免费医学论文发表-晚起的 CD4 T 细胞可解析小鼠巨细胞病毒在唾液腺中的持续复制

抽象

常规抗病毒记忆CD4 T细胞通常在急性感染的前两周出现。与大多数病毒不同，巨细胞病毒 （CMV） 表现出延长的持续复制阶段，然后是终生潜伏期，并伴有一些基因表达。我们发现，在小鼠 CMV （MCMV） 感染期间，识别源自病毒 M4 蛋白的表位的 CD09 T 细胞仅在常规记忆 T 细胞已经达到峰值并收缩后才会发育。通过突变 MCMV Smith 菌株中的 M4 基因组表位来消融这些 CD09 T 细胞，或通过将表位引入 K181 菌株来诱导它们，分别导致病毒持久性的延迟或增强控制。与传统的记忆细胞相比，这些细胞被证明是独特的;产生较高的 IFNγ 和 IL-2 以及较低的 IL-10 水平。RNAseq分析显示，与经典CD4 T细胞相比，它们表达不同的效应基因亚群。此外，当通过表位疫苗接种诱导M09细胞时，与单独的传统CD4 T细胞相比，它们显着增强了保护作用。这些数据表明，晚起的CD4 T细胞是一个独特的记忆亚群，具有出色的保护能力，显示出与大多数记忆T细胞截然不同的发育程序。

作者摘要

功能性记忆T细胞对于最终控制慢性病毒感染至关重要。我们发现巨细胞病毒 （CMV） 诱导了一组独特的记忆 CD4 T 细胞，这些细胞在感染后期扩增，并且比传统的 T 记忆细胞更好地解决病毒持久性。这些 T 细胞识别的基因组 CMV 表位的突变导致持续复制显着增强，并且将表位引入缺乏表位的 CMV 菌株中会诱导更快的持久性分辨率。当通过疫苗接种诱导时，我们发现这些T细胞对急性病毒攻击提供了显着增强的保护。总之，我们的研究确定了一种新的CD4 T细胞群，这些细胞群利用不同的效应功能来快速解决持续的病毒复制。

数字

Fig 4Fig 5图1图2图3Fig 4Fig 5图1图2图3

引文： Brunel S， Picarda G， Gupta A， Ghosh R， McDonald B， El Morabiti R， et al. （2024） 晚起的 CD4 T 细胞可解析小鼠巨细胞病毒在唾液腺中的持续复制。PLoS 病理学 20（1）： e1011852 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011852

编辑 器： Ian R. Humphreys，英国卡迪夫大学

收到： 24年2023月21日;接受： 2023年18月2024日;发表： <>月 <>， <>

版权所有： ? 2024 Brunel et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 本出版物中讨论的数据已存放在 NCBI 的基因表达综合数据库中，可通过 GEO 系列登录号 GSE237946 访问。（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE237946）。

资金： 这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）对C.A.B.R01AI101423和R01AI139749的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。

介绍

CD4 T细胞通过“帮助”CD8 T细胞[1,2]和抗体反应[3]以及介导直接抗病毒活性来协调宿主防御。它们对由不同病原体激活的特定炎症线索和抗原呈递细胞（APC）具有独特的反应，从而在随后的分化和效应功能方面具有显着的灵活性[4]。因此，发育的记忆T细胞在抑制慢性病毒性疾病（如HIV [5]和HCV [6,7]）方面发挥着关键作用，但也抑制了持久性病毒的复制和再激活，这些病毒在免疫力完好无损时通常致病性较低，如疱疹病毒。在这方面，在移植和先天性感染中，建立快速而强大的记忆CD4 T细胞应答与预防巨细胞病毒（CMV/HHV-5，一种β-疱疹病毒）密切相关[8\u11]。猴子的恒河猴巨细胞病毒感染也是如此[12]。记忆 T 细胞通常在急性病毒感染的最初几天被启动并扩增/分化。对于CD8 T细胞，记忆前体被认为在感染的第一周内发育，与效应T细胞池同时产生[13]。在CD4 T细胞中，记忆前体发育的要求不太明确，而调节细胞（Treg）、滤泡辅助细胞（Th）和组织驻留细胞（Trm）等特定谱系可能具有独特的要求[14\u17]。其中大部分信息来自对淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）的研究，该病毒在慢性感染期间以高全身水平复制，促进记忆T细胞功能障碍，如HIV和HCV感染[18]。相反，在短暂的全身性急性复制阶段后，巨细胞病毒在少数粘膜组织的导管上皮细胞中建立选择性持久性，以促进其分泌和水平传播。在巨细胞病毒感染期间，记忆CD8 T细胞耗竭并不常见，尽管该病毒终生被藏匿，并定期暴露于其同源抗原，导致其经历“记忆膨胀”[19]。因此，与其他更具致病性的慢性感染相比，巨细胞病毒独特的生活方式诱导了独特的记忆T细胞分化。

