免费医学论文发表-组氨酸转运对于金黄色葡萄球菌在低pH值下的生长至关重要
抽象
金黄色葡萄球菌是一种机会性病原体，能够引起许多不同的人类疾病。在定植和感染期间，S.金黄色葡萄球菌会遇到一系列恶劣的环境，包括酸性条件，例如在皮肤和巨噬细胞内发现的酸性条件。然而，人们对 S.金黄色葡萄球菌用于检测和响应低pH值。在这里，我们采用转座子测序方法在全基因组水平上确定在低pH值下生长所需或有害的基因。我们确定了 31 个对 S 生长至关重要的基因。pH 值为 4.5 的金黄色葡萄球菌，并通过使用单个基因灭活的突变菌株的后续实验证实了其中许多金黄色葡萄球菌的重要性。大多数基因鉴定出具有细胞壁组装和维持功能的蛋白质的编码。这些数据表明，在酸胁迫下，细胞壁在促进细菌存活方面的作用比以前所认为的更重要。我们还确定了几个以前与S中的酸应激反应无关的新过程。金黄色葡萄球菌。这些包括有氧呼吸和组氨酸转运，后者通过显示最重要的基因之一，SAUSA300_0846，编码以前未表征的组氨酸转运蛋白。我们进一步表明，在酸胁迫下，WT S中组氨酸转运蛋白基因的表达增加。金黄色葡萄球菌。在 S 中。金黄色葡萄球菌SAUSA300_0846组氨酸生物合成基因的突变菌株表达在酸胁迫条件下被诱导，使细菌能够维持胞质组氨酸水平。然而，该菌株无法将其胞质 pH 值维持在与 WT 菌株相同的程度上，从而揭示了 S 酸应激反应中组氨酸转运的重要功能。金黄色葡萄球菌。
作者摘要
金黄色葡萄球菌是一种重要的人类细菌病原体，可引起一系列疾病。在感染过程中，病原体会在人类宿主体内遇到恶劣的环境，包括酸性条件，例如在皮肤和巨噬细胞内发现的酸性条件。这种细菌已经发展出复杂的策略，可以在如此恶劣的条件下生存和生长。在这里，我们进行了全基因组筛选，以确定这种病原体在酸胁迫条件下生存所需的因素，并确定了包括组氨酸摄取在内的几个新过程。了解 S 的反应。金黄色葡萄球菌应对酸应激条件将帮助我们更好地管理感染。
数字
图8图9图1表1图2图3图4图5图6图7表2图8图9图1表1图2
引文： Beetham CM、Schuster CF、Kviatkovski I、Santiago M、Walker S、Gründling A （2024） 组氨酸转运对于金黄色葡萄球菌在低 pH 值下的生长至关重要。PLoS 病理学 20（1）： e1011927 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927
编辑 器： 弗朗西斯·阿朗佐，美国伊利诺伊大学芝加哥医学院
收到： 26年2023月28日;接受： 2023年16月2024日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2024 Beetham et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 使用文库A进行TN-seq实验的Illumina序列读数被存放在美国国家生物技术信息中心（NCBI）的短读长档案（SRA）中，BioProject ID PRJNA998095下。使用文库B进行TN-seq实验的Illumina序列读数作为先前研究的一部分存放在短读长档案（SRA）中，编号为BioProject ID PRJNA544248和登录号SRX5883253。抑制菌株的Illumina序列读数被保存到欧洲核苷酸档案库（ENA）中，项目编号为PRJEB62451。
资金： 这项工作得到了惠康信托 （https://wellcome.org/） 对 AG 的赠款 210671/Z/18/Z/WT 的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、手稿准备或发表决定中没有发挥任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性共生细菌，存在于皮肤、呼吸道和鼻腔中[1]。但是，S.金黄色葡萄球菌还可引起多种感染，从皮肤和软组织感染到菌血症[2]。为了引起如此广泛的感染，S。金黄色葡萄球菌需要能够在宿主的不同生态位中生存，其中许多生态位不适合细菌生长。其中一种环境是低pH值，在巨噬细胞摄取过程中，低pH值存在于皮肤、胃和吞噬体中。
低pH值会以多种方式对细菌产生不利影响。首先，细胞外质子浓度的增加会影响质子穿过膜的电化学梯度，称为质子动力（PMF）。细菌利用PMF产生ATP，改变pH值已被证明会影响ATP的合成[3]。质子还可以通过增加活性氧（ROS）的形成、影响具有最佳pH值范围的酶的活性、由于氨基酸上的不同电荷导致蛋白质变性和错误折叠以及促进脱嘌呤引起的DNA损伤而造成细胞内的损伤[4]。因此，细菌已经发展出一系列处理低pH值的机制[5,6]。首先，细菌可以通过改变其组成或电荷来降低其细胞膜和细胞壁对质子的渗透性。值得注意的是，在革兰氏阳性菌中，通过dlt操纵子将带正电荷的D-丙氨酸添加到磷壁酸上已被证明对低pH值下的生长和存活很重要[7,8]。其次，细菌可以通过质子泵（如 F）将多余的质子泵出细胞0F1-ATP酶[11]。第三，细菌可以增加消耗质子的反应速率，例如氨基酸脱羧。常见的途径包括谷氨酸、赖氨酸或精氨酸脱羧，所得产物和质子从细胞中输出。缓冲细胞质pH值的另一种方法是产生碱性分子，如氨。氨可以通过精氨酸脱氨酶系统产生[12]，也可以通过脲酶[13]从尿素中产生。氨很容易质子化形成铵，从而消耗质子。最后，细菌可以通过上调过程来应对低pH值，从而防止pH值引起的损伤，或在损伤后修复大分子。这可能包括防止pH诱导的蛋白质变性的伴侣蛋白、降解受损蛋白质的蛋白酶、ROS解毒系统或DNA修复过程[7,14,15]。
虽然在革兰氏阴性菌（如大肠杆菌和肠道沙门氏菌）中已经做了很多工作，但对革兰氏阳性菌，特别是 S.金黄色葡萄球菌，应对酸胁迫。关于 S 酸胁迫反应的大多数信息。金黄色葡萄球菌是从转录研究中获得的[16,17,18,19,20]。在这些研究中，一些上调最多的基因是尿素A-F和nixA基因，它们编码脲酶UreAB和辅助蛋白UreDEF，以及完全脲酶活性所需的高亲和力镍转运蛋白NixA。实验还证实，通过脲酶从尿素中产生氨对于S的生存至关重要。金黄色葡萄球菌在弱酸胁迫下以及 S 致病性所必需的。金黄色葡萄球菌[21]。此外，S.金黄色葡萄球菌可以通过精氨酸脱氨酶系统产生氨，而精氨酸分解代谢移动元件（ACME）促进了这一过程[22]。其他转录上调的基因编码参与细胞壁组装和细胞表面电荷调节的蛋白质。这些基因包括参与荚膜多糖生物合成的基因[17]，以及DLT基因，其编码的酶催化在细胞表面添加正电荷[19]。在几项转录研究中，观察到编码伴侣蛋白或编码Clp蛋白酶的clpC、clpP和clpB的groEL和groES基因上调[17,18,19,20]。 此外，参与DNA修复机制的基因如rexAB[18]和参与ROS解毒的基因也被上调[18]。最后，信号核苷酸环磷酸二腺苷 （c-di-AMP） 的细胞内水平已被证明与酸敏感性相关。在pH 4.5时，低c-di-AMP生产菌株的生长降低，而高c-di-AMP生产菌株表现出相反的表型[23]。其机制目前尚不清楚。
尽管这些转录研究提供了丰富的信息，但这些研究并未考虑转录后或翻译后修饰。其次，在大多数这些研究中，只研究了酸休克后5-30分钟内的初始反应。最后，很少有表型研究通过实验验证参与 S 酸胁迫反应的个体途径。金黄色葡萄球菌。在这里，我们采用转座子测序方法在全基因组水平上确定对 S 生长是必需的或有害的（意味着它们的破坏可能是有益的）基因。低pH值的金黄色葡萄球菌。强调对低pH培养基生长很重要的基因支持一些先前鉴定的S。金黄色葡萄球菌酸应激反应，包括细胞表面电荷的重要性。然而，我们的研究表明，其他细胞壁因子，如肽聚糖水解酶起着关键作用。还鉴定了几个以前与酸胁迫无关的基因，包括末端氧化酶基因qoxAB和SAUSA300_0846。进一步的表征表明，SAUSA300_0846是 S 中的主要组氨酸转运蛋白。金黄色葡萄球菌。最后，我们表明，在酸胁迫条件下，编码这种组氨酸转运蛋白的基因的表达上调，并且组氨酸摄取对 S 的生长很重要。酸性条件下的金黄色葡萄球菌。
结果
使用 Tn-Seq 鉴定 S 生长所需或有害的基因。酸胁迫条件下的金黄色葡萄球菌
确定对 S 生长所需或有害的基因。金黄色葡萄球菌在酸性胁迫条件下，使用两个S进行Tn-seq实验。USA300 TCH1516来源菌株背景TM283中的金黄色葡萄球菌转座子突变体文库[24,25]。这些文库将被称为文库 A 和 B，分别包含大约 600,000 和 > 1 万个混合菌落。转座子突变体池在标准TSB（pH 10.7）中生长3代，在TSB pH 5.5或TSB pH 4.5的酸胁迫条件下生长。随后收获细菌，并通过测序绘制转座子插入位点（图1A）。在 pH 值 5.5 下繁殖的培养物的生长速度与在 pH 值 7.3 下生长的培养物的生长速度相似，而在 pH 值 4.5 下培养的培养物的生长速率明显降低（图 1B）。在 pH 4.5 下生长的文库 A 未达到所需的 OD600结块引起的值。这种培养物是在OD上收获的600的 1.0，但在预期达到 OD 的时间点600的 1.4。对于文库和所有生长条件下，发现转座子插入分布在整个基因组中，表明覆盖率良好（S1图）。接下来，将每个基因在低pH培养基中生长后的转座子插入次数与在中性pH下繁殖时的插入次数进行比较（S1-S4表）。在低pH值下生长时插入次数最多是中性pH值下插入次数的一半的基因被归类为在酸胁迫条件下生长所必需的/必需的。有害基因被定义为与中性pH值相比，在低pH值下生长时插入次数至少是中性pH值的两倍的基因。这些基因在失活时可能会在酸胁迫下提供生长优势。通过将每个基因转座子插入数的倍数变化与q值作图来制备火山图（图1C和1D）。正如预期的那样，在pH 4.5下鉴定出的必需基因数量多于pH 5.5。接下来，我们试图识别文库A和B之间共同的必需或有害基因，并假设出现在两个文库中的任何基因都更有可能是相关的。为了进一步排除假阳性命中，本分析仅考虑了 Benjamini-Hochberg 校正 p 值为 ≤ 0.1 的基因。使用这些临界值，我们将 31 个基因归类为必需基因，将 10 个基因归类为对 pH 值 4.5 下的生长有害基因（图 1E 和表 1）。在pH 5.5的生长条件下，只有5个基因被鉴定为必需基因，15个基因被鉴定为有害基因（图1F）。由于在pH 5.5条件下仅鉴定出极少数必需基因，这表明胁迫不足，因此我们将进一步分析的重点放在pH 4.5条件下鉴定的基因上。
