免费医学论文发表-甲基腺苷去甲基化酶 ALKBH5 调节缺氧 HBV 转录组
抽象
慢性乙型肝炎是一个全球性的健康问题，目前的治疗方法只能抑制乙型肝炎病毒（HBV）感染，这凸显了对新的治愈性治疗方法的需求。氧水平影响HBV复制，我们之前报道过缺氧诱导因子（HIFs）激活基础核心启动子（BCP）。在这里，我们表明BCP衍生的转录物的缺氧依赖性增加依赖于N6-甲基腺苷（m6A） 调节 RNA 半衰期的 5' 茎环中的修饰。应用探针富集的长读长测序方法准确绘制HBV转录组图谱，显示前基因组RNA在缺氧条件下的丰度增加。绘制 BCP-RNA 的转录起始位点确定了缺氧在调节依赖于 m 的前基因组 RNA 剪接中的作用6甲基化。对已发表的小鼠肝脏单细胞RNA-seq的生物信息学分析显示，RNA去甲基化酶ALKBH5在中央低氧区表达增加。对人肝细胞来源的HepG2-NTCP细胞系的体外研究表明，在缺氧条件下，ALKBH5基因表达增加，m6A修饰的HBV BCP-RNA和宿主RNA同时减少。沉默去甲基化酶降低了 BCP-RNA 和宿主基因（CA9、NDRG1、VEGFA、BNIP3、FUT11、GAP 和 P4HA1）转录本的水平，这是通过降低 HIFα 表达介导的。总之，我们的研究强调了 ALKBH5 在协调病毒和细胞对低氧的转录反应中以前未被认识到的作用。
作者摘要
氧水平影响 HBV 复制，缺氧诱导因子 （HIF） 激活 HBV 转录。HBV转录组的长读长测序和定位显示，在依赖于N6-甲基腺苷修饰的缺氧条件下，病毒RNA的丰度增加。研究RNA去甲基化酶的氧依赖性表达，发现ALKBH5是一种缺氧激活基因，沉默其表达在缺氧条件下调节HBV和宿主基因表达中起关键作用。
数字
Fig 7图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7图1图2图3
引文： Tsukuda S， Harris JM， Magri A， Balfe P， Siddiqui A， Wing PA， et al. （2024） N6-甲基腺苷去甲基化酶 ALKBH5 调节缺氧 HBV 转录组。PLoS 病理学 20（1）： e1011917 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917
编辑 器： Robert F. Kalejta，威斯康星大学麦迪逊分校，美国
收到： 14年2023月20日;接受： 2023年16月2024日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2024 Tsukuda et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 主要数据可通过Mendeley Data获得：Tsukuda，Senko （2024），“N6-甲基腺苷去甲基化酶ALKBH5调节缺氧HBV转录组”，Mendeley Data，V1，doi：10.17632/ydwvgx9yfw.1
资金： McKeating实验室由惠康研究者奖200838/Z/16/Z、惠康发现奖225198/Z/22/Z、中国医学科学院医学科学创新基金资助（批准号：2018-I2M-2-002）。AM由约翰·布莱克基金会（John Black Foundation）支持，AS由NIH AI139234资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
慢性乙型肝炎（CHB）是世界上最重要的经济疾病之一，有2亿人在其一生中接触过该病毒，导致全球感染>290.1亿人。乙型肝炎病毒（HBV）在肝脏中复制，慢性感染可导致进行性肝病、肝硬化和肝细胞癌（HCC）[2]。HBV 是小包膜嗜肝病毒科肝病毒科的原型成员，具有部分双链松弛环状 DNA （rcDNA） 基因组。目前的治疗方法包括核苷（酸）类似物和干扰素，它们抑制病毒复制，但不能治愈，主要是由于游离型HBV基因组的持续存在和病毒特异性免疫应答功能失调[<>]。
HBV感染肝细胞，rcDNA基因组易位到细胞核，并通过宿主DNA修复酶转化为共价闭合环状DNA（cccDNA）[3]。宿主DNA修复途径的几个成员将rcDNA转化为cccDNA，作为病毒RNA的转录模板[4]。HBV 转录六种长度递减的主要 RNA，具有共同的 3' 多聚腺苷酸化信号，包括：编码 e 抗原 （HBeAg） 的前核心 （pC）;前基因组 （pgRNA），被翻译为产生核心蛋白和聚合酶;preS1、preS2 和 S RNA 编码多功能 x 蛋白 （HBx） 的表面包膜糖蛋白和 X 转录本。转录由四个启动子引导，这些启动子由两个离散但密切相关的增强子元件调节：增强子I激活转录pC和pgRNA的基础核心启动子（BCP），而增强子II激活调节包膜和X RNA的启动子[5,6]。pgRNA被病毒聚合酶包封和逆转录，产生可包膜和分泌的rcDNA基因组[7]。在实验性HBV复制模型[2,8]和CHB受试者的肝活检样本中报道了pC/pgRNA和preS9/S RNA的其他剪接亚型[10]，其中剪接变异株1（SP1）含量最高，据报道与更进展的肝病有关[11–13]。剪接RNA可以编码可能影响病毒复制的融合蛋白[11,14,15]（见文献[16]）。我们对HBV启动子和调节RNA剪接的宿主途径之间的相互作用的理解还不是很清楚。
N6-甲基腺苷（m6A）是在真核生物转录本上发现的最丰富的修饰，它可以调节mRNA结构、选择性剪接、稳定性和降解[17]。m6A 修改受 m 的平衡活动调节6“作家”和“橡皮擦”蛋白质。腺苷被甲基转移酶样3（METTL3）/METTL14复合物[18]以及肾母细胞瘤1相关蛋白（WTAP）等辅助因子甲基化[19]。该复合物通常甲基化共识 DRACH 内的腺苷残基（D = A、G 或 U;R = G 或 A;H = A， C 或 U） 基序，通常位于 mRNA 中的终止密码子、3' 非翻译区和内部外显子附近 [20， 21]。m6A修饰可以通过擦除，包括去甲基化酶、AlkB同源物5（ALKBH5）和脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）[22,23]。HBV cccDNA编码的DRACH基序存在于ε茎环区域中常见的3'多聚腺苷酸化信号附近的所有病毒转录本中，但值得注意的是，在pC和pgRNA开头的5'末端重复序列中也发现了该基序以及相关的剪接转录本[24]。m6修饰的HBV RNA被含有YTH结构域的蛋白2（YTHDF2）和干扰素诱导的RNase ISG20识别，ISG25可以对其进行降解处理[<>]。最近，m6据报道，修饰的pgRNA优先包封[26,27]。总的来说，这些研究证明了这些转录后修饰在HBV生命周期的多个阶段的重要作用。
