免费医学论文发表 -大肠杆菌代谢、基因表达和应激反应的统一计算框架
抽象
通才微生物通过其综合应激反应系统适应了多种环境压力。个体应激反应已通过 E 量化。大肠杆菌代谢和表达（ME）模型分别在热应激、氧化胁迫和酸胁迫下。然而，仍然缺乏对这些应激反应之间的交叉应力和串扰的系统量化。在这里，我们提出了 StressME：E 的统一应激反应模型。大肠杆菌结合了热 （FoldME）、氧化 （OxidizeME） 和酸 （AcidifyME） 应激反应。StressME 是最新的 E ME 模型。大肠杆菌，它再现了所有已发表的单应激ME模型。此外，它还包括精细的速率常数，以提高野生型和应激进化菌株的预测准确性。StressME揭示了与交叉应激和串扰反应相关的某些最佳蛋白质组分配策略。这些应激最佳蛋白质组是通过保护酶与代谢酶之间的权衡形成的;细胞质与周质伴侣;以及应激特异性蛋白的表达。由于 StressME 经过调整，可以计算温和酸、氧化和热应激下的代谢和基因表达反应，因此它可用于工程和健康应用。我们的开源软件包的模块化设计也促进了计算生物学社区的模型扩展（例如，扩展到新的应力机制）。
作者摘要
对 E 中多应力适应的基本理解。大肠杆菌具有潜在的工业相关性。而个体应激反应已通过 E 中的蛋白质调节网络进行量化。大肠杆菌，仍然缺乏对压力反应之间的交叉压力和串扰的系统量化。在这里，我们开发了一种新的建模管道，通过该管道，热应激，氧化和酸应激反应可以相互耦合，并且可以量化由于交叉应激和串扰引起的代谢活动，蛋白质和代谢通量重新分布。我们优化了积分模型中的有效速率常数。然后，我们通过在单应力下对已发表的数据进行验证来确认模型的鲁棒性。最后，我们使用该模型来表征保护蛋白和催化蛋白之间以及存在于不同细胞区室中的伴侣之间的交叉适应。我们通过调整 E 发现了有效的交叉保护来防止交叉应力。大肠杆菌细胞首先受到热应激。我们还通过权衡表明串扰的存在，通过权衡，细胞可能拒绝放弃更多的蛋白质分配，远离一种应激反应到另一种应激反应，因为这样做会进一步降低应激耐受性。单应力插件设计使模型构建管道具有灵活性和可扩展性，允许将更多应力源合并到工业应用的模型架构中。
数字
Fig 12图1图2图3图4图5图6图7Fig 8Fig 9Fig 10Fig 11Table 1图12图1图2图3
引文： Zhao J， Chen K， Palsson BO， Yang L （2024） StressME：大肠杆菌代谢、基因表达和应激反应的统一计算框架。PLoS 计算生物学 20（2）： 编号：E1011865。 https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865
编辑 器： Arturo Medrano-Soto，加州大学圣地亚哥分校，美国
收到： 2023年7月17日;接受： 2024年1月28日;发表： 2月 12， 2024
版权所有： ? 2024 Zhao et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 作者确认，这些发现所依据的所有数据都是完全可用的，不受限制。所有相关数据都在论文、其支持信息文件、Github （https://github.com/QCSB/StressME） 和 Docker Hub （https://hub.docker.com/r/queensysbio/stressme/tags） 中。
资金： 这项工作得到了美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所的支持，R01GM057089 BOP 和 LY、加拿大自然科学与工程研究委员会 （NSERC） [RGPIN-2020-06325]、加拿大政府通过加拿大基因组和安大略基因组学 （OGI-207）、安大略省政府通过安大略研究基金 （ORF）， 和女王大学到LY。这项研究在一定程度上得到了先进计算中心（皇后大学）、安大略省计算（computeontario.ca）和加拿大数字研究联盟（alliancecan.ca）对LY的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
波动环境中的微生物通过将单个压力检测和响应系统组合成一个集成网络来适应环境变化。为了更好地理解微生物如何抵抗环境压力，许多工作都集中在生理和分子水平上单一压力反应的复杂机制上。
在这些研究中，E.大肠杆菌是一种优良的模式细菌，因为全基因组测序已经完成，并且已经表征了单一应激反应的基因组结构和功能。已经发现 E.大肠杆菌细胞可以通过过表达蛋氨酸相关基因metK和mmuP，并使应激相关基因bolA失活来抵抗渗透应激[1]。为了在饥饿应激中生存，RpoS 调节基因在 E 中表达的水平。葡萄糖饥饿时大肠杆菌水平增加，但氨饥饿时RpoS水平仅略有增加，远低于葡萄糖饥饿时检测到的RpoS水平[2]。已经证实，在碳饥饿下受蛋白水解水平影响的RpoS蛋白的稳定性是RpoS调节的原因[3]。E.大肠杆菌可以通过周质HdeA/HdeB伴侣增强耐酸性，以防止周质蛋白在酸性条件下聚集[4]。增加 E 耐酸性的另一种机制。大肠杆菌是增加膜中不饱和脂肪酸的产生，从而降低膜的流动性以耐酸[5]。为了耐受热应力，E。大肠杆菌细胞同时使用DnaK伴侣机和GroEL/S伴侣蛋白来帮助其他蛋白质在较高温度下正确折叠而不是聚集[6]。两种刺激子（过氧化物刺激子和超氧化物刺激子）分别含有 30 多个基因，已在 E 中进行了表征。氧化应激下的大肠杆菌[7]。其中一些基因构成 OxyR 和 SoxRS 调节子，其基因产物负责预防（过氧化氢酶和超氧化物歧化酶）或修复（核酸内切酶）氧化损伤。
尽管对个体环境压力的生理和分子反应有很好的了解，但很少有人建立综合网络系统，将环境压力源的分子靶标与其他细胞内分子联系起来，从而导致集体生理反应。为了解决这些局限性，基于基因组规模的代谢和大分子表达模型（ME模型）的三个单一应激网络模型。大肠杆菌[8,9]已被开发用于描述细胞独立响应单热[10]、酸[11]和氧化[12]应激的基本机制。
热应激响应模型称为FoldME[10]，用于描述蛋白质组学资源在较高温度下在细胞内网络上的重新分配。分子水平上的这种反应可以通过提高胞质溶胶中保护蛋白（伴侣）的浓度来稳定蛋白质。另一方面，AcidifyME [11]建立了一个定量框架，重点关注膜和周质蛋白的酸应激反应。这些靶蛋白比细胞质蛋白更容易受到外部酸胁迫的影响，与膜中的脂质脂肪酸组成和酶活性以及周质伴侣保护机制有关。重建了OxidizeME[12]，以解释活性氧（ROS）对胞质溶胶中金属蛋白的损害，包括Fe（II）蛋白与替代金属离子脱金属/错金属化的基本机制，金属蛋白中发现的铁硫簇的损伤和修复，以及Fe（II）与H自发反应的羟基自由基对DNA的损伤2O2.
