免费医学论文发表-自然相关细菌调节秀丽隐杆线虫的奥赛病毒感染
抽象
与生物体相关的微生物可以显着调节其对病毒感染的易感性，但我们对单个微生物影响的理解仍然有限。线虫秀丽隐杆线虫是一种模式生物，在自然界中栖息在富含细菌的环境中。在这里，我们研究了 71 种天然相关细菌对 C 的影响。秀丽隐杆线虫对其唯一已知的天然病毒奥赛病毒易感。我们的研究结果表明，C.线虫受单细菌环境的显着影响。与大肠杆菌环境参考相比，大多数测试细菌降低了碳。Elegan对病毒感染的易感性。这种减少不是由病毒粒子降解或细菌营养不良引起的。细菌菌株 JUb44 和鞘杆菌 BIGb0172 对病毒感染的抑制不需要 RIG-I 同源物 DRH-1，已知 DRH-<> 可激活抗病毒反应，例如 RNA 干扰和转录调控。我们的研究强调了在病毒感染研究中考虑自然生物环境的必要性，并为未来宿主-微生物-病毒相互作用的研究开辟了道路。
作者摘要
秀丽隐杆线虫是一种线虫蛔虫，自然栖息在分解的植物物质中——动物觅食的富含细菌的环境。C的采样。在其自然栖息地中的线虫导致了其唯一已知的天然病毒奥赛病毒的发现。这一发现加强了使用C的病毒学研究。线虫。然而，大多数研究都是使用实验室细菌环境进行的。在这里，我们研究了自然界中与线虫相关的细菌对其对奥赛病毒感染易感性的影响。我们测试了一组不同的细菌，其中大多数来自存在奥赛病毒的地区。我们发现，与参考实验室细菌环境相比，这些天然细菌中的大多数降低了对感染的易感性。我们深入研究了一些细菌，发现即使在缺乏主要抗病毒免疫反应的动物中，一些细菌也能诱导对感染的抵抗力。我们的研究强调了相关微生物在宿主与病毒相互作用中发挥的关键作用，并强调了在研究中考虑自然环境的重要性。
数字
Fig 7Fig 8图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8图1图2图3
引文： González R， Félix M-A （2024） 天然相关细菌调节秀丽隐杆线虫的奥赛病毒感染。PLoS 病理学 20（1）： e1011947 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011947
编辑 器： Emily R. Troemel，美国加州大学圣地亚哥分校
收到： 4年2023月4日;接受： 2024年17月2024日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2024 González， Félix。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金： R.G. 由 EMBO 博士后奖学金 （ALTF 311-2021） 资助。M.A.F. 由国家科学研究中心资助。这项工作的部分资金来自国家研究署ANR-19-CE12-0025的赠款。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
生物体的生物环境影响其许多性状，包括其免疫反应[1]。特别是，微生物可以影响与致病病毒的相互作用[2]。在某些情况下，共生微生物和病原微生物可以增强宿主免疫力，减少病毒复制和传染性，从而提供预防感染的保护[3\u6]。相反，一些微生物会增加宿主对病毒感染的易感性;其中一些甚至可能对新病毒成功感染宿主至关重要[7\u9]。除了宿主、病毒和微生物之间错综复杂的三方相互作用之外，还必须加上形成相关微生物群落的单个微生物之间的复杂关系。对简化病理系统和相关微生物的研究将有助于理解这些相互作用和宿主对病毒感染的免疫力。
线虫秀丽隐杆线虫被广泛用作模式生物[10]，为研究微生物-宿主相互作用提供了理想的模型系统，在过去20年中取得了有见地的发现[11]。C 的一个关键特性。用于此类研究的线虫是，可以使用胚胎抵抗的漂白处理来释放动物的相关微生物，然后随意将它们与一种或几种微生物重新结合。
C的自然栖息地。线虫是腐烂的果实或其他分解的植物物质，富含细菌。这些细菌不仅是线虫的主要食物来源，也是其生物环境的一部分[12,13]。在过去的十年中，与C.线虫在其自然栖息地的特征已经显现出来，揭示了它们存在于线虫的外部环境、肠腔中，以及作为食物裂解和消化的部分[14\u16]。在从欧洲（特别是法国和西班牙）采集的样本中，发现最丰富的门是假单胞菌门（同义词：变形菌门，一组革兰氏阴性细菌）。还鉴定了其他门，如拟杆菌门（同义词：拟杆菌门，革兰氏阴性菌门）、芽孢杆菌门（同义词：厚壁菌门，革兰氏阳性菌门）和放线菌门（同义词：放线菌门，革兰氏阳性菌门）。此外，观察到富含变形菌门的苹果样品促进了C的增殖。线虫[16]。细菌环境已被证明会影响 C。秀丽隐杆线虫代谢、信号通路和免疫应答[17\u20]。而伴生细菌可以保护C。来自细胞外病原体（如细菌或真菌）的秀丽隐杆线虫[21\u26]，它们在调节与细胞内病原体（包括病毒）相互作用方面的作用仍未得到探索。
C中唯一已知的天然存在的病毒。秀丽隐杆线虫是奥赛病毒（Orsay virus， OrV）[27]。该病毒最初是从法国奥赛的腐烂苹果上发现的动物中分离出来的[27]。OrV 是一种阳性单链 RNA 病毒，其二分基因组与诺达病毒相似。该病毒在C时进入新宿主。线虫在进食时摄入病毒粒子，一旦进入宿主肠腔，就会感染肠道细胞。受感染的肠道细胞释放病毒粒子，病毒粒子通过粪口途径进一步水平传播给其他个体。OrV感染通过减少和延迟繁殖来影响宿主的适应性[28]。秀丽隐杆线虫缺乏在其他动物中发现的免疫成分，但能够对病毒感染产生免疫反应[29]。已知的机制包括使用 RNA 干扰 （RNAi） 和尿苷化反应来靶向病毒 RNA 进行降解，泛素介导的途径可能靶向病毒蛋白进行降解，以及响应感染的特定基因的转录激活。这种转录反应包括对 C 的特异性免疫反应。线虫的肠道细胞内病原体（即微孢子虫或病毒）称为细胞内病原体反应（intracellular pathogen response， IPR）[30]。IPR 涉及有限数量的基因的上调，包括属于 pals 基因家族的基因（其生化功能目前尚不清楚）和预测编码泛素连接酶成分的基因。IPR 依赖于解旋酶 DRH-1，它是 RIG-I 家族成员，它可能是病毒传感器，对 RNAi 反应也是必不可少的。在DRH-1的下游，IPR部分依赖于转录因子ZIP-1[31–33]。重度感染会引发一般的“生物应激反应”，包括应激反应基因（如lys-3）的上调[34]。C中涉及的许多机制和组件。秀丽隐杆线虫对奥赛病毒的免疫应答在进化上是保守的[31,32,34,35]。因此，研究这些反应可以为其他生物体中的病毒-宿主相互作用提供有价值的见解。
在这项研究中，我们研究了细菌环境对C的影响。秀丽隐杆线虫对 OrV 的易感性。我们专注于从C中分离的细菌克隆的单一培养。秀丽隐杆线虫的自然栖息地[14–16,36–38]，简称为“天然细菌”，其中许多是在发现奥赛病毒的地方分离出来的。我们主要研究了假单胞菌门的细菌菌株。此外，我们还研究了来自芽孢杆菌门、拟杆菌门和放线菌门的细菌菌株。我们的目的是确定细菌环境是否会影响线虫对病毒的反应，并更深入地了解特定细菌菌株如何调节宿主对病毒的易感性。通过研究 C.秀丽隐杆线虫、其天然细菌环境和奥赛病毒，我们的研究旨在为微生物环境在调节宿主-病原体相互作用中的作用提供新的见解，并为进一步研究奠定基础，有可能发现以前未知的病毒防御机制。
结果
单一细菌环境调节 C。秀丽隐杆线虫对病毒感染的易感性
