《免费医学论文发表-通用抑制基因突变通过稳定寡聚晶格来恢复 HSV-1 核出口复合物中的膜出芽缺陷》期刊简介
免费医学论文发表-通用抑制基因突变通过稳定寡聚晶格来恢复 HSV-1 核出口复合物中的膜出芽缺陷
抽象
细胞核排出是疱疹病毒复制中必不可少的过程，新生衣壳从细胞核转移到细胞质。核出口的初始步骤——在核内膜出芽——由核出口复合物 （NEC） 协调。NEC 由病毒蛋白 UL31 和 UL34 组成，当衣壳芽进入核周空间时，衣壳周围的膜会变形。NEC寡聚化成六方膜结合晶格对于出芽至关重要，因为旨在扰动晶格界面的NEC突变体会降低其出芽能力。以前，我们发现了一种NEC抑制基因突变，该突变能够将萌芽恢复到具有减弱的六边形晶格的突变体。使用已建立的体外出芽测定和 HSV-1 感染的细胞实验，我们表明抑制基因突变可以恢复多种出芽缺陷 NEC 突变体的出芽，从而充当通用抑制因子。抑制器NEC突变晶格的低温电子断层扫描显示，六方晶格让人联想到野生型NEC晶格，而不是替代晶格。使用X射线晶体学的进一步研究表明，抑制器突变促进了NEC六聚体之间新接触的形成，表面上稳定了六方晶格。这种稳定策略足够强大，可以覆盖通过不同机制破坏NEC晶格稳定性的突变的有害影响，从而产生功能性的NEC六方晶格并恢复膜出芽。
作者摘要
疱疹病毒感染大多数人群，形成周期性重新激活的终生感染。成功感染宿主需要在宿主细胞内形成新的病毒颗粒。在病毒组装的早期，衣壳从细胞核转移到细胞质中。衣壳核出口的这一过程是由病毒编码的核出口复合物 （NEC） 介导的，当衣壳寡聚化成六边形晶格时，该复合体会使衣壳周围的膜变形。破坏晶格的突变可以阻断细胞核流出并减少病毒后代的产生，使NEC成为一个有吸引力的治疗靶点。然而，病毒可以通过抑制突变来克服这种突变的抑制作用。在这里，我们表明，一种这样的抑制基因突变促进了新的晶格接触，这些接触有望加强晶格。我们假设NEC可以微调其晶格以响应外部扰动，无论是自然的，如膜曲率，还是人为的，如突变。任何针对NEC晶格形成的治疗方法都必须考虑其内在的灵活性。
数字
Fig 7Fig 8Fig 9图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 9图1图2图3
引文： Draganova EB， Wang H， Wu M， Liao S， Vu A， Gonzalez-Del Pino GL， et al. （2024） 通用抑制基因突变通过稳定寡聚晶格来恢复 HSV-1 核出口复合物中的膜出芽缺陷。PLoS 病理学 20（1）： e1011936 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936
编辑 器： Paul M. Lieberman，Wistar Institute，美国
收到： 13年2023月1日;接受： 2024年16月2024日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2024 Draganova et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 本研究期间生成或分析的所有数据都包含在手稿和支持文件中。为图 1–4 中显示的数据提供了源数据文件。冷冻断层扫描平均图已存放在EM数据库中，登录号为EMD-40223（WT NEC）、EMD-40224（NEC-DNUL34/SUPUL31）和EMD-40225（NEC-SUPUL31）。NEC-SUPUL31晶体结构的原子坐标和结构因子已存放在RCSB蛋白质数据库中，登录号为8G6D。
资金： EEH 得到了美国国立卫生研究院 （National Institutes of Health） R01GM111795和R01AI147625的赠款以及霍华德休斯医学研究所 （Howard Hughes Medical Institute） 的教师学者赠款55108533的支持。ZHZ得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的资助R01DE028583支持。RJR 得到了美国国立卫生研究院的资助R01AI150718和R21AI148831的支持。EBD 得到了美国国立卫生研究院 F32GM126760、K12GM133314 和 K99AI151891 的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者声明没有竞争利益。
介绍
病毒是重组宿主膜以在真核细胞的区室内部运输衣壳的专家。在疱疹病毒中发现了一种更不寻常的膜操纵机制，疱疹病毒是一种大型包膜病毒，可感染整个动物王国的多个物种，并在世界上大多数人口中引起终生感染[在[1]中回顾]。疱疹病毒dsDNA基因组的复制及其随后包装到衣壳中发生在细胞核内[在[2,3]]中进行了论述。然后，含有基因组的衣壳被转运到细胞质中，成熟为传染性病毒粒子。大多数核质运输通过核孔发生，但在直径~125 nm处，疱疹病毒衣壳太大，无法通过~40-nm核孔开口[4]。取而代之的是，衣壳使用一种复杂的、非经典的核运输路线，称为核出口[在[2,3,5]中讨论]。首先，它们停靠在核内膜 （INM） 并萌芽进入核周空间，产生核周包膜病毒粒子（称为初级包膜的阶段）。然后，这些中间体的包膜与外核膜（ONM）融合，然后衣壳被释放到细胞质中（称为去包膜的阶段）。
疱疹病毒科（通常称为疱疹病毒）最清楚核出口机制，它感染哺乳动物、鸟类和爬行动物。在单纯疱疹病毒 （HSV） 中，两种保守的病毒蛋白称为 UL31 和 UL34，对于疱疹病毒的核出口至关重要。UL31 是一种可溶性核磷蛋白 [6， 7]，而 UL34 是一种含有单个 C 端跨膜螺旋的 I 型膜蛋白 [6， 8]。UL31 和 UL34 共同形成异二聚体核出口复合物 （NEC），该复合体锚定在 INM 中并面向核内部。这两种蛋白对于细胞核流出都是必不可少的，如果没有这两种蛋白，衣壳就会被困在细胞核内，导致病毒滴度大大降低[6,7,9–13]。此外，UL31和UL34在未感染细胞中的过表达会导致空芽囊泡在核周空间中积聚，这意味着NEC不仅是INM出芽所必需的，而且是足够的[14\u18]。总的来说，这些发现突出了NEC在核出口中的核心作用。
最近对纯化的重组 NEC 和合成脂质囊泡的研究表明，在没有添加能量或其他蛋白质的情况下，几种 NEC 同源物可以在体外变形和出芽膜。这些病毒包括来自HSV-1的NECs[1]，这是一种典型的疱疹病毒，可感染世界上大部分人口;感染动物的密切相关的伪狂犬病病毒（pseudorabies virus， PRV）[19];以及关系更远的EB病毒（EBV）[20]，一种几乎无处不在的人类疱疹病毒。
NEC寡聚化成带芽囊泡内表面的膜结合涂层。通过低温电子显微镜/断层扫描（cryoEM/ET）在体外重组HSV-1 NEC形成的囊泡、过表达PRV NEC的未感染细胞中形成的囊泡[19]和HSV-22感染细胞中形成的核周囊泡[1]上观察到类似蜂窝的六边形外套[23]。有趣的是，来自HSV-1[24]和人巨细胞病毒（HCMV）[25]的结晶NEC同源物也形成了六方晶格，其几何形状和尺寸与膜结合NEC涂层中观察到的相似。最后，EBV NEC也在体外形成膜结合涂层，但其几何形状尚不清楚[21]。因此，内在的膜出芽能力和低聚涂层的形成似乎在NEC同系物中是保守的。
在HSV-1 NEC中，寡聚化到六方晶格中对于出芽至关重要。靶向NEC六聚体（六聚体）内或六聚体（六聚体间）晶格界面的突变在体外引起出芽缺陷[19,24]，并减少感染细胞的核流出[26,27]。在靶向HSV-35 UL37序列中电荷簇的突变筛选中发现了第一个将UL34中的D1和E34转变为丙氨酸（A）的突变突变[28]。认识到突变在基因中而不是蛋白质中，为了清楚起见，我们将把从突变基因翻译的蛋白质称为由改变的氨基酸指定的突变蛋白（在这种情况下，称为 D35A）TLR34型/E37ATLR34型突变体）。这种双重突变使病毒滴度降低~3个数量级至UL34无效突变体HSV-1的水平，并以显性阴性方式阻断衣壳从细胞核中排出[27]。因此，我们将其称为 DNTLR34型.突变不影响NEC的形成、其在INM的定位或衣壳在INM的对接，而是排除了衣壳出芽[27]。此外，纯化的重组 NEC-DNTLR34型在体外结合合成膜，但膜出芽活性极小，并且在膜上未形成六角形涂层[19]。
