免费医学论文发表-信号转导调节肠道再生，保护害虫免受苏云金芽孢杆菌产生的成孔毒素的侵害

抽象

各种协调的宿主细胞反应被激活，作为对成孔毒素 （PFT） 的防御机制。苏云金芽孢杆菌（Bt）是一种世界通用的生物农药，其功效和精确的应用方法限制了其在农业环境中替代合成农药的使用。本文分析了两种鳞翅目害虫在亚致死剂量Bt肺功能检测中毒后的肠道防御机制，以寻找潜在的功能基因。我们发现幼虫肠上皮最初被 PFT 破坏，并且在肠上皮再生后观察到幼虫存活。进一步分析表明，Cry9A 蛋白引起的肠道再生通过 c-Jun NH （2） 末端激酶 （JNK） 和 Janus 酪氨酸激酶/信号转导和转录激活因子 （JAK/STAT） 信号通路进行调控。JAK/STAT信号转导通过肠道干细胞的增殖和分化来调节肠道再生，以防御三种不同的Bt蛋白，包括抑制小菜蛾和草地贪夜蛾的三种不同的Bt蛋白。因此，基于Stat双链RNA（dsRNA）-纳米颗粒和Bt菌株的组合，设计了一种纳米生物农药来提高农药效。该配方控制了害虫，效果更好，表明其潜在用途是减少农业环境中合成农药的使用，以控制害虫。

作者摘要

苏云金芽孢杆菌（Bt）是通过微生物杀虫剂和转基因作物控制害虫的最成功细菌。它的杀虫蛋白在中肠上形成孔隙，导致目标幼虫死亡。然而，在此过程中，目标害虫的防御反应仍不清楚。在这里，我们发现幼虫在被亚致死剂量的Bt毒素中毒后会经历重塑。在重塑过程中，上皮细胞被毒素破坏后，诱导了JNK和JAK/STAT信号转导调控的肠道再生。令人惊讶的是，这种调节与EGFR通路和通常在果蝇防御反应中起作用的未配对基因无关。最后，基于研究结果，设计了dsRNA-纳米颗粒和Bt细菌菌株的混合物，以提高杀虫效果。

数字

Fig 7图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7图1图2图3

引文： Wang Z， Yang Y， Li S， 马 W， Wang K， Soberón M， et al. （2024） JAK/STAT信号调节肠道再生保护害虫免受苏云金芽孢杆菌产生的成孔毒素的侵害。PLoS 病理学 20（1）： e1011823 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011823

编辑 器： Raffi V. Aroian，马萨诸塞大学陈：美国马萨诸塞大学医学院

收到： 2023年5月26日;接受： 2023年11月13日;发表： 1月 18， 2024

版权所有： ? 2024 Wang et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 作者声明，在Dryad数据集（doi：10.5061/dryad.v15dv422z）上发表时，我们无限制地公开了复制我们研究结果所需的所有数据。

资金： 这项工作由国家自然科学基金（32001970 to ZW）资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。

介绍

合成杀虫剂是保护作物免受不同害虫侵害的有用工具。然而，它们的非标准使用和滥用导致农药残留增加，这些残留残留物残留在食物、植物和土壤中，也出现在加工商品和食物链中，对人类健康和生态系统平衡造成严重威胁[1\u20123]。此外，一些害虫已经进化出对合成杀虫剂的抗性[4]。在害虫防治中减少合成杀虫剂的最有希望的替代方案之一是使用基于革兰氏阳性细菌苏云金芽孢杆菌（Bt）的微生物生物杀虫剂。Bt以产生不同的杀虫成孔毒素（PFT）而闻名，例如攻击幼虫中肠细胞的Cry和Vip毒素[5]。自 1960 年代以来，这些蛋白质已被广泛用于农业害虫和人类疾病昆虫媒介的生物防治，并且来自Bt的某些毒素基因已被引入抵抗昆虫攻击的转基因作物中 [6]。Bt细菌产生单体PFT，这些PFT在与特异性受体结合后寡聚化，并组装成跨膜孔，透化中肠细胞并促进细菌感染[7]。PFTs的孔隙形成触发了多种协调的宿主-细胞反应作为防御机制[8,9]。双链RNA（dsRNA）农药是另一种安全、绿色、高效的新兴策略，通过靶向昆虫或微生物害虫的必需基因来控制害虫或植物病害[10,11]。 因此，需要基于Bt和/或dsRNA技术的高效配方来减少合成农药在害虫防治中的使用。Bt的毒性取决于昆虫宿主触发的剂量和防御反应。因此，减少幼虫肠道防御反应应增强Bt肺功能检测的毒性。

昆虫幼虫中肠上皮由两种主要的分化细胞类型组成：吸收性肠细胞（EC，也称为柱状细胞）和分泌性肠内分泌细胞（EE，也称为杯状细胞）[12\u201214]。当EC受到肠道感染等不同应激时，它们会通过不同的机制消除，例如肠细胞清除[15]、细胞脱落[16]或细胞凋亡[17]的调节反应。此外，肠道干细胞 （ISC） 在中肠稳态中起着重要作用，因为压力会诱导其细胞更新，确保组织在生物体的整个生命周期中的完整性和功能。受损和异常细胞的替代由ISC进行，其增殖和分化受到严格控制和协调，可防止器官变性和昆虫死亡[18\u201220]。

Janus酪氨酸激酶/信号转导和转录信号通路激活因子（JAK/STAT）已成为果蝇中肠再生的主要调节因子[21\u201225]。JAK酪氨酸磷酸化的主要底物是STAT，它能够与特定的DNA序列结合以激活转录。JAK/STAT通路的配体，如细胞因子-不配对的Upd2和Upd3，在应激或受损的EC和EE中被转录诱导，促进ISC的分裂[21,26]。 此外，研究表明，STAT信号转导也促进了EC和EE的分化，并且是EC和EE分化所必需的[22,27]。 然而，目前尚不清楚该功能是否需要Upd配体[25]。在果蝇中，除了JAK/STAT信号通路外，ISC还通过c-Jun NH（2）末端激酶（JNK）在应激上皮细胞中被激活，以促进其作为干细胞的增殖[27]。JNK 信号转导影响 ISC 和分化的 EC。在EC中，JNK通过触发受损EC细胞凋亡和代偿性ISC增殖来赋予应激耐受性并促进上皮转换[27,28]。 JNK信号转导的下游效应诱导EC中的Upd3表达，介导相邻ISC中JAK/STAT依赖性增殖[20,29]。 受损EC中的JNK激活也可以杀死这些细胞，从而增强中肠转换[28,30]。ISC中的JNK激活可能具有不同的功能，例如激活应激反应基因、防止氧化损伤[21]、刺激增殖[21,31]以及通过诱导Delta表达和/或促进ISC对称分裂来改变ISC分化[31–33]。除此之外，对果蝇的早期研究揭示了Delta/Notch信号转导在指导ISC后代分化中的核心作用[12,34–36]。Delta 从 ISC 中募集的肠母细胞 （EB） 中的高水平 Notch，促进 EB 分化为 EC;低水平Notch限制了ISC的细胞周期[29]。然而，这些途径在鳞翅目幼虫（不同作物的主要害虫）中导致中肠细胞中毒后导致中肠细胞再生的潜在参与尚未得到分析。

