免费医学论文发表-复发性金黄色葡萄球菌感染的训练有素的免疫力可促进细菌持久性
抽象
细菌持久性细胞是对抗生素高度耐受的休眠表型变异的一个亚群，对感染控制提出了重大挑战。研究抗生素持续存在的机制对于制定有效的治疗策略至关重要。在这里，我们发现牛乳腺炎的耐受频率与既往感染史之间存在显着关联。上一页 S.金黄色葡萄球菌感染导致 S.金黄色葡萄球菌在随后的体内和体外感染中被利福平杀死的耐受性。实际上，训练有素的免疫力的激活有助于利福平对S的持续存在。继发感染中的金黄色葡萄球菌，它降低了抗生素治疗的有效性并增加了疾病的严重程度。从机械上讲，我们发现 S.金黄色葡萄球菌的持续性是由训练有素的免疫力引起的富马酸盐积累介导的。二甲双胍和利福平联合治疗可促进顽固性疟原虫的根除，并改善复发性 S 的严重程度。金黄色葡萄球菌感染。这些发现为训练有素的免疫力与 S 之间的关系提供了机制见解。金黄色葡萄球菌持久性，同时提供概念证明，即训练有素的免疫力是涉及持久性病原体的复发性细菌感染的治疗靶点。
作者摘要
皮肤和软组织感染 （SSTI） 是人类和动物最常见的慢性、复发和难治性疾病之一，可能与病原体持续感染有关。血流感染中大肠杆菌耐受频率与既往感染有关，但对既往感染发作如何影响后续攻击中的细菌持久性知之甚少。在这项研究中，我们确定持续性频率与牛乳腺炎的既往感染史显着相关。使用训练有素的免疫模型，我们发现训练有素的免疫促进了 S。金黄色葡萄球菌利福平在继发性激发中持续存在，这可能与富马酸盐积累有关。我们还证明，二甲双胍和利福平的联合治疗可改善 S。金黄色葡萄球菌清除率和疾病严重程度。这些数据提供了直接证据，表明靶向训练有素的免疫可能是治疗涉及持久性病原体的复发性疾病的有效策略。
数字
Fig 7图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7图1图2图3
引文： Lin X-Q， Liu Z-Z， 周 C-K， Zhang L， Gao Y， Luo X-Y， et al. （2024） 复发性金黄色葡萄球菌感染的训练免疫促进细菌持久性。PLoS 病理学 20（1）： e1011918 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918
编辑 器： Andreas Peschel，德国图宾根大学
收到： 3年2023月20日;接受： 2023年19月2024日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2024 Lin et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有数据均可在手稿和支持信息中找到。
资金： 这项工作得到了国家自然科学基金（YJY第31972682号，WC 32070119）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
金黄色葡萄球菌（S.金黄色葡萄球菌）是皮肤和软组织感染（skin and soft tissue infection， SSTI）的主要原因，SSTI是危及生命的感染（如菌血症和心内膜炎）的主要进入途径[1]。复发性 S.在SSTI后50年内，儿童和成人金黄色葡萄球菌感染的发生率高达2%[3,4]。尽管选择一线抗生素来治疗 S.金黄色葡萄球菌感染、临床治疗失败和反复感染仍然非常频繁，对人类公共卫生和反刍动物养殖业构成巨大威胁[5,<>]。
抗生素药敏试验很容易检测到抗生素耐药性，但抗生素的持久性仍然在很大程度上被低估了。事实上，抗生素耐药性的发展已成为全球公共卫生的一大问题[6]。然而，许多慢性细菌感染患者往往需要长期、周期性地给予大剂量抗生素治疗，即使临床分离株易感[7]。这些细菌持续存在于生物膜、专业和非专业细胞或其他生态位中，以保护自己不被活性抗生素杀死[8]。
抗生素持久性被定义为小细菌亚群在高杀菌药物浓度下存活的能力，细菌对高浓度的杀菌药物具有短暂的、非复制的和抗生素耐受性的。与抗生素耐药性不同，持久性不是遗传的。持久性病通常以双相杀伤曲线为特征，并在抗生素清除后恢复正常表型[9]。最近，耐受盘（Tolerance Disk， TD）试验提供了对临床分离株中细菌耐受性或持久性的简单检测[10]。多项研究表明，在各种细菌感染中，如沙门氏菌、泌尿致病性大肠杆菌、结核分枝杆菌以及链球菌等，持久性感染者发病率高。金黄色葡萄球菌是慢性和复发性感染的潜在病因，最终导致治疗失败[8,11–13]。这增加了医疗成本，并可能加速耐药性的出现[14]。因此，亟需了解S的持久性机制。金黄色葡萄球菌更彻底地开发新的有效治疗策略。
最近的一项研究报告称，耐受性 E.大肠杆菌常见于血流分离株中，与既往感染显著相关[15]。在临床葡萄球菌分离株中也发现了高水平的持久性[16]。在此，我们调查了 S 的患病率。乳腺炎奶牛的金黄色葡萄球菌持续存在，发现持续存在频率与既往感染史显着相关（S1表）。先前的 S.金黄色葡萄球菌感染已被证明可以诱导训练有素的免疫力，以防止后续感染，尤其是在复发性 S 中。金黄色葡萄球菌感染[17]。训练有素的免疫是先天免疫细胞在短暂刺激后的长期功能重编程，导致在恢复到非激活状态时对继发性攻击的反应增强，这是事实上的先天免疫记忆[18]。
在这项研究中，我们提供了先前感染导致 S 增加的证据。使用 SSTIs 模型的金黄色葡萄球菌持久性和增强的先天免疫反应。我们证明了经典的热杀死C。白色念珠菌 （HK-C.一种）-诱导的训练有素的免疫也促进了 S。金黄色葡萄球菌抗生素持续存在，可能与富马酸盐的积累有关。由于持续性是治疗失败的潜在原因，我们接下来治疗复发性S。二甲双胍（一种训练有素的免疫抑制剂）与抗生素联合使用金黄色葡萄球菌感染。我们发现二甲双胍可以抵消训练有素的免疫介导的持久性形成并改善疾病的严重程度。
结果
链球菌的耐受性流行病学。乳腺炎奶牛的金黄色葡萄球菌
