免费医学论文发表--稻瘟病真菌的 bZIP 转录因子 BIP1 对感染至关重要，并调节一组特定的 appressorium 基因

抽象

稻瘟病真菌 Magnaporthe oryzae 分化称为 appressoria 的特殊细胞，这些细胞是真菌渗透到寄主叶片中所必需的。在这项研究中，我们鉴定了对致病性至关重要的新型碱性亮氨酸拉链 （bZIP） 转录因子 BIP1 （B-ZIP Involved in Pathogenesis-1）。BIP1 对于植物叶子的感染是必需的，即使它们受伤，但对于压迫介导的人造玻璃纸膜的渗透则不是必需的。该表型表明 BIP1 与穿透钉的分化无关，但对于真菌在植物细胞内的初始建立是必需的。BIP1 的表达通过转录和转录后控制限制在顶膜内。全基因组转录组分析显示，BIP1缺失突变体中有40个基因下调。这些基因大多在顶端特异性表达。它们编码具有发病机制相关功能的蛋白质，例如参与次级代谢的酶，包括由 ACE1 基因簇编码的酶，小分泌蛋白，例如 SLP2、BAS3、BAS4 和 AVR-Pi9 效应子，以及植物角质层和细胞壁降解酶。有趣的是，这种BIP1网络与其他已知的感染相关调控网络不同，突出了植物-真菌相互作用过程中基因表达控制的复杂性。BIP1 调节基因的启动子在体外与 BIP1 共享一个 GCN4/bZIP 结合 DNA 基序 （TGACTC）。该基序在MGG_08381启动子中的突变。ACE1 基因簇中的 7 消除了其 appressorium 特异性表达，表明 BIP1 表现为转录激活因子。综上所述，我们的研究结果表明，BIP1对早期侵袭相关基因的表达至关重要。这些基因可能是第一个感染宿主细胞的生物营养侵袭所必需的，但不是渗透过程本身所必需的。通过这些机制，稻瘟病真菌战略性地预测寄主植物环境和在压抑介导的渗透过程中的反应。

作者摘要

识别控制致病性的基因调控网络是了解植物感染和制定疾病控制新策略的主要研究目标。水稻是世界一半人口的主食，但其种植受到稻瘟病真菌稻瘟病菌的威胁，这种真菌会造成严重的产量损失。这种真菌可以使用称为 appressoria 的特殊细胞破坏完整的植物叶子。在这里，我们使用随机插入诱变在致病性突变筛选中鉴定了新型 M。oryzae bZIP 转录因子 BIP1 对感染至关重要。BIP1 与寄主叶片的发生或随后的渗透无关，但对于真菌在植物细胞内的初始建立是必需的。BIP1 协调 appressoria 内一组独特的早期侵袭相关基因的表达，编码分泌的效应子、酶、次级代谢相关酶和信号转导膜受体。我们的实验数据表明，BIP1 通过直接与其启动子中存在的 TGACTC 基序相互作用来控制它们的表达。与其他已知的致病性网络截然不同，BIP1调控网络强调了感染过程中真菌基因表达的复杂控制。BIP1 似乎准备了 M。Oryzae 用于 appressorium 介导的渗透过程中的早期生物营养生长。

数字

Table 1Fig 7Fig 8图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Table 1Fig 7Fig 8图1图2图3

引文： Lambou K， Tag A， Lassagne A， Collemare J， Clergeot P-H， Barbisan C， et al. （2024） 稻瘟病真菌的 bZIP 转录因子 BIP1 对感染至关重要，并调节一组特定的 appressorium 基因。PLoS 病理学 20（1）： e1011945 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945

编辑 器： Richard A. Wilson，美国内布拉斯加大学林肯分校

收到： 2023年3月16日;接受： 2024年1月4日;发表： 1月 22， 2024

版权所有： ? 2024 Lambou et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 该研究的转录组学数据已提交给 NCBI - 登录号为GSE18823。

资金： 作者没有为这项工作获得任何具体资助。

利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。

介绍

米蛾（Pyricularia oryzae）真菌对小麦、大麦和大米等多种谷物具有致病性，是最具破坏性的真菌植物病原体之一[1,2]。 此外，M.Oryzae已被开发为研究真菌-植物相互作用的模式生物[1,3\u20127]。其发病机制依赖于一种特殊细胞的形成，即介导渗透到寄主植物组织的顶膜[8,9]。 Appressoria 与附着在叶表面的萌发分生孢子的菌丝尖端不同。这一过程受化学和物理因素的控制，如角质层单体、表面疏水性和硬度[6,9]。开始压化需要严格控制细胞周期以及分生孢子细胞的自噬细胞死亡[10,11]。此外，它还依赖于与Pmk1丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和cAMP信号通路相关的信号转导[12]。Appressorium介导的叶片渗透需要高达8 MPa的高内部膨胀压力，这是由甘油的积累形成的[13]。压迫细胞壁的黑色素化对膨胀的产生至关重要，主要是通过增强其刚性和防止溶质外排[13,14]。在寄主叶的基部，一个称为寄生孔的区域与寄主叶紧密接触，没有黑色素。在顶膜成熟过程中，在孔隙处形成一个穿透钉，主要使用机械力破坏叶表皮的角质层和植物细胞壁[6]。NADPH氧化酶产生的ROS以及细胞骨架的隔膜GTP酶依赖性肌动蛋白重组是孔隙细胞再极化和穿透钉形成所必需的[15,16]。穿透性菌丝可区分球状感染菌丝，球状感染菌丝与宿主质膜密切相互作用，定植于受感染的宿主细胞[17]。在感染的早期阶段，真菌在真菌细胞壁和植物质膜之间的细胞外空间中分泌多种效应子，其中许多效应子易位到植物细胞中[18,19]。这些效应子抑制植物免疫并操纵宿主细胞过程以促进感染[20,21]。感染开始5日后，真菌转为坏死性生活方式，其特征是主动杀伤宿主组织，分化分生孢子，导致坏死性孢子病变的形成[5,6]。

在植物病原真菌中，已经揭示了感染过程每个阶段的特异性调控网络[22,23]。转录因子 （TF） 是这些感染特异性调控网络的主要组成部分。然而，到目前为止，仅发现了少量与感染相关的TF。它们的监管网络也大多定义不清[22,23]。米分枝杆菌有495个推定的TF编码基因[24]。在 M 中进行了不同 TF 家族的全基因组调查和系统遗传表征。米科[24\u201230]。他们发现了24个bZIP TF，其中15个在致病性、发育、应激反应或代谢方面具有关键功能[28,29,31–33]。只有少数由这些 bZIP TF 控制的监管网络被调查过。bZIP3 控制参与自噬依赖性膨胀体积聚的基因的表达 [32]，MoAP1 控制参与 appressorium 氧化应激反应的多种基因的表达 [31]，而 MoEITF1 和 MoEITF2 在感染早期控制效应子编码基因的表达 [33]。

在这项研究中，我们报告了一种新的M的鉴定。参与致病性的 oryzae 转录因子 BIP1 （bZIP TF Involved in Pathogenesis-1），其表达仅限于 appressorium。BIP1缺失突变体在水稻和大麦上无致病性，分化为黑色素化突变体，不能穿透寄主叶片，但穿透人工玻璃纸膜。全基因组转录分析揭示了一组由 BIP1 控制的独特基因，该基因定义了一种新的 appressorium 特异性调控网络。