我们研究了 71 种天然细菌菌株（S1 表）对 C 易感性的影响。秀丽隐杆线虫到OrV。在初步筛选中，我们使用了携带细胞内感染的pals-5p：：GFP报告基因的动物[39]。我们在五个实验区块（S1图）中进行了筛选，每个细菌环境测试了三个群体，每组≈100只动物，并在每个区块中包括大肠杆菌OP50作为参考。我们将无轴胚胎转移到接种有单一细菌菌株的平板上，用 OrV 接种平板，接种后 72 小时 （hpi） 对激活 pals-5 报告基因的动物比例进行评分，无论是否暴露于病毒。在没有病毒的情况下，没有细菌触发pals-5报告基因激活（S2图）。基于与E上病毒接种的群体相比，显示pals-5p：：GFP激活的群体中病毒接种动物的相对比例。大肠杆菌OP50参考文献（图1，上图），我们将细菌菌株分为三组：59个PALS-5报告基因激活的抑制因子（显著低于OP50的激活），5个增强子（显著高于OP50的激活）和7个具有与E相似作用的细菌。大肠杆菌环境。我们在不同的区块中测试了一些细菌菌株，验证了它们对病毒感染的影响是可重复的（S3A图）;在同一块内再次检查所有 6 种相对速率高于 1 的细菌，成功复制了初始筛选的观察结果（S3B 图）。对于在病毒感染后未观察到报告基因激活的细菌，我们想知道细菌环境是否阻止了其他类型的应激条件（如热应激）的PALS-5报告基因激活[30]。在这些细菌环境中，pals-5报告基因可能被热应激激活，表明抑制对病毒感染的反应具有特异性（S1表）。
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图 1. 大多数天然结合的细菌会减少碳。线虫对病毒感染的易感性与E相比。大肠杆菌执行部分50.
对于每种细菌环境，用奥赛病毒JUv100攻击约54只ERT1580动物的三个重复。在5 hpi下测量激活pals-72p：：GFP报告基因的动物比例（原始数据在S2文件中）。此处的数据绘制为三个重复之间的平均值±标准偏差，相对于同一天测量的 Escherichia OP50 的平均比例。使用以细菌为因子的一般线性模型和 Dunnett 对比法计算显着性，以将所有条件与大肠杆菌 OP50 参考（黄色突出显示的条形图）进行比较。诱导pals-0p：：GFP报告基因激活显著减少（P < 05.5）的细菌菌株以红色着色（PALS-0相对激活低于5.5的细菌菌株为深红色），与OP50无显著差异的细菌菌株为灰色，与OP16无显著差异的细菌菌株为蓝色，与OP<>无显著差异的细菌菌株为蓝色。细菌根据其系统发育关系进行排列，顶行提供分类学分类，底行提供基于其 <>S 序列的系统发育树。蓝色的细菌菌株名称表示这些菌株具有重要的系统发育信号。选择标有灰点的细菌菌株进行进一步研究。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011947.g001
我们的筛选包括一组 71 种细菌菌株的系统发育多样性（图 1）。使用系统发育关联的局部指标（局部Moran's I检验），我们没有检测到大多数菌株的系统发育信号，这表明在这种采样水平下，性状值随机分布在树上。然而，我们在Comamonas菌株中发现了一个显著的系统发育信号（P < 0.01），表明这三种菌株在触发特别高的C方面存在潜在的系统发育聚类。秀丽隐杆线虫对病毒感染的反应。我们还注意到，拟杆菌的所有 5 个测试成员在暴露于 OrV 时完全抑制了 pals-<> 的表达。
在四个案例中，我们的筛选包括两种不同的细菌菌株，它们用相同的物种名称标记，表明它们的关系特别密切，并且不同的菌株具有相似的效果（S4A图）。我们还测试了各种 E.大肠杆菌菌株发现，尽管存在一些微小但显着的差异，但在病毒接种的动物中，所有差异都使PALS-5p：：GFP报告基因激活比例相似（S4B图）。
对所选细菌进行深入表征
从这一点开始，我们专注于五个随机选择的天然细菌（由图1中的灰点表示）：在pals-5筛选中，两个增强了病毒接种动物的pals-5p：：GFP激活，三个抑制了它（S2图）。我们使用荧光原位杂交（FISH）直接对病毒RNA进行染色，以更直接地评估细菌环境对病毒感染的影响，并量化携带病毒感染的肠道细胞的动物数量。在增强的不动杆菌 BIGb0102 和三种抑制细菌上，病毒 FISH 染色结果与 pals-5 报告基因相匹配（图 2A 和 2B）。在Comamonas BIGb0172环境中，FISH染色动物的比例与OP50相似（图2A）。
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图 2. 对五种细菌菌株的关注证实了它们对 C 的调节。秀丽隐杆线虫对病毒感染的易感性。
（A-B）在对诱导 （A） 强激活或 （B） 在初始筛选中以 54 hpi 的 pals-5p：：GFP 在 72 hpi 的 pals-5p：：GFP 下未激活的细菌进行 OrV 接种后，显示 pals-50p：：GFP 激活（左图）或感染肠细胞（由 FISH 对病毒染色;右图）的 ERT100 动物比例，伴有大肠杆菌OP2作为参考。每个细菌菌株都在本图和下图中进行了颜色编码。在3个独立实验（不同日期）中对至少5只动物测定GFP阳性动物的比例，每个条件26个生物学重复。这两个实验分别用三角形和圆形表示。（C） 三个转录报告基因 （pals-2， F1F6.72 和 sdz-0102），在 Acinetobacter BIGb0172 或 Comamonas BIGb100 中接种奥赛病毒后 72 小时，在三个独立实验中测定，每次重复 1 只动物。每个实验都由数据点的不同形状表示。（D） 5 hpi 时的病毒载量，使用病毒 RNA100 的 RT-qPCR 测量，同时在 2 只动物的 54 次生物学重复中测量 pals-72p：：GFP 报告基因激活（左图）。从这 5 个总体中，通过合并每个总体创建了 100 个合并样本。使用基因 eft-1264 的拷贝数作为内源性参考（右）实现数据归一化。（E） ERT72 动物在 1264 hpi 下的比例，当用不同的奥赛病毒株对不同细菌进行攻击时，显示 pals-50p：：GFP 激活，分三次重复进行，每次 0 只动物。（F） 感染 C 的比例。布里格萨JU001 动物在 0 hpi 下接种 Santeuil 病毒株 JUv01 对不同细菌，使用 FISH 对病毒进行测定。每个实验评估三个生物学重复，每个数据点使用动物。数据以平均值±标准误差表示。黑色符号表示标记细菌与大肠杆菌OP0参考文献之间差异的显着性：***P < 01.0;** P < 05.0;* 05.2 < P < 2.2;高于 <>.<> 的 P 值标记为“ns”（本研究所有数字的符号相同）。使用一般线性混合模型计算面板 <>A-B 的显着性，其中细菌是固定因子，并实验随机效应;对于面板 <>C，我们使用了具有 Gamma 分布和对数链接函数的一般线性混合模型，其中细菌是固定因子;Tukey对比用于事后分析。对于面板 <>D-F，我们使用以细菌为因素的方差分析，并使用 Dunnett 检验进行事后分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011947.g002
