《免费医学论文发表-土壤传播的白根腐病原体 Rosellinia necatrix 在宿主定植期间表达抗菌蛋白》期刊简介
免费医学论文发表-土壤传播的白根腐病原体 Rosellinia necatrix 在宿主定植期间表达抗菌蛋白
抽象
Rosellinia necatrix 是一种普遍存在的土壤传播植物病原真菌，是多种寄主植物白根腐病的病原体。R 基因组资源的可用性有限。Necatrix 对其感染生物学的透彻理解变得复杂。在这里，我们对九个R进行了测序。使用牛津纳米孔测序技术的necatrix菌株，以及DNA邻近连接，我们将其中一个基因组无间隙组装成十条染色体。虽然许多丝状病原体显示出所谓的双速基因组，具有更动态和更保守的区室，但 R.Necatrix 基因组不显示这种基因组区室化。最近有人提出，真菌植物病原体可能使用具有抗菌活性的效应器来操纵宿主微生物群以促进感染。在R的预测分泌组中。Necatrix，鉴定出 26 种推定的抗菌效应蛋白，其中 <> 种在植物定植过程中表达。其中两种候选药物进行了测试，发现两者都具有选择性抗菌活性。有趣的是，一些被抑制的细菌是R的拮抗剂。necatrix在体外生长，可以缓解R。棉花植株上的Necatrix感染。总的来说，我们的数据显示，R.Necatrix 编码在宿主定植过程中表达的抗菌素，可能有助于调节宿主相关微生物群以刺激疾病发展。
作者摘要
大多数（如果不是全部）生物体，包括植物，都与生活在这些生物体内或其附近的多种微生物有关，这些微生物共同形成它们的微生物群。此外，越来越多的证据表明，微生物群是他们健康的关键决定因素。为了在宿主上引起疾病，微生物病原体需要克服宿主免疫力。可以想象，病原体需要克服微生物群对生物体健康的有益贡献。在这里，我们表明真菌白根腐病原体Rosellinia necatrix的基因组编码假定分泌的抗菌蛋白，其中许多在植物定植过程中表达。在这项研究中对其中两种蛋白质进行了功能分析，我们发现它们可以抑制拮抗R的细菌的生长。necatrix 在体外生长，可以缓解 R。棉花植株上的Necatrix感染。因此，我们建议 R.Necatrix在宿主定植期间使用抗菌剂，通过选择性操纵宿主微生物群来促进宿主感染。
数字
图10图11表1图1表2图2图3图4图5表3图6图7图8图9图10图11表1图1表2
引文： Chavarro-Carrero EA， Snelders NC， Torres DE， Kraege A， López-Moral A， Petti GC， et al. （2024） 土源性白根腐病原体 Rosellinia necatrix 在宿主定植期间表达抗菌蛋白。PLoS 病理学 20（1）： e1011866 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866
编辑 器： Sebastian Schornack，剑桥大学，英国
收到： 10年2023月27日;接受： 2023年18月2024日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2024 Chavarro-Carrero et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 基因组和基因组注释数据已通过BioProject PRJNA727191提交给NCBI。
资金： EACC 和 DET 确认收到墨西哥 CONACyT 的博士奖学金。ALM 是“Fundación Ramón Areces”资助的博士后研究员。BPHJT感谢亚历山大·冯·洪堡基金会在德国联邦教育和研究部授予的亚历山大·冯·洪堡教授席框架内的资助，并得到了德国卓越战略（EXC 2048/1）下德国研究基金会（DFG，德国研究基金会）的支持 - 项目编号：390686111。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
Rosellinia necatrix是一种普遍存在的土壤传播植物病原真菌，分布于世界各地的温带和热带地区[1]。作为白根腐病的病原体，R.Necatrix的寄主范围很广，包括至少170种双子叶被子植物，分布在63属和30科[2]。其中许多物种具有重要的经济意义，例如咖啡属（咖啡）、苹果属（苹果）、油橄榄（橄榄）、美洲柿子。（鳄梨）、李属（桃子、杏仁等）、葡萄（葡萄）[3]和蔷薇属（玫瑰）[4]。
被R感染的植物。Necatrix 通常表现出两种类型的症状。第一种类型显示在根系的地下，其中白色和黑色菌丝体菌落可能出现在受感染的根表面。当真菌穿透并定植根组织时，根部会获得深棕色[5]。第二种症状发生在地面上。这些症状会由于根系受损而迅速发展，包括叶子枯萎，通常是在一段时间的干旱或生理胁迫之后，这会影响植物的活力，最终导致植物死亡。R的症状。Necatrix 感染也可能缓慢出现，导致生长下降、叶片数量减少，以及叶子枯萎、萎黄病以及树枝和树枝死亡。在多年生植物上，这些症状会随着时间的推移而加重，当湿度和温度不利时，植物最终会死亡[5]。
各种研究已经解决了R的生物学问题。Necatrix[6,7]。然而，R.necatrix在很大程度上仍未被探索，主要是因为迄今为止基因组资源的有限可用性使对R分子生物学的研究变得复杂。Necatrix 感染。直到最近，只有单一的Illumina技术基于短读长测序的R。从日本苹果中分离出的菌株W97产生了necatrix基因组组装草图[8]。这个 44 Mb 的基因组组装是高度碎片化的，因为它由 1,209 个重叠群和 12,444 个预测的蛋白质编码基因组成 [8]。最近，从鳄梨中分离出的南非菌株（CMW50482）又发布了一个组装体，但该组装体更加分散，有1,362个重叠群[9]。
人们普遍认为，植物病原体在其寄主植物中分泌数十到数百个所谓的效应子，以刺激宿主定植[10,11]。效应子可以定义为由≤300个氨基酸组成的小的分泌蛋白，这些氨基酸富含半胱氨酸，具有通过二硫键稳定并由病原体分泌的三级结构，以促进植物宿主的疾病[12\u15]。然而，也发现较大的分泌蛋白可以作为效应子，例如几种LysM效应子[16,17]。此外，还描述了非蛋白质效应子，例如真菌次级代谢物以及递送至宿主细胞以抑制宿主免疫的小RNA（sRNA）分子[18]。许多效应子已被证明可抑制宿主免疫应答[10]。然而，最近的研究揭示了病原体效应蛋白在宿主定植中的其他功能[11]。例如，土壤传播的病原体黄萎病原体黄萎病原体大丽花（Verticillium dahliae）分泌效应蛋白，以调节寄主植物内部和土壤中宿主外部的微生物群组成，以支持宿主定植[19\u22]。其中之一是效应蛋白VdAve1，它被证明具有选择性抗菌活性，并通过抑制拮抗细菌（如Spingomonadaceae的成员）通过宿主微生物群操纵促进番茄和棉花植物的定植[19]。除了 VdAve1 之外，通过挖掘 V，还预测了另外 19 种潜在的抗菌效应蛋白候选物。大丽花分泌组，用于已知抗菌蛋白（AMP）的结构同源物[2]。其中一个候选者VdAMP19随后被发现对V有贡献。大丽花在土壤中的生存通过其在微生物竞争中的功效[3]。另一个候选药物VdAMP20通过其针对真菌生态位竞争者的抗真菌活性，促进腐烂宿主组织中微菌核的形成[1]。最近，一个与VdAve1同源的多等位基因被鉴定为VdAve1样（VdAve1L），其中VdAve2L22变体被证明编码一种效应子，该效应子通过抑制宿主微生物群中的拮抗放线菌来促进番茄定植[21]。 这些发现导致了微生物群操纵是植物病原体促进宿主定植的一般毒力策略的假设[<>]。然而，到目前为止，对于其他真菌植物病原体，缺乏这种活性的证据。
与V.相似。大丽花，也是R。Necatrix是一种土壤传播的病原体，其生命周期的至少一部分是在土壤中度过的，众所周知，土壤是一个竞争激烈且微生物丰富的环境[23]。在本研究中，我们旨在生成高质量的基因组组装来挖掘 R。necatrix 基因组用于在宿主定植期间被利用的潜在抗菌蛋白，并测试除 V 之外的其他致病真菌的假设。大丽花在宿主定植过程中也利用具有抗菌活性的效应蛋白。
结果
Rosellinia necatrix 菌株 R18 的染色体水平组装
到目前为止，两个支离破碎的 R.包含1,200多个重叠群的Necatrix基因组组装草案已公开发布[8,9]。生成更多且更连续的 R。necatrix 基因组组装，我们对 28 株 R 进行了测序。分别从墨西哥和西班牙的玫瑰和鳄梨中收集的necatrix，使用牛津纳米孔测序技术（ONT）。这导致基因组组装为18个（菌株R399）至12个（菌株CH1）重叠群（表18）。从墨西哥受感染的玫瑰植株中分离出的菌株R<>获得了最连续的组装。