结果

M.米扎插入突变体M763是非致病性的

在 M 中进行插入诱变筛选。使用限制性内切酶介导的潮霉素抗性盒插入（REMI，[34]）分离 P1.2。筛选了 1000 个耐潮霉素的 REMI 突变体对分离的大麦叶片的致病性，从而鉴定出非致病性突变体 M763。虽然用野生型 （WT） P1-2 分生孢子接种水稻和大麦叶片在接种 6 天后引起疾病症状 （dai），但在接种 M763 分生孢子后未观察到病变，即使是 10-15 dai（图 1A 和 1B）。M763 的分子分析发现，基因 MGG_08118 的开放阅读框 （ORF） 中有一个线性化的 pAN7.1 插入。M763与相反交配型的野生型菌株之间的杂交表明，这种插入与非致病性表型共分离。5'RACE实验确定了MGG_08118 cDNA的两个替代转录起始位点（TSS）。第一个 TSS 定位来自 ATG 起始密码子的 –234 个碱基对 （bp），对应于当前的 MGG_08118 基因模型，而第二个 TSS 定位在 -53 bp 处（图 2）。cDNA克隆测序显示，3'UTR为1217 bp，并显示该基因有3个内含子，分别为153、78和108 bp（图2）。为了确认插入突变体表型，通过用潮霉素抗性盒靶向替换其CDS，在分离株P1.2中删除MGG_08118（S1图）。MGG_08118缺失突变体对大麦和水稻植株以及分离的大麦叶片均无致病性（图1）。MGG_08118缺失突变体与MGG_08118野生型等位基因的互补恢复了致病性（图1A和1B）。MGG_08118缺失突变体，分化的黑色素化压迫，在形状、数量和膨胀上与WT的压迫没有区别（图3和S2）。因此，MGG_08118的丧失并没有损害压迫的分化、膨胀积聚和成熟。MGG_08118缺失突变体的分生孢子化（S3图）、菌丝体生长（S4图）或对细胞壁和氧化应激的抵抗力（S5图）也不受影响。然而，这种突变体渗透到大麦和水稻表皮细胞的能力被完全消除（图3和S6）。事实上，共聚焦显微镜显示，突变体在早期感染菌丝发展之前就被阻滞了，并且可能没有产生穿透钉（图 3 和 S6）。MGG_08118缺失突变体也无法感染受伤的叶片，表明侵袭性感染菌丝的形成在植物中也受损（S7图）。相比之下，MGG_08118缺失突变体能够穿透顶膜进入人造玻璃纸膜。作为野生型和互补菌株，MGG_08118突变体在膜内分化了球茎状假感染菌丝，在玻璃纸内形成星状菌丝网络（图4）。这些发现表明，MGG_08118不参与渗透钉或原发感染菌丝的分化。相反，他们认为MGG_08118对于真菌在其寄主植物中的早期建立至关重要，正如在压迫下方的表皮植物细胞中没有感染菌丝所证明的那样（图3和S6）。

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图 1. 米分枝杆菌突变体M763和Δbip1对大麦和水稻无致病性。

（A）脱落的大麦叶片接种分生孢子悬浮液液滴（3.105分生孢子/mL）从 M.稻瘟野生型分离株 P1.2、插入突变体 M763、Δbip1 缺失突变体和 Δbip1 辅以 BIP1 野生型拷贝 （Δbip1：：BIP1）。照片在接种后 6 天拍摄 （dai）。（B） 用分离株P1.2、M763 Δbip1或Δbip1：：BIP1（5.104分生孢子/mL）和照片拍摄7 dai。

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图 2. 米分枝杆菌 BIP1 位点。

BIP1 基因由三个内含子（黑线）和四个外显子组成，5'-UTR 为 234 bp，3'-UTR 为 1217 bp（均为灰色框），CDS 为 798 bp（黑色箭头）。5'-RACE 鉴定的转录从 ATG 的 –53 bp 和 – 234 bp 位置开始（灰色箭头）。在 M763 插入突变体中，质粒 pAN7.1（白色三角形）入第三个 BIP1 内含子中，即编码 bZIP 结构域的外显子的下游。将显示用于克隆的限制性位点。BIP1 蛋白 （266 aa） 在 N 端（白盒）附近有一个 bZIP 结构域。

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图 3. BIP1的缺失不影响雌膜成熟，但阻碍了雌膜介导的叶片穿透。

（A）用分离株P1.2（野生型，WT）或Δbip1的分生孢子悬浮液接种分离的大麦叶，并剥皮24和72 hai，在显微镜下观察（x400）。黑色素化压迫在 WT 和 Δbip1 中正常发展。在WT的24 hai处可见球茎感染菌丝，但在Δbip1中不存在，即使在72 hai时也是如此。尺寸棒 = 10 μm。（B） 使用共聚焦显微镜 （63X） 观察大麦细胞中菌丝渗透，并在组织固定后用 WGA-Alexa488 进行真菌染色。在Δbip1突变体感染的大麦叶片表皮细胞中未观察到感染菌丝，而Δbip1：：BIP1和P1.2感染的大麦叶片则因成功渗透大麦表皮细胞而显示出许多侵袭性感染菌丝。用 488 nm 光激发 WGA-Alexa488 染色的真菌细胞的荧光，并以绿色显示。用 380 nm 光激发钙荧光染色植物细胞的荧光，并以蓝色显示。下图：Z-stack的3D重建。尺寸棒 = 10 μm。（C） 使用共聚焦显微镜 （63X） 观察菌株 P1.2 和 Δbip1 在 48 hai 处的压抑介导的渗透。在感染Δbip1突变体的水稻鞘表皮细胞中未观察到感染菌丝，而感染P1.2的水稻鞘表皮细胞中充满了渗透事件引起的感染菌丝。组织固定后用 WGA-Alexa488 对真菌细胞进行染色。用 488 nm 光激发 WGA-Alexa488 染色的真菌细胞的荧光，并以绿色显示，并与叶片的明场图像相结合。单个明场和荧光图像显示在S6图中。尺寸棒 = 10μm。Ap：appressorium，Gt：胚管，Co：分生孢子，IH：侵袭性菌丝。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.g003

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图 4. Appressorium介导的Δbip1渗透到玻璃纸膜中。

将野生型（P1.2）、Δbip1突变体和Δbip1互补菌株的分生孢子沉积在玻璃纸膜上，在48 hai和72 hai处通过微分干涉对比显微镜观察生长到膜中的压裂（黑色箭头）和假感染菌丝（白色箭头）。棒 = 10μm。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.g004

MGG_08118编码 bZIP 转录因子

MGG_08118编码一个由266个氨基酸组成的蛋白质，具有一个假定的核定位信号和一个碱性亮氨酸拉链（bZIP）结构域，类似于酿酒酵母bZIP TFs GCN4和YAP1（S8A图）。蛋白质结构域搜索工具 CD （CD14688）、Panther （PTHR11462） 和 Superfamily （SSF57959） 在 BIP1 蛋白序列中鉴定出一个 bZIP 结构域（S8B 图），但未鉴定出 Pfam。该结构域由一个假定的 DNA 相互作用结构域组成，该结构域由富含碱性氨基酸的短序列和参与蛋白质二聚化的亮氨酸拉链基序的四个重复序列组成。因此，MGG_08118被命名为 BIP1 for bZIP TF Involved in Pathogenesis-1。对 M 的 BlastP 搜索。NCBI 的 oryzae 70-15 蛋白质组揭示了一个密切相关的 bZIP TF，MGG_08587，与 BIP1 共享 45% 的氨基酸序列同一性。编码与BIP1和MGG_08587相似的蛋白质的基因在Pezizomycotina中被发现，但在Saccharomycotina和担子菌门中没有被发现（图5）。我们将 BIP1 和 MGG_08587 与已知的 M bZIP TF 进行了比较。oryzae 和其他五种 Pezizomycotina（Neurospora crassa、Graminearum Fusarium graminearum、灰霉病菌、Parastagonospora nodorum 和 Aspergillus nidulans）通过它们的 bZIP 结构域序列的比对。该比对用于构建真菌bZIP TFs的系统发育树（图5）。系统发育分析表明，BIP1 和 MGG_08587 是与其他真菌 bZIP TF 作为独立分支聚类的旁系同源物。BIP1 和 MGG_08587 分支与先前描述的真菌 bZIP 分支不同 [28， 29]，它们具有共同的祖先，引导值为 89%（图 5）。BIP1 和 MGG_08587 分支属于 bZIP TF 超家族，包括 FLB、AP1、HAPX 和 RSMA 分支，但不属于聚集 ZIF1、HAC1、ATF1、MEAB、CPC1、IDI4 和 METR 分支的超家族（图 5）。

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图 5. BIP1 在 Pezizomycotina 中定义了一个新的 bZIP TFs 分支。

来自 M 的 TF 的 bZIP 结构域的系统发育树。稻瘟科和5种选定的Pezizomycotina物种（MGG：Magnaporthe oryzae，NCU：Neurospora crassa;ANID：构巢曲霉，BC1G：灰霉病菌，SNOG：Parastagonospora nodorum，禾谷镰刀菌）。红色表示 BIP1 的分支及其直系同源物。使用 Interpro 基序 IPR004827 和超家族基序 SSF57959鉴定 bZIP TF。此外，BIP1 及其最接近的同源物 bZIP TF MGG_08587，以及它们通过 blastp 搜索和 Panther 基序PTHR11462鉴定的直系同源物被添加到该数据集中。从蛋白质序列中提取bZIP结构域序列，并与ClustaL omega（S1数据）比对。采用最大似然法和RxML构建系统发育树。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.g005