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图 1. Tn-Seq鉴定了S生长所需或有害的基因。低pH值下的金黄色葡萄球菌。
（A）Tn-Seq实验方案的示意图。转座子文库在 pH 7.3、pH 5.5 或 pH 4.5 的 TSB 中生长约 10 代，收获细菌并通过测序鉴定转座子插入位点。（B）细菌生长曲线。在TSB pH 7.3、pH 5.5或pH 4.5培养基中，两个转座子突变体池（文库A和文库B）的生长情况通过OD进行监测600在定义的时间点读数。虚线表示收获细菌的 10 代截止点。在 pH 4.5 下生长的文库 A 培养物未达到所需的 OD600由于结块而产生的价值，而是在生长 11 小时后收获。（C 和 D）火山图。作为 S 生长后获得的必需和有害基因数量的直观表示。（C） TSB pH 4.5 或 （D） TSB pH 5.5 与 pH 7.3 火山地块相比，产生了金黄色葡萄球菌。在x轴上，将每个基因转座子插入次数的倍数变化绘制在对数上2负值表示必需基因，正值表示有害基因。垂直的绿线、橙色线或红线分别表示 2 倍、5 倍或 10 倍的变化。y 轴是 q 值（Benjamini-Hochberg 校正的 p 值），黑色水平线表示 q 值为 0.1。每个点代表一个基因，每当达到 q 值阈值时，着色都会遵循倍数变化方案。非常小的 q 值被截断以适合图形。（E 和 F）维恩图。在文库 A 和 B 之间比较了转座子插入数量减少 2 倍（必需基因）或增加 2 倍（有害基因）且 Benjamini-Hochberg 值为 ≤ 0.1 的基因列表，并显示在 （E） pH 4.5 和 （F） pH 5.5 胁迫条件下的维恩图中。表31列出了pH 10.4生长条件下重叠的5个必需基因和1个有害基因。图1A中的图像是从Schuster等人发表的图1（a）修改而来的。[25] 根据 CC BY 4.0 契约许可 （https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。
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表 1. 通过 Tn-Seq 鉴定为对 S 生长至关重要或有害的基因。TSB pH 4.5 培养基中的金黄色葡萄球菌。
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Tn-Seq强调细菌细胞壁是S酸胁迫反应的关键组成部分。葡萄球菌
确定 S 所需的主要通路。金黄色葡萄球菌在低pH条件下生长，我们更详细地检查了pH 4.5生长条件下Tn-seq实验中突出显示的基因列表（表1）。在低pH生长条件下，发现许多编码与细菌细胞壁相连的因子的基因是必需的（图2）。用于检测细胞壁应激的 VraSR 双组分系统的 vraS 和 vraR 编码在必需基因列表中。几种肽聚糖水解酶也在名单上，包括SpdC和SagB，它们形成一种在子细胞形成过程中释放新生肽聚糖所需的蛋白质复合物，以及免疫显性葡萄球菌抗原AIsaA，这是一种预测的裂解性转糖基酶[26,27,28]。与细胞壁相关的其他途径包括那些参与调节细胞表面电荷的途径。鉴定了编码 GraXRS-VraFG 五组分系统中两种膜结合感觉成分的 graS 和 vraG。该系统检测并响应细胞壁应激源，如阳离子抗菌肽，导致向细胞表面添加正电荷所需的因子的表达[29]。几个graXRS-vraFG靶基因在Tn-Seq检测中也被强调为必不可少的。这些包括来自dlt操纵子的dltB，它是将带正电荷的D-丙氨酸残基添加到磷壁酸上所必需的，以及mprF，它负责合成带正电荷的膜脂质赖氨酰磷脂酰甘油。最后，fmtA编码一种酶，该酶最近被证明是一种D-氨基酸酯酶，可从磷壁酸中去除D-丙氨酸，在低pH生长条件下也是必不可少的。有趣的是，在酸胁迫条件下，编码肽聚糖酰胺酶及其激活剂的lytH和actH被鉴定为两个最有害的基因，表明这种酰胺酶的活性在这些生长条件下是有害的。
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图 2. 在TnSeq实验中，参与细胞壁重塑的许多因素被确定为必不可少的因素。
S 的示意图。金黄色葡萄球菌细胞壁，其中蛋白质在本研究中强调对 TSB pH 4.5 的生长至关重要，并参与细胞壁合成或重塑。如果蛋白质是复合物的一部分，则在Tn-seq实验中鉴定的蛋白质以彩色显示，而其他蛋白质则以灰色显示。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.g002
此外，还有几种被强调为必不可少的途径，这些途径以前与 S 中的酸性应激反应无关。金黄色葡萄球菌。其中一种途径是有氧呼吸。鉴定出 srrA，它编码 SrrAB 双组分系统的反应调节因子，该系统调节参与有氧呼吸的基因。这些基因包括 qoxA 和 qoxB，编码 Qox 细胞色素 aa 的亚基3-型喹诺氧化酶，一种存在于 S 中的质子泵浦末端氧化酶。金黄色葡萄球菌。与此一致，在Tn-Seq实验中，qoxA和qoxB基因也被强调为在低pH生长条件下生长的必要条件。鉴定出的其他基因是编码预测阳离子：质子反转运蛋白的 SAUSA300_0846 和 mhnA1、编码蛋白质转位酶亚基的 secDF 和编码 tRNA 尿苷 5-羧甲基氨甲基修饰酶的 gidA。此外，还鉴定了几个功能仍未表征的基因，例如编码假定的 MSF 家族通透酶的 SAUSA300_2389、编码预测的磷脂磷酸酶SAUSA300_0429以及编码拟议的 t-RNA 腺苷脱氨酶的SAUSA300_0543基因。综上所述，这些数据证实了使用Tn-Seq作为探索S酸胁迫响应的方法的稳健性。金黄色葡萄球菌，因为先前已知的途径被确定为在低pH值下生长的重要途径，包括细胞壁和细胞表面电荷[19,32,33,34]。此外，在我们的实验中还发现了几种新的途径和基因，例如有氧呼吸和预测转运蛋白的SAUSA300_0846编码。
确认 S 生长所需的基因。低pH值下的金黄色葡萄球菌
进一步探索 Tn-Seq 测定中鉴定的每个基因在多大程度上有助于 S 的能力。金黄色葡萄球菌在低pH条件下生长，我们研究了个体S的生长情况。金黄色葡萄球菌突变株。为此，我们使用了来自内布拉斯加州突变转座子库（NTML）的定义转座子突变体[35]，或从其他集合中获得的突变株。然而，并非所有已鉴定的基因都可以进一步研究（表1），因为例如，有几个基因被认为对正常生长至关重要，因此在任何集合中都不存在突变菌株。最后，我们从20个必需基因列表中分析了31个突变菌株的生长，从7个有害基因列表中分析了10个突变菌株的生长。通过将过夜培养物的连续稀释液点样到TSA pH 7.3或TSA pH 4.5平板上来测试每个突变体的生长。在TSA pH 7.3上，所有菌株的菌落形成单位（CFU）数量均未出现任何显着差异，表明在中性pH条件下，灭活这些基因不会带来任何严重的生长缺陷（S2图）。另一方面，几种突变菌株在TSA pH 4.5平板上显示出生长缺陷（图3）。大多数携带细胞壁相关基因中转座子插入或缺失的突变菌株在 TSA pH 4.5 平板上表现出生长缺陷。这包括graS、vraG、vraR、vraS、mprF、fmtA和dltD突变体（图3A-3C），从而证实了细胞壁在S酸应激反应中的重要性。 金黄色葡萄球菌（图2）。参与有氧呼吸的失活基因也导致菌株在 TSA pH 4.5 平板上生长的能力降低。srrA突变体表现出严重的表型，qoxA和qoxB突变体的生长也略有减少（图3E）。其他在 pH 4.5 平板上生长能力降低的菌株包括在 SAUSA300_0846（预测转运蛋白）、SAUSA300_2389（预测的 MFS 通透酶）、SAUSA300_0543（预测的 t-RNA 腺苷脱氨酶）中插入转座子的突变体，并且 SAUSA300_0481（转录修复偶联因子 Mfd）和 SAUSA300_1518（DEAD-box ATP 依赖性 DNA 解旋酶 CshB）突变体 （图 3F 和 3G）。然而，并非所有突变菌株在TSA pH 4.5下都表现出生长能力降低，尽管在Tn-Seq实验中被确定为必不可少的。这些突变体包括SAUSA300_0482、SAUSA300_0957、sagB、spdC和SAUSA300_0429突变体（图3D、3F和3G）。
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图 3. 生长板和S的存活分析。在 pH 4.5 下被确定为对生长至关重要或有害的基因中插入转座子的金黄色葡萄球菌突变菌株。
（A-G）TSA pH 4.5 板上的细菌生长。将指示的 WT 和突变菌株的过夜培养物连续稀释，并将等分试样点样到 TSA pH 4.5 平板上。在 24°C 下孵育 37 小时后拍摄图像。 每张图像都代表三个实验。（H-J）酸胁迫生存曲线。将 WT JE2 以及 （H） JE2 lepA：：Tn、（I） JE2 noc：：Tn 或 （J） JE2 lytH：：Tn 的过夜培养物洗涤并稀释到 TSB pH 2.5 培养基中。紧接着（T = 0 h）和每隔2小时，取出长达8小时的等分试样，并通过将稀释液接种到TSA板上来测定CFU。对于每个菌株，T = 0 h 时的 CFU 计数设置为 100%，并且在计算的后续时间点的存活率为 %。绘制了三个（H和J）或四个（I）实验的存活率的平均值和标准差。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.g003
