免费医学论文发表-伸长的胃类的形状与由活性细胞爬行和差异粘附共同驱动的收敛延伸一致

抽象

胃类化合物已成为哺乳动物原肠胚形成的非常有用的体外模型。3D胃肠最显着的特征之一是它们的伸长率，它模仿了胚胎前后轴的延伸。尽管轴延伸对发育至关重要，但哺乳动物物种的潜在机制尚未完全阐明。胃类化合物为体外研究这种形态发生过程提供了机会。在这里，我们测量和量化了伸长的胃类动物的形状，并通过基于一种新颖的优化算法的细胞Potts模型模拟表明，由活性细胞爬行和差异粘附相结合驱动的收敛延伸可以解释观察到的形状。我们发现仅凭差异粘连是不够的，并且还通过胃类的延时成像直接观察到收敛延伸的标志。最后，我们表明胃样伸长可以通过抑制 Rho 激酶途径来消除，Rho 激酶途径参与体内的收敛延伸。总而言之，我们的研究证明了胃类动物如何被用来阐明胚胎发育中的形态发生过程。

作者摘要

在胚胎发育过程中，哺乳动物胚胎从单个细胞发育为具有复杂身体计划的完整生物体。为了确保组织和器官在正确的位置形成，胚胎会经历一系列高度协调的事件，这些事件建立了身体的基本轴，例如从头部（前）到尾部（后）的前后轴。沿该轴的广泛伸长对于正常发育至关重要，但其潜在机制尚不完全清楚，部分原因是胚胎实验很麻烦。在这项研究中，我们使用了小鼠胚胎干细胞的聚集体，称为胃类干细胞，它们在培养皿中模拟胚胎发育的元素，最重要的是伸长。我们开发了一种计算方法来模拟骨料形状，并使用测量的骨料形状来决定驱动伸长率机制的多个假设。我们发现，两种独立机制的组合可以解释测量的形状：1.细胞的主动爬行导致一个方向变窄并在垂直方向上延伸（如挤压压力球时）和2。不同类型细胞之间粘性（粘附性）的差异。

数字

图5图6图1图2图3表1表2图4图5图6图1图2图3

引自：de Jong MA、Adegeest E、Bérenger-Currias NMLP、Mircea M、Merks RMH、Semrau S （2024） 伸长的胃类动物的形状与由活性细胞爬行和差异粘附共同驱动的收敛延伸一致。PLoS 计算生物学 20（2）： 编号：E1011825。 https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825

编辑 器： 聂青， 加州大学欧文分校，美国

收到： 2023年5月25日;接受： 2024年1月12日;发表： 2月 2， 2024

版权所有： ? 2024 de Jong et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 我们的模拟、图像分析和 LOCO-EFA 的代码可以在 GitHub 上找到：https://github.com/Martijnadj/Gastruloids_convergent_extension_differential_adhesion。

资金： 这项工作得到了 Stichting voor Fundamenteel Onderzoek der Materie （FOM， www.nwo.nl） projectruimte grant 16PR1040 （EA， SS）、NWO Gravitation grant “Nanofront” （EA， SS）、NWO grant NWO/ENW-VICI 865.17.004 （RMHM） 和 NWO/ENW-XL 2019.029 （MdJ， RMHM） 以及教授博士的支持。Jan van der Hoevenstichting voor Theoretische Biologie （RMHM） 隶属于 Leids Universiteits Fonds （RMHM）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

胚胎形态发生使用一系列复杂的机制产生令人眼花缭乱的形状多样性。几十年来，通过对活胚胎的仔细观察和扰动，其中一些机制已被阐明，而许多形态发生过程仍然不为人所知。哺乳动物胚胎发生的研究特别具有挑战性，因为关键的形态发生事件发生在子宫内。例如，在胚胎植入子宫壁之后，原肠胚形成是将哺乳动物胚胎从单个上皮层（外胚层）转化为三个不同的胚层（外胚层、内胚层和中胚层）的过程。胃形成至关重要，因为胚层是特定组织的前体，因此对于适当的器官发生是必不可少的。高度协调的分化和细胞运动序列不仅伴随着胚层的形成，还伴随着随后的体轴和胚胎伸长的建立。光片显微镜[1,2]和胚胎离体培养[2,3]的最新进展已经开始对这些过程有更多的了解，但该系统的复杂性以及操纵或扰动它的机会有限，使得很难确定具体的机制。

最近，干细胞衍生的体外系统已成为可访问的模型，旨在以最少数量的必要组件模拟发育过程。这些模型的优点是易于大规模生产，并且容易受到扰动。与实际胚胎相比，它们的复杂性降低，使我们能够孤立地研究特定的发育过程。由van den Brink等[4]建立的胃类干细胞是小鼠胚胎干细胞（mESCs）的聚集体，具有原肠胚形成的特征。引人注目的是，胃泌体在 4 天分化轨迹的最后 24 小时内伸长。这种伸长被认为模仿了小鼠胚胎中第一体轴的形成和随后的延伸：前后 （AP） 轴。该轴是在胚胎后极原肠形成开始时形成的。在特定区域，即原始条纹中，细胞广泛进入和迁移，最终导致AP轴的形成。虽然AP轴伸长已在非哺乳动物脊椎动物中进行了广泛的研究[5]，但对AP轴形成过程中塑造小鼠或人类胚胎的机械细胞相互作用和相关运动模式知之甚少。因此，延长的胃类动物为揭示这些机制提供了一个令人兴奋的机会[6]。

组织伸长可由一系列不同的机制驱动，包括定向细胞迁移以及局部增殖或细胞生长[5]。果蝇[7]、非洲爪蟾[8]和斑马鱼[9]的AP轴的早期伸长显示出集体细胞运动的特征模式：收敛延伸（CE）。AP轴的细胞最初沿一个方向伸展，然后插入，使得组织沿垂直方向伸长。重要的是，CE 不需要细胞分裂。已经观察到两种相关的细胞机制是 CE 的基础。“爬行”机制涉及细胞两极上内侧方向的突起。这些突起在细胞外基质和邻近细胞上产生整合素依赖性力。相比之下，“连接收缩”机制利用细胞界面的主动收缩来驱动插层。果蝇[10]、非洲爪蟾[11]和小鼠[12]的证据表明，这两种机制可能协同作用，但受到独立调节[13]。在果蝇中，在缺乏这两种机制中的任何一种的情况下[10]，CE会减慢，但不会完全停止。在最近对非洲爪蟾[11]进行的一项实验和数学建模研究[11]中，实时成像证明了爬行和收缩的并发性。CE的数学模型显示，与独立发生的两种机制中的任何一种相比，两种机制一起发生会导致更强的插层。因此，“爬行”和“结收缩”机制可以相互加强，但足以独立驱动 CE。虽然实时成像已经确定了CE在小鼠胚胎发生中的作用，特别是在神经管形成中[12,14]，但它在AP轴伸长中的作用要少得多。

在这篇手稿中，我们将演示一种测试CE是否是伸长率基础的替代方法。我们推断，拉长的胃类动物的形状应该反映导致其伸长的机制。为了验证这一想法，我们在多个时间点对胃类动物进行了成像，并使用叶贡献椭圆傅里叶分析（LOCO-EFA）[15]量化了它们的形状。为了了解观察到的形状是如何由不同类型的细胞相互作用产生的，我们采用了基于细胞Potts模型（CPM）[16,17]（又名Glazier-Graner-Hogeweg模型）的计算机模拟方法。 CPM 将单个单元表示为晶格上的一组连接位点。细胞通过与相邻细胞交换晶格位点来移动并改变其形状。这些站点占用率的变化是使用蒙特卡罗方法随机生成的。变化的概率由系统的总能量决定，在模拟过程中，总能量最小化。总能量表达中的特定术语（哈密顿量）可用于模拟细胞之间的相互作用，例如沿细胞边界的不均匀粘附[18]或丝状伪足介导的主动拉扯[19]。我们首先在计算机模型中使用它来表明细胞间粘附的变异性不足以解释观察到的形状。然后，我们修改了“爬行”CE [19] 的丝状张力模型，使其在没有预定义的极化轴的情况下工作，并使用实验测量来约束自由模型参数。模拟表明，爬行产生的CE可以再现观察到的各种形状。通过在模型中添加额外的细胞类型和差异粘附，我们可以进一步提高与实验的一致性。为了通过实验确认 CE 的存在，我们对伸长的胃类进行了实时成像，并观察到了 CE 的标志。最后，我们证明抑制 Rho 激酶 （ROCK） 通路（发现这是体内 CE 所必需的）会损害胃样伸长。

材料和方法

实验方法

组织培养。

细胞系。胃类化合物由 E14 小鼠 ES 细胞产生。E14细胞系由Alexander van Oudenaarden提供。为了可视化胃类中的细胞膜，创建了一种细胞系，该细胞系表达与糖基磷脂酰肌醇 （GPI） 融合的荧光报告蛋白 mCherry。融合的 GPI 将 mCherry 蛋白锚定在细胞膜上。mCherry-GPI 细胞系是通过在 E14 细胞系中引入 GPI：mCherry 转基因而创建的。两种细胞系均在补充有 10% ES 认证胎牛血清（美国原产地，Gibco）、0.1 mM 2-巯基乙醇 （Sigma-Aldrich）、1 x 100 U/mL 青霉素/链霉素、1 x MEM 非必需氨基酸 （Gibco）、2 mM L-谷氨酰胺 （Gibco） 和 1000 U/mL 重组小鼠 LIF （ESGRO） 的 KnockOut DMEM 培养基 （Gibco） 中常规培养。细胞在组织培养处理的培养皿中生长，这些培养皿在37°C下预涂有0.2%明胶至少10分钟。 细胞每周传代 3 次，比例为 1：6，最多 20 次传代。细胞培养物保持在 37°C 和 5% CO2.