BIP1 在压迫中表达并位于细胞核中

定量RT-PCR（qRT-PCR）显示，BIP1在分生孢子和顶端中表达的水平与聚四氟乙烯分化的水平相同，而在无轴培养的菌丝体中仅显示低水平表达（图6A）。在受感染的大麦叶片中，早在接种后8小时就检测到BIP1（hai），并在17 hai时达到最大表达水平，这与雌雄成熟相吻合，早于寄主叶片穿透（图6B）。为了进一步研究 BIP1 的表达，在 BIP1 启动子及其 5' 和 3'UTR 序列的控制下，用携带 3 个 eGFP 拷贝的转录融合载体转化 Δbip1 突变体。采用荧光显微镜分析大麦叶片侵染不同阶段的真菌转化体。GFP荧光在成熟细胞中特异性检测，最大表达水平在15至48 hai之间，但在分生孢子、菌丝体和感染菌丝中均未检测到（图6C）。尽管通过qRT-PCR检测到BIP1 mRNA，但分生孢子中没有GFP荧光，这表明BIP1表达的转录后控制。这种控制可能涉及转化结构中存在的 BIP1、5'UTR 和 3'UTR 序列。为了监测 BIP1 蛋白的表达及其亚细胞定位，在 Δbip1 突变体中引入了在 BIP1 启动子及其 5' 和 3'UTR 的控制下携带 BIP1-3xeGFP 融合的翻译融合载体。共聚焦激光扫描显微镜在成熟顶端的细胞核中特异性地检测到GFP荧光，但在分生孢子、萌发菌丝和年轻顶端中均未检测到GFP荧光（图6D）。这些实验表明，BIP1 是一种具有核定位的 appressorium 特异性 TF，在细胞核迁移到 appressorium 后表达。

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图 6. BIP1 在 appressoria 中特异性表达。

（A） BIP1在不同M中的表达。水稻组织。使用qRT-PCR监测BIP1表达，提取的RNA来自P1.2野生型菌株Teflon分化的分生孢子（Co）、菌丝体（Myc）和24 h龄appressoria （App）。（B） 大麦叶片侵染过程中BIP1的表达。使用野生型分生孢子悬浮液滴接种后在不同时间点收集的受感染大麦叶片的 RNA，通过实时 RT-PCR 定量 BIP1 表达。数据相对于组成型表达基因 ILV5 进行归一化。每个数据点是三个生物学重复的平均值。标准偏差由误差线表示。（C） 感染期间压迫下 BIP1 的表达。将表达pBIP1：：3xeGFP转录融合构建体的Δbip1转化体接种在大麦叶片上。在20 hai下使用透射白光（左）或带有eGFP滤光片的荧光显微镜（右）分析成熟的appressoria。（D） BIP1在细胞核中的定位。将表达pBIP1：：BIP1-3xeGFP翻译融合的Δbip1转化子的分生孢子沉积在疏水性聚四氟乙烯膜上，形成24hai的压痕，用DAPI和calcofluor染色，并使用透射光（左）、eGFP荧光显微镜（中）和蓝色荧光显微镜（DAPI和calcofluor，右）进行观察。刻度 10 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.g006

BIP1 是顶膜中一组特定基因表达所必需的

为了鉴定 BIP1 调控的基因，使用 M 对在 Teflon 膜上分化的 WT 和 Δbip1 突变体进行了全基因组差异表达分析。Oryzae 寡核苷酸微阵列。该差异表达分析鉴定出 42 个基因在 Δbip1 中下调，但没有上调基因（表 1）。这些BIP1调控的基因根据其相应蛋白质的细胞功能分为7类（表1）。最大的一类收集了12个编码参与次级代谢（SM）的蛋白质的基因（表1）。其中，9个位于ACE1基因簇内（表1），这是一个57 kb的基因组区域，包含15个SM基因，包括编码杂交聚酮合酶/非核糖体肽合成酶（PKS-NRPS）的无毒基因ACE1[35,36]。 第二大类聚集了 11 个效应器，i。e.与已知蛋白质结构域没有同源性的小分泌蛋白（SSP），包括先前表征的生物营养效应子BAS2和BAS3，以及SLP2和AvrPi9效应子[37\u201240]（表1）。第三类由编码分泌酶的六个基因组成：2个α/β水解酶、1个角质酶、1个几丁质酶、1个阿魏酰酯酶和1个肽酶。阿魏酰酯酶MGG_03771的系统发育分析表明，该酶与A有关。构巢和 A.黑日尔阿魏酰酯酶FaeB（S9图）。在参与信号转导的Δbip1编码蛋白中，有5个基因下调，主要是G蛋白偶联受体（GPCR），对应于3种PTH11样蛋白（MGG_03584、MGG_06535、MGG_02160）和1种cAMP受体样蛋白（MGG_10544）[41]。总体而言，BIP1调控的基因分为两个功能组，一个可能作用于植物细胞（SSP、酶、次级代谢物），另一个参与雌性信号通路。

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表 1. 在聚四氟乙烯上分化的 Δbip1 appressoria 中下调的基因。

表达式比率经过 log2 转换。* ppressoria 和体外生长菌丝体的比较。Osés-Ruiz等人，2021年[42]比较了分生孢子和萌发分生孢子的RNA序列。NID：不在数据集中。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.t001

使用来自 Δbip1 的 RNA 和在 Teflon 上分化的野生型 appressoria 对来自 3 个功能类别的 8 个 BIP1 调节基因进行 qRT-PCR 实验。所有 8 个基因在 Δbip1 中下调至少 2 倍，其中 7 个下调超过 10 倍（表 1，qPCR1，Δbip1/wt）。与WT菌丝体相比，8个候选基因中有7个在WT中强烈上调（表1，qPCR2，Ap/My）。独立发表的appressorium RNAseq数据证实了这一结果[42]，该数据显示，93%的BIP1调控基因在成熟的野生型appressoria中上调（表1）。此外，还进行了qRT-PCR实验，以监测BIP1在植物侵染过程中对ACE1基因簇基因的调控。ACE1 （MGG_12447） 和 ACE1 基因簇中 9 个候选 BIP1 靶基因中的 7 个（表 1）在大麦感染早期 （24 hai） 的 Δbip1 中下调（S1 表）。只有两个基因，MGG_08386（BC2）和MGG_15928（CYP2）在Δbip1中的表达水平高于WT，这表明它们在聚四氟乙烯或植物叶片上分化的压附中受到不同的调节（表1和S1）。对水稻侵染初期15个BIP1调控基因（16 hai）表达的分析表明，其中6个基因的诱导被完全消除，另外5个基因被强烈下调（S2表）。

综上所述，我们的结果表明，BIP1 在压迫介导的渗透过程中协调一组特定的 40 个感染相关基因的表达。

BIP1 与 Δbip1 appressoria 中下调的基因启动子结合

对起始密码子上游 1 kb 处的启动子序列的分析显示，在 Δbip1 抑制下调的 40 个基因的启动子中，富集了与 GCN4 样结合基序相似的保守 TGACTC 序列。事实上，使用 MEME，在 36% 的 BIP1 调节基因中发现了该基序，在 M 的 12.593 个启动子中仅发现了 12%。oryzae（FIMO分析，p值10?6，[46]）。使用内部脚本搜索基序的更多退化版本，在所有 40 个基因的启动子中的一个或多个拷贝中鉴定出基序。

为了分析 BIP1 是否可以通过直接结合这些 GCN4 样结合基序来调节其靶基因，使用重组 BIP1 蛋白和放射性标记的 50 bp 寡核苷酸进行体外电泳迁移率位移测定 （EMSA），以来自六个随机选择的 BIP1 调节基因的启动子的 TGACTC 序列为中心（S3 表）。BIP1 与寡核苷酸结合，覆盖 ACE1 基因簇中 MGG_08380 （RAP2） 和 MGG_08381 （ORF3） 共享的双向启动子的两个基序（图 7A）。这种结合被过量的非标记探针所减少，并且分别被第一个或两个核心基序的突变强烈减少或消除（图7A和8A）。BIP1 还与以 MGG_02201 启动子（肽酶）的单个 GCN4 样结合基序为中心的探针结合（图 7A）结合。此外，BIP1 与覆盖 PTH11 样基因启动子的 GCN4 样基序的寡核苷酸结合MGG_03584，并MGG_06535（图 7A）。在所有情况下，BIP1结合都通过与未标记探针的竞争而减少。只有与编码 ACE1 基因簇的 BC2 TF 的 MGG_08386 的四个 TGACTC 基序相对应的寡核苷酸未结合 BIP1（S3 表）。总而言之，在用EMSA测试的五个启动子中，四个（MGG_02201;MGG_03584;MGG_06535;MGG_08380/ MGG_08381） 至少有一个与 BIP1 结合的 GCN4 样基序。寡核苷酸与BIP1在体外结合的序列比对突出了基序CATGACTC G，作为BIP1结合位点序列的可能延伸（图7B）。

