免费医学论文发表-靶向猪链球菌的未突变但 T 细胞依赖性 IgM 抗体在细菌清除中起着至关重要的作用

抽象

猪链球菌血清型 2 是一种重要的荚膜细菌性猪病原体和人畜共患病原体，目前尚无有效的疫苗。与 B 细胞的相互作用和对 S 的体液反应。尽管 SUI 可能与潜在疫苗相关，但人们对它们知之甚少。我们评估了生发中心（GC）B细胞动力学，以及S的产生和作用。小鼠模型中感染后的 SUIS 特异性抗体。我们发现感染了 S.suis 在感染后 13-21 天达到 GC 峰值。GC 进一步增加并持续存在，在模拟猪场真实生活条件的周期性再感染中。反S。苏伊斯产生了 IgM 和几个 IgG 亚类，但产生了针对 S 的抗体。荚膜多糖（CPS）主要为IgM。有趣的是，野生型小鼠血清中总IgG的消耗对体外调理吞噬作用的细菌杀伤没有影响。体细胞超突变和同种型转换对于控制感染或抗CPS IgM的产生是可有可无的。然而，T 细胞缺陷 （Tcrb-/-） 小鼠无法控制菌血症，产生最佳的抗 CPS IgM 滴度，或引发具有调理吞噬活性的抗体。SAP缺乏可阻止GC形成，但不能阻止滤泡外B细胞反应，消融抗S。suis-IgG 的产生，但维持了 IgM 的产生并消除了感染。相比之下，B细胞缺陷小鼠无法控制菌血症。总的来说，我们的结果表明，抗体反应在对 S 的免疫中起着重要作用。suis，GC 非依赖性但 T 细胞依赖性种系 IgM 是主要的有效抗体特异性。我们的研究结果进一步强调了 IgM 和潜在的抗 CPS 抗体在清除 S 中的重要性。suis 感染，并为 S 的未来发展提供见解。SUIS疫苗。

作者摘要

猪链球菌是一种重要的细菌病原体，会影响猪，并可导致人类严重感染。迄今为止，市面上尚无有效的预防链球菌的疫苗。SUIS感染。更糟糕的是，人们对细菌如何与B细胞相互作用知之甚少，B细胞是产生保护性抗体的细胞。在这项工作中，我们试图更好地了解感染后抗体是如何产生的，它们的具体靶点是什么，以及哪些抗体在消除细菌中起着重要作用。为此，我们首先在小鼠中进行了感染和免疫试验，以表征抗体反应如何发展。在此之后，我们测试了各种遗传特征的小鼠，以评估重要基因和细胞类型在产生有用抗体中的作用。本研究获得的结果表明，IgM抗体，例如能够靶向细菌保护壳的抗体，在S中起着重要作用。SUIS消除。本研究中获得的知识可以更好地了解针对 S 的免疫反应如何发展。suis 并为 S 疫苗的未来开发带来见解。苏伊斯。

数字

Fig 7图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7图1图2图3

引文： Dolbec D、Lehoux M、de Beauville AA、Zahn A、Di Noia JM、Segura M （2024） 靶向猪链球菌的未突变但 T 细胞依赖性 IgM 抗体在细菌清除中起着至关重要的作用。PLoS 病理学 20（1）： e1011957 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011957

编辑 器： 拉克希米·拉贾戈帕尔，华盛顿大学，美国

收到： 27年2023月8日;接受： 2024年19月2024日;发表： <>月 <>， <>

版权所有： ? 2024 Dolbec et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。

资金： 这项工作主要由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）项目资助（编号342150）支持。国际发展研究中心（IDRC）对MS（第109047号）的赠款和加拿大卫生研究院对JDN的项目赠款（PJ-166028）提供了额外的支持。D.D. 还是魁北克自然与技术研究基金会 （FRQ-NT） 博士研究奖学金 （# 268339） 的获得者，以及由 FRQ-NT （# RS-170946） 支持的猪和家禽传染病研究中心 （CRIPA） 奖学金的获得者。J.D.N. 得到了魁北克健康基金会 （FRQ-S） 的优秀奖学金的支持。M.S. 是加拿大研究主席 - Tier 1 的持有者。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。

介绍

猪链球菌是全球养猪业中最重要的细菌性病原体之一[1]，给猪业造成重大经济损失，并导致严重的健康状况，如败血症、脑膜炎和受影响猪的死亡[2]。猪链球菌也是一种人畜共患病原体，可能对养猪业工人构成健康风险[3]。人类感染通常会导致败血症、脑膜炎和其他严重全身性疾病的发展。过去曾报道过亚洲由毒性特别强的毒株引起的致命疫情[1]。

猪链球菌是一种革兰氏阳性菌，主要定植于猪的上呼吸道，尤其是扁桃体[4]。猪链球菌根据细菌周围厚荚膜多糖（CPS）的抗原多样性分为29种不同的血清型[5]。在所描述的所有血清型中，血清型2在猪和人类中都是临床上最重要的[1]。当仔猪与母猪受污染的阴道分泌物接触时，细菌的传播是垂直传播的，在猪群中通过气溶胶和直接接触进行水平传播[4]。新的毒株可以通过将健康携带者引入猪群而传播到猪场[6]。在病害动物排出较多细菌的暴发期间，水平转移会加剧[2]。在人类中，报告的主要进入途径是通过小的皮肤伤口，在一些亚洲国家，通过食用生的或未煮熟的受污染猪肉产品[3]。

S. 的预防和治疗。SUIS感染严重依赖抗菌药物的使用。S. 中抗菌素耐药性的上升。SUIS令人担忧[7]，这种细菌具有将耐药性转移到其他动物和人类病原体的高风险[8]。接种疫苗是预防感染和减少抗菌药物使用的有力工具。然而，目前尚无有效的通用疫苗来预防 S。尽管有几项研究和试验探索了许多潜在的候选抗原，但仍存在SUIS感染[9–11]。造成这种情况的因素有很多，例如菌株之间的高度基因组多样性和多种血清型的存在。缺乏对 S 诱导的适应性免疫反应的基础知识。SUIS感染增加了开发有效疫苗的挑战。

免疫逃避能力归因于 S 的毒力因子。SUIS[12]。从这个武器库中，厚厚的CPS被广泛认为是最重要的毒力因子，它允许细菌逃避宿主免疫系统，并通过干扰S来促进血流传播。宿主吞噬细胞的吞噬作用和杀伤[12,13]。事实上，已经证明 S.suis 血清型 2 阻碍树突状细胞 （DC） 介导的吞噬作用和细胞因子释放 [14]，并影响最佳 T 细胞活化 [15]，使细菌干扰 T 细胞的正常抗原呈递和下游原代和记忆反应。对 S. 的研究。SUIS、其他链球菌和包膜细菌已发现抗CPS抗体是免疫的重要参与者，可调理和消除致病菌[16\u20]，因此在设计疫苗时非常需要产生这些抗体。

抗体可以通过T依赖性（TD）反应产生，通常是当滤泡（FO）B细胞识别同源抗原并接受同源CD4 T细胞的帮助时[21] 然后，抗原激活的B细胞可以表达激活诱导脱氨酶（AID）酶，该酶启动抗体基因的基因修饰以允许同种型变化，例如从IgM到IgG， 通过类转换重组（CSR）过程[22\u24]。无论转换如何，TD反应中一定比例的活化B细胞可以形成生发中心（germinal centers， GC），其中AID活性将通过启动体细胞超突变（somatic hypermutation， SHM）过程使抗体反应的亲和力成熟[24,25]。GC 是在次级淋巴器官内感染时形成的特殊微环境。GC分为功能不同的暗区（DZ）和亮区（LZ）[21,25]。DZ 中的 B 细胞经历 SHM，这将通过在编码抗体可变区域的外显子中引入突变来改变对其同源抗原的亲和力。在 LZ 中，B 细胞将根据其抗体分子的亲和力通过与 T 细胞的相互作用进行选择。因此，GC可以增加抗体应答的整体亲和力[21,25]。高亲和力和类别转换的 GC B 细胞倾向于产生浆细胞 （PC），而记忆 B 细胞则具有一系列亲和力和同种型。高亲和力的PC细胞和记忆B细胞共同确保了持久的抗体反应[21,25]。+

另一方面，针对多糖（如CPS）的免疫应答通常不依赖于同源T细胞的帮助，可以以T细胞非依赖性（TI）方式触发[26]。边缘区（MZ）B细胞以预激活状态存在，是TI抗原的主要应答者[27]。由于多糖的高度重复结构，多糖与B细胞受体（BCR）的结合可以产生强烈的信号，可以诱导BCR交联[28]，这将触发反应性MZ B细胞快速分化和增殖为抗体分泌细胞[29]。然而，对 S.SUIS发现它们的免疫原性大多较差[30–32]。

如前所述，直到今天，市面上仍然没有有效的疫苗来预防S。SUIS感染。令人惊讶的是，人们对 S 之间的相互作用知之甚少。suis 和 B 细胞以及随后适应性体液反应的发展。为了满足这一需求，我们的目标是正确表征 S 后的适应性免疫反应。通过监测 GC 形成、抗体产生和成熟以及抗体功能来识别有助于消除 S 的有效抗体的来源。SUIS，这将为疫苗开发战略提供信息。

结果

猪链球菌感染诱导强大的抗体产生

表征 B 细胞如何对 S 感染做出反应。suis、C57BL/6野生型（WT）小鼠感染活S。SUIS 血清型 2。感染后，分析不同时间点的细菌血液负荷，以评估宿主在单次原发感染期间消除细菌的能力。在最初的48小时内，血液中的细菌水平显着下降了几个log（图1A）;然而，48小时时仍存在大量菌血症，这与临床症状的出现有关[33]。菌血症稳定5日，仅在第7日时基本检测不到（图1A），而未荚膜菌株在感染后6小时内清除[34]。