我们可用的 7 种菌株中，在有害基因中插入转座子的菌株中，没有一个在 TSA pH 4.5 平板上显示出生长增加（S3 图）。我们推测，这可能是因为该测定不够严格，无法检测到 pH 值为 4.5 时生长的增加，因为 WT 菌株在此条件下生长强劲。因此，我们还在低得多的pH值（2.5）的液体培养基中测定了WT和插入有害基因的突变菌株的存活率。在该测定中，与 WT 相比，在 TSB pH 2.5 中，其中 3 株菌株的存活率更高（图 3H、3I 和 12J）。它们是 lepA：：Tn、noc：：Tn 和 lytH：：Tn。后者在 Tn-Seq 测定中具有最高的比率，为 96.100，也显示出最大的存活率增加，CFU ml 增加了 <> 倍-1在 TSB pH 8.2 中孵育 5 小时后与 WT 相比计数（图 3H、3I 和 3J）。总体而言，在研究的 20 个必需基因中，有 15 个可以被证实对 S 的生长很重要。低pH条件下的金黄色葡萄球菌。此外，对于所研究的 3 个有害基因中的 7 个，可以证明它们的失活导致 S 的存活率增加。低pH条件下的金黄色葡萄球菌。这突出表明，Tn-seq是鉴定酸胁迫条件下细菌生长所需基因的可靠方法。几个新基因的重要性得到证实，包括编码未表征的膜转运蛋白的SAUSA300_0846，作为本研究的一部分，我们对此进行了进一步研究。
0846 是 S 中的主要组氨酸转运蛋白。葡萄球菌
选择SAUSA300_0846（以下称为0846）进行进一步研究，因为它在pH 4.5的Tn-Seq实验中具有最低的比率，因此可以被认为是低pH条件下最重要的因素之一。该基因在pH 5.5的Tn-Seq实验中也被确定为必需的。有趣的是，先前的几项研究表明，0846突变体在小鼠中的毒力降低[36,37,38]。然而，0846的细胞功能尚不清楚，因此可能突出了细菌在低pH条件下和感染期间生长所需的新途径。为了确认 0846：：Tn 突变株的酸敏感生长表型是由于 0846 基因的破坏所致，将 0846：：Tn 区域转移到干净的 S 中。葡萄球菌LAC* 背景应变。此外，通过将单位点整合质粒 pCL55-0846 引入 LAC* 0846：：Tn 突变株中，在其天然启动子控制下表达 0846，从而产生互补菌株。含有空 pCL0846 质粒的菌株 LAC* 55：：Tn 在低 pH 值下，无论是在 TSA pH 4.5 琼脂平板上还是在液体培养基中，都显示出预期的生长缺陷（图 4A 和 4B）。在互补菌株 LAC* 0846：：Tn pCL55-0846 中，生长恢复到 WT 水平，证实酸敏感性生长表型是由于 0846 的破坏（图 4）。
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图 4. 遗传互补恢复了0846：：Tn突变株的酸生长能力。
（A） TSA pH 4.5 板上的细菌生长。连续稀释 LAC* pCL55 （WT） LAC* 0846：：Tn pCL55 （0846：：Tn） 和互补菌株 LAC* 0846：：Tn pCL55-0846 （0846：：Tn comp.） 的过夜培养物，并在 TSA pH 4.5 上点样等分试样。在 24°C 下孵育 37 小时后拍摄图像。 每张图像代表三个实验。（B-C）细菌生长曲线。在 （B） TSB pH 7.3 或 （C） TSB pH 4.5 培养基中生长与 （A） 相同的菌株，在 96 孔板和 OD600在指定的时间点进行的测量。绘制了三个独立重复序列的平均读数和标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.g004
0846 是两个基因 0846-0847 操纵子的一部分，预计编码多膜跨越蛋白，而 0847 预计编码细胞质定位的硫酯酶超家族酶。这两种蛋白质的确切细胞功能仍然未知，因此不知道它们是否在同一细胞通路中起作用。然而，值得注意的是，只有 0846 而不是 0847 被强调为在酸胁迫条件下生长所必需的基因之一，因此仅进一步研究了 0846 的功能。文献和生物信息学分析揭示了0846的两个潜在功能。首先，它被注释为属于NhaC型转运蛋白的阳离子：质子逆向转运蛋白（CPA）。CPA 在 S 的碱性应激生长条件下具有公认的功能。金黄色葡萄球菌[39,40,41]。除了 0846，S.金黄色葡萄球菌有 7 个额外的潜在 CPA;另外1个Cpa2家族转运蛋白、3个Cpa39型转运蛋白、40个Cpa41型Mnh转运蛋白和1个NhaC家族转运蛋白[4,5,1]。在pH 1.1的Tn-Seq实验中，mnhA1被确定为必需的（表6），在之前的一项研究中，mnhA0和cpa0846-40的表达在pH 4.5时增加，但1没有[2]。因此，我们假设，除了在碱性胁迫条件下很重要外，CPA活性也可能对酸性胁迫反应很重要。为了进一步探讨这一点，我们研究了不同 S 的要求。葡萄球菌CPA转运蛋白，用于在低pH条件下生长。在编码这些转运蛋白的基因中插入转座子的突变体在 TSA pH 2.35 平板上测定其生长能力。然而，由于mnh39操纵子不具有功能性，mnh0846操纵子在LAC、LAC*和JE4衍生菌株中是必需的，因此无法测定Mnh转运蛋白[5,5]。只有 0846：：Tn 突变体，但在编码 CPA 的基因中插入转座子的其他五种突变株中，都没有显示出在 TSA pH <>.<> 平板上生长的能力降低（图 <>A）。虽然众所周知，CPA转运蛋白活性在碱性胁迫条件下很重要，但我们的数据表明，S的生长可能不需要它。低pH条件下的金黄色葡萄球菌，表明<>在酸胁迫期间的重要性可能不是由于阳离子质子反转运蛋白活性。
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图 5. 0846 是 S 中的主要组氨酸转运蛋白。金黄色葡萄球菌。
（A） TSA pH 4.5 板上的细菌生长。将JE2（WT）、0846：：Tn、cpa1-1：：Tn、cpa1-2：：Tn、cpa2：：Tn、nhaC1：：Tn、nhaC2：：Tn菌株的过夜培养物连续稀释，并在TSA pH 4.5平板上点样。在 24°C 下孵育 37 小时后拍摄图像。 每张图像都代表了三个生物实验。（B） S的示意图。金黄色葡萄球菌基因和操纵子受到所提出的组氨酸转录因子 HisR 的调控。（C）.组氨酸摄取试验。3将 H 放射性标记的 L-组氨酸添加到洗涤的 LAC* pCL55 （WT）、LAC* 0846：：Tn pCL55 （0846：：Tn pCL0846） 和互补菌株 LAC* 55：：Tn pCL0846-0846 （<>：：Tn comp.） 的对数中期培养物中。在指定的时间点，取出培养等分试样，过滤，洗涤，并使用闪烁计数器测量每个样品中累积的放射性，以每分钟计数（CPM）的形式测量。CPM 值归一化为 OD600值和平均 CPM/OD600并绘制了三个独立实验的标准差。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.g005
0846 的第二个注释是潜在的 YuiF 型组氨酸通透酶。这样的函数与其他已发表的计算预测一致。在之前的一项生物信息学研究中，S.鉴定出具有预测上游转录因子结合位点的金黄色葡萄球菌操纵子，包括组氨酸生物合成操纵子[42,43]（图5B）。自从更名为hisR（组氨酸调节因子）以来，在基因上游也发现了类似的序列，并预测编码调节组氨酸生物合成操纵子表达的转录因子。在0846–0847操纵子的上游也发现了这一序列[42]。为了测试 0846 是否编码组氨酸转运蛋白，我们测量了 WT S 中放射性标记组氨酸的摄取。金黄色葡萄球菌菌株 LAC*、同基因 LAC*0846：：Tn 突变株（均含有空 pCL55 质粒）和互补菌株 LAC*0846：：Tn pCL55-0846。虽然WT菌株能够吸收组氨酸，但该氨基酸的摄取在0846：：Tn突变体中几乎完全消除，并在互补菌株中再次恢复到WT水平（图5C）。这些数据表明，在我们的测定条件下，0846 是 S 中的主要组氨酸转运蛋白。金黄色葡萄球菌。
组氨酸对 S 的生长很重要。低pH条件下的金黄色葡萄球菌
为了确认细菌生长过程中 0846 的组氨酸转运活性，我们在含有或不含 130 μM 组氨酸的化学成分明确的培养基 （CDM） 中进行了生长曲线。在外源性组氨酸存在下，WT在约2小时后进入指数增长（图6A）。然而，当不存在组氨酸时，WT 显示出大约 5 小时的额外生长滞后。这表明 S.金黄色葡萄球菌通常吸收组氨酸来支持生长，如果去除，细菌需要几个小时才能适应和合成组氨酸。另一方面，无论是否存在该氨基酸，0846：：Tn菌株都显示出与在没有组氨酸的情况下生长的WT菌株非常相似的生长表型（图6B）。这可能是因为0846：：Tn突变体不能使用外源性组氨酸。在组氨酸存在下，0846：：Tn互补菌株在约2小时后再次能够开始生长（图6C）。综上所述，这些数据与 0846 编码 S 中主要组氨酸转运蛋白的概念一致。金黄色葡萄球菌。
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图 6. 组氨酸及其摄取对 S 的生长很重要。酸胁迫条件下的金黄色葡萄球菌。