乳腺炎是哺乳期妇女和奶牛中最严重的SSTI之一，从急性临床乳腺炎到慢性亚临床乳腺炎[19]。金黄色葡萄球菌是急性乳腺炎的主要原因，在慢性持续性乳腺炎感染中持续存在于乳房内[8,20]。研究 S.金黄色葡萄球菌耐受性和既往乳腺炎发生率，我们使用乳腺炎奶牛的回顾性队列来检测临床人群耐受性的流行病学。我们总共从农场获得了 90 个乳腺炎阳性牛奶样本。在阳性培养物中，76 种 （84%） 生长了 S。金黄色葡萄球菌。容差盘测试（TDtest）如前所述[15]。在分离的牛奶中，根据TDtest，有15株（15/76,19.7%）具有耐受性（图1A），表明耐受性很高。队列 1 乳腺炎奶牛的基线特征见 S1 表。相关性分析表明，耐受指数较高的乳腺炎奶牛既往感染发作频率较高（图1B）。
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图 1. 乳腺炎中的金黄色葡萄球菌耐受性可能与既往感染有关。
（A） 具有代表性的TDtest结果。将回顾性队列中的两种不同菌株接种在装有 3 个利福平盘（0.05、0.5 和 5 μg）的 Mueller Hinton 平板上，并孵育过夜。（a，c）第一次孵育后出现3个不同的抑制区（分别为小、中、大）;（b，d）向圆盘中添加营养物质和第二次孵育揭示了耐受水平的差异。（b），第二次孵育后无后期生长。（d） 抑制区内的几个菌落表明具有高度的耐受性。TDtest， Tolerance Disk Test. （B）既往感染与细菌耐受性的相关性。比值比：10.35,95% Cl：2.565-36.45。通过Fisher精确检验分析数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.g001
抗生素的持久性与先前 S 触发的宿主先天免疫保护直接相关。金黄色葡萄球菌感染
研究复发性 S 患者抗生素耐受性与宿主免疫状态的关系。金黄色葡萄球菌感染，我们比较了定植 S 的易感性。具有不同感染史的小鼠中的金黄色葡萄球菌到利福平（图2A）。我们发现，在S.无论利福平治疗如何，金黄色葡萄球菌感染的小鼠在继发性皮肤感染中都显示出皮损大小和皮肤病评分的降低（图2B和2C）。过去有S的小鼠脓肿内的细菌。金黄色葡萄球菌感染对利福平杀伤的耐受性（约39倍）高于对照小鼠（图2D和2E）。组织学分析显示表皮增生、真皮增厚、真皮胶原纤维破坏和真皮严重炎症浸润，S 的表皮和表皮严重浸润。金黄色葡萄球菌感染的小鼠。抗生素治疗有效缓解原发性S的病理损伤和炎性细胞浸润。金黄色葡萄球菌感染的小鼠，但反复感染干扰了利福平的疗效（图2F）。这些结果表明，先前的 S.金黄色葡萄球菌感染促进继发性 S 期间细菌对抗生素杀伤的耐受性。金黄色葡萄球菌皮肤感染，增加治疗难度。
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图 2. 小鼠体内感染表明 S.金黄色葡萄球菌与既往感染呈负相关。
（A） 示意图。C57BL/6J 小鼠给予皮下 （s.c.） 原发性感染 S。继发性 S 前 18 天金黄色葡萄球菌或 PBS。金黄色葡萄球菌感染 （S.C.）。RIF治疗于23 d开始，持续3 d。由 Biorender 创建。（B）小鼠23 d和26 d的皮肤病评分。 （C）在23 d和26 d测量小鼠的皮肤病变大小。 （D）感染（S.金黄色葡萄球菌）或未感染 （PBS） 小鼠在 23 天和 26 天时通过 CFU 计数确定。 （E） % S 存活率。利福平治疗后与利福平治疗前不同感染史的小鼠的金黄色葡萄球菌细胞（从 D 推断）。（F） 23 天和 26 天（放大 100 ×）时的代表性 H&E 染色皮肤切片。黑色箭头表示炎性细胞浸润。E：表皮;D：真皮;A：脂肪组织;M：肌肉纤维。S.a，S.（英语：S.A.），S.（英语：S金黄色葡萄球菌。从2个独立实验中汇总数据，每组5至6只小鼠。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， *****p < 0.0001。进行双因素方差分析或学生 t 检验方差分析，并将数据作为 SEM ±平均值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.g002
最近的研究表明，细菌持久性的诱导与宿主免疫激活显著相关，其中活性氧和活性氮可能发挥主要作用[21,22]。进一步阐明先天免疫记忆是否参与复发性 S 中抗生素耐受性的发展。金黄色葡萄球菌感染，我们研究了既往感染对腹膜巨噬细胞 （PMs） 和细胞内 S 的影响。金黄色葡萄球菌存活率（图3A），由于再生前滞后期延长，可在实验室生长板上显示为不稳定的小菌落变异（NSSCV）[23,24]。我们发现腹膜巨噬细胞从S.金黄色葡萄球菌引发的小鼠细胞内细菌水平较低，但其中大多数对利福平具有耐受性（与PBS对照组相比约为4.8倍），利福平是一种通常用于细胞内S的杀菌抗生素。金黄色葡萄球菌感染[25]（图3B、3C和S1）。此外，我们注意到细菌接种 20 小时后表型适应为小菌落变体 （SCV），表明切换到持久性表型（图 3D，左图）。这些 nsSCV 的数量在 S 的 PM 中也显着更高。金黄色葡萄球菌引发的小鼠比来自非引发小鼠的PM。（图 3D，右面板）。一致地，再生和抗生素敏感性实验显示所有 S。金黄色葡萄球菌细胞可以再生并恢复抗生素敏感性，并表现出双相杀伤特征（图3E）。瞬时表型转换表明，这些细胞内幸存者是持久性[23]。此外，炎症介质一氧化氮 （NO） 和细胞因子 TNF-α 在先前的 S 中产生。休息 3 天后，脂多糖 （LPS） 再刺激时金黄色葡萄球菌引发的巨噬细胞高于未引发的巨噬细胞（图 3F 和 26G），提示既往 S.金黄色葡萄球菌感染可激发训练有素的免疫力[<>]。总的来说，这些发现表明，先前的 S.金黄色葡萄球菌感染触发了先天免疫记忆，以防止随后的感染，而它有助于增加细菌的持久性。
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图 3. 上一页 S.金黄色葡萄球菌感染会增加抗生素在宿主巨噬细胞中的持久性。