我们进一步测试了 F26F2 的两种增强细菌荧光报告基因。1或SDZ-6基因是IPR应答的一部分，但与PALS-5不同，它们不受转录因子ZIP-1的控制[33]。对于不动杆菌 BIGb0102，我们观察到 F26F2 的类似基因激活模式。1 和 SDZ-6 报告者与 PALS-5 一样。但是，在 Comamonas BIGb0172 环境中，F26F2.在病毒感染时，1 个报告基因（而不是 SDZ-6）的激活水平高于 OP50（图 2C）。
为了评估动物种群中的病毒复制水平，我们使用RT-qPCR量化病毒载量，在胚胎放置在接种病毒的细菌草坪上72小时后收集动物。与OP50上的动物相比，耐药诱导细菌的动物显示出RNA250病毒拷贝的显着而强烈（>1倍）减少。与OP0172相比，在Comamonas BIGb18上饲养的动物的病毒载量降低了50倍，并且我们没有检测到在OP50和不动杆菌BIGb0102上达到的病毒水平之间存在显着差异（图2D）。
我们测试了细菌环境的影响是否特定于我们主要实验中使用的常规病毒株（OrV菌株JUv1580）。我们测试了JUv2572，据报道，JUv1580是一种OrV菌株，其传染性比JUv40更强，并且容易感染更多的宿主前肠细胞[2]。诱导耐药性的细菌在接种该病毒株时也诱导耐药性（图<>E）。
综上所述，红杆菌JUb44、鞘杆菌BIG0116和Lelliottia JUb276均能强烈抑制C的病毒感染。elegans 和下游 IPR 响应。在增强 IPR 反应的两种测试细菌中，与 E 相比，Comamonas BIGb0172 的病毒载量较低。大肠杆菌OP50，而 OrV 感染动物的比例在 Acinetobacter BIGb0102 上增加。
Caenorhabditis briggsae，一种与C有关的物种。在类似环境中发现的线虫也自然感染了结节样RNA病毒[27,28]。我们测试了 C。briggsae 对 Chryseobacterium JUb44 或 Lelliottia JUb276 上的 Santeuil 病毒易感性，它们抑制 C。OrV感染线虫。有趣的是，这两种细菌环境并没有呈现C。briggsae 对 Santeuil 病毒具有抗性，表明它们的作用是 C 特异性的。线虫与OrV的相互作用（图2F）。
天然细菌对C的影响。秀丽隐杆线虫的生长速度与其对病毒感染的影响不匹配
我们想知道细菌是否通过影响C来影响OrV的繁殖。线虫种群和个体生长参数。我们检验了 C 之间相关性的假设。线虫对每种细菌的生长参数和对病毒感染的易感性。
首先，作为种群增长的代表，我们测量了五种细菌和E中每一种随时间推移的后代产量。大肠杆菌，在没有病毒的情况下。与大肠杆菌OP0102相比，IPR增强不动杆菌BIGb50的动物总育雏面积显著增加（图3A），而Comamonas BIGb0172、Lelliottia JUb276和鞘杆菌BIGb0116则显著减少。除不动杆菌BIGb0102外，与大肠杆菌OP50相比，所有细菌环境都显着延迟了后代的产生（图3A），也就是说，耐药性诱导的Chryseobacterium JUb44和允许的Comamonas BIGb0172之间没有显着差异。
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图 3. 所选细菌对 C 的适应性和发育率的影响。线虫在没有病毒感染的情况下。
（A）上图显示了放置在每个细菌菌株上时未感染的ERT54动物的总育雏大小。下图代表未感染的ERT54动物的活后代的每日产量。进行了两个独立的实验，其中每天监测个体动物的活后代，在每个实验中，每种细菌类型至少观察到5个个体。上图代表下图所示的后代总数;这两个实验分别用三角形和圆形表示。（B） 在1小时（左图）和54小时后（右图）将ERT46菌株的停滞的轴L62幼虫暴露于每种细菌后测定的成虫比例，在100只动物的群体中，每个细菌菌株的三个重复群体中的每一个。数据以平均值±标准误差表示。图表上的黑色符号表示与大肠杆菌 OP50 参考值相比差异的统计学显着性：*** P < 0.001;** P < 0.01;* 0.01 < P < 0.05。超过 0.05 的 P 值标记为“ns”。使用线性混合模型计算面板 3A 的显着性，其中细菌是固定因子，实验作为随机效应;Tukey对比用于事后分析。对于面板 3B，我们使用细菌作为因素的方差分析，并使用 Dunnett 检验进行事后分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011947.g003
此外，天然细菌环境对个体发育率有显著影响（图3B）。在将无轴阻滞的L46幼虫置于不动杆菌BIGb1上0102小时后，成年动物的比例高于OP50。Comamonas BIGb0172、Lelliottia JUb276、Chryseobacterium JUb44 和 Sphingobacterium BIGb0116 的成虫比例较低。对于后两者，此时没有观察到成虫，而16小时后，在所有环境中，种群完全由成虫组成。
因此，我们得出结论，不同细菌的个体和种群增长率与对病毒感染的易感性不匹配。
诱导耐药性细菌的作用在混合细菌环境中占主导地位
然后，我们想知道不理想的饮食是否可能是病毒耐药性的原因。为了验证这一假设，我们接种了含有抗性诱导菌株和大肠杆菌 OP50 的个体培养物的混合培养板。这三种测试的天然细菌即使最初以10%的比例接种也会引起耐药性（图4A）。
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图 4. 病毒感染抑制作用的混合细菌环境中的流行率。
在所有面板中，感染评估为72hpi。（A-F）ORV接种ERT5后pals-2p：：GFP报告基因或病毒RNA54的FISH染色（图B）：（A）在细菌草坪上以指定的比例接种耐药诱导细菌和OP50的双重组合（在四次重复中测定，每次100只动物）;（B）在播种有80-20%耐药性诱导细菌和BIGb102组合的细菌草坪上，BIGb100是一种允许病毒感染的细菌菌株（分三次重复测定，每次50只动物）;（C）在补充有OP100的耐药性诱导细菌的草坪上（在三次重复中测定，每次102只动物）;（D）在草坪上补充了BIGb50的耐药性诱导细菌;（E）在大肠杆菌OP100的草坪上，补充有诱导耐药性的天然细菌的活培养物或热杀灭培养物（在两个独立实验中测定，一个重复三次，另一个重复四次，每次重复50只动物 - 每个实验由数据点的不同形状表示）;（F）在补充有重悬沉淀或过滤的诱导耐药性天然细菌的上清液的Escherichia OP100上（在四次重复中测定，每次50只动物）。在所有面板中，顶行显示了实验设计的示意图。数据以平均值±标准误差表示。黑色符号表示标记细菌与大肠杆菌OP0参考文献之间差异的显着性：***P < 001.0;** P < 01.0;* 01.0 < P < 05.0;高于 05.<> 的 P 值标记为“ns”（本研究所有数字的符号相同）。在图A-D和图F中，使用一般线性模型计算显著性，其中因素是细菌和治疗。在图E中，使用一般线性混合模型计算显著性，其中因素是细菌和治疗，实验被认为是随机效应。在这两种情况下，Tukey对比都用于事后分析。
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这使我们能够进一步测试线虫的生长速度是否对抑制病毒感染很重要。在[16]之后，我们将20%的允许性不动杆菌BIGb0102与80%影响C的抑制细菌混合。秀丽隐杆线虫的生长速率，并观察到动物的发育速率恢复（S5图）。然而，对病毒感染的抵抗力仍然存在（图4B）。