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表 1. <> 种 Rosellinia necatrix 菌株的测序总结和基因组组装统计。
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为了进一步改善菌株R18的基因组组装，以超HMW（UHMW）DNA为模板进行了额外的ONT测序。此外，还进行了染色体构象捕获（Hi-C），然后进行高通量测序[24,25]。基于这些正交测序数据，我们最终将R18基因组组装成11个重叠群（表1）。使用Tapestry[26]鉴定了1个端粒区域（[TTAGGG]n）（图11A），发现1个重叠群中有11个在两端都含有端粒区域，这表明这些区域代表了完全组装的染色体，这可以通过Hi-C分析来证实（图<>B）。这 <>第，最小的重叠群不包含端粒区域，显示出明显更高的覆盖率（读取深度）（图1B），BLAST分析揭示了对真菌线粒体基因组的命中，表明该重叠群属于线粒体基因组。因此，在十个染色体重叠群中的任何一个上都找不到线粒体基因。因此，我们得出结论，我们的组装包含十条完整的染色体，这些染色体组成了核基因组，以及一条 11第构成线粒体基因组的重叠群，因此我们产生了一个无间隙的端粒到端粒的基因组组装。为了测量基因组组装的完整性，我们将BUSCO v4与子囊菌群数据集[27]一起使用，其完整性得分为97%。
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图 1. Rosellinia necatrix 菌株 R18 的基因组组装。
（A）使用Tapestry生成的基因组组装图[26]。绿色条表示重叠群大小，颜色强度与读取覆盖率相关，而红色条表示端粒，颜色强度与端粒重复次数相关。Contig 11 缺乏端粒，代表线粒体基因组。（B） 显示 Rosellinia necatrix 菌株 R18 基因组中区域间相互作用频率的 Hi-C 接触矩阵。具有高染色体间相互作用频率的十个区域表示着丝粒，并用箭头表示。
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为了进一步探索 R.在公开的RNAseq数据[18]的指导下，使用Funannotate[28]进行necatrix菌株R8组装，进行基因组注释，结果预测了11,760个蛋白质编码基因（表2）。此外，使用EffectorP预测效应基因[29]。R的组装基因组。预计 necatrix 菌株 R18 编码 1,126 种分泌蛋白，其中 192 种被预测为效应候选蛋白。BLAST检索显示，其中182种与子囊菌真菌蛋白具有同源性，其中69种具有功能域注释，其余113种被注释为假设蛋白（S1表）。最大的一组注释效应子是细胞壁降解酶，包括糖苷水解酶和碳水化合物酯酶，它们通常参与植物细胞壁降解[30,31]。还发现了携带碳水化合物结合结构域但缺乏酶结构域的效应子，特别是刀豆球蛋白 A 样凝集素和两个细胞壁完整性和应激反应成分 （WSC） 结构域的蛋白质。刀豆球蛋白A样凝集素被描述为一种毒力因子，但尚未提出分子机制[32]，而含有WSC结构域的蛋白可以通过结构强化保护真菌细胞壁，但它们对植物定植的贡献尚不清楚[33]。此外，还发现了两种赖氨酸基序（lysM）效应子，它们通常结合几丁质，并通过抑制几丁质触发的免疫或屏蔽菌丝对抗宿主来源的几丁质酶在毒力中发挥作用[34\u37]。发现四个基因编码疏水素;通过充当植物毒素[38]或促进附着在植物表面和压迫形成而与毒力有关的蛋白质[39]，尽管也有报道对宿主定植产生负面影响[40]。最后，发现了三种潜在的毒素，即一种含角质-铂蛋白结构域的蛋白质[41]和两种通常被认为对真子叶植物具有植物毒性的坏死和乙烯诱导样（NLP）效应物[42,43]（S1表）。
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表 2. Rosellinia necatrix 菌株 R18 的基因组注释。
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研究R中效应基因目录的保守性。我们在研究中测序的necatrix基因组，我们进行了BLAST搜索，以在其他每个基因组中寻找菌株R18基因组中每个预测效应基因的同源物。有趣的是，我们发现存在-缺失变异非常小，其他一些基因组中只有很少的效应基因缺失。虽然菌株 R27、R28 和 R30 携带菌株 R18 中鉴定的所有效应基因，但菌株 R10 和 R25 缺少两个，菌株 R19 缺少三个，菌株 CH12 和 Rn400 缺少 192 个预测效应基因中的四个（S2 表）。此外，我们确定了每个预测效应子的单核苷酸多态性（SNP）的比率。有趣的是，虽然菌株 Rn19 和菌株 Rn400 没有相同的效应基因，菌株 CH12 与菌株 R18 只有一个相同的效应基因，但在谱的另一端，菌株 R10 与菌株 R152 共享 18 个相同的效应基因。此外，菌株 CH0 中效应FUN_26的 SNP 比率从 12% 到 011522.12% 不等。一般来说，我们观察到西班牙菌株（Rn19、CH12、Rn400）的效应子的变异性高于墨西哥菌株（R10、R25、R27、R28、R30）（S2表）。
除蛋白质效应子外，使用antiSMASH真菌版本预测了48个次级代谢物基因簇[45]（表2）。其中13个与已知的次生代谢物簇同源，包括用于生产斯温索宁、细胞松弛素E/K、吡啶醇、恩烟酸和萘的代谢物簇，这些簇的植物毒性活性与致病性有关[46\u52]，以及与植物伸长紊乱有关的二磷酸钴酰酯[53,54]（S3表）。
缺乏独特的基因组区室化
在许多丝状病原体中，效应基因存在于重复丰富和基因稀疏的基因组区室中，而它们在重复缺失和基因密集的区域中耗尽，这些区域通常含有管家基因，这种基因组组织通常被称为双速基因组[55]。因此，我们旨在探索效应基因是否与R中的重复区域相关。Necatrix也是。有趣的是，R 中的重复内容。necatrix 菌株 R18 低 （2.39%） 且均匀分布在整个基因组中，最丰富的家族是 DNA/Helitron （67%） 和长末端重复序列 （LTR; 31%）。因此，大多数重复元素并不优先位于效应器附近（距离排列测试后p>0.05）。此外，效应基因在基因间距离较大的区域并不优先存在（图2）。因此，我们的结果不支持效应基因与R中重复丰富的区域的关联。内卡特里克斯。
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图 2. 效应基因不定位于基因稀疏区域。
'5 和 '3 侧翼 log10 的基因密度图转换了基因间距离，虚线描绘了 R 中编码的所有基因 （A） 和候选效应基因的平均基因间距离。necatrix 基因组 （B）。
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对各种丝状真菌的基因组比较揭示了广泛的染色体重排和与效应基因密切相关的结构变异（structural variant， SV）[56\u60]。因此，我们测试了效应基因是否与 R 中的 SV 相关。内卡特里克斯。首先，探索R之间的基因组多样性。necatrix菌株，一个所有基因组的系统发育树，是用Realphy（1.12版）构建的[61]。鉴定出两个簇，一个是从玫瑰中分离出的来自墨西哥的菌株，另一个是从鳄梨中分离出的来自西班牙和南非的菌株，以及从苹果中分离出的日本菌株（图3）。然后，使用 NanoSV（默认设置为 1.2.4 版;[62]），当使用菌株 R18 的无间隙基因组组装作为参考时，通过识别各种菌株的分裂和间隙对齐长读长，以定义结构变异的断点连接。我们总共检索了 2,639 个 SV，包括 1,264 个插入、1,344 个缺失、4 个反位和 27 个易位（图 3A）。每个菌株的SV数量对应于它们基于全基因组比较的系统发育关系。研究 R 中 SV 的出现。necatrix 菌株，我们计算了分析中使用的菌株中每个 SV 的频率。大多数 SV （94.2%） 由 <50% 的菌株共享，这意味着它们发生在不到 3 个菌株中。这表明SV是一种普遍现象，符合R的系统发育和地理关系。Necatrix 菌株。有趣的是，SV存在于整个基因组中（图0B），在很大程度上独立于重复区域（距离排列测试后p>05.0），但发现与效应基因密切相关（距离排列测试后p<05.63）。总的来说，我们对 R.Necatrix证实了缺乏典型的基因组区室化，这与在许多其他丝状真菌中发现的双速基因组组织有关[<>]。
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图 3. <>个Rosellinia necatrix菌株的系统发育和结构变异。