不同组织的氧浓度各不相同，肝脏接受来自肝动脉的含氧血液，通过肝门静脉接受部分缺氧血液，导致门静脉周围和中心周围区域的氧梯度分别为8%-3%[28]。这种氧梯度与肝分化有关，肝分化是肝细胞在肝脏中表现出不同功能和结构组织的现象[29]。细胞通过由缺氧诱导因子 （HIF） 调节的协调转录反应来适应低氧：一种异二聚体转录因子复合物，包括一个 α（HIF-1α、HIF-2α 和研究较少的 HIF-3α）和一个 β 亚型 （HIF-1β/ARNT）。当氧气充足时，HIFα 亚基被 HIF 脯氨酰羟化酶结构域 （PHD） 酶羟基化，并靶向蛋白酶体降解。在低氧条件下，HIF调节影响细胞过程的多种转录靶标（见[30]）。HIF也可由免疫、代谢和炎症信号等非缺氧刺激诱导[31]，从而对各种生理刺激做出灵活反应[31–33]。我们报道了HIFs在低氧维持的实验室模型和HBV转基因小鼠中结合并激活HBV cccDNA转录[34]。HIF还通过载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样3B（APOBEC3B）抑制HBV cccDNA脱氨[35]并增强病毒复制。据报道，HIF会影响许多病毒的复制（见[36]），增强EB病毒复制[37,38]，但抑制甲型流感和SARS-CoV-2[39\u41]，突出了缺氧信号传导与病毒感染之间的复杂相互作用。
迄今为止，研究调查了 m 的作用6HBV 生命周期的修改是在 18% 氧气的标准实验室条件下进行的，其中 HIF 是无活性的。一些报告显示，HIFs激活了m6一种去甲基化酶ALKBH5 [42–44]，我们假设肝脏的低氧条件会增加ALKBH5的表达，并影响HBV RNA的甲基化状态及其在感染细胞中的丰度。我们的研究确定了 m 的作用6在缺氧条件下，5'ε茎环在调节pC和pgRNA半衰期和剪接方面的修饰。此外，我们确定了 ALKBH5 在缺氧条件下调节 HIF-1α 的作用，这会影响 HBV 和细胞转录本的丰度。
结果
HBV 基础核心启动子衍生转录本的缺氧增加取决于 m6A 修改
评估 m 的作用6A RNA修饰在低氧条件下调节HBV RNA的稳态水平，我们突变了DRACH基序以产生m6先前报道的A-null病毒（图1A）[24]。培养未感染的 HBV 野生型 （WT） 或 m6在 1% 氧下，A-null 感染的细胞稳定了 HIF-1α 和 HIF-2α 的表达。为了测量HBV转录本的HIF特异性调节，我们用HIF脯氨酰羟化酶抑制剂（FG-4592）处理感染细胞，该抑制剂可以在常氧条件下稳定HIFs[45]（图1A）。两种处理均诱导了HIF靶基因碳酸酐酶9（CA9）在WT和m中的基因表达[46]6A-null感染样本（图1A）。为了定量HBV转录本，我们选择了靶向基因组5'端的引物，以扩增BCP衍生的转录物（pC，pg及其剪接衍生物，SP）或所有转录本共享的3'区域（总HBV RNA）（图1B）。低氧或FG-4592处理增加了WT或m中总病毒RNA的水平6A-null 感染的细胞，但 BCP 衍生的转录水平在 m6A-null感染的细胞保持不变（图1B）。总之，这些数据表明 m 起着至关重要的作用6BCP-RNA缺氧诱导的修饰。
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图 1. HBV BCP-RNA的缺氧调节取决于m6修改。
(A） 5' 和 3' HBV RNA 茎环中 DRACH 突变的示意图和病毒感染方案。HepG2-NTCP细胞感染HBV野生型（WT）或m6A-无效，在 18%、1% 氧气下培养或用 FG-4592（FG，30 μM）处理 72 小时。 测量 HIF-1α、HIF-2α 或 β-肌动蛋白水平和 HIF 调节基因碳酸酐酶 9 （CA9） 转录本。（B） 用于 BCP-RNA（pC、pgRNA 和剪接 RNA，SP）和总 HBV RNA 的 qPCR 扩增的引物区域示意图。数据相对于每种条件下的 18% 氧气表示，并以 n = 3 的三个独立实验之一的平均 ± S.D. 表示，其统计显着性使用双向方差分析确定。* p < 0.05， ** p < 0.01， **** p < 0.0001.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.g001
5' 茎环 DRACH 基序在缺氧条件下调节 BCP-RNA 的丰度
要调查哪个 m6一个基序在低氧条件下调节 BCP-RNA 水平，我们用 HBV 2.1x 超长质粒转染 HepG3-NTCP 细胞，这些质粒编码 DRACH 基序突变，在 5' 茎环 （HBV m6A-5'null）、3'环路（HBV m6A-3'null）或两个环路（HBV m6A-null）（图 2A）。转染的HepG2-NTCP细胞在18%或1%氧气条件下培养，并测定BCP-RNA、HBeAg抗原、核心蛋白和分泌的HBV DNA。在转染后 4 小时测量细胞内 HBV DNA 显示出相似的质粒摄取效率（S1A 图），我们通过测量 HIF 蛋白水平和 CA9 基因表达证实了细胞缺氧反应（图 2A 和 S1B）。在 m 中注意到 BCP-RNA 水平较低6A-null 和 m6A-5'null转染细胞与WT或m的比较6A-3'null，与我们之前的报告一致，显示复制适应度降低（S1C图）[24]。缺氧增加了 WT 或 m 中 BCP-RNA、核心蛋白和细胞外 HBV DNA 的水平6A-3'null 转染细胞，而 m6A-null 也不是 m6A-5'null 显示出任何氧依赖性调节。（图 2B 和 S1D)