在这项工作中，我们发现 JNK/JAK/STAT 参与调节鳞翅目幼虫中 Bt PFT 孔形成触发的中肠再生。此外，我们发现，RNAi沉默JAK/STAT通路会增加两种不同鳞翅目物种中不同PFT的毒性。基于这些发现，开发了一种新型高效的Bt和dsStat纳米农药混合物，用于防治条纹茎螟和草地贪夜蛾幼虫。这种配制Bt菌株和抑制昆虫防御反应的dsRNA的新策略可用于有效控制某些对Bt不敏感的作物害虫。

结果

成孔毒素诱导的昆虫幼虫中肠组织重塑

此前有报道称，果蝇幼虫暴露于亚致死剂量的PFT后，由于EC顶端细胞质挤压到中肠腔（包括线粒体等一些细胞器）中肠，观察到中肠变薄，随后在毒素损伤数小时后中肠组织恢复到正常厚度[15]。在这里，2 日龄和 3 天的死亡率RD型分析了水稻害虫、条纹茎螟（Chilo suppressalis）的幼虫，在摄入亚致死剂量的BtCry9Aa毒素后（图1A和1B）。当亚致死剂量的Cry9Aa毒素（每克饮食200μg）相当于杀死20%幼虫的剂量（致死浓度值=LC20）用于喂养 3RD型幼虫，观察到中肠组织形态发生重要变化。从完整中肠组织的正中矢状面视图获得的激光扫描共聚焦显微镜 （LSCM） 图像的分析显示，摄入毒素 24 小时后（图 1C）。观察到中肠组织厚度显着减少 20% （p<0.0001），并且持续减少（最多减少 30%，p<0.0001），直到喂养后 48 小时（图 1D）。然而，在摄入毒素96小时后，肠道恢复到正常水平（图1C和1D）。当Cry9Aa浓度降低10倍时，观察到类似的趋势，具有中等水平的组织重塑，对应于杀死2%幼虫的剂量（LC2）测定（每克饮食20μg）（图1C和1D），表明PFT诱导的中肠组织重塑取决于毒素浓度。作为阴性对照，与Cry9Aa毒素相比，无毒的Cry9Aa-D125R突变体（S1表）不影响条纹茎螟幼虫的肠上皮（图1C和1D）。

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图 1. Cry9Aa成孔毒素诱导昆虫幼虫肠道重塑。

（A 和 B）Cry9Aa 对 2 日龄 （A） 或 3 的杀虫毒性试验RD型龄（B）水稻条纹茎螟幼虫。对35只幼虫进行每种毒素浓度的分析，并进行3次重复。误差条表示±SEM。 （C）矢状视图，从LSCM中观察到的用Cry9Aa处理的水稻条纹茎螟幼虫的中肠组织获得的代表性图像。鬼笔环肽-647（红色）染色存在于刷状边缘（上箭头）和内脏肌肉（下箭头）中的F-肌动蛋白。Hoechst33342（蓝色）标记细胞核。对照（Ctrl）样品用50 mM Na处理2一氧化碳3缓冲液 pH 10，即用于溶解 Cry9Aa 蛋白的缓冲液。（D 和 E）用对应于LC的亚致死剂量的Cry9Aa毒素（每g饮食200μg）处理后获得的肠厚度（D）和细胞数（E）的荧光信号的定量20（Cry9Aa-200）和Cry9Aa毒素（每克饮食20μg）对应于LC2（哭泣9Aa-20）。无毒素处理的幼虫肠道测量为100%。n = 每次治疗 36 张图像。 P 值通过双侧 Student t 检验计算，P<0.0001 显示差异具有统计学意义。误差线表示±SEM。 （F） 分析用 Cry9Aa 处理的幼虫向中肠腔释放的对硝基蒴内酰胺。对照 （Ctrl） 样品用 Cry9Aa-D125R 突变蛋白处理。n = 从 3 个中分离出的 15 个中肠组织RD型每次处理的龄幼虫。在三个独立实验中进行了三个生物重复样品。 P 值通过双侧 Student's t 检验计算，P<0.001 显示差异有统计学意义。P>0.05 无显著差异。误差条表示±SEM。 （G） Cry9Aa （LC 后 15 只幼虫中肠组织样品中磷酸化组蛋白 H3 （PH3） 和组蛋白 H3 （H3） 的蛋白质印迹检测20）中毒0-96小时，β-肌动蛋白被检测为内参。（H） 通过 RT-qPCR 测定的 delta 基因表达在用 Cry9Aa 处理的 15 只幼虫（LC20） 0、12、24、48、72、96 和 120 小时。将数据归一化为未感染的对照肠，并将伸长因子-1（EF-1）基因作为参考基因，用于在3个独立实验中进行的3个生物重复样品。误差线表示 ±SEM。

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此外，在摄入毒素24小时后，在该组织中发现的细胞总数显着减少，其中在48小时后观察到最低水平（p<0.0001），然后在96小时时细胞数量恢复（图1E）。在无毒的 Cry9Aa-D125R 突变体中未观察到这种效应，而当 LC2使用浓度的Cry9Aa，显示总细胞数损失较低，回收率较快（图1E）。这些数据表明，细胞损失还取决于PFT的活性和浓度。