MCMV在小鼠感染早期诱导出强大而多样化的CD4 T细胞反应[20,21]，在唾液腺（SG）中持续复制数月，CD4 T细胞对于在建立“全宿主潜伏期”之前最终解决这种扩展复制至关重要[22,23].在人类中，巨细胞病毒可以从粘膜部位（例如SG、肾脏和乳房）脱落多年，我们最近的研究表明，人类的CD4 T细胞反应同样广泛和多样化[24]。虽然CD4 T细胞至关重要，但目前尚不清楚提供保护的群体的确切性质。宿主产生的IL-10有助于维持小鼠CMV在SG粘膜中的持久性[25]，灵长类CMV编码其自身的IL-10直系同源物[26]，人CMV特异性CD4 T细胞可以产生IL-10[27]，表明这种免疫抑制细胞因子的关键作用。此外，虽然传统CD4 T记忆细胞在感染早期扩增产生的IFNγ可以抑制CMV的持续存在，但这还不足以完全减少复制[25,28,29]。这再次表明，为巨细胞病毒提供保护的记忆T细胞发育的动力学和性质与其他病毒不同。此前，我们发现了4个由感染MCMV Smith菌株的CD20 T细胞识别的免疫显性表位[14]。有趣的是，虽然我们发现识别其中 8 个表位的 T 细胞显示出常规的效应到记忆的过渡曲线，在第 3 天达到峰值扩增，然后是 ~ 09 周的收缩阶段，但一个群体针对源自病毒 M09 蛋白的表位 （M<>133-147）只是在后来的时候才显着积累。总之，这些数据表明，M09反应性CD4 T细胞可能对解决CMV持久性具有独特的重要性。在这里，我们表明，这些晚期崛起的M09细胞在SG中以高水平发育和积累，在常规记忆建立后很久，并构成>所有抗病毒CD10 T细胞的4%。最重要的是，我们表明它们对于解决持续的病毒复制至关重要，并且在通过疫苗接种诱导时也能提供质量上更好的保护，突出它们是一个独特的CMV记忆子集。

结果

晚发 M09 表位特异性 CD4 T 细胞的扩增与 MCMV 持续复制的分辨率平行

CD4 T细胞对于解析唾液腺（salivary landand， SG）中持续性MCMV复制至关重要[22,23]，但这些T细胞的总体特异性、分化要求和关键效应功能仍在很大程度上未知。为了解决这个问题，我们使用了野生型MCMV Smith菌株（MCMV史密斯) [30] 在 C57BL/6 小鼠 （B6） 中。MCMV 的复制史密斯在第 8 天在 SG 中可检测到，到第 10 天增加 15 倍，并在第 40 天保持不变。在感染第 5 天时复制减少了 50 倍，到 70 天时，超过 55% 的小鼠完全控制了复制（图 1A），这表明解决持久性所需的记忆 CD4 T 细胞需要更长的时间才能分化。从我们之前在 MCMV 中鉴定的 15 个表位特异性 CD4 T 细胞反应中史密斯感染的B6小鼠[20]，在感染后的第一周内，表位再刺激后在脾脏中检测到14只。值得注意的是，一种针对病毒 M09 蛋白 （M09133-147，M09），直到后来才扩大到显著水平[20]。测试MCMV的分辨率是否史密斯SG的持久性可能与这些“晚发”M09反应性细胞的出现相吻合，MHC-Il四聚体被产生以跟踪其发育。此外，对 CD4 T 细胞具有特异性的两种四聚体与源自病毒 M25 和 M142 蛋白的表位 （M25409-423和 M14224–38，M25和M142），在感染的最初几周内表现出常规扩张和收缩模式的细胞也被产生。这些四聚体用于流式细胞术，以鉴定感染后 09 至 25 天间 SG 组织中存在的 M142、M8 和 M200 细胞（图 1C 左右图）。M09 细胞在感染的第 8 天和第 15 天几乎检测不到，而 M25 和 M142 细胞的频率和数量在第 8 天达到峰值，此后收缩。相比之下，在第 09 天时在 SG 中检测到高频率的 M40 反应性 T 细胞，在病毒复制解析后第 55 天持续保持这一升高的数量，而 M25 和 M142 细胞在这些时间仅以非常低的数量存在（图 1B 和 1D）。在脾脏（S1A和S1B图）和血液（S1C和S1D图）中也看到了这三个MCMV CD4 T细胞群的类似结果。这些数据间接暗示了M09细胞可能在后期持久性时促进SG中病毒复制的最终分辨率。

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图 1. 晚发 M09 CD4 T 细胞的扩增与唾液腺中 MCMV 持久性的消退相吻合。

（A） MCMV的复制史密斯在感染后不同天数 （dpi） 通过斑块测定法测定的 SG 中。（B） MCMV 复制水平 （A）（右 Y 轴）和 MCMV 表位特异性 CD4 T 细胞频率随时间的重叠。（C） 感染后第 09 天至第 25 天 SG 中的 M142（红色）、M4（蓝色）和 M0（黑色）MHC-II 四聚体结合 CD200 T 细胞，百分比（左）和绝对数量（右）。（D） M09、M25 和 M142 CD4 T 细胞的代表性流式细胞术图，用用 2 种不同荧光团（PE 和 APC）标记的四聚体在 SG 中以 0 和 40 DPI 染色。所有时间点代表 4-8 只小鼠，实验至少重复两次。通过双向方差分析检验确定的统计学显着性显示在 M09 和 M25 或 M142 之间。**p < 0.01，****p < 0.0001。

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M09系列133-147表位在 MCMV 持久性中起着关键作用