缺乏的是对E中不同应激反应系统之间发生的相互作用的良好理解。大肠杆菌对多种环境压力做出集体反应。虽然单一应激反应可以通过ME模型通过整个蛋白质调控网络[10\u201222]进行量化，并且可以在湿实验室中表征一些响应交叉应激的表型[13]，但实际量化了E中对多种应激源的反应。大肠杆菌仍然缺乏，但这些信息对工业微生物过程非常有帮助。例如，在食品工业过程中，食源性细菌可能同时或按顺序暴露于各种环境胁迫，例如防腐剂的酸胁迫[14]、食品灭菌（如冷等离子体）的氧化应激[15]和轻度热处理的热应激[16]。此外，在微生物废物处理和微生物产物的高密度培养过程中，细胞可能更有可能同时经历一系列环境应激源，例如由内源性和外源性因素引起的热应激、酸应激和氧化应激[17,18]。通过建模方法更好地了解交叉适应机制将有助于为特定的生物技术过程制定最佳控制策略。
为了解决这些局限性，我们开发了一个 StressME 建模框架，通过该框架可以将单应力系统相互耦合，并且可以量化响应多个应激源的表型、蛋白质组和通量组。在StressME模拟中，选择了与工业生物技术过程相关的弱酸性pH值、热处理和ROS暴露，以研究不同应力之间的交叉适应。因此，本研究中的StressME模型和模拟具有潜在的工业相关性。它们可以用作进一步预测研究的基准，涉及工业环境中经历的更多环境压力源。
结果与讨论
StressME 模型概述
从 E 开始。大肠杆菌K-12 MG1655 ME模型（EcoliME）iJL1678-ME [9]，这项工作使用Ecolime框架从三个已发表的单应力ME模型中构建了一个集成的StressME模型，称为iZY1689-StressME [10\u201212]。
我们使用最新的 ME 代码库 COBRAme [9] 构建了 StressME，因为 FoldME [10]（热应力响应）是与以前版本的 ME 建模代码库一起发布的。从 COBRAme 及其相关的 E ME 模型开始。大肠杆菌K-12 MG1655 （iJL1678b-ME），我们整合了FoldME [10]、AcidifyME [11]和OxidizeME [12]。由此产生的模型称为 iZY1689-StressME，包括 1,689 个基因、1,578 个蛋白质、1,673 个代谢物、1,692 个复合物和 36,735 个反应（图 1）。该生物学范围是对原始 iJL1678b-ME 的显着扩展，该 iJL1678b-ME 由 1,678 个基因、1,568 个蛋白质、1,671 个代谢物、1,526 个复合物和 12,655 个反应组成。关于 StressME 和 iJL1678b-ME 之间的结构差异的更多详细信息，以及每个重建步骤后添加到 StressME 的反应，请参见 S1 附录中的表 A 和 B。每个添加反应的化学方程式可在 S2 附录中找到。
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图 1. 用于构建 StressME （iZY1689） 模型的管道和统计信息。
（1） EcoliME （iJL1678b） 在 python 3.6 中实现 FoldME、OxidizeME 和 AcidifyME （2） FoldME 到单个 StressME （°C） （3） Single StressME 与 AcidifyME 集成到双 StressME（°C 和 pH） （4） Dual StressME 与 OxidizeME 集成到三重 StressME（°C、pH 和 ROS） （5） Triple StressME 优化到最终的 iZY1689。
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在单应激ME模型[10\u201212]中，应激对细胞生长的影响是通过受影响细胞蛋白性质的变化和蛋白质组响应该性质改变的重新分配来量化的。因此，所有由一个单应激 ME 模型描述但被另一个单应激模型忽略的蛋白质都应包含在集成的 StressME 中。因此，总共有11个单应激相关蛋白根据其亚细胞位置偶联到EcoliME框架。其中，9种响应氧化应激的细胞质蛋白和1种与错误折叠蛋白降解相关的（ATP依赖性蛋白酶，Lon）被添加到已发表的FoldME中[10]（S3附录）。
单应力插件设计（详见材料和方法）使 StressME 构建管道具有灵活性和可扩展性，使模型能够在未来将更多应力模块（例如饥饿、渗透、碱性和冷应力）合并到 EcoliME 模型架构中。
估计在本地计算机（Intel Core i7-10875H @ 2.30 GHz，8 核，32GB DDR4-2933MHz）和 Graham 异构集群（Compute Canada，2 x Intel E5-2683 v4 Broadwell @ 2.1GHz，1 个 CPU;每个任务 8 GB 内存）中运行的 StressME 的平均时间。S4 附录的表 A 和 B 中列出了为 StressME 模型的相关用例运行非线性规划求解器（四精度 MINOS）的典型计算时间。它表明，通过使用 MINOS 中的热启动选项，根据压力条件，在不同平台上运行 StressME 的平均时间可以在 8 到 47 分钟之间。当生长速率可以固定，同时最大限度地提高代谢、转录、翻译或复合物形成速率时，平均时间可以快至 0.8 到 6 分钟。
StressME模型的质量控制
StressME 堆积管道基于独立的单应力 ME 模型，模型参数适合在特定应变（即 OxidizeME 和 AcidifyME 的野生型，以及 FoldME 的热演化）和应力（即氧化、酸和热）条件下获得的实验数据。单应激ME模型中参数值可变性的一个例子是Keff，它被定义为由相应大分子催化的细胞内过程的有效周转率。方程 1（方法部分）表示，如果 Keff 值增加，则要合成的蛋白质的量减少。因此，单应力ME模型之间Keff的差异可能导致集成StressME中的蛋白质组重新分配，这使得通过固有机制研究对多应力的响应变得复杂。例如，一些必需的大分子可能需要更多的蛋白质组学资源来合成伴侣，以帮助它们达到其天然折叠。不配位的Keff可能导致伴侣的过表达，以保护这些大分子不去折叠，这可能会因为共享蛋白质组资源的竞争而影响其他代谢功能。因此，StressME模型质量控制的第一步是校准关键的不协调Keff，以便其最佳值能够正确描述蛋白质组在不同应变和应激条件下的重新分配。