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图 1. 猪链球菌原发性感染可诱导持续的抗体反应。

C57BL/6 WT小鼠感染1 x 106活 S 的 CFU 剂量。suis 血清型 2 菌株 P1/7。（A）小鼠在感染后不同时间的细菌血液负荷（n;6小时=28，D1=27，D2=27，D3=9，D4=9，D5=9，D6=9和D7=9）。数据表示为具有几何平均值的单个鼠标值。（B） 反S。苏伊斯小鼠血清中的IgM和（C）IgG滴度，通过ELISA在不同时间点测量（n;D0 = 10，D5 = 9，D7 = 8，D13 = 5，D21 = 5，D35 = 5，D44 = 4 和 D98 = 5）。数据表示为具有平均值的单个值。* p < 0.05，表示指示时间点 （A） 或与时间 0 （B） 之间存在显着差异，由学生 t 检验评估。

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生产抗S。使用全细菌作为包被抗原评估SUIS特异性抗体。如图1B所示，特异性抗S。苏伊斯产生 IgM 和 IgG 抗体，并在初次感染后 98 天仍能检测到。IgM 生成在第 5 天早期达到峰值，直到感染后第 21 天显着增加，然后在第 35 天缓慢下降至接近基础水平。同时，IgG 的产生在第 7 天显着增加，但在第 13 天达到最高水平，并且至少持续到第 98 天。

这些结果表明，单次感染 S.suis 可诱导细菌特异性 IgM 和 IgG 抗体的产生，但其产生动力学，尤其是 IgG 的产生动力学，在感染清除后会下降。

猪链球菌原发感染刺激生发中心的形成

进一步表征对原代 S 的抗体反应。suis 感染 我们确定了感染动物脾脏中的GC形成及其动力学。未感染和用模型蛋白抗原卵清蛋白（OVA）免疫的小鼠作为对照。所有小鼠组的脾 B 细胞总数 （CD19+） 的比例相似，并且随着时间的推移保持相对稳定（S2A 图）。S.suis感染的小鼠产生GC B细胞（CD19，GL7，CD95;S1图中的门控策略），在第13天达到峰值，并持续到感染后第21天（图2B和S2B）。该GC峰比针对OVA的GC反应更宽，后者在第10天显示出窄峰（图2B和S2B）。S诱导的GC。suis 感染显示相似的 DZ （CD19、Gl7、CD95、CD184 和 CD86+++++++int）与LZ（CD19，Gl7，CD95，CD184和CD86）的比率高于幼稚小鼠中存在的低水平自发GC，但与OVA诱导的GC不同（图2A）。+++-+

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图 2. 猪链球菌感染产生生发中心。

C57BL/6 WT小鼠感染1 x 106活 S 的 CFU 剂量。suis 血清型 2 菌株 P1/7。（A） 未感染或 S 后 19 天小鼠脾脏中生发中心 （GC） B 细胞（在 CD13+ 细胞上设门）和相应的暗区 （DZ） 和浅区 （LZ） GC B 细胞的代表性流式细胞术图。suis感染，或卵清蛋白一剂免疫后10天（1x）（有关门控的详细信息，请参阅S1图）。（B） 在不同时间点通过流式细胞术评估的小鼠脾 B 细胞群中脾 B 细胞的比例，如 （A） 所示。数据表示为未感染小鼠的中值（n;D0 = 8，D7 = 6，D10 = 6，D13 = 3，D21 = 6，D28 = 3 和 D35 = 4），S。SUIS 感染 （N;D0 = 8、D7 = 5、D10 = 5、D13 = 18、D21 = 16、D28 = 5 和 D35 = 5） 和 OVA 免疫 （n;D0 = 8，D7 = 8，D10 = 10，D13 = 3，D21 = 7，D28 = 5 和 D35 = 3）。* p < 0.05，表明在相应时间与未感染的小鼠有显着差异，如学生 t 检验评估。

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所获得的结果表明，初始S.suis 感染诱导脾脏中 GC 的形成，其动力学比蛋白质免疫延迟但更持久。同样重要的是要注意，GC反应在菌血症消退后达到峰值。

靶向猪链球菌的抗体有助于控制再感染

猪反复接触硫菌。猪场的猪，因为细菌很容易通过直接接触和气溶胶在动物之间传播。此外，S.SUIS是上呼吸道的正常居民，可长期持续存在[6]。知道病原体特异性抗体是在原发性 S 之后产生的。SUIS感染，我们评估了这些抗体在再次感染中的作用。C57BL/6 WT小鼠依次感染等剂量的活S。每次感染后 14 天出血一次，出血 24 小时（图 3A）。每次再感染时，细菌血液负荷的降低程度明显更大（图3B），表明适应性反应不断演变。

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图 3. 反复的猪链球菌感染诱导具有调理吞噬细胞活性的抗体。

C57BL/6 WT小鼠连续感染1 x 106CFU 剂量的活 S。suis 血清型 2 菌株 P1/7。（A） 小鼠感染和血清收集的时间表，用于调理吞噬作用杀伤试验 （OPA）。（B）第一，第二和第三（n;24x = 1,23x = 2和20x = 3）S后19小时小鼠的细菌血液负荷。SUIS感染。数据表示为具有几何平均值的单个值。（C）小鼠血清诱导的调理吞噬作用杀死S。suis，由 OPA 评估。根据（A）中显示的时间线收集小鼠血清（n;未感染= 8,1x = 10,2x = 10和3x = 9），数据表示为具有平均值的单个值。反S。suis （D） IgM 滴度和 （E） 抗 S。苏伊斯在 OPA 中测试的小鼠血清样品的 IgG 滴度。数据表示为具有平均值的单个值。（f） 反 s。苏伊斯IgG + IgM抗体滴度在感染小鼠血清中1x（n;D0 = 7，D7 = 4，D14 = 8，D35 = 5 和 D98 = 5），2x （n;D0 = 7，D7 = 4，D14 = 8，D21 = 9，D28 = 10，D35 = 5 和 D98 = 6）和 3x （n;D0 = 7、D7 = 4、D14 = 8、D21 = 9、D28 = 10、D35 = 17、D49 = 10、D91 = 10 和 D98 = 5） 在不同时间点通过 ELISA 进行测试。（B-F）数据表示为具有平均值的单个值。（B-E）通过单因素方差分析评估，不共享字母（a、b或c）的组彼此显著不同（p < 0.05）。（F） * p < 0.05 表示与最近一次感染前的第一个时间点存在显着差异，如学生 t 检验所评估的那样。

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确定抗体是否有助于消除 S.如图3A所示收集血清样品，并在体外调理吞噬作用测定（OPA）中进行测试。从感染 2 倍或 3 倍的小鼠中收集的血清在诱导 S 的体外调理吞噬细胞杀伤方面明显更有效。初次感染后的suis比血清，显示调理吞噬细胞活性随着每次感染而增加（图3C）。

在 OPA 中测试的血清样本也进行了抗 S 评估。suis 特异性 IgM 和 IgG 抗体含量。与OPA结果相关，每次感染后IgM和IgG血清抗体水平继续升高（图3D和3E）。为了进一步表征连续感染后的抗体产生，在每次（再）感染后的不同时间点分析血清样品（图 3F）。第二次感染显著增加了靶向 S 的抗体的产生。SUIS与初始感染的比较。然而，第三次感染无法进一步增加抗体滴度。

综上所述，这些结果表明抗S。在该模型中，可以诱导细菌杀伤的SUIS抗体在感染时产生，并在一次再次感染后达到最大水平，这可能有助于控制感染。

在再感染期间，所有抗猪链球菌 IgG 亚类的滴度均增加，而没有亲和力成熟

确定反S。SUIS抗体的产生和功能随着再次感染而增加，我们决定进一步剖析抗体反应的质量。C57BL/6 WT小鼠组感染1x，2x或3x，并在第35天收集所有组的血清（图4A）。主要 S。suis 感染诱导显著水平的细菌特异性 IgG2b 和 IgG2c，但 IgM、IgG1 和 IgG3 水平相对较低。再次感染（2x小鼠）后，靶向细菌的IgM和IgG3适度但显着增加，而IgG1，IgG2b和IgG2c则显着增加（图4B）。另一次再感染（3x小鼠）没有显着增加任何同种型（图4B），表明单次再感染足以使反应饱和。

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图 4. 抗猪链球菌 IgG 滴度随反复感染而增加，但其亲和力不增加。

C57BL/6小鼠组感染1 x 106CFU 剂量的活 S。suis 血清型 2 菌株 P1/7。（A） 在不同组小鼠中进行的感染时间表，并在第 35 天收集所有组的血清。（B） 反S。通过ELISA测量未感染小鼠（n = 1）或感染2x（n = 2），3x（n = 5）或1x（n = 5）的小鼠血清中IgM，IgG2，IgG5b，IgG3c和IgG6的滴度。数据表示为具有平均值的单个值。（C） S的亲和力指数。感染 1x （n = 5）、2x （n = 5） 或 3x （n = 6） 的小鼠血清中的 suis 特异性 IgM 和 IgG，以及免疫 1x （n = 6）、2x （n = 5） 或 3x （n = 5） 的小鼠血清中的 OVA 特异性 IgG，通过 ELISA 与离液剂 NaSCN 偶联进行评估。亲和力指数表示 NaSCN 的 mM 浓度，在该浓度下，50% 的抗原特异性抗体被置换。数据表示为具有平均值的单个值。通过单因素方差分析评估，不共享字母（a、b或c）的组彼此显著不同（p < 0.05）。