为了直接验证这一假设，我们分析了 MCMV 菌株 K181 在 SG 中的持续复制。K181型最初是在MCMV连续传代后分离的史密斯在小鼠[31]中，以尝试选择显示增强发病机制的病毒变异。与此一致，我们发现了 MCMVK181型与 MCMV 相比，复制时间更长史密斯在SG中（图2A）。值得注意的是，当在这两种菌株中比较B20小鼠中鉴定为CD4 T细胞靶向的所有6个MCMV表位的序列时[32]，M09133-147表位只是三个中的一个（另外两个是M2136-150 [33] 和 M45192-206，两者都显示出正常的膨胀动力学）发现顺序不同（图2B），表明MCMV的持久性增强K181型可能是由于无法诱导M09 T细胞[20,32,33]。为了验证这一假设，我们生成了“表位交换”突变病毒，其中 MCMV 中的 M09 表位史密斯与 MCMV 的类似序列互换K181型（Smith M09K）和另一种突变病毒，其中来自 MCMV 的 M09 表位K181型与MCMV的类似序列互换史密斯（K181 M09S）（图 2B）。Smith M09K 和 K181 M09S 在第 4 天与脾脏和肝脏中的野生型菌株相同（S2A 和 S2B 图），表明 M09 表位的突变并未全面损害它们的适应性。MCMV 第 55 天 SG 中的复制水平K181型和史密斯 M09K 相当，~5 倍对数10高于 MCMV史密斯 (图2C）。此外，所有感染K181 M09S的小鼠在第55天解决了病毒持久性，而没有感染MCMV的小鼠K181型此时表现出控制力。反过来，没有感染Smith M09K的小鼠在第70天和MCMV时表现出持久性消退K181型在感染后第 130 天仍显示出高水平的持久性（S2C 和 S2D 图）。不出所料，MCMVK181型Smith M09K K181 未诱导显著水平的 M09 细胞，而 MCMV史密斯K181 M09S感染的小鼠表现出高频（图2D）。综上所述，这些数据清楚地表明，晚起的M09 CD4 T细胞不同于其他在感染早期扩增的传统MCMV CD4 T细胞，在解决SG中持续性病毒复制方面发挥着关键且非冗余的作用。

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图 2. M09系列133–147表位在解决 SG 中 MCMV 持久性方面起着关键作用。

（一）中小微机史密斯和 MCMVK181型SG 中 55 dpi 的复制水平。 （B） M09的氨基酸序列133-147Smith 和 K181 野生型菌株中的表位，以及 Smith M09K 和 K181 M09S 中产生的突变“交换突变体”。（C） SG 中 2 dpi 的野生型（图 55A）和表位交换突变体复制水平。 （D） 感染 09 天时 SG 中四聚体反应性 M48 细胞的百分比。虚线表示未感染小鼠中四聚体结合的背景。通过Mann Whitney检验评估统计学意义，**p < 0.01，****p < 0.0001。

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在 MCMV 持续感染期间，晚起的 CD4 T 细胞比传统细胞产生细胞因子更好

为了研究这些保护性M09 T细胞的表型，我们评估了它们的效应细胞因子产生。众所周知，CD4 T细胞来源的IFNγ在MCMV持久性的消退中起着重要作用[28,29]。因此，我们比较了 SG 中 M2 和 M25 反应细胞在第 09 天和第 8 天（每个群体数量达到峰值时）对 IFNγ 和 IL-40 的相对产生（图 3A）。在第 8 天，30% 的 SG 驻留 M25 细胞在再刺激后产生 IFNγ，明显高于第 40 天 （4%）。相比之下，感染后 40 天 ~50% 的 M09 细胞产生 IFNγ。此外，在SG的第25天或第2天，没有M8细胞产生IL-40，而~25%的M09细胞产生IL-3（图09A）。然后，我们检查了感染后第 25 至 142 天脾脏中 M8、M200 和 M3 细胞因子的产生（图 3B-09F）。M2细胞因子的产生（IFNγ、TNF和IL-8）在第15天和第25天几乎检测不到，而M142和M8细胞的细胞因子产生在第15天达到峰值，到第09天显著下降。相比之下，在感染后第 40 至 200 天可检测到大量 M09 反应性、产生细胞因子的 T 细胞。此外，在第 2 天产生 3 或 40 种这些细胞因子的 M25 细胞比例显着高于第 142 天或第 8 天的 M40 或 M3（图 3F 和 S3E–S09H），并且每个 M4 细胞产生的细胞因子水平也更高（例如 MFI，S09 图）。这些数据表明，在 MCMV 持续存在期间，与传统的 M25 或 M142 反应性记忆 T 细胞相比，晚期上升的 M<> 反应性记忆亚群是更好的抗病毒群体。

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图 3. 在病毒持久性期间，晚期上升的 CD4 T 细胞是更好的细胞因子产生者。

（A） 离体肽再刺激后 SG 驻留 M2 和 M09 反应细胞表达 IFNγ 和 IL-25 的代表性流式细胞术图。（B） 从感染第 2 天到第 4 天产生脾 CD8 T 细胞的 IFNγ （B）、IL-200 （C） 和 TNFα （D） 的绝对数量。（E） 感染后第 4 天（左）和第 44 天（右）M09、M25 或 M142 肽刺激肽后表达 IFNγ 的 CD8 记忆 （CD40+） 脾细胞的百分比。（F） MCMV 感染后第 09 天（上行）和第 25 天（下行）脾脏 M142、M4 和 M8 反应性 CD40 T 细胞多功能的欧拉表示。动力学差异通过双向方差分析检验确定。第<0.0001页。通过Mann Whitney检验评估组间，*p< 0.1**p< 0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011852.g003