有趣的是，由于DNTLR34型HSV-1 UL31、R229L 的外源突变可抑制突变TLR31型，在DN的连续传代过程中出现TLR34型UL1互补细胞系上的突变HSV-34病毒[27]通过定向病毒进化[在[29,30]中进行了论述]。我们将这种突变称为 SUPTLR31型.残留物 R229TLR31型位于六聚体间界面附近，远离DNTLR34型六聚体界面突变[24]，因此尚不清楚SUP是如何发生的TLR31型突变恢复 DNTLR34型核萌芽缺陷。
在这里，我们展示了 SUPTLR31型突变可以恢复破坏重要功能界面的各种突变体的有效出芽，作为出芽缺陷的“通用”抑制因子。使用低温电子断层扫描（cryoET）和X射线晶体学，我们表明SUPTLR31型突变不会改变NEC异二聚体的结构或其寡聚化为六聚体。相反，它促进了在六聚体间界面上形成新的接触。增加的六聚体间界面将增强六边形NEC晶格，帮助其抵消突变的晶格不稳定作用。我们假设它的动态性质允许NEC晶格适应它在核出口过程中遇到的扰动，例如膜曲率或衣壳相互作用的变化，并维持其功能。
结果
SUP的TLR31型突变使膜在体外出芽恢复到各种寡聚界面突变体
HSV-1 NEC寡聚物化成六方晶格（图1A），通过六聚体内NEC异二聚体之间的相互作用稳定（六聚体界面;图1B）和六聚体之间（六聚体间界面;图1C）。NEC六聚体晶格的形成对于膜出芽至关重要，因为经过工程改造以破坏晶格界面的突变会减少体外出芽[19,24]和感染细胞的细胞核流出[26,27]。这些出芽缺陷突变是 D35ATLR34型/E37ATLR34型（DNTLR34型）、V92FTLR34型， T123QTLR34型， V247FTLR31型和 F252YTLR31型在六聚体界面（图1B）和E153RTLR31型在六聚体间界面（图1C）。SUP的TLR31型突变使出芽在体外恢复为 DNTLR34型和 V92FTLR34型突变体[24]。在这里，我们询问它是否可以恢复其他界面突变体T123Q的萌芽TLR34型和 F252YTLR31型（六聚体）（图 1B）和 E153RTLR31型（六聚体间）（图 1C）。
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图 1. SUP的TLR31型突变恢复了出芽缺陷寡聚界面NEC突变体的出芽活性。
。HSV-1 NEC 六聚体和六聚体间界面突出显示了本研究中突变的残基位置。d） GUV 出芽测定的卡通表示，显示 NEC（紫色圆圈和粉红色矩形）与红色荧光 GUV 结合并经历负曲率以形成 NEC 涂层的腔内囊泡 （ILV）。游离 NEC 继续使 GUV 出芽，直到只剩下内部含有 NEC 的完全出芽囊泡。Cascade blue 是一种膜不可渗透染料，用于监测出芽。e） SUP-R229LTLR31型在体外挽救六聚体和六聚体间出芽缺陷的NEC突变体的萌芽。通过计算加入 NEC220 或相应的 NEC 突变体后 GUV 内 ILV 的数量来确定体外出芽的百分比。从每种情况下减去背景计数，即没有 NEC 时的 ILV 数量。每个构建体在三个生物学重复中进行了测试，每个重复由三个技术重复组成。符号表示与NEC220（100%;灰色）相比，三个技术重复的平均出芽效率。使用未配对的学生 t 检验和 Welch 校正计算显着性 （P < 0.01 = **;P < 0.001 = ***;ns = 不显着）在 GraphPad Prism 9.0 中。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.g001
我们还想评估D35A的个人贡献TLR34型和 E37ATLR34型DN 出芽缺陷表型的突变TLR34型突变体。残留物 E37TLR34型位于六聚体界面，其侧链与 T89 形成氢键TLR31型相邻的NEC异二聚体。E37A的TLR34型突变消除了这种氢键，这会破坏六聚体界面。事实上，E37ATLR34型突变体在体外出芽方面存在缺陷[24]。然而，残基D35的侧链TLR34型远离六聚体界面的点（图1B）。因此，我们测试了 D35ATLR34型突变会对萌芽产生任何影响。
使用荧光标记的巨型单层囊泡 （GUV）、可溶性荧光染料 Cascade Blue 和 HSV-19 NEC 的可溶性版本 NEC24（含有全长 UL31 和 UL32 残基 1–220）的既定测定法 [31,34,1,220] 测量所有 NEC 突变体的体外出芽活性（图 1D）。我们首先证实了出芽缺陷突变体的体外表型。两个DNTLR34型和 E37ATLR34型突变将出芽减少到WT NEC10的~220%（图1E），与我们之前的研究结果一致[24]，而D35ATLR34型单独突变没有影响（图1E）。因此，E37ATLR34型突变是 DN 非萌芽表型的唯一原因TLR34型.界面突变T123QTLR34型， F252YTLR31型和 E153RTLR31型 (图1BC）如前所述，WT NEC30的出芽率降低到~40-220%（图1E）[24]。SUP的TLR31型突变不影响WT NEC220的出芽效率，但不仅恢复了DN的出芽TLR34型如前所述[24]，但对于所有其他晶格界面突变体，无论它们的位置如何（图1E）。因此，SUPTLR31型突变可以恢复各种晶格界面突变体的有效出芽。
SUP的TLR31型突变补充了含有寡聚体界面突变的 HSV-1 的生长缺陷
为了将体外出芽表型与感染的细胞表型相关联，我们使用了已建立的病毒生长互补试验[11]。该测定法测量在反式中表达的突变蛋白补充缺乏相应基因的病毒（所谓的无效病毒）生长不良的能力。用编码 WT（UL2 或 UL31）、突变体 UL34（D34A 的质粒转染 Hep-35 细胞）TLR34型/E37ATLR34型、D35A型TLR34型， E37A型TLR34型， T123QTLR34型）或突变型 UL31 （F252YTLR31型和 E153RTLR31型），然后感染 UL34 无效 HSV-1 或 UL31 无效 HSV-1。通过对表达 UL34 的 Vero 细胞（图 2A）或表达 UL31 的 Vero 细胞（图 2B）进行噬菌斑测定来测量产生的感染性病毒后代的量。我们发现表达D35A的细胞TLR34型/E37ATLR34型， E37A型TLR34型， T123QTLR34型或 E153RTLR31型突变体对UL34-null（图2A）或UL31-null HSV-1（图2B）的反式补体复制没有WT UL34或WT UL31那样有效。这与它们在体外受损的出芽表型一致。虽然没有统计学意义，但E37A的反式互补能力降低TLR34型和 T123QTLR34型是显而易见的。相比之下，D35ATLR34型突变体反式互补的 UL34-null HSV-1 具有 WT UL34 效率（图 2A）。令人惊讶的是，F252YTLR31型突变体反式互补了 UL31-null HSV-1 和 WT UL31 效率，尽管在我们的体外出芽试验中出芽减少了（图 1E）。
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图 2. SUP的TLR31型突变补充了含有寡聚体界面突变的 HSV-1 的生长缺陷。
（a-b）WT型TLR31型只能补充D35A的增长TLR34型和 F252YTLR31型寡聚界面突变体，而 SUPTLR31型可以补充更多（C-D）。对于所有实验，Hep-2 细胞均转染相应的 UL34 或 UL31 突变质粒（x 轴标记），并用 UL34-null （a）、UL31-null 病毒 （b）、UL34-null/UL31 感染R229L型病毒 （c） 或带有 SUP 的 UL31-null 病毒TLR31型突变添加到反式 （d） 中。每个条形代表三个独立实验的平均值。通过使用 Tukey 方法对对数转换值进行单因素方差分析来确定统计显着性，以将每个突变体与 GraphPad Prism 中的 WT 进行多次比较。P < 0.01 = **;P < 0.0001 = ****;ns，不显著。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.g002