（A） 测序R的系统发育。使用Realphy[64]推断necatrix菌株。使用 1000 次 bootstrap 重复评估系统发育的稳健性，分支长度表示序列差异（具有最大 （100%） bootstrap 支持的分支以红色表示）。Rosellinia corticium 用于根植树。使用NanoSV [62]以菌株R18为参考计算结构变异的数量。（B） 显示 2,019 个 SV 沿 R 的 10 条染色体的基因组分布的圆形图。内卡特里克斯。轨迹按从外到内的顺序显示：基因密度 （10 kb）、重复密度 （10 kb）、效应基因位置、缺失、插入、倒置和易位。每个 SV 轨道的线的颜色强度描绘了 R 中的频率。Necatrix 集合。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.g003
效应器目录中的弱结构聚类
效应子不断向最佳功能进化，同时逃避植物免疫受体的识别，这被认为是效应蛋白缺乏序列保守性的原因之一。尽管缺乏序列保守性，但在各种丝状植物病原体中已经鉴定出具有三维结构的效应蛋白群，例如稻瘟病真菌Magnaporthe oryzae的MAX效应蛋白（Magnaporthe Avrs和ToxB样）家族[65]，与其他一些家族一起，也存在于黑星病真菌Venturia inaequalis中[66].据推测，MAX效应子表现出这种结构保守性，以适应质外体环境，或转运到植物胞质溶胶中[65]。调查 R.necatrix 效应子显示出类似的折叠守恒，它们的结构是用 Alphafold2 预测的，在所谓的预测局部距离差测试 （pLDDT） 中，平均质量得分为 86.1 （SD 11.8），范围从 0 到 100,100 表示完美预测。由于只有 11% 的预测结构得分低于 70，只有 2% 的得分低于 50，因此我们得出结论，R 的倍数预测。Necatrix 效应器目录通常很强大。接下来，我们对预测的效应器折叠进行了相似性聚类，发现近 40% 的效应子候选物在结构上是唯一的，而其余的效应子可以分配给总共 31 个聚类。由于这些聚类很小，平均只有四个成员，我们得出结论，R 之间发生的聚类相对较少。Necatrix 效应器。
为了检验观察到的聚类是否仅基于结构相似性，或者主要由序列守恒驱动，进一步分析了包含11至4个成员的五个最大聚类（图4B和0C）。五个聚类中的两个显示出较高的平均模板建模 （TM） 分数，分别为 85.0 和 91.0，范围为 1-43，同时还显示出相对较高的序列保守度，分别为 47% 和 21%。其他三个簇表现出较低的序列保守性，最高为0%，但结构保守性也明显较低，TM得分仅在57.0和64.<>之间，表明簇内的结构相似性与序列保守性呈正相关。因此，结构聚类可以通过效应蛋白之间的序列守恒来解释。综上所述，尽管在R中可以观察到相当多的结构效应子簇。Necatrix，它们只包含很少的成员，结构守恒主要基于序列守恒。因此，效应器家族的扩展似乎在R中只起了次要作用。Necatrix 效应器进化。
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图 4. R. necatrix 效应候选物表现出弱结构聚类，这是基于序列守恒的。
（A） 热图按基于结构相似性的分层聚类排序，根据模板建模 （TM） 分数（范围从 0 到 1）显示每个效应子对的结构相似性。效应子簇是根据相似性阈值 0.5 >识别的。五个最大的聚类用黑色方块突出显示，并按大小排序。（B）基于与簇中其他效应子相似度最高的效应子的五个簇中每个簇的示例结构。（C）五大结构效应器簇的特征。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.g004
培养滤液中的抗菌活性
最近有人提出，真菌植物病原体利用具有抗菌活性的效应器来操纵宿主微生物群以促进感染[10,11,21]。探究土源性真菌R.necatrix可能利用抗菌剂，我们首先测试了R.Necatrix 培养滤液可以抑制植物相关细菌的生长。为此，我们收集了 R。通过4.7nm过滤器过滤真菌生长9、0和45天后的Necatrix培养基，并将每种培养滤液的等分试样在95°C下热灭活10分钟。最后，将培养滤液用作来自37种植物相关细菌的多样性组合中单个细菌物种的生长培养基（S4表）。孵育过夜后，与在热灭活的培养滤液中培养的37种细菌中的4种细菌相比，7天和9天培养基滤液中的5种细菌的生长受到抑制，即淋氏芽孢杆菌、反硝化无色杆菌、鞘氨醇菌和豪恩斯黄杆菌。虽然在3天培养基滤液中未发现其中三种不再受到抑制，但B的生长。在这种滤液中，drentensis也仍然受到抑制（图<>）。鉴于热处理使抗菌活性失活，表明该活性是蛋白质性质的，我们将培养滤液通过截止值为 <> kDa 的离心柱，并测试这些滤液中 Bacillus drentensis 和 Flavobacterium hauense 的生长。有趣的是，没有一个滤液抑制细菌生长，这表明活性是由保留在离心柱中的蛋白质介导的，因为代谢物和其他小分子有望通过。总的来说，这些发现表明R.Necatrix 含有 （a） 具有选择性抗菌活性的热敏蛋白。
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图 5. Rosellinia necatrix 培养滤液可抑制特定植物相关细菌物种的生长。
（A） 在 R 中测量细菌生长随时间的变化。Necatrix 培养滤液，在真菌生长 4（红色）、7 天（灰色）和 9 天（绿色）后获得。使用真菌生长 4 天（蓝色）、7 天（黄色）和 9 天（黑色）后收集的热灭活培养滤液作为对照。（B） 在真菌生长 4 天（红色）、7 天（灰色）和 9 天（绿色）后收集的培养滤液中测量了 Bacillus drentensis 和 Flavobacterium hauense 的生长，此外，在真菌生长 3 天（黑色）、4 天（浅绿色）和 7 天（粉红色）后通过离心柱的培养滤液中，以 9 kDa 截止值测量了葡萄芽孢杆菌和豪恩斯黄杆菌的生长。实验进行了两次，误差线显示标准偏差 （n = 3）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.g005
潜在抗菌效应物候选物的预测
我们之前表明，结构预测成功地鉴定了 V 基因组中编码的抗菌效应蛋白。大丽花[19,20]。因此，我们同样挖掘了 R 的分泌组。使用Phyre18对已知抗菌蛋白的结构同源物进行necatrix菌株R2[17,19]，从而鉴定出26种具有潜在抗菌活性的候选物（表3）。随后，我们使用公开的RNAseq数据[8]来评估这些候选药物的表达，发现26个候选药物中有6个在鳄梨定植过程中高度表达（图18A）。为了进一步评估九个候选者的植物表达，我们测量了它们在R中的表达。necatrix 菌株 R6 在棉花接种时，发现 009266 个基因在棉花定植过程中高度表达（图 0100039B）。为了测试植物表达的预测分泌蛋白中的这些是否确实具有抗菌活性，我们研究了 E 中的异源蛋白生产。大肠杆菌。不幸的是，我们一再未能产生其中四种蛋白质（FUN_005751、FUN_006760、FUN_67和FUN_004580），尽管这可能被解释为潜在抗菌活性的标志[<>]，但阻碍了功能分析。然而，一种蛋白质可以成功生产和纯化（FUN_<>）。
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表 3. 预测 R 的分泌蛋白。necatrix 菌株 R18 与已知抗菌蛋白具有结构同源性。
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图 6. 在植物中表达 Rosellinia necatrix 基因，预测这些基因编码具有抗菌活性的效应蛋白。
（A） 对感染R的鳄梨植株的公开RNAseq数据进行计算机分析。Necatrix （n = 3） 揭示了 26 个编码潜在抗菌蛋白 （AMP） 的 2 个基因（以粗体显示）中高度诱导的植物。其中一些也在 R 的培养中表达。马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 体外的 necatrix （n = 14）。（B）植物中21种表达R的实时荧光定量PCR。在（A）中鉴定的necatrix基因显示，在接种后<>天和<>天的棉花定植过程中，有<>个基因表达（以粗体显示）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.g006