单 StressME 和集成 StressME 模型中的 Keff
在过去10年的发展中，已经发表的ME模型的Keff值存在差异[8,10–12,19]。在 StressME 中，我们结合了三个 stress-ME 模型，并包括 COBRAme [9] 中引入的更新。因此，我们试图创建一个整合的 Keff 向量，使个体应激反应能够被重现。
首先，我们确定了 FoldME 和 AcidifyME 中使用的 Keff 值之间的不兼容性：交换它们的 Keff 值产生的模拟结果与已发表的热和酸响应结果不一致（图 2C-2D）。这些不一致是由 FoldME 和 AcidifyME/OxidizeME 中使用的不同 Keff 值引起的：Keffs 在 FoldME 中的分布比 AcidifyME 和 OxidizeME 更窄，并且它们的中值不同（图 2A 和 2B）。
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图 2. 研究预测表型和蛋白质组对动割组的敏感性（keff，有效速率常数）。
（A）和（B）：先前单应激ME模型中使用的代谢反应的Keffs分布;（C）和（D）：不同胁迫条件下Keffs对StressME模拟生长速率的影响;（E）和（F）不同胁迫条件下Keffs对StressME模拟蛋白质质量分数的影响。
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有趣的是，使用 FoldME Keffs 模拟生长会产生更多的热演化表型，最大生长速率接近 42°C（图 2C）。同时，在 StressME 中使用 AcidifyME/OxidizeME Keffs 产生的温度依赖性生长速率与野生型 E 非常相似。大肠杆菌–最大生长速率接近37°C。 因此，关于热响应，StressME计算两种表型：热演化型（使用FoldME Keffs）和野生型（使用AcidifyME / OxidizeME Keffs）。
在热应激或酸胁迫下的模拟蛋白质组在两个 Keff 组之间也不同（图 2E 和 2F）。它表明 FoldME Keff 模型具有表达更多其他有用蛋白质（伴侣除外）的能力，因为有更多的空间将蛋白质组重新分配给在应激条件下增加生长速率的蛋白质（图 2C 和 2D）。蛋白质分配能力增加的一个关键原因是，与野生型 Keffs （0.01） 相比，使用 FoldME Keffs （88.72） 可以以低得多（约 8872 倍）的浓度 （Eq 1） 表达 dxr 蛋白。因此，考虑到对总蛋白质组质量的限制，当 dxr 及其保护伴侣（dnaK 和 dnaJ）在 FoldME Keff 模型中以较低浓度表达时，其他蛋白质可以以较高浓度表达。区分应激反应的关键速率常数。
然后，我们试图确定区分野生型和热进化应激反应的关键 Keffs。我们使用了简单的单效应敏感性分析，对每个反应依次交替使用野生型和热演化型 Keff 值，并计算最大生长速率。生长对DXPRli的Keff最敏感，DXPRli由需要Mn2+、Co2+或Mg2+的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶（dxr）催化（图3A）。将 DXPRli 的 Keff 更改在 0.01 到 88.72 之间，导致增长率从 0.88 增加到 1.04 小时-1.当Keff在野生型和热进化值之间交换时，其他反应几乎没有生长速率变化。这些 keff 值可能已经在合理范围内，或者某些反应可能具有实现类似功能的替代途径。
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图 3.
StressME 的应激演化 Keffs （A） 模拟生长速率对每个反应的 keff 选择的敏感性。受影响最大的两个反应：反应DXPRli（1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶，dxr）;反应 RHCCE（S-核糖基同型半胱氨酸裂解酶，luxS） （B） 反应 DXPRli 的 keff 对蛋白质组分配的影响 （C） dxr 的蛋白质去折叠 Keq 对生长速率的影响 （D） 反应 RHCCE 的 keff 对蛋白质组分配的影响 （E） 反应 RHCCE 的 Keff 和蛋白质特性（去折叠 Keq 和聚集倾向）对生长速率的影响。
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DXPRli是萜类生物合成中的关键反应。萜类化合物对 E 至关重要。大肠杆菌的生长和代谢，与呼吸链和膜生物合成和稳定性中的电子传递（泛醌和甲萘醌）有关[20]。图 3B 表明，与较高的 FoldME Keff 相比，较低的 DXPRli 默认 Keff 将显着增加 dxr 和用于折叠的保护伴侣（dnaK 和 dnaJ）的合成。这将减少蛋白质组约束下其他必需大分子的合成，导致代谢活性水平低。
我们研究了热敏蛋白去折叠是否可以解释DXPRli的热敏感性。为此，我们扰乱了其相关的蛋白质去折叠Keq。降低 dxr 在较高温度下的折叠要求应该会提高生长速度。通过人为降低 dxr 的去折叠 Keq（天然 ? 已折叠）来证实这一点，这增加了热应力下的生长速率（图 3C）。然而，这种影响在较低温度下不太显着。
第二敏感的 keff 是 RHCCE。降低其 keff 会大大增加蛋白质质量分数（图 3D），但生长速率不会受到太大影响（图 3A），这表明存在替代途径来实现 RHCCE 的某些功能，因此不需要太多蛋白质组学资源来合成相应的保护伴侣。
在StressME中（反应和代谢物标识符由BIGG标识符标准化[16]），RHCCE反应由S-核糖基同型半胱氨酸切割酶（由基因luxS编码）催化，产生用于甲硫氨酸合成的同型半胱氨酸。
RHCCE（S-核糖基同型半胱氨酸裂解酶）
同型半胱氨酸的替代反应 CYSTL 由 MetC 或 MalY 编码。
CYSTL（胱硫氨酸 b-裂解酶）