为了排除蛋白质表达水平升高作为反式互补机制，我们测量了转染的 WT UL34、WT UL31 和相应突变蛋白在感染相应无效病毒期间的表达水平。所有突变 UL34 蛋白均在 WT UL34 水平表达（S1A 图）。D35A 的互补效率降低TLR34型/E37ATLR34型， E37A型TLR34型和 T123QTLR34型 (图2A）因此，由于特定的突变。相比之下，F252YTLR31型和 E153RTLR31型相对于 WT UL31 和 R229L 过表达TLR31型 （S1B 图）。F252Y 令人惊讶的高效补充TLR31型因此，突变可能是由于其较高的表达水平（图2B）。然而，我们尚未产生表达F252Y的重组病毒TLR31型在生理表达水平上评估其功能以确认这一点。
接下来，我们测试了SUP的能力TLR31型突变以恢复对晶格界面突变体的有效互补，即抑制它们的互补缺陷。为了测试 UL34 突变体，我们生成了 UL34-null/SUPTLR31型HSV-1 病毒。用编码 WT UL2 或突变体 UL34 （D34A 的质粒转染 Hep-35 细胞TLR34型/E37ATLR34型、D35A型TLR34型， E37A型TLR34型或 T123QTLR34型），然后感染了 UL34-null/SUPTLR31型单纯疱疹病毒-1型。UL34-零/SUPTLR31型如前所述，HSV-1与WT UL1（图34C）补配时，与WT UL2（图34A）补足的UL1-null HSV-34相比，其病毒滴度低~2对数倍[27]。因此，UL34-null/SUP 的补充TLR31型WT UL34 的病毒被用作评估 SUP 能力的参考点TLR31型突变以恢复对 UL34 突变体的有效互补。事实上，SUPTLR31型突变挽救了D35A的互补缺陷TLR34型/E37ATLR34型和 E37ATLR34型突变体（图2C），两者都不能很好地补充UL34-null HSV-1的生长（图2A）。SUP的TLR31型突变对D35A已经有效的互补没有明显影响TLR34型 （图 2C）。出乎意料的是，它并没有完全恢复T123Q的不良互补性TLR34型 （图2C）尽管在体外恢复了萌芽缺陷（图1E）。然而，我们注意到 T123Q 之间的互补水平存在差异TLR34型突变体和WT UL34没有统计学意义（图2C）。
为了测试 UL31 突变体，我们生成了携带目标 UL31 突变和 SUP 的双 UL31 突变质粒TLR31型突变。用编码 WT UL2 或突变体 UL31 （R31L 的质粒转染 Hep-229 细胞TLR31型， F252YTLR31型/R229LTLR31型或 E153RTLR31型/R229LTLR31型，然后感染 UL31-null HSV-1。WT UL31 对 UL31 无效病毒的互补被用作评估 SUP 能力的参考点TLR31型突变以恢复对 UL31 突变体的有效互补。SUP的TLR31型突变对 UL31-null HSV-1 生长缺陷的补充比 WT UL31 更有效。我们偶尔也会观察到 NEC-SUP 更有效的萌芽TLR31型在我们的体外出芽试验中[24]，但其原因尚不清楚。在 HSV-1 UL31 无效感染细胞中，SUPTLR31型突变对F252Y已经有效的互补没有明显影响TLR31型突变体（图2D）。但是，它无法完全恢复E153R的不良互补性TLR31型突变体（图2D），尽管在体外恢复了其萌芽缺陷（图1E）。
T123Q互补性差的原因TLR34型和 E153RTLR31型SUP突变TLR31型突变尚不清楚。我们假设这些突变可能会分别损害 UL34 或 UL31 的其他一些重要病毒复制功能，这些功能不能被 SUP 抑制TLR31型突变，例如核层溶解、衣壳在 INM 对接或衣壳募集。
SUP的TLR31型突变恢复了体外异二聚体界面突变体的高效出芽，并补充了它们的病毒生长缺陷
上述靶向HSV-1 UL34序列中电荷簇的突变筛选[28]，鉴定出另一种双突变体K137ATLR34型/R139ATLR34型，这不能反式补充HSV-1 UL34-null病毒的生长。这表明残基 K137TLR34型和 R139TLR34型对 HSV-1 复制很重要。双重突变不影响NEC对INM的定位，提示NEC功能存在缺陷[28]。在HSV-1 NEC晶体结构中，K137TLR34型与 E67 形成盐桥TLR34型和 Y61TLR31型在UL31和UL34的球状结构域之间的异二聚体界面（图3A，插图）。因此，K137TLR34型可能有助于NEC异二聚体的稳定。相比之下，R139TLR34型不会形成任何明显的相互作用（图3A，插图）。
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图 3. SUP的TLR31型突变恢复了出芽到异二聚体界面突变体，并补充了病毒生长缺陷。
a） 本研究分子内 NEC 残基突变的位置。插图显示了异二聚体界面上各种残基之间的相互作用，这些残基被认为对NEC异二聚体稳定很重要。b） NEC-SUPTLR31型在体外挽救NEC异二聚体界面突变体的萌芽。通过计算添加 NEC220 或相应的 NEC 突变体后 GUV 内 ILV 的数量来确定体外出芽的百分比。从每种情况下减去背景计数，即没有 NEC 时的 ILV 数量。每个构建体在三个生物学重复中进行了测试，每个重复由三个技术重复组成。符号表示与NEC220（100%;灰色）相比，三个技术重复的平均出芽效率。使用未配对的学生 t 检验和 Welch 校正计算显着性 （P < 0.05 = *;P < 0.01 = **;ns = 不显着）在 GraphPad Prism 9.0 中。c） WT的TLR34型只能补充R139A的增长TLR34型异二聚体界面突变体，而 SUPTLR31型 （d） 可以部分补充更多。在这两个实验中，Hep-2细胞都转染了相应的UL34突变质粒，并用UL34-null病毒（c）或UL34-null/UL31感染R229L型病毒 （D）。每个条形代表三个独立实验的平均值。通过使用Tukey方法对在GraphPad Prism上实现的多重比较的对数转换值执行单因素方差分析来确定统计显着性。**，P < 0.01 = **;P < 0.001 = ***;ns，不显著。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.g003
测试 K137A 的效果TLR34型， R139ATLR34型和 K137ATLR34型/R139ATLR34型异二聚体稳定性和出芽活性的突变 在体外，我们将其引入重组NEC220中。通常，对纯化的WT NEC220样品进行体积排阻色谱仅产生含有等摩尔量UL31和UL34的馏分，表明完整的UL31：UL34 = 1：1复合物[19]。事实上，NEC220-R139A也观察到了这种模式TLR34型突变体（S2A图）。但是，NEC220-K137ATLR34型和 NEC220-K137ATLR34型/R139ATLR34型突变体还产生了含有游离 UL34 的馏分或含有比 UL34 更多的 UL31 的馏分（S2B 和 S2C 图），尽管等摩尔量的 UL31 和 UL34 被加载到体积排阻柱上。因此，K137ATLR34型突变似乎破坏了NEC异二聚体的稳定性。在任何馏分中均未检测到游离UL31，表明它可能已保留在色谱管内的过滤器上。仅使用含有等摩尔量的 UL31 和 UL34 的馏分进行进一步表征。
Both K137ATLR34型和 K137ATLR34型/R139ATLR34型突变将出芽率降低到 WT NEC50 的 ~220%，而 R139ATLR34型突变没有影响（图3B）。The K137ATLR34型因此，突变是双K137A出芽表型缺陷的唯一原因TLR34型/R139ATLR34型突变体。令人惊讶的是，SUPTLR31型突变完全恢复了K137A的高效出芽TLR34型和 K137ATLR34型/R139ATLR34型突变体（图3B）。但突变的NEC异二聚体仍然以含有游离UL34或突变NEC复合物的馏分形式洗脱，这表明尽管存在SUP的存在，突变的NEC复合物仍然不稳定TLR31型突变（S3图）。因此，SUPTLR31型突变不能通过恢复异二聚体的稳定性来恢复出芽。