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图 2. HBV BCP-RNA 和分泌病毒 DNA 的缺氧依赖性增加依赖于 5' m6修改。
(A） HBV 质粒示意图，指示 5' 和 3' m 的 A-C 突变位置6BCP-RNA中的位点。圆圈代表 WT（绿色）和 C 突变（红色）。用HBV质粒转染HepG2-NTCP细胞4h，在20%氧气下再孵育18h，然后转移到18%或1%氧气中72h。 评估HIF-1α、HIF-2α和β-肌动蛋白表达。（B） 对细胞内 BCP-RNA、细胞外分泌的 HBeAg 和 HBV DNA 进行定量，并以三个独立实验的平均值 ± S.D. 表示数据。使用 Mann-Whitney 检验确定统计学意义，并对多重比较进行 Bonferroni 校正。** p < 0.01， *** p < 0.001， **** p < 0.0001. （C） 制备如图 A 所示的 HepG2-NTCP 细胞和从细胞组分中提取的 RNA，用 TURBO DNase 处理以去除通过 qPCR 定量的任何污染质粒 DNA 和 BCP-RNA。数据从 n = 5 个独立样本中获得，并以平均值表示±标准差。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.g002
为了了解缺氧相关的BCP-RNA增加是否会导致其细胞定位的严重变化，我们用HBV转染HepG2细胞，并量化了细胞核，胞质溶胶或病毒衣壳中病毒转录本的相对丰度。大多数BCP-RNA位于胞质溶胶中，并且在低氧条件下没有变化（图2C），这表明缺氧不会影响封装机制和/或组装过程。综上所述，这些数据表明，5' m6修饰在 BCP-RNA 的缺氧依赖性增加中起着至关重要的作用。
HBV BCP-RNA半衰期的缺氧增加为m6A-依赖型
由于甲基化和缺氧都会影响RNA的稳定性[47,48]，因此我们测量了WT或m的半衰期6使用最近开发的“路障PCR”[49]，在低氧条件下获得A-null衍生的BCP-RNA（图3A）。该测定使我们能够测量 HBV 转染细胞中的 mRNA 衰变动力学，而无需使用可能影响细胞活力的一般转录阻滞剂放线菌素 D。我们观察到在缺氧条件下（5.5h v 10.6h）WT BCP-RNA的半衰期显着增加，这在m中并不明显。6A-无效转染样品（8.6h v 9.1h）（图3B）。半衰期 （t1/2）是从具有95%置信区间的单相指数衰减估计的（图3C）。总之，这些数据凸显了 m 的重要作用6在缺氧条件下调节BCP-RNA半衰期的修饰。
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图 3. HBV BCP-RNA 半衰期的缺氧增加取决于 m6A-修饰。
(A） 实验程序示意图。用 HBV WT 或 m 转染的 HepG2-NTCP 细胞6将A-无效质粒在18%或1%氧气条件下孵育48h。用 4-硫尿苷 （4sU） 处理培养物，并在 0sU 处理后 6、12、24 和 4 小时收获细胞。（B） BCP-RNA 水平通过 qPCR 进行量化，并提供了相对于 0h 4sU 处理的数据，代表了两个独立实验中 n = 6 的平均值 ± S.D.。（C） 半衰期 （t1/2）通过非线性回归、一相指数衰减和从两个独立感染中列出的 95% 置信区间 （CI） 进行分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.g003
绘制缺氧HBV转录组的图谱和m的影响6甲基化
为了进一步探索HBV转录组缺氧和甲基化状态之间的相互作用，我们使用了先前报道的探针富集长读长测序方法[9]来绘制未剪接和剪接的转录本（图4A）。我们定量了源自先前报道的转录起始位点（TSS）[8,50]的病毒读长，包括WT和m中的转录起始位点[<>,<>]6A-null 转染的 HepG2 细胞。测序文库包含47,697-119,071个reads，我们注意到样本中HBV读取的频率相似，占总数的41-55%（S1表）。为了比较不同样品中HBV RNA的谱图，我们将病毒读数表示为百万分之一的转录本（TPM）。pC 和 pgRNA 是病毒转录组的次要组成部分 （<5%），编码表面糖蛋白的 RNA （preS1、preS2、S） 是最丰富的转录本，与缺氧条件或甲基化状态无关（图 4B）。许多病毒转录本没有映射到已知的TSS，并被归类为不完整，其中许多编码S基因开放阅读框（ORF）（S1表）。对剪接转录本进行映射，确认SP1是最丰度的（~1,500–8,000 TPM），还检测到SP9、SP6、SP7、SP14和pSP9转录本（>500 TPM）（S1表）。差异表达分析发现 pgRNA 显着增加 3.9 倍，而 pC（pC-L 和 pC-S）转录本显示不显着（1.3 倍）变化，这意味着我们之前观察到的缺氧下 BCP-RNA 增加最有可能反映 pgRNA 丰度的变化。在缺氧条件下培养的 WT 转染细胞中观察到 preS2（1.8 倍）和 S（1.9 倍）转录本的适度增加（校正 p 值 < 10?5），表明病毒转录本的缺氧增强延伸到BCP之外（图4C）。
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图 4. HBV长读长序列分析。
(A） 描绘了 HBV 基因组产生的主要未剪接和剪接转录本的卡通，其中显示了主要病毒 RNA 的转录起始位点 （TSS）。（B） HBV WT 或 m 中主要未剪接和剪接转录本的相对频率6在 2% 或 18% 氧气下培养表达 A-null 的 HepG1 细胞。（C） 缺氧调节HBV WT和m的差异基因表达6A-null RNA，其中 X 轴表示样本之间的差异（Log2 倍数变化），Y 轴表示调整后的变化概率（-log10（调整后的 p 值））。显著性阈值定义为 5% （-log10[0.05] = 1.303）。（D） 描述BCP-RNA（pC-L、pC-S、pg和相关剪接RNA）的TSS范围及其相对频率（HBV WT或m）的示意图6在 18% 或 1% 氧气下培养 A-null 感染的培养物。（E） BCP 来源的剪接 RNA 在 HBV WT 或 m 中的相对 TSS 使用6A-null感染（18%O 2），转录本按丰度顺序列出（见S1表）。（F） HBV WT 或 m 中 SP1 RNA 的相对 TSS 使用情况6在 18% 或 1% 氧气下培养 A-null 感染的培养物。在所有面板中，误差线表示与 S1 表中列出的重复的平均 TPM 的标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.g004