（A） 示意图。小鼠腹膜内感染S。金黄色葡萄球菌或PBS（ip），3天后，注射3%巯基乙酸盐肉汤。4 d后收集腹膜巨噬细胞（PMs），并用活S感染30 min。金黄色葡萄球菌（MOI 25）第二天。然后洗涤板并加入庆大霉素（100μg/ mL）再30分钟以消除细胞外细菌。感染后 1 小时，加入 8 μg/mL 利福平 （RIF） 或 10 μg/mL 庆大霉素（对照），并将细胞裂解物在琼脂平板上孵育以量化细菌数量 （CFU）。另一方面，用LPS再刺激PM24 h，并获得细胞培养上清液以检测NO和TNF-α。由 Biorender 创建。（b） S的存活。PM中未感染（PBS）或感染（S.金黄色葡萄球菌）小 鼠。（c） S. 的存活率百分比。与庆大霉素对照（从B推断）相比，用利福平处理2小时的金黄色葡萄球菌细胞。（D）不稳定小菌落变异（nsSCVs）的形态和丰度。白色箭头表示左侧面板的 nsSCV。（E） 肉汤中 RIF 对指数期培养物（红色符号）或从巨噬细胞（蓝色符号）中回收的细菌的活性，暴露于 1000 × MIC RIF 中 3 小时。 （F-G） NO 和 TNF-α 用商业试剂盒测量。S.a，S.（英语：S.A.），S.（英语：S金黄色葡萄球菌。从2个独立实验中汇总数据，每组5至6只小鼠。p < 0.001、****p < 0.0001 表示各组间差异有统计学意义。对学生进行方差检验分析，并将数据作为SEM±平均值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.g003
训练有素的免疫可减少复发性 S 的细菌负荷。金黄色葡萄球菌皮肤感染，但促进抗生素持续存在
为了进一步确定抗生素的持久性是否与训练有素的免疫有关，我们建立了一种体外实验方法来模拟小鼠的先天免疫记忆（图4A）。与我们之前的研究一致[27]，HK-C。a训练的PM显示出更高的TNF-α和NO产生，在用LPS，热杀死S再刺激后，比幼稚PM更强的杀菌活性。金黄色葡萄球菌 （HK-S.a） 或感染了活 S。4天后（图4B-3D），提示HK-C.在腹膜巨噬细胞中诱导训练有素的免疫。同时，大多数细胞内S.幼稚 PM 中的金黄色葡萄球菌细胞对利福平敏感，而 HK-C 中存活的细菌对利福平敏感。训练有素的巨噬细胞对利福平具有显着的耐受性（与PBS处理的巨噬细胞相比约为3.4倍）（图4E和4F）。HK-C 中 nsSCV 的水平。与幼稚巨噬细胞相比，a训练的巨噬细胞也显着增加（图2G）。此外，细胞内 S 的耐受性和持久性。HK-C 中针对各种抗生素（即氨苄西林、卡那霉素、四环素和万古霉素）的金黄色葡萄球菌细胞。训练有素的 PM 显著高于幼稚的 PM（S3 图）。在小鼠骨髓来源的巨噬细胞中也观察到类似的现象（S<>图）。这些结果表明，训练有素的免疫力会减弱细胞内 S。巨噬细胞中的金黄色葡萄球菌负荷，但促进持久菌的形成。
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图 4. 训练有素的免疫力可促进 S 的抗生素持久性。宿主巨噬细胞中的金黄色葡萄球菌。
（A） 示意图。小鼠腹膜内感染HK-C。a或PBS（ip），3天后，注射3%巯基乙酸盐肉汤。5天后，分离腹膜巨噬细胞，并用LPS或Heat-kill S再刺激。金黄色葡萄球菌 （HK-S.a） 或再次感染活 S。金黄色葡萄球菌（S.a，MOI = 25 或 5）。收获并检测细胞样本。由 Biorender 创建。（B-D）TNF-α （B）、NO （C） 和细胞内杀伤 S。金黄色葡萄球菌 （D） 在来自 na?ve （PBS） 或 HK-C 的 PM。训练有素的小鼠，MOI = 25。（e） S. 的存活。PM中的金黄色葡萄球菌细胞来自幼稚（PBS）或HK-C。训练有素的小鼠，MOI = 2。（F） S. 的存活率百分比。与庆大霉素对照（从D推断）相比，用利福平处理25小时的金黄色葡萄球菌细胞。（G） 来自幼稚 （PBS） 或 HK-C 的 PM 中 nsSCV 的丰度。训练有素的小鼠，MOI = 0。*p < 05.0，**p < 01.0，***p < 001.0，****p < 0001.2 表示各组间差异显著。S.a，S.（英语：S.A.），S.（英语：S金黄色葡萄球菌。从5个独立实验中汇总数据，每组6至<>只小鼠。进行双因素方差分析或学生 t 检验方差分析，并将数据作为 SEM ±平均值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.g004
接下来，我们探讨了训练有素的免疫力对 S 的影响。复发性 SSTI 中的金黄色葡萄球菌持续存在。为此，用HK-C治疗小鼠。a 第 0 天和第 3 天腹膜内两次，然后皮下注射 S。第 7 天发生金黄色葡萄球菌感染，监测 5 天直至利福平治疗。（图 5A）。我们的结果表明，HK-C.治疗小鼠的皮损大小、皮肤病评分、S。金黄色葡萄球菌负担和病理损伤。（图 5B–5D 和 5L，左面板）。同时，从脓肿中获得的细菌用利福平离体攻击 4 小时以测试抗生素的持久性。我们研究了 HK-C 中利福平持久性的显着增加。与幼稚小鼠相比，训练有素的小鼠（图5E和5F），表明训练有素的免疫力强烈促进了S的增加。复发性 SSTI 中的金黄色葡萄球菌持续存在。此外，HK-C.训练有素的小鼠表现出更严重的皮肤损伤（图 5B、5C 和 5L，右图）和更高水平的 S。抗生素治疗5天后，与PBS治疗的小鼠相比，金黄色葡萄球菌负荷（图3G），表明训练有素的免疫减弱了利福平的治疗效果。S 的数量和频率。HK-C 中的金黄色葡萄球菌持久性细胞。接受或不接受抗生素治疗的训练有素的小鼠显着高于幼稚小鼠（图5H和5I）。S的动态变化。小鼠利福平治疗前后的金黄色葡萄球菌负荷在HK-C中显示出更高的利福平耐受比例（约22倍）。训练有素的小鼠与PBS处理的小鼠相比（图5J和5K）。总体而言，这些结果表明，训练有素的免疫力对利福平在随后的 S 中的持久性具有诱导作用。金黄色葡萄球菌皮肤感染。