M09 T细胞的表型和转录组学分析

为了进一步探索晚起的 M09 和常规 M25 T 细胞之间的潜在表型差异，在四聚体结合、SG 驻留细胞中评估了几种细胞表面标志物的表达（图 4 和 S3）。在第8天，M25细胞高度表达CD69和43B1抗体（以下简称CD11）识别的激活标志物CD43的差异糖基化亚型[34]。CD27在潜伏期期间在一些HCMV特异性CD4 T细胞中下调[9,35,36]，在感染第4天时，CD8的表达与幼稚CD4 T细胞的表达基本相似（图40A）。然而，在第 09 天，即 M43 细胞扩增的高峰期，这些晚起细胞中的大多数表现出低 CD27 和 CD44 表达，但 CD69 和 CD25 水平与 M4 细胞相似（图 09A）。值得注意的是，在第 25 天，许多其他细胞表面活化/分化标志物在 M40 和 M5 细胞中表达相似（S4 图）。此外，多克隆 MCMV CD43 T 细胞在第 27 天显示出与 M25 细胞相似的 CD8 和 CD40 表达谱，而在第 09 天，它们显示出与 M25 和 M4 细胞中间的表型（图 09A）。为了进一步比较 M25 和 M40 反应性 T 细胞，在第 43 天根据其 CD10 的差异表达对两者进行分选，并通过 RNAseq 进行分析。值得注意的是，IL-25 和该细胞因子的几个阳性上游诱导剂在 M43 CD<> 中以较高水平表达你好细胞与 M09 CD43 的比较瞧细胞（图4B和4C）。

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图 4. M09 和 M25 CD4 T 细胞的细胞表面和转录组表型。

（A） 第 25、09 和 4 天来自 SG 的常规（M8，蓝色）和晚期（M15，红色）四聚体结合 CD40 T 细胞的细胞表面表型。总 MCMV 特异性 （CD11a你好还显示了 CD49d+）（虚线）和幼稚 （CD11aloCD49d-）（灰色填充直方图）CD4 T 细胞。（二） M09-CD43瞧和 M25-CD43你好从第40天感染小鼠的脾脏中分选的细胞进行RNA-seq。由于发现 M10 细胞中的 IL-09 mRNA 水平较低，因此对核心 IL-10 诱导剂进行 IPA 分析，然后进行基因集富集分析 （GSEA）。热图显示了IL-10调控基因，差异为P<0.2。（C） 使用UCSC基因组轨迹沿图4B中列出的基因的基因组坐标进行大量RNA-Seq表达富集。箭头表示基因方向，箭头内的线是外显子。RPKM，每百万个千碱基的读取数。（D） IL-10的绝对数量GFP+型感染 09 天时的 M25 和 M40 SG 驻留细胞。（E） CD10hi/lo M43 tet+ CD09 T 细胞在 4 DPI 下表达 IL-40。 （F） 脾总 MCMV 特异性 （CD11a你好CD49d+） 对 CD4 T 细胞进行 CD43 分选你好和 CD43瞧在感染后第 45 天表达，将 5e4 细胞过继性转移到幼稚小鼠中，随后用 MCMV 攻击，并在第 15 天测定 SG 复制。通过 Mann Whitney 检验评估统计学意义，*p<0.1。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011852.g004

评估 SG 驻留 CD10 T 细胞中 IL-4 蛋白的表达，IL-10GFP系列报告小鼠感染MCMV和IL-10的绝对数量GFP+型在第 25 天测定 M09 和 M40 细胞。IL-10型GFP+型M25 和 M09 细胞在病毒持久性期间以相似的数量存在（分别为 40 和 50 个细胞/SG）（图 4D），尽管此时观察到产生 IFNγ 的 M100 细胞多 ~09 倍（见图 3B）。此外，CD43 的少数群体你好发现 M09 细胞比 CD10 细胞表达更多的 IL-43瞧，表明这两个子集有一个不同的分化程序（图 4E）。基于这些结果，我们假设 CD43 的低表达可用作 MCMV CD09 T 细胞的 M4 群体的替代标志物，以及潜在的其他 M09 样抗病毒 CD4 T 细胞，由于高 IFNγ 表达和低 IL-10 产生，它们可以更好地控制病毒持久性。为了验证这一点，在第4天分离总病毒特异性CD37 T细胞[38,40]，根据CD43表达进行分选，转移到幼稚小鼠体内，随后用MCMV攻击。引人注目的是，只有CD43瞧细胞在第 15 天对 SG 中的 MCMV 复制提供了一定的控制，CD43你好介导无对照的细胞（图4F）。这些结果表明，CD43 的低表达标志着大多数晚起的 M09 反应性 T 细胞更擅长解决病毒持久性。