FUN_004580预测了与藤条链霉菌的抗真菌蛋白1（AFP1）的结构同源性[68]（图7A）。在抗真菌活性筛选中，这种蛋白质被鉴定为一种针对特定子囊菌真菌的非酶促几丁质结合抗真菌药[69]。有趣的是，在乳酸菌乳酸球菌乳酸球菌中产生功能性AFP1的尝试失败了[70]，这表明该蛋白也可能发挥抗菌活性。使用FUN_004580氨基酸序列的BLAST搜索显示~100个子囊菌真菌同源物，而HMMER搜索也揭示了链霉菌分支（Viridiplantae）中的同源物（S6表）。有趣的是，使用FUN_004580氨基酸序列的BLAST和HMMER搜索并未显示与AFP1的同源性，这支持了结构同源性，而不是序列同源性，推动了FUN_004580作为抗菌剂的预测。
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图 7. Rosellinia necatrix 效应蛋白，具有基于结构同源性的预测抗菌活性。
（A） R 的 Alphafold2 模型。necatrix 效应蛋白 FUN_004580（左）显示出与来自细菌 Streptomyces tendae（右）的抗真菌蛋白 1 （AFP1） 的结构同源性。（B） R 的 Alphafold2 模型。necatrix 效应蛋白 FUN_011519（左）显示出与植物 Amaranthus caudatus（右）的抗菌蛋白 AcAMP2 的结构同源性。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.g007
获得不依赖于异源微生物表达系统中表达的功能分析蛋白质的另一种方法是肽合成，尽管这通常仅限于短于 100 个氨基酸的序列。不幸的是，用棉花表示的所有五个效应器都大于这个尺寸。然而，在鳄梨定植过程中高度表达的九种候选物中，一种编码的蛋白质（FUN_011519）小到足以合成蛋白质（Biomatik Corporation，安大略省，加拿大）。
FUN_011519预测了与植物苋菜的抗菌蛋白AcAMP2的结构同源性[71]（图7B）。该蛋白基于与植物几丁质结合蛋白的半胱氨酸/甘氨酸富集结构域的同源性鉴定，并显示出抗真菌活性，以及对革兰氏阳性菌的活性[72]。BLAST和HMMER检索仅显示子囊菌真菌同源物，鉴定出~100种真菌蛋白（S7表）。有趣的是，使用FUN_011519氨基酸序列的BLAST和HMMER搜索并未显示与AcAMP2的同源性，这支持了在这种情况下结构同源性，而不是序列同源性，推动了抗菌药物的预测。
候选抗菌效应蛋白具有选择性抗菌活性
鉴于FUN_004580和FUN_011519是根据具有抗真菌活性的蛋白质的结构同源性鉴定的，我们测试了八种真菌的潜在抗菌活性：五种丝状真菌（黄萎病菌、链格孢菌、黄瓜枝孢菌、病毒木霉和 R.necatrix）和四种酵母（毕赤酵母、赛博林纳亚、范日氏重霉菌和红花）。有趣的是，这两种蛋白质都显示出选择性的抗真菌活性。而FUN_004580抑制了除R以外的所有丝状真菌的生长。necatrix（图8A）以及除P以外的所有酵母。pastoris（图7B），FUN_011519具有较窄的活性谱，因为它仅抑制V的生长。大丽花和A。芸苔属（图8C）和酵母C。jadinii 和 R.bogoriensis（图8D）。因此，我们得出结论，这两种蛋白质都具有明显的抗真菌活性。
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图 8. Rosellinia necatrix 效应蛋白具有抗真菌活性。
在FUN_5（004580μM）或丝状真菌（A）和酵母（B）的水存在下，或在丝状真菌（C）和酵母（D）存在下，在6%马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中生长，或存在FUN_011519（10μM）或丝状真菌（C）和酵母（D）的水。使用ImageJ量化了显微图像（n = 6）中显示的相对增长。星号表示差异显著（未配对的双侧学生 t 检验 （P<0.01））。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.g008
为了进一步研究两种预测的分泌效应蛋白FUN_004580和FUN_011519的抗菌活性，我们在 37 种细菌的多样性面板上测试了它们的活性，这些细菌跨越广泛的分类多样性，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性分类群（S4 表）。有趣的是，尽管我们发现大多数细菌的生长不受这两种蛋白质中的任何一种的影响，但一些细菌的生长显然受到阻碍。虽然FUN_004580强烈影响了苏氏黄单胞菌（Pseudoxanthomonas suwonensis）、豪恩斯黄杆菌（Flavobacterium hauense）和纤维素微杆菌（Cellulosimicrobium cellulans）的生长，并抑制了万胡恩斯黄杆菌（Chryseobacterium wanjuense）的生长，但FUN_011519抑制了德氏芽孢杆菌（Bacillus drentensis）和反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans），可能还抑制了鞘氨醇（Sphingobium mellinum）和包扎念珠菌（Candidimonas bauzanensis）（图9 ).因此，我们得出结论，两种效应器也都具有抗菌活性。总的来说，我们的数据表明，这两种效应蛋白都具有选择性抗菌活性。
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图 9. Rosellinia necatrix 效应蛋白对植物相关细菌具有选择性抗菌活性。
（A）红线表示细菌在FUN_011519（10μM）存在下生长，而蓝线表示细菌在水中生长。对于肾生芽孢杆菌，额外的橙色线表示用切断 10 kDa 的离心柱过滤的蛋白质中的细菌生长，绿线表示用切断 3 kDa 的离心柱过滤的蛋白质中的细菌生长，黄线表示热灭活蛋白质的生长。（B）红线表示细菌在FUN_004580（6μM）存在下生长，而蓝线表示细菌在水中生长。对于豪恩斯黄杆菌，额外的橙色线表示用切断 10 kDa 的离心柱过滤的蛋白质中的细菌生长，绿线表示用切断 3 kDa 的离心柱过滤的蛋白质中的细菌生长，黄线表示热灭活蛋白质中的生长。误差线显示标准偏差 （n = 3）。荤虫Exiguobacterium artemiae的生长不受任何一种蛋白质的抑制，并且显示为非抑制细菌分类群的代表。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.g009
几种植物相关细菌表现出拮抗活性
真菌用抗菌剂靶向特定微生物的一个明显原因是，由于表现出拮抗活性，这些微生物可能对真菌生长有害。测试针对 R 的此类活动。necatrix，我们在体外进行了对抗测定，在那里我们培养了 R。necatrix 靠近 37 种细菌多样性面板（S4 表）中的单个细菌物种。在这些测定中，我们观察到几种细菌物种对 R 的拮抗作用。necatrix（图 10）。有趣的是，被两种效应蛋白中的任何一种抑制的几种细菌物种都显示出对R的拮抗活性。necatrix，包括 Bacillus drentensis、Bacillus licheniformis 和 Sphingobium mellinum（受FUN_011519抑制），以及纤维素微杆菌、Chryseobacterium wanjuense 和 Pseudoxanthomonas suwonensis（受蛋白 FUN_004580 抑制）（图 10).然而，其他一些未被发现被两种效应蛋白中的任何一种抑制的细菌物种也表现出拮抗活性，即 Kaistia adipata、Pedobacter steynii、Pedobacter panaciterrae、Pseudomonas corrugata、Pseudomonas knackmusii、Solibacillus isronensis 和 Solibacillus silvestris.这些发现表明，多种植物相关细菌对R具有固有的拮抗活性。necatrix，其中一些细菌被R的效应蛋白靶向。内卡特里克斯。
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图 10. 各种植物相关细菌对 Rosellinia necatrix 具有拮抗活性。
将真菌PDA盘放置在培养皿的中心，并在其旁边，在撒布器（n = 5）的帮助下将单个细菌物种沉积在一条直线上，将细菌物种单独放置（右列）作为对照。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.g010