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图 5. 训练有素的免疫增强了 S 的抗生素持久性。小鼠SSTI模型中的金黄色葡萄球菌。
（A）小鼠训练和感染模型的方案。小鼠腹膜内感染HK-C。第 0 天和第 3 天的 a 或 PBS （ip）。第7天，小鼠皮下感染S。金黄色葡萄球菌。感染后 3 天，他们接受了 RIF 治疗 12 天。在RIF处理前后收集样本进行检测。该图最初是由第一作者手绘的。感染后指定时间点不同治疗的小鼠的皮肤病变大小（B）和皮肤病评分（C）。（D） 第 8 天小鼠脓肿中的细菌负荷。（E） 使用 RIF （24 μg/mL） 对从小鼠脓肿中收获的细菌进行离体持久测定。（F） 第 12 天小鼠脓肿中持久性细胞的百分比。（G-I）第 15 天小鼠脓肿中的细菌载量 （G）、持久性测定 （H） 和持久性百分比 （I）。（J） RIF治疗前后鼠脓肿细菌载量的变化。（K） S. 的存活率百分比。与DMSO对照组相比，用利福平处理3天的金黄色葡萄球菌细胞（从J推断）。（L） H&E 染色的皮肤切片（放大倍数为 100 ×）。黑色箭头表示炎性细胞浸润。E：表皮;D：真皮;A：脂肪组织;M： 肌纤维;*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001 表示各组间差异显著。S.a，S.（英语：S.A.），S.（英语：S金黄色葡萄球菌。从2个独立实验中汇总数据，每组5至6只小鼠。进行学生t检验或单因素方差分析，数据作为SEM±均值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.g005
S的持久性。训练有素的免疫诱导的金黄色葡萄球菌可能与富马酸盐的积累有关
训练有素的免疫力的代谢标志是有氧糖酵解和TCA循环增加[18]。探究训练免疫促进S的内在机制。金黄色葡萄球菌持久性，我们对HK-C刺激的巨噬细胞进行了细胞内代谢组分析。a 或 PBS 并检查一些与糖酵解和 TCA 循环相关的基因的表达。代谢组学分析表明，主要差异代谢产物富集于柠檬酸循环（TCA循环）以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径（图6A–6C和S4）。HK-C.刺激还导致 gapdh、hk2、pfk、sdh 和 fh2 基因的 mRNA 水平升高，但 irg-1 除外（图 6D）。该基因编码免疫反应基因1（IRG1），该基因负责将TCA循环中间体顺乌头酸脱羧为衣康酸[28]。重要的是，将琥珀酸氧化成富马酸盐的琥珀酸脱氢酶 （SDH） 的 mRNA 水平在 HK-C 后显着增加。一种刺激。这与先前的研究一致，即训练有素的免疫促进TCA循环中SDH/IRG-1轴的失衡[29]。最近的研究表明，富马酸单甲酯（MMF）可以诱导训练有素的免疫表型[30]，但富马酸二甲酯（DMF）抑制炎症免疫细胞亚群中增加的有氧糖酵解[31]。既往研究还发现，富马酸二钠（DSF）可以促进大肠杆菌对抗生素的持久性[32]。这些研究表明，富马酸盐衍生物表现出不同的生物学功能。我们首先研究了这些富马酸盐衍生物在训练有素的免疫力中的潜在作用。在第 0 天用 MMF 和 DSF 刺激巨噬细胞在第 6 天再刺激时诱导 TNF-α 产生增加，而 DMF 没有诱导这种作用（图 6E）。这与MMF和DSF诱导的细胞内富马酸盐增加一致，但与DMF无关（图6F）。衣康酸二甲酯（DMI）或二甲双胍分别抑制SDH或mTOR也降低了训练巨噬细胞中TNF-α表达和富马酸盐浓度（图6F，S5和S6）。此外，我们观察到细胞内 S 的增加。用MMF和DSF训练的巨噬细胞中的金黄色葡萄球菌持久性，被DMI和二甲双胍抵消（图6G）。这些数据表明，富马酸盐是训练有素的免疫力和 S 之间的关键联系。金黄色葡萄球菌持久性。
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图 6. 训练有素的免疫介导的富马酸盐蓄积与 S 相关。金黄色葡萄球菌持久性。
从小鼠中分离PM并接种到平底板上。将细胞粘附24小时。然后，根据实验抑制剂和/或HK-C。a 已添加。孵育24小时后，用温热的PBS洗涤细胞一次，并在培养基中静置50天（中途更换一次培养基）。在第 24 天，用 4 ng/mL LPS 重新刺激细胞 6 小时或获得细胞进行代谢组分析。（A） HK-C之间主要差异代谢物的聚类热图。a 和 PBS 组。行表示不同的代谢物，列表示不同的条件 （n = 6） （B） HK-C 主要差异调节代谢途径的 KEGG 分析。a/ PBS组。（C） 描述用 HK-C 处理的巨噬细胞中主要代谢变化（填充矩形框）的 TCA 循环通路示意图。a 与第 6 天的 PBS 对比。红色，上调的代谢物和基因。绿色，下调的代谢物和基因。由 Biorender 创建。（D） LPS 再刺激前第 2 天 PM 中部分糖酵解和柠檬酸循环基因 mRNA 水平的定量实时 PCR 分析。（E） 不同富马酸盐衍生物初始刺激对LPS再刺激后TNF-α产生的影响。（F）在第3天，裂解细胞并测定富马酸盐的细胞内浓度。（G） 二甲双胍和衣康酸二甲酯对S持续频率的影响。与庆大霉素对照相比，用利福平处理 8 小时的 PM 中的金黄色葡萄球菌细胞。（H） 针对 S 的时间消磨曲线。指数期培养中的金黄色葡萄球菌与富马酸二钠（DSF）预孵育50小时，然后暴露于2μg/ mL RIF或3μg/ mL万古霉素（VAN）指定时间。S.a，S.（英语：S.A.），S.（英语：S金黄色葡萄球菌。从 0 个独立实验（每组 05 次重复）中合并数据。*p < 0.01， **p < 0.001， ***p < 0.0001， ****p < 0.05;#p < 0.01，##p < <>.<> 表示各组差异显著。进行学生t检验、单因素方差分析或双因素方差分析，数据作为SEM±平均值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.g006