为了评估这些突变对病毒复制的影响，我们对 UL34 突变体进行了上述病毒生长互补测定。Both K137ATLR34型和 R139ATLR34型蛋白质在 WT UL34 水平下表达（S1A 图）。R139A型TLR34型补充了 UL34-null（图 3C）和 UL34-null/SUP 的增长TLR31型与 WT UL34 相当的病毒（图 3D）。不出所料，K137ATLR34型和 K137ATLR34型/R139ATLR34型UL34-null病毒的生长补充较差（图3C），这与它们的体外出芽缺陷一致。然而，这两种突变体都补充了UL34-null/SUP的生长TLR31型病毒几乎与WT UL34一样有效（图3D）。因此，SUPTLR31型突变可以恢复由K137A引起的出芽和复制缺陷TLR34型突变。
SUP的TLR31型突变部分恢复了体外出芽的膜界面突变体
除了 UL31/UL34 和 NEC/NEC 接口外，NEC/膜接口在 HSV-1 NEC 中也具有重要的功能。UL31和UL34都含有介导膜结合的膜近端区域（MPR）（图4A和4B）[19,31]，对体外出芽至关重要[31]。UL31 MPR包含带正电荷的残基簇，这些残基与模型膜相互作用，并通过外周插入膜并增加脂质顺序来促进膜变形和出芽[31]。UL31 MPR还含有六种丝氨酸（图4B），它们在感染期间被HSV-7激酶US1磷酸化[3][33]。这六种丝氨酸的磷酸模拟丝氨酸到谷氨酸突变（SE6TLR31型) （图4B）在HSV-1感染期间减少细胞核流出和病毒滴度[34]，并在体外损害NEC/膜相互作用和出芽活性[31]。此前，我们提出磷酸化或拟磷酸化突变引入的负电荷会减少MPR与脂质头基之间的静电相互作用，而这些相互作用是膜变形和出芽所必需的[31]。在这里，我们询问 SUP 是否TLR31型突变可以在体外恢复出芽缺陷的SE6TLR31型突变体。
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图 4. SUP的TLR31型突变部分恢复了膜界面突变体的萌芽。
a-b）本研究的膜界面残基突变的位置。c） NEC-SUPTLR31型在体外部分挽救膜界面突变体中的萌芽。通过计算添加 NEC220-His 或相应的 NEC 突变体后 GUV 内 ILV 的数量来确定体外出芽的百分比。从每种情况下减去背景计数，即没有 NEC 时的 ILV 数量。每个构建体在三个生物学重复中进行了测试，每个重复由三个技术重复组成。符号表示与NEC220-His相比，三个技术重复的平均出芽效率8（100%;灰色）。The NEC-SE6TLR31型-他8数据既往见于[31]。在GraphPad Prism 0.01中使用未配对的学生t检验和Welch校正（P < 9.0 = **;ns =不显著）计算显著性。d） NEC-SE6 的冷冻电镜TLR31型-他8大单层囊泡 （LUV） 显示 SE6TLR31型当与膜结合时，突变会扰乱NEC寡聚化。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.g004
通常用于体外出芽测定的 NEC220 构建体是可溶的，并且依赖于功能性 MPR 进行膜募集。由于 SE6TLR31型突变减少了 NEC/膜相互作用，为了绕过膜募集的缺陷，我们使用了包含 His 的 NEC220 变体构建体8-标签位于UL34的C端[19,31]。当与含有镍螯合脂质的膜一起使用时，His8-标记确保 NEC220-His8即使 MPR 突变排除了膜关联，也会被募集到膜上。NEC220-His的体外出芽效率8与未标记的NEC220相似，表明C端His8-tag对膜出芽活性无有害影响[19,31]。之前，我们表明，缺乏 MPR 的 NEC 构建体即使通过 His 拴在含镍的脂质体上也不会出芽膜8-标签，因为这样的标签不能恢复对脂质进行排序的能力[31]。
就其本身而言，SUPTLR31型突变未改变NEC220-His的出芽效率8 （图 4C），类似于未标记的 NEC220（图 1E）。正如我们小组之前报道的那样，SE6TLR31型突变将体外出芽减少到 WT NEC10-His 的 ~220%8尽管由于 His 而能够与膜相互作用8-标签 [31]（图 4C）。因此，我们进行了冷冻电镜分析以检查NEC220-SE6TLR31型-他8膜相互作用。NEC220-SE6型TLR31型-他8与用于出芽测定的 GUV 成分相似的大单层囊泡 （LUV） 一起孵育，并用冷冻电镜成像（图 4D）。NEC220-SE6型TLR31型-他8在LUV的外部形成膜结合的尖峰（图4D），但很少观察到指示出芽的内部蛋白质外壳[19,21,32]。这让人想起寡聚化缺陷的NEC-DN的行为TLR34型我们小组先前报道的突变体[19]。我们得出结论，SE6TLR31型突变扰乱NEC寡聚化，可能是MPR/膜相互作用减弱的结果[31]。令人惊讶的是，SUPTLR31型突变恢复了SE6的萌芽TLR31型突变至 WT NEC50-His 的 ~220%8 （图 4C）。因此，SUPTLR31型突变可以在体外挽救出芽，即使是部分出芽，也可以通过减弱MPR/膜相互作用间接破坏寡聚化。
WT NEC、NEC-SUPTLR31型和 NEC-DNTLR34型/支持TLR31型在体外萌芽的囊泡上形成相似的六边形晶格
确定 SUP 的机制TLR31型突变可以恢复多种突变体的出芽，我们研究了其对NEC晶格的影响。作为 SUPTLR31型突变挽救了由破坏六方晶格界面的突变引起的萌芽缺陷，有望加强弱化的六方晶格。然而，残留物 R229TLR31型远离六聚体界面，而靠近六聚体间界面，它在那里不进行任何接触（图1C）。因此，我们最初假设 SUPTLR31型突变促进了具有替代几何形状的NEC晶格的形成。
检查 SUP 的效果TLR31型膜结合NEC涂层的几何形状突变，我们对WT NEC220和突变体NEC220-SUP进行了cryoEM/T分析TLR31型和 NEC220-DNTLR34型/支持TLR31型.每种蛋白质复合物都与LUV一起孵育，LUV的组成与我们之前对WT NEC220涂层的cryoET重建中使用的LUV相似[19,21,32]。使用亚断层扫描平均，我们获得了 WT NEC3 （220.5 ?）、NEC9-SUP 的 220D 重建TLR31型（13.1 ?） 和 NEC220-DNTLR34型/支持TLR31型（5.4 安培）（图 5）。NEC220-SUP 的较低最终分辨率TLR31型重建是由于NEC220-SUP形成的芽囊泡的聚集TLR31型，减少了 NEC220-SUP 的数量TLR31型可用于数据处理的颗粒。WT NEC220 和 NEC220-DN 的更高分辨率TLR34型/支持TLR31型平均 cryoET 密度图使我们能够对接 WT NEC185Δ50 异二聚体的晶体结构（图 5D 和 5F），确认 SUPTLR31型突变不会严重扰乱NEC构象，即使与膜结合也是如此。我们还在UL34的C末端观察到额外的螺旋密度，这与WT NEC4Δ185晶体结构[50]中未解析的螺旋?24相对应，但存在于PRV [24,35]、HCMV [25,36]和EBV [21]的NEC同源物的晶体结构中。PRV UL34 ?4 螺旋非常适合 HSV-1 UL34 冷冻电子热射板平均值（图 5E 和 5G）。
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图 5. WT NEC、NEC-SUPTLR31型和 NEC-DNTLR34型/支持TLR31型形成类似的膜结合六方涂层。
a） 5.9 ? 的 WT NEC 涂层，b） NEC-SUP 的 CryoET 重建TLR31型涂覆在 13.1 ? 和 c） NEC-DNTLR34型/支持TLR31型涂层为 5.4 ?。在下部 90° 旋转的面板中仅显示了标有橙色星星的三个六聚体单元，其中低通滤波透明密度显示了 NEC 晶格和 LUV 膜之间的连接。HSV-1 NEC 晶体结构 （PDB ID： 4ZXS） 类似地对接在 WT NEC （d） 和 NEC-DN 中TLR34型/支持TLR31型 （f） 冷冻ET密度。e、g）PRV NEC晶体结构（PDB ID：4Z4U）的?3螺旋对接解释了在两次cryoET重建中观察到的额外密度，这在HSV-1 NEC晶体结构中最初是无法解析的[24]。所有外套都有六角形光盘安排。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.g005