混合了细菌的播种板可能会导致它们之间潜在的相互作用和竞争。为了尽量减少细菌相互作用，我们 （i） 制备含有抑制性天然细菌并添加允许细菌的平板：大肠杆菌 OP50（图 4C）或不动杆菌 BIGb0102 和 Comamonas BIGb0172（图 4D），就在转移无轴胚胎并接种 OrV 或 （ii） 将抑制性天然细菌添加到大肠杆菌 OP50 平板上（图 4E 和 4F）。在这些补充环境中，红杆菌 JUb44、鞘杆菌 BIGb0116 和 Lelliottia JUb276 诱导对感染的抵抗力。然而，如果首先对抑制性天然细菌进行热杀灭（图4E）或加入活细菌的过滤上清液（图4F），则诱导的OrV耐药性被消除。
在测试CeMbio群落时，也观察到耐药性诱导效应的普遍性，CeMbio群落是一个定义的自然和生态相关的细菌群落[41]。CeMbio 社区中的单个细菌菌株对感染易感性具有不同的影响。然而，当与CeMbio群落结合时，这些动物对感染具有抵抗力（S6A图）。因此，细菌引起的耐药性胜过允许的细菌。因此，这些发现否定了不良饮食假说。
抑制病毒感染不能通过避免细菌草坪来解释
秀丽隐杆线虫可避开某些细菌[42]。在我们的实验中，我们将病毒接种物涂在琼脂平板中心发现的细菌草坪上。我们假设这些动物可能会避开这片草坪，阻碍病毒体的吸收。为了研究这一假设，我们分析了动物在中央细菌草坪上斑点的盘子上的分布。在最初的48小时内，这些动物没有表现出回避。在此之后，动物对诱导耐药性的Lelliottia JUb276和诱导易感的不动杆菌BIGb0102表现出一些厌恶。在模拟板和病毒接种板中都观察到这种行为（图5A）。这些结果表明，对细菌的厌恶程度与它们对病毒感染的影响不匹配。
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图 5. 对细菌草坪的厌恶并不能解释抑制病毒感染。
（A） 将大约 100 只 ERT1 菌株的 L54 幼虫放置在不同的细菌草坪周围，其中模拟接种了 M9（上图）或接种了 OrV JUv1580（下图）。在不同时间点目视统计占据细菌草坪的个体比例。（B） 在完全被细菌和 JUv5 病毒接种物覆盖的平板中以 72 hpi 显示转录 IPR 反应（pals-1580p：：GFP 激活;左图）或感染肠细胞（由 FISH 对病毒染色;右图）的动物比例。对每个细菌进行了三次生物学重复测试，并对每个细菌的100只动物进行了检测。数据以平均值±标准误差表示。黑色符号表示标记细菌与大肠杆菌OP50参考文献之间差异的显着性：*** P < 0.001;** P < 0.01;* 0.01 < P < 0.05。大于 0.05 的 P 值标记为“ns”。使用以细菌为因素的方差分析和事后分析的 Dunnett 检验来计算显着性。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011947.g005
为了进一步确保避免病毒接种物不会导致抑制细菌不感染，我们将病毒和细菌分布在琼脂的整个表面上。在这种动物无法避免暴露于细菌和病毒接种物的情况下，细菌菌株JUb44、BIGb0116和JUb276仍然具有病毒耐药性（图5B）。
天然细菌从预感染的 C 中消除 OrV。两代内的线虫种群
在自然环境中，随着受感染的生物体不断产生和释放病毒，病毒感染会在人群中传播[43]。为了创造必须发生水平病毒传播才能维持病毒感染的条件，我们从受感染的 C 转移了个体。先前接种在大肠杆菌OP50上的线虫种群，以对抗性诱导的细菌环境（图6A）。与对照组 Escherichia OP5 相比，这些动物的后代减少了 pals-50p：：GFP 感染报告基因的激活，感染个体的比例较低。在第二代中，病毒感染几乎被消除，除了对照组（图6B和S6B）。另一个通过将琼脂从第一个平板转移到新平板来进行转移的实验给出了类似的结果（S6C图）。
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图 6. 细菌环境可以抑制OrV在几代人中的持久性。
（A）实验设计的示意图（详见方法）。携带 pals-54p：：GFP 报告基因的 ERT5 动物在 E 上接种 OrV JUv1580。大肠杆菌OP50 并转移到选定的细菌上。（B） pals-5p：：GFP 报告基因（上图）的激活或连续两代感染动物的比例（使用 FISH 染色;下图）。数据点代表 100 只动物，每个细菌菌株有三个生物学重复。条形图表示重复之间的平均值±标准误差。黑色符号表示标记细菌与大肠杆菌 OP50 参考文献之间差异的显着性：*** P < 0.001;** P < 0.01;* 0.01 < P < 0.05。大于 0.05 的 P 值标记为“ns”。使用一般线性模型计算显著性，其中细菌和生成是因素。Tukey对比用于事后分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011947.g006
诱导耐药性的细菌在摄入病毒粒子后起作用
为了检查细菌草坪在进入宿主之前是否影响病毒粒子感染性，我们采用了两种方法：（i）在接种前将病毒与细菌预孵育，以及（ii）接种C。在Escherichia OP50草坪上携带病毒的线虫，然后将它们转移到另一个细菌环境中。
在第一种方法中，我们将病毒与E一起孵育。大肠杆菌或抑制细菌在20°C下24小时（图7A）。孵育后，将细菌沉淀，并将过滤的病毒上清液接种到大肠杆菌OP50上的动物身上。我们没有看到病毒制剂的最终感染性有显着差异（图7A）。这些结果表明，细菌不会通过降解宿主外的病毒粒子来诱导对感染的抵抗力。
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图 7. 抑制性细菌环境在摄入病毒后起作用。
（A） 在 Escherichia OP5 上 ERT54 动物中激活 pals-50p：：GFP 报告基因，用先前与各种细菌培养物孵育的病毒攻击（详见方法部分“细菌培养物和病毒接种物的结合”）。每个条件评估四个重复群体，每个群体至少检测 100 只动物。上图显示了实验设计的示意图（详见方法）。（B） GFP 阳性 ERT54 动物在最初暴露于 OP50 上的病毒并随后转移到不同的、未接种病毒的细菌后的比例。上图显示了实验设计的示意图（详见方法部分“普通花园接种实验”）。对于转录反应，根据条件和实验评估了三个重复群体。将这三个群体合并并对 vRNA FISH 进行染色，以量化受感染动物的比例。每个数据点代表一个生物复制，每个种群至少检测 100 只动物。在不同日期进行的独立实验由数据点的形状表示。数据以平均值±标准误差表示。“dpi” = 接种后天数。黑色符号表示标记细菌与大肠杆菌 OP50 参考文献之间差异的显着性：*** P < 0.001;** P < 0.01;* 0.01 < P < 0.05;高于 0.05 的 P 值标记为“ns”。使用细菌作为因素的方差分析和事后分析的 Dunnett 检验计算面板 A 的显着性，使用一般线性混合模型计算面板 B 的显着性，其中细菌是固定因子，实验作为随机效应，Tukey 对比用于事后分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011947.g007