进一步研究富马酸盐是否直接诱导S。金黄色葡萄球菌持久性，我们预处理S。金黄色葡萄球菌与这些富马酸盐衍生物并测试了抗生素的杀菌作用。结果表明，DSF可以显著提高S的持久性。金黄色葡萄球菌与利福平和万古霉素相比，但不包括MMF或DMF（图6H，S7A–S7D和S8A）。值得注意的是，二甲双胍显著降低了 S。金黄色葡萄球菌对利福平的持续存在，而 DMI 没有表现出这种作用（S7E、S7F、S8B 和 S8C 图）。同样，二甲双胍也降低了 S。DSF诱导的金黄色葡萄球菌对利福平和万古霉素的持续存在（S8D和S8E图）。总的来说，这些结果表明，由训练有素的免疫力触发的富马酸盐积累有可能增强 S 的形成。金黄色葡萄球菌持久性，为复发性 S 提供了新的有前途的辅助治疗靶点。金黄色葡萄球菌感染。
二甲双胍/利福平联合治疗可减轻复发性链球菌的细菌负荷和持续性。葡萄球菌SSTI的
由于二甲双胍有效抑制训练有素的免疫的能力已有充分证明[33,34]，因此我们试图评估二甲双胍/抗生素联合治疗复发性S的疗效。金黄色葡萄球菌感染模型。小鼠感染了S。再次感染前 18 天以相同剂量使用金黄色葡萄球菌，然后在再感染后 3 天进行利福平治疗 7 天（图 3A）。二甲双胍在两个时间点（再感染前或再感染后）每天给药 7 天。我们验证了之前的 S。与PBS对照组相比，整个感染期间的皮肤病变较小，皮肤病评分较低，这与既往研究结果一致（图7B和17C）[35,2]。此外，炎症因子 TNF-α 和部分关键代谢基因 sdh、gapdh、hk7 在既往 S 小鼠中上调。金黄色葡萄球菌感染反映了训练有素的免疫特征（图 7D 和 26E）。在复发性皮肤感染中，二甲双胍和利福平联合治疗的两种方法在第 7 天都比单独使用利福平治疗更大程度地减少了皮损大小、皮肤病评分、TNF-α 表达和病理损伤（图 7B-7D 和 2I）。二甲双胍治疗也下调己糖激酶基因hk7和琥珀酸脱氢酶基因sdh的mRNA表达。重要的是，联合治疗显着增强了复发性 S 的利福平杀菌活性。金黄色葡萄球菌皮肤感染（图90F）。根据总细菌负荷，联合治疗也显著减少了对利福平耐受细菌和 nsSCV 的数量（RIF 耐受性 S 为 95% 和 74%。金黄色葡萄球菌，nsSCV 为 71% 和 7%），与利福平单独治疗复发性 S 小鼠相比。金黄色葡萄球菌皮肤感染（图7G和<>H）。总体而言，这些结果表明二甲双胍对利福平治疗复发性 S 具有协同作用。金黄色葡萄球菌感染，尤其是当涉及到细菌持久性时。因此，训练有素的免疫抑制剂与抗生素治疗的联合治疗可能为复发性 S 提供一种新的策略。将来会出现金黄色葡萄球菌皮肤感染。
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图 7. 二甲双胍/利福平联合用药可降低链球菌。小鼠中的金黄色葡萄球菌负荷和持久性。
（A）小鼠皮肤感染模型方案。该图最初是由第一作者手绘的。皮损大小（B）、皮肤病评分（C）、TNF-α（D）、gapdh、hk2、sdh、fh2和irg-1的相对mRNA表达（E）、S数量。葡萄球菌在指定的时间点测量皮肤中的 CFU （F）。（g） S. 的存活率百分比。与DMSO对照相比，用利福平处理3天的金黄色葡萄球菌细胞。（H）不同处理的小鼠皮肤中nsSCVs的丰度。（I）H&E染色的皮肤切片在S后显示出严重的炎症损伤。金黄色葡萄球菌感染（放大 100 ×）。黑色箭头表示炎性细胞浸润。E：表皮;D：真皮;A：脂肪组织;M：肌肉纤维。S.a，S.（英语：S.A.），S.（英语：S金黄色葡萄球菌。从3个独立实验中汇总数据，每组5至6只小鼠。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001 表示各组间差异显著。进行单因素方差分析或双因素方差分析，数据作为SEM±平均值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.g007
讨论
Persister 细胞是生长停滞细胞的一个亚群，对致死剂量的抗生素具有短暂的耐受性，通常与慢性或复发性感染有关[36,37]。金黄色葡萄球菌 SSTI 与频繁复发有关。在这项研究中，我们进行了 S 的患病率调查。牛乳腺炎中的金黄色葡萄球菌持续存在，并显示持续性频率与既往感染史显著相关。这与最近的一项研究类似。血流感染患者的大肠杆菌耐受性与既往发作相关[15]。我们的研究还揭示了以前的 S。金黄色葡萄球菌感染导致 S.金黄色葡萄球菌在随后的体内和体外感染中被利福平杀死。既往泌尿路致病性大肠杆菌感染会诱导膀胱上皮干细胞发生训练有素的免疫应答，从而影响对复发感染的易感性[38]。此外，复发性 S.金黄色葡萄球菌皮肤感染表明，巨噬细胞赋予了训练有素的免疫特征[17]，但训练有素的免疫与细菌持久性之间的关系知之甚少。使用 HK-C.在体内和体外诱导的训练免疫模型中，我们发现训练免疫的激活有助于利福平对 S 的持久性。继发感染中的金黄色葡萄球菌，它降低了抗生素治疗的有效性并增加了疾病的严重程度。
金黄色葡萄球菌持久性通过转录组重编程转变为不稳定的小菌落变异株（NSSCV），并保持代谢活性[23,39]。在这里，我们发现细胞内 S 的集落半径存在广泛的异质性。金黄色葡萄球菌在抗生素处理后24小时立即接种。一旦抗生素压力被移除，持久性就会重新生长并产生易感种群[40]。事实上，我们观察到细胞内 S 的生长恢复和对利福平的敏感性方面表型的完全逆转。在肉汤中重新接种后来自训练有素的巨噬细胞的金黄色葡萄球菌。这些结果证明，这些细胞内S.金黄色葡萄球菌亚群是持久性。