（空调）。CDM pH 7.2 中的细菌生长曲线。金黄色葡萄球菌菌株 （A） LAC* pCL55 （WT）、（B） LAC* 0846：：Tn pCL55 （0846：：Tn） 和 （C） LAC* 0846：：Tn pCL55-0846 （0846：：Tn comp.） 在含或不含 7 μM 组氨酸和 OD 的 CDM pH 2.130 中生长600定时读取的读数。绘制了三个独立重复序列的平均读数和标准偏差。（D-F）CDM pH 4.3 中的细菌生长曲线。监测 （D） LAC* pCL55 （WT）、（E） LAC* 0846：：Tn pCL55 （0846：：Tn） 和 （F） LAC* 0846：：Tn pCL55-0846 （0846：：Tn comp.） 的生长，并按照面板 A-C 的描述绘制，但使用 CDM pH 4.3，含或不带 130 μM 组氨酸。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.g006
评估组氨酸是否对 S 的酸应激反应重要。金黄色葡萄球菌，我们还比较了 WT、0846：：Tn 和补补菌株在非常严格的 pH 4.3 条件下的生长。虽然与在pH 4.3（图6A）下生长相比，在pH 7.2的CDM中生长时WT菌株的生长减少（图6A），但培养基中组氨酸浓度的降低导致剂量依赖性生长减少（S4图），并且在没有组氨酸的情况下，WT菌株几乎完全无法生长（图6D）。0846：：Tn菌株，无论是否存在组氨酸，它都不能吸收组氨酸，并且在pH 4.3下无法生长（图6E）。0846在互补菌株中的表达恢复了突变体在低pH值下组氨酸存在下的生长能力（图6F）。这些数据表明，通过 0846 转运蛋白的组氨酸转运是 S 生长所必需的。低pH值下的金黄色葡萄球菌。
0846：：Tn突变株的酸敏感性可以通过诱导严格的响应来绕过
进一步研究为什么 0846 对 S 的生长很重要。在酸胁迫下，我们选择了 LAC*0846：：Tn 抑制菌株，该菌株在 TSA pH 4.5 平板上显示出改善的生长。这些菌株可以很容易地获得（图7A），并且通过全基因组测序确定了导致其中2种抑制菌株生长改善的基因组改变（表2）。其中7个抑制菌株在codY中具有单核苷酸多态性（SNP），在rel中具有44个（表0846）。CodY 是主基因调节因子，与 Rel 一起是 S 严格反应系统的重要组成部分。金黄色葡萄球菌（图 45B）。在营养限制条件下，Rel从GTP产生（p）ppGpp，导致GTP细胞内浓度降低[4]。其中，这会将 CodY 转变为无 GTP 状态，导致参与营养和氨基酸生物合成的基因转录。其中两个抑制菌株在鳕鱼中具有相同的SNP，导致早期终止密码子并可能使鳕鱼失活。这表明严格反应在具有 codY 突变的 LAC* 5：：Tn 抑制菌株中被激活。rel突变的功能后果并不容易预测。这是因为Rel具有（p）ppGpp水解酶、（p）ppGpp合成酶和其他C端调节结构域[4]。其中一个抑制菌株在水解酶结构域中具有SNP，另一个菌株在C端调节结构域之一中具有SNP。但考虑到在鳕鱼中观察到的突变类型，我们假设rel中的突变也会导致严格反应的激活。通过在TSB pH 5.0846液体培养基中执行生长曲线，我们进一步证实了两种codY抑制因子和rel抑制因子在酸胁迫条件下的生长得到改善。作为这些实验的对照，我们纳入了 LAC* codY：：Tn 突变株。与原始7：：Tn突变株相比，所有抑制菌株的行为都与codY：：Tn突变体相似，并且在pH 0846.<>时显示出更好的生长（图<>C）。综上所述，这些数据表明，抑制菌株通过激活严格反应来补偿<>：：Tn突变体的酸敏感生长表型。
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图 7. 0846：：Tn突变株的酸敏感表型可以通过激活严格反应来绕过。
（A） TSA pH 4.5 板上的细菌生长。LAC*（WT）、0846：：Tn突变体或抑制菌株0846：：Tn-S1、0846：：Tn-S2、0846：：Tn-S3、0846：：Tn-S4、0846：：Tn-S5、0846：：Tn-S6、0846：：Tn-S7、0846：：Tn-S8的过夜培养连续稀释，并在 TSA pH 4.5 板上点样等分试样。在 24°C 下孵育 37 小时后拍摄图像。 该实验只进行了一次，但通过全基因组测序证实了基因组突变的存在（B）。严格响应的示意图。在营养和氨基酸过剩的情况下，CodY 以 GTP 结合形式，与 DNA 相互作用并阻止基因表达。在营养或氨基酸限制的条件下，Rel 从 GTP 产生 （p）ppGpp，从而降低 GTP 的细胞内浓度。在低细胞GTP水平下，CodY将处于GTP未结合状态，不再与DNA结合，从而允许表达严格的反应基因。（C）细菌生长曲线。LAC* （WT）、LAC* codY：：Tn、LAC* 0846：：Tn 突变体和指定的 LAC* 0846：：Tn 抑制菌株在 （C） TSB pH 4.5 培养基和 OD 中生长600定时读取的读数。绘制了三个独立重复序列的平均读数和标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.g007
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表 2. 在 LAC*0846：：Tn 抑制菌株中鉴定的基因组改变。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.t002
在酸胁迫下，WT 诱导组氨酸转运，而组氨酸生物合成基因的表达在 0846：：Tn 突变体中被诱导
为了评估组氨酸生物合成基因是否在无法吸收组氨酸的0846：：Tn突变体中被诱导，并确定组氨酸转运或生物合成在酸胁迫期间是否被激活，我们进行了qPCR实验。更具体地说，我们确定了 hisG 和 hisD 的转录水平，它们编码催化组氨酸生物合成途径第一步和最后一步的酶、WT、codY：：Tn 和 0846：：Tn 突变株以及 0846：：Tn/codY E163号*抑制。对于产生功能性组氨酸转运蛋白的WT和codY：：Tn突变株，我们还确定了0846的转录水平。所有菌株均在TSB pH 7.3和TSB pH 4.5的酸胁迫条件下生长。我们首先通过分别比较每个菌株中的转录水平，评估了在酸胁迫条件下的任何菌株中是否诱导了组氨酸生物合成或转运的基因。该分析表明，在WT菌株中，组氨酸转运蛋白基因0846在酸胁迫条件下被诱导超过2倍，但hisD基因只有轻微的诱导，而hisG基因没有诱导（图8A）。在鳕鱼Y：：Tn突变株中，组氨酸生物合成和转运基因的表达在酸胁迫条件下被诱导超过2倍（图8B）。有趣的是，在 0846：：Tn 突变体和 0846：：Tn/codY 中E163号*抑制菌株不能吸收组氨酸，组氨酸生物合成基因在酸胁迫条件下诱导的组氨酸生物合成基因是10倍以上（图8C和8D）。这些数据表明，在WT S中诱导组氨酸转运，但不诱导合成。酸胁迫条件下的金黄色葡萄球菌菌株为这种组氨酸转运蛋白在酸胁迫期间的重要性提供了进一步的证据。在没有组氨酸转运蛋白 0846 的情况下，组氨酸生物合成在酸胁迫条件下在 0846：：Tn 突变体和抑制菌株中被激活。
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图 8. 在酸胁迫下，组氨酸转运蛋白基因 0846 在 WT 中被诱导，而组氨酸生物合成基因在 0846 突变株中被诱导。
采用qPCR技术检测组氨酸生物合成基因hisD和hisG以及组氨酸转运蛋白基因0846在不同S中的表达。在 TSB pH 7.3 或 TSB 4.5 培养基中生长后的金黄色葡萄球菌菌株。（A-D）为了确定组氨酸生物合成或转运基因在酸胁迫期间是否被激活，测定了 （A） LAC* （WT）、（B） LAC* 鳕鱼：：Tn、（C） LAC* 0846：：Tn 和 （D） 抑制菌株 LAC* 7：：Tn / 鳕鱼的 hisD、hisG 和 3 在 TSB pH4.5 与 TSB 0846.0846 培养基中的表达水平（如适用） E163号*.（东至下）为了确定WT和突变菌株之间组氨酸生物合成或转运基因转录水平的差异，比较了WT和指定突变菌株在（E）TSB pH0846.7培养基和（F）TSB pH 3.4培养基中生长后的hisD、hisG和5水平。采用ΔΔCt法，以gyrB为检测参考基因，计算hisD、hisG和SAUSA300_0846的相对表达量。表达水平倍数变化的平均值（2-ΔΔCt），并绘制了三个重复的标准差。为了进行统计分析，进行了学生的 t 检验，以在面板 A-D 中比较 pH 值为 7.3 和 pH 值为 4.5 时指示基因的转录水平。星号 （*） 表示 p≤ 0.05，ns = 不显著。对于图E和F的统计分析，对WT和codY：：Tn之间的0846转录水平进行了学生t检验。星号 （*） 表示 p≤0.05，ns = 不显著。采用Bonferroni多重比较校正对学生t检验，比较WT与0株突变株的转录水平。在本例中，星号 （*） 表示 p≤ 0167.<>。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.g008
接下来，我们比较了WT株和突变株之间组氨酸生物合成基因和转运蛋白基因的表达。这种比较表明，在TSB pH 7.3培养基中生长期间，与WT菌株相比，在所有突变菌株中都诱导了组氨酸生物合成基因hisD和hisG的表达。在鳕鱼Y：：Tn菌株中，与WT相比，转录水平增加了约8倍，而在0846：：Tn菌株中，这种增加约为20倍（图8E）。对于抑制器应变，这种增加介于两者之间。在酸胁迫生长条件下，与WT相比，所有突变株都观察到组氨酸生物合成基因的进一步诱导，其中codY：：Tn突变体>增加20倍，0846：：Tn突变体和0846：：Tn/codYE163号*与WT菌株相比，抑制菌株显示出显着的增加，增加了200多倍。另一方面，在酸胁迫下，鳕鱼Y：：Tn突变体中0846组氨酸转运蛋白基因的表达量仅可在WT和鳕鱼Y：：Tn菌株之间进行比较，因为这是仅有的两个具有完整0846基因的菌株，与WT相比，2组氨酸转运蛋白基因的表达量增加了不到0846倍。 综上所述，这些数据突出表明，组氨酸生物合成基因在codY：：Tn突变体中被诱导，但在无法吸收组氨酸的突变体中上调得更多。观察到组氨酸生物合成基因在0846：：Tn突变体和<>：：Tn/codY中增加到相似水平E163号*抑制因子反对一种模型，即组氨酸生物合成的增加会导致抑制因子菌株的抗酸应激性增加，并认为激活其他氨基酸或转运系统的合成，如先前报道的鳕鱼Y突变体[46,47,48]，有助于需要在酸胁迫条件下合成组氨酸的菌株在这些条件下生长。