模拟表明，当 RHCCE 的 Keff 从 0.01 增加到 28.8 时，S-核糖基同型半胱氨酸裂解酶的质量分数从 0.02920 降低到 0.00001，但通过 RHCCE 的通量从 0.03157 增加到 0.03281 mmol g-1h-1，同时胱硫氨酸 b-裂解酶的质量分数从 0.0000763 增加到 0.0000773，同时通过 CYSTL 的通量从 0.13087 增加到 0.13242 mmol g-1h-1.因此，CYSTL是同型半胱氨酸的主要来源。在EcoliME中已经很小的RHCCE的Keff变化对E的生长和代谢影响微不足道。大肠杆菌。
图3E显示，当将大范围的Keff值应用于RHCCE时，除了生长速率的轻微变化外，蛋白质性质的变化（去折叠Keq和聚集倾向）不会影响生长速率。这种不敏感性进一步证实了RHCCE反应与其他具有较低默认Keffs的反应一样，不如StressME模型中的DXPRli反应重要。
总的来说，质量控制管道确定了反应DXPRli的关键Keff。如果不协调，可能会导致dxr及其相应的伴侣在热应力下过表达。这可能导致 StressME 对热演化应变预测的应力响应表征不正确。
应该感兴趣的是，DXPRLi的体外表征表明，这种酶在高达60°C时可以保持热稳定[21]。因此，这种关键酶一旦在体内适应较高温度，可能就不需要更多的蛋白质组资源来合成自身及其保护伴侣，从而为其他可以在热应激下支持生长的蛋白质合成节省更多资源。这也许可以解释为什么DXPRli Keff的差异会导致热进化菌株与野生型菌株不同。
代谢组和蛋白质组的质量平衡检查
我们通过检查代谢组和蛋白质组的质量平衡，进一步评估了所有测试条件下的 StressME 模型的质量。对于所有 1673 种代谢物，我们获得了每种代谢物的消耗和生产之间的完美匹配（S5 附录中的图 A）。对于所有条件下的所有 1578 种蛋白质，我们始终获得的总模拟质量分数 （modeled_protein_fraction） 非常接近 90% 的设定值（S5 附录中的图 B），即modeled_protein_fraction应接近 {1 –unmodeled_protein_fraction}，其中 unmodeled_protein_fraction 是基于蛋白质组质量的实验定量（约 5% 未测量）[22] 和先前的 ME 模型（约 15% 未建模）[12]。
使用整合动缩模进行表型验证
最后，我们整合了一个代表热演化应激反应的单个动切体（已发表的 FoldME 结果），同时还正确地再现了已发表的酸和氧化 ME 模型应激反应。根据上述结果，这种固结只需要修改一个相对于 AcidifyME/OxidizeME 动割机的 Keff：DXPRli keff 从 0.01 到 88.72 秒-1.
利用这种综合的Keff，我们模拟了暴露于个体应激（热、氧化、酸）的野生型和热演化菌株的生长速率。图 4 表明，最终的 StressME 模型与 Keffs 一起用于演热菌株，模拟了与单应力 ME 模型非常相似的应激响应，包括菌株生长速率对温度（图 4A）、pH（图 4B）、ROS 水平（图 4C 和 4D）和氨基酸的不同补充（AA，见图 4D）).在这里，AA供应用于缓解ROS对AA生物合成途径的失活。它还表明，野生型菌株的StressME和Keffs可以重现该菌株在各种胁迫条件下的实验观察到的内容[10\u201212]。
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图 4. StressME可以准确地模拟个人的压力反应。
（A）热应激（B）酸应激（C）和（D）氧化应激与氨基酸（AAs）供应量不同。
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应该注意的是，通过仅协调热演化菌株中一个反应的 Keff 值 （DXPRli），集成的 StressME 能够重现所有单个 Stress ME 模型报告的表型。此外，带有野生型 Keffs 的 StressME 可以正确描述通过 OxidizeME 和 AcidifyME 获得的表型，以及野生型菌株的实验观察到的表型（例如，在 37°C 左右的生长最大值）。因此，它证实了 StressME 的整体稳健性——如果将更多的基因、蛋白质、代谢物和反应添加到模型中，则可能不需要为所有其他反应重新拟合 Keffs。
个体应激反应模拟的微小差异可能是由于：（1）单一应激固有的机制已被整合，因此，StressME中的个体应激反应机制之间存在一些相互联系（2）由于添加了新蛋白质，未建模的蛋白质组分发生了变化。
野生型菌株和热演化菌株之间的交换通量随温度存在一些差异，如S6附录中的图A所示。它表明野生型开始降低代谢活性（约36°C）与热演化型（42°C）的温度不同。这种差异证实了热演化菌株在代谢活动方面已经适应了更高的温度。
面对压力源的替代最佳（策略）
通量变异性分析。
对放热型（图5A-5D）和野生型（图5E-5H）StressME进行通量变异性分析（FVA），通过固定不同温度下95%-100%的生长速率，同时最小化和最大化乙酸盐产生速率（APR）、摄氧率（OUR）、葡萄糖摄取率（GUR）和CO2产生率（CPR）来找到最小和最大交换通量。
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图 5. 通过通量变异性分析 （FVA） 计算 StressME 的替代最优解。
放热菌株的FVA（A）-（D）：（A）葡萄糖摄取率（GUR），（B）摄氧率（OUR），（C）CO2产生/摄取率（CO2）和（D）乙酸盐产生率（APR）。野生型菌株 （E）-（H） 的 FVA。粉红色区域表示支持95%-100%最大生物质生产率的最优解决方案空间的最大边界。负值表示交换反应的反方向。
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对于那些可观察到的表型，以支持95%-100%的最大生物质生产率，FVA通过固定100%的增长率，找到了最佳解空间的有界性，其范围很窄。它提出了 StressME 可以获得的有限替代最优值，证实了模型的鲁棒性。有趣的是，100%生长的FVA确定了野生型和热进化菌株在很宽的温度范围内乙酸盐代谢的三个阶段，即活性乙酸盐溢出从24到30°C，从36到46°C，但非活性醋酸盐溢出在31和35°C之间。 在越来越低的温度下，100%生长的FVA预测野生型APR的溶液空间比热演化型的APR相对更宽，这表明乙酸盐溢出可能是细胞根据应激条件调整其蛋白质的有效方式。