疫苗诱导的M09细胞具有高度保护性

为了进一步测试晚起的M09细胞是否可以在解决MCMV持久性方面发挥独特且非冗余的作用，我们询问了当通过疫苗接种诱导时，它们是否可以提供比传统MCMV CD4 T记忆细胞更好的质量更好的控制。小鼠接种了15个25mer表位，这些表位在急性感染期间显示出常规的效应记忆转换（M139+M142+M3，'20conv'）[09]，有或没有M09表位。重要的是，在病毒攻击之前，单肽（M25、M142 或 M5）疫苗接种方案扩增了脾脏中等效数量的细胞（图 4A），这与我们的观察结果一致，即这 4 个群体的 CD6 T 前体存在于幼稚 B15 小鼠中。然而，令人惊讶的是，在MCMV攻击时，接种了这些团中的任何一个的小鼠在第5天测量的SG复制水平没有降低（图4B）。这表明这并不是因为免疫无效，我们发现接种两种常规 CD25 T 表位（M142 和 M8）可防止肝脏中的 MCMV 攻击，相当于使用两种表征的 CD38 T 细胞表位 （M<>316-323+ IE3浏览器416-423) [引人注目的是，当将M39肽表位添加到M09 + M25疫苗接种方案中时，到第142天，75%的小鼠完全控制了肝脏中的病毒复制（图8C）。鉴于 IL-5 在维持 MCMV SG 复制中的重要性，以及它在早期持续存在时由 CD10 T 细胞高度表达的事实，我们怀疑这种细胞因子可能会限制疫苗诱导的 CD4 T 细胞在该组织中发挥控制作用的能力。因此，重复接种疫苗并结合 IL-4R 信号转导 （αlL-10R） 的抗体阻断，在 MCMV 攻击后第 10 天和第 8 天测量保护。在αlL-15R存在的情况下，结果现在在很大程度上概括了在肝脏中看到的情况，与单独的10conv或αlL-3R治疗相比，10conv+αlL-20R团提供了≥3倍的保护（图10D）。最值得注意的是，在两个时间点，包含具有IL-5阻断的M09肽完全控制了≥10%小鼠SG中的MCMV SG复制（图50D）。综上所述，这些数据表明，与单独的传统记忆CD5 T细胞相比，通过疫苗接种诱导正常晚期上升的M09记忆CD4 T细胞的早期扩增，可以更好地防止病毒持久性。

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图 5. 疫苗诱导的 M09 细胞提供显着的保护。

（A） 在 MCMV 攻击之前，分析单独接种 M09、M25 或 M142 肽的单次免疫 （CFA） 的小鼠脾脏中四聚体阳性细胞的数量。（B） 接种 M25+M142+M139 肽 （3conv） 或 3conv+M09 的小鼠用 MCMV 攻击史密斯，并在第 15 天确定 SG 复制水平。（C）小鼠接种M25+M142、M25+M142+M09或两种CD8 T细胞表位（M38+IE3），并在MCMV攻击后8天测定肝脏复制水平。（D） 在第 10 天和第 0 天（第 4 天）或第 8 天和第 0 天（第 7 天）在接种疫苗的小鼠中注射封闭抗 IL-15R 抗体，并在 MCMV 攻击后第 8 天（上图）或第 15 天（下图）测定 SG 复制水平。通过Mann Whitney检验评估统计学意义，***p< 0.001，**p< 0.01，*p<0.1。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011852.g005

讨论

这项工作表明，与更早发育的传统记忆细胞相比，在MCMV感染期间较晚扩增的表位特异性CD4 T细胞反应在自然感染和疫苗接种期间在减少持续复制方面明显更好。MCMV诱导几种表位特异性记忆CD8 T细胞反应，这些反应缓慢扩增和/或不收缩，称为“记忆膨胀”[40\u42]。然而，M09特异性细胞是已知的唯一已知的疱疹病毒特异性CD4 T细胞，在感染的最初几周内不能有效启动，尽管在多瘤病毒和LCMV感染中确实存在这样的例子[43,44]，因此我们将其定义为“晚发性”。MHC-II 四聚体的开发使我们能够表征 SG 组织中这些晚发 T 细胞，SG 组织是 CMV 持续和传播的主要部位，表明它们产生的 IL-10 比传统的病毒特异性 CD2T 细胞少得多，IFNγ 和 IL-4 多得多。它还允许我们进行所展示的RNAseq实验。此外，与传统的记忆CD4 T细胞相比，这些晚起的细胞在通过肽疫苗接种共同诱导时提供了明显更好的保护。总的来说，研究结果支持了一种模型，即CMV感染驱动了一种独特的、高度保护的晚发T细胞亚群的分化，与MCMV和其他持续性感染早期出现的常规或组织驻留抗病毒记忆细胞相比，该亚群可以更好地解决持久性问题[15,45,46]。

K181菌株具有两个氨基酸，它们在Smith M09表位上有所不同，这促进了M09表位交换突变体的产生，正式证明了这些晚起细胞在解决MCMV持久性方面的非冗余作用[20,21,36]。目前尚不清楚K181是如何从1960年代史密斯的连续传代中衍生出来的[31,32,47]，但K181是M09的“逃逸突变体”的可能性存在。然而，Smith和K181之间存在显著的基因组差异，表明原始Smith分离株也可能包含两种菌株[48]，并且几种野生MCMV菌株在M09 15mer表位中也存在差异[32]。因此，K181的确切起源尚不清楚，但一个合理的假设是，可能存在针对诱导晚起M09细胞的选择性压力。CD4 T细胞表位逃逸突变体的出现增强慢性LCMV感染已有先例，据报道，这些突变体在免疫功能低下的小鼠或转基因SMARTA CD4细胞中出现[49]。然而，据我们所知，这项研究是第一个对病毒持久性产生如此巨大影响的记忆CD4 T细胞群在自然感染期间表现出明显表位选择的例子。