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然后我们问抗S是否增加。SUIS抗体与其亲和力的增加相关。反S的狂热。苏伊斯与针对原发感染产生的IgM相比，IgM在一次再次感染时显着增加，但在感染3倍的小鼠中没有进一步增加（图4C）。相比之下，无论感染次数如何，抗菌IgG反应均未显示出任何显着的亲和力改善（图4C）。单独分析IgG亚类时也观察到类似的结果（S3图）。正如预期的那样，抗OVA IgG在增强后显示出亲和力的增加（图4C）。

结果显示，1例再次感染S。suis 足以将抗菌 IgM 和 IgG 的滴度提高到最大水平，但虽然 IgM 的亲和力经历了一些明显的成熟，但对于 IgG，它没有。

猪链球菌再感染可维持持续的生发中心反应

然后，我们询问再次感染对GC B细胞生成的影响是什么。感染 C57BL/6 WT 小鼠 1x、2x 或 3x，并通过流式细胞术测定脾 GC B 细胞。再感染 2 倍的小鼠产生的 GC B 细胞比单次感染小鼠的峰值 GC 多 ~2 倍 （p < 0.05）（图 5A）。另一次再感染没有进一步增加GCs，但它维持了反应（图5A）。在每种情况下，GC 反应在最后一次感染剂量后 ~8-10 天开始减少（图 5A），这表明一旦细菌从血液中清除，GC 就会消退。与对原发感染有反应的小鼠相比，再感染小鼠GC B细胞的DZ与LZ比率显着降低（p < 0.05）（图5B）。

这些结果表明，定期再感染会随着时间的推移而保持强烈而持续的 GC 反应。

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图 5. 猪链球菌再感染维持生发中心反应。

C57BL/6 小鼠感染 1 x 106CFU 剂量的活 S。suis 血清型 2 菌株 P1/7。（A） 在未感染小鼠的不同时间点通过流式细胞术评估的脾 B 细胞群中 GC B 细胞的比例 （n;D0 = 8，D7 = 6，D10 = 6，D13 = 3，D21 = 6，D22 = 5，D27 = 5，D28 = 3，D35 = 4，D36 = 3和D41 = 3），感染S的小鼠。SUIS 1x （N;D0 = 8，D7 = 5，D10 = 5，D13 = 18，D21 = 16，D28 = 5，D35 = 5 和 D41 = 6），2x （n;D22 = 14，D27 = 8，D36 = 5 和 D41 = 5）和 3x （n;D36 = 12 和 D41 = 13）。数据表示为中位数。（B） 感染 S 的小鼠的 GC B 细胞暗区 （DZ） 与亮区 （LZ） 比率。suis 一次 （n;D7 = 5 和 D13 = 18），两次 （n;D22 = 14 和 D27 = 8） 和三次 （n;D36 = 12 和 D41 = 13）。通过学生 t 检验分析数据，其中 * 表示与感染组 0 倍的显着差异 （p < 05.1）。

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SHM 和 CSR 对于产生猪链球菌调理吞噬细胞抗体是可有可无的

生产抗S。多种同种型的 suis 抗体，以及抗 S 的明显增加。苏伊斯IgM 亲和力会将 CSR 和 SHM 与反应联系起来。我们通过比较Aicda小鼠的反应，询问同种型转换和/或亲和力成熟是否有助于效应抗体的产生，Aicda小鼠不能进行SHM或CSR[23]，而Ung小鼠的反应降低CSR，尽管这可以通过慢性抗原暴露来补偿，但可以经历SHM和IgM的亲和力成熟[35，36]。-/--/-

将小鼠感染1x，2x或3x，并在感染后的不同时间和第35天收集所有组的血清（图6A）。WT和AID或UNG（尿嘧啶DNA糖基化酶）缺陷小鼠之间的菌血症没有显着差异（图6B）。为了补充我们的体内观察，收集血清样本并通过OPA测试在体外进行测试。同样，WT的血清和任何突变小鼠的血清之间没有观察到细菌杀伤能力的显着差异（图6C）。不出所料，反S。在Aidca小鼠中，suis反应仅为IgM，而Ung小鼠则表现出类似增强的抗S。苏伊斯IgM 反应和显着降低的 IgG（比 WT 小鼠低 2 倍）（图 6D）。为了完成抗体反应的表征，我们测量了特异性靶向 S CPS 的抗体水平。suis（图 6E）。所有小鼠系仅产生相同水平的抗CPS IgM（图6E）。-/--/-

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图 6. AID 和 UNG 对于产生调理吞噬细胞抗猪链球菌抗体是可有可无的。

C57BL/6 WT、Aidca和Ung小鼠感染1 x 10-/--/-6CFU 剂量的活 S。suis 血清型 2 菌株 P1/7。（A） 在不同组小鼠中进行的感染时间表，以及用于调理吞噬作用杀伤试验 （OPA） 的血清收集时间。（B）第一次（n;WT = 24，Aidca = 27 和 Ung = 33），第二 （n; WT = 22，Aidca = 17 和 Ung = 18）和第三（n; WT = 14，Aidca = 17 和 Ung = 14） S。 SUIS感染。数据表示为几何均值和 14% 置信区间。（C）小鼠血清诱导的调理吞噬作用杀死S。通过 OPA 评估 WT、Aidca 和 Ung 血清的 suis（n;未感染 = 95，感染 5x = 1，感染 5x = 2 和感染 5x = 3）。在（A）中显示的时间点收集测试的血清。数据以SEM±平均值表示。 （D） 抗 S。苏伊斯第 5 天从未感染小鼠收集的血清中的 IgM 和 IgG 滴度 （n;WT = 35，Aidca = 13 和 Ung = 11） 或小鼠感染 6 次 （n; WT = 16，Aidca = 14 和 Ung = 14），通过 ELISA 测量。数据表示为具有平均值的单个值。（e） 反 s。第 35 天从未感染小鼠 （n;WT = 13，Aidca = 11 和 Ung = 6） 或小鼠感染 17 次 （n; WT = 14，Aidca = 14 和 Ung = 0），通过 ELISA 测量。数据表示为具有平均值的单个值。通过学生t检验分析数据，其中*表示与WT小鼠有显著差异（p < 05.<>）。-/--/--/--/--/--/--/--/--/--/--/--/--/--/--/--/-

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这些结果表明，SHM或CSR不需要产生能够调理和诱导S吞噬作用的抗体。SUIS和最有可能在再次感染时消除细菌。

IgM抗体在猪链球菌消除中起着至关重要的作用

为了批判性地检验抗体在细菌消除中发挥作用的假设，我们求助于小鼠，使我们能够剖析T细胞，B细胞和GC在抗S中的作用。SUIS响应。我们使用了缺乏α/β T细胞的Tcrb小鼠[37]、缺乏所有B细胞的μMT小鼠[38]和Sh2d1a-/--/Y小鼠缺乏SAP（信号淋巴细胞活化分子或SLAM相关蛋白），不能产生GC，但仍能产生滤泡外B细胞反应[39]。

对小鼠进行1次、2次或3次感染，并分析细菌消除和抗体反应（如图6A所示）。与WT小鼠相比，Tcrb和μMT小鼠对血菌血症的控制明显受损，但仅在第三次感染后（图7A），表明需要T细胞和B细胞来控制再感染。另一方面，缺乏SAP的小鼠控制感染与WT相似（图7A），表明不需要GC。-/-

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图 7. 生发中心非依赖性抗荚膜IgM在消除猪链球菌中起着至关重要的作用。

WT、SAP （Sh2d1a）--/Y）、C57BL/6J 谱系的 Tcrb 和 μMT 小鼠感染 1 x 10-/-6CFU 剂量的活 S。suis 血清型 2 菌株 P1/7。（A）第一次（n;WT = 24，SAP = 30，Tcrb = 20 和 μMT = 10），秒 （n; WT = 18，SAP = 24，Tcrb = 11 和 μMT = 10）和第三（n; WT = 12，SAP = 24，Tcrb = 11，μMT = 10） S。SUIS感染。数据表示为几何均值和 12% 置信区间。（B） 反S。第 95 天从未感染小鼠收集的血清 IgM 和 IgG 的滴度 （n;WT = 35，SAP = 10，Tcrb = 5，μMT = 5）和小鼠感染三次（n;WT = 6，SAP = 12，Tcrb = 11，μMT = 10），通过 ELISA 测量。数据表示为具有平均值的单个值。（c） 反 s。第 6 天从未感染小鼠收集的血清中 IgM 和 IgG 的猪荚膜多糖 （CPS） 滴度 （n;WT = 35，SAP = 10，Tcrb = 5，μMT = 5）和小鼠感染三次（n;WT = 6，SAP = 12，Tcrb = 11，μMT = 10），通过 ELISA 测量。数据表示为具有平均值的单个值。（D）小鼠血清诱导的调理吞噬作用杀死S。suis，通过调理吞噬作用杀伤试验 （OPA） 评估第 6 天从未感染小鼠收集的血清 （n;WT = 35，SAP = 10，Tcrb = 5，μMT = 5）或小鼠感染三次（n;WT = 6，SAP = 12，Tcrb = 11，μMT = 10）。数据表示为SEM±平均值。 （E） 小鼠血清诱导的调理吞噬作用杀死 S。suis，通过 OPA 评估第 6 天从感染 3 次的小鼠和 WT ΔIgG 血清 （n = 35） 收集的 WT （n = 3） 血清。通过使用 Dynabeads 与蛋白 G 偶联来去除 WT 血清中的 IgG 含量，从而产生 WT ΔIgG 血清，数据表示为 SEM ±平均值。 通过学生 t 检验分析数据，其中 * 表示与 WT 小鼠有显着差异 （p < 0.05）。--/---/---/---/---/---/---/---/---/-