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图 7. BIP1 与类似 GCN4 的 TGACTC 基序结合。

（A） 放射性标记的寡核苷酸探针以 MGG_08381/MGG08380 （ORF3/RAP2）、MGG_02201（肽酶）、MGG_03584（PTH11 样）、MGG_06535 （PTH11 样）基因的启动子的 TGACTC 基序为中心，在结合缓冲液（FP，游离探针）、BIP1 兔网织红细胞裂解物 （BIP1）、具有未标记探针的 BIP1 裂解物（摩尔比 1：2 或 1：10）或缺乏 BIP1 表达构建体的兔网织红细胞裂解物 （Lysate） 存在下孵育，然后进行非变性 PAGE。 对于 MGG_08381/MGG08380 （ORF3/RAP2），除了野生型寡核苷酸外，还测试了携带第一个或两个 GCN4 基序突变的寡核苷酸探针。突变寡核苷酸探针 pORF3-mut1 和 pORF3-mut2 以蓝色显示突变碱基。（B） EMSA 中 BIP1 结合的寡核苷酸在 TGACTC 核心序列上对齐并提交给 WebLogo 以定义 BIP1 结合的共识基序。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.g007

启动子中的 BIP1 结合位点MGG_08381是 appressorium 特异性表达所必需的

为了测试在BIP1调节基因的启动子中发现的TGACTCG结合位点的功能作用，我们从ACE1基因簇中选择了在appressoria中特异性表达的MGG_08381[36]。转基因M.构建了携带 eGFP 转录融合的 Oryzae 分离株，该分离株与 MGG_08381 的 378 bp 启动子的天然或突变版本融合。在突变启动子中，两个TGACTCG BIP1结合基序以及它们之间的六个核苷酸发生突变。携带这些突变的寡核苷酸探针未与EMSA中的BIP1结合（图8A）。具有原生MGG_08381的转化体。7启动子在大麦叶片穿透过程中在顶端显示出高GFP荧光（图8B），表明该启动子片段足以驱动顶端特异性表达。相反，携带突变型MGG_08381启动子的转化体在其顶端未显示eGFP荧光（图8B）。该结果表明，启动子的TGACTCG BIP1结合基序MGG_08381是顶端特异性表达所必需的。

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图 8. ORF3 启动子中的 BIP1 结合基序是其 appressorium 特异性表达所必需的。

（A） BIP1 与 ORF3 启动子片段的结合依赖于 GCN4 基序的存在。在结合缓冲液（FP，游离探针）、BIP1兔网织红细胞裂解物（BIP1）、具有未标记探针的BIP1裂解物（摩尔比为1：2或1：10摩尔比）或缺乏BIP1表达构建体（裂解物）的兔网织红细胞裂解物（Lysate）或缺乏BIP1表达构建体（裂解物）的兔网织红细胞裂解物（Lysate）存在下孵育含有两个GCN4样TGACTC MGG_08381基序的寡核苷酸探针（ORF3）（左图）或针对这些基序突变的探针和连接的6个核苷酸（右图）。（B） 转基因 M.将携带GFP报告基因的稻谷分离株接种在野生型ORF3启动子或缺乏两个BIP1结合基序的突变启动子的控制下，接种在大麦叶片上，并通过荧光显微镜分析20 Hai的成熟雌虫透射白光（上）和绿色荧光（下）。比例尺 = 10 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.g008

讨论

BIP1 是一种新型 M。oryzae bZIP 致病性所需的转录因子

在这项研究中，我们鉴定了 BIP1 （MGG_08118） 一种新型的 M bZIP TF。水稻参与真菌致病性。在以往对稻瘟病真菌bZIP TF的全基因组调查中，尚未检测到BIP1及其最接近的旁系同源物（paralog， MGG_08587）[28,29]。因此，它们从未被研究过，特别是在使用缺失突变体的功能分析中没有[28,29]。我们在 Pezizomycotina 中鉴定了 BIP1 和 BIP2 的直系同源物，并发现它们在子囊菌真菌的这个主要亚区中描绘了 bZIP TFs 的两个新分支（图 5）。

BIP1缺失突变体（Δbip1）在水稻和大麦叶片上是非致病性的（图1）。尽管它们将黑色素的压迫与正常的膨胀区分开来，但它们无法穿透完整或受伤的寄主叶片（图3，S2和S7）。这种表型不同于在雌膜成熟、膨胀生成或雌蕊粘附方面受损的突变体，后者不能穿透完整的叶子，但仍能感染受伤的叶子，例如黑色素生物合成缺陷的Δbuf1、cAMP信号传导缺陷的ΔcpkA和精胺合酶缺陷的Δsps1[47,48]。

米分枝杆菌突变体不能以Δbip1感染受害植物，其受PLS1、NOX2、MPS1或MST12等渗透钉形成所必需的基因影响[5,15,42,47,49]，或对在受感染植物细胞内建立原发感染菌丝至关重要[50]。 对 Δbip1 突变体进行的玻璃纸渗透测定表明，BIP1 不直接参与渗透钉的分化。相反，BIP1更有可能对于真菌在植物细胞内的早期建立至关重要。事实上，作为野生型，Δbip1突变体通过顶膜渗透到人造玻璃纸膜中，在那里它形成了球茎状假感染菌丝，生长在顶膜下的膜内（图4）。

在大多数其他 M.具有早期侵袭性感染生长缺陷的稻谷突变体，在被阻止之前在第一个感染细胞中形成原发感染菌丝（PIH）[51]。然而，一些突变体表现出与Δbip1相似的表型，其特征是不存在或存在非常短的PIH。第二种类型包括组蛋白脱乙酰酶TIG1、转录因子ATF1或铁代谢蛋白DES1的缺失突变体[50,52,53]。这三个突变体分化了几个短PIH，这些PIH在第一个感染的表皮细胞中迅速被阻断。这些突变体对H的敏感性增加202，未观察到 Δbip1。他们试图感染在第一个感染的细胞中触发强大的植物防御，包括增加的H202生产，可能是他们被捕的原因。在 Δatf1 和 Δdes1 的情况下，可以通过药理学抑制 ROS 的产生来恢复致病性，进一步支持非致病性表型主要是由于无法克服植物防御。一些 M.oryzae突变体表现出与Δbip1更相似的表型。例如，MPS1/SLT2信号通路中MIG1转录因子的缺失突变体不能在水稻和洋葱细胞内形成PIH，但与Δbip1一样可以穿透玻璃纸。此外，它还侵入了热杀灭的水稻和洋葱叶表皮细胞[54]。转录因子WOR1/GTI1的缺失突变体在水稻和洋葱细胞内形成非常短的PIH[55]。对其监管网络的初步表征表明，其与BIP1存在差异（见下文）。基于文献中的这些例子，我们得出结论，BIP1 对于早期侵袭性感染生长至关重要。这一假设可以在未来的研究中进一步检验，阐明其在第一个感染细胞内建立和/或克服植物防御中的作用。