从初次感染开始，给予αlL-10R后，M09细胞在第20天没有扩增到更高的水平，这表明IL-10不调节其晚发表型，尽管IL-10缺陷小鼠显示出其他MCMV特异性CD4 T细胞的增强扩增[50]。另一种可能性是 M09 表位在感染早期没有有效地呈递，或者由 APC 呈递，这不能促进其强劲的扩增。正如我们的疫苗接种研究所示，这些细胞可以在感染早期被召回，但幼稚细胞和记忆细胞扩增的要求明显不同。此外，根据图5A，M09，M25和M142的前体频率可能相似，反映了幼稚小鼠的测量结果。据报道，MCMV感染的SG上皮细胞的MHC-II水平较低[28]，这引发了抗病毒CD4效应T细胞最终如何控制该器官中小瓶持久性的问题。然而，这是在感染3周时分析的，此时IL-10由常规CD4 T记忆细胞高度产生，M09细胞远未达到峰值水平，IL-10在MCMV感染期间抑制MHC-Il[51]。在急性MCMV感染期间，基质和DC群体产生高IFN-I水平[52]，诱导IL-27，随后促进MCMV CD4 T细胞产生IL-10[53]，因此，在晚期持续存在期间，较低的IFN-I水平可能使该轴不那么显性。我们假设 M09 细胞介导 SG 中直接且可能独特的效应器功能，以协调持久性的解决。这可能包括CTL活性，正如我们在MCMV感染小鼠的肝脏中显示的那样[54]。Moss及其同事发现，HCMV表位特异性CD4 T细胞可以表现出CTL活性[36]，最近的结果表明gB特异性CD4 T可以消除HCMV感染的衰老成纤维细胞[55]。值得注意的是，CD43+ CD8 T记忆细胞在其他感染模型中显示出增强的二次扩增[56,57]，我们目前正在评估MCMV特异性CD4T细胞的二次扩增。除了强调这些由自然感染诱导的保护性晚发T细胞的性质外，我们的数据还代表了以CD4 T细胞为中心的CMV疫苗策略的首次报告。之所以尝试这样做，是因为建立强大的CD4 T细胞反应可缩短HCMV脱落的持续时间，并可能限制先天性感染[58,59]，而耗竭CD4 T细胞会促进恒河猴的先天性CMV感染[60]。我们认为，未来的CMV疫苗策略应仔细评估诱导CD4T细胞的表型，这是过去临床试验中未被充分探索的领域[61,62]。在MCMV的情况下，晚期CD4 T细胞的存在可能是特异性的，但我们假设类似的细胞出现在猴子和人类中，以最终控制CMV的持久性。仅仅在HCMV+个体的外周血中观察病毒表位特异性CD4 T细胞并不能回答这个问题，因为在大多数情况下，感染发生在几年前，但在接种疫苗或移植的HCMV队列中包括动力学分析可以开始评估这一点。CD4 T细胞疫苗接种可诱导慢性CMV感染的免疫病理学[63]，但这可能是由于与MCMV相比，该模型的全身复制和免疫细胞活化水平非常高[64].有趣的是，CD4 T 细胞耗竭在第 8 天不会改变 MCMV 肝脏复制水平，这表明它们在此时是不必要的或多余的，进一步突出了它们惊人的疫苗接种保护能力。为什么在SG中需要共阻断IL-10，而不需要在肝脏中保护CD4 T细胞疫苗，这很有趣，并且有报道称IL-10在肝脏MCMV控制中具有冗余作用[65]。感染的不同细胞类型和这两个器官中独特的免疫环境可能会影响 IL10 抑制的重要性。

总之，晚期崛起的 M09 CD4 T 细胞既能解决自然感染期间的病毒持久性，又能在疫苗接种中提供更好的保护，这可能是由于与传统记忆 CD4 T 细胞反应相比，它们具有独特的表型和效应功能。

材料与方法

道德声明

本研究严格按照实验动物护理评估和认证协会 （AAALAC） 和美国国立卫生研究院 （NIH） 的指南进行。本研究中使用的所有动物方案均已获得拉霍亚免疫学研究所 （LJI） 机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

小鼠、病毒和细胞

所有实验均使用12至57周龄雌性野生型C6BL/10和IL-66 GFP报告小鼠[1]。小鼠在LJI实验动物护理系的特定无病原体条件下繁殖。除非另有说明;小鼠腹腔内感染 10x<>6成纤维细胞中产生的 MCMV BAC 衍生菌株的 PFU。通过将BAC DNA电穿孔到3T3细胞中，随后在MEF中扩增，在3T3细胞中通过标准噬菌斑测定进行定量，从而产生MCMV病毒储备液[67]。

MCMV突变史密斯如前所述，通过en-passant（ET）诱变在大肠杆菌中进行BAC检测[68]，并通过PCR测序确认诱变成功。还对整个BAC进行了测序，以验证与Smith相比，Smith M09K突变体中不存在其他突变WT型巴克。通过Bowtie 10.2.0将BAC克隆的0 bp双端短读长与BAC载体序列和大肠杆菌（DH69B菌株）进行过滤[0]。然后将未对齐的读长映射到 MCMV 序列。Freebayes （v9.18.3-72-gb21a70b） 用于根据排序的 BAM 文件调用 SNP。对过滤后的变异进行Vt包装[348373]进行归一化，然后将多等位基因变异以及双等位基因块替换分解为组成SNP。该序列被存入GenBank（KY3）。如前所述，通过3T71细胞中的斑块测定法测定MCMV器官复制水平[<>]。