胃样培养。为了培养胃类动物，我们遵循了van den Brink等人[4]最初描述的方案。在 37°C 下用胰蛋白酶-EDTA （0.25%） 解离 3 分钟后，从培养皿中收集 ES 细胞。 通过加入等量的培养基停止胰蛋白酶消化，然后用移液管轻轻研磨并离心（300 rcf，3 min）。将细胞沉淀重悬于2 mL新鲜制备的N2B27培养基中：含有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的DMEM / F12，不含补充有0.5 x N2添加剂（Gibco），0.5 x B27添加剂（Gibco），0.5 mM L-谷氨酰胺（Gibco），0.5 x MEM非必需氨基酸（Gibco），0.1 mM 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich）和1 x 100 U / mL青霉素/链霉素的HEPES（Sigma，D8062）。对细胞进行计数以确定细胞浓度。将总共 200 个细胞接种在 U 形底低粘附性 96 孔板 （Greiner CELLSTAR） 中，每孔 40 μL 的 N2B27 培养基中。48 小时后，通过向每个孔中加入 150 μL N2B27 培养基，将所得聚集体暴露于 GSK-3 抑制剂CHIR99021 （Axon Medchem） 的 24 小时脉冲中，补充有 3 μM CHIR99021。在细胞接种后72小时，通过用新鲜的N2B27培养基替换每个孔中150 μL的培养基来停止24小时CHIR99021脉冲。在接种后96小时，收集并固定胃状体以分析其形状。对于图 1，在细胞接种后 48 小时和 72 小时也收集了胃类。随着时间的流逝，我们通过以 1：16 的比例接种 E14-GPI：mCherry ES 细胞和常规 E14 ES 细胞的混合物来培养嵌合胃体。对于ROCK抑制实验，在细胞接种后72小时将10 μM的ROCK抑制剂Y-27632（Sigma）加入N2B27培养基中。用Y-27632处理持续24小时，直到细胞接种后96小时。对照组在细胞接种后72小时接受不含Y-27632的N2B27培养基。我们为这个实验总共进行了两次生物学重复。

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图 1. 使用 LOCO-EFA 对胃类进行实验观察和形状量化。

答：48 h、72 h和96 h后固定胃的代表性图像。用DAPI对细胞核进行染色。显示的是 z 堆栈的中平面。比例尺：100 μm（48 小时和 72 小时），200 μm（96 小时）。B：从该图像创建的带有二进制掩码的胃状体图像。L 的数值2/L1和 L3/L1对于这个胃类化合物是给予的。比例尺：100 μm。 C：在72小时（n = 132，两个生物学重复）和96小时（n = 413,8个生物学重复）时对测量的胃类动物进行LOCO-EFA分析。每个数据点都是一个胃食体。散点图显示了缩放的 LOCO-EFA 系数 L2/L1和 L3/L1.3 个插图显示了 LOCO-EFA 散点图中突出显示的胃类图像。用DAPI对细胞核进行染色。显示的是 z 堆栈的中平面。对于每个胃类动物，缩放的 LOCO-EFA 系数 L2/L1和 L3/L1是给定的。比例尺：100 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.g001

免疫染色。

固定和阻滞。通过将胃类化合物在 4°C 下在 4% 多聚甲醛（PFA，Alfa Aeser）中孵育 4 小时来固定胃类化合物。通过在补充有1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中洗涤3次来停止胃类化合物的固定。在免疫染色之前，将胃类化合物在 4°C 下在封闭缓冲液（PBS、1%BSA、0.3% Triton-X-100）中孵育至少 1 小时。

全挂载免疫标记。如图2A所示，胃类的全安装免疫标记基于Dekkers等人[20]描述的方案。简而言之，在固定和封闭后，将胃类化合物与一抗在补充有0.02%十二烷基硫酸钠（SDS）的类器官洗涤缓冲液（OWB）（PBS，0.2%BSA，0.1%Triton-X-100）中孵育，称为OWB-SDS。在 4°C 下在滚动混合器 （30 rpm） 上孵育过夜。使用以下一抗：大鼠抗SOX2（1：200,14–9811-82，Thermo Fisher Scientific），山羊抗T（1：200，AF2085，R&D Systems）和大鼠抗Cerberus1（1：200，MAB1986，R&D Systems）。第二天，在室温（RT）下在管旋转器上的OWB-SDS中洗涤胃类物质2小时。此步骤总共重复了三次。洗涤后，将胃类药物与二抗和 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1 μg/mL，Merck）在 OWB-SDS 中于 4°C 在黑暗中在滚动混合器 （30 rpm） 上孵育过夜。使用了以下二抗：驴抗大鼠 Alexa Fluor 488（1：400，A-21208，Thermo Fisher Scientific）、驴抗山羊 Alexa Fluor 555（1：400，A-21432，Thermo Fisher Scientific）、驴抗山羊 Alexa Fluor 488（1：400，A-11055，Thermo Fisher Scientific）和鸡抗大鼠 Alexa Fluor 647（1：400，A-21472，Thermo Fisher Scientific）。第二天，在室温下用OWB-SDS在管旋转器上再次洗涤胃液3次2小时。洗涤后，立即对胃液进行成像或在4°C下储存，然后再成像。

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图 2. 差异粘连不能解释胃类的形状分布。

A：在72小时（左）和96小时（右）胃液中对Brachyury（洋红色）进行全脂免疫染色。显示的是最大 z 投影。细胞核用DAPI（灰色）染色。比例尺：200 μm。 B：模拟 120、30,000、60,000、90,000 和 120,000 个蒙特卡洛台阶的差异附着力得出的形状示例。不同的细胞类型/粘附强度用颜色表示。C，D：通过差异附着力模拟产生的形状的量化。显示的是一组形状的平均 LOCO-EFA 系数。阴影区域（在实验数据中）和垂直条（在仿真数据中）表示标准偏差。C：表面张力γ（c，M）变化。 斜率保持在对应于两个相邻细胞类型之间的张力γ（τ， τ+ 1）2.5的值。D：粘附梯度的斜率是变化的。偏移量保持在 25。L2/L1随斜率的增加而增加，但 L3/L1保持近似恒定。E：缩放的 LOCO-EFA 系数 L 的散点图3/L1与 L2/L1用于偏移量 25 和斜率 2.5 的差异附着力的实验数据和模拟。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.g002

切片的冷冻切片和免疫标记。为了准备用于冷冻切片的胃类物质，首先将胃类物质在蔗糖溶液（10%、20%和30%的PBS溶液）中在27°C下依次孵育30分钟。 在这些蔗糖孵育步骤之后，将胃类化合物转移到 10 × 10 × 5 mm （Sakura） 的 Tissue-TEK 冷冻中。在那里，去除 30% 的蔗糖溶液，并用最佳切割温度 （O.C.T.） 化合物 （VWR） 代替。将 O.C.T. 填充的冷冻模具在干冰上快速冷冻并储存在 -80°C 直至切片。在切片当天，将低温模具转移到低温恒温器中，使其达到-20°C的切割温度。 大约一小时后，取下低温模具，并将 O.C.T. 块安装在低温恒温器上。切割厚度为 10 μm 的切片并放置在 Epredia SuperFrost Plus 附着力载玻片 （Merck） 上。载玻片在 -80°C 下储存直至染色。为了对切片进行免疫荧光染色，在室温下解冻载玻片，然后用 PBS 洗涤 10 分钟以溶解 O.C.T。洗涤后，将切片在 4°C 下孵育过夜，并将以下一抗稀释在封闭缓冲液中：大鼠抗 SOX2（1：200,14-9811-82，Thermo Fisher Scientific）、山羊抗 T（1：200，AF2085，R&D Systems）和兔抗 Ki-67（1：200，MA5-14520，Thermo Fisher Scientific）。第二天，载玻片在室温下的PBS中洗涤两次，每次10分钟。洗涤后，将载玻片在 4°C 下与 DAPI（1 μg/mL，Merck）和在封闭缓冲液中稀释的以下二抗一起孵育 4 小时：驴抗大鼠 Alexa Fluor 488（1：400，A-21208，Thermo Fisher Scientific）、驴抗山羊 Alexa Fluor 555（1：400，A-21432，Thermo Fisher Scientific）和驴抗兔 Alexa Fluor 647（1：200，A-31573，Thermo Fisher Scientific）。4小时后，在室温下用PBS洗涤载玻片3次10分钟。最后，将切片安装在 ProLong Gold 抗淬灭封片剂 （Thermo Fisher Scientific） 中。载玻片在室温下固化48小时，然后再成像。

成像。

固定胃类的影像学检查。为了对全体免疫染色的胃类进行成像，将胃类转移到μ载玻片 8 孔玻璃底室 （ibidi， Cat.No 80827） 中。全安装胃液和冷冻切片胃液均在配备 Andor iXON Ultra 888 EMCCD 相机和专用定制荧光滤光片组 （Nikon） 的尼康 Ti-Eclipse 落射荧光显微镜上成像。使用10×/0.3 Plan Fluor DLL物镜（Nikon）或20×/0.5Plan Fluor DLL物镜（Nikon）拍摄图像。收集全安装胃类的Z-堆栈，平面之间的距离为10 μm。免疫染色冷冻切片的图像在 ImageJ 中进行预处理，以去除存在于 Brachyury/T 和 SOX2 通道中的非特异性背景信号。对于这些通道，使用滚球函数（半径：100 像素 = 64 μm）减去背景。

光片显微镜上的延时成像。在细胞接种后91小时至96小时之间，在伸长的最后几个小时内对镶嵌胃突进行延时。使用自制的光片荧光显微镜进行成像，该显微镜可保持温度和一氧化碳2实验期间的水平常数分别为37°C和5%。在时间流逝期间，以 4 μ m 的步长和每个时间点 40 个平面拍摄 z 堆栈，从而覆盖了 160 μm 的成像深度。每张图像的曝光时间为 160 ms，每 10 分钟拍摄一次 z 堆栈，共 5 小时。mCherry荧光蛋白由561 nm激光激发，激光功率为50 μW（在像平面处测量）。当光片厚度为 8.7 μm 时，由光束的厚度（全宽半最大值，FWHM）确定，计算出样品平面处的辐照度为 79 W/cm2.

