《免费医学论文发表-暴露于分枝杆菌重塑了肺泡巨噬细胞和对结核分枝杆菌感染的早期先天反应》期刊简介
免费医学论文发表-暴露于分枝杆菌重塑了肺泡巨噬细胞和对结核分枝杆菌感染的早期先天反应
抽象
肺泡巨噬细胞 （AM） 在结核分枝杆菌 （Mtb） 感染期间起着关键作用，是肺部中第一个遇到细菌的细胞。我们之前表明，AM最初通过安装细胞保护性而不是促炎性反应来对体内Mtb做出反应。然而，初始AM反应的可塑性尚不清楚。在这里，我们描述了以前暴露于分枝杆菌的情况，无论是通过皮下接种牛分枝杆菌 （scBCG） 还是通过模拟伴随免疫方面的封闭 Mtb 感染 （coMtb），如何影响 AM 的初始反应。我们发现 scBCG 和 coMtb 都加速了早期先天细胞的活化和募集，并通过 AM 在体内对 Mtb 产生更强的促炎反应。在肺部环境中，来自scBCG疫苗接种小鼠的AM产生强大的干扰素相关反应，而来自coMtb小鼠的AM产生更广泛的炎症反应，不受干扰素刺激基因的支配。使用 scRNAseq，我们确定了分枝杆菌暴露后气道驻留巨噬细胞频率和表型的变化，并富集了干扰素相关和促炎的 AM 群体。相比之下，暴露后气道驻留T细胞和树突状细胞的变化很小。用 Pam3Cys、LPS 和 Mtb 对 AM 进行体外刺激表明，scBCG 和 coMtb 暴露对 LPS 和 Mtb 产生更强的干扰素相关反应，这些反应是细胞内在的变化。然而，体内 Mtb 感染后每种暴露方式所特有的 AM 特征取决于肺部环境，并且在体外刺激后不会出现。总体而言，我们的研究揭示了暴露于分枝杆菌后AM的显着和持久的重塑，有证据表明AM的内在变化和改变的肺部微环境的贡献。scBCG 和 coMtb 模型之间的比较突出了气道中 AM 的可塑性，以及通过疫苗接种或宿主导向疗法靶向其功能的机会。
作者摘要
结核病是一种由结核分枝杆菌（Mtb）引起的疾病，每年夺走约160万人的生命，使其成为全球传染性病原体死亡的主要原因之一。基于常规免疫记忆的原理，先前暴露于 Mtb 或 M。牛卡介苗导致抗原特异性、适应性免疫反应的持久变化，可有效防止后续攻击。然而，这些暴露如何影响先天免疫反应尚不清楚。肺泡巨噬细胞是驻留在组织中的髓系细胞，在 Mtb 感染期间作为肺部的先天免疫哨兵和对感染做出反应的第一个宿主细胞发挥重要作用。在这里，我们研究了先前的分枝杆菌暴露，无论是通过卡介苗疫苗接种还是包含的 Mtb 感染模型，如何影响肺泡巨噬细胞的早期先天反应。我们发现，先前的暴露通过细胞内在变化和依赖于改变的肺环境的信号来重塑肺泡巨噬细胞对 Mtb 的反应。这些发现表明，早期先天免疫反应可以通过疫苗接种或宿主定向治疗来靶向，并且可以补充现有的策略，以增强宿主对Mtb的反应。
数字
Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3
引文： Mai D， Jahn A， Murray T， Morikubo M， Lim PN， Cervantes MM， et al. （2024） 暴露于分枝杆菌重塑肺泡巨噬细胞和对结核分枝杆菌感染的早期先天反应。PLoS 病理学 20（1）： e1011871 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871
编辑 器： Padmini Salgame，美国新泽西医学院
收到： 2023年8月3日;接受： 2023年11月27日;发表： 1月 18， 2024
版权所有： ? 2024 Mai et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 原始和处理过的RNA测序数据可以从国家生物技术信息中心（NCBI）基因表达综合（GEO）数据库中访问，登录号为GSE212205。
资金： 这项工作得到了美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所的支持，获得了U19AI135976奖（AA），R01AI032972（AA），75N93019C00070（K.U.，A.C.R.，A.A.）和R21AI163809（A.C.R.）。J.N.得到了瑞士国家基金会的资助，资助号为310030_200407。PL得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）颁发的国家研究服务奖T32 GM135096的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 我阅读了该杂志的政策，这篇手稿的作者有以下相互竞争的利益：J.N.获得了Oxford Immunotec，Gilead和ViiV的演讲酬金。
介绍
结核分枝杆菌 （Mtb） 是结核病 （TB） 的病原体，在 2021 年夺走了 160 多万人的生命。自2005年以来，全球结核病死亡人数首次出现上升[1,2]。这些趋势凸显了对新疫苗和治疗策略的迫切需要。传统上，疫苗设计的重点是产生快速、稳健和有效的适应性免疫反应。然而，最近的研究表明，先天免疫系统可以以训练有素的免疫形式发生长期变化[3]，从而影响感染结果，并可能作为有效结核病疫苗的重要组成部分[4,5]。最初的训练免疫研究侧重于中枢训练免疫，即造血干细胞的长期变化，导致短寿命先天细胞区室（即单核细胞、NK细胞、树突状细胞）的功能改变[3]。最近的研究检查了组织驻留巨噬细胞的先天训练，并证明这些细胞也受到先前暴露的影响。组织驻留巨噬细胞可对远端损伤和炎症作出反应[6]，发生长期变化[3]，并在肺部病毒感染后表现出对细菌的反应改变[7–9]。
肺驻留肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages， AMs）是最早感染吸入性Mtb的细胞，并产生由转录因子Nrf2介导的细胞保护反应，阻碍了其有效控制细菌生长的能力[10,11]。在这项研究中，我们研究了先前的分枝杆菌暴露如何重新编程 AM，并改变肺部对 Mtb 气溶胶攻击的整体先天反应。为了评估AM可塑性的范围，我们选择将皮下BCG疫苗接种（scBCG）与包含的Mtb感染（coMtb）模型产生的效果进行比较。卡介苗，一种源自支原体的减毒活结核病疫苗。牛皮治疗通常在婴儿期使用，可预防播散性儿童疾病，但对成人肺部疾病的疗效较低[12–14]。除了增强基于共同抗原的Mtb特异性适应性反应外，BCG疫苗接种还会导致骨髓中髓系细胞的造血和表观遗传重编程发生变化[15]，早期单核细胞募集和Mtb播散[16]，以及对T细胞启动至关重要的树突状细胞的先天激活[17]。鼻内接种卡介苗可预防肺炎链球菌，并诱导AM的长期激活[18]。最近的一项研究表明，卡介苗疫苗接种可以引起对AM的先天训练效应，与单核细胞群的改变不同，其一种机制是通过改变肠道微生物组和微生物代谢物[19]。接种卡介苗还与人类训练有素的免疫效应有关[20–22]，包括明确描述的降低新生儿全因死亡率和预防膀胱癌[3,23]。
coMtb模型是通过将毒性Mtb皮内接种到小鼠耳朵中产生的，并导致包含但持续的淋巴结Mtb感染[24,25]。该模型复制了在人类和非人灵长类动物（non-human primate， NHPs）中的观察结果，即先前暴露于Mtb感染通过一种伴随免疫形式提供保护，防止后续暴露[26,27]。在之前的一项研究中，我们发现coMtb可以防止气溶胶Mtb感染的攻击，并保护小鼠免受异源攻击，包括单核细胞增生李斯特菌感染和B16黑色素瘤细胞的扩增，结果表明先天免疫反应发生了实质性的重塑[25]。我们发现，与对照小鼠相比，coMtb小鼠的AM对Mtb感染的炎症反应更大，并且通过MHC II表达测量的感染后AM激活的增强依赖于IFNγR信号转导[25]。
在这里，我们表明，虽然 coMtb 和 scBCG 都可以防止低剂量 Mtb 气溶胶攻击，但它们以不同的方式重塑体内先天反应。在 AM 中，scBCG 在 AM 中引发非常强烈的干扰素反应，而 coMtb 促进更广泛的促炎反应，而干扰素刺激基因较少占主导地位。先前暴露于分枝杆菌也会重塑气溶胶攻击前肺部AM亚群的频率和表型，并导致整体先天反应的早期动力学发生显着变化。虽然每次暴露（scBCG、coMtb）特有的AM反应的变化取决于肺部环境，但LPS和Mtb离体刺激后更强的干扰素相关反应揭示了细胞内在的变化。
结果
先前暴露于分枝杆菌可加速与 Mtb 控制相关的活化和先天细胞募集
我们首先确定了感染的最早阶段，当时免疫反应因先前暴露于分枝杆菌而改变。小鼠接种scBCG疫苗或用coMtb治疗，休息8周，然后用低剂量H37Rv气溶胶感染攻击。我们在感染后10、12和14日测量了肺部先天免疫细胞的细胞化和活化情况，这是已知先天细胞被募集的最早时间点[10,11,28]。与对照组相比，我们观察到 coMtb 小鼠的 AM 的 MHC II 中位荧光强度 （MFI） 早在第 10 天和 scBCG 小鼠的 AM 的第 12 天显着增加（图 1A 和 S1）。在第 0 天攻击前，MHC II 表达没有显着差异（图 1A）。与对照组相比，coMtb小鼠的单核细胞衍生巨噬细胞（MDM）、中性粒细胞（PMN）、树突状细胞和Ly6C CD11b单核细胞的数量在第10天也显着增加，在第12天和第14天进一步增加（图1B和S1）。从第 10 天开始，scBCG 在这些人群中引起了类似的增加，但这些增加并不像在 coMtb 中观察到的那样强劲或迅速。在MDM的第10、12和14天，PMN的第14天，树突状细胞的第12和14天，以及Ly6C CD11b单核细胞的第14天，scBCG和coMtb组之间存在显著差异（图1B）。虽然三种情况之间的AM细胞数量没有显着差异，但到第14天，scBCG和coMtb小鼠的AM的活力都略有下降（图1C）。++++