MHC-II四聚体染色和富集

生物素标记的 M25 或 M09 （1-A°） 单体由 NIH 四聚体核心设施（阿拉巴马州埃默里市）生成，并在我们的实验室中根据其说明通过添加链霉亲和素结合的荧光染料进行四聚化。单细胞悬液基本上如上所述进行特异性CD4 T细胞四聚体富集[72]，或直接用与APC和RPE结合的四聚体染色。简而言之，将分离的单核细胞与荧光染料偶联的 II 类四聚体 （6 ug/ml） 在室温 （RT） 下孵育 120 分钟，然后用其他流式细胞术抗体染色细胞或按照提供者方案的推荐加入用于富集抗荧光染料磁珠 （Miltenyi-Biotec）。然后将微珠结合的细胞通过磁分离 （MS） 柱，使四聚体结合的 CD100 T 细胞富集 ~4 倍。

细胞分离和流式细胞术

从未感染或MCMV感染的小鼠中制备SG的单细胞悬浮液。在用含有胶原酶D（10mg / ml），DNase（1.0mg / ml）和CaCl 1（2mM）的RPMI培养基（+ 5%FBS）消化组织之前，小心地去除SG相关淋巴结。消化的样品通过70uM细胞过滤器，并使用淋巴溶质溶液（雪松兰）通过密度梯度离心分离组织相关淋巴细胞。通过70uM细胞过滤器轻轻捣碎脾脏，然后加入红细胞裂解缓冲液（Thermofisher / eBioscience）来分离脾细胞。通过下颌下皮肤穿刺收集血液，精确测量收集的血液体积，用红细胞裂解缓冲液去除红细胞，使用精密计数微球（Biolegend）评估细胞数量。用对 CD4（克隆 3A17）、CD2（克隆 RM4-4）、NK5.1（克隆 PK1）、CD136（克隆 IM44）、CD7a（克隆 M11/17）、CD4d（克隆 R49-1）、CD2（克隆 43B1）、CD11（克隆 LG.27A3）、CD10（克隆 H69.1F2）、CD3L（MR40）、CD1/137-4BB （1AH1）、CD2（CNX160-46）、GITR （DTA-3）、CD1/OX134 （X-40）、CD86/BTLA （272F6）、Ly7c （HK6-1）、 PSGL4 （1PH2）、CD1/PD279 （1F.29A1）。在一些实验中，还对细胞进行了TNFα（MP12-XT6）、IFNγ（克隆XMG 22.1）和IL-2（JES2-6H5）染色。除非另有说明，否则抗体均购自BD Pharmingen（加利福尼亚州圣地亚哥）、Thermofisher/eBioscience（加利福尼亚州圣地亚哥）或Biolegend（加利福尼亚州圣地亚哥）。在LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）上收集数据，并使用FlowJo软件进行分析。

收养转移

WT MCMV 感染的小鼠在感染第 45 天被安乐死，脾脏 CD4 T 细胞表现出 CD11a+CD49d+ 表型，根据 CD43 hi vs lo 群体进行 FACS 分类。分选后，在 MCMV 攻击前 50 小时静脉注射 000,4 个 CD24 T 细胞到幼稚小鼠中。

细胞内细胞因子染色

用醋酸佛波醇肉豆蔻酸酯（PMA; 100 ng/ml;Sigma-Aldrich，USA）、离子霉素（500ng/ml;Sigma-Aldrich）和布雷菲德素A（2 ug/ml）在5°C下放置6-37小时。 再刺激后，细胞直接进行抗体染色或在四聚体富集后进行染色。然后将细胞固定并透化（BD Pharmingen），然后与抗IFNγ，TNFα或IL-2抗体一起孵育。对于IL-10，使用Il10-GFP报告小鼠（顶点）。

接种疫苗

小鼠在50ul完全弗氏佐剂（CFA）中接种50ug的每种肽用于启动，50周后接种3ul不完全弗氏佐剂（IFA）用于加强[73]。模拟免疫小鼠接受在CFA或IFA中乳化的DMSO。接种疫苗的小鼠在加强后 3 周受到攻击。对于M09、M25和M142细胞诱导（图5A），在50ul完全弗氏佐剂（CFA）中接种50ug每种肽，8天后分析脾脏中的四聚体阳性细胞。

