学计算机科学系，英国牛津一个同样贡献的作者?通讯作者 jakub.koery@glasgow.ac.uk2月 3， 2024S1.1 以数量和大小衡量的数据可靠性连接的组件数量如本节所述了解对放疗的灌注反应及其决定因素在主体中，肿瘤脉管系统 7 的血管数量在前四天增加照射后。表 A 记录了该脉管系统相对于网络大小具有极大量连接组件 （CC） 和极小的最大连接组件，表示图像处理方面的问题，这就是为什么该肿瘤被排除在后续分析之外的原因。表 A：与连接组件的数量和尺寸相关的统计数据表明存在以下问题：肿瘤编号 7 的图像采集。第 0 天的肿瘤统计1234567船舶数量（网络规模）1000408710382175644528436CC 数量β010 秒18417310 秒8286184每种尺寸的 CC 数量β00.300.050.170.140.130.160.42最大 CC 的大小1683467317136533835359每个尺寸的最大 CC 的大小0.170.850.310.630.520.670.141
S1.2 安装分叉网络并分配船舶 IDS1.2.1 调整血管直径以匹配实际血管的汇总统计量拉图尔在整个工作过程中，我们将世代数固定为 7 代，以便容器直径跨度足够大范围大。为了产生显著的代内直径异质性，我们考虑了三个值α，即 1.1, 1.2 和 1.3.考虑最小和最大α、手段和标准直径分布的偏差位于实际汇总统计量所划定的范围内当且仅当入口直径大致在 80 范围内时，脉管系统?100μm（见图 A）。取入口图A：Murray定律中直径分布的均值（蓝色）和标准差（红色）分叉网络7容器的代数与入口直径 （d默里入口） 代表 （A）α= 1.1及 （B）α= 1.3.彩色区域描绘了均值（青色）和标准偏差（洋红色）的范围在真实脉管系统中发现的直径分布。直径为90μm，图 B 中的顶部面板显示了记录直径分布的条形图不同α，而底部面板详细说明了直径在各个世代中的分布情况。请注意，从图 A 和 B 中可以看出，两者都增加了固定的入口直径α并增加α用于固定入口图 B：参数α决定了默里定律分叉网络的直径分布。这生成的分布以 （A-C） 直方图和 （D-F） 群图的形式描述，其中血管属于同一代人的颜色相同。直径导致标准偏差增加。然而，这两种方法也会产生改变的均值2
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S1 附录。 第 S1.1-S1.8 节“暴露于放疗后的增强灌注：理论研究”。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011252.s001
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确认
HMB和PKM感谢剑桥大学艾萨克·牛顿数学科学研究所在“运动数学”课程期间的支持和款待，为完成本文所做的工作奠定了基础。
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