几项研究报告了 m 之间的关联6A水平和选择性mRNA剪接[51,52]，包括腺病毒转录组[53]，但其潜在机制尚未阐明。长读长测序鉴定了BCP-RNA，我们绘制了两个pC转录本（pC-Long（L）或pC-Short（S））、pgRNA和一些编码5'茎环DRAH基序的剪接RNA（图4D和S1表）。由于大多数 pC 转录本从 210-270 个核苷酸开始，其中 pC-L 转录本相对罕见 （6.1%），因此所有后续分析都合并了这些转录本（S1 表）。在常氧条件下，剪接的转录本来源于WT和m中的pC和pgRNA6A-无效转染（图4E）。然而，在缺氧条件下，WT转染样品中pgRNA衍生的剪接转录本的频率显着增加，这在m中并不明显6A-null样本（图4F和S2）。这些长读长测序研究强调了 m 的作用6调控缺氧HBV转录组和pgRNA剪接命运的转录后修饰。
ALKBH5 的缺氧活化影响 m6改良的 HBV 和宿主转录本
这 m6去甲基化酶ALKBH5是HIF-1α和HIF-2α的直接靶标[42–44]，在多种细胞系（包括乳腺癌和脂肪细胞）中受到缺氧调节。我们使用已发表的小鼠肝脏单细胞RNA-seq数据集研究了肝脏中ALKBH5的表达[54]。与静脉周围区域 （PV） 相比，我们观察到低氧中心周围区域 （PC） 中 Alkbh5 转录物的富集（图 5A）。注意到 HIF 靶基因 N-myc 下游调节 1 （Ndrg1） 的区带表达，而 m 的表达6去甲基化酶脂肪量和肥胖相关 （Fto） 基因在整个肝小叶中具有可比性（图 5A）。为了确定这些观察结果是否转化为我们的体外模型，我们在 2% 和 18% 氧气下培养 HepG1 细胞，并显示缺氧细胞中 ALKBH5 蛋白和基因表达增加，而 FTO 基因表达保持不变（图 5B-5C）。没有证据表明 m 的缺氧调节6写入器（METTL3、METTL14 和 WTAP）或 m6读取蛋白（YTHDF1-3）（S3图）。为了评估 ALKBH5 表达增加的功能后果，我们测量了总 m6用抗 m6A 抗体进行免疫 Northern 印迹，观察到 m 降低6A修饰的细胞RNA在缺氧条件下，与去甲基化酶表达的增加一致（图5D）。
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图 5. ALKBH5 表达的缺氧增加调节 HBV BCP-RNA 的甲基化和丰度。
(A） 基于小鼠肝脏scRNA-seq数据的RNA去甲基化酶ALKBH5、FTO和NDRG1的分区[54]。（B） HepG2-NTCP 细胞在 18% 或 1% 氧气下培养指定时间，并测量 HIF-1α、HIF-2α、ALKBH5 或 β-肌动蛋白表达。ALKBH5 表达通过密度测定法进行定量。（C） 在 5% 或 2% 氧气下培养 18 小时的 HepG1-NTCP 细胞中的 ALKBH72 和 FTO 转录水平。数据相对于管家基因 B2M 表示，并表示为 4 个实验中 n = 2 的平均值 ± S.D.。使用 Mann-Whitney 检验确定统计学意义，对多重比较进行 Bonferroni 校正，**** p < 0.0001。（D） 米6A修饰的细胞RNA。从在2%或18%氧气条件下培养1h的HepG72-NTCP细胞中提取RNA，并使用m进行免疫-northern印迹6抗体（左）。对Northern印迹进行密度定量，并表达相对于18%氧的数据。数据显示为 4 个独立实验的平均值± S.D.，使用 Mann-Whitney 检验确定具有统计学意义。* p < 0.05。（E） 甲基化 HBV BCP-RNA 的定量。HepG2-NTCP细胞用HBV WT质粒转染18h，18%或1%氧培养72h。提取总细胞RNA，进行甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）测定，并通过qPCR测量BCP-RNA和对照CREBBP RNA。数据表示为来自 6 个独立实验的 n = 3 个样本的平均值 ± S.D.，使用 Mann-Whitney 检验和 Bonferroni 校正确定统计显着性以进行多重比较。** p < 0.01。（F） HepG2-NTCP 细胞转染 siRNA （NC;非靶向，ALK;ALKBH5）6h，然后递送HBV WT质粒，并在18%或1%氧气下培养72h。 提取RNA，并通过qPCR定量BCP-RNA水平。数据相对于管家基因 B2M 表示，并表示为 9 个独立实验的 n = 3 个样本的平均值 ± S.D.。使用Mann-Whitney检验和Bonferroni校正确定统计学意义，以进行多重比较。* p < 0.05， **** p < 0.0001.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.g005
为了研究缺氧是否会改变BCP-RNA甲基化状态，我们使用了m6A-RNA免疫沉淀（MeRIP）测定与qPCR相结合，显示低氧条件下沉淀的病毒RNA显着减少（图5E）。作为对照，我们对m6A修饰的CREBBP转录本进行了PCR定量，并注意到在缺氧条件下减少（图5E）。为了研究 ALKBH5 在调节 BCP-RNA 丰度方面的潜在作用，我们用两个靶向不同外显子的独立 siRNA 沉默了去甲基化酶。我们用 siRNA #18 证实了在 1% 或 2% 氧气下培养的细胞中 siRNA 的功效，该细胞对 ALKBH5 表达的抑制作用更大（S4 图）。用任一 siRNA 沉默 ALKBH5 可减弱缺氧相关的 BCP-RNA 增加（图 5F），表明这种去甲基化酶在低氧条件下调节这些病毒 RNA 的作用。
ALKBH5 调节 HIF-α 表达