组氨酸摄取而不是细胞组氨酸水平对 S 的生长很重要。酸胁迫条件下的金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌能够通过组氨酸利用（Hut）途径将组氨酸转化为谷氨酸等其他化合物，其中氨作为副产物产生[49,50]。氨已被证明对细菌的酸应激反应很重要。Hut降解途径仅在细菌吸收组氨酸时有效，而在需要合成该氨基酸时不活跃[49,50]。确定通过 Hut 途径降解组氨酸是否对 S 的生长很重要。金黄色葡萄球菌在酸胁迫条件下，我们评估了金黄色葡萄球菌的能力。在 hutH 和 hutU 中插入转座子的金黄色葡萄球菌突变体，编码催化该过程前两个步骤的酶，在低 pH 条件下生长。所有菌株在TSA pH 7.3平板上生长良好，与0846：：Tn突变体（作为对照）相比，与WT菌株相比，hutH：：Tn和hutU：：Tn突变体在TSA pH 4.5平板上没有表现出生长缺陷（图9A）。这些数据表明，通过 Hut 途径降解组氨酸不太可能成为在低 pH 生长条件下组氨酸摄取很重要的原因。组氨酸的 pKa 值约为 6.0，因此被提议在生理条件下充当缓冲剂。因此，我们假设组氨酸本身可以作为缓冲剂，并且与 WT 菌株相比，0846 突变体中的细胞组氨酸水平可能会降低。为了通过实验测试这一点，我们确定了 WT、0846：：Tn 突变体和在 TSB pH 4.5 培养基中生长后的互补菌株中的细胞组氨酸水平。该分析表明，与排除该模型的WT和互补菌株相比，0846：：Tn突变株中的细胞组氨酸水平更高（图9B）。综上所述，从这些数据中，我们得出结论，对 S 的生长很重要的不是细胞组氨酸水平本身，而是组氨酸的获取方式，即通过摄取或生物合成。酸胁迫条件下的金黄色葡萄球菌。
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图 9. 评估组氨酸利用途径、细胞组氨酸水平和胞质 pH 值对 S 存活的重要性。酸胁迫下的金黄色葡萄球菌。
（A） 细菌在 TSA pH 7.3 和 4.5 平板上的生长。连续稀释JE2（WT）、JE2 0846：：Tn突变体和两个组氨酸利用途径突变体JE2 hutH：：Tn和JE2 hutU：：Tn的过夜培养物，并在TSA pH 7.3（左图）或TSA pH 4.5板（右图）上点样等分试样。在 24°C 下孵育 37 小时后拍摄图像。 将实验重复三次，并显示具有代表性的图像。（B） 细胞组氨酸水平。在 TSB pH 0846.0846 培养基中生长至 LAC* （WT）、LAC* 4：：Tn 和互补菌株 LAC* 5：：Tn 复合物，按照方法部分所述制备提取物，并通过 LC-MS 测定细胞组氨酸水平。该实验采用5个生物学重复进行，并绘制了样品蛋白质含量归一化的组氨酸特异性信号的平均值和标准偏差。对于统计分析，先进行单因素方差分析检验，然后进行土耳其的多重比较检验。星号 （*） 表示 p≤0.05，ns = 不显著。（C-D）细胞内pH测定。金黄色葡萄球菌菌株 （C） LAC* （WT） 和 LAC* 0846：：Tn 和 （D） LAC* 0846：：Tn 和抑制菌株 LAC* 0846：：Tn / codYE163号*在 TSB pH 7.3 或 TSB pH 4.5 中生长至对数中期，并使用 pHrodo Red 染料测定细胞内 pH 值，如材料和方法部分所述。绘制了三个独立实验的平均值和标准差。（E） LAC* （WT）、LAC* 0846：：Tn 和抑制菌株 LAC* 0846：：Tn / codY 的胞质 pH 值 （ΔpH） 变化E163号*绘制了 TSB pH 4.5 培养基与 pH 7.3 培养基的生长情况，这些培养基来自图 C 和 D 中所示的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.g009
与 WT S 相比，0846 突变体和抑制菌株改变了胞质 pH 值。金黄色葡萄球菌菌株
金黄色葡萄球菌需要将其胞质pH值保持在接近中性，即使外部培养基的pH值为酸性或碱性。在以前的工作中，已经报道了在TSB pH 7培养基中生长期间，WT S的胞质pH值。金黄色葡萄球菌约为7.5，在pH 6.5培养基中生长时仅降至5.0左右[38]。虽然我们在上面已经表明组氨酸本身不太可能充当胞质缓冲液，因为在酸胁迫条件下，与WT菌株相比，0846：：Tn突变菌株中的组氨酸水平更高，但需要合成组氨酸而不是吸收组氨酸的菌株在维持其胞质pH值方面存在缺陷仍然是合理的。因此，我们通过使用 pH 敏感染料 pHrodo 测量 WT 和 0846：：Tn 突变体的细胞内 pH 值，评估了 WT 与 0846：：Tn 突变株在酸胁迫条件下维持细胞质 pH 值的能力（图 9）。我们发现，当生长培养基的细胞外pH值从0.4降低到7.2时，WT菌株的细胞内pH值从6.8降低到7.3，降低了约4.5个单位（图9C和9E）。0846：：Tn突变体在中性pH培养基中生长过程中的细胞内pH值已经比WT菌株略强，其值在7.0左右，当突变株在低pH培养基中生长时，细胞内pH值的差异更加明显，细胞内pH值降至6.4左右， 因此，pH值下降了约0.6个单位（图9C和9E）。这些发现表明，0846：：Tn菌株无法像WT菌株那样调节其细胞内pH值，尤其是在低pH条件下。有趣的是，当我们比较 0846：：Tn 突变体和抑制菌株 0846：：Tn/codY 之间的细胞内 pH 值时E163号*菌株我们发现抑制菌株在标准TSB pH 7.3培养基中生长期间意外地具有较低的细胞内pH值。然而，与0846：：Tn突变体相比，在酸胁迫条件下，抑制菌株的细胞内pH值没有进一步下降（图9D）。事实上，我们实际上观察到，与中性pH条件下的生长相比，在酸胁迫条件下生长期间，抑制菌株的细胞内pH值增加了约0.5个pH单位（图9E）。这些数据表明，与WT菌株相比，0846突变菌株在酸胁迫条件下维持其胞质pH值的能力降低，并且抑制菌株似乎已经适应了在中性pH值下细胞溶质pH值降低的生长，并且在酸胁迫期间没有观察到进一步的降低。
讨论
在这项研究中，我们采用Tn-Seq方法来鉴定对S生长至关重要或有害的基因。酸性pH值下的金黄色葡萄球菌。我们使用了两个独立构建的大型转座子文库进行实验，并使用了两种胁迫条件，pH 4.5 和 pH 5.5。正如预期的那样，与pH 4.5相比，在pH 5.5下，更多的基因被强调为对生长至关重要，根据我们的分析标准，分别有31个和5个基因。因此，我们主要将工作重点放在pH 4.5基因和通路上。文库的制作、生长或收获方式的差异导致每个基因集的大约 50% 对于一个文库是唯一的。但是，通过结合来自两个文库的数据并仅关注重叠，可以确认以这种方式鉴定的大多数基因，因为在低pH值下，单个基因失活的突变体的生长或存活率降低。
在我们的 Tn-Seq 实验中，一个以前未表征的基因被确定为在酸胁迫条件下生长所必需的基因是 0846。选择该基因进行进一步研究是因为在比较应激条件下的转座子插入次数与中性 pH 值下的生长时，该基因的比率较低。该基因也是仅有的五个基因之一，被确定为在 pH 5.5 下生长所必需的。值得注意的是，在之前的几项研究中，0846也被确定为毒力因子[36,37,38]，但该蛋白的细胞功能尚不清楚。0846 被注释为 CPA 转运蛋白和组氨酸渗透酶。在先前发表在预印本服务器上的一项研究中，有报道称，0846（本研究中名为NhaC3）在碱性pH值下具有K：H抗端性，并且在pH 9.0时其表达上调[40]。然而，这里进行的氨基酸摄取测定表明，0846 是 S 中的主要组氨酸转运蛋白。金黄色葡萄球菌。据我们所知，这是 S 中组氨酸转运蛋白的第一个体内证据。金黄色葡萄球菌。通过种植 S。在中性pH下，不含或含有130μM组氨酸的CDM中的金黄色葡萄球菌，其在人血液中存在的组氨酸水平范围内[51]，我们发现WT S。与含有组氨酸的培养基相比，金黄色葡萄球菌菌株在没有组氨酸的情况下生长时具有更长的滞后期（图4）。这些数据与S一致。金黄色葡萄球菌从培养基中吸收组氨酸进行生长。另一方面，无论是否存在组氨酸，0846：：Tn突变株都具有较长的滞后期;然而，在存在外源性组氨酸的情况下，生长会稍早恢复（图4）。我们假设 S.金黄色葡萄球菌可能具有第二种组氨酸转运蛋白。对 S 的分析。金黄色葡萄球菌基因组揭示了编码潜在第二组氨酸转运蛋白的基因SAUSA300_0319[52]。然而，放射性标记的组氨酸摄取测定，以及 0846：：Tn 菌株对外源组氨酸的唯一轻微敏感性，表明 0846 是 S 中的主要组氨酸转运蛋白。金黄色葡萄球菌。++
通过测定组氨酸生物合成基因和组氨酸转运蛋白基因的表达水平，发现在酸胁迫条件下，转运蛋白的表达在WT菌株中被诱导，而合成基因的表达在0846突变株中被诱导。这进一步凸显了细菌在酸胁迫期间吸收组氨酸或合成组氨酸的必要性（图8）。进一步证实了组氨酸对 S 存活的重要性。酸胁迫下的金黄色葡萄球菌是我们的发现，在没有组氨酸的情况下，WT 菌株不能在 pH 4.3 的 CDM 中生长，而当存在组氨酸时，它可以生长。缺乏活性组氨酸转运蛋白的0846：：Tn菌株不能在CDM pH 4.3下生长，无论培养基中是否存在组氨酸。我们还表明，即使在没有组氨酸转运的情况下，0846突变染色剂仍然能够在酸胁迫下提高细胞组氨酸水平（图9），可能是通过增加生物合成基因的表达。这突出了获得组氨酸的实际途径，即摄取与生物合成，对 S 的生长很重要。酸胁迫条件下的金黄色葡萄球菌。