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图 1. 先前暴露于分枝杆菌会导致气溶胶 Mtb 攻击后更快的激活和先天细胞募集。
对照组、scBCG 和 coMtb 小鼠，暴露后 8 周，用标准低剂量 H37Rv 攻击。 感染后第 10、12 和 14 天收集肺。A） AM MHC II MFI。B） MDM、PMN、DC 和 Ly6CCD11b 单核细胞的总数。C） AM 活力 （% Zombie Violet-）。D） CD44 CD4 T 细胞、ESAT6-四聚体 CD4 T 细胞、CD44 CD8 T 细胞和 TB10.4-四聚体 CD8 T 细胞的总数。平均+/- SEM，每组5只小鼠，代表3个独立实验。使用 Tukey 后测的单因素方差分析。* p< 0.05， **p< 0.01， ***p < 0.001.B、C） *、** 和 *** scBCG 或 coMtb 与对照组;+， ++ scBCG 与 coMtb。++++++++++
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除了先天细胞活化和募集的早期变化外，我们还观察到从第 10 天开始在 coMtb 和 scBCG 小鼠的肺部早期募集活化的 CD44、CD4 和 CD8 T 细胞，以及与对照组和 scBCG 小鼠相比，从第 10 天开始，coMtb 小鼠的 TB 抗原特异性 T 细胞、ESAT6-四聚体 CD4 T 细胞和 TB10.4-四聚体 CD8 T 细胞（图 1D 和 S1).由于 ESAT6 抗原由 H37Rv 表达，但 BCG 和 coMtb 之间 ESAT6-四聚体 CD4 T 细胞募集的差异是预期的，而不是由 BCG 表达的。+++++++++
我们还评估了这些细胞募集差异是否与细菌负荷的变化相关。为了编译来自三个独立实验的 CFU 结果，每个实验的细菌生长略有不同（S2A 图），我们计算了一个 ΔCFU 值，该值将每个样品的细菌负荷与基于时间点、器官和实验的相应对照的平均值进行比较。我们发现，与对照组相比，这两种方式在第14天和第28天都显著降低了肺、脾和肺引流淋巴结（LN）的细菌负荷，正如先前报道的那样[16,25,29]（S2A–S2D图）。在第 10 天，我们观察到与对照组相比，scBCG 或 coMtb 小鼠的肺细菌负荷没有差异，并且 coMtb 小鼠的肺细菌负荷比 scBCG 略有增加。此时，大多数对照小鼠的脾脏和LN中都有检测不到的细菌。与对照组相比，到第 12 天，coMtb 但 scBCG 小鼠的肺部细菌负荷显着降低，并且两种模型的 LN 中 CFU 显着降低（S2B 图）。我们的结果表明，在感染的前两周内，先前的分枝杆菌暴露导致先天细胞活化和募集加速，同时活化的 T 细胞增加，与 scBCG 相比，coMtb 产生更快、更强的反应。这些早期免疫变化与肺部细菌负荷的减少有关。LN 和脾脏中细菌负荷的差异表明细菌播散延迟，首先在第 12 天出现在 LN 中，然后在第 14 天出现在脾脏中（S2A 图）。
分枝杆菌暴露改变体内肺泡巨噬细胞对 Mtb 感染的反应
为了检查对Mtb的最早反应，我们测量了通过支气管肺泡灌洗和细胞分选分离的Mtb感染AM的基因表达谱，如前所述[10]，在scBCG疫苗接种的小鼠中用高剂量mEmerald-H37Rv（沉积物：4667,4800）进行气溶胶攻击后24小时，并将这些测量结果与先前从对照（未暴露）小鼠[10]和coMtb小鼠[25]（S1表）生成的AM谱进行比较).如前所述，对于高剂量感染，平均有 1.79%（范围：0.91-3.18%）的分离性 AM 在感染后 24 小时感染了 Mtb。通过比较三组（对照组、scBCG、coMtb）中每组（对照组、scBCG、coMtb）的 Mtb 感染 AM 和各自的幼稚 AM 之间的基因表达来测量 Mtb 感染引起的变化。对Mtb感染诱导变化的主成分分析表明，三种条件中的每一个都导致了不同的表达变化（图2A），并且大多数上调的差异表达基因（DEG）（倍数变化>2，FDR<0.05）在每种条件下都是唯一的（对照：151个唯一/257个总DEG，scBCG：222/289，coMtb：156/229）（图2B）).Mtb 感染的 AM 对 3 种疾病中每一种疾病的反应差异也反映在 Ingenuity Pathway Analysis 确定的前 20 个典型通路的多样性上（S3 图）。
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图 2. 分枝杆菌暴露会改变体内肺泡巨噬细胞对 Mtb 感染的转录反应。
高剂量 mEmerald-H37Rv 感染后 24 小时 Mtb 感染的 AM 的批量 RNA-seq 谱。将基因表达变化与各自的幼稚样本进行比较：Mtb-inf 对照与幼稚对照;Mtb-inf scBCG 与朴素 scBCG;Mtb-inf coMtb 与幼稚 coMtb（对照组 - 在 Rothchild 等人，2019 [10] 中报道;coMtb- 在 Nemeth 等人，2020 年 [25] 中报道）。A） 与各自的初治 AM（对照、scBCG 或 coMtb）相比，在 Mtb 感染的 AM 中使用 DEG（|倍数变化| > 2，FDR< 0.05）进行主成分分析。B） 维恩图和 3 种条件之间上调 DEG 重叠的交点图。c） 50 个标志性通路的基因集富集分析。所示路径有 |NES|> 1.5 和 FDR< 0.05 至少一个条件。* FDR< 0.05，**FDR< 0.01，***FDR< 0.001。D） 131 个原始体内 DEG 在 Mtb 感染的 AM 中 24 小时的热图（左图），干扰素刺激基因，源自巨噬细胞对 IFNα 的反应（倍数变化 >2，p 值 < 0.01） Mostafavi 等人，2016 [30]（中左），IL6 JAK STAT3 标志通路（中右）和选定的 coMtb 特征基因（右，*FDR< 0.05，FC> 2）。E） 描绘褶皱变化的散点图（对数2）用于 Mtb 感染的 AM，而不是 scBCG 与 coMtb 的初治 AM。突出通路：131 个原始体内 DEG（56 个基因，紫色）中的 Nrf2 相关基因，scBCG 干扰素 α 反应和干扰素 γ 反应通路（61 个基因，橙色）的共同前沿基因，以及 coMtb IL6 JAK STAT3 通路的前缘基因（23 个基因，绿色）。根据每个条件的 4 个独立实验（用于对照）编译而成，每个条件 2 个独立实验用于 scBCG 和 coMtb。
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为了确定组间趋势，我们使用一组 50 个 Hallmark 通路进行了基因集富集分析。正如我们之前所展示的，来自对照小鼠的 24 小时 Mtb 感染的 AM 对“异生代谢”和“活性氧”通路具有很强的富集，表明 Nrf2 相关的细胞保护反应（图 2C）。虽然这两种通路不是暴露组中最富集的通路之一，但来自所有组的 Mtb 感染的 AM 上调了与 131 个体内 DEG 相关的基因，这些基因构成了 24 小时的细胞保护性 Nrf2 驱动反应 [10]（图 2D）。来自scBCG小鼠的Mtb感染AM的表达谱显示，“干扰素α反应”和“干扰素γ反应”通路的富集最强，它们包含许多共享基因（图2C）。通过检查一组干扰素刺激基因（ISG）的基因表达变化，进一步强调了干扰素反应的强度，这些基因是从对IFNα有反应的巨噬细胞中鉴定出来的（倍数变化>2，p值<0.01）[30]（图2D）。与scBCG相比，来自coMtb小鼠的Mtb感染AM的表达谱显示干扰素反应通路的富集较弱，上调的ISG较少，而是显示出包括“IL6 JAK STAT3信号传导”在内的许多炎症通路的富集（图2C和2D）。通过突出显示 Nrf2 相关干扰素 α 和 γ 反应或 IL-6 JAK STAT3 通路基因的散点图，可以更容易地可视化 scBCG 与 coMtb 小鼠的 AM 基因表达模式之间的直接比较（图 2E）。
总之，分枝杆菌暴露会改变AM在攻击后24小时对Mtb感染的初始体内反应，并以不同的方式重塑AM反应。来自 scBCG 疫苗接种动物的 AM 具有强烈的干扰素相关反应，而来自 coMtb 小鼠的 AM 表达更多样化的炎症谱，包括干扰素相关基因和其他促炎基因，包括 IL-6 JAK STAT3 通路中的基因。