训练有素的免疫促进了琥珀酸脱氢酶（SDH）的表达，导致细胞内富马酸的积累，进一步加速了训练效果[29,41]。在这里，我们还观察到训练后巨噬细胞中SDH表达和富马酸盐积累的显着增加。据报道，富马酸钠作为一种富马酸衍生物，可诱导抗生素在大肠杆菌中持续存在，部分原因是其末端电子受体功能[32]。在这项研究中，我们发现富马酸钠诱导了 S 的持久性。金黄色葡萄球菌到万古霉素和利福平，是MRSA感染中常用的两种抗生素。然而，其他富马酸衍生物，包括富马酸单甲酯和富马酸二甲酯，尽管它们具有显著的免疫调节特性，但并未诱导抗生素持久性。这与一些研究一致，即富马酸二甲酯可作为抗生素佐剂有效治疗 S。金黄色葡萄球菌持续性感染，由于对GAPDH的拮抗作用和糖酵解的下调[31,42,43]。然而，据报道，富马酸单甲酯具有驱动先天免疫和诱导训练免疫的功能[30,44]。有趣的是，我们研究了富马酸钠也诱导了训练有素的免疫力。因此，我们证明，由训练有素的免疫诱导的富马酸盐的积累，特别是富马酸钠，是 S 形成的重要宿主因素。金黄色葡萄球菌持久性。
富马酸盐在巨噬细胞中的积累可能以多种方式诱导持久性物质的形成。首先，暴露S。富马酸盐的金黄色葡萄球菌导致 S 中细胞内富马酸盐积累增加。金黄色葡萄球菌[32]，由于碳源转变，金黄色葡萄球菌可能触发ppGpp依赖性机制[45]。因为巨噬细胞的细胞内环境缺乏 S 的营养物质（例如葡萄糖、氨基酸等）。金黄色葡萄球菌存活时，细胞内积累的富马酸盐可能被用作第二碳源。这种碳源转变导致细胞内金黄色葡萄球菌的 ppGpp 依赖性严格反应。二、富马酸盐在硫酸中的积累。金黄色葡萄球菌细胞可能会影响电子传递链，导致质子动力 （PMF） 降低。PMF是ATP合成的驱动力[46]，对外排泵的功能至关重要[47]。S 中 ATP 水平降低。金黄色葡萄球菌细胞促进内源性蛋白质聚集体的形成，损害抗生素的外排，并增加抗生素的持久性和休眠[48]。第三，细胞内富马酸盐在S。金黄色葡萄球菌细胞可能会减少羟基自由基的产生（·哦）。羟基自由基的产生被怀疑是抗生素诱导的细胞死亡的常见机制[49\u51]。传统上， ·OH是在电子传递到氧气的过程中产生的[29]。然而，富马酸盐介导的持久性蛋白和 hipA7 突变体显示减少 ·即使细胞在有氧条件下生长，也会形成OH[32]。因此，坚持者也可以避免 ·OH的产生是通过将电子从ETC绕道到富马酸盐，就像有氧糖酵解一样。
因为药物预防 S.金黄色葡萄球菌感染是不切实际的，它对感染后的治疗非常重要。二甲双胍作为一种已知的训练有素的免疫抑制剂[34]，我们证明它可以减少巨噬细胞中富马酸盐的积累。在体外，二甲双胍还促进S的敏感性。金黄色葡萄球菌对抗生素的影响，并减弱富马酸钠诱导的抗生素持久性。然而，其潜在的机制需要进一步研究。此外，二甲双胍和抗生素的联合使用显着降低了 S 引起的皮肤感染的严重程度。金黄色葡萄球菌，表明二甲双胍可以作为对抗细菌感染的潜在抗生素佐剂。
总之，我们的研究揭示了以前的 S。金黄色葡萄球菌感染可诱导先天免疫记忆，防止继发感染，促进S。通过巨噬细胞中富马酸盐的积累而持续存在的金黄色葡萄球菌，这为结合宿主环境的药物筛选策略提供了令人信服的论据。此外，作为训练有素的免疫抑制剂，二甲双胍已被证明可以逆转训练有素的先天免疫记忆表型并降低 S 的频率。金黄色葡萄球菌持久性。最后，这项工作隐含了一个有趣的预测：抑制训练有素的免疫力和逆转抗生素耐受表型的化合物的鉴定可能代表一种新型药物，当与现有的一线抗生素联合使用时，该药物将显示出广谱协同作用。
材料与方法
道德声明
所有动物研究均须经中国吉林大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。IACUC伦理委员会审议了完整的提案，该委员会批准了动物护理和使用许可证（KT201902111）。所有实验均符合美国国立卫生研究院出版的实验动物护理和使用手册。
材料
富马酸甲酯 （MMF）、富马酸二甲酯 （DMF）、富马酸二钠 （DSF）、衣康酸二甲酯 （DMI） 和利福平购自 Macklin（中国上海）。TNF-α酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自中国神州（北京）有限公司。一氧化氮（NO）检测试剂盒购自Beyotime（中国南京）。富马酸盐检测试剂盒购自晶美生物科技（中国盐城）。
细菌生长条件
对于指数生长条件，将细菌在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中生长过夜（16小时），稀释，并在TSB中重新生长2小时。
容差性椎间盘测试
如前所述进行了耐受盘（TD）测试，并进行了一些修改[15]：将生长过夜的细菌培养物调整至0nm处的光密度为1.600（OD600）。将100μl细菌悬浮液均匀地接种在Mueller Hinton琼脂平板上，并将10μl利福平溶液移液到空白的抗菌药敏Oxoid圆盘上。圆盘上利福平的最终量为0.05μg，0.5μg和5μg，并将板在37°C下孵育过夜18小时（步骤I）。在步骤II中，将10μl含有40%葡萄糖和20%酪蛋白氨基酸混合物的溶液加入抗生素盘中，并将板在37°C下再孵育18小时。如果在步骤II之后抗菌区内出现超过20个微菌落，则菌株被定义为“耐受性”。
训练有素的免疫模型
C57BL / 6J小鼠腹膜内注射100μlHK-C。一个 （1×106CFU） 或 PBS 分别在 -7 天和 -4 天。腹膜巨噬细胞在腹膜注射后3天通过腹膜灌洗从小鼠身上收获，在-4天内用3mL 3%巯基乙酸酯。将 PM 接种在补充有 96% 胎牛血清 （FBS） 和抗生素（青霉素-链霉素;Gibco）在 1640°C/10% CO 的加湿培养箱中过夜2.第二天，用LPS（100 ng/mL;大肠杆菌O55：B5;Sigma-Aldrich）、HK-S.a （MOI 5） 在 RPMI 1640 中持续 24 小时。收获上清液用于定量TNF-α和一氧化氮释放。
肉汤实验
对于时间消磨曲线，S.将金黄色葡萄球菌在TSB肉汤中生长过夜，在新鲜培养基中稀释至起始OD 600 nm为0.01，并生长至指数期中期。将培养物在 PBS 中洗涤两次，重悬于新鲜的 TSB 培养基中，并稀释至 5 × 10 的起始接种物8CFU/mL 并暴露于不同倍数 MIC 的利福平，持续指定时间。对于CFU计数，样品在接种在胰蛋白酶大豆琼脂上之前用PBS稀释。数据表示为每mL裂解物log10 CFU。