StressME预测了野生型和热进化菌株在较高温度下乙酸盐的排泄，如S6附录中的图A所示，这与实验观察结果一致[23]。然而，发现两种菌株的乙酸盐产生速率在42°C后都有所下降，同时葡萄糖和氧气吸收率下降，CO2排泄率下降，从热演化菌株的42°C开始，野生型的产卵率在35°C左右。这种显着的并发下降与代谢活动的下调有关。
发现两种菌株的醋酸盐溢出代谢在30°C至36°C之间终止，但在36°C后恢复到活性状态。 它表明细胞可以利用乙酸盐溢出代谢从完全呼吸生长切换到呼吸发酵生长，以维持其在压力下的代谢活动。
StressME 捕获的替代最优值（purT 与 ackA）。
应该注意的是，StressME 可能会捕获其他一些替代最优值。虽然它们不影响表型，但它们可能会影响蛋白质组和通量组的预测局部分布。这种替代最优的一个例子是存在三种蛋白质（TdcD、PurT和AckA），其中任何一种都能够根据EcoliME中的基因-蛋白质-反应（GPR）规则催化反应ACKr[9]。我们使用对蛋白质结构、稳定性和功能的系统分析来确认在较低温度下比 ackA 更可取的 purT 表达是由于替代最优值（参见 S7 附录）。
26°C 下的蛋白质组资源分配表明 purT 蛋白 （GAR 转化酶-T） 的合成显着增加，如 S7 附录中的图 A 所示。GAR转化酶-T主要用于催化嘌呤和嘧啶的生物合成。然而，它也能够催化乙酰磷酸酯裂解，与ATP（反应ACKr）一起产生乙酸盐[24]。另一种具有类似GAR转化酶-T（purT）催化机制的双功能酶是丙酸激酶（tdcD），它主要负责磷酸丙酰和ADP转化为丙酸酯和ATP，但也具有乙酸激酶活性（ackA）。
三种蛋白质（tdcD、purT 和 ackA）的结构如 S7 附录的表 A 所示，根据 EcoliME 中的基因-蛋白质-反应 （GPR） 规则，这三种蛋白质中的任何一种都能够催化反应 ACKr[9]。这三种蛋白质在分子量和残基数量等结构上彼此相似，这表明蛋白质生物合成的成本并不是 StressME 更喜欢 purT 蛋白而不是 tdcD 和 ackA 蛋白的原因。
通过分别改变 purT 和 ackA 蛋白的去折叠平衡常数 （Keq）、聚集倾向 （agg） 和蛋白质动力学折叠速率 [kf] 的 100 倍来检查蛋白质稳定性对合成偏好的影响。StressME 模拟表明，蛋白质组以及表型和通量组不受蛋白质稳定性的显着影响，从而排除了其他可能的稳定性原因，这些原因决定了乙酸激酶活性的 purT 选择。
最后，在 26°C 的 StressME 中关闭 purT 基因的 mRNA 翻译和蛋白质合成。 蛋白质组清楚地表明，当 purT 关闭时，在 26°C 下合成相同量的乙酸激酶 （ackA）。 然而，当 purT 再次打开时，乙酸激酶的合成被阻断（S7 附录中的图 A）。S7附录中的图A进一步表明，如果purT蛋白合成受阻，则在26°C下观察到但在32°C时几乎消失的乙酸盐溢出代谢也可能由乙酸激酶（ackA）引起。这些模拟表明，在 26°C 下，purT 表达优于 ackA 是由于 StressME 捕获的替代最优值，而不是可能显着影响整体蛋白质组和通量组的“隐藏”生物学机制。
使用 StressME 研究交叉应力和串扰电阻
抗交叉应力是一个复杂的系统级现象，正在积极研究，因此为StressME的效用提供了一个很好的案例研究。微生物的交叉应激抗性是指在暴露于不同的初级应激后获得对第二种应激的抗性[25]。对交叉应激抵抗力的理解已经从归因于普遍机制（例如，一般应激反应）发展到严格依赖于主要应力的特定机制[25]。因此，施加应力的类型和顺序决定了抗交叉应力：例如，酸[26,27]或各种生物体的氧化应激[25]后的耐热性。直观地说，某些应激诱发的因子在多种应激下具有保护活性，例如，海藻糖被假设通过稳定磷脂的极性基团来保护膜，清除自由基，并且是一个能量库[25]。然而，后来的研究驳斥了海藻糖提供一般应激保护的作用，而是认为海藻糖在能量代谢中的特定作用或与之相关的蛋白质组表达改变更为重要[25]。此外，研究还认识到抑制大量基因（例如生长过程）的作用，以使其他对应激反应很重要的蛋白质的表达[25]。然而，每个表达基因在交叉应激反应中的确切作用很难确定。
另一方面，串扰电阻是另一种复杂的系统级现象，它在多重应力下整合了不同的应力-响应途径，以最大限度地提高保护性能。在系统水平上加强对串扰机制的理解将具有潜在的实际意义，例如在食品工业过程、微生物废物处理和微生物产品的高密度培养中，细胞可能更有可能同时经历一组环境压力源。
从这些角度来看，我们研究了系统级蛋白质组分配，以及与交叉应激和串扰机制相关的特定生化活性。我们首先考虑两种情况：
情景 A：暴露于压力 1 →没有长期适应（野生型）→暴露于压力 2
情景 B：暴露于压力 1 →适应压力 1（热演化）→暴露于压力 2
对于场景B，我们假设细胞在进化时间尺度上已经适应了应激1。
在我们的计算机模拟实验中，我们研究了热适应或非适应菌株（每个菌株具有不同的 Keffs）如何同时响应单个应激（热、ROS、酸）或这些应力的组合（即热氧化、热酸、氧化酸和热氧化酸）。
我们首先比较了热适应（热演化）和热不适应（野生型）菌株之间对ROS的蛋白质组分配，在所有三种胁迫下，热和酸反应：ROS从1x到10x，温度从37到42°C，pH 7.0和5.0。对野生型和热进化的 Keff 载体重复这些模拟。
我们发现，当受到应力 2 时，相对于单（热）或双（热氧化）应力，演热应变（图 6C 和 6D）的抗应力性增加。在10倍ROS和42°C热胁迫下，热演化菌株中的热活化蛋白质组质量分数可从野生型的47.1%降低到23.8%（图6A和6B）。因此，热适应可以通过释放蛋白质组资源来协同改善ROS反应，否则这些资源将分配给伴侣。在10倍ROS和42°C热胁迫下，热演化菌株的ROS活化蛋白质组质量分数比野生型增加了5.2%。同时，热演化菌株表现出更活跃的代谢活性（生长速率0.82 h-1）比野生型菌株（生长速率0.32小时-1).