分枝杆菌暴露会改变气道中肺泡巨噬细胞的基线表型
尽管 scBCG 和 coMtb 暴露改变了体内对 Mtb 感染的 AM 反应，但通过对对照、scBCG 或 coMtb 小鼠的幼稚 AM 进行批量 RNA 测序来测量，包括先天受体和接头的表达，转录效应在感染前并不广泛明显（S4 图）。然而，我们假设重塑效应在整个AM群体中可能不是同质的，并且使用单细胞方法可以检测到基线图谱的微小异质性变化。因此，我们分析了在单细胞 RNA 测序 （scRNAseq） 暴露分枝杆菌 8 周后从三种条件（对照、scBCG、coMtb）中每一种中获取的 10 只年龄和性别匹配的小鼠的混合 BAL 样本。通过流式细胞术分析常见谱系标志物测量，总细胞性不受分枝杆菌暴露的影响，AMs 是主要的造血细胞类型（占 CD45 活细胞的 57.4-85.8%），其次是淋巴细胞（占 CD45 活细胞的 5.26-22.7%），其他先天细胞群的贡献较小（S5 图）。++
六个样本，每个样本平均有 2,709 个细胞（范围：2,117–4,232），一起分析，共检测到 17,788 个基因。最突出的表达簇映射到 AM 谱，较小的簇映射到 T 和 B 淋巴细胞、树突状细胞和中性粒细胞（图 3A）。所有映射到巨噬细胞图谱的细胞都被提取并重新聚类为 11 个巨噬细胞亚簇（图 3B 和 3C）。除两个巨噬细胞亚簇（簇 6 和 8）外，所有巨噬细胞亚簇均表达 AM 谱系标志物（Siglecf、Mertk、Fcgr1 （CD64）、Lyz2 （LysM） 和 Itgax （CD11c），并且 Itgam （CD11b） 表达低（图 3D）。簇 6 显示 Itgam 和 Lyz2 高表达，Siglecf 表达较低，可能代表气道中小的单核细胞来源的巨噬细胞群，而簇 8 显示 Lyz2 高表达，其他 AM 标志物低表达，Sftpa1 和 Wfdc2 表达（S2 表 ），最常由肺上皮细胞表达的基因，表明该簇代表一小群上皮细胞，
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图 3. 分枝杆菌暴露会改变气道激发前肺泡巨噬细胞表型。
对来自对照、scBCG 和 coMtb 小鼠气溶胶前激发的 BAL 样品进行单细胞 RNA 测序。A） 所有 BAL 样品的 scRNAseq 数据，由主要聚类突出显示，根据最接近的 Immgen 样本匹配进行注释。B） 突出显示用于巨噬细胞亚簇分析的两个簇。C）巨噬细胞亚簇分析生成的11个簇，按条件分开。D） 主要巨噬细胞特异性标志物的表达：Siglecf、Mertk、Fcgr1、Lyz2、Itgam （CD11b） 和 Itgax （CD11c）。E-I） 每个巨噬细胞亚簇的相对频率。（按集群划分的小提琴图）与其他簇相比，由该簇区分的代表性基因的表达水平。Tukey后测的单因素方差分析，* p< 0.05。（按条件划分的 3 路小提琴图）对照组、scBCG 组和 coMtb 样本之间第 2、7 和 3 组内的差异表达基因。Wilcoxon 秩和检验，Bonferroni 调整了 p 值。*adj-p< 0.05， **adj-p< 0.01， ***adj-p< 0.001.J） 伪时间分析 （Monocle3），起始节点位于控制中最大的簇 0（顶部）和增殖细胞簇 4,9（底部）。K） 按集群划分的 ISG 模块分数。源自巨噬细胞对IFNα的反应（倍数变化>2，p值<0.01）（Mostafavi等人，2016）[30]。数据来自两个独立的实验（圆形、三角形），每个实验有 3 个条件，总共 6 个样本。
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为了解释各种表达亚簇，我们确定了将每个簇与其他簇区分开来的基因（S6图和S2表）。正如其他研究组所报道的[31,32]，两个簇（簇4,9）中一小部分AM具有细胞周期基因（即Top2a，Mki67）的高表达，表明细胞增殖（图3E和S2表）。簇0是脂质代谢基因（即Abcg1、Fabp1）高表达的丰度最大的巨噬细胞簇（图3F和S2表）。与 coMtb 相比，scBCG 样本的聚类 2 的相对频率显着增加（p = 0.032，Tukey 后测的单因素方差分析），并与氧化应激反应基因 （Hmox1， Gclm） 相关。与对照组或 coMtb 相比，几个 Cluster 2 相关基因 Slc7a11、Hmox1 和 Sqstm1 在 scBCG 样品中的总体表达水平也更高（图 3G 和 S2 表）。聚类 7 是唯一一个 scBCG 和 coMtb 的相对频率趋势均有所增加的聚类 （p = 0.076，单因素方差分析）。该簇中的细胞具有高表达的干扰素刺激基因（Ifit1、Isg15），在该簇中，来自 scBCG 样品的细胞的 Axl 和 Ifi204 表达高于来自 coMtb 样品的细胞。（图 3H 和 S2 表）。与对照组和scBCG样本相比，聚类3对coMtb样本的相对频率显著更高（p = 0.021、0.039，Tukey后验单因素方差分析），并通过巨噬细胞相关转录因子（Cebpb、Zeb2、Bhlhe40）[33,34]、线粒体氧化磷酸化（mt-Co1、mt-Cytb、mt-Nd2）、染色质的表达来区分重塑（Ankrd11、Baz1a）和免疫信号传导，包括 CARD9 复合物（Malt1、Bcl10、Prkcd）（图 3I 和 S7 和 S2 表）。该表达谱与Pisu等人先前描述的AM亚簇非常吻合，即“间质巨噬细胞样”AM群体（标记为“AM_2”），在低剂量H37Rv感染后3周，该群体在肺样本中的相对频率增加[31]。与对照组或scBCG组相比，CoMtb样本中CoMtb样本中Cebpb、Mt-Cyb和Lars2的相对表达水平更高。
有趣的是，聚类 2（scBCG 中的相对频率较高）和聚类 3（coMtb 中的相对频率较高）代表了由轨迹推理分析生成的伪时间图的不同端点，无论起点是对照组（聚类 0）（图 3J，顶部）还是增殖细胞簇（聚类 4）（图 3J， 底部）。这一结果表明，scBCG 和 coMtb 可能在不同的方向上驱动 AM 表型，并表明 AM 反应可以重塑为多种风味，而不仅仅是二元“开/关”状态。
为了进一步研究AM的子簇是否可能是scBCG和coMtb小鼠体内Mtb反应中干扰素α/γ反应通路富集增加的原因，我们根据ISG基因模块对每个簇进行评分，先前在图2D中使用。正如预期的那样，我们观察到只有簇 7 对 ISG 表现出很强的富集，scBCG 和 coMtb 样本的频率都呈上升趋势（图 3K）。
为了研究非AM巨噬细胞的潜在重编程，我们检查了簇6，即具有低Siglecf和高Itgam表达的巨噬细胞簇，与单核细胞衍生的巨噬细胞群一致。我们观察到，在三种情况中，该簇的相对大小没有统计学上的显着差异（S8A图）。然而，两组之间存在许多差异表达基因 （DEG），包括与对照组相比，scBCG 和 coMtb 巨噬细胞的 CD11b （Itgam） 和巨噬细胞清除受体 （Msr1） 的表达降低，与对照组相比，coMtb 巨噬细胞的 MHC 相关基因 （H2-Aa， Cd74） 和铁代谢相关基因 （Cd63、Fth1、Ftl1） 的增加（S8B 图).先前的一项研究发现，静脉注射卡介苗可诱导其中一些基因的AM和IM的染色质可及性改变[31]。
此外，我们将 scBCG 和 coMtb 暴露后 AM 的基线变化与 ivBCG 疫苗接种后的 AM 变化进行了比较（S9 图）。总体而言，我们发现ivBCG暴露导致AM人群的变化与scBCG疫苗接种相似，AM聚集到“氧化应激反应”和“干扰素刺激基因（ISG）”的频率增加（S9C图）。scRNAseq 的这些基线变化反映了在批量 RNAseq 感染 24 小时后观察到的 ivBCG 小鼠 Mtb 感染的 AM 的反应（S9A 和 S9B 图）。来自ivBCG疫苗接种小鼠的Mtb感染AM的特征与来自scBCG疫苗接种小鼠的Mtb感染AM的特征最接近，干扰素刺激基因具有强大的上调。这些结果表明，皮下注射和静脉注射卡介苗都会导致类似的 AM 重塑，其特征与 coMtb 暴露的特征不同。
总之，对 BAL 分离的巨噬细胞的 scRNAseq 分析表明，分枝杆菌暴露会导致气道中少数 AM 亚群的细微变化，包括与干扰素反应和间质巨噬细胞表型相关的变化，同时保持最丰富的 AM 亚群在频率或基因表达上保持不变。我们假设基线图谱中的这些微小变化可能足以推动体内AM Mtb反应中观察到的更实质性的变化，如图2所示。
分枝杆菌暴露对气道中 T 细胞群的影响最小