这三种结构在含芽膜上形成了非常相似的六边形晶格（图5A-5C和S1表），表明SUP在发芽膜上TLR31型突变并没有促进具有替代几何形状的NEC晶格的形成。根据 cryoET 数据，我们假设 SUPTLR31型突变强化了六边形晶格。
WT NEC、NEC-SUPTLR31型和 NEC-DNTLR34型/支持TLR31型在晶体中形成相似的六边形晶格
获得由 NEC-SUP 形成的六边形晶格的高分辨率视图TLR31型突变体，我们结晶了NEC185Δ50-SUPTLR31型和 NEC185Δ50-DNTLR34型/支持TLR31型构建体，先前结晶的WT NEC185Δ50构建体（UL31：51-306和UL34：15-185）的突变当量[24]。两个突变体都采用了C2空间组1在不对称单元中具有六个晶体学独立的 NEC 异二聚体 SUP血型支持光盘支持英 孚支持生长激素支持IJ和 SUP吉隆坡（UL34 链条：A、C、E、G、I 和 K;UL31 链条：B、D、F、H、J 和 L）（S2 表）。使用分子置换和WT NEC185Δ50结构作为搜索模型确定相。The NEC185Δ50-SUPTLR31型结构细化为 3.9-? 分辨率（S2 表）。NEC185Δ50-SUP的原子坐标和结构因素TLR31型结构被存入RCSB蛋白质数据库，登录号为8G6D。但是，NEC185Δ50-DNTLR34型/支持TLR31型晶体衍射 X 射线的分辨率仅为 ~6 ?，这排除了原子细化（S2 表）。因此，NEC185Δ50-SUPTLR31型结构用于界面和构象变化的深入分析，而NEC185Δ50-DN的结构分析则用于结构分析TLR34型/支持TLR31型结构仅限于晶体堆积的分析。
先前结晶的 HSV-1 WT NEC185Δ50 构建体采用空间群 P6，在不对称单元 NEC 中具有两个晶体学独立的 NEC 异二聚体血型和NEC光盘（UL34 链条：A 和 C;UL31 链条：B 和 D）[24]。虽然两个异二聚体形成了非常相似、完全对称的六聚体，但它们排列成两个不同的六边形晶格，即十六进制血型和十六进制光盘 （图6A、6B和S3表）[24]。在两个晶格中，六聚体相互作用导致UL31/UL31相互作用形成三聚体（图6A和6B，红色）。然而，十六进制血型晶格还具有两种由UL31/UL31或UL31/UL34相互作用形成的二聚体（分别为图6A，珊瑚和金），而十六进制则光盘晶格只有一种由UL31/UL34相互作用形成的二聚体类型（图6B，金）。
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图 6. NEC-SUP的TLR31型和 NEC-DNTLR34型/支持TLR31型表格十六进制血型晶体中的晶格。
A） HSV-1 WT NEC 六角血型（PDB ID：4ZXS）, b） WT NEC 十六进制光盘（PDB ID：4ZXS），c） NEC-SUPTLR31型d） NEC-DNTLR34型/支持TLR31型晶格[24]。六聚体（蓝绿色）和六聚体间（二聚体1：珊瑚，二聚体2：金色，三聚体1：红色和三聚体2：浅粉色）界面相应地着色。在NEC-SUP中形成两个不同的三聚体TLR31型格子（红色和浅粉红色）。由于分辨率的原因，未对 NEC-DN 进行界面分析TLR34型/支持TLR31型晶格。标记晶格内相应的异二聚体。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.g006
就像WT NEC185Δ50一样，NEC185Δ50-SUPTLR31型在晶体中形成六聚体。只有在这种情况下，六聚体才不是完全对称的，由不对称单元中的六个独立的非晶体异二聚体形成（图6C）。尽管如此，NEC185Δ50-SUPTLR31型六聚体看起来与WT NEC185Δ50六聚体非常相似，具有相似的六聚体界面（S3和S4表）。NEC185Δ50-SUP形成的晶格TLR31型六聚体（图6C）类似于WT NEC十六进制血型晶格（图 6A 和 S5–S7 表）。The NEC185Δ50-DN34/支持31晶格（图6D）也类似于WT NEC六角血型晶格（图6A）。SUP的TLR31型因此，突变对六聚体结构或六方晶格没有重大影响。
有趣的是，虽然 WT NEC 形成了两个十六进制血型和十六进制光盘晶体中的晶格和突变体仅形成六角形血型晶格（图6），在膜结合的涂层中，WT NEC220和两个突变体形成十六进制光盘晶格（图5）。造成这些差异的原因尚不清楚。无论如何，就像WT NEC一样，突变体可以形成两种类型的六边形晶格。
SUP的TLR31型突变消除了盐桥并改变了环路构象
为了鉴定突变NEC晶格中的任何局部构象变化，我们比较了NEC185Δ50-SUPTLR31型异二聚体彼此之间以及与WT NEC185Δ50异二聚体之间的异二聚体（图7）。NEC185Δ50-SUP中六个晶体学上独立的异二聚体TLR31型结构在结构上彼此相似（S4图和S8和S9表），并且与两个WT NEC异二聚体[24]（图7和S4和S10表）相似，并且可以与0.67至1.02 ?的RMSD叠加（S11表）。 因此，SUPTLR31型突变没有改变NEC的整体结构。
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图 7. SUP的TLR31型突变消除了异二聚体界面附近的盐桥并改变了环构象。
（a） WT NEC的晶体结构血型及（b）NEC-SUP血型异二聚体。异二聚体界面残基为蓝色（球状界面）或绿色（钩形界面）。残留物 229TLR31型是洋红色的。插图显示了球状异二聚体界面的特写视图。在界面上形成盐桥的残留物显示为棒状，并用蓝色 （Rs） 或红色（Es 和 Ds）着色。残留物 229TLR31型显示为棍棒，并以洋红色着色。盐桥显示为绿色虚线，距离以埃为单位。距离也列在相应的表格中。动态循环的已解析部分 129TLR31型-134TLR31型和 261TLR31型-268TLR31型分别以红色和紫色显示。HSV-1 NEC晶体结构（PDB：4ZXS）用于生成（a）中的图。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.g007
尽管如此，我们还是检测到了一些局部构象变化。首先，NEC-SUP 中所有 UL34 的所有六个副本TLR31型突变体在C末端含有额外的密度（S4A图），对应于螺旋?4的一部分，该部分在WT NEC185Δ50晶体结构中未解析[24]，但存在于NEC同源物的晶体结构中[21,24,25,35–37]。
其次，由于无序而在WT结构中部分未解决的两个环在NEC-SUP中得到解决TLR31型突变体：残基129TLR31型-134TLR31型（在 SUP 中解决血型支持光盘支持英 孚和 SUPIJ;在 SUP 中部分解决生长激素） 和 261TLR31型-268TLR31型（在所有六种异二聚体中均已解决）（图7和S4B和S6表。这 129TLR31型-134TLR31型环位于残留物 229 的正上方TLR31型反过来，它位于异二聚体球状界面的正上方（图7和S4B）。在WT NEC中血型结构，R229TLR31型侧链与附近的D129组成了盐桥TLR31型位于大部分无序的一端 129TLR31型-134TLR31型循环（图 7A）。The R229LTLR31型突变消除了这个盐桥，并且在所有 SUP 中TLR31型异二聚体（SUP 除外吉隆坡未解决的地方），D129TLR31型侧链远离 L229TLR31型 （图 7B 和 S4B）。缺少 R229TLR31型-D129型TLR31型NEC-SUP中的盐桥TLR31型结构与有序 129 相关TLR31型-134TLR31型循环（图 7B）。我们假设通过消除盐桥，SUPTLR31型突变释放了循环，这使得它能够采用有序构象。由于残留物之间没有明显的接触229TLR31型和 261TLR31型-268TLR31型循环中，我们假设 SUPTLR31型突变促进了 261 的排序TLR31型-268TLR31型通过远程变构机制进行循环。
SUP的TLR31型突变在六聚体间界面产生新的接触