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011957.g007

Tcrb小鼠不产生任何抗S。苏伊斯IgG，表明感染时的所有 IgG 反应都是 T 细胞依赖性的，（图 7B）。另一方面，缺乏SAP的小鼠受到显着损害，但仍能够产生一些抗S。苏伊斯IgG（比 WT 低 23 倍），揭示了反复再感染时存在滤泡外反应（图 7B）。Tcrb 和 SAP 缺陷小鼠都能够产生抗 S。苏伊斯IgM，尽管与WT相比水平降低了2倍（图7B）。两只小鼠也产生了较少的抗CPS IgM反应，尽管这只在Tcrb小鼠中达到显着性（图7C）。正如预期的那样，在μMT小鼠中观察到完全没有抗体（图7B和7C）。-/--/--/-

直接测试抗体在 S 中的作用。suis 清除，我们确认来自感染的 μMT 小鼠的血清在 OPA 测试中无法诱导细菌杀伤。来自Tcrb小鼠的血清诱导细菌杀伤的能力大大降低（图7D），表明T细胞有助于产生调理吞噬细胞抗体。另一方面，来自受感染的SAP缺陷小鼠的血清表现出与WT小鼠相似的杀伤率，表明GC对于产生调理吞噬细胞抗体是可有可无的（图7D）。剖析 S 的相对贡献。suis 特异性 IgG 与 IgM，我们耗尽了 WT 血清的 IgG 含量。OPA检测结果显示，WT血清与IgG耗尽的对应物之间没有显著差异（图7E）。-/-

这些结果表明，靶向细菌的 T 细胞依赖性 IgM 抗体，可能具有抗 CPS IgM 的贡献，在消除 S 中起着至关重要的作用。苏伊斯。

讨论

猪链球菌感染是养猪业面临的全球挑战[1]，对猪和人类都构成健康风险[3]。预防 S.猪场的SUIS感染仍然是一个问题，也是养猪者的经济负担[40]。事实上，尽管人们努力研究各种疫苗接种策略，但仍然没有有效的市售疫苗来预防S。SUIS感染[9]。巧合的是，关于B细胞和S细胞之间的相互作用仍然知之甚少。SUIS及其对抗体产生的影响。

S. 后抗体的产生。小鼠的SUIS感染已有研究[31];然而，使用了高致死的细菌剂量。在致命的 S 期间引起的炎症加剧。已知SUIS感染会调节主要组织相容性复合物（MHC）分子的表达[41]，这可能会影响适应性免疫反应的最佳发展。事实上，S 的严重临床症状之间存在相关性。SUIS病和抗体反应受损[15]。在猪场中，猪不断暴露于细菌中，细菌是猪上呼吸道的天然居民[4]，这种共存可能会影响对病原体的整体反应。为了更好地模拟这一点，我们通过使用非致死剂量的活细菌来调整感染小鼠模型，并缩短了后续感染之间的时间。小鼠产生的抗体遵循与先前报道相似的混合Th1/Th2谱[31]。尽管不是 S 的自然目标。suis，小鼠已被公认为研究 S 的合适模型。SUIS的发病机制，因为已发现它们出现与猪相似的临床表现和/或临床表现[42]。在以前的出版物中，原发性 S.在猪身上观察到的SUIS特异性抗体反应与在小鼠身上观察到的抗体反应非常相似，尽管猪的抗体滴度总体较低。猪蛋白特异性反应主要由IgG1和IgG2亚类组成，表明在小鼠中观察到明显的同种型转换[31]。在本研究中，我们进一步观察到抗体滴度随着时间的推移而增加，并在小鼠继发感染后达到最大水平，但令人惊讶的是，产生的 IgG 的亲和力并没有增加。IgG浓度和对靶向抗原的亲和力的测量通常被用作疫苗对病原体（如肺炎链球菌）的保护作用的相关性[43–45]。我们假设 IgG 对 S.suis 未适当成熟，并研究了 GC 的形成是否受损。据我们所知，这是第一项评估 S 后 GC 形成的研究。SUIS感染。急性激发试验诱导的GC通常在抗原暴露后~3-4周内形成、扩增，然后消散[46]。GC 与血菌血症之间的关系也可能决定 GC 形成和消退的动力学。虽然导致GC终止的机制尚不完全清楚[47]，但众所周知，抗原是维持治疗所必需的[47]。由于抗原（以长寿命免疫复合物的形式）可以被 GC 抗原呈递细胞维持的时间比检测到活病原体的时间更长，因此 GC 分辨率可能在 S 中。suis感染的小鼠是由循环细菌的消除触发的，但由于GC中抗原的持续存在，该过程在可检测到的菌血症丧失后需要几天时间。我们还发现，在原发性 S 之后诱导的 GC。suis感染形成得晚得多，并且比模型蛋白抗原OVA诱导的GC少（根据GC B细胞的比例判断）。这可能表明免疫系统需要相对较长的时间才能识别 S。胃食管腔形成，可能源于其抗原特性和/或CPS的存在，CPS会损害免疫系统对细菌的识别和处理[14,15,41]，以及链球菌中潜在的但未知的免疫抑制分子。苏伊斯。在感染其他细菌病原体（如埃立克体和肠道沙门氏菌）时也观察到GC受压[48,49]。在S上也观察到类似的效果。肺炎，发现完整菌株和灭活菌株具有免疫抑制特性，可抑制与OVA共免疫的小鼠脾GC B细胞的生成和IgG的生成[50,51]。先前在感染活 S 的小鼠中也报道了抑制抗 OVA 抗体的产生。SUIS[15]。知道了这一点，S.suis 可能具有类似的免疫抑制机制，导致 GC 延迟和产生的抗 S 缺乏增加的亲和力。苏伊斯免疫球蛋白。考虑到GC随着随后的S而进一步增加，这是令人惊讶的。suis 感染以及 IgG 滴度，并且 GC 持续存在其他感染。因此，缺乏明显的抗体亲和力成熟表明 S.suis 会干扰 GC 的功能。值得注意的是，S.suis可以改变脾CD4 T细胞分泌细胞因子[15]，这可能导致亲和力成熟过程明显缺乏。然而，抗体亲和力成熟缺陷的根本原因仍有待研究。尽管如此，我们的数据确实表明 IgG 抗体反应（针对表面蛋白）在 S 之后。suis 不具有保护作用，因为在 IgG 减少或缺乏的血清中保留了最佳 OPA 活性（Aidca、Ung、SAP 缺陷、ΔIgG）。+-/--/-

先天免疫系统在消除病原体方面起着关键作用;然而，S.已知SUIS可逃避宿主细胞的吞噬作用[14,52,53]。这与在初次感染后的前48小时内观察到的小鼠血液细菌负荷适度减少一致。观察到的早期 IgM 反应（很可能是滤泡外）可能有助于控制原发感染。一个值得未来研究的特征。然而，在随后的感染过程中，小鼠对感染的控制更好更快，这可能归因于病原体特异性抗体的存在，在体外具有更高水平的细菌杀伤。血液清除阻力与保护 S 的厚 CPS 有关。先天免疫系统识别和吞噬作用产生的SUIS[14,52,53]。因此，靶向包封病原体CPS的抗体可以通过诱导调理吞噬作用来发挥高度保护作用[54,55]，S已经证明了这一特性。使用CPS特异性单克隆抗体[16,32]。然而，靶向 CPS 或其他细菌表面抗原（如蛋白质）的抗体和参与控制感染的 Ig 亚类的相对贡献仍然知之甚少。尽管具有针对整个细菌的多样化Th1和Th2 IgG抗体谱，但我们的研究首次表明，感染期间产生的保护性抗体主要是IgM。这一观察结果得到了以下事实的支持：IgG反应受损或耗尽的小鼠仍然能够消除S。SUIS体内和体外。与 IgG 不同，IgM 反应显示再感染小鼠的亲和力明显增加。然而，由于与猪链球菌调理吞噬作用相关的 IgM 抗体不需要 AID 或 GC，因此我们必须得出结论，这种亲和力的增加对于调理吞噬活性是可有可无的，或者这种增加反映了具有较高亲和力的特定克隆型的扩增，而不是 SHM 的典型亲和力成熟过程。

我们发现小鼠对 S 的 CPS 产生弱抗体反应。suis，与CPS免疫原性差一致[31,56]。此外，感染后不会产生 IgG，仅产生相对较低的靶向 CPS 的 IgM 滴度。同样，一项研究报告称，CPS特异性抗体反应较低，其特征是猪的原发性和继发性感染后均缺乏同种型转换[31]。长期以来，多糖一直被视为TI抗原，因为它们不能募集同源T细胞帮助，这是由于不能与MHC-II结合，因此无法呈递给TCR[57]。然而，并非所有多糖都是 TI 抗原，例如来自 S 的 CPS。肺炎血清型1，具有两性离子电荷，可与MHC-II结合并激活同源T细胞[58]。尚未针对 S 的 CPS 报告此属性。麾;尽管如此，抗CPS IgM的产生显着减少，但并未因Tcrb小鼠T细胞功能的丧失而消除。对这一过程的一种可能的解释是，B细胞受益于非同源T细胞的帮助，以建立抗CPS抗体反应。T 细胞和 B 细胞之间的这种旁观者相互作用已被证明对 S 中的抗多糖抗体反应很重要。肺炎[59,60]。靶向 S CPS 的 IgM 水平。suis 在 SAP 小鼠中受到的影响较小，表明该反应具有较大的滤泡外成分。最后，抗体诱导的S杀伤。suis 在 Tcrb 小鼠中受到显着影响，表明抗 CPS IgM 水平与最佳细菌清除率之间存在关系。-/--/-