其他 15 个具有缺陷突变表型的 bZIP TF 已在 M 中描述。oryzae（S4 表）。这些bZIP TF突变体中有7个显示出与胁迫反应，发育（主要是孢子形成）或特定生长条件相关的表型，但对植物没有致病性（S4表）。其中一些控制基本的细胞过程，如MobZIP12，它编码A的直系同源物。构巢MeaB，氮同化的调节剂[56]。如A。构巢，MobZIP12缺失突变体不能在含有亚硝酸盐或硝酸盐的合成培养基上生长。然而，它们仍然对水稻具有致病性。其他8个MobZIP TF缺失突变体的致病性发生了改变（S4表）。其中6例的致病性降低（-70%至-80%），并且在形态学、发育（孢子形成、有性生殖）和应激反应（渗透性、氧化性）方面都表现出额外的缺陷。该类的代表是bZIP13，与控制铁稳态的烟曲霉HapX同源[57]，bZIP7，性发育所需的禾谷镰刀菌ZIF1的直系同源物[58]，以及bZIP17，A的直系同源物。构巢AftA参与分生孢子氧化应激反应[59]。最后两个MobZIP缺失突变体（MobZIP21、MobZIP22）与Δbip1一样具有非致病性。删除 MobZIP21，N 的直系同源物。参与氧化应激反应的crassa AP1[60]导致突变体对氧化应激过敏，孢子形成和气生菌丝形成高度减少，分化黑色素压迫无法渗透到水稻叶片中[31]。从 N 中删除 MobZIP22，这是 CYS3 的直系同源物。crassa [61] 和 metR 来自 A.构巢[62]参与硫代谢的调节，导致蛋氨酸和半胱氨酸的突变体营养不良，尽管形成了黑色化的压迫，但无法穿透水稻叶片。外源蛋氨酸的加入挽救了Δbzip22的渗透缺陷。M描述了类似的表型。oryzae 蛋氨酸合酶突变体 Δmet6 [63]。Δbzip22 和 Δmet6 突变体都无法感染水稻叶片，因为它们无法在没有蛋氨酸供应的情况下在受感染的叶片上/在受感染的叶片上/中生长。事实上，这种氨基酸不能在水稻叶片的表面和质外体中自由获得。这些研究表明，MobZIP21 和 MobZIP22 分别参与控制氧化应激反应和蛋氨酸生物合成，这是感染所需的基本细胞过程。相反，Δbip1突变体除了缺乏致病性外，没有表现出任何其他有缺陷的表型，这表明BIP1控制感染特别需要的细胞功能。

BIP1 是发病机制相关基因在压迫中表达所必需的

对 appressorium 转录组的全基因组分析发现，与野生型相比，Δbip1 突变体中有 40 个基因下调。这些 BIP1 调节的基因中的大多数 （93%） 在成熟的野生型 appressoria 中过表达，如 BIP1 所观察到的（表 1）。这些 BIP1 调节基因的启动子共享一个 TGACTC GCN4/bZIP 样结合基序，该基序在体外与 BIP1 结合。该基序在MGG_08381启动子中的突变。5（来自 ACE1 簇的 ORF3）在体外消除了 BIP1 结合及其在外膜特异性表达（图 8）。总之，这些结果表明，在成熟的 appressoria 中，BIP1 通过与启动子中存在的 TGACTC 基序结合来激活一组独特基因的表达。该调节网络的特异性可能是由于 BIP1 表达仅限于顶端。

BIP1 调节的基因编码具有非常不同的细胞功能的蛋白质，i。e. 小分泌蛋白、参与次生代谢的酶、细胞壁降解酶或 GPCR。然而，这些蛋白质的一个共同特征是它们假定参与感染过程。来自 BIP1 网络的角质层和植物细胞壁降解酶包括角质酶、肽酶和阿魏酰酯酶。MGG_11966，角质酶在渗透过程中被特异性表达[64]，可能参与植物角质层在渗透介导的渗透过程中的降解。阿魏酰酯酶编码基因 MGG_03771 与 A 同源。由FaeB编码的黑日尔阿魏酰酯酶（S9图）。该酶通过酯化阿拉伯木聚糖释放酚类化合物以及破坏木聚糖之间以及木聚糖与木质素之间的二阿魏酸键，参与植物细胞壁的弱化[45]。因此，MGG_03771阿魏酰酯酶可以削弱植物细胞壁，促进真菌渗透到寄主叶片中。候选蛋白效应子（小分泌蛋白，表1）也可以通过靶向植物细胞过程在感染过程中发挥重要作用[19,20]。其中4种分别为BAS2、BAS3、AvrPi9和SLP2（分别为MGG_09693、MGG_11610、MGG_12655、MGG_03464、MGG_03468）在感染早期被特异性表达[37–40]。然而，它们的功能和植物靶标仍然未知，除了BAS3显示出植物细胞死亡抑制活性[40]。次级代谢物可能在感染过程中发挥重要作用[65]。BIP1控制参与其生物合成的基因的表达。它们大多属于ACE1基因簇[35]，参与可能的细胞松弛素衍生物的生物合成[66]，可能被水稻Pi33抗性基因识别[67]。我们的结果表明，BIP1对于ACE1簇基因的顶端特异性表达至关重要[44]。最后，BIP1调控的基因编码了五种信号蛋白（表1）。其中3个是PTH11 G蛋白偶联受体（GPCR）家族的成员[68,69]，1个是cAMP GPCR。这些GPCR的生物学作用尚不清楚。然而，它们可能参与压迫介导的渗透过程中宿主信号的感知以及侵袭性感染生长所需的信号通路的诱导。每个 BIP1 调节基因对致病性的贡献大多是未知的。ACE1/SYN2和效应子BAS2、BAS3、SLP2或AvrPi9的缺失不会导致致病性降低的突变体[36\u201239]。这些结果表明，单独BIP1调节的基因对感染并不重要。然而，它们共同履行的功能似乎对于压迫介导的渗透和侵入性感染生长至关重要。

BIP1调控网络与其他调控网络的比较

在 M 中，只有少数 appressorium 特异性调控网络被表征。米扎。定义最好的是由PMK1 MAP激酶信号通路激活的TF MST12和HOX7控制的无压特异性基因网络[42]。HOX7 控制胚管压迫的分化及其成熟，而 MST12 在穿透钉的形成过程中起作用。在Δmst12突变体[42]和BIP1调控基因中下调的基因之间存在有限的重叠（12个基因）。然而，在CHIP seq实验中鉴定的MST12的直接靶基因中均未检索到这些基因[42]，这表明MST12和BIP1控制着不同的顶端特异性基因集。

bZIP TF MoAP1（S4表中的MobZIP21）是感染和其他细胞过程（如抗氧化应激和发育）所必需的[31]。通过使用SAGE比较体外生长的野生型和突变型菌丝体的表达谱，研究了MoAP1控制的基因网络[31]。多达 1180 个基因差异表达，并进一步分析了下调最深的基因在感染中的作用（几丁质脱乙酰酶、C6 TF、漆酶、两种蛋白酶、琥珀酸脱氢酶 MoSSADH、乙酰转移酶 MoACT 和硫氧还蛋白 MoTRX2）。MoSSADH、MoACT 和 MoTRX2 的缺失突变体模仿了大多数 Δbzip21 表型，包括其抗氧化应激的缺陷和缺乏致病性。MobZIP21和BIP1调控网络基因的比较表明，它们没有重叠，表明这些调控网络控制着不同基因集的表达。

Zinc-Finger TF MoEITF1和bZIP TF MoEITF2（S4表中的MobZIP20）是感染所必需的[33]。它们的缺失突变体的致病性降低，并且在营养生长过程中不会表现出有缺陷的表型。两种 TF 仅在渗透前的成熟压迫中表达。对MoEITF1和MoEITF2缺失突变体中30个效应基因表达的分析显示，在感染早期，每个效应基因都正向调节一小部分效应基因的表达，包括无毒力蛋白AVR-Pik和AVR-Pizt以及效应子T1REP和T2REP [33]。MoEITF1 和 MoEITF2 缺失突变体中下调的效应子均不受 BIP1 调控。然而，由于没有对MoEITF1和MoEITF2缺失突变体进行全基因组基因表达分析，因此其网络与BIP1网络的比较有限。尽管如此，BIP1 调节的基因 BAS3 和 AVR-Pi9 仍在 MoEITF1 和 MoEITF2 缺失突变体中进行了表达测试。由于它们没有被下调[33]，我们可以假设MoEITF1和MoEITF2调控网络与BIP1网络不同。

对于前面提到的转录因子 WOR1，其突变体与 Δbip1 一样无法侵入第一个感染细胞，仅分析选定的基因在突变体中表达的改变。在 Δbip1 中下调的效应子 BAS2 在 Δwor1 中过表达。相反，效应子 BAS1、BAS4、AVR-Pita、Pwl2 和 MC69 在 Δbip1 中的表达没有改变，但在 WOR1 突变体中下调。 因此，我们假设BIP1和WOR1的调控网络是不同的。

结论

BIP1的发现，这在之前关于M的研究中一直被遗漏。oryzae bZIP TFs为植物侵染过程中真菌基因表达的控制提供了新的思路。BIP1 是表达一组对早期侵袭性感染生长至关重要的独特基因所必需的。这种新颖的 appressorium 特异性调控网络为理解感染早期阶段真菌基因表达的控制开辟了新的视角。我们发现BIP1通过与启动子中存在的GCN4 bZIP基序结合来控制其靶基因的表达，从而激活其转录。BIP1 的特异性似乎取决于其通过转录和转录后控制机制局限于成熟压迫的表达。在 M 中已经表征了特定于 appressorium 的其他调节网络。oryzae（例如MST12，MoEITF1，MoEITF2：[33,42]）。它们的靶基因与BIP1调控的基因不同，这表明这些网络作用于不同的基因和过程集。尽管如此，每个网络都不是专用于单一蜂窝功能的。事实上，在所有这些不同的网络中都发现了编码效应子的基因。这一观察结果表明，具有特定靶基因集的不同TF并行作用，以诱导在感染早期阶段观察到的大量转录变化。BIP1 因其在调节顶膜内一组特定早期入侵相关基因的表达方面的独特作用而脱颖而出。这种独特的功能使真菌，甚至在压膜介导的渗透之前就，能够适应植物的细胞环境并预测其防御反应。