在第二种方法中，我们将无轴胚胎暴露于OrV中24小时，在Escherichia OP50草坪上，然后将幼虫转移到具有不同细菌草坪的平板中（图7B）。请注意，在这个实验装置中，动物在相同的细菌环境中获得病毒，从而以相同的速率泵送病毒。我们观察到，在常见的易感环境中首次暴露病毒后，天然细菌可以改变pals-5p：：GFP激活和感染易感性（受感染动物的比例）（图7B）。这些结果表明，被测试的细菌在将病毒摄入动物肠腔后诱导耐药性，并且泵送速率不是观察到的耐药性的关键因素。
细菌抑制病毒感染不需要完整的宿主抗病毒通路
我们试图确定细菌对病毒感染的抑制作用所需的宿主途径，测试携带无效等位基因的动物的抗病毒反应的关键成分。抗病毒免疫的主轴始于 DRH-1/RIG-I 触发小 RNA 反应和转录 IPR（因此降低泛素介导的免疫）。由于 drh-1 突变体的 IPR 反应未被激活，因此我们不能使用 pals-5p：：GFP 作为报告基因，而是使用 lys-3p：：GFP 报告基因，该基因在严重感染时被激活 [34]。在OrV接种后，75%的drh-1动物激活了大肠杆菌OP3上的lys-50p：：GFP报告基因，但在测试的28种细菌中，很少有甚至没有激活（图8A）。因此，抑制主要独立于 DRH-1，DRH-<> 是抗病毒反应的主要节点。
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图 8. 细菌环境还抑制了抗病毒免疫反应受阻的动物的OrV感染。
（A） 在不同病毒耐药性诱导细菌上接种 OrV 后激活 lys-1p：：GFP 报告基因的 drh-3 动物比例。（B-C）通过RNA2 FISH测定的受感染动物在图A中能够轻微激活报告基因的两种细菌上的比例，对于（B）野生型和drh-1;（B）野生型和rde-1型动物。（D-F）通过 RNA2 FISH 测定的 （D） 野生型 drh-1 和 rde-1 的三种选定抑制细菌上受感染动物的比例;（E） zip-1;（F）cde-1动物。（G） 通过 RNA2 FISH 测定的 WT 和 drh-1 动物中 OrV 感染的肠环数量。在面板（A-F）中，每个条件评估了三个重复群体。每个数据点代表至少 100 只动物的复制品。数据以平均值±标准误差表示。在图G中，合并了三个种群，并评估了100只动物。黑色符号表示标记细菌与大肠杆菌OP50参考文献之间差异的显著性，红色符号表示基因型间差异的显著性：***P < 0.001;** P < 0.01;* 0.01 < P < 0.05;高于 0.05 的 P 值标记为“ns”。使用以细菌为因子的方差分析（图8A、8E和8F）或因子为细菌和宿主基因型的一般线性模型（图8B、8C和8D）计算显著性。在这两种情况下，Tukey对比都用于事后分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011947.g008
在三种细菌（Raoultella BIGb0399、Pseudomonas BIGb0477 和 Acinetobacter MYb10）上，lys-3p：：GFP 的激活降低程度较低（图 8A）。我们在后一种细菌（图8B和8C）和上述三种抑制细菌（图8D）上使用病毒RNA FISH重复实验和 8E）。
在 Chryseobacterium JUb44 和 Sphingobacterium BIGb0116 上，该病毒不能感染 DRH-1 突变体（图 6D），表明这些细菌不需要 DRH-1 来抑制 OrV 感染。
在 Pseudomonas BIGb0477、Acinetobacter MYb10 和 Lelliottia JUb276 环境中，drh-1 动物的感染率低于 Escherichia OP50，但与野生型动物相比，感染率显着增加（图 8B、8D、8G 和 S6D）。我们使用模拟自然缺失的 drh-276 等位基因确认了 Lelliottia JUb1 的结果 [31]（S6E 图）。因此，即使对于这三种细菌，在没有drh-1的情况下也观察到抑制作用，但抑制是不完全的。
在 DRH-1 的下游，我们测试了 RDE-1（RNAi 干扰反应所需的 Argonaute）和部分 DRH-1 依赖性转录 IPR 所需的 ZIP-1 转录因子中的突变体（图 8C、8E 和 8F）。在这些突变体上，抑制细菌，包括Lelliottia JUb276，完全抑制了感染。因此，在 Lelliottia JUb1 上的 drh-276 突变体中观察到的弱感染似乎不依赖于 RDE-1 或 ZIP-1。
我们进一步测试了 cde-1 突变体，这些突变体在病毒尿苷化反应中存在缺陷，发现 cde-1 突变体对 Chryseobacterium JUb44、Sphingobacterium BIGb0166 和 Lelliottia JUb276 环境中的病毒感染具有抗性（图 8F）。
最后，我们想知道针对细菌的免疫途径，如p38 / PMK-1，是否可能与细菌诱导的病毒耐药性有关。我们测试了 Lelliottia JUb1 上 tir-1、tol-1 和 pmk-276 突变体对病毒感染的易感性。这种细菌在我们测试的所有突变体中诱导了耐药性（S7A和S7B图）。此外，我们测试了我们深入研究的天然细菌是否会激活 sysm-1 报告基因，这是 p38/PMK-1 通路的一个元素。所有测试细菌均未激活报告基因（S7C图）。
总之，对于大多数抑制性细菌，病毒感染的减少与已知的抗病毒反应无关，包括小RNA介导的RNA降解和DRH-1下游的转录调控，以及尿苷化。然而，当 DRH-0477 不起作用时，假单胞菌 BIGb10、不动杆菌 MYb276 和 Lelliottia JUb1 无法诱导对病毒感染的完全抵抗力。
讨论
我们对 71 种与 C 天然相关的细菌的影响进行了全面调查。秀丽隐杆线虫对病毒感染的易感性。我们的筛选显示，单细菌环境显着影响宿主对病毒感染的易感性，一些细菌提供保护作用，而另一些细菌则允许病毒感染。值得注意的是，在我们的筛选中，与E相比，大多数测试的天然细菌降低了宿主对病毒感染的易感性。大肠杆菌实验室常用的OP50环境。然而，当我们测试其中两种抑制细菌对 C 感染的影响时。briggsae通过其Santeuil病毒，它们没有诱导耐药性，这表明与宿主，病毒或两者的相互作用具有特异性。总体而言，我们的研究结果强调了在分离野生动物品系以研究其病毒时考虑实验室微生物环境的重要性。
宿主-微生物的相互作用包括宿主在诱导的病毒耐药性和细菌对宿主的影响之间可能的权衡，无论病毒是否存在[44]。我们发现 BIGb0116 和 JUb276 细菌菌株可以防止病毒感染，同时在没有病毒的情况下降低宿主种群的指数增长参数。在我们深入测试的五种天然细菌环境中，除BIGb0102外，由于发育迟缓，动物在幼虫阶段花费的时间更长，因此种群生长更慢。发育迟缓似乎并不能解释对感染的抵抗力，因为所有四个 C。秀丽隐杆线虫幼虫阶段易受感染，如JU1580 [45]和N2 [46]菌株所示。最令人信服的是，我们观察到对病毒感染的抵抗力保持在恢复动物发育速度的混合细菌环境中。
宿主营养对病原体的影响各不相同[47]。我们已经发展了 C。线虫处于不同的细菌环境中，重要的是要指出，对于这种线虫，食物（营养）和生物环境之间没有区别。我们的实验表明，对病毒感染的抵抗力不是由营养不足引起的，因为补充使病毒感染的细菌不能恢复对病毒的易感性。补充C.含有化学物质的线虫已被证明可以恢复对耐药基因型的病毒易感性;脂质代谢紊乱的突变体在补充某些脂质后可恢复对感染的易感性[48]。一些细菌菌株已被证明即使在被热杀灭后仍具有免疫调节特性[49]。我们测试的细菌在被热杀灭后不会引起耐药性，这表明细菌需要活着才能产生耐药性，或者诱发耐药性的细菌因子是不耐热的。我们得出结论，天然细菌对 C.线虫对病毒的易感性超出了营养成分。这一观察结果与对线虫其他生理表型的观察结果一致[16]。