光片显微镜的设计。为了对马赛克胃泌体进行延时成像，我们使用了自制的光片荧光显微镜。该显微镜基于[21]中描述的设计以及对类器官成像[22]的一些改进。简而言之，该装置由一个照明臂、一个成像臂和一个定制的样品室组成。该装置的照明臂配备了一个 C-FLEX 激光合路器 （Hübner Photonics），它将三个二极管激光器（405 nm、488 nm、647 nm;06–01 系列，Cobolt）和一个二极管泵浦固态激光器（561 nm;06–01 系列，Cobolt）组合成一条通过单模/保偏光纤（kineFLEX、Qioptic）的路径。光纤的输出耦合到消色差准直器（PAF2-A4A，Thorlabs）以准直出射光束。准直光束首先通过中性密度滤光片轮，衰减系数设置为 10×，以保持像平面处的激光功率较低。然后，衰减光束进入一个两轴偏转单元（MINISCAN-II-10，Raylase），其两个振镜扫描镜由桌面设备（ScanMaster SM1000，Cambridge Technology）控制。远心 F-Theta 透镜（S4LFT0061/065，Sill Optics）连接到偏转单元的输出端，以确保反射镜对光束的角偏转转化为试样中的线性位移。因此，沿一个轴扫描光束会产生虚拟扫描的光片。在扫描头之后，光束被发送到构成潜望镜的两个运动学反射镜，以将光束带到样品室的高度。然后，光束穿过镜筒透镜（f = 200 mm，尼康）以获得准直光束。镜筒透镜放置在照明物镜的前面，使其焦平面与照明物镜的后焦平面重合。照明物镜是一个 10× 倍率的浸水物镜（CFI Plan Fluor 10X W，0.3 NA，16 mm W.D.，尼康）水平定向，并将虚拟扫描的光片投射到样品平面上。测得的薄片厚度为 8.7 μm （FWHM）。在成像臂中，发射的荧光通过25×倍率的浸水物镜（CFI75 Apochromat 25XC W，1.1 NA，2 mm W.D.，Nikon）从下方收集。位于检测物镜下方的运动学反射镜将发射的荧光引导通过放置在电动滤光片轮（FW103H/M，Thorlabs）内的发射滤光片。使用 605/15 发射滤光片（FF01–605/15-25，Semrock）收集来自 mCherry-GPI 细胞的发射荧光。然后，滤光通过镜筒透镜（f = 200 mm，尼康），将图像投射到sCMOS相机（Iris 15，Teledyne Photometrics）上。照明和检测物镜安装在定制的样品室中。在这个腔室中，温度由外部水浴（CORIO CD-B13，Julabo）调节，该水浴在给定温度下连续供水。样品室中位于样品架高度处的排水管将多余的水返回到水浴中。公司2样品室内的液位由 CO 控制2传感器和控制器（ProCO2 P120、Biospherix）。样品架分别沿 x、y 和 z 轴通过三个线性定位器（SLC-24、SmarAct）移动。将标本放入一次性、即用型、无菌的TruLive3D培养皿（TruLive3D，布鲁克）中。其中两个培养皿可以放置在定制的样品架中。TruLive3D培养皿的透明FEP箔具有弯曲的形状，但折射率与水的折射率相匹配。因此，它将培养皿内的细胞培养基与标本室外部的水分离，而不会引入折射。

计算方法

胃状快照的形状分析。

从图像中提取形状。为了能够定量胃状体形状，收集并处理了固定的、DAPI染色的胃类的宽视场图像。为了提取形状，我们开发了一种计算工具，可以将形状（通常是一张图像中的多个形状）分割成单独的二进制掩码。分段步骤如下所述。首先，我们对标准偏差为 5 像素的图像应用了高斯滤波器。然后，我们用Otsu的方法[23]找到了一个全局阈值。我们将阈值应用于过滤后的图像，随后对生成的二进制图像应用半径为 10 像素的膨胀和开放，以避免分割对象出现孔洞。接下来，我们计算了从每个前景像素到最近背景像素的平均欧几里得距离，并在距离矩阵中确定了局部最大值。选择最小距离为 70 像素的局部最大值作为图像中每个对象的标记。背景被添加为附加标记。此外，我们在滤波后的图像上使用了 Scharr 变换 [24] 来生成高程图。然后，我们以标记为起点，在高程图上应用了分水岭算法[25]。大小小于 1000 像素的对象以及接触图像边界的对象被排除在外。

瓣贡献椭圆傅里叶分析。由于胃状体形状的复杂性，我们发现标量形状指标不足以充分描述观察到的形状分布。因此，我们采用了最近对经典傅里叶分析方法的改进来描述形状。叶贡献椭圆傅里叶分析（LOCO-EFA）[15]是为量化细胞形状而开发的，但可以应用于任意二维紧凑的形状。LOCO-EFA 系数 Ln量化具有 n 个波瓣的模态对二维形状的贡献。L1因此，本质上是形状线性大小的度量。为了使实验数据（以物理空间单位测量）与模拟（在没有物理尺寸规范的晶格上运行）具有可比性，L 的所有值n（对于 n ≥ 2）通过除以 L 进行缩放1各自的形状。对于模拟形状，从 100 个独立模拟中计算平均 LOCO-EFA 系数。对于实验形状，从源自 2 个生物学重复（72 小时时间点，n = 132）或 8 个生物学重复（96 小时时间点，n = 413）的胃类化合物计算 LOCO-EFA 系数。

光片显微镜测量分析。

图像去噪。在分析之前，在斐济[26]在胃突周围裁剪了马赛克mCherry-GPI胃状体的延时图像，以减小文件大小。接下来，使用基于Noise2Void（N2V）机器学习的方法对每个时间点的z堆栈进行去噪[27]。N2V 直接对要去噪的数据进行训练，不需要嘈杂的图像对或干净的目标图像。我们的延时数据集由 31 个 z 形堆栈组成，每个 z 形堆栈包含 40 个图像平面，（裁剪）面积为 2960 × 1878 像素。总共从单个 z 堆栈中提取了 10672 个大小为 32 × 64 × 64 像素（z、y、x）的非重叠 3D 补丁。90%的补丁用于训练，10%用于预测。在一个 GPU 上的其中一个 z 堆栈上训练模型，每个 epoch 使用 200 个 epoch 和 75 个训练步长，大约需要 4 个小时。经过训练的模型可用于对未用于训练但使用相同图像设置记录的数据进行降噪。新数据应具有与训练数据相似的噪声分布。在整个时间流逝过程中，我们检测到噪声分布的波动。因此，我们训练了三个不同的模型：第一个模型是在 1圣时间点，仅用于预测来自该时间点的 z 堆栈的去噪图像;第二个模型是在7上训练的第时间点，用于预测来自 2 的 z 堆栈的去噪图像钕至 7第时间点;第三个模型在最后一个时间点进行训练，用于预测来自 8 个 z 堆栈的去噪图像第到最后 （31圣） 时间点。三个模型的原始图像和去噪图像的示例显示在（S1图）中。为了能够对去噪图像和原始图像进行定性比较，将每个图像的最小显示值设置为 5第图像强度分布的百分位数。

形状动态。为了可视化胃泌体在时间流逝过程中的变化形状，在延时的第一个和最后一个时间点，在胃泌体的最大 z 投影顶部绘制了多边形，连接相同的细胞。为了进一步分析二维形状是否像 CE 预期的那样显示出延长和变窄，我们比较了第一个和最后一个时间点之间的拟合椭圆的长轴和短轴的长度（参见上一节）。我们还通过比较从二进制图像中获得的 2D 区域的大小来观察整体尺寸的增加。

单细胞跟踪：对胃瘤样旋转和漂移进行校正。为了使三维延时数据与二维模拟数据具有可比性，使用 Fiji 为每个时间点生成去噪图像堆栈的最大 z 投影。总共有 14 个表达 mCherry-GPI 的细胞在斐济使用点工具进行手动追踪。从这 14 个细胞中，有 4 个细胞在时间流逝期间分裂。对于这些细胞，在分裂后追踪两个子细胞。为了将这 14 个细胞的轨迹与在模拟伸长的胃中移动的细胞的轨迹进行比较，我们还追踪了计算机模拟细胞。为了便于观察，我们将 200 个单元格中的 20 个单元格涂成灰色（参见 S3 视频），并分别存储它们的中心位置。最终，选择了 12 个细胞的轨迹作为绘图，以显示具有代表性的轨迹，同时最大限度地减少它们之间的重叠。在进一步分析体外和计算机细胞的轨迹或绘制在图像上之前，由于胃类取向随时间的变化（旋转校正）以及由于胃类中心位置随时间的变化而校正细胞位置的位移（漂移校正）。为了计算和校正这些偏移，我们首先使用OpenCV Python软件包[28]中的工具将延时摄影或模拟的图像转换为掩模。对于延时图像，我们首先对图像应用了高斯模糊（内核 = 51 × 51 像素）。接下来，我们应用阈值 40/255 来创建二进制图像。由于 t = 1 和 t = 26 时的整体图像强度与其他图像略有不同，我们对这些时间点使用了不同的阈值（分别为 63/255 和 45/255）。为了填补生成的二进制图像中的漏洞，我们应用了膨胀（内核 = 5 × 5 像素，迭代 = 40），然后是侵蚀（内核 = 5 × 5 像素，迭代 = 40）。对于模拟图像，我们通过应用侵蚀（内核 = 5 × 5 像素，迭代 = 4）然后膨胀（内核 = 5 × 5 像素，迭代 = 4）将已经二进制的图像转换为掩码。接下来，我们使用 scikit-image Python 包 [29] 中的 EllipseModel 函数将椭圆拟合到掩码上。从拟合的椭圆中，我们获得了中心坐标和椭圆长轴与逆时针旋转时最近的正交轴之间的角度θ（x轴为硅类胃类，y轴为体外胃类）。通常，EllipseModel 函数报告的 θ 与实际 θ 相差 π/2。我们通过比较相邻时间点或蒙特卡罗步长来检测并纠正此误差的 θ。最后，为了校正胃状体旋转，我们应用了一个旋转矩阵，该矩阵将细胞位置旋转 θ。为了校正胃泌体随时间的漂移，我们校正了每个时间点或蒙特卡洛步长发现的拟合椭圆中心坐标变化的细胞位置。为了在延时摄影或模拟的最终图上绘制校正后的轨迹，我们旋转了轨迹，使它们与胃的最终方向相匹配。对于体外胃食，初始和最终时间点分别为 91 小时和 96 小时。在模拟中，我们选择了 20,000 个蒙特卡罗步 （MCS） 作为起点，因为以前胃泌素的伸长轴没有明确定义。在最后一个时间点，我们使用了 100,000 个 MCS。在 17 个时间点绘制轨迹，平均分布在 20,000 到 100,000 MCS 之间。

单细胞跟踪：在胃状轴上的投影。我们计算了细胞在时间流逝（91 h—96 h）或模拟（20,000—100,000 MCS）期间沿胃状体长轴行进的距离，并将该距离与每个细胞在最后时间点或投影在长轴上的蒙特卡洛步骤的位置进行对比。在延时或模拟期间沿胃短轴行进的距离（S2（B）图中的y轴）以类似的方式计算（见S2（A）图，下图为示意图）。我们还考虑了细胞在延时或模拟期间沿胃泌体短轴行进的方向，并绘制了沿短轴（S2（C）图中的y轴，下图）相对于每个细胞在最终时间点或蒙特卡洛步骤的位置的行进距离，投影在长轴上（S2（C）图中的x轴，底板）。为了可视化沿短轴的运动方向，我们通过沿短轴向内或向外移动来为细胞着色。向内移动（朝向短轴）的细胞被涂成橙色，向外移动（远离短轴）的细胞被涂成深蓝色，在时间流逝或模拟期间向外移动但越过短轴的细胞被涂成浅蓝色（见S2（C）图，上图）。

为了可视化，对于模拟胃中每个细胞，它向哪个方向移动，我们将净运动（最终位置 - 初始位置）绘制为最终时间点每个细胞中心位置顶部的向量。为了计算这种净运动，我们使用了上一段中描述的针对旋转和漂移进行校正的单元格位置。为了便于可视化，将矢量的大小除以 20 倍，以避免箭头重叠。箭头使用“暮光之城”循环颜色图根据其方向进行着色。