特异性拮抗剂可缓解棉花中的罗氏菌病
测试是否有任何被 R. 抑制的细菌物种。Necatrix 效应蛋白和表现出对真菌的拮抗活性可以抑制疾病发展，我们在存在和不存在这些细菌的情况下进行了接种测定。作为 R.Necatrix 是一种广泛的宿主病原体，我们对棉花植株进行了感染测定。为此，在14日龄的棉花cv.XLZ幼苗中接种R。necatrix 菌株 R18，在接种后两周内导致明显的疾病症状（图 11）。接下来，我们用拮抗细菌 Bacillus drentensis、Sphingobium mellinum、Cellulosimicrobium cellulans 或 Pseudoxanthomonas suwonensis 对棉花 cv. XLZ 种子进行预处理。为了证明拮抗菌对疾病发展的抑制不是由MAMP触发的宿主免疫激活引起的，我们纳入了非拮抗细菌Exiguobacterium artemiae，Candidomonas bauzanensis，Flavobacterium hauense，Achromobacter denitrificans的预处理或土壤。此外，包括所有细菌的混合物，包括拮抗和非拮抗细菌物种以及水作为对照，然后是R。Necatrix 接种。有趣的是，接种两周后，可以观察到用每种拮抗菌进行预处理导致棉花植株对 R 的敏感性降低。Necatrix与未接受细菌预处理的植物相比。由于用非拮抗菌或土壤悬浮液治疗不会减轻疾病症状，因此我们推断，用拮抗细菌治疗后疾病发展的减少不太可能是由MAMP触发的宿主免疫激活引起的，而可能是通过对真菌病原体的直接拮抗。最后，在没有病原体接种的情况下，没有细菌影响棉花植株的生长（图11）。
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图 11. 拮抗植物相关细菌可减少棉花中的白根腐病。
（A）棉花植株的顶部和侧面图片。将棉籽浸泡在拮抗细菌 Bacillus drentensis、Sphingobium mellinum、Cellulosimicrobium cellulans 或 Pseudoxanthomonas suwonensis 和非拮抗细菌 Exiguobacterium artemiae、Candidomonas bauzanensis、Flavobacterium hauense 或 Achromobacter denitrificans 的悬浮液中，所有细菌、土壤悬浮液或水的混合物作为对照。随后，用R接种胚芽（n = 10）。necatrix 菌株 R18 或模拟接种。（B） 发育迟缓的量化。星号表示 R 之间的显著差异。接种necatrix的植物和用细菌处理的植物种子（方差分析，然后进行Fisher's LSD试验（P<0.01））。实验进行了两次。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.g011
讨论
越来越多的证据支持这样一种观点，即植物可以将微生物募集到其微生物群中，从而帮助它们抵御病原体感染[73\u76]。基于这一观点，有人推测病原体已经进化到可以抵消有益微生物的募集以促进宿主定植[77]。为了支持这一假说，研究表明，土源性真菌病原体大丽黄萎病菌分泌一系列具有选择性抗菌活性的效应分子，以抑制宿主微生物群中的拮抗微生物，从而支持宿主进入[19\u21]。尽管有人推测其他真菌病原体也可能进化到调节宿主微生物群[19,21]，但迄今为止仍缺乏支持这一假说的证据。在这项研究中，我们发现土壤传播的病原体 Rosellinia necatrix 在宿主定植期间以选择性抗菌活性类似地表达预测的分泌效应蛋白。具体来说，我们发现编码效应蛋白的两个基因 FUN_004580 和 FUN_011519 在宿主定植期间表达，这些预测的分泌效应子在体外对特定的植物相关细菌和真菌表现出选择性抗菌活性。有趣的是，一些被抗菌效应蛋白抑制的细菌物种显示出对R的拮抗活性。Necatrix在体外。此外，当应用于棉花种子时，几种拮抗细菌种类可减少白根腐病。总的来说，我们的研究结果表明，R.Necatrix 在宿主定植过程中分泌抗菌效应蛋白，以调节宿主微生物群并支持疾病发展。
效应蛋白 FUN_004580 和 FUN_011519 分别基于与藤尾链霉菌 AFP1 的结构同源性和与植物苋菜 AcAMP2 的同源性。AFP1被描述为一种针对特定子囊菌真菌的非酶促几丁质结合抗真菌药[69]，最近的研究表明，从植物Carum carvi（Cc-AFP1）中分离出的AFP1同源物改变了真菌细胞膜通透性[78]。AcAMP2基于与植物几丁质结合蛋白的半胱氨酸/甘氨酸富集结构域的同源性鉴定，并显示出抗真菌活性，以及对革兰氏阳性菌的活性[72]。描述的结构同源物的抗菌机制表明，FUN_004580和FUN_011519可能参与细胞膜破坏，但需要进一步的功能研究，包括抗真菌活性测定来研究这一点。
效应蛋白FUN_004580和FUN_011519在体外对植物相关细菌和真菌物种表现出选择性抗菌活性，并显示出不同的活性谱，表明它们具有加性活性。对抗菌效应蛋白 VdAMP2 和 VdAve1 的 V 也进行了类似的观察。大丽花在土壤定植过程中相互增加的活动光谱[19]。在植物表达的效应子VdAve1、VdAve1L2和VdAMP3中也观察到不同的活性谱[19,21]。此外，在R中观察到不同植物宿主上抗菌效应子的差异表达。内卡特里克斯。在 26 个 AMP 候选者中，有 004580 个在鳄梨定植期间表达，其中 011519 个也在棉花定植期间表达。其中，FUN_004580和FUN_4在鳄梨定植过程中表达，而只有FUN_011519在棉花上表达（图<>）。不同寄主植物的表达谱表明抗菌剂在R中的表达存在差异。Necatrix，可能是由于这些植物宿主的微生物群组成不同。可能，FUN_<>进化为针对与鳄梨特别相关的微生物，或者棉花植物微生物群中不存在的微生物。
各种研究表明，植物塑造了它们的微生物群组成[79]。例如，一个负责产生硫代葡萄糖苷的基因显著改变了转基因拟南芥根部的微生物群落[80]。此外，拟南芥的ATP结合盒（ABC）转运蛋白abcg30突变体分泌富含酚类化合物且含糖较少的根系分泌物，从而产生不同的根系微生物群组成[81]。此外，A.负责防御、激酶相关活动和细胞壁完整性的拟南藻基因会影响微生物群的组成[82]。除了 A.拟南芥、不同的马铃薯和番茄植物组成不同的微生物群[83\u84]。
像 V。大丽花，R.Necatrix 是一种土壤传播的病原体，其生命周期的一部分存在于富含微生物的土壤中，在那里微生物间对有限养分的竞争非常激烈。虽然 R.necatrix 在系统发育上与 V 相关。大丽花科，都属于Sordariomycetes类，我们的研究结果表明，在土壤传播的真菌中利用抗菌效应蛋白可能是司空见惯的。然而，这种效应蛋白的使用是否仅与土壤传播的病原体有关，或者也与其他类型的植物病原体共享，目前仍然是个谜[21]。
为了进一步研究R的效应子目录。necatrix，我们研究了 R 中的效应基因。Necatrix 与重复区域相关。许多丝状植物病原体的基因组是分隔的，包括基因密集/重复缺失的区域，这些区域含有必需的和广泛保守的管家基因，以及基因稀疏/重复丰富的区域，含有快速进化的毒力相关基因[55,85,86]。但是，在 R 的情况下。Necatrix，重复含量很低，有趣的是，绝大多数重复元素并不靠近效应器。这表明 R 中的效应基因。Necatrix 与重复丰富的区域无关。与R相似。Necatrix，其他基因组被发现缺乏明显的基因组区室化，例如叶斑真菌Ramularia collo-cygni[87]，大麦白粉病真菌Blumeria graminis f.sp。Hordei [88] 和小麦条纹锈菌 Puccinia striiformis f.sp.Tritici[89]。有趣的是，虽然后两者的基因组具有高重复含量的特征，但 Ramularia collo-cygni 的基因组具有低重复含量，如 R。Necatrix[87–89]。在这些基因组中，效应基因的适应和进化被认为受效应基因座的拷贝数变异（CNV）和杂合性控制[88]。在 R 中。necatrix，我们发现插入和缺失是与效应基因相关的主要结构变异 （SV），这表明这些 SV 可能在效应基因目录的进化中发挥作用。
为了了解效应子的多样性和功能特性，我们研究了它们的3D蛋白质结构。本研究结果表明，R之间的结构聚类相对较少。Necatrix 效应器。鉴定出的五个最大的簇主要是由序列保守而不是结构相似性驱动的，这表明基于结构相似性的效应子家族扩展在R中仅起次要作用。Necatrix 效应器进化。效应蛋白结构聚类表明，许多植物病原体效应子属于不同的结构家族。例如，MAX [65]和与haustoria相关的RNase样蛋白（RALPH）[90]是具有结构相似性的效应子家族。共同的主题正在出现，如结构同源性，在某些情况下还有相似的作用模式[91]。虽然在一些病原真菌中观察到结构保守[65,90]，但序列保守是R之间结构聚类的主要驱动因素。Necatrix 效应器。未来的研究可以探索已识别的效应子簇在R中的功能意义。Necatrix 和其他植物病原体，并研究了效应蛋白进化的机制。