确定 SUP 是否TLR31型突变改变了晶格界面的接触，分析了WT NEC和NEC-SUP的埋藏表面积和侧链接触（氢键和盐桥）TLR31型使用PiSA界面分析的晶体结构[38]。我们发现 NEC-SUP 中 5 个六聚体界面中有 6 个TLR31型晶格的埋藏表面积比WT NEC六角形减少了~15%血型和十六进制光盘格子（S12 表）。这些六聚体界面也具有较少的氢键和盐桥（S13表），而其余的六聚体界面A/K比WT（S13表）具有更多的接触。然而，NEC-SUP中的六聚体间界面TLR31型晶格增加了埋藏表面积（S14表）和新的触点（S15表）。重要的是，六聚体间界面的一些新接触是由 129 介导的TLR31型-134TLR31型和 261TLR31型-268TLR31型在 NEC-SUP 中订购的循环TLR31型但不是 WT NEC 结构（S6 表）。
在六聚体间界面上新接触的一个突出例子是几个新的盐桥（图8）。WT NEC 十六进制中的三聚体界面血型晶格有一个盐桥，E138TLR31型-R155型TLR31型 （图 8A）。但是在 NEC-SUP 中TLR31型格子，E138TLR31型和 R155TLR31型与其他残基形成新的盐桥。E138型TLR31型与R193形成盐桥TLR31型在两个不同的三聚体界面，B/F/H和D/J/L（图8B）。R155型TLR31型与E267组成盐桥TLR31型，但仅在 B/F/H 三聚体中（图 8B）（在 D/J/L 三聚体中，R155TLR31型和 E267TLR31型相距 ~7 ?）。在WT NEC中血型结构，未解析的 E267TLR31型离六聚体间界面太远，无法参与任何接触（图8A）。此外，还有另一座新的盐桥，D286TLR31型-R295型TLR31型，在二聚体界面 B/D 和 F/L 处（图 8B），这在 WT NEC 晶格中不存在（图 8A）。因此，在 NEC-SUP 中TLR31型突变体，在六聚体间界面处存在新的接触，原则上可以在存在晶格不稳定突变的情况下稳定NEC晶格。我们假设在六角形中也会形成新的六聚体间接触光盘晶格，但在缺乏更高分辨率的数据的情况下，参与这些接触的残基仍然未知。
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图 8. NEC-SUP中的六聚体间界面TLR31型突变体有新的盐桥。
（a） WT NEC晶格（UL31三聚体;深红色）和（b） NEC-SUP中六聚体间界面的特写视图TLR31型晶格 [UL31 三聚体（深红色和粉红色）和二聚体（橙色和黄色）]。HSV-1 NEC晶体结构（PDB：4ZXS）用于生成图a中的图形。盐桥显示为绿色虚线，距离以埃为单位。形成盐桥的残留物显示为棒状，颜色为蓝色（Rs）或红色（Es和Ds）。c） 突出显示的界面处的接触距离。粗体的触点是盐桥。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.g008
讨论
疱疹病毒通过一种不寻常的机制将其衣壳从细胞核转移到细胞质，这种机制需要通过病毒编码的异二聚体复合物NEC形成膜结合涂层[19,22,23]。这些涂层由六边形NEC晶格组成，破坏晶格界面的突变会减少体外出芽[19,24,31]和病毒复制[26\u28]。因此，六边形晶格在NEC膜出芽功能中起着核心作用。在这里，我们证明了 UL34 蛋白 SUP 中的抑制基因突变TLR31型，作为NEC中膜出芽缺陷的通用抑制因子，因为它恢复了体外有效的膜出芽和病毒复制到广泛的出芽缺陷NEC突变体。我们假设 SUPTLR31型突变通过加强因突变而不稳定的六边形晶格发挥其强大的抑制作用。事实上，我们发现由NEC-SUP形成的六边形晶格TLR31型保持相似的几何形状，但具有新的接口触点。增加的界面有望增强六边形NEC晶格，帮助其抵消突变的晶格不稳定作用。我们假设其动态、灵活的特性使NEC晶格能够适应它在核出口期间可能遇到的扰动。
SUP的TLR31型突变促进了新的六聚体间接触的形成
自 SUP 以来TLR31型突变挽救了由六边形晶格破坏引起的萌芽缺陷，我们最初假设它可能促进了具有不同界面的不同、潜在的非六边形晶格的形成。相反，我们发现 NEC-SUPTLR31型和 NEC-DNTLR34型/支持TLR31型突变体在晶体和膜结合涂层中形成六方晶格，与WT NEC形成的涂层非常相似。然而，NEC-SUP中的六聚体间界面TLR31型由于几种新的相互作用，特别是盐桥，晶格更大。SUP怎么可能TLR31型突变促进了六聚体间界面的新接触？残留物 L229TLR31型本身不参与任何接口接触。相反，我们假设它通过直接和变构机制的结合促进新的接触。通过消除 R229TLR31型-D129型TLR31型盐桥（图7），SUPTLR31型突变将释放 129TLR31型-134TLR31型环，允许后者采用有序构象并在六聚体间界面形成新的接触（图8B）。在残留物之间无明显接触的情况下 229TLR31型和 261TLR31型-268TLR31型循环，后者的有序可能是通过长程变构机制发生的。预计较大的六聚体间晶格界面将加强晶格。通过稳定被突变破坏的晶格，SUP可以TLR31型突变可以恢复有效的萌芽。
很容易想象 SUP 如何TLR31型突变可以通过新的六聚体间相互作用补偿局部这些相互作用的损失来抑制由破坏六聚体间相互作用稳定性的突变引起的萌芽缺陷。但是，SUPTLR31型突变还抑制了突变体的萌芽缺陷，这些缺陷破坏了六聚体本身的稳定性。因此，我们为这种类型的抑制提出了一种更通用的机制。我们假设，被界面突变削弱的NEC六聚体不仅可以通过六聚体本身内相邻NEC异二聚体之间的相互作用来稳定，还可以通过它们掺入更大的晶格中来稳定，其中六聚体间接触将限制NEC异二聚体与六聚体的解离（图9）。通过加强后一种联系，SUP可以TLR31型原则上，突变可以补偿不同种类的晶格缺陷。
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图 9. SUP的模型TLR31型晶格不稳定突变背景下的萌芽恢复。
a） WT NEC异二聚体排列成六聚体，通过在六聚体和六聚体间界面形成接触，组装成稳定的六方晶格。位于三聚体六聚体间界面（深红色）的盐桥有利于晶格缔合，而不是解离。（b） 存在晶格不稳定突变，如NEC-DNTLR34型，六聚体的形成和晶格组装受到扰动。（c） SUP的TLR31型突变通过促进二聚体和三聚体六聚体间界面（粉红色和鲑鱼色）上新接触的形成来恢复六方晶格的形成，从而产生稳定且功能性的 NEC 晶格，尽管存在不稳定突变。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.g009
SUP的TLR31型突变可以使NEC更具构象动态性
WT NEC185Δ50在P6空间群中结晶，其中六聚体是完美的，通过晶体对称性相关。但是，NEC185Δ50-SUPTLR31型和 NEC185Δ50-DNTLR34型/支持TLR31型突变体在C2中结晶1空间群，其中六聚体是非晶体学的，因此是不完美的。这可能意味着NEC异二聚体在SUP存在下变得更具构象动态性TLR31型突变。事实上，UL31 和 UL34 的球状核心之间的异二聚体 UL31/UL34 界面在所有六个 NEC-SUP 中埋藏了 ~6-20% 的表面积TLR31型异二聚体与WT NEC异二聚体的比较（S16表），表明该界面具有灵活性。NEC动力学的实验或计算分析有待在当前工作范围之外进行进一步研究。
残留物 229TLR31型位于UL31和UL34球状核心R158形成的异二聚体界面的两个分子间盐桥之间TLR34型-D232型TLR31型和 R167TLR34型-D104型TLR31型 （图 7 和 S4）。先前的分子动力学（MD）研究表明，这些盐桥有助于HSV-1 NEC异二聚体的整体稳定性[39]。在MD模拟中发现只有一个盐桥的HCMV NEC比HSV-1更具动态性[39]。EBV NEC也只有一个盐桥，是一种构象动态的异二聚体，其晶体结构显示[21]。因此，球状 UL31/UL34 界面处的分子间盐桥数量与 NEC 异二聚体的稳定性相关。