细胞内持久性模型
感染遵循Peyrusson F等[40]改编的方案进行。简而言之，灌注或非灌注 PM（2 × 105）接种到24.0 mL培养基中的5孔板中，并用S感染。葡萄球菌USA300 在 25 的多重感染下持续 30 分钟以允许吞噬作用。然后用PBS洗涤细胞，在补充有30μg/ mL庆大霉素（Sigma）的RPMI 37中，在1640°C下孵育100分钟，以消除未吞噬的细菌。通过在PBS中洗涤来消除庆大霉素，然后在37μg/mL庆大霉素（防止细胞外生长;对照条件）或利福平在1640 × MIC存在下，在10°C下将细胞与10%FBS中重新孵育1000%FBS，指定时间。然后用PBS洗涤细胞，并用含有0.1%（w / v）Triton X-100（Sigma）的PBS裂解以释放细胞内细菌。裂解物在PBS中连续倍数稀释，然后接种在胰蛋白酶大豆琼脂上。对CFU进行计数并确定菌落表型。数据表示为每mL裂解物log10 CFU。
小鼠感染模型
将已启动或未启动的 C57BL/6J 小鼠注射到 S 的侧翼。如前所述，金黄色葡萄球菌诱导脓肿形成[1]。根据治疗方案，在感染后5天或8天杀死小鼠。使用前面描述的评分系统以盲法评估皮肤[52]。将皮肤样品固定在10%福尔马林中，并进行H&E处理，通过使用RIF进行持久性测定来测定Persister水平。
Persister 检测
大约 1 × 107将CFU/mL细菌接种在补充有利福平（1000 × MIC）的TSB肉汤中。4小时后，通过CFU计数确定细菌存活率，并相对于接种物进行计算。指数期细菌用于测试基线生存水平。
没有生产
通过Griess反应测量一氧化氮（NO）的生成。根据NO测定试剂盒（Beyotime S0021S）上的指示测量培养上清液的NO产生量。
代谢组分析
将腹膜巨噬细胞接种在90mm细胞培养皿中，每种培养皿1个培养皿。用温热的PBS洗涤后，仅将PM作为阴性对照或<>%体积的HK-C与培养基一起孵育。a （外径600纳米= 1）24小时（在10%混合胎牛血清中）。用 2 mL 温热的 PBS 洗涤细胞一次，并在含有 5% 血清的培养基中孵育 10 天，更换培养基一次。对细胞进行胰蛋白酶消化并对活细胞进行计数。将细胞沉淀物（约 10^7 个细胞）快速冷冻并储存在 ?80°C 直至代谢物分析。在提取液（MeOH：CAN：H2O，2：2：1 （v/v））中提取代谢物，并采用液相色谱-串联质谱联用（LC-MS/MS）进行分析。使用UHPLC系统（Vanquish，Thermo Fisher Scientific）和Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm）与Orbitrap Exploris 120质谱仪（Orbitrap MS，Thermo）联用进行LC-MS/MS分析。流动相为25 mmol/L的醋酸铵和25 氢氧化氨的水溶液（pH = 9.75）（A）和乙腈（B）溶液。自动进样器温度为4°C，进样体积为2 μL。Orbitrap Exploris 120 质谱仪之所以能够通过采集软件（Xcalibur、Thermo）的控制，在信息相关采集 （IDA） 模式下采集 MS/MS 谱图。在这种模式下，采集软件会连续评估完整的扫描MS谱图。ESI源条件分别为：鞘气流速为50Arb，辅助气流速为15 Arb，毛细管温度为320°C，全MS分辨率为60000，MS/MS分辨率为15000，碰撞能量：SNCE 20/30/40，喷雾电压为3.8 kV（正）或-3.4 kV（负）。
使用 ProteoWizard 将原始数据转换为 mzXML 格式，并使用内部程序进行处理。它是使用 R 开发并基于 XCMS 开发的，用于峰检测、提取、比对和积分。R软件包和BiotreeDB（V3.0）应用于代谢物鉴定[53]。
RT-PCR检测
使用 TRIzol 试剂 （Takara） 从培养的细胞中分离 RNA，并使用高容量逆转录试剂盒（Applied Biosystems，Bleiswijk，荷兰）逆转录为 cDNA。在 Quantstudio 3 上进行 RT-PCR。使用预先设计的引物组的实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems）。管家基因 β-肌动蛋白用于标准化每个样本的 CT 值。使用 2 计算相对 mRNA 量-ΔΔCt（折数变化）方法，如图例所示。
统计分析
Graphpad Prism 8.3（Graphpad Software，La Jolla，CA，USA）用于图形设计和统计分析。根据数据分布，采用独立样本 Student's t 检验、单因素方差分析或双因素方差分析，然后进行 Bonferroni 事后分析来比较两组或多组。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。
伦理批准
所有动物研究均须经中国吉林大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。IACUC伦理委员会审议了完整的提案，该委员会批准了动物护理和使用许可证（KT201902111）。所有实验均符合美国国立卫生研究院出版的实验动物护理和使用手册。
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针对 S 的时间杀伤曲线。在指定时期内暴露于不同浓度的利福平的指数期培养物中的金黄色葡萄球菌。
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S1 图。 针对 S 的时间杀伤曲线。在指定时期内暴露于不同浓度的利福平的指数期培养物中的金黄色葡萄球菌。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.s001