由于我们之前已经确定了 HIF 结合 HBV cccDNA 和激活转录的作用，因此我们研究了 ALKBH5 和 HIF 之间的相互作用。HIF-1α mRNA 在 HepG2 细胞中甲基化，抗 m 水平相当6在缺氧条件下观察到沉淀的转录本（S5A图）。用靶向 ALKBH2 或无关阴性对照 （NC） 的 siRNA 转染 HepG5 细胞，并在 1% 氧气下培养 24 h，以稳定 HIF 表达并激活 NDRG1 表达。用 siALKBH5 转染的细胞显示 HIF-α 亚型和 NDRG1 水平降低，而在沉默细胞中观察到相当水平的 HIF-1α 和 HIF-2α 转录本（图 6A–6B）。沉默 HepG5 细胞中的 ALKBH2 减弱了一组 HIF 靶基因（CA9、NDRG1、VEGFA、BNIP3、FUT11、GP1 和 P4HA1）的缺氧诱导，证明了这种去甲基化酶对调节 HIF 转录活性的广泛影响（图 6C）。
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图 6. ALKBH5 在缺氧条件下调节 HIFα 的表达。
(A） HIF-α 在 ALKBH5 沉默细胞中的表达。用 ALKBH2 特异性 siRNA 转染 HepG5-NTCP 细胞 48 小时，并在 1% 氧气下培养 12 或 24 小时。检测样品中的HIF-1α、HIF-2α、NDRG1、ALKBH5或β-肌动蛋白，并通过密度测定法定量表达。数据相对于 24 小时缺氧 siNC 样品表示，代表 3 个独立实验的平均值± S.D.。使用双因素方差分析确定统计学意义。* p < 0.05，** p < 0.01。（B） 通过qPCR测量HIF-1α和HIF-2α mRNA，并提供与siNC缺氧条件相关的数据。（C） HIF调控基因在ALKBH5沉默细胞中的表达。如图2E所示培养HepG5-NTCP细胞，并通过qPCR定量指示的基因转录本，数据在缺氧条件下相对于siNC表达。数据表示来自 3 个独立实验的样本的平均值±标准差。（D） HIF-1α 蛋白在 ALKBH5 沉默细胞中的表达。将HepG2-NTCP细胞在1%氧气中培养24小时，并用环己酰亚胺（CHX，20μg/ mL）或MG132（20μM）处理指定时间。收集样品，通过蛋白质印迹法检测HIF-1α、HIF-2α、ALKBH5和β-肌动蛋白。注意：上下面板使用了不同的曝光时间。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.g006
当氧气充足时，HIF-α被PHD酶羟基化，导致其泛素化和蛋白酶体降解。ALKBH5沉默对羟基化HIF-1α的水平没有重大影响（S6A图）。最近的报道显示，组蛋白脱乙酰酶4（HDAC4）调节HIF-1α蛋白乙酰化和稳定性[55\u57]，ALKBH5调节m。6胰腺癌细胞缺氧条件下HDAC4转录本的A修饰[58]。研究 ALKBH5 是否调节 HDAC4 m6A HepG2-NTCP 肝癌细胞的修饰我们在缺氧条件下在 ALKBH4 沉默细胞中沉淀甲基化的 HDAC5 mRNA。我们注意到抗m水平显着增加6在沉默的缺氧细胞中沉淀的HDAC4转录本（S6B图）。为了评估 ALKBH5 在 HIF-α 转录后调控中的作用，用 siALKBH2 #5 转染 HepG2 细胞，因为它显示出最强大的沉默。将细胞在缺氧条件下培养24h，然后用环己酰亚胺（CHX）处理以抑制蛋白质合成。CHX处理抑制HIF-1α和HIF-2α的表达，并且在没有ALKBH5的情况下加速其降解（图6D）。此外，在用蛋白酶体抑制剂MG5处理的ALKBH132耗尽细胞中，两种HIF-α亚型均被还原（图6D）。总的来说，这些数据说明了 ALKBH5 去甲基化酶在调节 HIFα 表达和功能中的作用。
讨论
我们的研究表明，m6在缺氧条件下调节BCP-RNA半衰期的修饰。感染细胞的长读长测序使我们能够准确地绘制 BCP-RNA，并且我们观察到 WT 感染细胞中 pgRNA 在缺氧条件下显着增加，这在 m 中并不明显6A-null 示例。这些长读长测序研究强调了 m 的作用6调节pgRNA剪接命运的转录后修饰。鉴于HBV转录本的重叠性质，我们无法通过qPCR区分pC和pgRNA;MeRIP 测定证实两个转录本均被甲基化。缺氧介导的 pgRNA 增加取决于 5'-m 的观察结果6修改建议了特定的识别机制。Wang等人分析了m的位置6对从缺氧HeLa细胞中分离的RNA的修饰，并报告了细胞对其m的重编程6通过改变 m 的表观转录组6特定位点的修改及其分布模式[48]。我们不能排除缺氧可能会改变其他 m6HBV RNA上的修饰位点。5'-m的突变6位于 1907 位（A 至 C）的 DRACH HBV 基序不太可能损害 HIF-1α 与位于 BCP 残基 1751-1769 处的缺氧反应元件的结合。对感染细胞中甲基化和非甲基化转录本的细胞内位置进行成像的进一步实验可能会提供机制见解。
最近的研究强调了缺氧信号与 m 之间的相互作用6A-转录后调控通路;随着 M 水平降低6A-RNA见于乳腺癌、心脏微血管内皮细胞和宫颈癌细胞[43,59]。相反，m 水平升高6在缺氧条件下，在人脐静脉内皮细胞、心肌细胞和小鼠心脏中发现了一种修饰的RNA，这些RNA与甲基转移酶METTL3表达增加有关[60–62]。总的来说，这些研究表明，m 的缺氧调节6A-RNA依赖于组织和细胞类型。与我们的观察结果一致，Wang等人报告了m的缺氧减少6人肝癌瘤Huh-7、HepG2和Hep3B细胞系中的一种修饰RNA，通过沉默ALKBH5部分逆转[48]。报告 m6一种修饰的RNA在炎症性疾病中受到干扰，突出了靶向该途径的潜在治疗作用（见[63]）。