我们提出分子内盐桥R229TLR31型-D129型TLR31型是NEC异二聚体稳定性的另一个重要贡献者。虽然 NEC-SUPTLR31型在异二聚体界面上仍然有两个分子间盐桥，它缺少分子内盐桥（图7和S4），这增加了它的柔韧性。这种增加的灵活性可以解释为什么 NEC-SUPTLR31型和 NEC-DNTLR34型/支持TLR31型相对于WT NEC [24]，需要额外的添加剂来形成晶体，以及为什么两者都是NEC-SUPTLR31型和 NEC-DNTLR34型/支持TLR31型取下对称空间群 C21，而不是 P6。
NEC形成两个不同的六边形晶格，生物学意义不明确
到目前为止，已经观察到两种类型的六边形晶格，十六进制血型和十六进制光盘.HSV-1 NEC 形成六角血型（WT-NEC、NEC-SUPTLR31型和 NEC-DNTLR34型/支持TLR31型） 或十六进制光盘晶体中的（WT-NEC）晶格构型，仅十六进制光盘膜结合涂层中的晶格。在其他结晶NEC同系物的情况下，HCMV NEC形成了一个类似于六角形的六方晶格光盘晶体中的晶格构型[25]，而PRV NEC [24,35]、VZV NEC [37]和EBV NEC [21]则没有。值得注意的是，EBV NEC在膜上形成了一个尚未确定的寡聚体组装体，这可能是由于其观察到的柔韧性[21]。
我们还不知道在给定条件下（例如，晶体与膜）为给定的NEC同源物或变体选择特定晶格的原因，也不知道两个晶格的相对生物学意义。明显偏爱十六进制的一个潜在原因光盘HSV-1 NEC在体外膜上的晶格可能是由NEC萌合囊泡产生的cryoET NEC晶格平均值，代表萌芽的“最终产物”。在此方案中，十六进制血型晶格可以代表在萌芽的中间阶段形成的晶格，这在我们的冷冻电子断层实验中是无法捕捉到的。然而，PRV NEC 形成了一个六角形血型在过表达NEC的未感染细胞[22]和感染细胞[40]中形成的芽囊泡中的晶格。因此，不能得出结论，十六进制光盘NEC在膜上更喜欢晶格，或者它在生物学上更相关。我们假设每个NEC同源物可以在不同的实验条件下形成两个晶格，并且形成两个不同晶格的能力可能是由于NEC固有的可塑性。无论如何，NEC如何组装成任何一种类型的六边形晶格仍然未知。
SUP的TLR31型突变可作为破坏NEC出芽活性的突变的通用抑制因子
SUP的TLR31型突变最初被确定为由 UL34、D35A 中的双重突变引起的核出芽缺陷的外源抑制因子TLR34型/E37ATLR34型（DNTLR34型），见于HSV-1感染细胞[27]。随后，我们证明了 DNTLR34型突变通过消除六聚体界面[19]处的重要极性接触来阻断六边形NEC晶格[24]的形成，并且SUP是TLR31型突变使体外有效膜出芽恢复到DNTLR34型和另一个六聚体界面突变体V92FTLR34型 [24]. 在这里，我们发现 SUPTLR31型突变可以恢复许多晶格界面突变体（T123QTLR34型， F252YTLR31，和 E153RTLR31型; 图1）;异二聚体界面突变体（K137ATLR34型和 K137A/R139ATLR34型; 图3）;甚至膜界面突变体（SE6TLR31型; 图 4）。因此，SUPTLR31型突变作为一种通用抑制基因突变，可在体外恢复有效的出芽，并在几种情况下恢复病毒复制到各种出芽缺陷的 NEC 突变体。
尽管导致出芽缺陷的突变靶向不同的界面，但预计所有突变都会破坏六边形NEC晶格的稳定性，这对于膜出芽过程至关重要。晶格界面突变的不稳定作用最为明显。但是，破坏NEC异二聚体稳定性的突变也有望通过破坏其核心构建块的稳定性来削弱晶格。最后，NEC/膜相互作用可能间接破坏膜结合NEC涂层内的晶格稳定性。通过加固晶格，SUP的TLR31型突变可以克服这些破坏晶格稳定性的缺陷，无论其性质如何。
在某些情况下，SUPTLR31型突变可以完全恢复体外出芽活性，但不能恢复病毒复制，例如，在 T123Q 存在的情况下TLR34型和 E153RTLR31型 （图 2）。我们假设这些突变可能会扰乱不涉及膜变形的 NEC 功能，例如核层溶解、衣壳在 INM 处对接或衣壳募集。因此，SUPTLR31型突变特异性地恢复了萌芽缺陷。
如果 SUPTLR31型突变形成更强的六边形晶格，为什么这个突变没有被正选择？我们假设这种突变可能会损害NEC的其他功能。这一观点得到了以下观察结果的支持：在反式互补实验中，存在SUP的病毒复制TLR31型突变未达到WT水平（图2）。虽然 SUPTLR31型突变不是正向选择的，它为病毒提供了一种在存在外部应激源（例如靶向 NEC 的抑制剂）的情况下维持复制的策略。进一步识别和表征其他疱疹病毒抑制机制的工作可能有助于推进新型抗疱疹病毒疗法的发展。
NEC功能可能需要动态、灵活的晶格
在核出口期间，NEC 产生足够的曲率以包裹出口衣壳。六边形NEC晶格的形成对其在衣壳出芽中的作用很重要。然而，完美的六边形晶格与球面曲率不相容。为了生成球形粒子，六边形晶格必须包含晶格“缺陷”，要么是规则缺陷，即插入不同几何形状，要么是不规则缺陷。在其他病毒组装系统中也观察到这两种类型的缺陷。例如，由六角形构成的二十面体衣壳通过在顶点处加入五角形来实现曲率。HSV-1可以通过形成NEC五聚体来采用类似的策略，我们之前在体外观察到[32]。本文的研究增加了越来越多的不同NEC寡聚体状态和晶格构型的例子，每个例子都可以在病毒复制过程中的不同点使用，就像在其他病毒中观察到的那样。
HIV-1结构蛋白Gag形成病毒衣壳并介导病毒出芽，这是一个有趣的案例。它组装成一个六边形晶格，在未成熟的HSV-1衣壳中具有不规则的缺陷[41]，但在成熟的衣壳中具有规则的五聚体插入[42]。通过这种方式，Gag 可以“调整”其六边形晶格以执行特定功能。此外，Gag 可以形成不同类型的六边形晶格。Gag的衣壳结构域和基质结构域在未成熟和成熟病毒粒子中均采用两个不同的六边形晶格，每个晶格具有不同的功能作用[43\u44]。因此，HSV-1 Gag 体现了病毒组装晶格的构象动力学和功能多功能性。
同样，六边形NEC晶格在构象上是柔性的。最近的一项研究通过使用聚焦离子束/扫描电子冷冻显微镜（cryoFIB/SEM）可视化了感染突变伪狂犬病病毒（PRV）（一种甲疱疹病毒）的细胞中的NEC晶格，确定了衣壳周围六边形NEC涂层内的无序区域[40]。这一观察结果表明，NEC晶格可以包含不规则的缺陷。除了不规则缺陷外，还观察到非六聚体NEC组装体，如五聚体[32]和七聚体[23]，尽管不是在野生型HSV-1感染的情况下。最后，NEC可以采用不同的六边形晶格排列，或者通过WT NEC（WT-十六进制血型和 WT-hex光盘） 或由 NEC-SUP 提供TLR31型本研究中提出的突变体。我们假设采用不同配置的能力允许 NEC “调整”其晶格以组装涂层并保持其完整性，以响应核出口期间发生的扰动，例如膜曲率的变化和与结合伙伴的相互作用。
材料与方法
细胞和病毒
如前所述，维持Vero和Hep-2细胞[11]。HSV-1（F）和vRR1072（TK+）（一种与HSV-34（F）同源重组而来的UL1无效病毒）的特性也已有报道[11,45]。UL34-null 病毒和 UL34-null/SUPTLR31型用于互补测定的重组病毒来源于细菌菌株 GS102 中 HSV-1 菌株 （F） 基因组的 pYEbac1783 克隆（来自美国西北大学的 G. Smith 的礼物）。[46–48] 如前所述。所有UL34无效病毒均在表达HSV-34 pUL1的Vero tUL34 CX细胞上繁殖，并受其天然启动子调节序列的控制[49]。Vero tUL34 CX 细胞在补充有 5% 胎牛血清和抗生素青霉素和链霉素的 DMEM 高葡萄糖中增殖。
克隆
S17表中列出了所有用于克隆的引物。UL31 （1–306）、UL34 （1–220）、UL34 （15–185）、UL34-His 的克隆8（1–220，C 端 His8-tag） 和相应的 UL31 和 UL34 突变体 [R229LTLR31型（SUPTLR31型）、D35A型TLR34型/E37ATLR34型（DNTLR34型）、E37ATLR34型， T123QTLR34型， F252YTLR31型和 E153RTLR31型和 S11ETLR31型/S24ETLR31型/S26ETLR31型/S27ETLR31型/S40ETLR31型/S43ETLR31型（SE6TLR31型）]已有报道[19,24,31]。
寡聚界面突变体