只有当环境中组氨酸丰富且可被吸收时，细胞通路才会开启，即组氨酸利用（Hut）通路[50]。因此，我们最初假设组氨酸通过 Hut 途径降解，其中组氨酸降解为谷氨酸或谷氨酰胺并导致产生两个氨分子，是组氨酸转运蛋白重要性的原因。氨已被证明对 S 的酸应激反应很重要。金黄色葡萄球菌，通过脲酶或ADI系统产生[21,22]。然而，没有一个小屋基因，存在于 S.金黄色葡萄球菌，在Tn-Seq测定中被确定为必需的。我们还评估了 S。在 hutH 和 hutU 中插入转座子的金黄色葡萄球菌突变株，编码催化该过程前两个步骤的酶，因为它们能够在低 pH 条件下生长。两种突变体在TSA pH 4.5平板上均未显示出生长缺陷（图9），这表明通过Hut途径降解组氨酸并不是组氨酸在低pH生长条件下重要的原因。组氨酸的另一个降解过程与细菌在酸胁迫条件下更好地生长的能力有关，是通过组氨酸脱羧酶系统。在该途径中，组氨酸被脱羧为组胺，在此过程中消耗质子。虽然这些系统已被证明对乳酸菌的酸应激反应很重要，特别是乳酸杆菌属。[53]，对S的基因组分析。金黄色葡萄球菌未发现任何已知的细菌组氨酸脱羧酶。另一种假设是为什么组氨酸摄取而不是生物合成对 S 的生长很重要。在酸胁迫条件下，金黄色葡萄球菌是合成组氨酸对S有害的。低pH值下的金黄色葡萄球菌。这可能是因为合成组氨酸的过程会消耗其他氨基酸或代谢物，这些氨基酸或代谢物对酸胁迫条件下的生长很重要。这样的模型将与我们的抑制器应变分析一致。耐酸性增加的0846：：Tn突变抑制菌株均具有codY或rel突变，可能导致严格反应的激活。当严格响应在 S 中被激活时。金黄色葡萄球菌：大量基因的表达增加，但主要是氨基酸生物合成和摄取所需的基因[46,47,48]。
作为对Tn-Seq方法的验证，我们确定了以前与S酸性应激相关的基因和途径。金黄色葡萄球菌。这些包括维持电池表面电荷所需的 vraG 和 dltB。研究显示，dltABCD的表达在酸休克时上调[17]，最近的研究表明，GraXRS-VraFG五组分系统可以直接检测低pH值并对其作出反应[32,33,34]。我们的研究结果证实了改变细胞表面电荷以抵消酸胁迫的重要性。然而，由于在我们的研究中鉴定的大多数必需基因都编码了在细胞壁组装和维持中具有已知功能的蛋白质，这表明除了细胞表面电荷外，整个细胞壁在帮助细菌在酸胁迫下生存方面的作用比以前所理解的要重要。此外，一些编码细胞功能未知的蛋白质的基因，并在这项研究中被确定为在低pH值下生长所必需的基因，可能在细胞壁组装中发挥作用。
我们还确定了几种对 S 生长很重要的新基因和途径。低pH值的金黄色葡萄球菌。其中之一是有氧呼吸，特别是QoxAB末端氧化酶。QoxAB接受来自电子传输链的电子，将氧还原为H2O.在此过程中，QoxAB将质子从细胞中运输出来。其他细菌质子泵，特别是 F0F1-ATP酶，已被证明对包括E在内的一系列细菌的酸性应激反应很重要。大肠杆菌 [54]， S.肠道[55,56]和单核细胞增生李斯特菌[57,58,59]。然而，目前尚不清楚质子泵是否直接作用于缓冲细胞内pH值，或者质子的这种运动是ATP产生用于其他酸性应激反应所必需的。然而，值得注意的是，S.金黄色葡萄球菌具有第二个末端氧化酶Cyd。Cyd氧化酶与QoxAB的不同之处在于它不充当质子泵，这可以解释为什么它在我们的Tn-Seq实验中没有被确定为必需的。这可能支持以下假设：QoxAB在低pH值下生长的重要性在于其质子泵浦能力。或者，如果 S.金黄色葡萄球菌的呼吸能力降低，生物体将更严重地依赖发酵来产生能量，并且所需的乳酸脱氢酶（LDH）酶已被证明在碱性pH值下发挥最佳作用[60]。如本文和先前的工作[38]所示，S.在酸胁迫条件下，金黄色葡萄球菌降至 7 以下，因此 LDH 酶将不起作用，因此 S。在酸胁迫条件下，金黄色葡萄球菌菌株的生长将更严重地依赖呼吸作用。事实上，在以前的工作中已经表明，S.金黄色葡萄球菌atpG突变体无法将胞质pH值提高到7以上，对呼吸抑制剂非常敏感，这可能是因为该菌株无法通过发酵产生能量[38]。
总之，我们已经确定了对 S 生长很重要的广泛途径。低pH值下的金黄色葡萄球菌。其中一些途径已经与葡萄球菌酸性应激反应有关，例如细胞壁和细胞表面电荷，这验证了我们的Tn-Seq方法。此外，我们还确定了几种新的途径，包括有氧呼吸和通过 0846 转运的组氨酸。
材料与方法
细菌菌株和生长条件
本研究中使用的细菌菌株列在 S5 表中。大肠杆菌菌株在溶原性肉汤 （LB） 或 LB 琼脂平板上生长，金黄色葡萄球菌菌株在胰蛋白酶大豆琼脂 （TSA） 平板或胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB） 中生长。在指定的情况下，在高压灭菌之前用HCl将培养基或板调节至指示的pH值。如前所述，为了制备低pH琼脂平板，细菌琼脂浓度从标准的15%（w/v）增加到30%（w/v）[23]。金黄色葡萄球菌菌株也在化学成分明确的培养基（CDM）中生长，CDM如前所述制备[61,62]或缺乏组氨酸的CDM。如果需要，在培养基中补充抗生素，如S5表所示。
质粒和细菌菌株构建
本研究中使用的几种菌株来源于内布拉斯加转座子突变体文库（NTML）文库[35]。通过PCR和测序确认了本研究中使用的所有NTML菌株的转座子插入位点。使用噬菌体 Φ0846 通过噬菌体转导将原始 NTML 菌株 NE967 （JE2 0846：：Tn） 的 85：：Tn 转座子区域移动到新鲜 S 中。葡萄球菌JE2 或 LAC* 背景菌株，产生转导 （ANG2） 和 LAC* 0846：：Tn （ANG6197） 的菌株。为了互补分析，构建质粒pCL0846-6049。使用引物 55 （AAA GAATTC GAATTACCGATTACTGCAACCGAACGTGC） 和 0846 AAAGGATCCGTCTCTAATAAATGAGTCATATTTTCACC）通过 PCR 扩增SAUSA300_0846基因，包括其天然启动子区域。所得PCR产物和质粒pCL3443用EcoRI和BamHI酶切，连接并初步在E中回收。大肠杆菌株 CLG3444 产生菌株 CLG55 pCL190-190 （ANG55）。质粒 pCL0846-6028 随后从 E 中分离出来。大肠杆菌和电穿孔进入 S。金黄色葡萄球菌菌株 RN55，整合到 GEH 基因位点，生成菌株 RN0846 pCL4220-4220 （ANG55）。最后，用噬菌体 Φ0846 将该区域转导到 LAC* 6069：：Tn （ANG85） 中，从而构建互补菌株 LAC* 0846：：Tn pCL6197-0846 （ANG55）。 菌株 LAC* pCL0846 （ANG6076） 用作某些实验的对照菌株，也使用来自 S 的噬菌体 Φ55 移动空质粒 pCL3795。金黄色葡萄球菌菌株 RN55 pCL85 （ANG4220） 进入菌株 LAC* 55：：Tn （ANG266），产生菌株 LAC* 0846：：Tn pCL6197 （ANG0846）。 通过噬菌体 Φ55 转导将菌株 JE6078 codY：：Tn 的 codY：：Tn 区域移动到 LAC* 菌株背景中，构建了菌株 LAC* codY：：Tn （ANG6293）。
Tn-Seq实验
本研究使用了两个独立的转座子突变体文库。这两个库都是在 S 中建造的。葡萄球菌USA300 TCH1516来源的 MRSA 菌株 TM283。第一个文库（文库 A）是一个包含约 600,000 个菌落的库，使用六种不同转座子（包含 5 种不同的外向启动子和 24 种启动子无钝转座子）的混合物生成。其结构已在前面描述过[63,1]。第二个文库（文库 B）包含 > 25 万个菌落，仅使用单个无启动子转座子（钝转座子）生成。该库的构建在前面也有描述[7]。为了鉴定酸胁迫期间必需的基因，将转座子突变文库在TSB培养基（中性pH值为3.5）或用HCl调节至pH 5.4或pH 5.20的TSB培养基中繁殖。将文库的小瓶在冰上解冻，并用于将补充有Erm 5或10μg/ ml的<>ml TSB培养基接种到OD中600的 0.1。将预培养物在 37°C 下振荡 1 小时。随后使用该预培养物将 25 ml（文库 A）或 100 ml 的 Erm 5 μg/ml（文库 B）新鲜 TSB 培养基 （pH 7.3）、TSB pH 5.5 或 TSB 4.5 培养基接种到 OD 中600的 0.00125。这些培养物在 37°C 下生长，以 180 rpm 振荡直至达到 OD600在大约 1.4 个（10 代）中，通过离心收获 12 ml 培养物中的细菌，用 TSB 洗涤一次，并将细胞沉淀在 -20°C 下冷冻，随后分离基因组 DNA。测序分析的样品制备如前所述[63]。简而言之，用 NotI 消化基因组 DNA，用 PEG300 选择性沉淀 8000 bp > DNA 片段，然后连接生物素化接头。之后，用MmeI和连接条形码的Illumina接头消化DNA。使用Illumina HiSeq平台在美国塔夫茨大学TUCF基因组学核心设施进行100个碱基单端读长测序。使用文库A进行TN-seq实验的Illumina序列读数被存放在美国国家生物技术信息中心（NCBI）的短读长档案（SRA）中，BioProject ID PRJNA998095和运行编号SRR25408001。使用文库B进行TN-seq实验的Illumina序列读长作为先前研究的一部分存放在BioProject ID PRJNA544248下的短读长档案（SRA）中，运行编号为SRX5883253[25]。
Tn-Seq数据分析