虽然AM是气道中的主要免疫细胞类型，但其他细胞群在对照组中平均占BAL细胞的18.4%（范围：10.4-26.3%），在暴露组中占31.3%（范围：14.0-48.8%）。为了研究分枝杆菌暴露如何影响气道中的其他细胞，我们重点关注了T细胞和树突状细胞（DC），它们在AM之后具有两个最高的相对频率（图4A和4B）。T 细胞和 DC 分别由两个原始簇组合而成。两个群体的相对频率均未显示出统计学上的显着差异（图4B）。为了更详细地检查 T 细胞群的定性变化，我们接下来对 T 细胞进行了重新聚类，产生了 7 个 T 细胞簇。我们根据最匹配的Immgen图谱和关键谱系特异性标记的表达（图4A-4C和S10）手动注释了每个簇。我们专注于 5 个最丰富的 T 细胞亚簇（簇 0-4）。虽然我们观察到每组相对频率的细微变化，但没有一个达到统计学意义。簇 0 是丰度最高的簇，其表达谱与γδ T细胞最一致，包括Cd3e的表达（Cd4和Cd8a的表达低至零），以及Zbtb16（PLZF）和Tmem176a（一种受RORγt调控的离子通道）的部分表达，据报道由肺γδ T细胞表达[35,36]（图4D–4F和S10）。簇 1 与效应 CD4 T 细胞的谱相匹配（图 4D-4F 和 S10），簇 2 与幼稚 CD8 T 细胞的谱相匹配（图 4D-4F 和 S10）。 簇 3 具有与效应记忆/驻留记忆 CD8 T 细胞一致的特征（T+++EM/RM 系列) (图 4D–4F 和 S10）簇 4 具有与 NK 细胞一致的谱。总体而言，尽管在气道中检测到许多不同的淋巴细胞亚群，但T细胞或NK亚簇的相对频率没有显着变化。
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图 4. 分枝杆菌暴露后的气道 T 细胞和树突状细胞谱。
对来自对照、scBCG 和 coMtb 小鼠气溶胶前激发的 BAL 样品进行单细胞 RNA 测序。A） 编译了所有 BAL 样品的 scRNAseq 数据，突出显示了 T 细胞和树突状细胞簇。B） T 细胞和 DC 的相对频率。 C-F） T 细胞亚簇分析。C） 按条件编译和拆分的 T 细胞子簇。在 Immgen 轮廓匹配和手动标记检查后进行的注释。D） 每种条件的聚类 0-4 的相对频率。E） 一般 T 细胞标志物的 UMAP 基因表达图。F） UMAP基因表达绘制按条件划分的簇特异性标记。G-J） 树突状细胞亚簇分析。G） 树突状细胞亚簇，由 3 个不同簇中的每一个着色。H） 每种条件的聚类 0-2 的相对频率。I） 簇特异性标记和目标基因的小提琴图。J） 簇 0 中的差异表达基因按条件分裂。*adj-p< 0.05， **adj-p< 0 .01， ***adj-p< 0.001， Wilcoxon 秩和检验， Bonferroni 调整后的 p 值。数据来自两个独立实验，每个实验有 3 个条件，总共 6 个样本。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.g004
分枝杆菌暴露改变了树突状细胞气道景观
DCs的重新聚类产生了2个主要簇（簇0,1）和1个次要簇（簇2），它们具有混合表型，两个主要簇的基因表达（图4G）。簇 0 中的细胞 Clec9a、Itgae （CD103） 和 MHC II 基因 （H2-Ab1、H2-DMa） 表达高，与肺 CD103 cDC 的表达谱一致 [37]（图 4I），而簇 1 中的细胞 Batf3、Ccr7 和 Fscn1 表达较高。所有三个簇都具有高 Irf8 表达和 Xcr1、Irf4 和 Itgam （CD11b） 低表达（图 4I）。 虽然与对照组或scBCG样本相比，coMtb样本在聚类0的相对频率上呈上升趋势，而在聚类1中呈较低趋势，但这些差异并不符合统计学意义（Tukey后检验的单因素方差分析，p = 0.16，p = 0.11）（图4H）。这可能是由于统计功效的限制，只有 2 次重复。然而，值得注意的是，对于簇 0 内的细胞，与对照细胞或 scBCG 细胞相比，coMtb 细胞的 MHC II 基因（H2-Aa、H2-DMb1 和 Cd74）的表达水平显着更高（图 4J）。这表明 coMtb 可能能够在气道中引发更成熟或激活的 DC。总体而言，scRNAseq 分析表明，分枝杆菌暴露导致气道中 T 细胞和树突状细胞群的最小变化，尽管我们假设 DC 成熟/激活的微小变化可能对气溶胶感染后的适应性免疫启动动力学产生重要影响。+
分枝杆菌暴露后肺泡巨噬细胞的细胞内在重塑允许干扰素在体外反应
对体内 Mtb 的 AM 反应分析表明，对 Mtb 的最早免疫反应因先前的分枝杆菌暴露而改变。然而，这种方法的一个局限性是无法辨别AM的变化是细胞内在的还是依赖于改变的组织环境，尤其是Mtb特异性T细胞的存在。因此，为了确定分枝杆菌暴露是否诱导AM的细胞内在变化，我们从对照，scBCG和coMtb小鼠中分离AM，用LPS，Pam3Cys或H37Rv在体外刺激它们，并在6小时后测量它们的转录谱（图5A）。首先，PAMP特有的趋势是值得注意的。与LPS和H37Rv刺激后对照小鼠的AM相比，来自coMtb和scBCG小鼠的AM显示出不同的反应，但在Pam3Cys刺激后只有最小的变化（图5B和S3表）。先天受体或接头表达没有明显变化，无法解释PAMP特异性差异（S11图）。其次，正如我们之前报道的那样，Mtb感染的AMs在体外并没有强烈上调Nrf2相关基因（图5C）。第三，当我们检查区分scBCG和coMtb小鼠之间体内AM反应的基因集时，“干扰素α/γ反应”和“IL6 JAK STAT3”（图2E），我们发现暴露方式之间的差异在体外减少，表明肺部环境对反应质量的贡献（图5C).使用基因集富集分析，我们确定了“干扰素γ反应”、“干扰素α反应”、“通过NF-kB的TNFa信号传导”和“炎症反应”通路是scBCG和coMtb AMs的LPS和H37Rv反应最强的富集途径（图5D）。为了评估观察到的细胞内在变化是否持久，我们通过RT-qPCR比较了scBCG疫苗接种后8周或23周AM的反应。 与8周相比，暴露后23周的基因表达增加同样强劲甚至增强，这表明暴露诱导的AM变化相对较长（S12图).为了验证基因表达的变化是否反映在蛋白质水平上，我们试图开发一种基于流式细胞术的检测方法来评估AM特异性反应。用LPS刺激原代AM20小时，并通过流式细胞术测量MHC II和TNF表达（图5E）。我们发现，来自coMtb小鼠的AM的MHC II表达明显高于对照组，并且在2个实验中的1个实验中观察到scBCG AM的类似模式（图5F）。在2个实验中的1个实验中，来自coMtb小鼠的AM也显示出TNF表达的显着增加（图5G）。
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图 5. 分枝杆菌暴露后肺泡巨噬细胞的细胞内在重塑。
A） scBCG 或 coMtb 暴露后 8 周的 AM 隔离。用 Pam3Cys （10 ng/ml）、LPS （10 ng/ml） 和 H37Rv（有效 MOI ~2：1）刺激 AM 6 小时（RNA-seq）或 20 小时（流式细胞术）。B-D） 与各自未刺激的 AM 相比，通过大量 RNA-seq 测量的受刺激 AM 的基因表达变化（即 LPS-stim 对照 AM 与未受刺激的 AM;LPS-stim scBCG AM 与 unstim scBCG AM;LPS-stim coMtb AM 与 unstim coMtb AM）。B） 散点图、对数2对于每种情况（对照、scBCG、coMtb），刺激到未刺激的 AM 的基因表达发生倍数变化。差异表达基因 （DEG） 在一种或两种情况下突出显示 （|折变 |> 2， FDR< Pam3Cys 和 LPS 为 0.05; |折变 |> 2，FDR< H37Rv 为 0.2）。C） 散点图、对数2H37Rv 刺激到未刺激的 scBCG 与 coMtb AM 的基因表达发生倍数变化。突出显示的基因来源于图 2E 中的基因集。Nrf2 相关基因（56 个基因，紫色）、干扰素 α/γ 反应（61 个基因，橙色）和 IL6 JAK STAT3（23 个基因，绿色）。D） 50 个 HALLMARK 通路的基因集富集分析结果。所示通路至少有一种条件的 NES> 1.5 和 FDR< 0.05。*FDR< 0.05，**FDR< 0.01，***FDR< 0.001。E） coMtb AM 的门控策略以及 MHC II 和 TNF 直方图，与 LPS 相比，无刺激。LPS 刺激 20 小时后，F-G） MHC II 和 TNF MFI 在对照、scBCG 和 coMtb AM 中。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001， Tukey后测的单因素方差分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.g005