我们发现一些细菌可以诱导对感染的抵抗力，而不需要已知的宿主抗病毒机制。一些细菌不能在 DRH-1 无效突变体中诱导完全耐药性，但可以在作用于 DRH-1 下游的因子的突变体中诱导它。DRH-1可能通过其保守的RIG-I结构域[31]将病毒基因组识别为外来病毒基因组，并激活多种免疫应答和功能未知基因的转录。我们的研究结果表明，一些细菌未能在高度易感的DRH-1突变体中诱导耐药性，或者细菌通过未知的下游途径通过DRH-1部分诱导耐药性。也有可能是，这种抑制不是通过DRH-1介导的抗病毒途径的激活，而是因为病毒RNA不会进入抑制细菌的肠道细胞，或者细胞不能胜任病毒生命周期的某些部分，如复制、翻译或包装。
我们的研究强调了在病毒感染及其生态和进化影响研究中考虑自然生物环境的重要性[50\u51]。我们的工作与Vassallo及其同事最近的一项研究一致，该研究报告称，Pseudomonas lurida和Pseudomonas aeruginosa减弱了奥赛病毒的传播和感染率。这种衰减取决于群体感应的细菌调节因子[52]。我们的研究为未来的研究提供了宝贵的基础，表明了未知的抗病毒机制的参与，并为剖析宿主-病毒相互作用的分子机制奠定了基础。未来的研究应旨在揭示这些保护作用背后的分子机制，并探索它们对更广泛的病毒株和宿主物种的适用性。这种理解可能有助于发现新的免疫机制，并通过有针对性地操纵与生物体相关的微生物来改善宿主健康。
材料与方法
动物品系和维护
按照标准程序，将秀丽隐杆线虫在线虫生长培养基（NGM）平板上，在20°C下培养[53,54]。C. briggsae 在 23°C 下培养。 NGM 平板接种 100 μL 单细菌培养物，并在室温下保存 4 天，然后储存在 3°C 下。 所有实验均使用储存不到 2 周的接种板进行。本研究中使用的线虫品系列在S<>表中。
drh-1（mcp553）等位基因模拟JU1580和其他C的自然缺失。秀丽隐杆线虫野生分离株[31]。它是由 CNRS Segicel 平台（法国里昂）在 N9 背景下使用 CRISPR/Cas2 介导版本创建的，使用两个指南 crMG023 （gCTATCGTGTTGCTAGTCGA） 和 crMG024 （ACCGACCGAAATACGACAAT） 和修复模板 （tctttacatgcttattttatttaatttaatttaatttaattttcagctattca AATGAGAGATGCGGATCAAGCTCGAACACCAATGGTATTTGAGCATCACGCGAATGGAGA）。用于确认缺失的引物为AAACTCGCCTGACGGATGAG、TTGGAACTGAGCGATTGGCA和TCGGTACCTTCGACTAGCAAC。
将ZD4289雌雄同体[agIs219 [sysm-1p：：GFP + ttx-3p：：GFP] III; pmk-2（km39） IV]与N219雄性，然后F1雄性与N3杂交，选择GFP阳性动物，获得在N1背景下具有agIs25[sysm-2p：：GFP + ttx-1p：：GFP]转基因的JU2菌株。
细菌维护
将细菌在 -80°C 下冷冻保存在含有 10% 甘油的 Luria 肉汤培养基（LB;5 g/L 胰蛋白虨、5 g/L 酵母提取物、25 g/L NaCl）中。对于培养，将冷冻保存的培养物在LB-琼脂平板上划线并在室温下孵育48小时。然后挑选菌落并接种到 5 mL 液体 LB 中。培养物在 28°C 和 220 rpm 下生长 16 小时，用于天然相关的细菌菌株，而 E.大肠杆菌OP50在37°C下生长。 本研究中使用的细菌菌株列在S1表中。
病毒接种物的制备
除奥赛病毒株JUv1580 [27]或Santeuil病毒株JUv2572 [40]外，所有实验均使用奥赛病毒株JUv1264 [27]。JUv1580的病毒制剂是通过在1580 mm OP27接种板上接种来自原始JU90感染动物的病毒滤液[50]获得的，JUv2624动物（C.线虫JU1580分离株，其中lys-3p：：GFP构建体通过10轮回交渗入JU1580;接种34天后用M9缓冲液收集动物，沉淀，上清液经0.22μm过滤器过滤，得OrV感染性上清液。将上清液等分并在-80°C下冷冻保存，并在每次实验中新鲜解冻所需量。
病毒接种程序
为了同步线虫群体并获得无轴动物，我们用 4 mL 漂白剂溶液（2 mL 次氯酸钠 12%、1.25 mL NaOH 10 N、6.75 mL H 2 O）处理年轻成年群体 15 分钟。然后，我们用 9 mL M50 缓冲液洗涤样品四次。该程序产生了无轴胚胎，将其放置在先前接种了 20 μL 病毒接种物的细菌草坪周围。将动物接种的平板保持在 72°C，并在接种后 <> 小时 （hpi） 评估感染。
病毒感染的荧光报告基因
使用徕卡MZ FLIII荧光立体显微镜在6倍放大倍率下观察动物。当在肠细胞中观察到高于背景水平的GFP荧光时，动物在视觉上被归类为阳性。GFP信号被评分为二元性状，在动物种群中量化。使用细胞内感染时激活的荧光报告基因（pals-5p：：GFP，F26F2）测量细胞内病原体反应的激活。1p：：GFP 或 sdz-6p：：GFP;33,34,39）在遗传背景drh-1中，由于drh-3动物不诱导pals-1表达，因此使用了严重生物胁迫的报告基因（lys-5p：：GFP）。
荧光原位杂交
通过可视化宿主肠道细胞中的病毒RNA来量化感染动物的比例。使用荧光原位杂交（FISH）标记病毒RNA，如Frézal及其同事所述[40]。简而言之，收集动物并将其固定在10%甲酰胺溶液中。使用与Cal Fluor red 2荧光基团偶联的寡核苷酸序列混合物[1,40]或与Texas Red偶联的未稀释的单个探针（40'ACC ATG CGA GCA TTC TGA ACG TCA 55'）的610：5稀释液对固定动物进行靶向OrV RNA3分子染色。为了对Santeuil病毒进行染色，我们使用与Cal Fluor红1荧光基团偶联的寡核苷酸序列混合物[1]的40：40稀释度靶向其RNA610分子。然后使用具有1×（10.0数值孔径）和3×（40.1数值孔径）物镜的AxioImager M3（蔡司）复合显微镜检查动物。如果至少一个肠细胞显示出比该个体的背景染色水平更高的明显荧光，则认为该动物被感染。
RNA提取
按照酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取方案分离RNA[56]。A 100μlC。将秀丽隐杆线虫沉淀重悬于500μlTrizol中，并将悬浮液进行5次冻融循环。然后将悬浮液涡旋 30 秒，静置相等的持续时间，并将该涡旋-静止序列执行五次。然后加入100μl氯仿。用手剧烈摇晃试管 15 秒，然后在室温下静置 2-3 分钟。孵育后，将混合物在 15°C 的温度下以 13000 rpm 离心 4 分钟。 将上层水相转移到新管中，加入250μl异丙醇，混合，并在室温下孵育10分钟。随后在相同条件下进行离心。弃去所得的上清液，用500μl75%乙醇洗涤沉淀。然后将该混合物在 5°C 下以 13,000 rpm 的速度涡旋和离心 4 分钟。 弃去上清液后，将沉淀风干10分钟，并溶解在50μl无RNAse的水中。