如前所述[24,63]使用Tufts Galaxy Server对测序数据进行分析和映射。简而言之，对读段进行修整，用Illumina条形码分割，然后用转座子条形码进一步分割。然后将读段映射到 USA300-TCH1516 基因组并生成 Hopcount 表。使用 Mann-Whitney 检验进行统计分析，以发现每个基因的读取数存在显着差异，并使用 Benjamini-Hochberg 检验来校正多假设检验的 p 值。圆形图和火山图是使用 R 脚本和马戏团生成的。使用Excel中的过滤功能对Tn-Seq数据进行进一步分析。以下参数用于过滤：Benjamini-Hochberg ≤为 0.1，仅考虑具有 ≥ 10 个转座子插入的基因。当在低pH胁迫条件下生长后基因中的转座子插入数量与标准TSB（中性pH≤）生长后的转座子插入数量之比为0.5时，基因被认为是必需的，或者当该比率为≥2时，基因被认为是有害基因。虽然USA300-TCH1516基因组用于Tn-seq数据分析，但USA300 FPR3757位点标签编号显示在表1中，以与NTML菌株注释相匹配。
琼脂平板点样测定
指示的 S。将金黄色葡萄球菌菌株在 3°C 的 5–37 ml TSB 培养基中振荡生长过夜。第二天，细菌来自相当于1ml培养物的OD600其中5个通过在3,17xg下离心000分钟沉淀，并用1ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次。接下来，将 10 倍稀释至 10 倍稀释?7在PBS中制备。在高压灭菌之前，在用HCl酸化的标准TSA板（pH 7.3）或TSA pH 4.5板上点样<>μl未稀释的培养物和每种稀释液。除非另有说明，否则实验分三次独立运行进行。
酸胁迫生存曲线
将指定的菌株在 3°C 的 5–37 ml TSB 培养基中振荡生长过夜。来自1ml培养物的细菌，OD600通过在8,17xg离心000分钟收集3个，并用3ml TSB洗涤1次。随后将细菌悬浮液转移到pH值为20.2的5ml TSB中以产生近似的OD600的 0.4。将培养物在 37°C 下孵育，以 180 RPM 振荡至指定的时间点。通过除去 200 μl 细菌培养物并在 PBS 中制备 10 倍稀释液来测定菌落形成单位 （CFU）。将 100 μl 选定的稀释液接种在 TSA 平板上，并将平板在 37°C 下孵育 16-18 小时，然后对菌落进行计数。对于T = 0 h时间点，在转移到低pH培养基后立即取培养等分试样。对于每个菌株，T = 0 h 时的 CFU 计数设置为 100%，并且在计算的后续时间点的存活率为 %。绘制了三个独立实验中存活率的平均值和标准差。所有图形的原始数据都在 S1 数据文件中提供。
酶标仪中的细菌生长曲线
生长曲线在各种培养基中进行，如结果部分和图例中定义。在高压灭菌或过滤器灭菌之前，通过加入HCl将TSB或CDM酸化至指示的pH值。对于某些实验，使用不含组氨酸或指示组氨酸浓度范围为 0.2 μM 至 130 μM 的 CDM。对于生长测定，将细菌在 3°C 的 5–37 ml TSB 培养基中振荡生长过夜。将来自1ml等分试样的细菌以3,17 xg离心000分钟沉淀，并用1ml PBS缓冲液洗涤一次。洗涤的细菌悬浮液用于将1ml新鲜培养基接种至最终OD600的 0.05。将 200 μl 稀释培养物的三次技术重复转移到 96 孔板的孔中，并将板在 37°C 下以 500 rpm 振荡，每 300 分钟在 SPECTROstar 中孵育 10 秒纳米读板机。外径600每 30 分钟测量一次，持续 24 小时。最终外径600通过对三个技术重复取平均值并减去OD来计算值600仅含有培养基的空白孔的读数。计算并绘制了3个独立实验的平均值和标准差。
组氨酸摄取测定
如前所述，进行了摄取测定，测量放射性标记氨基酸的掺入情况[62]。简而言之，将培养物在 37°C 的 CDM 中振荡生长过夜。第二天，将培养物稀释至OD600在 0 ml 新鲜 CDM 中加入 05.50 个，并在 37°C 下以 180 rpm 振荡至对数中期阶段。通过离心沉淀来自2ml培养物的细菌细胞，并用2ml 缺乏组氨酸的CDM洗涤一次，随后用缺乏组氨酸的CDM调整至OD600值为 1。An OD600此时再次读取读数，以确定该培养悬浮液的确切密度，以便进行归一化。接下来，向450μl洗涤的细菌培养物中，2μl的3H 放射性标记的 L-组氨酸（组氨酸 L-[环-2,5-3H;加入ARC UK Limited，ART 0234），并通过旋转混合悬浮液。紧接着（T = 0分钟时间点），取出100μl培养物并使用真空歧管过滤到硝酸纤维素过滤器上，随后用32ml PBS洗涤。将培养物的其余部分在室温（RT）下孵育，并在T = 100,3和6分钟时再取9μl样品并如上所述进行处理。随后取出洗涤的滤光片并放入9ml滤光片计数闪烁液（珀金埃尔默）中。使用 Wallac 1409 DSA 液体闪烁计数器以每分钟计数 （CPM） 为单位测量每个样品的放射性。然后将 CPM 归一化为最终的 OD600用于这些测定的培养物的值。进行了三个独立实验，并计算了平均值和标准差并绘制了图表。
产生耐酸性增强的 LAC* 0846：：Tn 抑制菌株
菌株 LAC* 0846：：Tn 的多个独立培养物在 37°C 的 TSB 培养基中生长过夜。 第二天，50μl10?2至 10?4将稀释液接种到TPA pH 4.4或4.5板上。在 48°C 下孵育 37 小时后，在低 pH 值 TSA 平板上获得的菌落在 TSA pH 4.4 或 pH 4.5 下重新划线，并将平板在 48°C 下再次孵育 37 小时。 接下来，挑选单个菌落，在补充有 10 μg/ml Erm 的 TSB 中生长过夜，并将这些抑制菌株培养物的等分试样冷冻储存在 -80°C 下。 随后使用上述琼脂平板斑点测定法证实了 LAC* 0846：：Tn 抑制菌株的耐酸性增加。
全基因组测序、样品制备和分析
使用先前描述的方法[64\u65]分离基因组DNA，并使用Illumina Nextera DNA试剂盒制备用于Illumina测序的样品。在哈默史密斯医院的MRC伦敦医学科学研究所，使用Miseq机器和Illumina MiSeq试剂盒v2（300个循环）对样本进行测序，以产生150 bp的双端读长。对于基因组序列分析，使用先前描述的使用CLC工作台基因组学软件（Qiagen）的方案[66]，并将reads映射到自定义S。葡萄球菌USA300 LAC*参考基因组在先前的研究中生成，其Illumina读数已存入欧洲核苷酸档案库（ENA），项目编号为PRJEB14759[23]。单核苷酸多态性 （SNP） 基于至少 70% 的频率进行测定，并通过将它们与亲本 LAC*0846：：Tn 菌株基因组序列中也存在的 SNP 和低覆盖区域进行比较来去除菌株背景 SNP 和低覆盖区域。抑制菌株的Illumina序列读数被保存到欧洲核苷酸档案库（ENA）中，项目编号为PRJEB62451。
细胞内pH值测量
使用pHrodo Red AM细胞内pH指示剂染料（ThermoFisher，Cat.不。P35372），如前所述，但进行了一些修改[38]。LAC* WT 和 LAC* 0846：：Tn 或 LAC* 0846：：Tn 以及抑制菌株 LAC* 0846：：Tn 鳕鱼的过夜培养物E163号*在 TSB pH 7.3 或 TSB pH 5.5 培养基中，在 37°C 下振荡生长。第二天，将培养物稀释至起始 OD600将 0.05 分别放入 20 ml TSB pH 7.3 或 TSB pH 4.5 中，并生长至对数中期。来自相当于 5 ml 培养物的细菌，OD600通过在 0 xg 下离心 5 分钟收集 20.660 个，然后用 2 ml 5 mM HEPES 缓冲液 pH 50.7 洗涤 4 次。接下来，按照制造商的说明，将20μlPowerLoad浓缩物加入到每种培养物的2ml中，并在黑暗中室温下用5μM终浓度的pHrodo红色染料染色30分钟。孵育后，通过在350,3xg下离心17分钟收集000μl染色的细菌，并悬浮在350μlml新鲜的50mM HEPES缓冲液pH 7.4中。将两个150μl的技术重复移动到黑壁96孔板上，然后在TECAN酶标仪上测量荧光，激发/发射波长为560 / 590 nm，以获得最佳增益。每 5 分钟测量一次，持续 25 分钟，每次测量后以 432 rpm 振荡 120 秒。通过将荧光测量的两个技术重复的平均值与针对每种菌株和pH生长条件独立生成的标准曲线进行比较，从10分钟timpe点确定细胞内pH值，以校正不同的染料摄取。为了生成标准曲线，将细菌培养物预生长至对数中期，并用pHrodo Red染料染色，如上所述，用于实验样品。染色后，除去每个菌株和条件的350 x 3μl培养物，通过在17,000 xg离心4分钟收集细菌，并重悬于设定为pH 5.5，pH 5.6，pH 5.7或pH 5.10的校准缓冲液中，并根据制造商的方案含有10μM尼日利亚菌素和35379μM缬氨霉素（细胞内pH校准缓冲液试剂盒， 赛默飞世尔，目录号编号P10）。将每个校准样品两个技术重复的平均值绘制在图形上，并使用半对数线性回归来计算最佳拟合线。这用于将实验样品的荧光读数转换为细胞内pH值。进行了三个独立的实验，并绘制了T = <> min时间点的细胞内pH值的平均值和标准偏差，其中pH值落在标准曲线范围内。
逆转录qPCR