分析已发表的小鼠肝脏单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集[54]显示Alkbh5有分带，但Fto没有分带，肝脏中央周围区域的转录本更丰富，与缺氧调节一致。ALKBH5 是一种 HIF 调节基因，在低氧条件下表达增加。ALKBH5活性还受到翻译后甲基化和SUM化修饰的调控，从而进一步控制了去甲基化酶活性[64]。我们的研究结果显示，在缺氧条件下，HBV 感染的 ALKBH5 沉默细胞中 BCP-RNA 水平降低，支持这种去甲基化酶在调节病毒感染易感性方面的积极作用。这一结论与我们之前的研究结果一致，该研究报道了HBV转基因小鼠肝脏中心周围“高ALKBH5”区域HBV抗原表达细胞的表达增加[34,35]。Liu等人报道，Alkbh5缺陷小鼠对一系列DNA和RNA病毒（VSV，HSV-1 EMCV）的感染具有抵抗力，这些病毒由m介导。6促进病毒复制的α-酮戊二酸脱氢酶（OGDH）-衣康酸通路的RNA依赖性下调[65]。作者报告说，水疱性口炎病毒感染靶向ALKBH5以逃避这种宿主限制性途径。在我们的实验中，HBV感染改变ALKBH5表达或活性的证据有限。Qu等人报道，HBx增加了ALKBH3启动子区域的H4K3me5修饰，这与去甲基化酶表达增加有关[66]。作者指出，HBV-HCC中ALKBH5表达增加，然而，没有机制研究将其与HBx直接联系起来，并且鉴于HCC的缺氧性质（见[67]），可能与HIF驱动的ALKBH5基因表达激活一致。
腺苷甲基化可以调节 mRNA 代谢的许多方面，包括剪接、核输出、稳定性和翻译。细胞中的大多数翻译事件是通过 eIF4F 蛋白复合物识别帽而发生的。然而，细胞凋亡、有丝分裂或应激反应等细胞状态可以抑制帽依赖性翻译，从而允许翻译选定的 mRNA。最近的研究报告说，应激条件，如热休克或氨基酸饥饿，促进了核运输。6读取蛋白 YTHDF1 和 YTHDF2 [68,69]，并增加 m mRNA 的帽非依赖性翻译6A修饰的5'UTR[68,70–72]。我们发现 ALKBH5 沉默降低了 HIF-α 表达而不影响 RNA 水平。ALKBH5 的沉默并没有改变羟基化 HIF-1α 的水平，这表明这种去甲基化酶不直接调节 PHD 活性，然而，需要功能酶研究来解决这种可能性。我们发现，在ALKBH6沉默细胞中，HDAC4的m5A修饰增加，这可能会影响我们肝癌模型中HIF-α蛋白的稳定性，正如先前在胰腺癌中报道的那样[58]。有报道显示，PBMR1是染色质重塑剂SWI/SNF的一个组成部分，在常氧和缺氧条件下，通过蛋白质与YTHDF1的相互作用正向调节HIF-2α翻译，当这些蛋白质沉默时，HIF表达降低[68]。这些报告与 m 的重要作用是一致的6细胞适应缺氧应激的修饰RNA。综上所述，我们的研究结果支持ALKBH5在调节HIF-1α稳定性和转录活性以及细胞适应缺氧应激中的作用。我们对 ALKBH5 和 HIF 信号交叉扰的研究结果为调节 HBV 转录本的细胞反应提供了机制见解，并可能更广泛地适用于其他肝热带病原体（图 7）。
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图 7. 缺氧条件下 HBV RNA 的 ALKBH5 调控模型。
1. 缺氧增加 ALKBH5 蛋白表达和 m6A 甲基化宿主和 HBV BCP RNA 的整体减少。2.缺氧增加HDAC4的表达，稳定HIF-1a和HIF-2a的表达，通过与基底核心启动子的结合来激活HBV转录。3. m6A甲基化减少增加HBV BCP-RNA的半衰期。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.g007
材料与方法
试剂
FG-4592 购自 Selleckchem 或 MedChemExpress。环己酰胺购自 Abcam。siRNA 购自 Thermo Fisher Scientific、MG132 和 4-硫尿苷，N-乙基马来酰亚胺购自 Sigma-Aldrich。本研究中使用的一抗是 ALKBH5 （Atlas 抗体）、β肌动蛋白 （Sigma）、HIF-1α （BD Bioscience）、HIF-2α （NOVUS）、HIF-1β （NOVUS）、NDRG1 （CST）、HBc （DAKO）、抗 m6一种多克隆抗体（突触系统）。HRP偶联的二抗购自DAKO。
细胞系
将HepG2-NTCP细胞维持在Dulbecco改良的Eagles培养基（DMEM）（ThermoFisher）中，该培养基含有补充有10%胎牛血清的Glutamax，50U / ml青霉素/链霉素和非必需氨基酸。细胞保持在 5% CO 中2和 18% 的氧气。细胞的缺氧处理在缺氧培养箱（New Brunswick Galaxy 48R，Eppendorf）或缺氧室（Invivo 400，Baker-Ruskinn Technologies）中以5%CO进行2和 1% 的氧气。
HBV的制备和感染
以HepG2细胞的上清液转染HBV1.3质粒[24]，经聚乙二醇8000沉淀制备HBV。简而言之，将培养基与 10% PEG8000/2.3% NaCl 混合，并在 4°C 下孵育 16 小时，然后在 4500°C 下以 1 rpm 离心 4 小时。 弃去上清液后，将沉淀重悬于DMEM（~200倍浓度）中。接种物在37°C下用DNase处理1h，提取DNA，qPCR定量，测定HBV基因组拷贝。将HepG2-NTCP细胞接种在胶原包被的塑料器皿上，并在300%PEG1存在下感染HBV（基于基因组拷贝的MOI为000或4,8000），持续16h。取出病毒接种物，用PBS洗涤细胞5次。感染细胞保持在<>%CO中2和 18% 的氧气和应用治疗。
转染
根据制造商的方案，使用聚乙烯亚胺 （PEI） 或 FuGENE HD 转染试剂 （Promega） 将质粒转染到 HepG2-NTCP 细胞中。ALKBH5 （#1 s29686 和 #2 s29688） 和非靶向对照 （4390844） 的 siRNA 取自 Thermo Fisher Scientific，并根据制造商的方案使用 DharmaFECT 4 转染试剂 （Horizon Discovery） 进行转染。
定量PCR
使用RNeasy试剂盒（Qiagen）提取总细胞RNA，然后用TURBO DNA-free（Thermo Fisher Scientific）处理，并根据制造商的方案使用cDNA合成试剂盒（PCR Biosystems）进行逆转录。使用QIAamp DNA kit （Qiagen）提取细胞DNA。使用 SyGreen Blue 混合物 （PCR Biosystems） 对 S2 表中列出的寡核苷酸进行基因表达定量，使用 95°C 2 分钟的 qPCR 程序，然后在 45°C 下循环 95 次，持续 5 秒，在 60°C 下循环 30 秒。通过ΔΔCt方法计算基因表达相对于管家基因β2-微球蛋白（B2M）的变化。