材料与方法
纳米孔测序和基因组组装
从1个R中提取高分子量（HMW）DNA。Chavarro-Carrero等人（2021）[92]所描述的necatrix菌株（表1），不同之处在于菌丝体是在5/004 PDB而不是Czapek Dox培养基中生长的。通过Nanodrop、Qubit分析和凝胶电泳评估DNA质量、大小和数量。根据制造商的说明（Oxford Nanopore Technologies，Oxford，UK），使用~400 ng HMW DNA使用快速测序试剂盒（SQK-RAD9）进行文库制备。加载R4.1.24流通池（Oxford Nanopore Technologies，Oxford，UK）并运行3小时，随后使用Guppy（版本1.3.0;Oxford Nanopore Technologies，牛津，英国）。使用 Porechop（默认设置为 2.4.93 版;[1]并使用Canu（8.94版;[<>].
为了获得更长的read，进行了超高分子量（UHMW）DNA提取。为此，在 DNA 沉淀后，按照制造商的方案使用 Nanobind Big DNA Kit（SKU NB-900-801-01，Circulomics，USA）来选择 >50 kb 的 DNA 片段。同时，为了对ONT读段进行纠错，在北京基因组研究所（BGI）使用DNBseq平台进行了双端短读长（150 bp）测序。使用 FMLRC 进行纠错后（默认设置为 1.0.0 版;[95]，使用Canu对ONT读数进行修整和组装。
根据制造商的方案，根据前面描述的Proximo Hi-C试剂盒（微生物）（Phase Genomics，Seattle，WA，USA）进行Hi-C，并在USEQ（荷兰乌得勒支）的NextSeq96平台上对Hi-C文库进行双端（150 bp）测序。随后，使用 Juicer（具有早期设置的 500.1 版;[6]，以及三维（97D）从头组装（3D-DNA）管道（版本3，重叠群大小阈值为180922;[1000]被使用。使用 Juicebox 组装工具 （JBAT）（版本 98.1.11;[08] 和 99D-DNA 后审查 ASM 流程 [3]。Tapestry（默认设置的版本 98.1.0;[0] 用于通过端粒序列 （[TTAGGG]n） 可视化染色体和端粒区域。
系统发育树构建和结构变异检出
使用Realphy（1.12版）[61]构建了所有测序菌株的系统发育树。简言之，使用Bowtie18（版本2.2.2，[6]）将基因组读长与菌株R64的基因组作对，并使用RAxML（版本8.2.8）[100]推断出最大似然系统发育树，使用Rosellinia corticium的基因组序列来根系。随后，为了预测SV，我们使用了NanoSV（默认设置为1.2.4版;[62]） 与作为参考的 R18 菌株相比，每个基因组。最初使用bcftools v.1.3.2过滤每个菌株的输出，使用GT = AA， QUAL>50， GQ>10， SUPPORT>20 [101]。使用SURVIVOR v.1.0.6 [102]合并结果，允许1,000 bp作为断点的最大距离，并仅考虑相同的SV类型。仅保留最小大小为 >100 bp 且最大大小为 100 kb 的 SV。使用 R/Bioconductor region v.1.8.1 软件包 [103] 计算排列测试，并使用平均距离进行 10,000 次迭代，以评估 SV 断点、TE 和效应子之间的最接近关系（bp 距离），以及循环随机化以保持染色体上区域的顺序和距离。
基因组挖掘
在公开RNAseq数据的指导下，使用Funannotate（版本1.8.13，[28]）进行基因组注释[8]。此外，分别使用 SignalP（5.0 版，[44]）、EffectorP（2.0 版，[29]）和 antiSMASH（6.0.0 版，[45]）预测分泌基因、效应基因和次级代谢物基因簇。R.尼卡特里克斯如前所述，从R18基因组中挖掘编码分泌抗菌剂的候选基因[19]。简而言之，使用Phyre2[17]挖掘预测的分泌组和效应子目录，然后进行手动整理，以搜索已知抗菌蛋白的预测结构同系物。使用Bedtools（设置：getfasta）提取基因序列[104]。随后，RNAseq数据用于确认所选候选药物的表达。为此，将RNAseq数据映射到R18组装，并使用Kallisto（版本0.46.1，默认设置，[105]）计算相对表达。
使用EDTA v.1.9.4对重复区域进行注释[106]。简而言之，我们使用了“敏感”、“无序”和“评估”选项来最大限度地提高转座元件的发现和完整性。然后，使用一个代码对TE库进行优化，以找到所有代码[107]，并且只保留了完整的LTR。
R的结构预测。Necatrix 效应器目录
效应候选物的结构预测基于缺乏信号肽的成熟氨基酸序列，Alphafold2 [108] 使用 casp14 预设。为每个候选效应子生成了五个模型，其中pLDDT得分最高的模型用于进一步分析。为了评估候选效应子之间的结构相似性，使用TM-align进行了全对全比对[109]。当成对互换的平均 TM 分数（以 0-1 量表计算）为 >0.5 时，结构被认为是相似的。使用SciPy[110]基于结构相似性的简单团聚分层聚类和最小相似性阈值为0.5来识别效应子聚类。对于111个最大的簇，平均序列同一性是通过在EMBL-EBI上使用MAFFT进行的多序列比对计算得出的[112]。通过为每个蛋白质生成 PANNZER [2] 注释，然后为每个簇手动整理共识注释来执行聚类注释。使用 PyMOL （PyMOL 分子图形系统，版本 0.<> Schr?dinger， LLC， DeLano Scientific， Palo Alto， CA， USA）生成蛋白质结构。
实时荧光定量PCR
确定在R期间编码分泌抗菌剂的候选基因的表达谱。如前所述[113]，在棉花的necatrix感染下，接种了18周龄的棉花（cv.XLZ）幼苗R。necatrix 菌株 R21 和茎的收获量高达 18 dpi。此外，菌丝体是从114日龄的R中收获的。necatrix 菌株 R5 在马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 平板上培养。如前所述进行总RNA提取和cDNA合成[3]。使用S007054表中列出的引物进行实时荧光定量PCR，使用R。necatrix 甘油醛-95-磷酸脱氢酶基因 （GAPDH;FUN_10）作为内源性对照。PCR循环条件包括初始15°C变性步骤95分钟，然后在30°C下变性60秒，在72°C下退火40秒，在<>°C下延伸<>个循环。
异源蛋白生产
将编码成熟蛋白的序列克隆到具有 N 端 His15 标签序列的载体 pET-6b 中（Novagen，Darmstadt，Germany）（引物序列，参见 S5 表）。通过测序验证所得表达载体，并用于转化大肠杆菌菌株BL21。对于异源蛋白生产，将BL21细胞在2°C的37×酵母提取物胰蛋白胨（YT）培养基中生长，以200rpm连续振荡，直到培养物达到600nm（OD600） 的 2。用 1 mM 异丙基 β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） 在 42°C 下以 200 rpm 振荡 2 小时诱导蛋白质产生。将细菌细胞沉淀，并在pH 50.10下用8mM Tris HCl和0%甘油洗涤。为了破坏细胞，它们按照由一秒超声处理组成的周期进行三次超声处理，然后在冰上放置 0.5 秒和暂停一分钟。接下来，将样品以 16,000g 离心 10 分钟。将不溶性沉淀重悬于30 mL 6 M盐酸胍（GnHCl）、pH 10.8的0 mM Tris和10 mM β-巯基乙醇中，并在室温下孵育过夜。接下来，通过以 16,000g 离心 10 分钟将碎片沉淀，并将所得蛋白质溶液转移到新管中并从 1.2 至 0.45 μm 逐步过滤。随后使用预填充的 HisTrap FF 色谱柱（Cytiva，Medemblik，荷兰）在变性条件下通过金属亲和色谱纯化蛋白质，并透析（Spectra/Por 3 透析膜，截留分子量为 10 kDa;Spectrum Laboratories， Rancho Dominguez， U.S.A） 在 pH 20.0 下对 01 体积的 10.2 M BisTris、8 mM 还原型谷胱甘肽和 0 mM 氧化谷胱甘肽进行降低，GnHCl 浓度以 24 M 至 5 M 的五个连续步骤（至少 1 小时）进行复性。最后，将蛋白质与软化水进行透析24小时，并使用Qubit（ThermoFisher Scientific，Waltham，U.S.A）测定最终浓度。