为了进一步分析肠道厚度和细胞数量的减少，测定了GPI锚定氨基肽酶N（APN）在幼虫肠腔中的酶活性。APN蛋白在中肠细胞的顶膜中含量很高，据报道，其在中肠腔内的酶活性是细胞脱落的标志物[37]。APN酶活性表明，摄入Cry9Aa24小时后观察到细胞脱落（p<0.0001）（图1F）。在这些测定中用作阴性对照 （Ctrl） 的无毒 Cry9Aa-D125R 突变蛋白未观察到这种效果。

众所周知，诱导中肠组织损伤的病原体也会促进ISCs的增殖[38]。组蛋白H3（PH3）的磷酸化被认为是ISC有丝分裂反应的标志物[27]。Cry9Aa 处理 24 至 96 小时后检测到 PH3，这与细胞数量恢复的时间段一致，并观察到中肠再生（图 1G）。ISC 特异性诱导 Notch 配体 Delta 的表达。ISCs的Delta/Notch信号转导水平升高，引导EB分化为EC[25,39]。 根据 ISC 增殖（图 1G），在中肠组织 Cry9Aa 处理后 24 至 96 小时检测到 delta 转录本的上调（图 1G），表明细胞分化响应于 Cry9Aa PFT 诱导的细胞脱落而被激活。总体而言，这些数据表明，在亚致死剂量的PFT治疗后，中肠被重塑，显示出细胞损失和中肠组织变薄。然后激活防御反应，观察到摄入毒素 96 小时后，中肠组织通过 ISC 增殖和上皮细胞分化恢复到正常水平，从而允许幼虫存活。

JAK/STAT通路调节中肠再生和幼虫存活，抵消成孔毒素损伤

JAK/STAT通路是一种保守的信号通路。研究表明，在果蝇中，JAK激酶促进STAT3样转录因子（STAT92E）转位到细胞核中，以调节特定的转录靶标，如Socs36E[28]。条纹茎螟幼虫中肠组织中Stat和Socs36E基因的基因表达分析表明，在Cry9Aa处理48 h后，两个基因在恢复阶段均显著激活，但在Cry9Aa喂养6 h后未发生变化（图2A）。据报道，使用掺入星形聚阳离子复合物（SPc）纳米颗粒的dsRNA沉默Stat和Socs36E（S1A图）[40]增加了Cry9Aa处理的幼虫死亡率（图2B和S2）。硝呋嗪是一种抑制STAT组成型磷酸化的抑制剂[41]，抑制STAT也增加了幼虫对Cry9Aa治疗的死亡率，支持JAK/STAT参与对这种PFT的防御反应（图2C）。此外，在Cry9Aa处理48至96小时后，通过RNAi沉默STAT或通过硝呋嗪处理抑制其活性也抑制了中肠再生（图2D）。在 36 张中肠图像中量化了肠厚度和细胞数量的变化，表明中肠再生和 ISC 增殖均受到显着抑制 （p<0.0001）（图 2E 和 2F）。

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图 2. JAK/STAT通路调节中肠再生和幼虫在遇到成孔毒素损伤时的存活。

（A） JAK/STAT通路基因在肠道中的表达 15 3RD型条纹茎螟幼虫用Cry9Aa处理后的龄龄幼虫（LC20）通过RT-qPCR测定的不同时间。 对照（Ctrl）用无毒的Cry9Aa-D125R处理幼虫。将数据归一化为未感染对照，以EF-1基因为参照基因。该实验是在三个独立实验中进行的三个生物重复样品上进行的。 P 值通过双侧 Student t 检验计算，P<0.01 显示差异有统计学意义。P>0.05 无显著差异。误差线表示±SEM。 （B） RNAi沉默JAK/STAT通路基因（Stat和Socs36E基因）后，Cry9Aa对条纹螟虫新生幼虫的杀虫毒性试验。在每次治疗中分析了 35 名新生儿。进行了三次重复。P<0.0001 显示差异有统计学意义（单因素方差分析和 Tukey 检验）。误差线表示±SEM。 （C） Cry9Aa 对条纹螟新生儿的杀虫毒性试验，该试验采用 JAK/STAT 通路抑制剂硝呋嗪处理。在每次治疗中分析了 35 名新生儿。进行了三次重复。P<0.001 显示具有统计学意义的差异（双侧学生 t 检验）。误差线表示±SEM。 对照（Ctrl）用无毒的Cry9Aa-D125R处理幼虫。（D） 矢状面视图的代表性图像3RD型从用Cry9Aa处理的活水稻条纹茎螟幼虫中分离出的龄幼虫中肠组织（LC20）在LSCM中观察到或不使用Stat dsRNA或硝呋嗪处理。Hoechst33342（蓝色）标记细胞核。鬼笔环肽-647（红色）染色存在于刷状边缘（上箭头）和内脏肌肉（下箭头）中的F-肌动蛋白。对照（Ctrl）用无毒的Cry9Aa-D125R处理幼虫。（E 和 F）Cry9Aa （LC20）联合或不联合 Stat dsRNA 或硝呋嗪处理。对照 （Ctrl） 是用无毒的 Cry9Aa-D125R 突变体处理的中肠。无毒素处理的肠道测量为 100%。n = 每次治疗 36 张图像。 P 值通过单因素方差分析和 Tukey 检验计算，P<0.0001 显示差异有统计学意义。P>0.05 无显著差异。大条对应于平均值，而较小的条形表示 ±SEM。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011823.g002

因此，这些数据表明，JAK/STAT通路通过激活PFT引起的上皮细胞丢失后的肠道再生来促进幼虫存活。

JNK信号转导促进成孔毒素处理后的幼虫存活

先前研究表明，JNK通路是一种有丝分裂原激活的MAPK型激酶级联反应，在细胞应激下被激活，并且还参与果蝇肠损伤后的代偿性细胞增殖[20,25,29]。 在果蝇中，皱褶（puc）基因编码Jun N末端激酶磷酸酶，该磷酸酶是JNK信号转导下游的有效靶标[42]。我们发现，用Cry9Aa处理6 h后，Jnk和puc基因在幼虫中肠组织中均上调，48 h后两个基因的表达水平降低至对照幼虫相似的水平（图3A），表明JNK可能在早期参与中肠组织再生。用SP600125（JNK抑制剂的蒽吡唑抑制剂）[43]抑制JNK活性，或使用掺入SPc纳米颗粒中的dsRNA沉默JNK（S1B图），增加了幼虫对Cry9Aa毒素处理的死亡率（图3B，3C和S2），表明JNK通路也参与了对Cry9Aa作用的防御反应。