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S2 图。 腹膜巨噬细胞中金黄色葡萄球菌对不同抗生素的持续性。
（A） 测定小鼠腹膜巨噬细胞中细胞内不稳定的小菌落变异 （nsSCV）。（B） S的抗生素耐受频率。来自幼稚 （PBS） 和 HK-C 的 PM 中的金黄色葡萄球菌。训练有素的小鼠使用不同的抗生素。VAN，万古霉素。AMP，氨苄西林。KAN，卡那霉素。TET，四环素。S.a，S.（英语：S.A.），S.（英语：S金黄色葡萄球菌。从 3 个独立实验（每组 3 次重复）中合并数据。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001 表示各组间差异显著。进行双因素方差分析，数据作为SEM±平均值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.s002
（TIF）
S3 图。 金黄色葡萄球菌在小鼠骨髓源性巨噬细胞 （mBMDM） 中对利福平治疗的持续存在。
（A） mBMDM中细胞内不稳定小菌落变异的测定。（B）利福平耐受频率为S。用PBS或HK-C预处理的mBMDM中的金黄色葡萄球菌。一种。一个，S。金黄色葡萄球菌。从 3 个独立实验（每组 3 次重复）中合并数据。**p < 0.01、***p < 0.001 表示各组间差异显著。进行单因素方差分析，并对数据进行±SEM的平均值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.s003
（TIF）
S4 图。 HK-C刺激巨噬细胞的代谢组分析。a 通过非靶向代谢组分析。
（A） PBS 和 HK-C 之间的主成分分析 （PCA） 评分图和 （B） 差异代谢物的火山图 （p < 0.05）。A处理的巨噬细胞。（C-H）与 PBS 与 HK-C 的 TCA 循环相关的差异代谢物的箱形图。A处理的巨噬细胞。n = 每组 4 个生物学重复。*p < 0.05，**p < 0.01 表示各组间差异显著。对学生进行方差检验分析，并将数据作为SEM±平均值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.s004
（TIF）
S5 图。 DMI 和 Met 对训练有素的免疫力的影响。
（A-B）用HK-C训练小鼠腹膜巨噬细胞。a或在存在或不存在SDH抑制剂（DMI）或mTOR抑制剂（Met）的情况下在培养基中放置24小时。5 天后，用 LPS 重新刺激细胞以确定 NO （A） 和 TNF-α （B） 的产生。数据显示为SEM±平均值，数据汇集自3个独立实验，每组3次重复。使用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验确定显著性;*p < 0.05，***p < 0.001，****p < 0.0001。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.s005
（TIF）
S6 图。 使用 CCK8 测定的体外细胞毒性实验。
腹膜巨噬细胞在不同浓度条件下分别用MMF（A）、DMF（B）、DSF（C）、DMI（D）和Met（E）处理。每个数据都表示为SEM±均值。 使用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验确定显著性;*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001 与对照组。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.s006
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S7 图。 富马酸盐衍生物、DMI 和二甲双胍对 S 的细胞毒性。金黄色葡萄球菌。
（A）富马酸及其衍生物的结构式。（B-F）S的生长曲线。指数期培养的金黄色葡萄球菌与不同浓度的 MMF （B）、DMF （C）、DSF （D）、Met （E） 和 DMI （F） 共同孵育。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.s007
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S8 图。 预先暴露于富马酸盐衍生物或训练有素的免疫抑制剂对 S 的影响。金黄色葡萄球菌持续性水平。
（A） S的时杀曲线。金黄色葡萄球菌与 MMF、DMF 和 DSF 预孵育，然后进行利福平处理。（B-C）S的存活细胞比例。在用利福平或万古霉素二次治疗指定时间后，用 DMI （B） 或 Met （C） 预处理金黄色葡萄球菌。（D-E）S的存活细胞比例。金黄色葡萄球菌用 DSF 预处理，Met，在用利福平 （D） 或万古霉素 （E） 二次处理指定时间后。使用双因素方差分析和Tukey多重比较检验确定显著性;*p < 0.05，***p < 0.001，****p < 0.0001。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.s008
（TIF）
S1 表。 乳腺炎奶牛的基线特征。金黄色葡萄球菌感染。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.s009
（文件）
S1 数据。 Excel 电子表格，在单独的工作表中包含图 1-7 和 S1-S8 中显示的数据点。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011918.s010
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确认
我们感谢所有完成这项工作的人。
引用
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