总体而言，我们的工作强调了 IgM 抗体在消除 S 中的重要性。苏伊斯。在我们的模型中，保护性 IgM 反应持续了第 35 天。因此，可以合理地假设 IgM 在整个 S 根除过程中都很重要。苏伊斯。这一观察结果合理化了先前描述S的研究。suis 拥有一种蛋白酶 Ide苏伊斯（S. 的免疫球蛋白 M 降解酶。suis），可以特异性中和猪IgM[61]。拥有这种蛋白酶将通过降低宿主抵抗细菌的能力来提供对抗免疫系统的显着优势，尤其是在再次感染时。还发现该酶能够中和猪mIgM B细胞受体，这也可能进一步阻碍B细胞活化并削弱宿主防御能力[62]。与我们使用小鼠模型的结果一致，两项研究报告了 S.在IgM存在的情况下，猪血中的suis受到很大限制[63,64]。确实，添加 Ide苏伊斯蛋白酶将猪 IgM 裂解，但不裂解 IgG，用于猪血杀菌试验，导致血 S 显着增加。SUIS存活率[64]。我们不能完全排除 IgG 可能对 S 发挥的潜在作用。苏伊斯。确实，S。suis还具有一种能够降解猪IgG的蛋白酶[65]，这表明IgGs也对S施加进化压力。苏伊斯。尽管如此，我们的数据指向了引发抗 CPS 和其他抗 S 的方法。苏伊斯IgM（免疫球蛋白）在制定疫苗策略时出现。

总之，本研究对 S 后抗体反应的发展进行了深入分析。SUIS感染，这有助于改进未来的疫苗设计。猪链球菌损害了 IgG 反应的最佳成熟，可能限制了它们的保护能力，如本文所示。研究表明，靶向细菌的 IgM 及其 CPS 在 S 期间起主要作用。SUIS感染，这些信息可能有助于开发未来的有效疫苗。

材料与方法

道德声明

所有小鼠程序均按照加拿大动物护理委员会指南和政策的建议以及《实验动物护理和使用指南》中规定的原则进行。蒙特利尔大学动物福利委员会批准了协议和程序，包括安乐死，以根据既定的临床终点网格最大限度地减少受感染严重影响的动物的痛苦（研究协议编号：Rech-1399 和 Rech-1523）。根据IRCM动物保护委员会2019-05年协议的批准，一些小鼠品系在蒙特利尔临床研究所（IRCM）繁殖，然后转移到蒙特利尔大学兽医学院。老鼠可以自由获得水和食物颗粒，以及丰富的食物，例如用作床上用品的各种材料，以及避难所和用于啃咬的橡胶玩具。

猪链球菌菌株和生长条件

特征明确且毒性强的 S.本研究使用了最初从一头患有脑膜炎的猪中分离出的血清型2 P1/7菌株[66]。将菌株在绵羊血琼脂（Oxoid，Fisher Scientific，Ottawa，ON，Canada）上生长，并将单个菌落在5ml Todd-Hewitt肉汤（THB，Becton Dickinson，Mississauga，ON，Canada）中培养8小时，在37°C下，120rpm搅拌。然后将细菌悬浮液稀释103和 10 μl 该稀释液用于接种 30 ml 新鲜 THB，在 16°C 下搅拌培养 37 小时。然后用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细菌两次，并重悬于THB中用于体内实验感染。对于体外感染，将洗涤的细菌重新悬浮在完全细胞培养基中，该培养基由补充有1640%热灭活胎牛血清，5mM HEPES，10mM L-谷氨酰胺和2μM 50-巯基乙醇（Gibco，Burlington，ON，Canada）的RPMI-2培养基组成。将细菌培养物稀释并接种在THB琼脂上，以确定最终悬浮液的菌落形成单位（CFU）的浓度。

小鼠实验感染和免疫

WT小鼠（C57BL / 6）购自Charles River（美国马萨诸塞州威尔明顿）。此外，艾克达?/?（B6.Cg-艾克达tm1Hon）小鼠[23]，Ung?/?（B6;129P2-UNG型tm1TLD） 小鼠 [35]， SAP?（B6.129-SH2D1Atm1林）小鼠[67,68]和μMT（B6.129S2-Ighmtm1Cgn）在蒙特利尔倩婶研究所（IRCM;加拿大魁北克省蒙特利尔），并转移到蒙特利尔大学兽医学院进行实验性感染。Tcrb（英语：Tcrb）?/?（B6.129P2-TCRBtm1妈妈）与WT对应物（C57BL / 6J）一起购自Jackson Research Laboratories（美国缅因州巴港）。所有小鼠均饲养在特定的无病原体条件下。

以57周龄小鼠为S，应用标准化的C6BL/42小鼠感染模型[69,6]。SUIS在幼年动物中引起疾病[1]。在进行实验之前，小鼠在整整一周内适应实验室条件。小鼠实验性地感染 1 ml 的 10 x <>6CFU/ml 活 S 悬浮液。如果实验需要，在第 2 天通过腹膜内注射给药 suis 血清型 1 P7/0 菌株，并在第 14 天和第 28 天进行后续感染。根据既往发表的文献[30,70]确定最佳细菌剂量，以获得可靠的感染（菌血症）和有限的死亡率。对于每个实验，包括阴性对照小鼠，其中小鼠注射匹配的载体溶液。在不同的时间点从尾静脉或下颌下静脉采集血样。小鼠在不同时间点实施安乐死，从总血中收集血清，保持在-80°C进行进一步分析。

用在PBS中稀释并悬浮在10%烷凝胶（Brenntag;Frederikssund，丹麦）用作选定实验的阳性对照。OVA是一种广泛使用且具有特征的模型抗原，通常用于研究免疫应答，在本研究中用作阳性对照[2,15,50]。不同实验中使用的小鼠数量详见图例。

菌血症的测量

通过在感染后5小时，6小时和24小时从尾静脉收集48μl血液样本来评估感染小鼠的血液细菌载量。将样品在PBS中连续稀释，并接种在THB琼脂上以计数细菌菌落。如果样品第一次稀释的菌落计数为负，则将样品的最小值定为 100，该值对应于所采用的最低稀释因子（表示为 102在图形的 Y 轴上）。

猪链球菌特异性抗体的滴定

如前所述，进行了酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）[30]。微孔板，Nunc Immuno Polysorp（Thermo Fisher;Rochester， NY， USA），涂有 100 μl 的 1 x 108CFU/ml S. 悬浮液。suis 血清型 2 P1/7 菌株。将包被板风干，然后加入50μl32M甲醇（Sigma-Aldrich）并使其蒸发。然后将干燥的涂层板储存在室温 （RT） 直至使用。用补充有0.05%吐温20（Sigma-Aldrich）（PBS-T）的PBS洗涤板。将小鼠血清在PBS-T中连续稀释（2倍），将100μl加入孔中并在室温下孵育1小时。PBS-T 洗涤后，将平板与过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠总 Ig [IgG + IgM]、IgG （Jackson ImmunoResearch;West Grove， PA， USA）、IgM、IgG1、IgG2b、IgG2c 或 IgG3（Southern Biotech;Birmingham， AL， USA）在室温下抗体 1 小时。PBS-T洗涤后，用100μl3,3′，5,5′-四甲基联苯胺底物（TMB;Invitrogen（免疫原）;Frederick， MD， USA），并通过加入50μl0.5M H来终止反应2所以4（费舍尔科学）。当OD450阳性内部对照的值为1.0，由来自S过度免疫小鼠的血清池组成。如前所述，SUIS血清型2[56]。最后一次血清稀释的倒数值导致吸光度为0.15（预先确定的临界值）被认为是该血清的滴度。如果样品第一次稀释的吸光度值低于临界值，则滴度的最小值为100，对应于所采用的最低稀释因子（表示为102在图形的 Y 轴上）。所有使用的抗体都列在S1表中。

猪链球菌荚膜多糖特异性抗体的滴定

如前所述进行ELISA[30]，其中Nunc Immuno Polysorp微孔板（Thermo Fisher）涂有200ng天然S。2.0 M NaCO 中的 suis 血清型 1 CPS3（pH值9.6）（Fisher Scientific）并在4°C下孵育过夜，如前所述[30]。然后用PBS-T洗涤板，并用含有1%牛血清白蛋白的PBS（GE Healthcare Life Sciences，Mississauga，ON，Canada）封闭1小时。将小鼠血清样品在PBS-T中连续稀释（2倍），将100μl加入孔中并在室温下孵育1小时。使用suis血清型2 CPS、mAb 16H11（IgG）和mAb 9E7（IgM）作为阳性对照[16]。在PBS-T洗涤后，将平板与过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠，IgG（Jackson ImmunoResearch）或IgM（Southern Biotech）抗体在室温下孵育1小时。反应如上所述展开。所有使用的抗体都列在S1表中。

抗体亲和力指数测定

使用前面描述的硫氰酸钠（NaSCN）方法测定小鼠血清的亲和力指数[16]。血清稀释度，在 PBS-T 中，提供至少 OD 的读数450= 1.0 在涂有任一 S 的孔中孵育。suis 血清型 2 P1/7 菌株或 OVA 在室温下 1 小时。在室温下向孔中加入梯度（0至1M）的NaSCN（Sigma-Aldrich）15分钟。S的完整性。使用对照板测试NaSCN处理后的suis和OVA涂层。NaSCN处理不影响涂层完整性。如前所述进行抗OVA抗体的ELISA测定[30]并用作对照。处理后，通过PBS-T洗涤去除NaSCN和洗脱的抗体。将过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG（Jackson ImmunoResearch）加入孔中，并在室温下孵育1小时。PBS-T洗涤后，用TMB显影板，并通过加入50μl0.5M H来终止反应2所以4.用ELISA酶标仪在450nm处读取孔的吸光度。血清的亲和力指数是 NaSCN 的浓度和 50% 的 S。洗脱 suis 特异性或 OVA 特异性抗体。