由于“干扰素α反应”和“干扰素γ反应”通路在分枝杆菌暴露后的H37Rv刺激中富集度最高，因此我们决定进一步研究干扰素相关反应[30]。我们专门寻找了一个数据集，可以识别 Mtb 感染的巨噬细胞特异性 ISG。为了产生IFNγ衍生的特征，我们需要一个巨噬细胞-T细胞共培养系统，并分拣出Mtb感染的巨噬细胞，因为小鼠巨噬细胞在体外Mtb感染期间不会产生IFNγ。因此，我们决定从 Mtb 感染的 IFNAR 骨髓来源的巨噬细胞 （BMDM） 数据集中检查 IFNα/β 衍生的特征。根据H37Rv感染后WT与IFNAR BMDM的基因表达，我们将巨噬细胞对H37Rv刺激的反应分为“IFN依赖性”或“IFN非依赖性”（参见方法部分）（S4表）[38]。IFN依赖性基因的表达在对照AMs中被诱导最小，但在暴露于分枝杆菌的小鼠的AMs中强烈上调，如GSEA标准化富集评分（NES）测量（图6A，左）。相比之下，IFN非依赖性基因的表达在对照AM中适度上调，并且仅因分枝杆菌暴露而略有改变（图6A，右）。当我们将这两个基因集应用于图 2 中描述的体内反应谱时，在高剂量感染 mEmerald-H37Rv 后为 Mtb 感染的 AM 生成，我们观察到来自 scBCG 小鼠的 Mtb 感染的 AM 在体内上调 IFN 依赖性反应，表明 IFN 依赖性反应的许可在 BCG 疫苗接种后体内发挥作用（图 6B）。coMtb 小鼠对 AM 的体外和体内反应之间的差异表明肺部环境的额外贡献。-/--/-
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图 6. 分枝杆菌暴露允许肺泡巨噬细胞对 H37Rv 产生干扰素依赖性反应。
与各自未刺激的 AM 相比，通过批量 RNA-seq 测量的 Mtb 感染 AM 的基因表达变化（即 Mtb-inf 对照 AM 与未刺激对照 AM;Mtb-inf scBCG AM 与 unstim scBCG AM;Mtb-inf coMtb AM 与 unstim coMtb AM）。A） 对照、scBCG 和 coMtb AM 的基因表达，离体 6 小时 H37Rv 感染，日志2倍数变化（Mtb 感染/未感染）。基于 WT vs IFNAR BMDM 批量 RNA-seq 数据集的 IFN 依赖性基因（共 339 个）和 IFN 非依赖性基因（共 352 个）（Olson 等人，2021）（参见方法部分）。B） 对照、scBCG 和 coMtb AM 的基因表达，体内 24 小时 H37Rv 感染，Mtb 感染排序，日志-/-2（A）中相同IFN依赖性和IFN非依赖性基因集的倍数变化（Mtb感染/未感染）。灰色条表示 GSEA 为 Hallmark Pathways 的两个数据集计算的 ND 标准化富集评分 （NES）。+罗斯福< 0.05， ++罗斯福< 0.01， +++罗斯福< 0.001.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.g006
这些结果表明，先前的分枝杆菌暴露导致AM的细胞内在变化，从而增强了对Mtb的IFN依赖性反应，这些反应在体外保留，而scBCG和coMtb在体内反应的定性差异取决于来自肺部环境的信号。
讨论
在这里，我们描述了AMs的重塑，AMs是长寿命的气道常驻先天细胞，遵循两种分枝杆菌暴露方式，scBCG疫苗接种和coMtb，一种包含Mtb感染的模型。AM是气溶胶Mtb感染后在肺部产生性感染的首批细胞[10,11]。我们之前表明，AM最初通过细胞保护性Nrf2驱动的程序对Mtb感染做出反应，这对早期宿主控制是有害的[10]，这表明AM缺乏强大的反应会妨碍早期有效的宿主控制。与该模型一致，其他人已经表明，AM的耗竭或“绕过”AM的策略，包括直接注射抗原引发的DC或激活DC可加速免疫应答并减少细菌负荷[17,39,40]。然而，疫苗接种或既往暴露如何影响AM的初始反应，以及是否有治疗策略可以增强其对感染的初始反应，尚未得到充分研究[41]。
大多数研究检查先前暴露于Mtb或其他分枝杆菌物种的影响，包括卡介苗疫苗接种，都集中在适应性免疫反应的持久抗原特异性变化上。相比之下，我们专注于组织驻留先天细胞的变化及其在感染最早阶段（≤ 14 天）的反应。随着 T 细胞反应的早期变化，scBCG 和 coMtb 在 Mtb 气溶胶感染后的前 10-14 天内加速先天细胞活化和免疫细胞募集，甚至在感染后的前 24 小时内对 Mtb 的最初 AM 反应也会在暴露于分枝杆菌后重塑。观察到的持久变化与最近的许多研究相吻合，这些研究揭示了病毒感染后AM抗菌表型增强[7–9]或反应受损[42,43]。其他研究发现，鼻内接种腺病毒疫苗或灭活全细胞疫苗后，AM会发生长期变化[18,44,45]。
我们观察到，在 scBCG 或 coMtb 之后，AM 反应的最强大的细胞内在变化是在 IFN 依赖性基因（图 6）和 ISG（图 2D）中发现的，这表明干扰素信号在感染期间肺部早期先天反应的变化中起着关键作用。值得注意的是，这一发现不仅限于小鼠模型。接种IV、ID或气溶胶卡介苗后，非人灵长类的BAL同样显示AM富集干扰素γ反应通路基因[46]。AM 可以对 I 型 （IFNα/β） 和 II 型干扰素 （IFNγ） 产生反应，仅根据转录分析无法区分对 IFNα/β 和 IFNγ 的反应。scBCG和coMtb模型中活细菌的存在限制了整个系统的扰动，例如T细胞耗竭或抗IFNγ阻断，这将逆转遏制[24]。出于这个原因，我们无法直接测试来自scBCG或coMtb的干扰素信号如何以细胞自主的方式重塑AM，但我们设想未来的研究来检查单个细胞因子对AM重塑的具体影响。
尽管IFNAR巨噬细胞用于产生图6中鉴定的ISG特征，但IFNγ更有可能在分枝杆菌暴露后促进AM重塑。静脉接种卡介苗后，骨髓源性髓系细胞需要IFNγ产生训练有素的免疫力[15,47]。虽然发现静脉注射和气溶胶H37Rv感染可诱导I.型IFN并减少骨髓生成[47]，但我们之前发现coMtb（其中Mtb包含在引流耳淋巴结内）会导致低水平的全身性细胞分裂症，包括IFNγ的产生。使用WT：Ifngr1混合骨髓嵌合体，我们发现IFNγ信号转导负责coMtb建立后的单核细胞和AM激活[25]。此外，一些报告已经确定 T 细胞来源的 IFNγ 对改变 AM 功能至关重要，尽管免疫学结果因环境而异。在一项研究中，腺病毒感染后的 T 细胞来源的 IFNγ 导致 AM 激活、先天训练和 S 保护。肺炎[8]，而在另一项研究中，流感诱导的T细胞来源的IFNγ导致AM功能障碍和S清除受损。肺炎[43]。一项纳入88例SARS-CoV-2患者的研究发现，AM和T细胞来源的IFNγ是气道正反馈回路的一部分[48]。相比之下，I.型IFN特征与人类和非人灵长类动物的活动性结核病或结核病进展有关[49–51]。宿主扰动（如poly I：C治疗或病毒合并感染）诱发I.型IFN导致疾病恶化[52,53]，I型IFN已被证明在Mtb感染期间阻断骨髓细胞中IL-1β的产生[54]，I.型IFN驱动Mtb感染巨噬细胞的线粒体应激和代谢功能障碍[38]。-/--/-
我们注意到，这里测试的两种模式由不同的分枝杆菌种类、不同的剂量和不同的途径组成。我们预计这三个因素都可能有助于提高增材制造改造的质量。例如，它们对于AM暴露的IFNγ的位置、时间和数量可能很重要。虽然对这些因素中的每一个进行深入研究超出了本研究的范围，但对两种不同的暴露模型（scBCG 和 coMtb）的并排比较使我们能够检查 AM 表型的可塑性以及导致不同反应的局部和/或系统环境的影响。值得注意的是，scBCG可迅速从WT小鼠体内清除，而coMtb复制在颈浅淋巴结中可持续长达1年或更长时间[25]。抗生素治疗后，coMtb介导的H37Rv攻击的保护作用被消除，但并未完全丧失[25]。这表明，活性细菌复制和细菌清除后的长期微环境变化可能对AM重塑有不同的贡献，这将在后续研究中解决。
特别值得注意的是，通过体内转录分析鉴定的模态特异性特征与Nrf2特征一起在离体分离后消失。体内和离体特征之间的差异表明，改变的肺部微环境在AM重塑中做出了重要贡献，值得进一步的后续研究。
我们方法的另一个局限性是，在没有细胞分选的情况下，体外样本是批量收集的，因此，与体内研究不同，极少数旁观者AM可能与Mtb感染的AM一起收集，这可能对转录特征产生轻微影响。AM可以被重塑成不止一种状态，这一事实表明，先天免疫特征的额外复杂性尚未得到充分探索。髓系重编程的异质性不仅限于小鼠模型，在人单核细胞中也观察到[55]。
最近有几项研究描述了气道内的先天适应性相互作用，这些相互作用被认为会影响感染动力学[46,48]。我们注意到，在这些模型中，我们观察到先天细胞活化和募集与T细胞活化和募集同时发生，并且这些事件可能相互促进。我们对在感染的前两周（图1A）和体外刺激后（图5F）在体内观察到的AM MHC II类表达的变化特别感兴趣。与其他髓系亚群相比，AM被认为是较差的抗原呈递者，但Mtb特异性T细胞募集到肺部的速度越快，AM作为原发性T细胞靶标的可能性就越大[37,56–60]。我们的结果表明，AM抗原呈递的增强可能是一种先天机制，可以靶向补充和协同感染期间的适应性免疫反应。AM重塑可能有助于增强Mtb气溶胶攻击后细菌控制的其他潜在机制包括吞噬活性增强或直接抗分枝杆菌活性增加，如Jeyanathan等[19]先前证明的那样。需要进一步的研究来进一步探究这些先天机制的贡献。