病毒载量的测量
cDNA 由 500 ng 总 RNA 和随机引物生成，使用用 SuperScript IV 逆转录酶（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）合成的 cDNA，遵循制造商的说明。将cDNA稀释至1：10进行RT-qPCR分析。按照制造商的说明，使用LightCycler 480 SYBR Green I Master（Roche，Mannheim，Germany）进行RT-qPCR。扩增在LightCycler 480实时荧光定量PCR系统（Roche）上进行。在每个样品中，测量病毒 RNA1（引物 GW194：5′ ACCTCACAACTGCCATCTACA 和 GW195：5′ GACGCTTCCAAGATTGGTATTGGTGGT，27）水平并将其归一化为内源基因 eft-2 （etf-2 2F 5′ CTGCCCGTCGTGTGTTCTAC 和 etf-2 2R 5′ TCCTCGAAAACGTGTCCTCTT） 的相应水平。
混合细菌环境实验
采用以下两种方法混合细菌。（i）对于图4A和4B：根据图中所示的比例混合抑制和允许菌株的液体细菌培养物的体积，并将100μL混合物接种在NGM平板上。这些板在室温下保存两天，然后在 4°C 下储存直至使用。在三周内使用平板，并在实验开始前在室温下适应几个小时。（ii）对于图4C至4F：在开始实验前30分钟，我们在播种有单菌草坪的平板的细菌草坪上加入100μL细菌培养物（如“细菌维持”所述制备）（如“动物菌株和维护”中所述制备）。具体而言，在图4E中，将热杀灭的培养物添加到接种板中。通过将细菌培养物在100°C的水浴中孵育40分钟来热杀灭细菌。通过将 100 μL 热灭培养物接种到 LB 板上并在 37°C 下孵育过夜后观察到没有生长，证实了热杀灭过程的有效性。 在图 4F 中，我们通过以 5 rpm 离心 10 分钟来沉淀 5000 mL 液体细菌培养物。收集上清液并通过0.22μm过滤器过滤。随后，将 100 μL 过滤的上清液加入到单细菌草坪上。将沉淀重悬于 5 mL LB 中，并将 100 μL 重悬沉淀加入单细菌草坪的顶部，如图 x 轴所示）。
实验分析OrV在几代人的持久性
我们用感染 OrV 的 ERT54 动物群体开始了这些实验，如 pals-5p：GFP 阳性个体的存在所示。这些人群的感染是通过在含有无轴胚胎的OP50种子板上接种OrV而引发的。为了维持这些感染群体，将 7 mm x 7 mm 琼脂块切块到新鲜的 OP50 种子平板中。在开始实验之前，该转移程序进行了 2-3 次。从这些平板中，我们选择了 10 只随机的 L4 期动物，并将它们放在接种有天然细菌菌株或 OP50 作为对照的平板上。96小时后，我们通过检查10名年轻人，测定了这1只动物（称为第100代）后代的感染。然后，我们重复了这个过程，从第10代中随机挑选了另外4个L1幼虫，并将它们转移到接种了与各自父母相同的细菌的新培养板中。96 小时后，我们评估了第 2 代后代的感染情况，再次检查了 100 名年轻人。
图 6 说明了该实验，通过 pals-5p：：GFP 报告基因和 vRNA 的 FISH 染色评估感染。S6B Fig 复制了实验，但仅依靠 pals-5p：：GFP 报告基因来评估感染。S6C 图显示了实验的变体，其中不是转移 10 只 L4 动物，而是将含有不同阶段随机分类的动物的 7 mm x 7 mm 琼脂片段转移到新平板上，并且仅在第 5 代中测定 pals-2p：：GFP 报告基因。
细菌培养物和病毒接种物的共同培养
在图7A中，我们将1mL液体细菌培养物（图x轴所示的细菌菌株，按照“细菌维持”中的描述制备的培养物）与1mL病毒接种物（如“病毒维持”中所述制备）混合。将该 1：1 混合物在 24°C 下孵育 20 小时。 孵育时间过后，将试管以10rpm离心5000分钟，收集上清液并通过0.22μm过滤器。我们使用 120 μL 过滤的上清液接种 OP50 种子板。将无轴胚胎放在这些平板上，在 20°C 下孵育，并测量 pals-5p：：GFP 活化度为 72 hpi。
普通园林接种实验
在图 7B 中，我们将无轴 ERT54 胚胎放置在接种有 OP90 的 50 mm 平板上。然后用 300 μL 病毒接种物接种这些平板，然后将动物保持在 20°C 下 24 小时以摄入病毒粒子。24小时后，将动物收集在M9缓冲液中，并在15mL M9缓冲液中洗涤48次。然后将洗涤过的动物分开并转移到接种有x轴上指示的不同细菌菌株的非病毒接种板上。在转移到新平板后<>小时评估动物的感染状态。
系统发育分析
系统发育分析中使用的细菌 16S rDNA 序列可以在 S1 文件中找到。使用MPI生物信息学工具包[7]的MAFFT v57工具[58]进行多序列比对。使用IQ-TREE网络服务器[59]，使用比对序列通过最大似然推断系统发育树。系统发育树和图1的图是使用“phylosignal”软件包4.1版[3]中的phylo60d函数生成的。使用lipaMoran函数评估性状数据中的系统发育信号，该函数也可在“phylosignal”包中找到。为了考虑多重测试，我们使用 Benjamini-Hochberg 方法调整了获得的 P 值。显著性水平设定为P < 0.01。
统计分析
所有统计分析均在 Rstudio 开发环境版本 3.6.1 中使用 R 版本 1.3.1093 进行。显著性水平设定为P < 0.05。应用于每个图形的具体统计方法在相应图形的图例中详细说明。
使用以下函数进行方差分析、Tukey 或 Dunnett 事后检验以及基于字母的多重比较分组：（i） “stats”软件包版本 3.6.1 [61] 中的 aov（） 函数用于执行方差分析 （ii） “stats”包中的 TukeyHSD（） 函数用于执行 Tukey 事后检验 （iii） Dunnett 的事后测试是使用 glht（） 进行的“multcomp”软件包版本 1.4–23 [62] 中的函数 （iv） “multcompView”软件包版本 4.0.1 [8] 中的 multcompLetters63 函数用于生成基于字母的分组以进行多重比较。一般线性模型是使用“stats”包中的 glm 函数执行的。为了解释块效应，我们采用了线性混合效应或一般线性混合效应模型。使用“lme4”软件包版本1.1–21中的lmer或glmer函数对模型进行拟合[64]。使用“emmeans”软件包版本 1.4.7 中的 emmeans 函数进行事后成对比较 [65]。Tukey的方法用于调整成对比较中的多重比较。
使用 R 中的“ggpubr”包版本 0.2.4 [66] 生成图形。
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S1 图。 在不同细菌上接种奥赛病毒后激活pals-5p：：GFP报告基因的动物比例。
图1中使用的原始数据，包括此处的实验块结构。对于每种细菌环境，用 OrV JUv100 攻击约 54 只 ERT1580 动物的 5 次重复。激活pals-72p：：GFP报告基因的动物比例测量为50 hpi。数据以平均值±标准误差表示。条形上方的字母表示基于字母的分组，以便进行多重比较。黄色条表示 E。大肠杆菌执行部分<>.