宽视场显微镜延时电影分析。

在宽视场显微镜[30]上拍摄的72 h至96 h之间发育中的胃状体的现有明场延时电影通过手动提取胃状体轮廓进行分析，直到分别在94 h、91 h 40 m和88 h 40 m后部分离开视野。在明场通道中的任何胃状分化实验中，大量从胃状体中脱落的细胞的存在禁止自动分析。

增殖细胞的空间分布。

对于每个切片，通过在斐济应用几个分割步骤获得增殖（Ki-67阳性）细胞的位置[26]。首先，对图像施加高斯滤波器（半径 1 像素）。接下来，应用二进制操作“填充孔”，然后应用二进制操作“Watershed”。在四个部分（左上角 （n = 24）、右上角 （n = 30）、左下角 （n = 23）、右下角 （n = 18））中总共检测到 n = 96 个细胞核。各个部分的轮廓是手动绘制的，并转换为二进制蒙版。将掩码中的每个像素视为一个数据点，我们使用 scikit-learn 包 [31] 来计算主成分，这些主成分对应于掩码/胃泌体的长轴或短轴。然后将原子核的质心位置投影到两个轴上，并沿各自的轴缩放到掩模的延伸，这导致相对位置的值在 0 到 1 之间。

模拟。

细胞 Potts 模型。使用细胞Potts模型进行模拟，如[16,17]中首次引入的那样。 Cellular Potts 模型模拟规则晶格上的细胞，并将细胞表示为连接晶格位点的斑块。每个晶格位点都与一个自旋或单元 ID 相关联。然后，单元 C（s） 被定义为自旋 s 的晶格位点的集合，通常连接。自旋 σ = 0 是为介质 M 保留的特殊状态。

系统的状态由哈密顿量 H 给出，它描述了系统中所有单元之间的力平衡。使用Metropolis算法[32]对哈密顿量进行最小化，该算法随机尝试以牺牲相邻单元为代价，将一个单元C（s）扩展一个晶格位点。更准确地说，在其中一次复制尝试中，随机选择一对相邻的晶格位点，其中 和 的 摩尔邻域，即 的直接和对角线相邻位点的集合。然后，ΔH 成为将自旋复制到 而产生的能量变化。假设接受此变化的概率服从温度为 T 的玻尔兹曼分布：

(1)

在该模型中，T 决定细胞运动。复制尝试旨在模仿伪足延伸，因此代表了物理上合理的微观动力学。因此，我们可以同时考虑系统的平衡状态及其时间动态。时间以蒙特卡罗步长 （MCS） 为单位进行，其中一个步长定义为 |Λ|复制尝试，即常规Cellular Potts模型实现中的晶格位点的数量。

一般的 Cellular Potts 模型由哈密顿量给出，

(2)

其中第一个和在所有相邻晶格位点对上，第二个和在所有单元上。一个T和 LT是目标区域和目标长度。在这项研究中，使用了 100 像素的目标区域和 10 像素的目标直径。由于由 100 像素组成的球形单元的直径为 ～ 11 像素，因此该目标长度确保了单元倾向于保持球形。 是细胞之间每单位长度的界面能量，其中 τ ∈ M、1、2 分别显示为白色、红色和黄色，表示细胞类型，δ 是克朗内克增量。该哈密顿量在每个模型中扩展了附加项，定义如下。

我们进一步将表面张力定义为[17]，

(3)

如果 γ（c， M） > 0，则细胞倾向于保持连接，而如果 γ（c， M） < 0，则细胞倾向于分散。 同样，如果 γ（1， 2） > 0，则细胞类型 1 和 2 倾向于分选，而如果 γ（1， 2） < 0，则细胞类型倾向于混合。

每个模拟都使用不同的随机种子。除非另有说明，否则我们对每组参数进行了 100 次独立模拟。

差异粘附模型。通过定义 10 种细胞类型 τ ∈ {1， ...， 10}，介质的界面能量为 25，细胞类型 τ 和 τ′ 之间的粘附力由 J（τ， τ′） = O + | τ ? τ′|? S.这里 O 表示偏移量，S 表示不同粘附能的斜率。因此，我们得到了：

(4)

在模拟过程中，O 和 S 是固定的。

在模拟的初始状态下，根据粘附梯度对 10 种细胞类型进行预排列。或者，也可以以未排序的方式初始化单元，以模拟对称性破坏。然而，最初混合的组织导致的形状不那么细长[33]。因此，从预分类细胞开始的模拟有更好的机会来概括实验中发现的更细长的形状。

丝状张力模型。为了模拟爬行驱动的 CE，我们根据 [19] 中提出的丝状张力模型，在哈密顿量中添加了一个额外的项。在这个模型中，彼此靠近但不一定相邻的细胞可以通过丝状伪足相互施加拉力，丝状伪足在分配给每个细胞 C 的极化 P（s） 周围形成一个双锥体。从细胞中心，我们创建了一组最多 n麦克斯丝状伪足在角 θ 的双锥内随机麦克斯和半径 r麦克斯围绕电池的极化 P（s）（图 3A）。如果这些丝状伪足位于视锥细胞内，则它们可以连接到相邻细胞的质心。丝状伪足在 t 后刷新间隔蒙特卡洛台阶。丝状伪足施加的拉力由 ΔH 中的附加项给出，

(5)

对于一些常数 λF.我们将所有丝状体的总和，其中 Ri，之前是它们的当前长度和 Ri，之后它们的新长度由复制尝试产生。

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图 3. 包括爬网驱动的 CE 在内的仿真再现了平均 LOCO-EFA 系数。

答：具有自组织首选方向的丝状张力模型示意图。绿色和蓝色箭头表示细胞的偏振方向。突出显示的细胞 s 可以围绕其偏振方向在阴影的蓝色锥体内扩展丝状伪足。这种丝状伪足目前附着在细胞上1、s2和 s3，由细胞中心之间的链接表示。小区s的新偏振方向是其旧偏振方向和小区s的平均偏振方向的加权平均值1、s2和 s3.最右边的面板以蓝色箭头的形式显示单元格 s 的新偏振方向。旧的偏振方向由粉红色箭头指示。B：使用 100、25,000、50,000、75,000 和 100,000 蒙特卡洛步长的一种像元类型模拟生成的示例形状。C，D：通过爬行驱动的 CE 模拟产生的形状的量化。显示的是一组形状的平均 LOCO-EFA 系数。阴影区域（在实验数据中）和垂直条（在仿真数据中）表示标准偏差。C：与介质的相互作用强度各不相同。拉力保持在15。D：拉力各不相同。介质的表面张力保持在5。E：缩放的 LOCO-EFA 系数 L 的散点图3/L1与 L2/L1用于爬行驱动 CE 的实验数据和模拟，拉力为 λF= 15，表面张力 γ（c， M） = 5。这些参数给出了比较实验和模拟的最小 2D Kolmogorov-Smirnov 检验统计量 （D = 0.40， p = 9.3 ? 10?9).F：实验观察到的形状（底部）与高度相似的模拟形状（顶部）及其相应的缩放LOCO-EFA系数L的示例3/L1和 L2/L1.底部：96小时固定胃食体。显示的是 z 堆栈的中平面。用DAPI对细胞核进行染色。比例尺：200 μ米。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.g003

每次刷新丝状伪足时，都会根据Vicsek模型[34]调整细胞的极化，并具有记忆因子，但没有噪声（图3A）。考虑一个极化方向为 P（s） 的细胞 C（s），该细胞将丝状伪足附着在细胞 C 上 1）， ...， C（sn） 偏振方向为 P（s1）， ...， P（s2).然后，邻居的平均极化为

(6)

细胞 x 的新极化计算公式为

(7)

在我们的模拟中，我们使用了 w = 0.99，但出于说明目的，在（图 3A）中选择了 w = 0.85。这种高记忆参数对于实现类似于测量的胃类的形状分布是必要的。在对该参数进行实验后，选择了 0.99 的值。w的较小值导致近乎瞬时的全局极化，并产生极其狭窄的组织，如[19]所示。该研究实施了不同的偏振调整，其中细胞的复极化是根据连接细胞的位置而不是它们的偏振方向计算的。此外，还假定存在一个全球首选方向。我们已经完全删除了这个假设。在我们的模拟中，所有细胞都以 [0， 2π] 范围内的均匀随机极化方向开始。

默认参数。默认参数列表可在表 1 中找到。这些只有在手稿中明确提及时才会被更改。

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表 1. 模拟中使用的默认参数。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.t001

实施。我们使用 Tissue Simulation Toolkit [35， 36] 实现了 CPM。为了提高组织模拟工具包中的模拟速度，我们实现了边缘列表算法，该算法仅选择边缘，即具有不相等自旋 （） 的相邻晶格位点 （） 对。因此，边列表算法会跟踪那些在复制时会改变配置的晶格位点对，从而提高效率，特别是对于大型单元的仿真。这种新算法引入了一种高效的采样和更新方法，通过跟踪一堆边缘索引来改进以前的边缘列表算法[37]。以前的算法需要定期进行碎片整理，以保持列表中的邻接关系并保持效率。

设边 e 由一对相邻的晶格位点定义，其中 和 E 是胞界面处的一组边 e，即 。边列表算法为每个边 e ∈ E 分配一个从 0 到 |Λ|? n铌? 1，其中 |λ|是晶格大小和 n铌每个格子站点的邻居数。在初始化过程中，代码构造两个耦合列表，称为 edgelist 和 edgeindices，以将所有边存储在 E 中。在列表边列表中，所有边都存储为扁平化的 3D 数组，使得最外层的环在 y 坐标上运行，中间的环在 x 坐标上运行，最内层的环在晶格位点的相邻点上运行，其中晶格的边界状态被排除在外。即，列表的第 i 个条目对应于邻居 nb = （i mod n铌） + 晶格位点 p 的 1 = ?i/n铌?，可以在位置找到。如果对于格位点及其第 nb 个邻居，则边缘索引将收到一个从 0 到 |E|? 1 位于位置 i，否则值为 ?1。在边缘索引中，第一个 |E|条目表示值大于 ?1 的 edgelist 条目的位置，而后续条目等于 ?1（表 2）。这确保了一个列表中的值与另一个列表中值不等于 ?1 的位置之间是 1 对 1 的关系。

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表 2. 边缘列表数组的示例。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.t002

对于每次复制尝试，即尝试将晶格位点复制到相邻的晶格位点，我们从边缘索引中随机采样一条边。如果接受复制尝试，则通过循环访问已更改站点的邻域来相应地更新这两个列表。在位置添加新边 |E|在 edgeindices 中。如果必须删除 edgeindices 中位置 i 处的边，则最后一个位置的边 |E|? 1 将替换此边，使边缘索引保持连续列表。列表边缘列表也会更新，以便保留两个列表之间的 1 对 1 关系。这种关系对于从这些列表中有效更新和抽样至关重要。此外，每个蒙特卡洛步骤的复制尝试次数已更改为 |E|/n铌每个蒙特卡洛步骤的复制尝试次数，其中 |E|在蒙特卡罗步骤中可能会有所不同，从 |Λ|传统算法中的复制尝试。这种重新缩放是合理的，因为在传统的细胞波茨模型中，复制尝试有概率选择属于两个不同细胞的一对晶格位点，因此 |E|/n铌这些对平均按常规蒙特卡罗步长选择。