还有许多其他问题。虽然我们确定了细胞内在变化和依赖于肺部环境的变化，但我们还不知道在没有环境线索的情况下细胞内在变化是否长期保留。我们不知道这些变化的持久性，包括细胞内在的和环境依赖性的，以及它们是否由表观遗传效应介导。我们最长的实验显示，23周后AMs的细胞内在变化得以保留。在Nemeth等人的研究中，我们发现抗生素治疗减少了coMtb介导的保护作用，这表明持续复制是宿主保护的关键部分[25]。AM重塑在初次暴露后8周或更长时间保留，此时肺部几乎没有可检测到的分枝杆菌，排除了AM重塑中局部持续细菌复制的需求，尽管来自远程细菌复制的全身信号可能仍然起作用。我们还使用静脉注射卡介苗（ivBCG）进行了其中几项研究，在小鼠模型中，ivBCG比scBCG可导致更持久的细菌复制[61]。虽然我们在 ivBCG 模型中观察到与 AM 相似的重塑，但这些重塑与 scBCG 疫苗接种的质量没有差异，尽管细菌复制存在重大差异，并且 T 细胞募集到气道的次数要大得多，这表明这些变化不是 AM 重塑所必需的（S9 图）。
关于驱动组织驻留先天细胞重编程的信号还有很多未知数。理想情况下，疫苗的设计将利用这些信号，以促进先天反应和适应性反应之间最有效的相互作用。确定AM被炎症信号重新编程的方式以及它们改变的表型对感染早期阶段的影响将有助于改进未来的疫苗或宿主定向疗法。
材料与方法
道德声明
在西雅图儿童研究所进行的动物研究是按照西雅图儿童研究所的机构动物护理和使用委员会的规定和批准进行的。在马萨诸塞大学阿默斯特分校进行的动物研究是在马萨诸塞大学阿默斯特分校机构动物护理和使用委员会的批准下进行的。所有小鼠均被饲养并维持在特定的无病原体条件下。
小 鼠
C57BL / 6小鼠购自Jackson Laboratories（缅因州巴港）。所有实验均使用6-12周龄的雄性和雌性小鼠，但RNA测序除外，该测序仅使用雌性小鼠进行均匀性。感染 Mtb 的小鼠被饲养在动物生物危害收容套件的生物安全 3 级设施中。
分枝杆菌暴露模型：卡介苗免疫和coMtb的建立
将 BCG-Pasteur 在 Middlebrook 7H9 肉汤中于 37°C 培养至外径为 0.1–0.3。细菌在 PBS 和 1 x 10 中稀释6200ml中的CFU皮下注射（SC）或静脉注射（IV）。皮内感染以建立coMtb，如前所述[24]，并进行了一些修改，详见前文[25]。简而言之，在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉后，使用 10 μL 汉密尔顿注射器以 10 μL PBS 皮内将 10,000 CFU 的 Mtb （H37Rv） 对数期生长注入耳朵。
结核分枝杆菌气溶胶感染与肺单核细胞分离
使用野生型 H37Rv 进行气溶胶感染，包括一些用 mEmerald 报告基因 pMV261 质粒转化的气溶胶感染，由 Chris Sassetti 博士和 Christina Baer（马萨诸塞大学医学院，伍斯特，马萨诸塞州）慷慨提供。对于标准（~100 CFU）和高剂量（1,473-4,800 CFU）感染，将小鼠封闭在气溶胶感染室（Glas-Col）中，解冻冷冻的细菌储备液并置于相关的雾化器内。为了确定感染剂量，一天后处死每个感染中的三只小鼠，并将肺匀浆接种到7H10平板上用于CFU计数。如前所述，在scBCG疫苗接种后4周和coMtb疫苗接种后2周对Mtb感染的AM进行高剂量激发和分选[62]。所有其他分析均在分枝杆菌暴露后 8 周进行。
肺单细胞悬浮液
在每个时间点，切除肺，并通过含有DNaseI（30μg/ ml;Sigma-Aldrich）在37°C下30分钟，使用温和的MACS解离器（Miltenyi Biotec）进行机械破坏，然后通过70μM细胞过滤器过滤。将细胞重悬于FACS缓冲液（PBS、1%FBS和0.1%NaN）中3）在流式细胞术染色之前。对于细菌计数，使用温和的MACS解离剂（Miltenyi Biotec）在PBS中的0.05%吐温-80中处理肺，并接种到7H10板上用于CFU计数。ΔCFU（对数）的计算公式如下：ΔCFU = log（（样品 CFU）/（平均对照 CFU*）。 *适用于各自的实验、时间点和器官。与对照组相比，ΔCFU 值为 -1 对应于样品的 CFU 降低了 10 倍。同样，ΔCFU 值为 1 对应于 CFU 增加 10 倍。
肺泡巨噬细胞分离
通过支气管肺泡灌洗 （BAL） 收集用于细胞分选、批量 RNA 测序、单细胞 RNA 测序和体外刺激的 AM。通过暴露安乐死小鼠的气管，用 Vannas 微型剪刀 （VWR） 刺穿气管并使用连接到 1 mL 注射器的 20G-1“ IV 导管 （McKesson） 注射 1 mL PBS 来执行 BAL。将PBS冲洗到肺部，然后吸出三次，并将回收的液体放入冰上的15mL管中。洗涤再重复 3 次。细胞被过滤并旋转下来。对于抗体染色，将细胞悬浮在FACS缓冲液中。对于细胞培养，细胞以 5 x 10 的密度接种4完全 RPMI（RPMI 加 FBS（10%，VWR）、L-谷氨酰胺（2mM，Invitrogen）和青霉素-链霉素（100 U/ml;Invitrogen），并在 37°C 加湿培养箱（5% CO2).在感染 Mtb 之前，用抗生素洗掉培养基。
细胞分选和流式细胞术
用抗CD16/32（2.4G2，BD Pharmingen）阻断Fc受体。使用 Zombie Violet 染料 （Biolegend） 评估细胞活力。将细胞悬浮在含有 0.01% NaN 的 1X PBS （pH 7.4） 中3和 1% 胎牛血清（即 FACS 缓冲液）。表面染色在4度下进行20分钟，包括对小鼠具有特异性的抗体：Siglec F（E50-2440，BD Pharmingen），CD11b（M1/70），CD64（X54-5/7.1），CD45（104），CD3（17A2，eBiosciences），CD19（1D3，eBiosciences），CD11c（N418），I-A/I-E（M5/114.15.2），Ly6G（1A8），Ly6C（HK1.4），TNF（MP6-XT22）。对于 ICS，在 LPS 刺激期间添加 Brefeldin A。使用 Cyto-Fast Fix/Perm 和 Cyto-Fast Perm Wash 试剂进行细胞内染色。除非另有说明，否则试剂均来自 Biolegend。MHC II 类四聚体 ESAT-6 （I-A（b） 4-17，序列：QQWNFAGIEAAASA） 和 MHC I 类四聚体 TB10.4 （H-2K（b） 4-11，序列：IMYNYPAM）购自美国国立卫生研究院四聚体核心设施。在FACS Aria（BD Biosciences）上进行细胞分选。将分选的细胞收集在完全培养基中，旋转，重悬于TRIzol中，并在RNA分离前在-80°C下冷冻过夜。将流式细胞术样品固定在PBS中的2%多聚甲醛溶液中，并使用LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）和FlowJo软件（Tree Star，Inc.）进行分析。
批量RNA测序和分析
所有高剂量感染和对 Mtb 感染的 AM（对照、scBCG 和 coMtb）进行批量 RNA 测序的分选均在西雅图儿童研究所的 ABSL-3 设施中进行。所有感染都使用相同的 Mtb 菌株 mEmerald-H37Rv，并且基于 TRIzol 的 RNA 分离方案由同一个人 （D.M.） 执行。使用 TRIzol （Invitrogen）、两次连续氯仿提取、糖蓝载体 （Thermo Fisher）、异丙醇沉淀和用 75% 乙醇洗涤进行 RNA 分离。使用 Bioanalyzer RNA 6000 Pico Kit （Agilent） 对 RNA 进行定量分析。按照制造商的说明，使用 SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit （v2）–Pico Input Mammalian （Clontech） 构建 cDNA 文库。扩增文库，然后在Illumina NextSeq（2 x 76，双端（分选的BAL细胞）或2 x 151，双端（离体刺激样品））上测序。对链式双端读长进行预处理：按照 SMARTer 链式总 RNA-Seq 试剂盒-Pico 输入哺乳动物用户手册 （v2： 063017） 中的描述去除 R2 的前三个核苷酸，并去除由超过 66% 的相同核苷酸组成的读段。使用gsnap比对器[63]（v.2018-07-04）将剩余的read对与小鼠基因组（mm10）+ Mtb H37Rv基因组比对，从而实现新的剪接。使用 iocond 程序和 Ensembl 的基因定义将唯一对齐的读取对（~2000 万个/样本）一致地映射Mus_Musculus GRCm38.78 编码和非编码基因分配给外显子。使用edgeR包中的“filterByExpr”功能过滤低表达基因[64]。使用 ioconductor.org 的“edgeR”包[64]计算差异表达。使用 Benjamini-Hochberg 算法计算错误发现率。在 R 中使用“Tsclust”和“hclust”库执行分层聚类。热图和散点图可视化分别使用“heatmap.2”和“ggplot2”库在 R 中生成。
基因集富集分析（GSEA）