材料与方法

真菌菌株和方法

本研究中使用的米分枝杆菌分离株P1.2由国际农艺发展合作中心（CIRAD）提供。真菌和性杂交的分离株、培养基组成、维持和转化已有报道[49,70]。 在大米培养基（米粉 2% [wt/vol]、0.2% [wt/vol] 酵母提取物、1.5% [wt/vol] 细菌琼脂）或完全培养基（CM;1% [wt/vol] 葡萄糖、0.2% [wt/vol] 蛋白胨、0.1% [wt/vol] 酵母提取物、0.1% [wt/vol] 酪蛋白氨基酸、0.1% 微量元素和 1X 硝酸盐、1.5% [wt/vol] 细菌琼脂）上培养菌株，并在 25°C 下，在 12 小时光照/黑暗循环下孵育 5 至 12 天。对于体外菌丝生长和孢子形成速率，所有菌株均在25°C的水稻培养基或CM培养基上生长。 菌株在至少三个独立的培养基平板上生长。生长 12 天后，收获分生孢子并使用 tecan 计数。为了观察应激下的营养菌丝生长，1mM H2O2， 0.003% SDS， 0.005% SDS， 400 μ g.mL-1calcofluor 和 600 μ g.mL-1将calcofluor单独加入CM琼脂培养基中。将每种菌株的年轻菌丝塞（直径 5 mm）接种在含有培养皿的琼脂培养基的中心，并通过测量生长 5、7 和 9 天后的培养直径来评估生长速率。

REMI插入诱变

根据限制性内切酶介导整合（REMI）程序[34,71]，使用1μg环状或线性化质粒pAN7.1[49]和0.25-10单位限制性内切酶BamHI、BglII、HindIII或Kpn，通过原生质体转化进行插入诱变I.用用于REMI转化的限制性内切酶消化pAN7.1，然后进行苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀，制备用于REMI转化的线性化质粒。

M763插入突变体的遗传特征

M763突变体的Southern印迹分析和M763与野生型菌株（M4）杂交后代的共分离分析表明，它含有单个线性化的pAN7.1质粒插入。通过质粒抢救回收一个 0.4 kb Nde I-SspI 基因组限制性片段，该片段位于插入的质粒和基因组 DNA 之间的一个连接处（图 2）的侧翼，并用于筛选 M。Oryzae 基因组 Cosmid 文库。鉴定出与该探针杂交的 6 kb Xho I-BglII 限制性片段并亚克隆用于互补分析（图 2）。90% 的 M763 转化体使用该限制性片段恢复了致病性，表明 M763 表型是由于该片段中存在的基因突变所致。一个M。使用 0.4 kb Nde I-SspI 探针筛选 oryzae cDNA 文库，得到 4 个 2 kb 的 cDNA，与 MGG_08118 具有相同的开放阅读框。

致病性测定、压迫分化、膨胀和渗透测定

如前所述，筛选REMI潮霉素耐药转化体的致病性丧失[49]。通过收获 10 至 14 日龄 M 的分生孢子来制备真菌接种物。无菌水中的米稻琼脂培养物。如前所述，对大麦（Hordeum vulgare L.）脱落或受伤的叶子进行滴接种，并对盆栽中生长的大麦和水稻（Oryza sativa）植物进行喷雾接种[49]。本研究使用了大麦品种 Express 和 Plaisant 以及水稻品种 Maratelli。如前所述，在用乳酚-棉蓝染色和表皮层剥落后，观察到米分枝杆菌在24、36、48和72 hai中分化和渗透到大麦表皮细胞中[35]。如前所述，对特氟龙膜进行了米分枝杆菌的分化和塌陷试验[49]。在16 hai时，在Teflon膜上观察到压裂，而在24 hai时，通过处理成熟appressoria，在10 min内以4% [wt/vol]、10% [wt/vol]和25% [wt/vol]处理成熟appress PEG8000 oria，评估塌陷率。通过沉积 5.10 的液滴进行渗透测定4conidia.mL-1分生孢子悬浮在完整的大麦叶或漂浮的水稻叶鞘上。使用倒置共聚焦显微镜（Objective 63X PLAN APO 1.4 Oil DIC）在48 hai处观察植物中的渗透测定。使用ETOH/Chloroforme（3：1）、乙酸（0.15%）固定真菌材料过夜，然后用0.002%的WGA Alexa 488荧光染一晚。在15 min内用0.01%的calcofluor对植物材料进行染色。通过沉积分生孢子液滴（5.104conidia.mL-1）在玻璃纸膜（NC2380，thermofisher）上含有10μM十六烷二醇，先前放置在3%（w / v）水 - 琼脂层的顶部。在通过微分干涉对比显微镜（Nikon Eclipse Ni）接种分生孢子悬浮液后48小时和72小时观察玻璃纸膜，并实现z-stacks。

核酸方法

M的制备。如前所述进行oryzae基因组DNA[72]。根据热酸苯酚法从聚四氟乙烯膜上分化的分生孢子或分生孢子中提取总RNA[73]。克隆、Southern和Northern杂交、PCR扩增、cosmid和cDNA文库筛选根据标准方案（[74]或制造商说明）进行。

BIP1克隆

对于质粒救援[75]，1μg来自M的基因组DNA。在 37°C 下用 20 μL 的 KpnI 消化 5 小时，然后进行苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀。将沉淀溶解在ddH中2O 并与 2 单位 T4 DNA 连接酶（Roche Diagnostics，Mannheim，Germany）一起孵育，总体积为 500 μL。在 16°C 下孵育 12 小时后，用乙醇沉淀 DNA 并溶解在 5 μL ddH 中2O.大肠杆菌菌株DH10B的感受态细胞通过用2μL连接产物电穿孔转化。以获救的11 kb质粒的0.4 kb Nde I-SspI基因组限制性片段为探针，筛选M基因组cosmid文库。Oryzae 后代 96/0/76 [76]。将一个与探针杂交的 6 kb Xho I-BglII cosmid 亚克隆引入质粒 pCB1265 [77] 中，得到 pCM763，随后用于互补分析。选择M763与pCM763的转化体在为该可选择标记物定义的复合培养基上具有磷膦虫素耐药性[77]，并含有35 mg/L的Bialaphos。使用相同的 0.4 kb Nde I-SspI 基因组探针筛选由 M 中提取的 RNA 制成的 cDNA 文库。在液体完全培养基中生长的水稻菌丝体培养物[49]。

5' 人种

通过扫描使用 GeneRacer 试剂盒 （Invitrogen） 获得的 5' RACE 产物序列和来自 M 分生孢子或压生孢子的 RNA 来确定 BIP1 的转录起始位点。oryzae 隔离 P1.2 作为模板。使用基因特异性 RACE1 引物（BIP1 基因的外显子 3，S5 表）进行逆转录。反向引物 RACE2（BIP1 的外显子 2）和试剂盒随附的 RNA 引物用于 cDNA 的 PCR 扩增。将5' RACE产物克隆到pCR-4Blunt-TOPO中。

通过靶向基因替换删除 BIP1

以P1.2基因组DNA为模板，Pfu turbo聚合酶（Stratagene，La Jolla，CA）和引物对KO1/KO2-Sfi Ia和KO3-Sfi Ib/KO4（S1图和S5表），通过PCR扩增获得BIP1侧翼的上游（LB-BIP1;1.2 kb）和下游（RB-BIP1;1.36 kb）区域。引物 KO2-Sfi Ia 和 KO3-Sfi Ib 具有不对称的 Sfi Ia 或 SfiIb 限制位点。所得扩增产物用SfiI（2h，50°C）消化。同时，通过用 SfiI 消化质粒 pFV8（拜耳作物科学的 F. Villalba 博士赠送的礼物）获得由构巢曲霉菌 TrpC 启动子驱动的 1.4 kb 潮霉素抗性盒 （hph）。使用 T4 DNA 连接酶连接三个不对称限制性片段以组装 3.7 kb pRBIP1 缺失盒，将其克隆到 pCR-4Blunt-TOPO （Invitrogen， Carlsbad， CA） 中。使用 KO5 和 KO6 引物以及 Pfu turbo 聚合酶通过 PCR 扩增缺失盒。使用 3 μg 缺失盒进行 P1.2 原生质体的转化。