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图 6. 当暴露于应力 2（热或酸或氧化或组合）时，热（应激 1）适应对系统级蛋白质组重新分配的影响作为权衡。
（A） 0.0 到 1.0 的野生型菌株-蛋白质组质量分数概览 （B） 0.000 到 0.015 的野生型菌株-蛋白质组放大视图 （C） 0.0 到 1.0 的热演化菌株-蛋白质组质量分数概览 （D） 0.000 到 0.015 的热演化菌株-蛋白质组放大视图。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.g006
在酸胁迫下，演热应变在单应力、双应力和三应力下性能均不能显著提高。在热（42°C）和酸胁迫（pH 5.0）下，与野生型模拟相比，酸活化蛋白质组仅增加0.80%。同时，两株菌株均表现出相似的低代谢活性（即生长速率为0.071 ~ 0.087 h）-1在 37°C 和 0.031 ~ 0.035 小时-1在 42°C）。
因此，酸反应不太可能受益于暴露于应激 1 引起的基于蛋白质组分配的机制，因为在我们的模型中，酸反应的最大贡献者是不直接与细胞质蛋白竞争的周质伴侣 （Hde）。因此，我们认为交叉应力保护可以通过蛋白质组分配权衡来解释。此外，这些权衡需要精确的表征，因为它们取决于激活的蛋白质的身份及其定位，这将在下一节中讨论。
热适应可以诱导针对热应激或热氧化应激的交叉保护。
首先，在同时的热氧化应激下，所有个体应激反应都被激活。野生型模拟表明，在低ROS水平（0.01x）下，COG功能O类（翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣）的质量分数从15%（37°C）增加到63%（42°C）（图7C）。将 ROS 提高到 10 倍可适度降低 O 类表达：11% （37°C） 至 53% （42°C）。因此，正如预期的那样，伴侣表达随着热应激而强烈增加。同时，热适应模拟显示，当ROS增加到10倍时，O类质量分数仅从10%（37°C）增加到27%（42°C）（图7A）。因此，由于热适应，ROS响应可能受益于蛋白质组的重新分配。
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图 7. 热应激和氧化双重应激下的蛋白质组重分配。
热演化菌株 （A）-（B）：（A） COG 官能团的蛋白质组质量分数 （B） 关键氧化反应基团的蛋白质组质量分数。野生型菌株（C）-（D）。ROS 基因：ROS 激活的蛋白质组（19 种 ROS 应激排他性和应激强化蛋白）。损伤基因：ROS易感蛋白质组（31个[Fe-S]结合蛋白）。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.g007
图7B和图7D分别表示热适应型和野生型菌株的ROS激活蛋白质组（19个ROS应激排斥和应激强化蛋白）[12]和ROS易感蛋白质组（31个[Fe-S]结合蛋白）[12]。在10倍ROS和42°C热胁迫下，与野生型相比，ROS活化和ROS易感蛋白质组质量分数分别增加了4.7%和8.9%。在ROS易感[Fe-S]结合蛋白中，喹啉酸合酶（nadA）的质量分数显著增加（10.4%），用于热演化模拟与野生型模拟。ROS引起的nadA损伤通量从1.27和5.11 nmol g增加-1h-1至 96.8 和 387 nmol g-1h-1，当 ROS 从 0.01 倍上升到 10 倍基础水平时。为了补充这种 ROS 损伤损失，如果蛋白质组可用性足以允许这种重新分配，则 nadA 的表达应该增加。
另一个重要的 ROS 易感 [Fe-S] 结合蛋白是由 nuo 编码的 NADH 脱氢酶（S8 附录）。在1x ROS和37°C下，热进化菌株的nuo蛋白质组（13种蛋白质）质量分数比野生型增加了7.5%。 随着 ROS 增加到 10 倍，两种菌株的 nuo 蛋白质组表达终止，但由 ndh 编码的替代 NADH 脱氢酶（S8 附录）显着增加，表明细胞试图避免不经济的 nuo 编码的 NADH 通路易受 ROS 损伤。在NADH通路转移后，热适应菌株的ndh表达仍比野生型高12.2%。在ROS和42°C胁迫下，两种菌株均终止了nuo和ndh的表达，表明没有足够的蛋白质组可用性来使ROS响应更加全面。
热适应不能诱导对酸应力的交叉保护。
图8显示了热演化和宽型菌株在热酸胁迫下的蛋白质组重新分配。热适应释放了一些胞质蛋白质组资源，否则这些资源将被分配给伴侣。因此，在从低温到高温的酸胁迫下，热演化菌株比野生型菌株更显著地重新分配了胞质蛋白质组。然而，酸应激增加了对周质伴侣（HdeB）、周质膜合成（LptA）和西格玛转录因子（rpoE）等酸反应蛋白的需求，以实现胞浆外活性[28]。这些周质蛋白不与细胞质蛋白直接竞争，这可能会因热适应而降低蛋白质组重新分配的益处。
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图 8. 热酸双重胁迫下的蛋白质组重分配。
放热菌株（A）-（D）：（A） PH 5.0 和 pH 7.0 at 26°C;（B） pH 5.0 和 pH 7.0 at 32°C;（C） 40°C 时的 pH 值为 5.0 和 pH 7.0，（D） 42°C 时的 pH 值为 5.0 和 pH 7.0。 野生型菌株：（E）-（H）。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.g008
代谢通量平衡分析（MFBA）进一步证实，热适应不能诱导对酸胁迫的交叉保护。两种菌株在酸胁迫（pH 5.0）下都显示出相似的细胞内和细胞外通量分布（图9B和9D），尽管在pH 7.0下，热演化菌株比野生型菌株具有更活跃的代谢状态（图9A和9C）。
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图 9.