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图 3. JNK 而不是 EGFR 信号转导促进幼虫对成孔毒素的存活。

（A） Jnk、puc和Egfr基因在肠道中的表达 3RD型条纹茎螟幼虫用Cry9Aa处理后的龄龄幼虫（LC20）通过RT-qPCR测定的不同时间。 对照（Ctrl）用无毒的Cry9Aa-D125R处理幼虫。将数据归一化为未感染对照，以EF-1基因为参照基因。数据来自在三个独立实验中进行的一式三份生物样品。P值采用双侧Student's t检验计算，P<0.05表示差异显著。P>0.05 无显著差异。误差线表示±SEM。 （B） Cry9Aa在RNAi沉默JAK/STAT通路基因（Jnk和egfr）后对条纹茎螟新生幼虫的杀虫毒性试验。每次治疗分析35名新生儿。沉默GFP作为阴性对照。进行了三次重复。P<0.001 显示差异有统计学意义（单因素方差分析和 Tukey 检验）。误差线表示±SEM。 （C）Cry9Aa（LC20）对JNK通路抑制剂SP600125治疗后的条纹茎螟新生儿。每次治疗分析35名新生儿。进行了三次重复。P<0.001 显示具有统计学意义的差异（双侧学生 t 检验）。误差线表示±SEM。 对照（Ctrl）用无毒的Cry9Aa-D125R处理幼虫。（D） 从 3 中分离出的中肠组织的矢状视图代表性图像RD型用Cry9Aa处理的龄活条纹茎螟幼虫（LC20）在LSCM中观察到或不使用Jnk dsRNA或SP600125抑制剂治疗。Hoechst33342（蓝色）标记细胞核。鬼笔环肽-647（红色）染色存在于刷状边缘（上箭头）和内脏肌肉（下箭头）中的F-肌动蛋白。对照（Ctrl）用无毒的Cry9Aa-D125R处理幼虫。（E 和 F）Cry9Aa （LC20）联合或不联合 Jnk dsRNA 或 SP600125 抑制剂治疗。对照 （Ctrl） 是用无毒的 Cry9Aa-D125R 突变体处理的中肠。无毒素处理的肠道测量为 100%。n = 每次治疗 36 张图像。 P 值通过单因素方差分析和 Tukey 检验计算，P<0.0001 显示差异有统计学意义。P>0.05 无显著差异。大条对应于平均值，而较小的条形表示 ±SEM。

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关于EGFR信号通路，据报道，该通路在正常和应激条件下均对促进ISC增殖至关重要[38,44]。 然而，Egfr 的 RNAi 沉默（图 3B）并没有将幼虫死亡率改变为 Cry9Aa，尽管在 Cry9Aa 中毒的早期阶段（6 小时）观察到 Egfr 基因表达的上调（图 3A 和 3B）。

此外，通过使用掺入 SPc 纳米颗粒中的 dsRNA 沉默 JNK 表达或通过特异性蒽吡唑抑制剂抑制 JNK 活性也抑制了 Cry9Aa 处理 48 至 96 小时后的中肠再生（图 3D-3F），而不影响中肠组织厚度和总细胞数减少的初始反应。因此，JNK信号通路而不是EGFR通路通过激活上皮细胞脱落后被成孔毒素破坏的肠道再生来促进幼虫存活。

JNK 调节的 JAK/STAT 信号转导诱导细胞增殖和分化

Jnk基因的时间表达分析表明，该基因在摄入Cry9Aa1.5 h后在条纹茎螟幼虫中肠中表达上调，12 h后达到最高表达值（图4A）。Stat基因的表达也有所增加，在48小时时表达最高（图4A），与中肠恢复相对应（图2D-2F）。根据观察到的基因表达模式，通过RNAi进一步分析了STAT和JNK在相应时间点的关系。RNAi沉默Jnk后，Cry9Aa处理48 h后幼虫中肠Stat的表达受到抑制，而当Stat基因被RNAi沉默时，Cry9Aa毒素处理6 h后Jnk的表达不受影响（图4B），表明JNK位于STAT的上游，调节STAT的表达。

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图 4. JNK 调节的 JAK/STAT 信号转导诱导细胞增殖和分化。

（A） 通过RT-qPCR测定的Jnk和Stat基因在3RD型用Cry9Aa处理的龄龄条纹茎螟幼虫（LC20） 用于不同的时间。将数据归一化为未感染对照，以EF-1基因为参照基因。进行了三次生物学重复和三次独立实验。误差线表示±SEM。 （B） 通过 RT-qPCR 测定的 Jnk、Stat 和 delta 基因在用 Cry9Aa 处理的沉默幼虫（LC20） 6 和 48 小时。在无毒素处理的肠道中检测到的基因表达测量为 100%。十五 3RD型在每次处理沉默后分析龄幼虫。将数据归一化为未感染对照，以EF-1基因为参照基因。沉默GFP作为阴性对照。进行了三个生物学重复样品和三个独立实验。P<0.05 显示统计学差异。P>0.05 无显著差异。误差线表示±SEM。 （C） 矢状视图 从Cry9Aa（LC20） 处理 3RD型在LSCM中观察到的活条纹茎螟幼虫预处理，有或没有Jnk或Stat dsRNA处理。分析了 6 个中肠组织，并使用特异性抗 PH3 抗体检测磷酸化组蛋白 H3 （PH3），然后使用 FITC 标记的二抗（绿色）。Hoechst33342（蓝色）标记细胞核。鬼笔环肽-647（红色）标记细胞骨架。对照（Ctrl）用无毒的Cry9Aa-D125R处理幼虫。（D） 15 3 中肠组织样本中 PH3 的蛋白质印迹检测RD型Cry9Aa后的龄龄幼虫（LC20） 预处理后有或没有 Jnk 或 Stat dsRNA 后中毒。β肌动蛋白被检测为内参。组蛋白H3（H3）检测结果显示H3负载量相近。对照（Ctrl）用无毒的Cry9Aa-D125R处理幼虫。（E） 72 只幼虫的代表性图像，用 Cry9Aa （LC20）在有或没有沉默Jnk或Stat治疗后120小时。阴性对照 （Ctrl） 用无毒的 Cry9Aa-D125R 处理。（F） 用 Cry9Aa 处理的 72 只幼虫长度的量化 （LC20）在有或没有沉默Jnk或Stat治疗后120小时。 P 值通过单因素方差分析和 Tukey 检验计算，P<0.0001 显示差异有统计学意义。