BIP1转录和翻译融合表达载体

对于 BIP1 启动子 （1345 bp） 与 3xeGFP 的转录融合，在用 EcoRI 消化 pCM763 后纯化含有 BIP1 启动子 （946 bp） 和 BIP1 ORF 的限制性片段，并引入质粒 pUC19（登录号：L09137）中，得到 pUC19-pBIP1-BIP1 ORF。 BIP1ORF 通过用 NcoI 和 NaeI 消化从 pUC19-pBIP1-BIP1 ORF 中去除。用含有3xeGFP的限制性片段代替，该片段通过用相同的酶消化质粒pUMA647[78]获得，得到pUC19-p BIP1-3xeGFP。用 EcoRI 消化 pUC19-p BIP1-3xeGFP 后纯化 pBIP1-3xeGFP 限制性片段，然后重新引入 EcoRI 初始限制后剩余的 pCM763 载体骨架中。所得质粒被命名为pCB1265-p BIP1-3xeGFP。对于翻译融合，在 BIP1 启动子和终止子的控制下，将 3xeGFP 融合到 BIP1 的 C 末端 （BIP1：：3xeGFP 融合）。通过用 NcoI 和 NaeI 消化从 pUMA647 中释放出含有 3xeGFP 的限制性片段。使用 End-It DNA 末端修复试剂盒（EPICENTRE Biotechnologies，麦迪逊，威斯康星州，美国）钝化其 NcoI 粘性末端。用NaeI限制后，将所得片段引入pUC19-pBIP1-BIP1 ORF中，得到pUC19-pBIP1-BIP1 ORF-3xeGFP。用EcoRI消化该质粒，并将pBIP1-BIP1 ORF-3xeGFP限制性片段重新引入pCM763载体骨架中，得到质粒pCB1265-p BIP1-BIP1 ORF-3xeGFP。使用 3 μg pCB1265-p BIP1-3xeGFP 或 pCB1265-p BIP1-BIP1 ORF-3xeGFP 质粒对突变体 Δbip1 原生质体进行转化，先前由 ScaI 线性化。

M. 的表型测定。米扎GFP转化体

使用感染分生孢子悬浮液液滴的分离大麦叶（栽培品种Plaisant）进行观察。使用配备 488/DM510-550 滤光片的蔡司落射荧光显微镜监测 20-24 hai 的 eGFP 荧光。使用0.8 μ的4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，32 670，Fluka）对细胞核进行染色 g.mL-1.用 10 μg/mL Calcofluor-white （Sigma-Aldrich） 对真菌细胞壁组分进行染色。使用配备 30 mW 氩激光器、X63 平场复消色差油浸物镜和蔡司滤光片组 09（GFP 的 450 至 490 nm 带通激发和 515 nm 长通发射）和 01（365/12 nm 带通激发滤光片和 397 nm 长通透光片）在特氟龙膜或大麦表皮上观察 BIP1-3xeGFP 融合蛋白的亚细胞定位Calcofluor和DAPI的发射）。

DNA微阵列分析

使用 Agilent M 进行微阵列分析。Oryzae 寡核苷酸微阵列（第 1 版）平台。按照 Ambion 方案中的指示，使用 2 μg 总 RNA 用 MessageAmp aRNA 扩增试剂盒 （Ambion->Agilent） 和 Cy3 或 Cy5 单反应染料 （Amersham） 生成荧光标记的 aRNA 探针。使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计 （NanoDrop Technologies） 定量所有 RNA，并在扩增前后使用 Agilent 2100 BioAnalyzer 进行定性测定。杂交按照安捷伦的描述进行。对于三个生物学重复中的每一个，都进行了两次技术重复，每个重复包括两张载玻片。为了解释由于两种染料之间的差异而引起的变化，每个菌株特异性探针的标记染料在每个技术对的一张载玻片上交换。使用 Affymetrix 428 扫描仪扫描杂交载玻片，并使用 GenePix 4.0 （Axon） 分析所得图像。将原始表达数据导入 GeneSpring 7.3 （Agilent） 并进行 Lowess 归一化，使用 20% 的数据拟合对数强度与对数比图中每个点的 Lowess 曲线。表达比临界值分别为2.0和0.6，分别用于选择上调和下调的基因。Axon Genepix 软件生成的原始数据也使用 GeneData Expressionist Refiner and Analyst 软件包进行分析。将 3 个生物重复的数据导入 GeneData Expressionist Refineer，并提交贝叶斯背景减法，背景标准差设置为 1，衰减率为 1000。这种方法允许在避免负信号的同时减去背景。背景减去数据使用 10% 的数据进行 LOWESS 归一化以拟合平滑曲线。归一化数据已导入 GeneData Expressionist Analyst。对于每个芯片，控制通道和信号通道保持独立，为每个基因生成 24 个独立的数据点（12 个野生型和 12 个突变型）。对整个数据集应用了额外的中位数归一化，以解释载玻片之间的差异。采用N-way ANOVA法确定突变对基因表达的影响。计算每个基因的 p 值，表示基因表达受突变影响的显着性。将此 p 值设置为 10?9与WT相比，突变体中产生了59个下调基因。方差分析鉴定的 59 个基因与 Genespring 分析的 81 个基因的交集产生了 42 个基因的基因列表，这些基因具有高度的置信度，即由于 BIP1 突变而下调（表 1）。微阵列数据已提交给NCBI，加入号为。GSE18823。

生物信息学分析

通过使用以下数据库基序（cd14688、IPR004827、SSF57959、PTHR11462）检测具有 bZIP 结构域的蛋白质的存在，在 Ensembl 真菌的 6 个子囊菌基因组（Magnaporthe oryzae、Neurospora crassa、Fusarium graminearum、灰霉菌、构巢曲霉、结节灰霉菌）中鉴定出 bZIP 转录因子。使用 Clustal Omega（S1 数据）对这 6 种子囊菌中编码所有 bZIP 结构域的氨基酸序列进行比对。该比对使用Jalview进行可视化，并用于构建系统发育树。使用NGPhylogeny通过基于最大似然的系统发育树推断和智能模型选择进行系统发育分析。使用下平-长谷川相似似然比检验（SH样aLRT）测量分支。将树根根到中点，并使用交互式生命树 （iTol） 工具进行可视化。使用Weeder算法v 1.3对潜在保守顺式调节元件的启动子序列进行分析[79]。Shuffleseq算法用于启动子序列的随机化。基于文库的CLOVER算法[80]用于鉴定BIP1靶基因启动子中的TGACTC核心基序。WebLogo（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）算法用于突出显示BIP1结合位点的共识序列。

qRT-PCR实验

从大麦品种 Plaisant 或水稻品种 Sariceltik 的分离叶中提取 RNA，分别接种分离株 P1.2 或 Δbip1 突变体 24 hai 和 17 hai 的分生孢子液滴。每个处理收获三个独立的重复样品，并分别提取RNA。使用无DNA（Ambion）去除基因组DNA。根据制造商的说明，使用 ThermoScript RT-PCR 系统 （Invitrogen） 逆转录 5 μg 总 RNA。将所得cDNA稀释10倍进行分析。使用Light Cycler 1.2 （Roche Diagnostics）使用LightCycler Faststart DNA Master SYBR Green I试剂盒（Roche Diagnostics）进行实时荧光定量PCR。用于qPCR的引物列于S5表中。如前所述，组成型表达的EF1-α和ILV5基因用于归一化[36]。使用2-ΔΔCt= 2（Ctgene X突变体–Ctgene ref突变体）–（Ctgene X野生型–Ctgene ref野生型）方法[81]。

DNA 结合检测

根据制造商的方案，使用 TnT 快速偶联转录/翻译系统 （Promega） 在体外生成重组 BIP1 蛋白。使用引物 BIP1-RL5 和 BIP1-RL-Strep2 从 p763c1 扩增 T7 表达构建体，凝胶纯化并直接用于体外转录/翻译反应。通过变性（95°C，10 min）和退火（室温，30 min）等摩尔互补的单链寡核苷酸来构建双链寡核苷酸探针，最终浓度为6 pmol/μL。探针 （3 pmol）（S3 表）使用 T4 多核苷酸激酶 （NEB） 和 γ32P-ATP，并通过凝胶过滤（DTR 柱，Edge Biosystems）纯化。结合反应包括 2.5 μL 结合缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5、250 mM NaCl、2.5 mM 二硫苏糖醇、2.5 mM EDTA、5 mM MgCl2，20%甘油v/v），2.5μL 1μg/μL聚dI-C，2.0μL标记探针，2.5μL BIP1或对照网织红细胞裂解物，9μldH 2 O）在室温下孵育20分钟，然后在冰上孵育15分钟，然后加入5μL上样缓冲液并上样在6%非变性丙烯酰胺凝胶上。