为了有效地安排仿真，我们在莱顿大学提供的高性能集群 ALICE 上使用了 GNU 并行 [38]。

实验与模拟的比较。

噪声和晶格常数的影响。我们将 LOCO-EFA 分析限制在前三种模态中，因为较高的模态对形状的贡献较小，但受 CPM 模拟的随机性质和晶格的影响更大（S3 图）。较低的 LOCO-EFA 系数对这种影响不太敏感，因为相应波瓣的典型长度尺度远大于模拟的晶格常数和单个细胞的直径。

2D Kolmogorov-Smirnov 检验。我们使用Kolmogorov-Smirnov检验（Fasano-Franceschini检验）[39]的二维版本来确定哪个模型变体和哪个参数集与实验数据最拟合。检验统计量 D 衡量两个分布的相似性。两个相同的分布导致 D = 0，而两个完全分离的数据点分布导致 D = 1。这里完全分离意味着我们可以找到一个点 （x， y），使得当通过 （x， y） 绘制轴时，两个分布位于相反的象限中。 计算原假设的 p 值，即两个经验分布是从相同的基础分布中抽取的。在模型中，将 100 个模拟与完整实验数据集进行比较，将 100 个模拟与完整实验数据集进行比较，将最佳参数集视为给出最低 D 值和最高 p 值的参数集。同样，根据D为各自的最佳参数集选择最佳模型变体（在两种细胞类型的情况下）。Fasano-Franceschini检验是使用R中的现有实现计算的[40]。

结果

胃状伸长导致各种形状

我们根据 [4] 开发的原始方案生成了胃类，并通过在多个时间点的宽场荧光成像可视化了它们的形状。48小时后，细胞形成球形聚集体（图1A）。此时，通过添加 GSK-3 抑制剂激活 Wnt 通路。在许多其他功能中，Wnt 通路调节 AP 轴的形成。因此，胃类在大约72小时后开始伸长，到96小时时形成各种形状（图1A）。为了能够量化，我们从宽视场图像中提取了形状轮廓，这些图像是（三维）胃状体形状的二维投影。为此，我们开发了一种计算工具，可以分割胃类，并将其形状表示为单独的二元掩码（图1B），参见材料和方法）。我们使用叶贡献椭圆傅里叶分析（LOCO-EFA）[15]分析了形状，这比传统的椭圆傅里叶分析更容易解释。LOCO-EFA 将形状轮廓分解为一系列模式，使得每个模式都有定义数量的波瓣。A 系数 Ln然后量化具有 n 个裂片的模式对形状的贡献。因此，虽然第一组分（L1） 表示形状的整体（线性）大小，L2和 L3分别指示存在 2 个或 3 个裂片。较大的 L 值3/L1因此表示更复杂的形状，而不仅仅是简单的椭圆。LOCO-EFA分析显示，胃类动物在96 h时比在72 h时更频繁地表现出更复杂的形状（图1C）。总而言之，我们的分析表明，胃类动物的形状比简单的椭球体更复杂。

差异附着力不足以解释观察到的形状

接下来，我们想找到观察到的形状分布的最简单的机理解释。首先，我们认为，即使在存在细胞迁移和增殖的情况下，均匀的细胞群也不会产生细长的形状。由于细胞和培养基之间的粘附，均匀的细胞聚集体将始终近似为球形，因为该形状最大限度地减少了细胞在固定总体积下与培养基的相互作用。因此，细胞聚集体有效地表现得像具有正表面张力的液滴。然而，胃液是异质的，并且在96小时时包含多种细胞类型[4,30]。这些细胞类型的粘附特性可能不同。因此，解释细长形状形成的最简单假设可能是细胞间粘附强度的差异，正如在基于CPM的差异粘附驱动的收敛延伸模型中首次探索的那样[33]。该模型由γ（c，M）参数化，即任何细胞c和介质M之间的表面张力，以及γ（τ，τ′），细胞类型τ和细胞类型τ′之间的表面张力（参见材料和方法）。该模型假设粘附差的线性梯度 γ（τ， τ′） = S ? | τ ? τ′|，其中 S 是梯度的斜率。在我们对差异粘附模型的模拟中，我们假设了 10 种不同的细胞类型，这些细胞类型最初是根据它们的粘附特性排列的。这种初始排列与胃类伸长前就已经发生的对称性破坏一致[4]。我们通过对原始条纹样细胞的标志物Brachyury进行染色，证实了胃样实验中多种细胞类型的存在。我们观察到这些细胞在胃状伸长后被强烈定位（图2A）。

正如假设的那样，差异粘附模型在 120,000 个蒙特卡洛台阶后产生了细长的形状（图 2B）。然而，更详细的分析表明，该模型无法解释实验观察到的形状。我们对两个参数进行了多次模拟，使用不同的值：胃表面的基线界面张力γ（c，M）和粘附梯度的斜率S。γ（c， M） 值越大，对应于较高的表面张力，导致 2 或 3 个裂片的 LOCO-EFA 系数略小（图 2C）。换言之，较高的表面张力导致与圆形形状的偏差较小，这是预期的。增加斜率参数 S 会增加相邻细胞类型 τ 和 τ + 1 之间的界面张力 γ（τ， τ + 1）。较高的γ（τ ， τ + 1）可减少细胞类型的混合，从而增加伸长率。正如预期的那样，我们观察到 L2/L1随着 S 的增加（图 2D）。L 的值3/L1然而，大致保持不变。由于组织在斜率高于所示斜率的模拟中开始崩解，因此我们无法获得 L 的值2/L1或 L3/L1在实验中观察到（图2E）。因此，差异粘附确实会导致形状有些拉长，但伸长率不如实验中观察到的那么明显。差异粘附似乎也不会驱动具有两个以上裂片的形状的形成。

具有自组织内侧轴的丝状张力模型概括了实验结果

在发现差异粘附不足以解释观察到的形状后，我们采用了Belmonte等[19]的CE模型进行模拟。该模型模仿了 CE 的“爬行”模型。它假设细胞通过优先垂直于预定义的偏振轴延伸的丝状突起相互施加拉力。这些突起是短暂的，新的突起会周期性地延伸。由于拉力，组织沿预定义的轴伸长并在垂直方向上变窄，正如 CE 中预期的那样。

没有理由假设胃类动物存在外在强加的内侧取向。因此，我们修改了Belmonte等[19]的模型，使伸长轴以自组织的方式出现。在模拟开始时，我们为每个细胞分配了均匀随机的极化。与Belmonte等人相反，我们将极化方向定义为平行于而不是垂直于丝状突起延伸的方向。每隔几个蒙特卡洛步长，就会根据电池极化的加权平均值和通过突起连接的所有邻居的极化来确定新的极化（图3A）。电池自身极化的权重被选为高（通常约为 0.99），这反映了电池随着时间的推移保持其极化的趋势。由于这种机制，细胞局部排列，允许 CE 发生（图 3B）。

我们用这个新模型获得的形状最强烈地取决于两个参数：介质和细胞之间的表面张力 γ（c， M） 和拉力 λF细胞之间。增加表面张力γ（c，M）会产生更多的圆形（图3C），因为这种形状减少了细胞和介质之间昂贵的界面的长度。 我们还观察到，增加拉力 λF产生的圆形较少（图 3D）。使用简单的网格搜索，我们找到了导致平均 LOCO-EFA 系数与实验观察值相似的参数。值得注意的是，对于 15 到 20 之间的拉力，两个 L2/L1和 L3/L1在表面张力保持在5的恒定值的情况下，平均匹配实验值。在我们的参数范围内，没有发现表面张力的同时匹配。

平均 LOCO-EFA 系数当然是对形状分布的不完整描述，特别是如果这些分布不是单峰分布。因此，我们想直接比较实验和模拟的形状分布。为了使这种比较有意义，多次模拟运行之间的可变性不应仅仅归因于蒙特卡洛算法固有的随机性，而应反映胃状体形状的能量景观。为了探索模拟中波动的性质，我们进行了扩展长度的模拟，并可视化了LOCO-EFA系数空间中的轨迹以及从72 h至96 h之间胃类动物的延时显微镜得出的形状[30]（S4（A）图）。模拟的胃体起初几乎是球形的，由低L的初始运动表示2/L1和 L3/L1面积。接下来是快速移动的阶段，这导致了不同模拟运行的不同轨迹，最后模拟轨迹在系数空间中不断探索相当大的区域（S4（A）和S4（B）图）。实验观察到的胃类动物的轨迹沿L覆盖了类似的区间2/L1轴作为模拟的快速相位，而这里分析的具体实验实例并没有大的L3/L1元件。对于没有拉力的模拟，探索区域明显更小（S4（C）图）。接下来，我们比较了在快速阶段之前和之后使用拉动的模拟中LOCO-EFA系数的变异性，以及没有拉动的模拟。在 100 次拉动模拟运行中，有 92 次有 L2<前 50,000 个 MCS 的 0.25 和该初始阶段相应的 LOCO-EFA 系数与 100 次模拟运行进行比较，而无需拉动。在有拉力的模拟初始阶段，方差明显大于没有拉动的模拟（p < 10?323，Brown-Forsythe检验[41]）。同样，100 次模拟运行中有 85 次拉动显示为 L2> 0.25 表示最后 50,000 个 MCS。同样，在有拉力的模拟的最后阶段，方差明显大于没有拉力的模拟（p < 10?323，Brown-Forsythe 检验）。模拟中的这种较大差异（包括拉动）支持了这样一种观点，即模拟中的形状变化不仅仅是由于围绕急剧的全球能量最小值的随机波动，而是反映了（局部）平坦的能量景观。这种能量分布既是模拟之间的可变性的基础，也是胃状体形状的多样性的基础。因此，比较模拟和测量的形状分布是有意义的。

为了定量比较实验和模拟形状分布，我们对 LOCO-EFA 系数的联合分布使用了二维 Kolmogorov-Smirnov （KS） 检验。此检验的原假设假设从相同的基础分布中抽取两个经验样本。相应的检验统计量 D 介于 0 和 1 之间，如果两个经验分布相似，则较小，如果它们非常不同，则接近 1。我们还计算了否定原假设的p值。我们认为这些模型参数是最优的，在比较实验和模拟形状分布时，我们发现了最小的检验统计量 D。对于我们的爬行驱动 CE 模型，最优参数（拉力 λF= 15 和 γ（c， M） = 5） 导致平均形状系数与实验观察到的相似（图 3C 和 3D），但分布仍然不同（D = 0.40 和 p = 9.3 ? 10?9) (图3E）。这表明该模型无法完全概括形状变化方面的实验。尽管如此，我们还是能够找到几个通过计算创建的形状，这些形状与单个实验形状非常相似（图3F）。这表明我们的模拟可以产生逼真的形状。