培养滤液生产
将 R. necatrix 菌株 R18 在马铃薯葡萄糖肉汤 （PDB） 中以 21°C 和 130 rpm 的速度生长。在孵育开始后 4、7 和 9 天收集培养物，并使用 0.45 nm 过滤器从培养基中分离菌丝体。将一半的培养滤液在 96°C 下热灭活 10 分钟。最后，将培养滤液储存在 -20°C 直至使用。
体外抗菌活性测定
生长试验如前所述[19]。简而言之，在溶原性肉汤琼脂 （LBA）、胰蛋白胨大豆琼脂 （TSA） 或 R2A 琼脂上在 28°C 下培养细菌菌株过夜（S4 表）。随后，选择单个菌落并在 28°C 下生长过夜，同时在低盐 Luria 肉汤 （LB） （NaCl， 130.0 g/L;胰蛋白胨，5 g/L;酵母提取物，10 g/L）。将过夜培养物重悬至OD600= 0.05 在低盐 LB 和 100 μL 中补充 100 μL 纯化的效应蛋白或培养滤液至最终 OD600= 0.025 在透明的 96 孔平底聚苯乙烯组织培养板（Greiner CELLSTAR，Sigma，Burlington，U.S.A）中。将培养板在 CLARIOstar 酶标仪（BMG LABTECH，Ortenberg，Germany）中在 25°C 下孵育，每 15 分钟振荡两次轨道，外径600每 15 分钟测量一次。
丝状真菌分离株在 22°C 下在 PDA 上生长，而对于酵母，选择单个菌落并在 5°C 的 28% PDB 中生长过夜，同时以 200 rpm 振荡。对于酵母，将过夜培养物重悬至OD600= 0.01 在补充有水、5 μM FUN_10或 011519 μM FUN_6的新鲜 004580% PDB 中。对于丝状真菌，从PDA中收获孢子并悬浮在补充有5μM FUN_10,011519μM FUN_6或水的004580%PDB中，终浓度为104孢子/mL。接下来，将 200 μL 真菌悬浮液等分到透明的 96 孔平底聚苯乙烯组织培养板（Greiner CELLSTAR，Sigma，Burlington，U.S.A）中。将平板在28°C下孵育，并使用带有EP10相机的SZX50体视显微镜（奥林巴斯，东京，日本）对真菌生长进行成像。
微生物对抗试验
将 R. necatrix 在 PDA 上生长 14 天，并使用活检打孔器（Kai Europe，Solingen，Germany）取直径为 5 mm 的菌丝体盘。单R。将 necatrix 圆盘放置在 PDA 板的中心，100 μL（OD600= 0.05） 的细菌培养物（S4 表），在 28°C 和 130 rpm 的 LB 培养基中生长过夜，用撒布器在真菌盘附近加入 （n = 5）。七天后，拍摄了照片。重复实验<>次。
生物防治试验
将 Bacillus drentensis、Sphingobium mellinum、Cellulosimicrobium cellulans 和 Pseudoxanthomonas suwonensis 在 28°C 的低盐 LB 中生长过夜，同时以 130 rpm 振荡。随后，将细菌悬浮液沉淀、洗涤并重悬至OD600= 0.05 在水中。将XLZ棉花种子用2%次氯酸钠表面灭菌16分钟，用无菌水洗涤24次，然后将细菌悬浮液浸泡8分钟。接下来，将种子转移到含有用每种细菌悬浮液润湿的滤纸的无菌培养皿中，并在室温下在黑暗中孵育。种子发芽后，将胚芽转移到温室的盆栽土壤中（22°C下光照14小时，250°C下黑暗10小时）。转移到盆栽土壤中10天后，用14日龄R的菌丝体接种幼苗。PDB中的necatrix培养。为此，将菌丝体沉淀、洗涤并重悬于 <> mL 水中。随后将该菌丝悬浮液用于棉花幼苗的根浸接种<> min，然后重新种植，并将<> mL菌丝体悬浮液倒入靠近茎的花盆上。在接种后 <> 天 （dpi） 记录疾病症状。重复实验<>次。
支持信息
R的预测效应蛋白的注释。necatrix 菌株 R18。
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S1 表。预测效应蛋白的注释内卡特里克斯菌株R18。查询 ID入藏 ID一个注解b生物c查询覆盖eE值身份 （%）d细胞壁降解酶FUN_005758XM_047973256.11,4-β-木糖苷酶木霉（Xylaria bambusicola）100%2E-140型77.49%FUN_004100XM_047973055.11,4-β-木糖苷酶木霉（Xylaria bambusicola）99%1E-123型85.37%FUN_007661XM_047977209.11,4-β-木糖苷酶木霉（Xylaria bambusicola）99%4E-129型85.85%FUN_007704XM_047978660.1乙酰木聚糖酯酶A木霉（Xylaria bambusicola）90%091.73%FUN_003106XM_047976713.1碳水化合物酯酶家族 4木霉（Xylaria bambusicola）100%078.52%FUN_001755XM_047979347.1碳水化合物酯酶家族 4木霉（Xylaria bambusicola）100%4E-162型89.27%FUN_010853XM_047976371.1纤维素单加氧酶木霉（Xylaria bambusicola）100%4E-131型87.32%FUN_008445XM_047977156.1纤维素单加氧酶木霉（Xylaria bambusicola）100%5E-153型87.39%FUN_001148XM_046148909.1角质酶微镓毛滴虫病100%8E-75型54.39%FUN_001573XM_047972062.1角质酶样蛋白木霉（Xylaria bambusicola）91%2E-97型81.18%FUN_005500XM_047972798.1糖苷水解酶家族 10木霉（Xylaria bambusicola）98%082.68%FUN_000721XM_047979386.1糖苷水解酶家族 12木霉（Xylaria bambusicola）98%2E-120型73.27%FUN_002439XM_047969089.1糖苷水解酶家族 16木霉（Xylaria bambusicola）100%1E-150型88.26%FUN_002410XM_048004698.1糖苷水解酶家族 16达尔丁尼亚100%2E-110型58.33%FUN_010054XM_047977697.1糖苷水解酶家族 17木霉（Xylaria bambusicola）98%085.76%FUN_008369XM_047932653.1糖苷水解酶家族 43Daldinia caldariorum （达尔丁尼亚）100%079.27%FUN_000284XM_047979212.1糖苷水解酶家族 43木霉（Xylaria bambusicola）100%079.88%FUN_008666XM_047975058.1糖苷水解酶家族 43木霉（Xylaria bambusicola）100%082.72%FUN_010499XM_047978711.1糖苷水解酶家族 45木霉（Xylaria bambusicola）99%2E-133型85.24%FUN_007581XM_047971870.1糖苷水解酶家族 5木霉（Xylaria bambusicola）99%084.94%FUN_004897XM_047976082.1裂解性多糖单加氧酶木霉（Xylaria bambusicola）100%3E-126型84.11%FUN_007011XM_022614464.1变位酶炭疽兰花98%3E-48型70.00%FUN_008395XM_047972336.1O-乙酰基木聚糖酯酶木霉（Xylaria bambusicola）100%3E-141型89.33%FUN_007837XM_040856674.1果胶裂解酶Pseudomassariella vexata（维萨塔假马萨里氏菌）100%6E-129型84.11%FUN_004715XM_047972211.1多糖裂解酶木霉（Xylaria bambusicola）100%4E-154型87.71%FUN_001279XM_047975706.1Polysaccharide lyase family 7 蛋白木霉（Xylaria bambusicola）100%4E-133型82.38%1