代谢通量平衡分析（MFBA）显示，在热酸胁迫下，从完全呼吸代谢到呼吸发酵代谢和乙酸盐溢出的转变：热演化菌株（A）和（B）;野生型菌株 （C） 和 （D）。（A）和（C）：通量组（mmol g-1DCW h-1）在pH 7.0，温度26°C、32°C和40°C下。 （B） 和 （D）：pH 值为 5.0、温度为 26°C、32°C 和 40°C 的通量组。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.g009
在酸胁迫下，MFBA捕获了电子转移途径中的潜在开关，从琥珀酸脱氢酶（SDH）的琥珀酸氧化到热演化菌株中的甲酸盐脱氢酶（FDO）氧化（图9B）。这种转变需要丙酮酸甲酸盐裂解酶 （tdcE），根据 StressME 对热演化菌株的模拟，它在 pH7 下是无活性的（图 9A）。因此，StressME模拟表明，热演化菌株可能会改变酸胁迫下的代谢，从通过TCA的完全呼吸代谢到通过厌氧糖酵解的呼吸发酵代谢。已经报道了 E 的呼吸发酵代谢。有氧[29,30]和厌氧条件下的大肠杆菌[31,32]。然而，目前还没有关于pH值对E的影响的研究。大肠杆菌热进化菌株与呼吸发酵有关。这种转变的可能原因是因为 E.大肠杆菌热演化菌株可能使用蛋白质组即用型呼吸发酵途径[33]，其中丙酮酸甲酸裂解酶在E中组成型表达。大肠杆菌[34]，以避免酸胁迫下能量生物发生的蛋白质组限制。也有报道称，在E中，发酵比呼吸作用更便宜的能量生物发生蛋白质组成本。大肠杆菌[35]，证明了在蛋白质组限制下选择呼吸发酵代谢的合理性。模拟表明，这种开关是野生型的固有特征，因为它即使在单一热应力下也是活跃的（图9C）。野生型可以使用这种呼吸发酵代谢来避免热应激下的蛋白质组限制，这是热演化菌株不需要的机制，因为它已经适应了热应激。需要进一步的实验工作来验证不同胁迫条件下TCA与呼吸发酵代谢之间的模拟转换。
TCA循环的较少使用可以解释单应力和交叉应力条件下醋酸盐溢出的机理。当两种菌株的TCA活性下调时，在好氧条件下部分进入TCA的乙酰辅酶A通过PTA-PCKA途径转化为乙酸盐，导致乙酸盐溢出表型。
我们进一步研究了热适应和热不适应菌株对氧化酸双重胁迫和热氧化酸三重胁迫的蛋白质组分配。我们证实，热适应不能诱导针对酸相关交叉应力的交叉保护，如这两种菌株之间的COG功能类别和ROS相关蛋白的质量分数相似（图10和11）所示。
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图 10. 氧化和酸双重应激下的蛋白质组重分配。
热演化菌株 （A）-（B）：（A） COG 官能团的蛋白质组质量分数 （B） 关键氧化反应基团的蛋白质组质量分数。野生型菌株（C）-（D）。ROS 基因：ROS 激活的蛋白质组（19 种 ROS 应激排他性和应激强化蛋白）。损伤基因：ROS易感蛋白质组（31个[Fe-S]结合蛋白）。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.g010
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图 11. 热-氧化-酸三重胁迫下的蛋白质组分配。
（A） 热适应菌株中 COG 官能团的蛋白质组质量分数 （B） 热不适应菌株中 COG 官能团的蛋白质组质量分数 （C） ROS 激活的蛋白质组（19 个 ROS 胁迫排他性和应激强化蛋白）和 ROS 易感蛋白质组（31 个 [Fe-S] 结合蛋白）用于热适应和热不适应菌株。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.g011
因此，StressME可以用作计算机模拟平台，以开发超级细菌实验进化的策略，以增强交叉应激抵抗力或对细胞外环境的最佳控制，以最大限度地提高串扰保护（例如，首先摆脱多个应激源的酸度）。
材料和方法
软件
这项工作使用CobraME[9]中开发的EcoliME框架，从三个已发表的单应力ME模型（FoldME [10]、AcidifyME [11]和OxidizeME [12]）中构建了一个集成的StressME模型。
所有代码都在 Python 版本 3.6.3 中进行了测试，这是我们 StressME 软件包的默认版本。我们将之前发布的单个 StressME 代码库的任何 Python v2.7 脚本转换为 Python v3.6。可以从 https://github.com/QCSB/StressME 下载三个更新的 ME 模型包。我们还为 COBRAme 提供支持脚本（模型构建和仿真脚本），我们修改了这些脚本以兼容 Python 3.6.3 和 StressME（参见 S9 附录）。
有经验的用户可以使用 S9 附录中的说明和三个更新的单应力 ME 模型 （https://github.com/QCSB/StressME） 来构建和扩展 StressME，并在 Linux 集群中运行模拟（详见 S9 附录）。本研究中的所有模拟均在基于此设置的 Compute Canada 集群中进行。用于在个人计算机中运行的独立可执行 StressME 软件包也由 docker 容器提供（queensysbio/stressme：v1.1，详见 S10 附录）。
单应力模型的集成
StressME由管道构建和优化，以结合EcoliME框架中三种单应力ME模型（热、氧化、酸）的机制。首先，在Python版本3.6.3下，基于已发布的协议[9]，从同一起点（大肠杆菌K-12 MG1655 ME模型iJL1678-ME [9]）重建了三个单应力ME模型（FoldME [10]、OxidizeME [12]、OxidizeME [12]和AcidifyME [11]）。其次，鉴定了 11 个未包含在 iJL1678-ME 中的应激反应基因/蛋白质。其中，通过建立温度依赖性蛋白质动力学折叠速率Kf（T）、热稳定性ΔG（T）、去折叠Keq（T）的平衡常数和聚集倾向（agg），将9种响应氧化应激的细胞质蛋白和1种与错误折叠的蛋白质降解相关的（ATP依赖性蛋白酶，Lon）添加到FoldME中（S3附录）).因此，此阶段的 StressME 可以将细胞质中的蛋白质折叠网络（即自发折叠、DnaK 辅助折叠和 GroEL/ES 介导的折叠的竞争途径）应用于这些添加的蛋白质。第三，一种响应酸胁迫的周质蛋白（HdeB）通过AcidifyME偶联到StressME，描述了周质蛋白的稳定性与pH值和温度的函数关系，以及HdeB通过自发折叠对未折叠周质蛋白的保护作用。在这个阶段，E.大肠杆菌膜脂质脂肪酸组成和膜蛋白活性随pH值的变化也通过AcidifyME与StressME偶联，以表征观察到的酸应激动应反应。最后，通过OxidizeME将与活性氧化物种（ROS）对大分子损伤相关的物质和反应偶联到StressME上，重建最终的StressME集成，包括ROS对Fe（II）蛋白的脱金属化、替代金属离子的错金属化、铁硫团簇的氧化和修复、未掺入的Fe（II）与H反应的相关机制2O2（Featon反应）生成羟基自由基，并保护Dps蛋白储存未掺入的Fe（II）。添加到StressME中的11种蛋白质如表1所示。耦合脚本可以在 https://github.com/QCSB/StressME 中找到
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表 1. 11个应激反应基因被添加到FoldME中。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.t001