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S2 图。 在不同细菌环境中接种模拟或病毒接种的 ERT54 [pals-5p：：GFP; myo-2p：：mCherry] 动物的荧光显微镜。
使用安装在AxioImager M9（蔡司）复合显微镜上的1580倍物镜在72 hpi下观察接种M10或接种OrV JUv1的动物，并用PIXIS 1024（普林斯顿仪器）相机捕获图像。比例尺表示 100 μm。GFP阳性动物可以在顶部三种细菌上接种病毒的动物的肠道细胞中看到。请注意，在模拟和病毒接种的人群中，特别是在JUb44环境中，在动物的后肠细胞中可以看到不太强烈的荧光。在OP50中生长的未感染动物中也观察到这种后肠荧光[39]。我们假设这种荧光是由产生 ERT3 菌株的质粒中使用的 unc-54 的 54'UTR 引起的。如[5]所述，该DNA片段可能含有在后肠细胞中表达的相邻基因aex-67的顺式调节位点。
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S3 图。 复制图1所示的一些实验。
（A） 细菌菌株对 ERT54 线虫病毒感染的影响在实验区块（不同日期进行）是一致的。（B）在初始筛选中增强感染的细菌的新实验如图1所示。每个数据点代表一个生物重复，每个种群检测 100 只动物。数据以平均值±标准误差表示。图表上的星号表示显著性值：*** P < 0.001;** P < 0.01;* 0.01 < P < 0.05;高于 0.05 的 P 值不被标记。使用以细菌为因子的一般线性模型和 Dunnett 对比来计算显着性，以将所有条件与 Escherichia OP50 参考进行比较。
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S4 图。 测试选定细菌种类的几种菌株。
（A） PALS-5p：：GFP 报告基因在相同细菌物种的不同菌株上对 ERT54 动物病毒感染时的激活。（B） pals-5p：：GFP报告基因在不同E上动物病毒感染时的激活。大肠杆菌菌株。每个数据点代表一个生物重复，每个种群检测 100 只动物。数据以平均值±标准误差表示。图表上的星号表示显著性值：*** P < 0.001;** P < 0.01;* 0.01 < P < 0.05;高于 0.05 的 P 值不被标记。使用以细菌为因子的一般线性模型和 Dunnett 对比来计算显着性，以将所有条件与 Escherichia OP50 参考进行比较。
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S5 图。 C的发育增长率。混合细菌环境中的线虫。
将 ERT1 菌株的停滞无菌 L54 幼虫暴露于每种单细菌环境或由 20% 的 BIGb0102 和 80% 的另一种细菌组成的混合环境（在 x 轴中表示）。在3和100小时后，观察每个环境条件下46个独立种群（每个种群62只动物）的成虫比例。
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S6 图。 新的实验来确认结果。
（A） pals-5p：：GFP 报告基因在不同单一 CeMbio 菌株和整个 CeMbio 群落的动物 OrV 感染时的激活。（B）重复图6所示的实验，但仅评估pals-5p：：GFP报告基因的激活。（C）重复图6所示的实验，在2代后使用琼脂块的转移（详见方法）。（D）重复实验，测试drh-1动物，如图8D所示。（E） 携带 drh-276 天然缺失等位基因的动物对 Lelliottia JUb1 病毒感染的易感性。数据以平均值±标准误差表示。黑色符号表示标记细菌与大肠杆菌OP50参考文献之间差异的显著性，而红色符号表示基因型之间差异的显著性：*** P < 0.001;** P < 0.01;* 0.01 < P < 0.05;高于 0.05 的 P 值标记为“ns”。使用以细菌为因子的方差分析（图A，C，D），因子为细菌和世代的一般线性模型（图D）或因子为细菌和宿主基因型的一般线性模型（图E）计算显着性。在这两种情况下，Tukey对比都用于事后分析。
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（TIF）
S7 图。 天然细菌和抗菌免疫途径。
（A） 在 Escherichia OP50 或 Lelliottia JUb276 上进行实验测试，测试突变体的病毒易感性，这些突变体在对细菌感染的反应中涉及不同基因的改变。我们测试了每种基因型的三个生物学重复，每个群体检测了 100 只动物。数据以平均值±标准误差表示。（B） 对 Escherichia OP50 或 Lelliottia JUb276 进行实验测试，测试 tir-1 突变体的病毒敏感性。我们测试了每种基因型的三个生物学重复，每个群体检测了 100 只动物。数据以平均值±标准误差表示。（C）sysm-1p：：GFP报告基因的荧光显微镜。JU4289动物携带agsl219[sysm-1p：：GFP + ttx-3p：：GFP]转基因。在指定的细菌环境中使用4289倍物镜在AxioImager M20（蔡司）复合显微镜上使用10倍物镜观察在1°C下生长的三只日龄JU1024动物。Cherry 和 GFP 荧光通道是用 PIXIS 14（普林斯顿仪器）相机捕获并叠加的。PA11 和 DB100 细菌环境作为报告基因激活的阳性对照。比例尺表示 <> μm。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011947.s007
（TIF）
S1 表。 本工作中使用的细菌菌株列表。
pals-5p：：GFP 列指示 C.线虫能够在热休克后激活测试菌株上的PALS-5p：：GFP报告基因。对于该测试，将 48 小时大的 ERT54 动物置于 30°C 下 24 小时，在 24 小时热休克后立即观察。FR是法国的缩写，GER是德国的缩写，USA是美国的缩写。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011947.s008
（文件）
S2 表。 本研究中使用的线虫菌株。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011947.s009
（文件）
S1 文件。 用于天然细菌系统发育分析的 16S rDNA 序列。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011947.s010
（TXT）
S2 文件。 本研究中生成的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011947.s011
（XLSX）
确认
我们感谢 Aurélien Richaud 提供的出色技术援助和建议，并感谢 Tony Bélicard 提供 JU2624 菌株。我们要感谢 Emily Troemel 分享 zip-1（jy13） 菌株。一些菌株由CGC提供，CGC由NIH研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助。我们感谢CNRS Segicel平台生成drh-1（mcp553）菌株。我们感谢 WormBase。我们还要感谢 Marie-Anne Félix、Marie Gendrel 和 Henrique Teotónio 团队成员进行的富有成效的讨论。
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