PacBio 长读长测序和分析
据报道，进行了HBV特异性寡核苷酸富集以及随后的长读长测序和分析[9]。简而言之，从转染 HBV HBV2.1 WT 或 m 的常氧或缺氧 HepG3-NTCP 细胞制备 RNA6A-null 构建体和 150ng 用条形码测序引物逆转录。如前所述，对HBV RNA进行寡核苷酸富集[73]。使用 Sequel II 仪器对样品进行测序，以生成 PacBio 的“Hifi 文库”。使用minimap3将reads定位到HBV参考基因组（基因型D2，ayw菌株）[8,74]。HBV读数被分配到先前报道的TSS中，以识别经典或未剪接的转录本[50]，并枚举剪接连接以识别非经典RNA[8]。未编码预期转录本长度的不完整序列和不源自 BCP 区域的剪接 RNA 未进行分析。使用 Limma 中的 Voom 函数（Bioconductor EdgeR 脚本）评估差异基因表达。测序数据可通过 NCBI 的 SRA 获得（BioProject ID：PRJNA1000182）。
细胞核、胞质溶胶和核心颗粒中 HBV BCP-RNA 的分离
用 PBS 洗涤转染 HBV2.1 质粒的 HepG3-NTCP 细胞，并在 50 mM Tris-HCl、pH 8.0 和 1% NP-40 中用蛋白酶抑制剂混合物裂解。将细胞在 4°C 下在培养板中孵育 20 分钟后，将裂解物以 5,20 x g 离心 000 分钟。沉淀是核组分，并使用Trizol提取RNA。根据Belloni等[75]描述的方案从上清液中分离HBV核心颗粒。简而言之，100 mM CaCl2、DNase I 和 RNase A 加入上清液中，并在 37°C 下孵育 2 小时。将上清液在 5 mM EDTA、7% PEG8000,1.75M NaCl 中，在 4°C 下孵育 2 小时。在20°C下以000,30×g离心4分钟后，弃去上清液，将含衣壳的沉淀重悬于TNE缓冲液（10mM Tris-HCl（pH 8）1mM EDTA，蛋白酶K）中，并使用Trizol提取RNA。为了计算胞质溶胶中的BCP-RNA水平，使用Trizol从细胞中提取总HBV RNA，并通过qPCR定量后减去细胞核和衣壳中的BCP-RNA量。
细胞外HBV DNA定量
根据上述方案对细胞外HBV DNA进行定量[76]。简而言之，将培养上清液在 37°C 下用 DNase I（赛默飞世尔科技）处理 60 分钟，然后用含有 2 mM EDTA 的 100x 裂解缓冲液（7 mM Tris-HCL （pH4.50）、0 mM KCl、25.100% Triton X-40 和 1% 甘油）处理。使用HBV rcDNA引物通过qPCR扩增HBV DNA，并根据DNA参照标准曲线进行定量。
路障qPCR
根据先前报道的方案进行Roadblock qPCR[77]。用 HBV2.1 质粒转染的 HepG3-NTCP 细胞，并在用 18 μM 1-硫尿苷 （100sU） 处理的 4% 或 4% 氧气条件下孵育 0、6、12 或 24 小时 18% 或 1% 氧气条件。使用 RNeasy （Qiagen） 试剂盒和 TURBO DNA-free 试剂盒 （Thermo Fisher Scientific） 提取总细胞 RNA，在 NEM 缓冲液 [1mM Tris/HCl （pH 54.50） 和 8mM EDTA] 中，用 0mM N-乙基马来酰亚胺 （NEM） 处理 1 μg RNA，在 42°C 下处理 90 分钟。用 20 mM DTT 终止反应，并使用 Zymo RNA Clean & Concentrator Kit 纯化 RNA。使用SuperScript III第一链合成系统（Thermo Fisher Scientific）从纯化的RNA合成cDNA，并通过qPCR分析HBV RNA。
SDS-PAGE和蛋白质印迹
样品在补充有蛋白酶抑制剂混合物片剂（罗氏）的 RIPA 缓冲液（50 mM Tris （pH 8.0）、150 mM NaCl、1% Nonidet P-40、0.5% 脱氧胆酸钠和 0.1% 十二烷基硫酸钠）中裂解。在4°C下加热95分钟之前，向样品中加入10x Laemmli还原缓冲液。在 8% 或 14% 聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质，并将其转移到活化的 0.45 μm PVDF 膜（VWR，英国）上。膜在 5% 脱脂牛奶中被封闭，并使用特定的一抗和 HRP 偶联的二抗检测蛋白质。使用 SuperSignal West Pico 化学发光底物试剂盒 （Pierce） 检测蛋白质，并在 G：Box mini （Syngene） 上收集图像。
免疫Northern测定
将 10 μg RNA 电泳到含有 1.2 M 甲醛的 2% MOPS 琼脂糖凝胶中。电泳后在紫外光下观察 18 S 和 28 S 核糖体 RNA 种类，以验证 RNA 的负载量并评估降解。用 50 mM NaOH 变性 5 分钟后，使用 20× SSC 缓冲液通过毛细管转移将 RNA 转移到尼龙膜上。UV交联后，将膜封闭在5%脱脂牛奶中，并与抗m孵育6多克隆抗体（突触系统）和 HRP 偶联的二抗。使用 SuperSignal West Pico 化学发光底物试剂盒 （Pierce） 和在 G：Box mini （Syngene） 上收集的图像实现信号。
MeRIP的
使用RNeasy（Qiagen）试剂盒和TURBO DNA-free Kit（Thermo Fisher Scientific）提取总细胞RNA，使用RNeasy试剂盒进一步纯化处理后的RNA。将 2 μg RNA 在 4°C 下与用兔 IgG 或抗 m 处理的蛋白 A 琼脂糖珠一起孵育过夜6MeRIP 缓冲液 （Tris-HCl （pH 8.0）、150 mM NaCl、0.1% NP-40、1 mM EDTA）中补充有 RNase 抑制剂 （Promega） 的多克隆抗体（突触系统）。用 MeRIP 缓冲液洗涤珠子 5 次，并用 6.7 mM m 洗脱结合的 RNA6A 钠盐。使用Qiagen RNA提取试剂盒纯化洗脱的RNA，并通过qPCR进行定量。计算 HBV BCP-RNA、CREBBP、HDAC4 和 HIF-1α 相对于输入总 RNA 的数量。