小鼠血清中 IgG 的耗竭

为了消耗小鼠血清中的 IgG 含量，将 Dynabeads 蛋白 G （Invitrogen） 用于先前感染 S 3 次的 WT 小鼠的混合血清。苏伊斯P1/7 应变。简而言之，将 5 ml 珠子转移到微管中，然后将其放置在磁铁上。除去储存溶液，然后用无菌PBS洗涤珠子一次，用EtOH 70%洗涤一次，然后用无菌PBS洗涤两次。然后从珠子中除去剩余的液体，并加入1ml混合血清。在室温下孵育 30 分钟并轻度手动搅拌后，将血清从珠子中取出并转移到新的微管中。在进一步实验之前，通过ELISA滴定法将处理过的血清与未处理的血清与整个S进行比较，以验证IgG的去除。SUIS（如上所述）。微球处理成功去除了超过 97% 的 IgG 和不到 6% 的 IgM。

抗体依赖性体外调理吞噬试验 （OPA）

OPA检测如前所述[72]。OPA基于这样一个事实，即细菌表面的特异性免疫球蛋白（抗体）的调理作用将被Fc受体识别，从而触发血液白细胞增强的免疫反应，从而导致细菌吞噬作用和杀菌活性。本文使用的OPA测试不需要使用细胞系或纯化的单细胞类型，而是需要来自幼稚小鼠的全血。该模型考虑了所有存在的血液白细胞，因此代表了全身感染期间所有免疫细胞和细菌之间复杂相互作用的更现实的模型[72]。简而言之，用肝素钠（Sigma-Aldrich）处理未感染的C57BL / 6小鼠的血液，然后用RPMI完全培养基稀释至6.25 x 106白细胞/毫升。如上所述制备悬浮在完全细胞培养基中的细菌制剂，并稀释得到1.25×106CFU/毫升。将血液和细菌制剂与来自感染或未感染小鼠的 40% （vol/vol） 血清混合，以达到 5 x 105白细胞和 5 x 104S 的 CFU。最终体积为0.2毫升的SUIS。使用无菌 25 号针头刺穿管顶，然后将微管在 37°C 下与 5% CO 一起孵育2每4分钟轻轻手动搅拌20小时。在孵育 4 小时时收集样品，以在 THB 琼脂平板上进行活菌计数。幼稚兔血清或参考兔抗 S。如前所述，使用SUIS血清型2血清作为阴性和阳性对照[72]。细菌杀灭率使用以下公式计算：

脾生发中心B细胞的流式细胞术分析

小鼠的脾脏是在感染后的不同时间点收集的，详见图例。将脾细胞通过 70 mm 细胞过滤器 （Fisher Scientific），离心，然后用氯化铵 （ACK） 红细胞裂解缓冲液 （Gibco） 处理。洗涤后，4 x 106总脾细胞与抗小鼠CD16/CD32（Fc Block，BD Biosciences;密西沙加，安大略省，加拿大）根据制造商的说明在冰上冰上 15 分钟。然后，用以下抗体进行表面染色：抗CD95体育、抗CD86生物素、抗CD19PE-Cy7型、抗GL-7AF647型和抗CD184BV421型（所有BD Biosciences）在冰上进行30分钟。洗涤后，将细胞与Brilliant Stain Buffer（BD Biosciences）一起孵育，并用链霉亲和定染色BV605型（BD Biosciences）在冰上10分钟。然后洗涤细胞并立即在BD FACSaria Fusion上进行分析。收集的数据在 FlowJo 版本 10 上进行分析。所有使用的抗体都列在S1表中。

统计分析

所有统计分析均使用SigmaPlot 11.0版完成。最小 p < 0.05 被认为具有统计学意义。为了评估两个配对组之间的统计差异，使用配对 t 检验分析参数数据，并使用符号秩检验分析非参数数据。对于非配对组，使用非配对 t 检验分析参数数据，使用 Mann-Whitney 秩和检验分析非参数数据。显著差异用星号（*）表示。

为了评估三组或更多组之间的统计学差异，使用单因素方差分析 （ANOVA） 和 Tukey 方法分析参数数据。使用Kruskal-Wallis单因素方差分析，然后使用Dunn方法分析非参数数据。不共享字母（a、b或c）的组有显著差异。

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脾生发中心B细胞的门控策略。

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S1 图。 脾生发中心B细胞的门控策略。

通过流式细胞术分析C57BL/6小鼠的脾脏。生发中心 （GC） B 细胞被鉴定为 CD19、GL-7 和 CD95，进一步鉴定暗区 （DZ） GC B 细胞定义为 CD19、Gl7、CD95、CD184 和 CD86+++++++int和光区 （LZ） GC B 细胞定义为 CD19、Gl7、CD95、CD184 和 CD86。+++-+

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011957.s001

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S2 图。 免疫后的脾 B 细胞群。

C57BL/6 小鼠用 1 x 1 感染一次 （10x）6活 S 的 CFU 剂量。suis 血清型 2 菌株 P1/7。（A） 脾脏和生发中心 （GC） B 细胞群中 B 细胞的百分比 （B） 在未感染的脾脏中通过流式细胞术评估的 B 细胞群 （B） （n;D0 = 8，D7 = 6，D10 = 6，D13 = 3，D21 = 6，D28 = 3，D35 = 4，D44 = 4，D70 = 3 和 D98 = 5），S。SUIS 感染 （N;D0 = 8、D7 = 5、D10 = 5、D13 = 18、D21 = 16、D28 = 5、D35 = 5、D44 = 5、D70 = 5 和 D98 = 4）和卵清蛋白免疫 （n;D0 = 8，D7 = 8，D10 = 10，D13 = 3，D21 = 7，D28 = 5，D35 = 3，D44 = 3，D70 = 7和D98 = 3）小鼠。数据表示为单个图和中位数。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011957.s002

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S3 图。 S 之后 IgG 类别的亲和力。SUIS感染。

C57BL/6 小鼠感染 1 x 106活 S 的 CFU 剂量。suis 血清型 2 菌株 P1/7。亲和力指数 S.感染一次 （n = 5）、两次 （n = 5） 或三次 （n = 6） 的小鼠血清中的 suis 特异性 IgG，在第 35 天收集所有组的血清，然后通过 ELISA 联合使用离液剂 NaSCN 进行评估。亲和力指数表示洗脱 50% 抗原特异性抗体时 NaSCN 的毫摩尔浓度。数据表示为具有平均值的单个值。通过学生t检验，组间差异无统计学意义。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011957.s003

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S1 表。 使用的抗体。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011957.s004

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S1 附录。 支持数据。

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确认

作者要感谢 Marcelo Gottschalk 博士（蒙特利尔大学）慷慨地赠送了针对 S 的参考抗血清。suis 及其建设性意见，以及 André Veillette 博士（Institut de Recherches Cliniques de Montréal）提供 SAP 小鼠品系。他们还要感谢 Guillaume Goyette-Desjardins 和 Jean-Philippe Auger 提供的技术建议和有益的讨论，以及 Annie Gaudreau、Servane Payen 和 Lorelei Corsaut 提供的技术帮助。-

引用

1.Goyette-Desjardins G， Auger JP， Xu J， Segura M， Gottschalk M. 猪链球菌，一种重要的猪病原体和新兴的人畜共患病病原体——基于血清分型和序列分型的全球分布更新。新兴微生物感染。2014;3（6）：e45.Epub格式 2015/06/04.PMID：26038745;PubMed Central PMCID：PMC4078792。

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2.Cloutier G， D'Allaire S， Martinez G， Surprenant C， Lacouture S， Gottschalk M. 猪群中猪链球菌血清型 5 感染的流行病学，有和没有临床疾病。兽医微生物。2003;97(1–2):135–51.Epub 格式 2003/11/26.PMID：14637045。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

3.Gottschalk M， Xu J， Calzas C， Segura M. 猪链球菌：一种新兴的还是被忽视的老病原体？未来的微生物学。2010;5(3):371–91.PMID：20210549

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

4.Gottschalk M.链球菌疾病。在：Straw BE，编辑。猪的疾病。爱荷华州艾姆斯：布莱克威尔酒吧;2006 年，第 769-83 页。

5.Lacouture S， Okura M， Takamatsu D， Corsaut L， Gottschalk M. 开发错配扩增突变测定法以正确分型猪链球菌血清型 1、2、1/2 和 14 的分离株。J Vet Diagn 投资。2020;32(3):490–4.Epub格式 2020/04/21.PMID：32306861;PubMed Central PMCID：PMC7377628。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

6.Gottschalk M，Segura M.链球菌病。猪的疾病：Wiley Blackwell;2019 年，第 934-50 页。

7.Varela NP， Gadbois P， Thibault C， Gottschalk M， Dick P， Wilson J. 猪链球菌的抗菌素耐药性和谨慎用药。Anim Health Res 修订版 2013;14(1):68–77.Epub格式 2013/05/21.PMID：23683342。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

8.黄杰， 马 J， 尚 K， 胡 X， 梁 Y， 李 D， 等.猪链球菌抗菌素耐药性相关动员组的进化和多样性：其他链球菌的可能移动遗传元件库。前细胞感染微生物。2016;6:118.Epub格式 2016/10/25.PMID：27774436;PubMed Central PMCID：PMC5053989。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

9.Segura M、Aragon V、Brockmeier SL、Gebhart C、Greeff A、Kerdsin A 等。抗菌药物限制时代猪链球菌研究与预防的最新情况：第四届链球菌国际研讨会。苏伊斯。病 原 体。4;2020(9).Epub格式 5/2020/05.PMID：20;PubMed Central PMCID：PMC32422856。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

10.Segura M. 猪链球菌疫苗：候选抗原和进展。专家Rev疫苗。2015;14(12):1587–608.Epub 格式 2015/10/16.PMID：26468755。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