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通过使用掺入 SPc 纳米颗粒的 dsRNA 沉默 Jnk 或 Stat，也导致 delta mRNA 水平下调（图 4B），表明参与激活上皮细胞分化的 delta 表达受 JNK 和 STAT 调节。此外，免疫荧光分析显示，在用 Cry9Aa 毒素处理 48 小时后，使用抗磷酸化组蛋白 H3 抗体在 ISC 中检测到 PH3（图 4C），但当 Jnk 或 Stat 被 RNAi 沉默时，PH3 信号消失（图 4C）。这些数据通过蛋白质印迹测定法（图4D）得到证实，表明Cry9Aa诱导的ISC有丝分裂的激活受JNK和JAK/STAT信号转导的调节。我们注意到，尽管在用亚致死剂量Cry9Aa处理96小时后，幼虫的肠道稳态恢复，但120小时后存活的幼虫的生长速度比没有毒素处理的对照幼虫慢（图4E和4F），这表明防御过程是消耗能量的。然而，由于毒素作用的增加，摄入 Cry9Aa 后的 Jnk 或 Stat 沉默的存活率在 120 小时后变得更小。

JAK/STAT调节肠道再生，对抗另一种害虫中不同的成孔毒素

我们测试了其他PFTs的毒性，如Cry1Fa [45]或Vip3Aa [46]，在另一种鳞翅目害虫，草地贪夜蛾（草地贪夜蛾）幼虫（一种有害的玉米害虫）中[47]。数据显示，沉默Stat（S1C图）可有效增加两种PFT的毒性（图5A）。在草地贪夜蛾幼虫中也观察到低剂量Cry1Fa处理后的肠道再生（图5B）。此外，当 Stat 被 RNAi 沉默时，幼虫中肠组织未能恢复（图 5B 和 5C）。用Cry1Fa处理72 h后，Stat沉默幼虫的肠道厚度和细胞数均显著低于非沉默对照幼虫（图5C和5D）。Cry1Fa处理后，在肠道中也检测到PH3，表明ISC增殖被激活（图5E），并且通过沉默Stat表达抑制了ISC增殖（图5E）。蛋白质印迹结果证实了这些数据，表明 Stat 敲低后组蛋白-H3 的磷酸化被抑制（图 5F）。最后，沉默Stat后，Cry1Fa和Vip3Aa诱导的delta基因表达也下调（图5G）。与条纹茎螟类似，幼虫在亚致死剂量Cry1Fa处理72小时后存活，生长速度快于用Stat dsRNA预处理的幼虫（图5H和5I），表明JAK/STAT信号通过调节肠道再生影响幼虫的整体生长。因此，这些数据表明，在不同的鳞翅目物种中，JAK/STAT信号转导在不同的鳞翅目物种中用不同的PFTs处理后，通过肠道再生参与诱导广泛的反应。

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图 5. JAK/STAT调节草地贪夜蛾幼虫肠道再生，对抗Cry1Fa和Vip3Aa毒素。

（A） Cry1Fa和Vip3Aa对用Stat的dsRNA预处理的新生草地贪夜蛾幼虫的杀虫生物测定。在每次治疗中分析了 35 名新生儿。进行了三次重复。 P 值通过双侧 Student t 检验计算，P<0.0001 显示差异具有统计学意义。P>0.05 无显著差异。误差线表示±SEM。 （B）矢状视图 Cry1Fa （LC 72h 后分离的 4 龄草地贪夜蛾幼虫中肠组织的矢状视图代表性图像20）处理，在LSCM中观察到有或没有Stat dsRNA预处理。Hoechst33342（蓝色）标记细胞核。鬼笔环肽-647（红色）染色存在于刷状边缘（上箭头）和内脏肌肉（下箭头）中的F-肌动蛋白。对照（Ctrl）用不含Cry1Fa毒素的饮食处理幼虫。（C 和 D）Cry1Fa （LC 72 小时后获得的肠厚度 （C） 和细胞数 （D） 荧光信号的定量20）有或没有 Stat dsRNA 预处理。对照 （Ctrl） 是用无毒素人工饮食处理的中肠。无毒素处理的肠道测量为 100%。n = 每次治疗 36 张图像。 P 值通过单因素方差分析和 Tukey 检验计算，P<0.0001 显示差异有统计学意义。P>0.05 无显著差异。大条对应于平均值，而较小的条形表示±SEM。 （E） 矢状面视图 Cry1Fa 36 小时后分离的中肠组织的代表性图像Fa （LC20）处理来自4龄活秋粘虫幼虫，在LSCM中观察到有或没有Stat dsRNA预处理。分析了 6 个中肠组织，并使用特异性抗 PH3 抗体检测磷酸化组蛋白 H3 （PH3），然后使用 FITC 标记的二抗（绿色）。Hoechst33342（蓝色）标记细胞核。鬼笔环肽-647（红色）标记细胞骨架。对照（Ctrl）在没有毒素的情况下处理幼虫。（F） Cry1Fa 36 h（LC20）中毒，有或没有 Stat dsRNA 处理。β肌动蛋白被检测为内参。组蛋白H3（H3）检测结果显示H3负载量相近。对照（Ctrl）在没有毒素的情况下处理幼虫。（G） 通过RT-qPCR测定δ基因在用Cry1Fa或Vip3Aa处理的15只4龄草地贪夜蛾幼虫（LC20）36小时。在3个独立实验中，将数据归一化为未感染的对照肠，并将无蜕皮激素（ECD）基因用作生物复制样品的参考基因。误差线表示 ±SEM。 P 值通过双侧 Student t 检验计算，P<0.05 表示统计学差异。（H） 72 只 4 龄幼虫的代表性图像，用 Cry1Fa （LC20） 72 小时，有或没有沉默 Stat。阴性对照（Ctrl）在没有毒素的情况下处理。（I） 用 Cry1Fa 处理的 72 只 4 龄幼虫的长度定量 （LC20）在有或没有沉默Stat治疗后72小时。 P 值通过单因素方差分析和 Tukey 检验计算，P<0.0001 显示差异有统计学意义。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011823.g005