StressME 进一步封装在一个用户友好的 I/O 平台中，以使用温度、pH 和 ROS 水平的简单输入阵列运行模拟。StressME 模拟可以在所有应力条件下自动生成表型、蛋白质组和通量组的 CSV 输出，以便进一步处理和可视化（图 12）。
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图 12. 集成 StressME 模型，结合三种单应力模型（热、氧化、酸）的机制。
用户友好的 I/O 平台，可运行具有简单温度、pH 和 ROS 水平阵列的模拟;表型、蛋白质组和通量组的 CSV 输出，用于进一步可视化。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.g012
不同菌株的 Keff 协调和优化
在StressME中，代谢反应催化酶的合成速率可以表示为：
（式1）
其中 μ/keff 是代谢反应携带通量所需的少量催化酶。方程 1 表示如果 Keff 值增加，则要合成的蛋白质的量减少。Keffs 对代谢反应存在不确定性。作为模型质量控制的第一步，针对分别代表野生型和热进化菌株的 StressME 优化了两个单 Keff 载体。这种质量控制基于一个协议，即改变最少数量的 Keffs，这些 Keffs 共同满足不同的应变和应力条件。这是通过计算当总共 5266 个代谢反应的每个代谢反应 Keff 同时从默认（野生型）改变为替代（热进化）时的生长速率来实现的。然后对所有模拟的 5266 生长速率进行排序，并确定受 Keff 变化影响最大的反应。筛选在Compute-Canada集群中并行进行。
验证
使用最佳Keff载体，StressME验证了暴露于各种单一胁迫的野生型和热演化菌株的生长速率，即温度为26°C至46°C，pH为5.0至7.0，超氧化物为0.02 nM至10 nM。对于氧化应激验证，使用了不同的氨基酸（AAs）——全AAs、不含Ile&Val的AAs、不含Met&Cys的AAs以及不含Phe、Typ和Tyr的aas。然后将StressME获得的增长速率分别与FoldME、AcidifyME和OxidizeME发表的增长速率进行比较，以检查响应不同类型胁迫的不同机制相互耦合后的模型鲁棒性和一致性。
通量变异性分析
对野生型和热演化型 StressME 进行了通量变异性分析 （FVA），以确定以最大值和最小值为界的交换通量的可能解范围。它是通过在不同温度下固定 95% - 100% 的生长速率，同时最小化和最大化乙酸盐产生率 （APR）、摄氧率 （OUR）、葡萄糖摄取率 （GUR） 和二氧化碳率 （CO2），分别。
细胞对多种应激源的反应
蛋白质组学和通量组学分析研究了野生型（热不适应）和热演化E的交叉应力和串扰电阻。大肠杆菌分别暴露于双重（热和氧化，热和酸和氧化和酸）和三重应激条件（热和酸和氧化）。通过StressME模拟热应激和氧化应激条件，将温度从37°C提高到42°C，将ROS从0.01倍提高到10倍基础水平。通过将温度从26°C提高到42°C，将pH值从5.0提高到7.0来模拟热应激和酸胁迫条件。通过StressME模拟氧化和酸胁迫条件，将ROS从0.01x提高到10x，pH从5.0提高到7.0。通过将温度从26°C提高到42°C，将ROS从1倍提高到10倍，将pH从5.0提高到7.0来模拟三重应力条件。响应应激源的蛋白质组重新分配通过蛋白质质量分数进行量化，蛋白质质量分数定义为合成的单个蛋白质与合成的总蛋白质的比率。计算蛋白质质量分数的算法在别处有描述[36]，该算法基于单个蛋白质的分子量、蛋白质的翻译通量和生长速率。通过细胞内代谢通量（mmol g-1h-1），由四精度线性和非线性规划求解器 qMINOS 5.6 计算得出，以最大限度地提高应力条件下的增长率。重点放在中枢代谢上，如糖酵解、柠檬酸循环、磷酸戊糖途径和电子传递链反应。
支持信息
StressME的生物扩增。
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S1 附录：StressME 的生物扩增表 A. StressME 和 EcoliME 之间模型组件的差异模型组件压力MEEcoliME公司基因1,6891,678mRNAs（mRNA）1,6891,678tRNAs（英语：tRNA）6363蛋白质1,5781,568蛋白质折叠状态9,5610代谢 产物1,6731,671配合 物1,6921,526反应36,73512,655表 B. 每个重建步骤后添加到 StressME 的反应步骤添加的反应*1： EcoliME （iJL1678b） => FoldME （ ）°摄氏度21,9572： FoldME （ ） => StressME （ ）°C°摄氏度1773： StressME （ ） => StressME （ ， pH）°C°摄氏度2174： StressME （ ， pH） => StressME （ ， pH， ROS）°C°摄氏度1,729*有关化学方程式反应的详细信息可在 S2 附录中找到;24,080在原始的EcoliME（iJL1678b）中添加了更多的反应以生成StressME。1
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S1 附录。 StressME的生物扩增。
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S2 附录。 有关在每个重建步骤中添加到 StressME 的反应的详细信息。
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S3 附录。 添加到 StressME 中的 10 种折叠蛋白的温度依赖性热稳定性、聚集倾向和折叠速率常数。
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S4 附录。 运行 StressME 的典型计算时间。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.s004
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S5 附录。 代谢物和蛋白质组的材料平衡检查。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.s005
（DOCX）
S6 附录。 温度依赖性表型和蛋白质组。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.s006
（DOCX）
S7 附录。 StressME 捕获的替代最优值（purT 与 ackA）。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.s007
（DOCX）
S8 附录。 NADH脱氢酶和喹啉酸合酶的反应。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.s008
（DOCX）
S9 附录。 使用 Linux（集群）的 StressME。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.s009
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S10 附录。 使用 docker 的 StressME。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011865.s010
（DOCX）
确认
我们感谢Herbert Yao对本文提出的宝贵建议。
引用
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