金黄色葡萄球菌菌株 LAC*、LAC* 0846：：Tn、LAC* 鳕鱼Y：：Tn 和抑制菌株 LAC* 0846：：Tn 鳕鱼E163号*在 5 ml TSB pH 7.3 或 TSB pH 5.5 中，在 37°C 下振荡生长过夜。第二天，将 140 μl 培养物反稀释到 40 ml TSB pH 7.3（使用在 pH 7.3 下生长过夜的培养物）或 TSB pH 4.5（使用在 pH 5.5 下生长过夜的培养物）中，并将培养物在 37°C 下振荡孵育直至达到 OD600在 0.5–1 之间。接下来，将20ml培养等分试样加入46.6ml GTC缓冲液（5M硫氰酸胍，0.5%N-月桂基肌氨酸，0.1M β-巯基乙醇，0.5%吐温-80,10mM Tris pH 7.5）中，并如前所述提取RNA[67]。简而言之，通过在10 xg下离心8300分钟，将GTC缓冲液中的细菌沉淀。用 1 ml GTC 缓冲液洗涤细菌，然后使用 MPBio 快速制备机裂解，并使用 MPBio RNA 试剂盒提取 RNA。将RNA悬浮于100μlRNA救援溶液中，在60°C下孵育10分钟，并使用Qiagen RNeasy离心柱进一步纯化。随后，使用 Ambion TURBO 不含 DNA 的 DNase 去除 DNA。使用 RT SuperMix （Invitrogen） 和每次反应 20 ng RNA 以 1000 μl 体积进行逆转录酶反应。使用引物和探针通过qPCR测量hisD、hisG、SAUSA300_0846和管家基因gyrB的转录水平，如S6表所示。qPCR反应含有5μlTaqMan快速混合物（Thermo Fisher），3.5μlH2O，0.5μl引物/探针混合物和1μl50ng cDNA。反应在一步法实时荧光定量PCR仪（Thermo Fisher）中进行，具体如下：95°C反应20秒，然后循环40次，95°C反应3秒，60°C循环30秒。采用ΔΔCt法，以gyrB为检测参考基因，计算hisD、hisG和SAUSA300_0846基因的相对表达量，并测定表达水平的倍数变化（2-ΔΔCt）被绘制。从三种独立生长的培养物中提取RNA，并绘制三个重复值的平均值和标准偏差。
代谢物提取和质谱分析
金黄色葡萄球菌菌株 LAC* pCL55、LAC* 0846：：Tn pCL55 和 LAC* 0846：：Tn pCL55-0846 在 5 ml TSB pH 5.5 和 37°C 下摇匀生长过夜。 第二天，使用140μl培养物接种40ml TSB pH 4.5培养基，并将培养物在37°C下振荡孵育直至达到OD600的 0.75。此时，细菌相当于 25 OD600通过以5×g离心6200分钟收集单位，用1ml 150mM醋酸铵缓冲液洗涤1次，并悬浮在最终体积为25.150ml 1mM醋酸铵缓冲液中。接下来，来自20ml该悬浮液的细菌（相当于<>OD600单位）沉淀用于代谢物提取，并使用 Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒 （Thermo Fisher） 沉淀 200 μl 用于蛋白质含量测量。对于代谢物提取，将细菌沉淀重悬于1ml冰冷的4：1甲醇：H中2O 提取缓冲液在 20°C 下涡旋并振荡孵育 4 分钟。 将样品在 5°C 下以 15000 x g 离心 4 分钟，并将上清液转移到新的微量离心管中。用300μl4：1甲醇：H重新提取沉淀两次2O溶液并如上所述离心，所有上清液合并并在室温下氮气流干燥。通过液相色谱质谱法（LC-MS）测定细胞组氨酸水平，如Lewis等人所报道的那样。2022 [68] 和组氨酸信号（Lewis 等人 [014 [2022] 中的 HPOS-68 特征）的平均值和标准偏差，该信号归一化为来自五个生物学重复的每 OD 单位的蛋白质含量。
支持信息
与pH 4.5相比，在pH 7.3下生长后文库A的Tn-Seq数据。
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一个 B C D E F
1 S1 表
2
3 标题： pH胁迫下的Tn-Seq实验原始数据
4 描述： 在pH 4.5和5.5下对金黄色葡萄球菌进行的Tn-Seq实验的原始数据
5
6 表S1 文库 A （ANG1） pH 4.5 文库 A 在 TSB pH 7.3 v TSB pH 4.5 中生长 10 代
7 表S2 文库 B （FCK1） pH 4.5 文库 B 在 TSB pH 7.3 v TSB pH 4.5 中生长 10 代
8 表S3 文库 A （ANG1） pH 5.5 文库 A 在 TSB pH 7.3 v TSB pH 5.5 中生长 10 代
9 表S4 文库 B （FCK1） pH 5.5 文库 A 在 TSB pH 7.3 v TSB pH 5.5 中生长 10 代
10
11
12
13 名字 测序条形码 条码序列 图书馆 条件
14
15 世代数 中等
16 ANG1型 BC1型 AGTCATGC公司 完整（Santiago 等人） 10 TSB pH 值 7.3
17 ANG1型 BC2型 ACGTACTG公司 完整（Santiago 等人） 10 TSB pH 值 5.5
18 ANG1型 BC3型 TGACTGCA公司 完整（Santiago 等人） 10 TSB pH 值 4.5
19
20 FCK1型 BC1型 AGTCATGC公司 布朗特（Schuster 等人） 10 TSB pH 值 7.3
21 FCK1型 BC2型 ACGTACTG公司 布朗特（Schuster 等人） 10 TSB pH 值 5.5
22 FCK1型 BC3型 TGACTGCA公司 布朗特（Schuster 等人） 10 TSB pH 值 4.5
描述库 A （ANG） pH 4.5
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S1 表。 与pH 4.5相比，在pH 7.3下生长后文库A的Tn-Seq数据。
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S2 表。 与pH 4.5相比，在pH 7.3下生长后文库B的Tn-Seq数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.s002
（XLSX）
S3 表。 与pH 5.5相比，在pH 7.3下生长后文库A的Tn-Seq数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.s003
（XLSX）
S4 表。 与pH 5.5相比，在pH 7.3下生长后文库B的Tn-Seq数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.s004
（XLSX）
S5 表。 本研究中使用的细菌菌株。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.s005
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S6 表。 本研究中使用的qPCR引物和探针。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.s006
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S1 图。 显示沿 S 的转座子插入密度的圆图。不同pH生长条件下的金黄色葡萄球菌基因组。
Tn文库A和B的圆形图，两个外环描绘了位于S中（+）（蓝色）或（-）（绿色）链上的基因。金黄色葡萄球菌菌株。内三个环显示了在TSB pH 7.3（红色）、pH 5.5（紫色）或pH 4.5（蓝色）中生长10代后，每个基因的转座子插入直方图。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.s007
（文件）
S2 图。 S. 的生长板分析。在pH 4.5下被鉴定为生长所必需的基因中插入转座子的金黄色葡萄球菌突变株。
（A-H）TSA pH 7.3 板上的细菌生长。将指示的 WT 和突变菌株的过夜培养物连续稀释并在 TSA pH 7.3 平板上点样。在 24°C 下孵育 37 小时后拍摄图像。 每张图像都代表三个实验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.s008
（文件）
S3 图。 S. 的生长板分析。在pH 4.5下被鉴定为不利于生长的基因中插入转座子的金黄色葡萄球菌突变株。
（A-D）TSA板上的细菌生长。将指定的 WT 和突变菌株的过夜培养物连续稀释并在 （A-B） TSA pH 7.3 平板或 （C-D） TSA pH 4.5 平板上点样。在 24°C 下孵育 37 小时后拍摄图像。 每张图像都代表三个实验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.s009
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S4 图。 培养基中组氨酸浓度的降低导致 S 的生长减少。酸胁迫条件下的金黄色葡萄球菌。
WT S.葡萄球菌含有空 pCL55 （WT EV） 的 LAC* 在 CDM pH 4.3 培养基中生长，组氨酸浓度从 130 μM 降至 0.2 μM，或者在不含组氨酸的情况下生长，如图图例中的不同符号所示。平均外径600绘制了三个实验的读数。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.s010
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S1 数据。 图形的原始数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011927.s011
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确认
我们感谢 Lisa Bowman、Freja CM Kirsebom 和 Sophie A Howard 对转座子突变体文库实验之一的帮助。我们感谢来自国家表型组中心的 Elena Chekmeneva、Carolina Sands 和 Lynn Maslen 对质谱实验的支持。
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