11.Weisse C、Dittmar D、Jakobczak B、Florian V、Schutze N、Alber G 等人。由六种保守免疫原组成的猪链球菌疫苗的免疫原性和保护效力。兽医研究 2021;52(1):112.Epub格式 2021/08/27.PMID：34433500;PubMed Central PMCID：PMC8390293。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

12.Fittipaldi N， Segura M， Grenier D， Gottschalk M. 参与猪病原体和人畜共患病原体猪链球菌引起的感染发病机制的毒力因子。未来的微生物。2012;7(2):259–79.Epub格式 2012/02/14.PMID：22324994。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

13.Segura M， Fittipaldi N， Calzas C， Gottschalk M. 关键猪链球菌毒力因子：它们真的都很关键吗？趋势微生物。2017;25(7):585–99.Epub 格式 2017/03/10.PMID：28274524。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

14.Lecours MP， Gottschalk M， Houde M， Lemire P， Fittipaldi N， Segura M. 猪链球菌细胞壁修饰和水溶素在树突状细胞抵抗补体依赖性杀伤中的关键作用。2011 年感染杂志;204(6):919–29.Epub 格式 2011/08/19.PMID：21849289。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

15.Lecours M-P、Letendre C、Clarke D、Lemire P、Galbas T、Benoit-Biancamano M-O 等人。猪链球菌血清型 4 感染期间 CD2+ T 细胞的免疫反应性。科学报告。2016;6(1):38061.PMID：27905502

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

16.Goyette-Desjardins G， Lacouture S， Auger JP， Roy R， Gottschalk M， Segura M. 使用糖缀合物获得的针对猪链球菌血清型 2 荚膜多糖的单克隆抗体的表征和保护活性。病 原 体。2019;8(3).Epub格式 2019/09/11.PMID：31500262;PubMed Central PMCID：PMC6789524。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

17.Su H， Liu Q， Bian X， Wang S， Curtiss R 3rd， Kong Q. 重组沙门氏菌疫苗合成和递送肺炎链球菌荚膜多糖.美国国家科学院院刊 2021;118(2).Epub格式 2021/01/01.PMID：33380455;PubMed Central PMCID：PMC7812815。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

18.Banerjee K，杂色议员，Diago-Navarro E，弗里斯 BC。感染患者对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的血清抗体反应。mSphere的。2021;6(2).Epub格式 2021/03/05.PMID：33658281。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

19.Fabbrini M、Rigat F、Tuscano G、Chiarot E、Donders G、Devlieger R 等。研究 B 组链球菌三价糖结合疫苗在孕妇中引发的母体和脐带抗体的功能活性。J 感染。2018;76(5):449–56.Epub 格式 2018/01/29.PMID：29374589。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

20.Finn A.细菌多糖蛋白结合疫苗。Br Med 公牛。2004;70:1–14.Epub 格式 2004/09/02.PMID：15339854。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

21.Cyster JG，艾伦疾病预防控制中心。B细胞反应：细胞相互作用动力学和决策。细胞。2019;177(3):524–40.Epub格式 2019/04/20.PMID：31002794;PubMed Central PMCID：PMC6538279。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

22.Roco JA， Mesin L， Binder SC， Nefzger C， Gonzalez-Figueroa P， Canete PF， et al. 类转换重组在生发中心很少发生。免疫。2019;51（2）：337–50 E7。Epub格式 2019/08/04.PMID：31375460;PubMed Central PMCID：PMC6914312。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

23.Muramatsu M， Kinoshita K， Fagarasan S， Yamada S， Shinkai Y， Honjo T. 类开关重组和超突变需要活化诱导的胞苷脱氨酶 （AID），这是一种潜在的 RNA 编辑酶。细胞。2000;102(5):553–63.Epub 格式 2000/09/28.PMID：11007474。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

24.Methot SP， Di Noia JM.体细胞超突变和类转换重组的分子机制。高级免疫。2017;133:37–87.Epub 格式 2017/02/22.PMID：28215280。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

25.Victora GD，Nussenzweig MC.生发中心。Annu Rev Immunol.2022;40:413–42.Epub 格式 2022/02/04.PMID：35113731。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

26.Weintraub A.细菌多糖抗原的免疫学。Carbohydr Res. 2003年;338(23):2539–47.Epub 格式 2003/12/13.PMID：14670715。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

27.亨德里克斯 J、博斯 NA、克罗斯女性生殖器切割。记忆边缘区B细胞的异质性。暴击 Rev Immunol。2018;38(2):145–58.Epub格式 2018/06/12.PMID：29887727;PubMed Central PMCID：PMC5989013。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

28.Defrance T、Taillardet M、Genestier L. T 细胞非依赖性 B 细胞记忆。Curr Opin 免疫学。2011;23(3):330–6.Epub格式 2011/04/13.PMID：21482090。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

29.马丁 F、奥利弗 AM、科尔尼 JF。边缘区和 B1 B 细胞联合起来，对 T 非依赖性血源性颗粒抗原的早期反应。免疫。2001;14(5):617–29.Epub 格式 2001/05/24.PMID：11371363。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

30.Calzas C、Taillardet M、Fourati IS、Roy D、Gottschalk M、Soudeyns H 等人。猪链球菌和B族荚膜链球菌多糖对体液反应的免疫调节特性的评价。病 原 体。2017;6(2).Epub格式 2017/04/21.PMID：28425925;PubMed Central PMCID：PMC5488650。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

31.Calzas C， Lemire P， Auray G， Gerdts V， Gottschalk M， Segura M. 在猪链球菌血清型 2 感染的动物中，对荚膜多糖特异性的抗体反应受损。感染免疫。 2015年;83(1):441–53.Epub格式 2014/11/10.PMID：25385801。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

32.Goyette-Desjardins G、Calzas C、Shiao TC、Neubauer A、Kempker J、Roy R 等。使用荚膜多糖结合疫苗预防猪链球菌血清型 2 感染。2016 年感染免疫;84(7):2059–75.Epub格式 2016/04/27.PMID：27113360;PubMed Central PMCID：PMC4936365。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

33.Lavagna A、Auger JP、Dumesnil A、Roy D、Girardin SE、Gisch N 等。猪链球菌血清型 1 诱导的白细胞介素-2 信号转导具有菌株依赖性，有助于小鼠感染模型中全身性疾病期间的细菌清除和炎症。兽医研究 2019;50(1):52.Epub格式 2019/07/03.PMID：31262357;PubMed Central PMCID：PMC6604435。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

34.Charland N， Harel J， Kobisch M， Lacasse S， Gottschalk M. 猪链球菌血清型 2 突变体缺乏荚膜表达。微生物学（阅读）。1998;144（第 2 部分）：325-32。Epub格式 1998/03/11.PMID：9493370。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

35.尼尔森 H、罗斯韦尔 I、罗宾斯 P、Skjelbred CF、安德森 S、Slupphaug G 等人。尿嘧啶-DNA 糖基化酶 （UNG） 缺陷小鼠揭示了该酶在 DNA 复制过程中的主要作用。摩尔细胞。2000;5(6):1059–65.Epub 格式 2000/07/27.PMID：10912000。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

36.Zahn A、Daugan M、Safavi S、Godin D、Cheong C、Lamarre A 等。急性免疫反应期间体内同种型转换和亲和力成熟与UNG缺陷小鼠循环自身抗体之间的功能分离。免疫学杂志。2013;190(12):5949–60.Epub格式 2013/05/15.PMID：23667108。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

37.Mombaerts P、Clarke AR、Rudnicki MA、Iacomini J、Itohara S、Lafaille JJ 等。T 细胞抗原受体基因 α 和 β 的突变在不同阶段阻断胸腺细胞发育。自然界。1992;360(6401):225–31.Epub格式 1992/11/19.PMID：1359428。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

38.北村 D、罗斯 J、库恩 R、拉杰夫斯基 K.通过靶向破坏免疫球蛋白μ链基因的膜外显子来缺陷B细胞小鼠。自然界。1991;350(6317):423–6.Epub 格式 1991/04/04.PMID：1901381。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

39.沙皇 MJ、Kersh EN、Mijares LA、Lanier G、Lewis J、Yap G 等。X连锁淋巴组织增生性疾病基因SH2D1A/DSHP/SAP缺陷小鼠的淋巴细胞反应和细胞因子产生改变。美国国家科学院院刊，2001年;98(13):7449–54.Epub格式 2001/06/19.PMID：11404475;PubMed Central PMCID：PMC34689。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

40.Neila-Ibá?ez C， Casal J， Hennig-Pauka I， Stockhofe-Zurwieden N， Gottschalk M， Migura-García L， et al. 对德国、荷兰和西班牙养猪场猪链球菌相关疾病经济影响的随机评估。2021;8(958).PMID：34490389

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

41.Letendre C， Auger J-P， Lemire P， Galbas T， Gottschalk M， Thibodeau J， et al. 猪链球菌血清型 2 感染损害白细胞介素-12 的产生和树突状细胞的 MHC-II 限制性抗原呈递能力。前免疫。2018;9:1199–.PMID：29899744。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

42.Dominguez-Punaro Mde L， Segura M， Radzioch D， Rivest S， Gottschalk M. C57BL/6 和 A/J 小鼠品系对猪链球菌血清型 2 感染的易感性比较。2008 年感染免疫;76(9):3901–10.Epub 格式 2008/06/25.PMID：18573893;PubMed Central PMCID：PMC2519407。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

43.Dobano C、Sanz H、Sorgho H、Dosoo D、Mpina M、Ubillos I 等人。不同环孢子表位抗体的浓度和亲和力与RTS，S/AS01E疟疾疫苗效力相关。国家通讯社。2019;10(1):2174.Epub格式 2019/05/17.PMID：31092823;PubMed Central PMCID：PMC6520358。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