GSEA的输入数据由列表组成，按-log（p值）排名，比较靶标样品的RNAseq表达测量值和朴素对照，包括倍数变化的方向性。使用分子特征数据库（Molecular Signatures Database， MsigDB）提供的列表定义人类Hallmark基因的小鼠直系同源物[65]。如前所述，GSEA软件用于计算每个标志性基因列表中排名列表的富集[66]。每个 ES 的名义 p 值是根据 1,000 个随机排列的零分布计算的。为了纠正多假设检验，计算了标准化富集评分 （NES），该评分根据零分布校正 ES。计算每个 NES 的错误发现率 （FDR）。前沿子集被定义为特定基因集中的基因，这些基因在运行总和达到其最大值时或之前是排名列表的一部分。
独创性通路分析 （IPA）
IPA（QIAGEN）用于鉴定初治AM和Mtb感染AM之间差异表达基因的富集通路（临界值：FDR<0.01，|FC|> 2）。报告了富集评分 p <值为 0.05 且超过 10 个基因成员的前 20 个典型通路。
单细胞RNA测序
每个样品合并每个条件的 10 只小鼠的 BAL，每个条件有两个独立的重复。按照10X Genomics的“CG000136 Rev. D”方案制备用于甲醇固定的样品[67]。简而言之，用 70 μm 过滤器过滤样品，并用 ACK 裂解缓冲液裂解红细胞。使用宽孔吸头将样品重悬于 1 mL 冰冷的 DPBS 中，并转移到 1.5 mL 低结合 Eppendorf 管中。将样品在 4°C 下以 700 × g 离心 5 分钟。 用p1000移液管小心除去上清液，用DPBS再洗涤细胞沉淀两次，计数，并重悬于200μL冰冷的DPBS/1×10中6细胞。滴加 800 μL 冰冷甲醇，最终浓度为 80% 甲醇。样品在 -20°C 下孵育 30 分钟，然后在 -80°C 下储存长达 6 周，然后再水化。对于再水化，将冷冻样品平衡至 4°C，在 4°C 下以 1,000 × g 离心 10 分钟，并重悬于 50 μL 洗涤重悬缓冲液（0.04% BSA + 1mM DTT + 0.2U/μL Protector RNAase 抑制剂，溶于 3× SSC 缓冲液中）以达到 ~1,000 个细胞/μL（假设样品损失率为 75%）。
单细胞RNA测序分析
按照制造商的说明，使用 Next GEM Single Cell 3′ Reagent Kits v3.1 （Dual Index） （10X Genomics） 制备文库。原始测序数据与小鼠基因组 （mm10） 和使用 Cell Ranger 流程 （10X Genomics） 确定的 UMI 计数进行比对。使用Seurat v.3进行数据处理、整合和分析[68]。丢弃含有少于 200 个检测到的基因、超过 4000 个检测到的基因（双峰鉴别）或超过 5% 线粒体的液滴。在所有样本中，少于 3 个细胞表达的基因被去除。使用Immgen数据库[69]作为参考，使用“SingleR”包[70]对集群进行无偏注释。使用“SeuratWrappers”和“Monocle3”R软件包进行伪时间分析[71]。使用 “Seurat”、“tidyverse”、“cowplot” 和 “viridis” R 包进行数据可视化。
肺泡巨噬细胞体外刺激
通过支气管肺泡灌洗分离AMs，并从每组5只小鼠中合并。细胞以 5 x 10 的密度接种4完全 RPMI（RPMI 加 FBS（10%，VWR）、L-谷氨酰胺（2mM，Invitrogen）和青霉素-链霉素（100 U/ml;Invitrogen），并在 37°C 加湿培养箱（5% CO2).在刺激前洗掉含有抗生素和非贴壁细胞的培养基。用 LPS（来自明尼苏达州沙门氏菌的 LPS，List Biologicals，#R595,10 ng/ml）、Pam3Cys（Pam3CSK4，EMC Microcollections，GmbH，10 ng/ml）或 H37Rv（有效 MOI ~2：1）刺激 AM。H37Rv 是通过在 37°C 下从 7H9 培养基中培养 48 小时至 0.1–0.3 的外径培养来制备的。根据菌株滴度计算最终浓度，并将细菌加入巨噬细胞中2小时。然后洗涤培养物三次以除去细胞外细菌。细胞培养物在 6 小时后在 PBS 中洗涤一次以去除死细胞，并在 TRIzol 中收集以通过氯仿/异丙醇提取进行 RNA 分离，或在 20 小时后收集用于流式细胞术和 ICS。
过滤干扰素依赖性和独立性基因集
根据Olson等人[38]的数据生成“IFN依赖性”和“IFN非依赖性”基因集，使用以下过滤器从H37Rv刺激的WT BMDM中上调的总共1,233个基因开始，平均CPM>1，log2倍数变化 > 1 和 FDR < 0.01：
“IFN 依赖性”= H37Rv 刺激的 IFNAR BMDM：log-/-21 和 H37Rv 刺激< WT 与 IFNAR 的倍数变化：log-/-2倍数变化 > 2 = 339 个基因
“IFN 无关”= H37Rv 刺激的 IFNAR BMDM：log-/-2倍数变化> 1、FDR < 0.01 和 H37Rv 刺激的 WT 与 IFNAR：对数-/-22 <倍数变化 = 352 个基因
qRT-PCR检测
在CFX384 Touch实时荧光定量PCR检测系统（BioRad）中使用TaqMan引物探针（ABI）和TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（ThermoFisher）进行定量PCR反应。通过单个样品中 Ef1a 表达水平对数据进行归一化。
统计分析
使用 Bioconductor.org 的 edgeR 软件包分析 RNA 测序，并使用 Benjamini-Hochberg 算法计算错误发现率。所有其他数据均以SEM±平均值表示，并通过单因素方差分析（95%置信区间）和Tukey后测（用于比较多种条件）进行分析。使用GraphPad Prism v6.0软件或使用“Prcomp”和“Biplot”软件包生成的R.PCA图进行数据的统计分析和图形表示。使用Intervene进行维恩图和基因集交叉分析[72]。p 值，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。
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S1 图。 （与图 1 相关）。流式细胞术设门方案。
髓系 （A） 和 T 细胞 （B） 分析的门控策略。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s001
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S2 图。 （与图 1 相关）。分枝杆菌暴露可防止标准低剂量 H37Rv 气溶胶攻击。
A） 对照小鼠在第 10、12、14 和 28 天沉积时的肺、脾和肺引流淋巴结 （LN） CFU。B-E） 第 10 天 （B）、第 12 天 （C）、第 14 天 （D） 和第 28 天 （E） 低剂量感染 H37Rv 后肺、脾脏和 LN 中 ΔCFU （log） 的汇总图。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。带有 Tukey 后检验的单因素方差分析。数据从每种条件下的2-3个独立实验中收集，每个实验每组5只小鼠。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s002
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S3 图。 （与图 2 相关）。Ingenuity Pathway 分析的 Mtb 感染肺泡巨噬细胞上调基因的 20 大典型通路。
高剂量 mEmerald-H37Rv 感染后 24 小时对照、scBCG 和 coMtb 小鼠的 Mtb 感染 AM 进行 IPA 分析。每个条件代表 3 个独立实验的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s003
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S4 图。 （与图 2 相关）。通过批量 RNA 测序暴露分枝杆菌后幼稚肺泡巨噬细胞的转录变化。
幼稚AM的批量RNA-seq谱（与Mtb感染的AM一起分离）。将幼稚AM中的基因表达变化与对照小鼠的AM进行比较：幼稚scBCG AM与幼稚对照AM;幼稚的 coMtb AM 与幼稚的控制 AM。A-B） 火山图描绘了 scBCG （A） 和 coMtb（B） 小鼠幼稚 AM 与对照小鼠幼稚 AM 相比基线基因表达的变化。显著改变的基因 （FDR < 0.05， |FC|> 2） 突出显示并标记。C） 目标先天受体和接头子的基因表达，log2与来自对照小鼠的未刺激AM相比，scBCG和coMtb小鼠的未刺激AM的倍数变化。* FDR < 0.01。由每种情况的 2 个独立实验编译而成。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s004