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宿主 CA9 基因表达、HBV BCP-RNA 和核心抗原缺氧增加。
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S1 图。 宿主 CA9 基因表达、HBV BCP-RNA 和核心抗原缺氧增加。
用HBV质粒转染HepG2-NTCP细胞（4h），并以18%或1%O培养2（A） 转染后 72 小时提取总细胞 DNA，测量 HBV DNA，归一化为 PrP 管家基因并相对于 HBV WT 表达。 数据以 n = 4 的平均值 ± SD 表示，来自 3 个独立实验之一。（B-C）CA3 mRNA 和 HBV BCP-RA 通过 qPCR 进行定量，相对于 B9M 管家基因表达，数据表示为 2 个独立实验的 n = 9 个样本的平均值 ± S.D.。使用非参数 （Kruskall-Wallis） 方差分析评估统计显着性，* p < 3.0，** p < 05.0 *** p < 01.0，**** p < 001.0。 （D） HBc蛋白和β-肌动蛋白的表达。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.s001
（每股收益）
S2 图。 缺氧扰乱了 HBV WT 和 m 的 TSS 使用6A-null 拼接转录本。
HBV WT 或 m 中 pC 或 pg TSS 剪接转录本的数量6测定18%或1%氧的A-null感染（S1表）。缺氧条件显示 WT 中 pgRNA TSS 的相对使用量显着增加，但 m 没有增加6A-null 样本（学生 t 检验，第 < 页 0.05）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.s002
（每股收益）
S3 图。 参与 m 的酶宿主基因表达的缺氧调控6A-修饰途径。
(A） m 示意图6与 A 相关的宿主因素。（B）m的基因表达6通过对 HepG2-NTCP 细胞的 RNA 进行测序来分析相关因素，这些细胞在 18% 或 1% 氧气中孵育 72 小时 （GSE ID： GSE186279）。RNA 水平的 Log2 倍数变化为 m6缺氧HepG2细胞中的相关因素。（C） 甲基转移酶复合物和m的表达6A结合因子。从2%或18%氧气下培养1h的HepG72-NTCP细胞中提取RNA样品，并通过qPCR分析。数据相对于 B2M 管家基因表示，并表示为 4 个独立实验的 n = 2 个样本的平均值 ± S.D.。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.s003
（每股收益）
S4 图。 ALKBH5 siRNA 的效率。
靶向 ALKBH1 的 siRNA #2 和 #5 的效率。转染 siRNA 的 HepG2-NTCP 细胞 （NC;非靶向，ALK;ALKBH5）6h，18%或1%氧培养72h，提取RNA。ALKBH5型分别通过qPCR和Western blotting检测RNA和蛋白质水平。使用 Mann-Whitney 检验评估统计学意义，对多重比较进行 Bonferroni 校正，*** p < 0.001。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.s004
（每股收益）
S5 图。 HIF-1α mRNA 甲基化。
甲基化 RNA 免疫沉淀 （MeRIP） 测定。将HepG2-NTCP细胞在18%或1%氧气中孵育72h，提取RNA，并与包被IgG或m的蛋白A琼脂糖珠孵育过夜6抗体。洗涤珠子 5 次，并用 6.7 mM m 洗脱结合的 RNA6钠盐，使用 Qiagen RNA 提取物试剂盒纯化，并通过 qPCR 测量 HIF-1α转录本。数据相对于输入的总 RNA 表示，并表示来自 4 个独立实验的 n = 2 个样品的平均值 ± S.D.。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.s005
（每股收益）
S6 图。 ALKBH1 沉默细胞中羟基化的 HIF-4α 蛋白表达和 HDAC5 mRNA 甲基化。
(A） 用 siRNA （siALKBH2-5） 转染 2 小时的 HepG6-NTCP 细胞在 1% 氧气下培养 24 小时，并用 MG132 （20 μM） 处理 4 小时。收集样品并通过蛋白质印迹法检测 HIF-1α、ALKBH5 和 β-肌动蛋白。（B） 将 HepG2-NTCP 细胞转染 siALKBH5 并在 1% 氧气下孵育 72 小时。 提取 RNA 并与蛋白 A 琼脂糖珠和 IgG 或 m 一起孵育过夜6抗体。洗涤珠子 5 次，并在 6.7 mM m 中洗脱结合的 RNA6钠盐，使用 Qiagen RNA 提取物试剂盒纯化，并通过 qPCR 测量 HDAC4 转录本。数据相对于输入的总RNA表示，表示来自6个独立实验的n = 3个样品的平均值±S.D.。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.s006
（每股收益）
S1 表。 通过长读长测序进行HBV转录本分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.s007
（XLSX）
S2 表。 用于qPCR的寡核苷酸序列。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011917.s008
（XLSX）
确认
我们感谢 Ulla Protzer（德国 TUM）提供 HBV 储备液，感谢 Stephan Urban（海德堡大学）提供 HepG2-NTCP 细胞，感谢 Azim Ansari 提供富集探针，感谢 Esther Ng 提供分析和绘制 HBV 序列的建议。
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