由于我们的复极化机制与[19]中建议的机制不同，我们将结果（图3E）与使用原始复极化机制的模拟进行了比较。从定性上讲，两种模型都产生了各种各样的形状（S5图）。用二维 Kolmogorov-Smirnov 检验对形状分布进行定量比较，得出 D = 0.41 和 p = 7.4 ? 10?30，表明结果是不同的。

此外，我们还使用 [19] 中的代码对爬网驱动的 CE 进行了 3D 仿真，作为概念验证。拉力必须改为 λF= 150 对于此模拟，因为接触面在三维空间中对总能量的贡献相对较大。从定性上讲，这种模拟的 3D 胃泌素的发展类似于 2D 模拟（S6 图和 S1 视频）。由于 LOCO-EFA 方法没有 3D 等效物，并且必须使用不同的拉力，因此不容易在 2D 和 3D 模拟之间进行直接比较。合理的比较需要对 3D 模型进行参数扫描，这在计算上是不可行的。

总而言之，与差分粘附模型相比，爬行驱动的CE模型产生的形状与观察到的形状更相似，但形状分布仍与实验结果有显著差异。特别是，较大的 L 值2/L1和 L3/L1，为测量的形状找到，未通过模拟重现。

CE的协同爬行和差异粘附模型提高了与实验的一致性

当然，我们想知道爬行和差异粘附的结合是否可以进一步提高与实验结果的一致性。为了在CE模型的背景下创建细胞类型多样性的最小模型，我们添加了第二种细胞类型（以黄色显示）。为了实现细胞类型的空间分离，我们假设相似细胞之间的粘附力强于不同类型细胞之间的粘附力（图4A）。为了进行比较，我们还考虑了细胞类型混合在能量上有利的情况。当有两种细胞类型时，可以有多种变体的拉动。我们研究了四种不同的变体：（1）细胞只能将丝状伪足附着在相同细胞类型的细胞上（“相同类型”模型），（2）所有细胞都可以将丝状伪足附着到所有其他细胞上（“全部”模型），（3）只有黄色细胞可以将丝状伪足附着到其他细胞上（“黄色”模型）和（4）黄色细胞只能将丝状伪足附着在黄色细胞上（“黄黄色”模型）。再次使用 2D KS 检验来比较模拟和实验形状，我们发现“相同类型”模型可以提供与数据的最佳拟合（图 4）。（参见 S7、S8 和 S9 图，了解使用其他型号变体获得的结果）。

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图 4. 对具有两种细胞类型的爬行驱动的 CE 的模拟可创建更极端的形状。

答：模拟 100、25,000、50,000、75,000 和 100,000 个蒙特卡罗步长的相同类型拉动产生的形状示例。B，C：通过两种细胞类型的爬行和差异粘附驱动的 CE 模拟产生的形状的量化。显示的是一组形状的平均 LOCO-EFA 系数。阴影区域（在实验数据中）和垂直条（在仿真数据中）表示标准偏差。B：两种细胞类型之间的表面张力不同，拉力保持在20。C：拉力各不相同。两种细胞类型之间的表面张力保持在-4。D：缩放的 LOCO-EFA 系数 L 的散点图3/L1与 L2/L1用于爬行驱动 CE 的实验数据和模拟，拉力为 λF= 20，表面张力 γ（1， 2） = ?4。这些参数给出了最小的 2D Kolmogorov-Smirnov 检验统计量 D = 0.15，最大 p 值 p = 0.15。E：实验观察到的形状（底部）与高度相似的模拟形状（顶部）及其相应的缩放 LOCO-EFA 系数 L 的示例3/L1和 L2/L1.底部：96小时固定胃食体。显示的是 z 堆栈的中平面。用DAPI对细胞核进行染色。比例尺：200 μ米。

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两个 L2/L1和 L3/L1当细胞类型之间的表面张力γ（1,2）增加时，几乎保持不变（图4B）。然而，增加拉力导致 L 的平均值大幅增加2/L1和 L3/L1 (图4C）。在15至20的拉力下，模拟的平均LOCO-EFA系数与实验结果相似，两种细胞类型之间的表面张力保持恒定在-4。因此，使用一组固定参数的仿真能够再现平均实验形状。请注意，负表面张力会导致细胞类型混合，因为它有利于它们之间更大的界面。为了进行更详细的比较，我们考虑了形状的完整分布，并使用了 2D KS 测试（图 4D）。对于 15 的拉力和 -4 的表面张力，我们发现检验统计量为 D = 0.15，这远低于具有一种细胞类型的模型。相应地，p值较高（p = 0.15），这意味着在现有数据下，没有迹象表明模拟结果和实验结果不同。使用最优参数，我们评估了模型探索的系数空间，包括两种细胞类型（S4（D）图）。虽然在初始或拉长状态下没有观察到明显的能量最小值，但再次在没有拉力的情况下探索的空间要小得多（S4（E）图），这表明在模拟中观察到的变异性反映了潜在的能量景观。具有两种细胞类型的模拟胃类化合物表现出较高的 L 值2/L1和 L3/L1，与均质的胃类动物相比（图3E）。对这种效应的一种解释可能是，相同细胞类型的簇往往会变成圆形，从而导致形状稍微复杂一些。由于相同细胞类型的细胞被拉动，即使表面张力为负，细胞仍然略微分选。再一次，我们发现具有相似LOCO-EFA系数的模拟和实验产生了相似的形状（图4E）。总体而言，添加另一种细胞类型提高了CE模型与实验观察结果的一致性。

2D KS 检验将“相同类型”模型确定为最佳模型，因为在将模拟形状分布与测量形状分布进行比较时，它实现了检验统计量 D 的最低值。就其本身而言，这不能排除其他型号变体。在（S10图）中，我们报告了所有模型变体和各种模型参数的检验统计量D。对于所有测试参数，差异附着力表现不佳（S10（A）图）。在具有一种细胞类型的 CE 模型中，表面张力 γ（c， M） 和拉力值之间存在明显的相关性，从而产生良好的模型 （S10（B） 图）：如果拉力增加，表面张力也必须增加。对于具有两种电池类型的CE，最佳表面张力γ（1,2）和拉力之间的关系相反（S10（C），S10（D），S10（E）和S10（F）图）：需要用两种电池类型之间的较低表面张力来补偿较高的拉力。值得注意的是，对于大于 20 的拉力，“相同类型”、“全部”和“黄色全部”变体（S10（C）、S10（D） 和 S10（F） 图）的测试统计量迅速下降，因为形状在这种制度下变得非常不规则。对于我们考虑的最大拉力，组织甚至偶尔会分裂成多个不相连的部分。此外，“all-all”变体产生的形状分布显着不同 （p = 1.4 ? 10?7）从所有参数值的测量形状分布（S10（D）图）来看，而Bonferroni校正后其他模型变体的差异不显著（分别为p = 0.15，p = 0.0098和p = 0.12）（S10（C），S10（E）和S10（F）图）。总之，在测试的模型变体中，“相同类型”和“黄黄”模型在一系列模型参数上与实验数据匹配良好。需要直接测量细胞粘附力或施加的力，以最终确定模型变体之间的结果。

胃类动物的延时成像揭示了 CE 的特征

接下来，我们寻找胃类中CE的直接证据。为此，我们创建了嵌合胃类，主要由大部分未标记的野生型 mESC 和一小部分 （1：16） 具有组成型荧光质膜的 mESC 组成（用 mCherry 荧光蛋白标记的 GPI 膜锚）。这些镶嵌胃状体使我们能够使用光片荧光显微镜随时间追踪单个细胞（见图5A和S2视频）。

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图 5. 胃类的延时成像揭示了 CE 的标志。

A：分化 91 小时（左）和 96 小时（右）后胃泌素的最大 z 投影。细胞轨迹是叠加的。胃的轮廓用黄色虚线表示。大约每 16 个细胞中就有 1 个表达 mCherry-GPI，其荧光标记膜。在实验期间追踪了其中的14个细胞，总共有31个时间点（间隔10分钟）。带有白色核心的圆圈显示细胞在 91 小时的位置。菱形显示了细胞在 96 小时时的位置。分裂细胞由一个带有深色核心的圆圈表示。对于每个分裂细胞，追踪两个子细胞。第 91 小时的插图显示了对被追踪的单元格编号 9 的放大。比例尺：200 μm，插图 10 μm。B：由所选单元格的位置定义的形状变形。比例尺：200 μm。 C：在 20,000 蒙特卡洛台阶（左）和 100,000 蒙特卡洛台阶（右）处模拟马赛克胃的静态图像，显示 20 个灰色细胞和 180 个白色细胞。在 17 个时间点显示的 12 个灰色单元格的轨迹被叠加。针对胃泌体的旋转和漂移校正了轨迹。轨迹从 20,000 蒙特卡洛台阶（圆圈）开始，到 100,000 蒙特卡洛台阶（菱形）结束。D：显示细胞位置如何投影在测量或模拟胃的长轴上的方案。旋转单元格的位置，使新的 x 坐标与长轴上的位置相对应，新的 y 坐标与短轴上的位置相对应。沿长轴的运动 vl或短轴 Vs测量每个细胞并归一化为胃泌素 L 的总长度。E：模拟和测量细胞轨迹沿长轴移动的距离与终点位置的关系。大的粉红色圆圈代表体外胃泌体的细胞。小的黑色圆圈代表模拟胃泌体的细胞。F：在最后的蒙特卡洛步骤中，每个细胞的净移动（最终位置 - 初始位置）绘制为每个细胞中心顶部的向量。如材料和方法中所述，对旋转和漂移进行了净运动校正。为了便于可视化，将矢量的大小除以 20 倍，以避免箭头重叠。箭头使用循环颜色图根据其方向进行着色。

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记录图像的最大z投影使我们能够测量每个时间点的胃泌体形状。我们观察到胃泌素在5小时内的伸长。在此期间，胃泌素的整体尺寸在投影面积上增加了约38%（从最大z投影获得，参见材料和方法）。这种大小的增加可以部分解释为细胞增殖，因为一些标记的细胞在 5 小时内分裂（图 5A）。在96小时的胃类细胞中对细胞增殖标志物Ki-67进行免疫荧光染色，我们确认细胞增殖确实发生，但我们没有观察到增殖细胞的强定位（S11图）。然而，观察到的伸长率显示出 CE 的标志。将椭圆拟合到二维 （2D） 投影形状显示，在 5 小时的时间段内，长轴增加了 52%，短轴减少了 8%。此外，在由所选细胞的位置定义的简单几何形状变形后（图5B），我们观察到组织延长和变窄，让人联想到接受CE的小鼠的前体组织[42]。总体而言，我们观察到细胞增殖均匀地发生在胃类（S11图）和高水平的细胞运动性。这些观察结果排除了基于细胞静态构型中强局部增殖或局部重排的延伸机制。