RNA-seq 和 GSEA

根据 CD25 和 CD09 的表达水平，从感染小鼠的混合脾脏中分选活的四聚体阳性 M4 和 M43 CD27 T 细胞。使用三个池，每组 5 只小鼠。使用 miRNA easy micro 试剂盒 （Qiagen） 纯化总 RNA，然后通过 Smart-seq50 方案扩增 1000–2 pg，并使用 AMPure XP 磁珠纯化 cDNA（比例为 1：1;贝克曼·库尔特）。在此步骤中，使用 1 ng cDNA 制备标准 Nextera XT 测序文库（Nextera XT DNA 样品制备试剂盒和索引试剂盒;Illumina）。使用HiSeq2500（Illumina）对样本进行测序，以获得50 bp的单端读长（TruSeq Rapid Kit;Illumina）平均每个样本产生~9万个映射读长。然后使用 TopHat （v 10.1.4） 将读数与 UCSC mm1 参考基因组对齐。在去除缺失的特征（所有样品中的计数为零）后，将原始计数导入 R/Bioconductor 包 DESeq2 [74] 以鉴定样品中的差异表达基因。使用 Wald 检验计算差异表达值，该检验估计拟合负二项式广义线性模型 （GLM） 中系数的显著性。然后使用B.Hochberg算法[75]调整这些p值以进行多重检验校正，以控制错误发现率。两组样本之间的差异表达基因定义为当 DESeq2 分析导致调整后的 P 值为 <0.1 且基因表达的倍数变化至少为 2 倍时。使用标准算法和指标进行主成分分析（PCA）。全转录组扩增和测序文库制备均以 96 孔形式进行，以减少检测间的变异性。包括质量控制步骤，以确定总RNA的质量和数量、PC预扩增循环的最佳数量和片段大小的选择。使用Ingenuity Pathway Analysis（Qiagen Bioinformatics）鉴定IL-10基因表达的上游正调控因子。使用log（P） *倍数变化征作为排名指标，使用'classic'作为富集统计量进行预排序基因集富集分析（GSEA）[76]。

本出版物中讨论的数据已存放在 NCBI 的基因表达综合数据库中，可通过 GEO 系列登录号 GSE237946 访问。

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE237946)

统计分析

通过合适的参数（未配对的 Student's t 检验和 Welch 校正）或非参数检验（Mann-Whitney U 检验）分析统计学意义。动力学差异通过双向方差分析检验确定。除非另有说明，否则数据以个体值/平均值? SEM表示，p<0.05 （*）， 0.01 （**）， 0.001 （***）， 0.0001（****）。

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分析来自脾脏和血液的 MCMV 表位特异性 CD4 T 细胞。

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S1 图。 分析来自脾脏和血液的 MCMV 表位特异性 CD4 T 细胞。

（A） 09 和 25 DPI 下脾脏中 M142、M4 和 M8 双四聚体染色的 CD40 T 细胞的代表性流式细胞术图。 （B） 感染后第 09 天至第 25 天脾脏中 M142（红点）、M4（蓝色方块）和 M0（黑色三角形）特异性四聚体 CD200 T 细胞，百分比（左）和绝对数（右）。（C） 09 DPI 下血液中 CD25 T 细胞的 M142、M4 和 M14 双色染色四聚体的代表性流式细胞术图，用相同的四聚体对幼稚小鼠的血液进行染色，显示了 M09 四聚体的代表性染色。（D） 感染后第 4 天至第 0 天血液中特异性四聚体 CD200 T 细胞，百分比（左）和绝对数量（右）。动力学差异通过双向方差分析检验确定。第<0.0001页。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011852.s001

（TIF）

S2 图。 MCMV 的 SG 复制水平史密斯、史密斯 M09K 和 MCMVK181型.

野生型和 Smith M09K 在 4 天时在脾脏 （A） 和 （B） 肝脏中的复制，以及第 30 至 70 天的 SG （C） 复制。（D） MCMV的SG复制水平K181型（60–130 dpi）和 MCMV史密斯和 Smith M09K 的 55 dpi。A、B采用Mann Whitney检验评估统计学意义，C采用双向方差分析检验确定。**p < 0.01，****p < 0.0001。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011852.s002

（TIF）

S3 图。 MCMV肽特异性反应细胞在感染期间产生细胞因子。

从感染第 4 天到 2 天，M09（红点）、M25（蓝色方块）和 M142（黑色三角形）肽刺激肽后表达 I IFNγ （A）、IL-8 （B） 和 TNFα （C） 的 CD200 脾细胞百分比的动力学。脾细胞 MCMV 肽刺激在 2 dpi 下 IFNγ 记忆 CD4 T 细胞 （CD44+） 中 TNFα （E）、IL-40 （F） 或两者 （G） 细胞因子的表达水平。（H） 感染后第 44 天 （M4） 和第 40 天（M09 和 M8）三阳性记忆 （CD25+） CD142 T 细胞细胞因子产生者的百分比。（I） 细胞因子阳性细胞的 MFI。组间比较采用Mann Whitney检验评估，*p< 0.1，**p< 0.01。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011852.s003

（TIF）

S4 图。 感染期间 MCMV 肽特异性反应细胞细胞因子的产生 （MFI）。

（A） 感染后第 2 天、第 8 天和第 40 天 IFNγ、IL55 和 TNFα 细胞因子阳性细胞的 MFI。组间比较采用Mann Whitney检验评估，*p< 0.1，**p< 0.01。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011852.s004

（TIF）

S5 图。 MCMV 特异性 CD4 T 细胞的细胞表面标志物表达。

在感染的第 25 天或第 09 天显示脾脏中常规（M4，蓝色）和晚发（M8，红色）四聚体结合 CD40 T 细胞表达的细胞表面标志物。总 MCMV 特异性 （CD11a你好CD49d+，虚线直方图）和幼稚（CD11a瞧CD49d-，灰色填充直方图）还显示了CD4 T细胞。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011852.s005

（TIF）

确认

流式细胞术和基因组测序在拉霍亚研究所的核心设施。

Alec Redwood 提供 K181 BAC 并讨论 MCMV 表位/序列变异。

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