FUN_009124XM_047969579.1推定内切-1,3（4）-β-葡聚糖酶木霉（Xylaria bambusicola）99%2E-142型78.03%FUN_010529XM_047974852.1木聚糖酶木霉（Xylaria bambusicola）100%7E-129型91.41%FUN_009151XM_047976406.1含溶菌酶样结构域蛋白木霉（Xylaria bambusicola）99%1E-95型83.73%FUN_003275XM_018318865.1Muramidase（胞浆糖酶）紫花紫薇 （Purpureocillium lilacinum）92%2E-97型64.29%FUN_005762XM_047972660.1推定胞壁酰胺酶木霉（Xylaria bambusicola）99%1E-102型71.16%FUN_001575XM_047978226.1氯过氧化物酶木霉（Xylaria bambusicola）99%2E-133型76.17%碳水化合物结合FUN_003047XM_047979309.1刀豆球蛋白A样凝集素木霉（Xylaria bambusicola）99%1E-176型81.06%FUN_003763XM_047969123.1含WSC结构域的蛋白木霉（Xylaria bambusicola）88%3E-121型77.39%FUN_000265XM_047976926.1含WSC结构域的蛋白木霉（Xylaria bambusicola）100%079.34%赖氨酸基序 （LysM） 效应子FUN_000206XM_001268710.1含 LysM 结构域的蛋白克拉瓦曲霉83%4E-08型38.46%FUN_006904XM_001268710.1含 LysM 结构域的蛋白Aspesgillus clavatus（克拉瓦特阿斯吉勒斯）98%8E-25型37.84%疏水素FUN_007007XM_040863415.1Cerato-ulmin家族蛋白Pseudomassariella vexata（维萨塔假马萨里氏菌）81%1E-32型76.71%FUN_000192XM_047977015.1Cerato-ulmin家族蛋白木霉（Xylaria bambusicola）95%5E-40型82.28%FUN_001605XM_047978428.1疏水素木霉（Xylaria bambusicola）100%1E-31型57.55%FUN_011531XM_047976151.1疏水素样蛋白木霉（Xylaria bambusicola）84%6E-40型90.14%蛋白酶FUN_001370XM_047978948.1酸性蛋白酶木霉（Xylaria bambusicola）100%7E-106型65.82%FUN_004271XM_036641540.1中性蛋白酶 2 样蛋白Colletotrichum siamense99%1E-114型51.81%FUN_000625XM_033580201.1木瓜蛋白酶抑制剂Daldinia childiae 儿童大石97%2E-36型65.12%毒素FUN_002843XM_047969234.1坏死诱导蛋白结构域含蛋白质木霉（Xylaria bambusicola）100%6E-147型82.45%FUN_005483XM_046238898.1坏死诱导蛋白结构域含蛋白质Ilyonectria robusta 罗布斯塔92%3E-82型54.20%FUN_010366XM_047972065.1Cerato-platanin 家族蛋白木霉（Xylaria bambusicola）100%2E-64型80.83%别人FUN_000283XM_047980145.1脱氧核糖核酸酶 NucA/NucB木霉（Xylaria bambusicola）99%1E-124型81.73%FUN_003451XM_047976696.1鸟嘌呤特异性核糖核酸酶N1木霉（Xylaria bambusicola）100%3E-61型79.82%FUN_009264XM_047973582.1emp24/gp25L/p24 系列/GOLD-含结构域的蛋白质木霉（Xylaria bambusicola）100%9E-108型75.37%2
FUN_009552XM_047973428.1emp24/gp25L/p24 系列/GOLD-含结构域的蛋白质木霉（Xylaria bambusicola）100%4E-127型88.61%FUN_005699XM_047975004.1emp24/gp25L/p24 系列/GOLD-含结构域的蛋白质木霉（Xylaria bambusicola）100%4E-123型90.96%FUN_001432XM_047970391.12OG-Fe（II）加氧酶超家族蛋白木霉（Xylaria bambusicola）100%5E-133型75.95%FUN_011359XM_048011353.1FMN依赖性α-羟基酸脱氢酶达尔丁尼亚95%2E-69型74.10%FUN_011399KY782142.1硫代血红素过氧化物酶Ustulina deusta99%1E-124型73.33%FUN_001799XM_047970313.1茚二醇环裂解双加氧酶木霉（Xylaria bambusicola）100%074.93%FUN_009516XM_049306200.1推定胆碱脱氢酶大白桦87%3E-28型63.10%FUN_004320XM_047974920.1ERV/ALR 巯基氧化酶木霉（Xylaria bambusicola）91%1E-87型79.49%FUN_002834XM_047975475.1酰基转移酶木霉（Xylaria bambusicola）76%1E-93型78.57%FUN_006056XM_047978164.1Apc13p泛素连接酶木霉（Xylaria bambusicola）87%4E-59型65.41%FUN_005907XM_047975260.1氰病毒素-N木霉（Xylaria bambusicola）93%1E-57型66.94%FUN_006163XM_046160209.1亲环蛋白样蛋白微镓毛滴虫病100%1E-102型81.67%未知FUN_010039XM_033580564.1Bys1 结构域蛋白Daldinia childiae 儿童大石100%5E-79型82.09%FUN_005325XM_047969535.1Met-10+ 类蛋白结构域-含蛋白质木霉（Xylaria bambusicola）100%1E-95型70.79%一个存放主题的数据库登录 ID。b使用 BLAST （tblastn） 注释最佳命中。c注释同源物的生物体。d查询的标识百分比。3
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S1 表。 R的预测效应蛋白的注释。necatrix 菌株 R18。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.s001
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S2 表。 R 中预测效应基因的单核苷酸多态性比率 （SNP） 和存在-缺失变异。本研究使用 R 对 necatrix 菌株进行测序。necatrix 菌株 R18 作为参考。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.s002
（文件）
S3 表。 R的注释次级代谢物簇。necatrix 菌株 R18。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.s003
（文件）
S4 表。 本研究中使用的细菌菌株。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.s004
（文件）
S5 表。 本研究中使用的引物。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.s005
（文件）
S6 表。 将 BLAST 和 HMMER 命中注释到效应器FUN_004580。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.s006
（文件）
S7 表。 将 BLAST 和 HMMER 命中注释到效应器FUN_011519。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011866.s007
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