时间分辨的单细胞测量也为测试我们的计算模型的有效性提供了另一个机会。我们使用上面获得的单细胞类型模型（图3）的最佳参数运行了新的模拟，并在数千个蒙特卡洛步骤中收集了细胞的位置（见图5C和S3视频）。为了比较模拟和实验，我们在胃泌体的长轴上投影了细胞位置（图5D），并绘制了细胞沿该轴移动的距离与其轨迹的最终位置（图5E）。在实验和模拟中，最终靠近胃质两极的细胞走得更远，而以中间为终点的细胞几乎不沿长轴移动。这种趋势与 CE 一致，我们预计胃状体中心附近的细胞主要沿短轴向内移动（收敛）。同时，我们期望远离中心的细胞沿着胃状体的伸长轴（延伸）向外移动。在短轴上预测细胞位置没有显示与轨迹最终位置相关的任何其他趋势（S2（B）和S2（C）图）。有趣的是，在实验数据中，胃泌体第一和最后一季度（沿长轴）的细胞似乎以大致相同的量移动（图5E）。相应地，在模拟中，距离短轴较远的细胞似乎以更均匀的组向两极移动（图 5F）。总而言之，仿真概括了延时成像数据的显著特征。

抑制 ROCK 通路可防止延伸，但不能防止细胞类型分离

为了进一步独立验证爬虫驱动的 CE 的重要性，我们考虑了信号通路的扰动。先前对小鼠神经管[14]和P19小鼠胚胎癌细胞的延伸聚集体[43]的研究表明，在这些系统中，CE依赖于Rho激酶（ROCK）通路。该途径广泛参与细胞运动，最重要的是肌动蛋白-细胞骨架组装、细胞收缩力、细胞粘附、应力纤维组织和板状突起[44]。因此，ROCK抑制可能会干扰细胞之间拉力的应用，这对于爬行驱动的CE至关重要。在分化的最后 24 小时内，在 ROCK 抑制剂存在下生长的胃类动物导致细长的胃类动物明显减少，其余的非球形样品通常呈现雪人状形状（图 6A）。胃样形状的 LOCO-EFA 分析显示向较低比例的 LOCO-EFA 系数 L 转变2/L1和 L3/L1作为 ROCK 抑制剂处理的结果（图 6D）。对原始条纹（Brachyury/T）、神经组织（Sox2）或体细胞组织（Cer1 [45， 46]）标志物的抗体染色显示，雪人的形状可能是由不同细胞类型的分离驱动的（图6B和6C）。在对照条件下，细胞类型被类似地分离，但胃类也被拉长，似乎跨越了多种不同的细胞类型。这些结果支持了这样一种观点，即观察到的胃状体形状可以通过爬行（取决于ROCK通路）和多种细胞类型之间的差异粘附来解释。

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图 6. 抑制ROCK通路可防止延伸，但不能防止细胞类型分离。

A：在分化的最后 24 小时内，用（左）或不用（右）10 μM ROCK 抑制剂 Y-27632 处理的 96 小时固定胃类。显示的是最大 z 投影。用DAPI对细胞核进行染色。比例尺：200 μm。 B：在用（顶部）或不处理（底部）10μM Y-27632 处理的 96 小时时，固定胃类中 Brachyury/T 和 Sox2 的全安装免疫染色。用DAPI对细胞核进行染色。比例尺：200 μm。 C：在用（顶部）或不处理（底部）10μM Y-27632 处理的 96 小时时，固定胃体中 Brachyury/T 和 Cer1 的全程免疫染色。用DAPI对细胞核进行染色。比例尺：200 μm。 D：在96小时用（n = 110）或不用（n = 106）10μM Y-27632处理的胃类的LOCO-EFA分析。合并了两个生物学重复的结果。每个数据点都是一个胃食体。散点图显示了缩放的 LOCO-EFA 系数 L2/L1和 L3/L1.

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讨论

在这项研究中，我们采用了一种综合的实验计算方法来确定可能成为胃类伸长基础的机制。我们仔细考虑了我们方法的几个警告。

在所有实验中，我们收集了三维胃状体形状的二维投影。在这种情况下，必须考虑两个实验因素。首先，胃类动物的质量密度比成像缓冲液高得多，这意味着它们会迅速沉降到用于成像的容器底部，其长轴位于图像平面上。其次，我们确保胃类动物永远不会重叠，避免胃类动物以不确定的方向堆积在一起的潜在问题。如果长轴不可见，我们可能会低估 L2LOCO-EFA组件。我们关于差异附着力不足以解释观察到的形状的说法将得到更大的测量L的更有力支持2值。没有先验的理由相信高阶裂片，这些裂片由 L 量化3和更高的LOCO-EFA成分，发生在相对于胃泌体长轴的特定位置或方向。因此，我们认为我们分析的二维投影具有代表性。

在我们之前的出版物[30]中，我们在96小时时区分了大量不同的胃类细胞类型。在为当前研究开发计算模型时，我们有意识地避免表示胃类动物的全部细胞类型复杂性。相反，我们试图找到一个概括胃状体形状的最小模型。我们引入了第二种细胞类型，因为我们感兴趣的是任何细胞类型的异质性可能对形状产生什么影响。引入更多的细胞类型可能会产生影响，但我们怀疑这将是微妙的。由于目前可用的成像数据无法揭示不同细胞类型的位置，我们认为更详细的模型不能受到数据的限制。本着最小模型的精神，我们进一步忽略了细胞分裂、细胞分化或定向迁移。显然，这些过程对于解释测量的胃状体形状是可有可无的。

我们的计算模型是在高度抽象的层面上定义的，这使得模型参数和生物物理参数之间的直接比较变得困难。通过与延时数据的比较，我们估计 1 个 MCS 大约对应于 1-1.5 秒：平均而言，51 ? 103MCS 需要实现相同的 L 增加2/L1如从72小时到88小时40米（1000分钟）的延时摄影，见S4（A）图。另一方面，我们在模拟中进行了 100,000 次 MCS，并发现了 96 小时胃肠的相似形状分布。由此，我们估计 1 个 MCS 大约相当于 3-4 秒。因此，本研究中的 1 个 MCS 大致相当于 1.5-3 秒。通过这种推理，我们发现每 30-60 秒就会附着一个新的丝状伪足，细胞将其极化调整 1%。因此，细胞旋转 π/2 需要 1-3 小时。这种重新定向速度与机械拉伸引起的细胞复极化具有相同的数量级[47]。因此，我们认为影响复极动力学的模型参数是合理的。

我们研究的主要结果是，爬行驱动的收敛延伸可以很好地解释在胃类动物中观察到的形状分布。虽然仅靠差异粘附本身无法产生足够细长和复杂的形状，但基于细胞爬行的 CE 机制以自组织方式产生了与实验结果更相似的模拟形状分布。我们进一步发现，具有两种细胞类型的模型表现稍好。值得注意的是，在所有测试的双细胞类型模型中，对称的“全能”模型表现最差。因此，我们推测其他三个双细胞类型模型固有的不对称性促进了更复杂形状的形成。此外，差异粘附本身可能会增加形状复杂性。最近的一项实验研究支持了这种差异粘附的作用，该研究证明了钙粘蛋白（细胞粘附分子）对适当的胃状体形状形成至关重要[48]。

我们确定了“相同类型”模型，以产生最类似于测量值的形状分布。然而，我们无法最终否定其他三个模型，当更大的实验数据集可用时，这可能是可以实现的。或者，直接测量不同细胞类型之间的力，无论有没有ROCK抑制，都可以帮助确定多种细胞类型是否在CE中发挥积极作用。例如，如果多种细胞类型施加力，则可以拒绝“黄-黄”模型。我们在模型中假设的丝状拉动机制主要受到“爬行”机制的启发。尽管我们观察到很大程度的细胞运动，这与“爬行”最一致，但我们没有足够的数据来排除连接收缩机制也是活跃的。丝状拉动模型足够通用，可以代表CE的两种细胞机制，因此明确的连接收缩模型或结合两种机制的模型[11]可以产生相似的胃状体形状分布。作为我们方法的补充，其他研究已经解释了由表面张力异质性驱动的组织流动在胃类中的对称性破坏[49,50]。 这种平流样的旋转组织流动也发生在雏鸡原肠胚形成期间的体内（例如，在[51]中综述）。模型表明，在细胞迁移局部协调的条件下，原始脊髓的延伸可以驱动旋转组织流动[51]。有趣的是，确定在胃类动物中观察到的旋转流动在多大程度上可以用基于爬行的 CE 导致的轴延伸来解释，或者组织流动和 CE 是否对对称性破坏产生不同的贡献。

在ROCK抑制剂存在下，胃泌素伸长受到抑制，但细胞类型仍分离，形成雪人状形状。这些形状让人想起另一种基于胃泌体的分化方案，该方案产生内胚层室[49]。探索两个系统中是否存在相似的细胞分离机制，以及由此产生的形状是否可以用两个流体相之间的线张力来解释，这将是很有趣的[52]。在存在差异粘附的情况下，计算机中也产生了类似的形状[33]。当用ROCK抑制剂处理胃类动物时，具有高LOCO-EFA系数L2/L1和 L3/L1消失。值得注意的是，对照条件下的许多胃类动物与ROCK抑制剂处理的胃类动物具有相似的形状。这可能表明大量的胃类动物未能正常伸长，可能是因为根本没有发生主动爬行。研究伸长失败是否与不同的初始细胞状态有关会很有趣，正如最近提出的那样[53]。

除了揭示胚胎发育过程中可能的形态发生过程外，我们用于形状量化和模拟的方法也可能在生物医学或药理学应用中有用。最近，人胃类药物已被用于测试特定药物是否会导致发育畸形（致畸性）[54]。在这项研究中，使用简单的指标分析形状，例如（2D投影的）面积，纵横比和圆度。在这里，我们采用了LOCO-EFA方法，该方法可能会对药物治疗的胃泌体进行更详细的描述。此外，伴随的CPM模拟甚至可以导致对药物作用机制的假设。

在未来，在三维空间中重复模拟并结合细胞生长和分裂将非常有趣，尽管计算成本要高得多。此外，使用当前模型进行更广泛的参数扫描可以提供新的见解，尽管这在计算上同样很昂贵。该模型可以通过包括胃类动物中不同细胞类型的更多细节来进一步扩展。在实验方面，测量不同细胞类型之间的粘附强度和力并解决伸长过程中细胞形状的变化将非常有用。我们希望这项研究能成为更复杂的模型和更详细的测量的垫脚石。