该模型表明，在中肠细胞被亚致死剂量的PFT损伤后，涉及JNK/JAK/STAT通路的防御机制反应被激活，通过激活ISCs的增殖和分化来促进中肠组织再生（图6）。

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图 6. 亚致死剂量的 PFT 中毒后幼虫中肠细胞中激活的防御机制示意图模型。

苏云金芽孢杆菌（Bt）产生的成孔毒素，如Cry9Aa、Cry1Fa和Vip3Aa，在幼虫中肠细胞的顶膜上形成孔隙。在肠细胞亚致死性中毒 （EC） 后短时间内，孔隙形成会激活 JNK 信号传导。如下，诱导 JAK/STAT 信号转导而不是 EGFR 促进肠道干细胞 （ISC） 增殖和 Delta 调节分化，导致肠道再生和幼虫存活。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011823.g006

沉默统计 协同Bt农药的杀虫活性，保护水稻幼苗免受条纹茎螟的损害

为了测试沉默Stat基因表达与Bt毒素联合有效防治虫害的潜在用途，将Stat-dsRNA掺入SPc纳米颗粒[40]中，并与产生Cry9A、Cry1I、Cry9E和Vip3A蛋白的Bt血清型福冈菌株同时喷洒在水稻幼苗的茎叶上[48]在接种条纹茎螟幼虫之前。与仅喷洒Bt菌株的对照植物相比，该配方同时含有Bt菌株和SPc-dsStat，更有效地控制了幼虫（图7A）。该制剂的毒性在三天内达到80%的死亡率，并且在处理三天后在茎附近的土壤上观察到死亡的幼虫（图7A）。我们的数据表明，dsStat联合Bt菌株喷洒的幼苗比其他处理更健康、更强壮，叶子更大（图7B），茎上的虫洞更少（图7C），株高更高（图7B和7D）。相比之下，未经处理或仅用dsRNA处理的幼苗没有受到保护（图7B-7D）。与未进行Bt菌株处理的对照组相比，由于Bt毒素的作用，dsgfp与Bt菌株的混合物一起使用，显示出一定的保护作用，因为干燥和卷曲的叶子更少（图7B），茎上的虫洞更少（图7C）。

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图 7. 喷洒Stat dsRNA纳米颗粒协同Bt农药，保护水稻幼苗免受条纹螟虫的侵害。

（a） 死亡率为2钕条纹茎螟幼虫（每株6只幼虫）在喷洒Bt福冈菌株和Stat-dsRNA或gfp-dsRNA组合纳米颗粒混合物的水稻幼苗上。用 Bt 菌株处理 3 天的代表性幼虫，有或没有沉默 Stat。阴性对照是无Bt菌株喷洒的植物。误差线表示±SEM。 （B）喷洒或不喷洒Bt农药和Stat-dsRNA组合纳米颗粒混合物的水稻幼苗生长。阴性对照为喷施Bt菌株和GFP-dsRNA结合纳米颗粒的植株。每盆四叶期水稻苗2盆，每盆2盆，重复3次。（C）幼虫产生的虫洞的代表性图像，这些虫洞破坏了水稻茎，特别是在地面附近。不同的处理方式如图所示。（D）喷洒Bt菌株和Stat-dsRNA组合纳米颗粒混合物的水稻幼苗和感染条纹茎螟幼虫的水稻幼苗株高的定量。P值通过单因素方差分析和Tukey检验计算。P<0.0001 表示静态显著差异。大条对应于平均值，而较小的条形表示 ±SEM。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011823.g007

设计用于沉默 Stat 的 dsRNA 在智人组装体的基因组中没有显示同源基因 （GCF_000001405.40;GCF_009914755.1）染色体。Stat 基因在不同的鳞翅目昆虫中相对保守，例如在家蚕中，基因同一性为 50.1%。然而，我们在这里使用的dsRNA是从条纹茎螟中Stat的特定区域设计的，与家蚕中的基因没有同源性（GCA_026075555.1），这表明其对非靶标生物的潜在安全性。我们得出的结论是，喷洒dsStat与Bt农药相结合可能是改善害虫控制的有效和安全策略。

讨论

Bt产生的PFT被认为是感染和杀死昆虫宿主的关键毒力决定因素。一般来说，PFT通过产生蛋白质孔来破坏质膜，这些蛋白质孔会诱导细胞外和细胞内环境之间不受控制的离子交换，从而极大地扰乱细胞稳态[49]。据报道，在表征真核细胞中进化的保守细胞修复机制方面取得了重要进展，使细胞能够从PFT在其质膜中产生的机械破坏中恢复[9]。这些防御机制包括堵塞孔[50]、通过起泡隔离膜损伤[51]、大细胞质挤出脱落和受损上皮细胞变薄[52,53]、内吞作用/胞吐作用以及与溶酶体融合后的降解[8,54]。在果蝇中，有报道称，中肠组织中的细胞更新率不断变化，这是对不同应激条件的反应，例如感染性肠道微生物产生的PFT中毒[25]。

为了鉴定参与中肠细胞修复和周转的靶基因，以制定增强鳞翅目昆虫中Bt杀虫蛋白毒性的策略，我们表征了暴露于亚致死剂量的Bt、Cry9Aa PFT后参与幼虫中肠细胞再生的信号转导途径。暴露于Cry9Aa的幼虫经历了中肠损伤和细胞丢失，随后是ISC增殖和组织再生（图1D-1F）。这些数据与先前发表的文献一致，这些文献显示摄入Cry1A毒素后鳞翅目中肠组织受损[55]。

我们证明了JAK-STAT信号通路在PFTs处理后调节鳞翅目幼虫的肠道再生（图2），这与先前的出版物一致，表明JAK-STAT信号通路是果蝇中肠再生的主要调节因子[23\u201225]。之前研究表明，当果蝇的中肠组织受到应激或受损时，ECs通过触发JAK/STAT信号反应来刺激ISC的再生，其中Upd2和Upd3在ECs和EEs中被转录诱导，触发ISC中的STAT信号，促进它们的分裂[21,26]。 令人惊讶的是，在条纹茎螟的基因组中没有发现与Upd基因的显着相似性。一种可能性是，在条纹茎螟虫中，还有其他分子将信号从 EC 传递到 ISC。另一种可能性是，分离的ECs是通过E-cadherin作为一种细胞间通讯的丧失被ISC感知到的[56]。