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S5 图。 （与图 3 相关）。对制备用于 10X 单细胞 RNA 测序的 BAL 样品进行流式分析。
每个群体（AM、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、MDM、其他 CD45）占 CD45 ZV 的百分比。AM = Siglec F CD64，嗜酸性粒细胞 = Siglec F CD64，淋巴细胞 = CD3/CD19，MDM = Siglec F CD64，其他 CD45 = CD3 CD19 Siglec F CD64。注意：通过流式细胞术分析的两个coMtb样品中的一个没有随附的10X样品。第二个coMtb 10X样品单独处理，无需流动分析。++-+++-+-++----
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s005
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S6 图。 （与图 3 相关）。11 个巨噬细胞亚簇中每个亚簇中前 10 个基因差异表达。
在 11 个簇中的每一个簇中，与所有其他簇差异表达最强的基因的热图。以 > 0.25 的对数倍数变化阈值和 25% 的最小百分比表达过滤基因。除一个基因（Gsto1）外，所有基因的调整p值均<1.0x10-5。*五个基因（Fabp4、Fabp5、Stmn1、Mki67、Cbr2）在多个簇中满足此标准，与更丰富的簇分组。 数据来自两个独立实验，每个实验 3 个条件，总共 6 个样本。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s006
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S7 图。 （与图 3 相关）。与巨噬细胞亚簇 3 相关基因的 UMAP 基因表达曲线，并在 AM_2 中发现 （Pisu 等人） （31）。
与线粒体氧化磷酸化（mt-Co1、mt-Cytb、mt-Nd2）、染色质重塑（Ankrd11、Baz1a）、巨噬细胞相关转录因子（Cebpb、Zeb2、Bhlhe40、Hif1a）和 CARD9 信号转导（Malt1、Bcl10）相关的基因。 数据来自两个独立实验，每个实验有 3 个条件，总共 6 个样本。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s007
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S8 图。 （与图 3 相关）。集群 6 巨噬细胞在暴露条件下的频率和基因表达。
A） 来自对照组、scBCG 和 coMtb 小鼠的 BAL 样本的单细胞 RNA 测序。巨噬细胞亚簇，每个簇都有注释。每个重复的簇 6 的相对频率。B） 对照组、scBCG 组和 coMtb 样本之间第 6 组内的差异表达基因。Wilcoxon 秩和检验，Bonferroni 调整 p 值，***adj-p < 0.001。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s008
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S9 图。 （与图 3 相关）。静脉注射卡介苗可导致与皮下注射卡介苗相似的肺泡巨噬细胞重塑。
A-B） 与对照组相比，在先前暴露于 scBCG、ivBCG 和 coMtb 的小鼠中，在高剂量 mEmerald-H37Rv 感染后 24 小时，幼稚和 Mtb 感染的 AM 之间的批量 RNA-seq 基因表达分析。（对照 - Rothchild 等人报告，2019 年（10）;CMTB- 在 Nemeth 等人中报告，2020（25））。A） 在 24 小时内使用 DEG（倍数变化 >|2|，FDR < 0.05）对 Mtb 感染的 AM 进行主成分分析。B） Mtb 感染的 AM（左）干扰素刺激基因 24 小时 131 DEG 的热图，源自巨噬细胞对 IFNα 的反应（倍数变化 >2，p 值< 0.01） Mostafavi 等人，2016 （30）（中），IL6 JAK STAT3 标志通路（右）。C） 来自对照、scBCG、ivBCG 和 coMtb scRNAseq BAL 样本的巨噬细胞亚群的 3 个关键簇的相对频率。（A-B）由每个条件的 3+ 个独立实验编制而成，每个条件对 scBCG、ivBCG 和 coMtb 进行 2 个独立实验。（C） 数据来自两个独立的实验（圆形、三角形），每个实验有 3 个条件，共 6 个样本。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s009
（TIF）
S10 图。 （与图 4 相关）。T 细胞亚簇感兴趣的簇和谱系标记基因的 UMAP 基因表达图。
数据来自两个独立实验，每个实验有 3 个条件，总共 6 个样本。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s010
（TIF）
S11 图。 （与图 5 相关）。来自体外刺激的肺泡巨噬细胞的基因表达。
A） 与各自未刺激的 AM 相比，通过批量 RNA-seq 测量的受刺激 AM 的基因表达变化（即 LPS-stim 对照 AM 与未受刺激对照 AM;LPS-stim scBCG AM 与 unstim scBCG AM;LPS-stim coMtb AM 与 unstim coMtb AM）。用 Pam3Cys （10 ng/ml）、LPS （10 ng/ml） 或 H37Rv（有效 MOI ~2：1）刺激 AM 6 小时。火山图描绘了褶皱变化（log2） 和 P 值 （-log10） 与各自未刺激的对照组相比，三组（对照组 scBCG、coMtb）中每组的每种刺激条件。DEG（p 值 < 0.001;|倍数变化| > 2）在空间允许的情况下突出显示和标记。B） 与对照 AM 相比，scBCG 和 coMtb AM 的先天受体和目标接头的基线基因表达，log2倍数变化，unstim scBCG AM vs unstim control AM;unstim coMtb AM 与 unstim 控制 AM。由 3 个独立实验编译而成。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s011
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S12 图。 （与图 5 相关）。接种后 23 周保留肺泡巨噬细胞反应的细胞内在变化。
Mx1、Cxcl10、Il1b、Cxcl2、Irf7 和 Il6 的基因表达，通过 qPCR 测量 BAL 从 scBCG 疫苗接种后 8 周和 23 周的小鼠和年龄匹配的对照中分离的 AM，有和没有 LPS （10 ng/ml） 刺激。数据代表了来自单个实验的技术增材制造重复项。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s012
（TIF）
S1 表。 来自 scBCG 小鼠的高剂量 H37Rv-mEmerald 攻击后 24 小时肺泡巨噬细胞的 RNA 测序数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s013
（XLSX）
S2 表。 用于巨噬细胞、T 细胞和树突状细胞亚簇分析的单个簇的顶级差异表达基因。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s014
（XLSX）
S3 表。 体外刺激肺泡巨噬细胞的RNA测序数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s015
（XLSX）
S4 表。 基于 WT 和 IFNAR BMDM RNA-seq 数据的 IFN 非依赖性和 IFN 依赖性基因。-/-
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011871.s016
（XLSX）
确认
我们感谢西雅图儿童研究所和马萨诸塞大学阿默斯特分校的动物护理人员Pamela Troisch和系统生物学研究所的下一代测序核心。作者感谢西雅图儿童研究所的研究科学计算部门提供的 HPC 资源，这些资源为本文报告的研究结果做出了贡献。我们感谢 Aderem、Urdahl 和 Rothchild 实验室的成员进行了有益的讨论。
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