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原始图像与使用 Noise2Void 去噪的图像的比较。

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S1 图。 原始图像与使用 Noise2Void 去噪的图像的比较。

答：t = 1 时的原始数据（上图）和去噪数据（下图）的图像。显示 11 个裁剪图像（505 × 505 像素）第1 的 Z 堆栈平面圣时间流逝的时间点。去噪图像是从在 1 的图像上训练的模型预测的圣时间点。B：t = 5 时的原始数据（上图）和去噪数据（下图）的图像。裁剪后的图像（505 × 505 像素）显示 10第5 的 Z 堆栈平面第时间流逝的时间点。去噪图像是从在 7 的图像上训练的模型预测的第时间点。C：t = 23 时的原始数据（上图）和去噪数据（下图）的图像。显示了裁剪后的图像（505 × 505 像素）的 6第23 的 Z 堆栈平面RD路时间流逝的时间点。去噪图像是从在 31 的图像上训练的模型预测的圣时间点，时间流逝的最后一个时间点。D：t = 31 时的原始数据（左图）和去噪数据（右图）的图像。裁剪后的图像（674 × 674 像素）显示了 31 的 z 堆栈的最大投影圣时间流逝的时间点。去噪图像是从在 31 的图像上训练的模型预测的圣时间点。A、B、C、D：每张图像的最小显示值设置为 5第图像强度分布的百分位数，以便进行定性比较。比例尺：20 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s001

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S2 图。 分析细胞相对于长轴和短轴的运动。

答：显示细胞位置如何投影在胃泌体长轴上的方案。在胃泌体的轮廓上安装了一个椭圆。为每个时间点确定椭圆长轴与最近正交轴之间的角度θ，当逆时针旋转时（上图）。细胞的位置以θ角旋转，以将它们投射到胃的长轴上。在这里，每个像元的新 x 坐标对应于像元在长轴上的位置，而新的 y 坐标对应于像元在短轴上的位置。对于每个单元，沿长轴的运动 vl (x结束? x开始） 或沿短轴 vs (y结束? y开始）确定，并分别由长轴L或短轴S的长度归一化。得到的 vl/L是根据投影在长轴（中间面板）上的每个单元的最终位置绘制的。得到的 vs/S与投影在短轴（下图）上的每个单元的最终位置作图。B：每个像元沿短轴移动的距离，与投影在短轴上的每个像元的结束位置相对应。粉红色的大圆圈表示测量的细胞。小的黑色圆圈代表模拟胃中的细胞。C，顶部面板：与 B 中的图相同，数据点按相对于短轴的运动方向着色。橙色：细胞向内移动，朝向长轴;深蓝色：细胞向外移动，远离长轴;浅蓝色：穿过长轴的细胞，因此首先向内移动，然后向外移动。下图：每个像元沿短轴移动的距离，与投影在长轴上的每个像元的最终位置相对应。单元格的着色方式与顶部面板中的颜色相同。大圆圈表示测量的单元格。小圆圈代表模拟胃中的小细胞。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s002

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S3 图。 对于最低模态，LOCO-EFA系数在模拟和实验中非常相似。

比较了相似的测量和模拟胃状体形状（另见图4E）。与测量的胃泌体相比，晶格效应和模拟噪声导致模拟形状中更高模态的贡献更大。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s003

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S4 图。 模拟中的形状分布不是由于局部最小值周围的波动造成的。

答：具有相同参数（拉力λF= 20 和 γ（c， M） = 15） 和 L 中的三个体外时间流逝2/L1? 升3/L1空间。模拟在500,000个蒙特卡罗步长的时间内进行。细实线表示 L2/L1和 L3/L1每 5,000 个蒙特卡洛步数。粗实线表示 25 次测量的平均值（每个测量相隔 500 个蒙特卡洛步）。这些点突出显示了 100,000 蒙特卡罗步长处的值，这是所有其他图形中的模拟时间。虚线表示通过体外延时显微镜分别从72小时到94小时，91小时20米和88小时40米测量的橙色，金色和棕色曲线的胃类形状。胃状体形状是手动获得的。细线显示原始数据（每间隔 40 分钟），粗线显示超过 200 分钟的平均时间。B：L 的分布2/L1和 L3/L1在不同时间点使用相同参数的 100 次模拟值，最多 500,000 个蒙特卡罗步长。100,000 蒙特卡洛步长处的值用点表示。C：L 的分布2/L1和 L3/L1在不同时间点使用相同参数的 100 次模拟的值，无需拉动，最多 50,000 个蒙特卡洛步长。D：与 B 相同，但具有两种细胞类型和参数 γ（1， 2） = ?4 和 λF= 20，如图 4D）。E：与 C 相同，但具有两种单元格类型和参数 γ（1， 2） = ?4。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s004

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S5 图。 我们实现的复极化机制与Belmonte等[19]的复极化机制之间的比较。

比较形状分布的 2D Kolmogorov-Smirnov 检验得出 D = 0.41 和 p = 7.4 ? 10?30.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s005

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S6 图。 胃泌体的 3D 模拟示例。

使用了与（图4）中的最佳参数相同的参数，但拉力为λF= 150。对于 100,000 个 MCS，单元与模拟边界接触。请参阅 S1 视频）。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s006

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S7 图。 使用两种细胞类型模拟爬行驱动的 CE，其中所有细胞都延伸丝状足。

答：模拟 100、25,000、50,000、75,000 和 100,000 蒙特卡罗步长的全能拉动产生的示例形状。B，C：通过两种细胞类型的爬行和差异粘附驱动的 CE 模拟产生的形状的量化。显示的是一组形状的平均 LOCO-EFA 系数。阴影区域（在实验数据中）和垂直条（在仿真数据中）表示标准偏差。B：细胞类型之间的表面张力是不同的。拉力保持在15。C：拉力各不相同。细胞类型之间的表面张力保持在10。D：缩放的 LOCO-EFA 系数 L 的散点图3/L1与 L2/L1用于爬行驱动 CE 的实验数据和模拟，拉力为 λF= 15 和表面张力 γ（1， 2） = 10。这些参数给出了最小的 2D Kolmogorov-Smirnov 检验统计量 D = 0.37 和 p = 1.4 ? 10?7.E：实验观察到的形状（底部）与高度相似的模拟形状（顶部）及其相应的缩放 LOCO-EFA 系数 L 的示例3/L1和 L2/L1.底部：96小时固定胃食体。显示的是 z 堆栈的中平面。用DAPI对细胞核进行染色。比例尺：200 μ米。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s007

（每股收益）

S8 图。 具有两种细胞类型的爬行驱动的 CE 的模拟，其中只有黄色细胞延伸丝状足。

答：模拟 100、25,000、50,000、75,000 和 100,000 个蒙特卡洛步长的黄色拉动生成的示例形状。B，C：通过两种细胞类型的爬行和差异粘附驱动的 CE 模拟产生的形状的量化。显示的是一组形状的平均 LOCO-EFA 系数。阴影区域（在实验数据中）和垂直条（在仿真数据中）表示标准偏差。B：细胞类型之间的表面张力是不同的。拉力保持在25。C：拉力各不相同。细胞类型之间的表面张力保持恒定在2。D：缩放的 LOCO-EFA 系数 L 的散点图3/L1与 L2/L1用于爬行驱动 CE 的实验数据和模拟，拉力为 λF= 25 和相互作用能 γ（1， 2） = 2.这些参数给出了最小的 2D Kolmogorov-Smirnov 检验统计量 D = 0.21 和 p = 0.0098。E：实验观察到的形状（底部）与高度相似的模拟形状（顶部）及其相应的缩放 LOCO-EFA 系数 L 的示例3/L1和 L2/L1.底部：96小时固定胃食体。显示的是 z 堆栈的中平面。用DAPI对细胞核进行染色。比例尺：200μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s008

（每股收益）

S9 图。 使用两种细胞类型模拟爬行驱动的 CE，其中黄色细胞将丝状伪足扩展到黄色细胞。

红细胞不会施加或感觉到丝状伪足。答：模拟 100、25,000、50,000、75,000 和 100,000 个蒙特卡洛步长的黄黄色拉动生成的示例形状。B，C：通过两种细胞类型的爬行和差异粘附驱动的 CE 模拟产生的形状的量化。显示的是一组形状的平均 LOCO-EFA 系数。阴影区域（在实验数据中）和垂直条（在仿真数据中）表示标准偏差。B：细胞类型之间的表面张力是不同的。拉力保持在20。C：细胞类型之间的表面张力保持在2。D：缩放的 LOCO-EFA 系数 L 的散点图3/L1与 L2/L1用于爬行驱动 CE 的实验数据和模拟，拉力为 λF= 20，表面张力 γ（1， 2） = 2。这些参数给出了最小的 2D Kolmogorov-Smirnov 检验统计量 D = 0.15 和 p = 0.12。E：实验观察到的形状（底部）与高度相似的模拟形状（顶部）及其相应的缩放 LOCO-EFA 系数 L 的示例3/L1和 L2/L1.底部：96小时固定胃食体。显示的是 z 堆栈的中平面。用DAPI对细胞核进行染色。比例尺：200 μ米。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s009

（每股收益）

S10 图。 不同参数的检验统计量D的热图显示了多个可行参数。

2D Kolmogorov-Smirnov 检验的检验统计量 D 是从不同参数值和不同模型的 100 个模拟点计算得出的。最低值用白点表示，代表体外和计算机形状分布之间的最佳对应关系。答：用于不同的附着力。B：对于一种细胞类型拉动。C：用于同类型拉动。D：用于全方位拉动。E：用于黄色全部拉动。F：用于黄黄色拉扯。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s010

（每股收益）

S11 图。 在整个 96 小时的胃泌体中都发现了增殖细胞。

答：固定在 96 小时的四个胃类的免疫染色切片。左图：Brachyury/T、Sox2 和增殖标志物 Ki-67 的免疫染色。右图：相同的切片，但仅显示了 Ki-67 的免疫染色。用DAPI对细胞核进行染色。比例尺：100 μm。 B：增殖细胞（Ki-67阳性）沿相应胃体的长轴（左）或短轴（右）的相对位置分布。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s011

（每股收益）

S1 视频。 胃泌体的 3D 模拟。

有关详细信息，请参见 S6 图。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s012

（MP4格式）

S2 视频。 在5小时内对伸长的胃泌素进行延时光片测量。

最大 z 投影。有关详细信息，请参见图 5。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s013

（莫夫）

S3 视频。 延长胃泌体的CPM模拟。

有关详细信息，请参见图 5。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011825.s014

（动图）

确认

这项工作是在荷兰国家电子基础设施上进行的，得到了SURF合作社的支持，并使用了莱顿大学提供的莱顿学术跨学科集群环境（ALICE）的计算资源。

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