在这里，我们发现JNK在感染后的早期（图4A）上调，RNAi沉默Jnk抑制条纹茎螟幼虫的STAT反应（图4B），表明JNK信号可能在肠道再生过程中启动STAT反应。这些数据与先前的研究结果相关，表明当被直接损害肠道上皮的病原体（如假单胞菌）感染时，JNK信号在EC中被激活[27,30]。 我们的数据无法区分JNK的STAT激活是直接的还是间接的，需要更多的研究来解决这个问题。此外，JNK和STAT信号转导的定位以及责任细胞的鉴定仍有待确定。这些信息将有助于了解该途径在对 Cry9Aa 毒素的防御反应中的参与。

同样，先前的研究表明，在由嗜昆虫假单胞菌产生的PFT溶血素引起的中肠损伤后，EGFR/Ras/MAPK通路是诱导果蝇EE/EC生长所必需的[38]。然而，我们发现 Egfr 的 RNAi 并没有改变条纹茎螟幼虫对 Cry9Aa 毒素的死亡率，尽管 Egfr 在 PFT 中毒的早期阶段上调（图 3A）。我们假设，在暴露于 Bt Cry9Aa PFT 的幼虫中肠组织的情况下，EGFR 可能独立于 JNK/JAK/STAT 通路发挥作用。此外，我们不能否认EGFR也参与鳞翅目昆虫的肠道再生，但其他途径补偿了EGFR的沉默，解释了沉默幼虫缺乏表型的原因。这还有待将来研究。

总体而言，我们的数据显示，JNK 和 JAK/STAT 通路参与 PFT 损伤后的中肠组织再生。此外，JAK/STAT是一种保守的途径，用于调节两种不同的昆虫鳞翅目害虫（条纹茎螟和草地贪夜蛾）对三种不同Bt的PFT（Cry9Aa，Cry1Fa）的防御（图5）。如前所述，这项工作的主要目的是确定敲低肠道再生反应的靶基因，以增加Bt哭泣杀虫蛋白的毒性。我们的数据表明，沉默Stat基因在暴露于Cry杀虫蛋白后抑制肠道再生，增强了Cry蛋白对至少两种不同害虫的毒性（图7）。此外，我们证明将这种新配方喷洒到植物中有助于防止害虫的损害。因此，这是一种新颖的策略，可用于增强Cry对不同害虫的毒性。此外，在转基因植物或主题制剂中同时表达Stat dsRNA和Cry毒素可以为有效控制对Cry毒素或对这些杀虫蛋白进化出抗性的昆虫表现出低敏感性的害虫提供手段。

材料与方法

昆虫种群

从中国湖北省获得的条纹茎螟（Chilo suppressalis）由Shennong Inc.（中国湖北）提供。从中国云南省获得的草地贪夜蛾（草地贪夜蛾）由吉林省农业科学院植物保护研究所徐文静教授提供。

杀虫生物测定

Cry9Aa3、无毒的Cry9Aa3-D125R突变体和Vip3Aa11蛋白在大肠杆菌中表达，如前所述，使用Ni-螯合亲和层析法纯化[57]。Cry1Fa3蛋白在Bt中表达，并按照前面描述的晶体裂解方法纯化[58]。

对2日龄幼虫进行生物测定以确定中位致死浓度值，而根据先前的描述，使用饮食掺入测定法对2日喂养dsRNA后的新生儿幼虫进行额外的死亡率生物测定[57,59]。 在针对条纹茎螟的杀虫死亡率试验中，将5个梯度浓度的Cry9Aa或其突变蛋白（1mL）与3-g人工饲料（由中国农业科学院植物保护研究所的韩兰芝教授和李云和教授提供）[60]充分混合，并转移到平板玻璃管中。将35只幼虫放入每个管内，每次处理进行三次重复。死亡率在7天后计算。20%幼虫死亡率（LC20）和致死浓度2%的幼虫死亡率（LC2）通过概率分析[61]计算得出。

根据先前的出版物，针对草地贪夜蛾的杀虫死亡率测定，制备了一种基于大豆粉和麦麸的改良人工饲料[62]。在生物测定中，将 15 g 人工饲料与 7.5 μg Cry1Fa （0.5 μg/g） 或 15 μg Vip3Aa （1 μg/g） 掺入，并均匀填充到 24 孔培养板中。在每个孔中放置一只 2 天大的幼虫。每种处理进行三次重复。7 天后计算死亡率百分比。

肠厚度和细胞数测定

在每g日粮中喂食200μg Cry9Aa蛋白不同时间（1.5-120小时）后，解剖存活下来的三龄幼虫的中肠组织，并在4°C下在4%多聚甲醛中固定过夜。 用PBS仔细洗涤这些中肠组织三次，并在室温（RT）下用1：1000鬼笔环肽-iFluor 647（Abcam，Cambridge，UK）标记1小时。用PBS洗涤两次后，用10μg/ ml Hoechst33342（Solarbio Life Sciences，Beijing，China）在PBS中的终浓度标记组织5分钟。用PBS洗涤三次后，用Prolong Diamond Antifade（Invitrogen，Oregon，USA）将组织密封在显微镜载玻片上。在共聚焦LSM 980（德国蔡司）中使用20X物镜获得图像。每次治疗使用六个内脏，从每个中肠拍摄六张图像。肠道厚度测量基于使用 ImageJ 软件在总共 36 张图像中用鬼笔环肽-iFluor 647 染色的细胞骨架数据。根据用 Hoechst33342 染色的细胞核数计算中肠细胞数，然后除以肠道长度作为每 μm 面积的细胞核数。每种处理进行三次重复。

APN发布分析

用200 μg/g Cry9Aa处理3龄幼虫12和24 h。在指定时间从活幼虫中解剖 15 个完整的中肠，并转移到 100 μl 50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）中。涡旋 30 秒，在 4°C 下以 21,000 xg 离心 5 分钟，并将这些样品中肠腔中含有内容物的上清液用于 APN 活性分析。使用Bradford试剂盒（Solarbio Life Sciences，Beijing，China）测量样品中的蛋白质浓度。使用 4 mM L-亮氨酰基对硝基苯胺作为底物，在 50 mM Tris-HCl （pH 7.5） 缓冲液中测定 APN 活性。使用FlexStation 3多功能酶标仪（Molecular Devices，USA）在405nm处监测LpNA水解释放的对硝基苯胺10分钟。较高的APN酶活性是代表肠道损伤状况的肠细胞脱落增加的结果。在这些实验中，我们使用无毒的 Cry9Aa-D125R 突变蛋白作为阴性对照 （Ctrl），其突变位点位于结构域 I 螺旋 α3 中。这种突变体失去了毒性，但保留了与 Cry9Aa 相同的与 BBMV 结合的能力。对照组和所有治疗均重复三次进行。