MGG_08381。7 转录融合表达载体

MGG_08381。7个终止子（1589bp）用引物扩增TERMMGG_08381。7NotI+ 和TERMMGG_08381。7EcoRI-使用Pfu Turbo聚合酶（S5表）。将由NotI和EcoRI消化的PCR产物引入质粒pCB1635中，pCB1635携带草铵膦抗性标记物[77]，从而产生质粒pCB1635-MGG_08381.5。野生型MGG_08381。金斯瑞公司（美国皮斯卡特韦）合成了7个启动子（ATG上游378bp）和一个推定BIP1结合位点（tcgagtcatgctcctagtcatg）被修饰的突变版本（ttggcgtaaccctgtagccatt）。在每个启动子的 5' 端插入一个 NotI 限制位点，在 ATG 处插入一个 NcoI 位点。在pUC57质粒中克隆合成的启动子（登录号：Y14837）。通过对质粒promACE1：eGFP进行Nco I和SnaBI酶切获得报告基因GFP[44]，并将所得的1484 bp限制性片段插入NcoI和SmaI消化的pUC57-MGG_08381.7（p）和pUC57-MGG_08381.7（p-mut）中MGG_08381。通过Not I酶切检索到与GFP融合的7个启动子（天然和突变），并在先前由NotI线性化的pCB16335-MGG_08381.7（术语）中引入。所得质粒分别命名为pMGG_08381.7（p）-报告基因和pMGG_08381.7（p-mut）-报告基因。

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BIP1 的基因替代。

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S1 图。 BIP1 的基因替代。

上午。用于构建基因替换载体的 oryzae BIP1 位点区域。使用 P1.2 基因组 DNA 和引物扩增 BIP1 ORF 两侧的 1.2 kb 和 1.36 kb 基因组区域（分别为左边框和右边框灰色框）（S5 表）。BIP1 的四个外显子显示为由内含子隔开的黑匣子。B.Δbip1突变体中BIP1位点的结构。阴影盒对应于潮霉素抗性盒。灰色框表示用于构建基因替代载体的BIP1 ORF两侧的左右边界序列。C.通过Southern印迹分析转化体。用 HindIII 消化基因组 DNA，并用 1.36 kb RB 片段（顶部）和 0.85 kb hph 盒（底部）进行探测。泳道 1、2 和 3，Δbip1 转化子;泳道 4，百搭型 （P1.2）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s001

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S2 图。 不同PEG8000浓度下菌株P1.2、Δbip1和Δbip1：：BIP1的分化和塌陷率。

A.在16 hai处在聚四氟乙烯膜上观察到压迫的分化。误差线表示标准偏差。B.在聚四氟乙烯膜上形成的压裂被评估为24海，PEG8000分别为4%、10%和25%。对每个三个不同的重复样品进行树独立实验。3种菌株的塌陷率差异无统计学意义（方差分析：F = 0.50，P = 0.74，Df = 4）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s002

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S3 图。 菌株P1.2、Δbip1和Δbip1：：BIP1的分生孢子率。

分生孢子率 （conidia.mL-1）在水稻培养基培养 12 天后。Δbip1 和野生型 P1.2 之间的孢子形成率没有显著差异（t 测试第 5 天，p = 0.84）或 Δbip1 和 Δbip1：：BIP1 补补菌株之间的孢子形成率没有显着差异（t 测试第 5 天，p = 0.87）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s003

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S4 图。 菌株 P1.2、Δbip1 和 Δbip1：：BIP1 的菌丝生长。

A.P1.2，Δbip1和Δbip1：：BIP1的五日龄水稻培养基培养物。B.5,7和9日龄水稻培养基培养物的菌丝生长直径（cm）。Δbip1 和野生型 P1.2 之间（t 检验第 5 天，p = 1）或 Δbip1 和 Δbip1：：BIP1 补补菌株（t 检验第 5 天，p = 1）之间没有观察到显着差异。B显示了三个独立实验的结果，每个实验都使用三个不同的重复样品进行。误差线是标准差。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s004

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S5 图。 P1.2 （WT）、Δbip1、Δbip1：：BIP1菌株的应激敏感性。

P1.2、Δbip1、Δbip1：：BIP1菌株在CM培养基上培养，不含或含有应激剂（细胞壁完整性应激源：0.003或0.005%SDS（A，B），200或400μ g.mL -1钙氟（C，D）;氧化应激诱导剂：1mM H2O2（英，女）.接种细胞壁应激（SDS、calcofluor）后 5 天和接种氧化应激后 7 天测量菌株的菌落直径 （H2O2).生长抑制用以下公式计算（抑制率=（未处理菌株的直径—处理菌株的直径）/（未处理菌株的直径）×100%）。进行三次独立重复，每次重复三次样品（B、D、F）。误差线是标准差。Δbip1 和 P1.2 以及 Δbip1：：BIP1 之间没有观察到显着差异（T 检验 p 值> 0.05）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s005

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S6 图。 使用共聚焦显微镜 （63X） 观察菌株 P1.2 和 Δbip1 在 48 hai 处的压抑介导的渗透。

在感染Δbip1突变体的水稻鞘表皮细胞中未观察到感染菌丝，而感染P1.2的水稻鞘表皮细胞中充满了渗透事件引起的感染菌丝。用 488 nm 光激发 WGA-Alexa488 染色的真菌细胞的荧光，并以绿色显示。Ap：分生孢子，Co：分生孢子，IH：侵袭性菌丝，大小bar = 10μm。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s006

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S7 图。 大麦叶片中菌株P1.2、Δbip1和Δbip1：：BIP1的致病性测定。

分生孢子悬浮液液滴（5.104conidia.mL-1）沉积在分离的完整或受伤的大麦叶或分离的受伤水稻叶上。照片拍摄了 5 代。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s007

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S8 图。 BIP1 的 bZIP 域。

A. 来自 BIP1 的 bZIP 域、来自 N 的 BIP1 直系同源物的对齐。克拉萨 （NcBIP1， NCU03847）， F.禾谷 （FgBIP1， FGRAMPH1_01G06311）， B.cinerea （BcBIP1， Bcin09g05210）， A.构巢（AnBIP1，ANIA_00825）和P。诺多鲁姆（SNOG_11592）。酿酒酵母 Gcn4 （ScGCN4， YEL009C） 和 S.酿酒酵母加入Yap1（ScYAP1，YML007W）TFs进行比较。从蛋白质序列中提取bZIP结构域，并使用Clustal omega进行比对。100% 相同的氨基酸以黑色突出显示。90-80% 的相似氨基酸以深灰色突出显示。70-60% 的相似氨基酸以浅灰色突出显示。NLS：使用隐马尔可夫模型预测核定位信号，用于核定位信号预测。B.使用CDD数据库（bZIP-YAP，CD14688结构域）在BIP1蛋白中鉴定的功能域，并使用YAP1真菌TFs（A）进行先前分析。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s008

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S9 图。 M.的系统发育分析。Oryzae 阿魏酰酯酶 MGG_03771.

编码阿魏酰酯酶或单宁酶的选定真菌序列的最小进化树。以黑曲霉FaeA和2个直系同源序列为外群。比例尺显示相当于每个位点 0.5 个氨基酸替换的距离。引导值（1000 个引导）显示在节点上。生化表征的蛋白质以粗体显示。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s009

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S1 表。 ACE1 在大麦侵染期间 Δbip1 的簇状表达 24 hai.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s010

（PDF格式）

S2 表。 水稻感染初期 15 个 BIP1 调节基因的表达 （16hpi）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s011

（PDF格式）

S3 表。 BIP1与用于EMSA的靶启动子结合的总结。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s012

（PDF格式）

S4 表。 M中bZIP转录因子的总结。

米扎。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s013

（PDF格式）

S5 表。 本研究中使用的引物。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s014

（PDF格式）

S1 数据。 用于生成图4（Fasta格式）的bZIP结构域序列的比对。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011945.s015

（法斯塔）

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