44.Puschnik A， Lau L， Cromwell EA， Balmaseda A， Zompi S， Harris E. 登革热特异性中和抗体与人类原发性和继发性登革热病毒 3 自然感染血清亲和力之间的相关性。PLoS Negl Trop Dis. 2013;7（6）：e2274.Epub 格式 2013/06/21.PMID：23785536;PubMed Central PMCID：PMC3681624。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

45.Usinger WR，卢卡斯 AH。亲和力是人类抗体对肺炎球菌荚膜多糖的保护功效的决定因素。1999年感染免疫;67(5):2366–70.Epub格式 1999/05/04.PMID：10225896;PubMed Central PMCID：PMC115979。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

46.Litzler LC， Zahn A， Meli AP， Hebert S， Patenaude AM， Methot SP， et al. PRMT5 对 B 细胞发育和生发中心动力学至关重要。国家通讯社。2019;10(1):22.Epub格式 2019/01/04.PMID：30604754;PubMed Central PMCID：PMC6318318。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

47.Arulraj T、Binder SC、Robert PA、Meyer-Hermann M. Germinal 中心关闭。前免疫。2021;12:705240.Epub 格式 2021/07/27.PMID：34305944;PubMed Central PMCID：PMC8293096。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

48.Racine R， Jones DD， Chatterjee M， McLaughlin M， Macnamara KC， Winslow GM. 细胞内细菌感染期间生发中心反应受损和局部 IgG 产生的抑制。免疫学杂志。2010;184(9):5085–93.Epub格式 2010/03/31.PMID：20351185;PubMed Central PMCID：PMC3190965。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

49.Cunningham AF， Gaspal F， Serre K， Mohr E， Henderson IR， Scott-Tucker A， et al. 沙门氏菌诱导没有生发中心的转换抗体反应，从而阻碍感染的细胞外扩散。免疫学杂志。2007;178(10):6200–7.Epub 格式 2007/05/04.PMID：17475847。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

50.Saumyaa ， Arjunaraja S， Pujanauski L， Colino J， Torres RM， Snapper CM. 肺炎链球菌细胞壁内的免疫抑制特性，可抑制 T 滤泡辅助细胞、生发中心和浆细胞对共免疫异源蛋白的反应的产生。感染免疫。 2013年;81(9):3426–33.Epub格式 2013/07/03.PMID：23817619;PubMed Central PMCID：PMC3754212。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

51.Chattopadhyay G， Chen Q， Colino J， Lees A， Snapper CM. 完整细菌抑制对细菌来源和异源可溶性 T 细胞依赖性抗原的体液免疫反应的诱导。免疫学杂志。2009;182(4):2011–9.Epub 格式 2009/02/10.PMID：19201854。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

52.Segura MA、Cleroux P、Gottschalk M. 猪链球菌和 B 组链球菌在与小鼠巨噬细胞的相互作用上有所不同。FEMS Immunol Med 微生物。1998;21(3):189–95.Epub格式 1998/08/26.PMID：9718208。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

53.Chabot-Roy G， Willson P， Segura M， Lacouture S， Gottschalk M. 猪中性粒细胞吞噬和杀死猪链球菌。微生物病理。2006;41(1):21–32.Epub格式 2006/05/23.PMID：16714092。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

54.Johri AK、Paoletti LC、Glaser P、Dua M、Sharma PK、Grandi G 等人 B 组链球菌：全球发病率和疫苗开发。Nat Rev 微生物。2006;4(12):932–42.Epub 格式 2006/11/08.PMID：17088932;PubMed Central PMCID：PMC2742968。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

55.索伦森 RU，埃德加 JDM。抗体介导的 S 免疫概述。肺炎：肺炎球菌感染、肺炎球菌免疫评估和 IG 产品评估建议。输液。2018;58 增刊3：3106-13。Epub格式 2018/12/12.PMID：30536434。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

56.Goyette-Desjardins G， Auger JP， Dolbec D， Vinogradov E， Okura M， Takamatsu D， et al. 猪链球菌血清型 3、7、8 和 9 纯化荚膜多糖免疫原性特性的比较研究：血清型 3 多糖诱导调理作用 IgG 反应。感染免疫。 2020年;88(10).Epub格式 2020/08/05.PMID：32747605;PubMed Central PMCID：PMC7504959。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

57.Harding CV， Roof RW， Allen PM， Unanue ER. pH 值和多糖对肽与 II 类主要组织相容性复合物分子结合的影响。美国国家科学院院刊，1991年;88(7):2740–4.Epub格式 1991/04/01.PMID：2011583;PubMed Central PMCID：PMC51314。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

58.卡尔卡-莫尔 WM、齐亚纳博斯 AO、布莱恩特 PW、尼迈耶 M、普洛格 HL、卡斯珀 DL。两性离子多糖通过MHC II类依赖性相互作用刺激T细胞。免疫学杂志。2002;169(11):6149–53.Epub 格式 2002/11/22.PMID：12444118。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

59.鲷鱼 CM、Shen Y、Khan AQ、Colino J、Zelazowski P、Mond JJ 等。不同类型的T细胞有助于诱导对肺炎链球菌的体液免疫反应。趋势免疫。2001;22(6):308–11.Epub 格式 2001/05/30.PMID：11377289。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

60.朴C，金TJ。T 细胞依赖性抗体反应的扩增和亚分类，以涵盖先天样 T 细胞在抗体反应中的作用。免疫网络。2018;18（5）：e34.Epub格式 2018/11/08.PMID：30402329;PubMed Central PMCID：PMC6215906。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

61.Seele J、Singpiel A、Spoerry C、von Pawel-Rammingen U、Valentin-Weigand P、Baums CG。在猪链球菌中鉴定一种新型宿主特异性 IgM 蛋白酶。J 细菌学. 2013;195(5):930–40.Epub格式 2012/12/18.PMID：23243300;PubMed Central PMCID：PMC3571317。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

62.Breitfelder AK， Schrodl W， Rungelrath V， Baums CG， Alber G， Schutze N， et al. 猪链球菌免疫球蛋白 M 降解酶 （Ide （Ssuis）） 损害猪 B 细胞信号传导。前免疫。2023;14:1122808.Epub格式 2023/03/07.PMID：36875121;PubMed Central PMCID：PMC9980343。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

63.Rungelrath V、Weisse C、Schutze N、Muller U、Meurer M、Rohde M 等人。猪链球菌裂解IgM可减少与细菌表面结合的IgM，是一种新的补体逃避机制。毒性。2018;9(1):1314–37.Epub 格式 2018/07/13.PMID：30001174;PubMed Central PMCID：PMC6177247。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

64.里克曼 K、赛德尔 A、Szewczyk K、克里姆克 K、朗格拉斯 V、鲍姆斯 CG。猪链球菌cps7：一种新兴的毒力序列类型（ST29），在断奶后的早期适应性免疫反应中显示出明显的、由IgM决定的细菌在仔猪血液中的存活模式。兽医研究 2018;49(1):48.Epub格式 2018/06/16.PMID：29903042;PubMed Central PMCID：PMC6003162。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

65.Spoerry C， Seele J， Valentin-Weigand P， Baums CG， von Pawel-Rammingen U. IgdE 的鉴定和表征，IgdE 是一种新型猪链球菌 IgG 降解蛋白酶，对猪 IgG 具有独特的特异性。生物化学杂志 2016;291(15):7915–25.Epub格式 2016/02/11.PMID：26861873;PubMed Central PMCID：PMC4824999。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

66.Slater JD、Allen AG、May JP、Bolitho S、Lindsay H、Maskell DJ。转座子Tn917诱变马链球菌和猪链球菌。 兽医微生物学。2003;93(3):197–206.PMID：12695044

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

67.Roncagalli R， Taylor JE， Zhang S， Shi X， Chen R， Cruz-Munoz ME， et al.通过 SAP 相关接头 EAT-2 负调控自然杀伤细胞功能。Nat 免疫。2005;6(10):1002–10.Epub 格式 2005/08/30.PMID：16127454。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

68.Yin L， Al-Alem U， Liang J， Tong WM， Li C， Badiali M， et al.缺乏 X 连锁淋巴组织增生性疾病基因汁液的小鼠表现出对小鼠 γherpesvirus-68 和低丙种球蛋白血症的易感性增加。J Med Virol。2003;71(3):446–55.Epub格式 2003/09/11.PMID：12966553。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

69.Dominguez-Punaro MC， Segura M， Plante MM， Lacouture S， Rivest S， Gottschalk M. 猪链球菌血清型 2 是一种重要的猪和人类病原体，在感染小鼠模型中诱导强烈的全身和脑炎症反应。免疫学杂志。2007;179(3):1842–54.Epub格式 2007/07/21.PMID：17641051。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

70.Auger JP， Dolbec D， Roy D， Segura M， Gottschalk M. 猪链球菌血清型 2 荚膜多糖在与树突状细胞相互作用中的作用是菌株依赖性的，但对毒力仍然至关重要。PLoS 一。2018;13（7）：e0200453.Epub 格式 2018/07/13.PMID：30001363;PubMed Central PMCID：PMC6042740。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

71.Wang C， Hart M， Chui C， Ajuogu A， Brian IJ， de Cassan SC， et al. 生发中心 B 细胞和 T 滤泡辅助细胞对病毒载体和蛋白质佐剂疫苗的反应。免疫学杂志。2016;197(4):1242–51.Epub格式 2016/07/15.PMID：27412417;PubMed Central PMCID：PMC4974488。

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72.Goyette-Desjardins G， Roy R， Segura M. 小鼠全血调理吞噬作用测定，以评估针对包膜细胞外细菌的抗体的保护作用。在：Lepenies B，编辑。基于碳水化合物的疫苗：方法和方案。纽约，纽约：施普林格纽约;2015 年，第 81-92 页。