RNA干扰检测

dsRNA的DNA模板是从幼虫中肠的cDNA中克隆的（有关dsRNA的引物和所选基因片段的信息在S2表中描述）。将 DNA 连接到 pEasy Blunt Zero 载体（TransGen Biotech，北京，中国）中。单独构建了428 bp的增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）片段[63]。根据制造商的说明，使用T7 RiboMAX Express RNAi系统（Promega，Madison，USA）从质粒DNA合成不同的dsRNA。使用NanoDrop（ThermoFisher Scientific，Oregon，USA）测定合成dsRNA的浓度。将 75 μg dsRNA 与星形聚阳离子 （SPc） 复合物 [40] 以 1：1 的质量比混合在 1 mL 无核酸酶水中。室温孵育15 min后，用3 g日粮与SPc-dsRNA制剂混合处理50只条纹螟虫或草地贪夜蛾新生儿48 h，以SPc-dsegfp为阴性对照。收集15只幼虫进行逆转录定量PCR（qRT-PCR），其余处理的幼虫转移至含有20 μg Cry9Aa/g日粮的人工日粮中，用于条纹茎螟，或0.5 μg Cry1Fa/g日粮或1.0 μg Vip3Aa /g日粮用于草地贪夜蛾杀虫生物测定。200μg/g Cry9Aa（LC20）用于条纹茎螟的三龄幼虫的肠道再生分析，或用30μg/g Cry1Fa或77μg/g Vip3A（LC20）为如上所述的草地贪夜蛾的四龄幼虫。每次治疗重复三次。

逆转录定量PCR（RT-qPCR）

使用S3表中描述的引物通过RT-qPCR评估RNAi效率和基因表达。将 30 只 2 日龄幼虫或 15 只来自三龄幼虫的中肠收集在一起，并混合在单个样品中，用于分析 RNAi 效率和每种处理的基因表达测定。使用总RNA试剂盒I（OMEGA Bio-tek，GA，USA）从样品中提取总RNA。使用HiScript III RT SuperMix（Vazyme，南京，中国）进行逆转录。通过QuantStudio 6（Applied Biosystems，MA，USA），使用SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，Nanjing，China）将cDNA稀释20倍作为qPCR模板。使用2 -ΔΔ CT方法[66]。进行了三次重复和三次独立实验。

免疫荧光显微镜

从幼虫中解剖出每个处理的六个中肠组织，并在 4°C 下固定在 4% 多聚甲醛中过夜。 用PBS洗涤三次后，在室温下用2%Triton X-100在PBS中小心透化2小时。加入一抗，室温孵育2 h，其浓度如下：抗磷酸化组蛋白H3抗体1：50稀释（Abclonal Technology，China）。用PBS洗涤3次，每次5 min后，加入山羊抗兔FITC二抗（1：100稀释）（Solarbio Life Sciences，北京，中国），并在室温下孵育2小时[67]。用PBS洗涤3次，每次5分钟后，如上所述用鬼笔环肽-iFluor 647和Hoechst33342标记中肠组织。使用共聚焦LSM 980显微镜获得图像。使用Image J软件测量荧光强度。

蛋白质印迹

使用Protein Kit（OMEGA Bio-tek，GA，USA）提取从幼虫中获得的15个中肠组织的总蛋白。使用BCA试剂盒（Solarbio Life Sciences，北京，中国）定量中肠样品中总蛋白的量。然后，在SDS-PAGE凝胶上分离每种处理的35μg蛋白质，并电转印到PVDF过滤器上。在室温下在1%非蛋白质封闭溶液（Sangon Biotech，Shanghai，China）中封闭40分钟后，将PVDF过滤器与以下一抗之一抗β-肌动蛋白（ABclonal Technology，Wuhan，China）在1：30000稀释下孵育，抗组蛋白H3（ABclonal Technology，Wuhan，China）在1：3000稀释和抗磷酸化组蛋白H3（ABclonal Technology，Wuhan， 中国）以1：1000稀释在含有0.1%吐温-20（PBST）的PBS中。用PBST洗涤3次，每次10分钟后，将PVDF过滤器与用FITC（Solarbio Life Sciences，北京，中国）标记的相应山羊抗兔二抗在PBST中以1：1000稀释在室温下孵育1小时。

锅实验

以每盆四叶期水稻秧苗2株（Oryza sativa L.）为研究对象进行喷施试验。含有 1.8x10 的 5 mL 配方9将实验室中保存的具有cry9Aa基因的cfu Bt血清型福冈菌株[48]与60 μg dsRNA样品混合，以1：1的质量比嵌入SPc中，如前所述[40]，喷洒在幼苗上。1 h后，每株株放置6只二龄条纹茎螟幼虫。每次处理使用两个花盆。进行了三次重复。我们每天分析虫洞和死虫，并在第七天计算植物高度。

统计分析

复制文章中报告的所有研究结果所需的数据已在树妖数据集上公布并公开提供[68]。所有实验至少重复三次，并使用Graphpad Prism 7.0软件（Graphpad，San Diego，CA）进行统计分析。通过学生 t 检验进行成对比较。单因素方差分析（ANOVA）用于比较多组，Tukey检验用作事后检验（通过对数变换的百分比）。

支持信息

通过RT-qPCR测定用相应dsRNA处理48小时的新生儿幼虫的RNAi效率。

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S1 图。 通过RT-qPCR测定用相应dsRNA处理48小时的新生儿幼虫的RNAi效率。

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S2 图。 Cry9A 蛋白对 Chilo suppressalis 的完整剂量反应曲线。

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S1 表。 Cry9A及其突变蛋白的中位致死浓度。

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S2 表。 合成dsRNA的引物。

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S3 表。 RT-qPCR的引物。

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确认

中国农业科学院植物保护研究所韩兰芝教授和李云和教授为条纹茎螟提供人工饲料;徐文静教授提供草地贪夜蛾幼虫。

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