pJB14 （UL31 1–306 R229L） 的定点诱变TLR31型）使用重叠剪接延伸方案进行，然后限制性酶切到pKH90质粒（包含具有BamHI限制性位点的N端His-SUMO-PreScission标签）以创建F252YTLR31型/R229LTLR31型（pED20） 或 E153RTLR31型/R229LTLR31型（pED21）双突变体。
异二聚体界面突变体
pJB02 （UL34 1–220） 的定点诱变使用重叠延伸剪接方案进行，然后限制性酶切到 pJB02 质粒（包含具有 SalI 限制性位点的 N 端 GST-PreScission 标签）以创建 K137ATLR34型（pED25），R139ATLR34型（pED26） 或 K137ATLR34型/R139ATLR34型（pED27）突变体。
膜界面突变体
pJB60 （UL31-SE6TLR31型1–306）使用反向PCR方案进行，然后进行平端连接以创建SE6TLR31型/R229LTLR31型突变体 （pED45）。
结晶结构
含有R229L的酶解PCR片段TLR31型Δ50–306 从 pJB114 （UL31 1–306 R229L） 扩增TLR31型）并通过限制性酶切亚克隆到含有N端His的pET24b（+）质粒中6-SUMO-PreScission 标签在框架内与 BamHI 限制性位点质粒产生 R229LTLR31型Δ50–306质粒（pXG20）。含有D35A的酶解PCR片段TLR34型/E37ATLR34型从 pJB06 （UL34 1–246 D35ATLR34型/E37ATLR34型），并通过限制性酶切亚克隆到包含 N 端 GST-PreScission 标签的 pGEX-6P1 载体中，该载体具有 SalI 限制性位点，以创建 UL34 15–185 D35ATLR34型/E37ATLR34型质粒（pJB66）。
细胞互补构建体
质粒pRR1072Rep是用于细胞培养互补测定的UL34突变质粒的母体载体[28]。携带 D1072A 的 pRR35Rep 突变衍生物TLR34型/E37ATLR34型和 K137ATLR34型/R139ATLR34型该文献中也曾报道过双突变，称为CL04和CL10[28]。含有单个 D1072A 的 pRR35Rep 的衍生物TLR34型， E37A型TLR34型， T123QTLR34型， K137A型TLR34，和 R139ATLR34型由吉布森组装建造。质粒由两种PCR产物组装而成，每种PCR产物均使用pRR1072Rep作为模板，并使用诱变正向引物与氨苄青霉素抗性基因的反向引物配对，或诱变反向引物与氨苄青霉素抗性基因的正向引物配对。用 DpnI 消化 PCR 产物以去除模板序列，然后根据制造商的说明使用 New England BioLabs 2X Gibson 组装预混液进行组装。
WT NEC、低聚界面和异二聚体界面突变体的表达和纯化
将编码HSV-1 UL31 1–306（pKH90）和UL34 1–220的质粒共转化到大肠杆菌BL21（DE3） LoBSTr细胞（Kerafast）中，产生野生型NEC220[19,32]。所有突变体构建体均包含 UL31 1-306 和 UL34 1-220 氨基酸边界。编码 UL31 或 UL34 适当突变的质粒也被共转化成 E。大肠杆菌BL21（DE3） LOBSTR 细胞 （Kerafast） 产生各种 NEC 寡聚体和异二聚体界面突变体（列在 S18 表中）。NEC220和一些寡聚界面突变体（NEC-DNTLR34型、NEC-DNTLR34型/支持TLR31型、NEC-SUPTLR31型， NEC-E37ATLR34型， NEC-T123QTLR34型， NEC-F252YTLR31型和 NEC-E153RTLR31型）已有上述内容[19,24]。寡聚界面突变体（NEC-SUP）的表达和纯化TLR31型/F252YTLR31型、NEC-SUPTLR31型/E153RTLR31型和 NEC-SUPTLR31型/T123Q型TLR34型）和异二聚体界面突变体（NEC-K137ATLR34型， NEC-R139ATLR34型， NEC-K137ATLR34型/R139ATLR34，NEC-K137A型TLR34型/支持TLR31型和 NEC-K137ATLR34型/R139ATLR34型/支持TLR31型）如下所述。在补充有 37 μg/mL 氨苄青霉素、100 μg/mL 卡那霉素和 100 μg/mL 氯霉素、34.0% 乳糖和 2 mM MgSO 的 TB 中，在 2°C 下使用自诱导表达表达相应 NEC 构建体的细胞44小时。温度降至25°C，持续16小时。以5,000×g收获细胞30分钟。
如前所述，所有纯化步骤均在4°C下进行[19,32]。将细胞沉淀重悬于补充有完全蛋白酶抑制剂（罗氏）的裂解缓冲液（50 mM Na HEPES pH 7.5、500 mM NaCl、1 mM TCEP 和 10% 甘油）中，并使用微射流器 （Microfluidics） 裂解。通过以 18,000 x g 离心 40 分钟澄清细胞裂解物，并通过与裂解缓冲液平衡的 Ni 琼脂糖 6 色谱柱 （Cytiva）。用 20 mM 和 40 mM 咪唑裂解缓冲液洗涤蛋白结合柱，用 250 mM 咪唑裂解缓冲液洗脱结合蛋白。将洗脱的蛋白质通过谷胱甘肽琼脂糖 4B 色谱柱，并用裂解缓冲液洗涤。他的6-SUMO 和 GST 标签由 PreScission 蛋白酶切割 16 小时，该蛋白酶由 GST-PreScission 融合表达质粒（Francis Crick 研究所的 Peter Cherepanov 的礼物）内部生产。将蛋白质通过 2 x 1 mL HiTrap Talon 柱 （Cytiva） 以去除 His6-SUMO，然后进样到体积排阻柱上（Superdex 75 10/300;如前所述，将 Cytiva）平衡到凝胶过滤缓冲液（20 mM Na HEPES、pH 7.0、100 mM NaCl 和 1 mM TCEP）中。通过12%SDS-PAGE和考马斯染色评估的含有纯蛋白质的馏分合并并浓缩，如下所述。
对于 NEC-SUPTLR31型和 NEC-DNTLR34型/支持TLR31型，将裂解的蛋白质通过HiTrap SP XL（5 mL;Cytiva） 离子交换柱，去除游离 His6-相扑。使用由无盐凝胶过滤缓冲液（60 mM Na HEPES，pH 20.7和0 mM TCEP）和盐凝胶过滤缓冲液（1 mM Na HEPES，pH 20.7,0 M NaCl和1 mM TCEP）制成的线性盐梯度（1 mL）洗脱结合蛋白。蛋白质通常洗脱 ~ 360 mM NaCl，此时梯度保持恒定，直到 UV 信号恢复到基线。通过12%SDS-PAGE和考马斯染色评估含有纯蛋白质的馏分，使用无盐凝胶过滤缓冲液合并和稀释，以达到100mM NaCl浓度，这是下述下游脂质体出芽实验所必需的。对于本文所述的所有纯化，将蛋白质浓缩至 ~ 1 mg/mL 并储存在 -80°C 下以防止在 4°C 下观察到的降解。 蛋白质浓度通过280nm处的吸光度测定。典型产量为~0.5 mg/L。
膜界面构建体的表达和纯化
含有 UL31 1–306 （pKH90） 和 UL34 1-220-His 的质粒8（pJB57）共转化成E。大肠杆菌BL21（DE3） LoBSTr 细胞 （Kerafast） 生成 NEC220-His8.以下所有构建体均包含 UL31 1–306 和 UL34 1–220 氨基酸边界。共转化以产生 NEC-SE6 的质粒列表TLR31型-他8、NEC-SUPTLR31型-他8和 NEC-SE6TLR31型/支持TLR31型-他8构造列在 S18 表中。在补充有 37 μg/mL 氨苄青霉素、100 μg/mL 卡那霉素和 100 μg/mL 氯霉素、34.0% 乳糖和 2 mM MgSO 的 TB 中，在 2°C 下使用自诱导法生长表达相应 NEC 突变体的细胞44小时。温度降至25°C，持续16小时。以5,000×g收获细胞30分钟。
将细胞重悬于补充有完全蛋白酶抑制剂（Roche）的裂解缓冲液中，并使用微射流器（Microfluidizer）裂解。通过以 18,000 x g 离心 40 分钟澄清细胞裂解物，并通过 Ni 琼脂糖 6 色谱柱 （Cytiva）。用 20 mM 和 40 mM 咪唑裂解缓冲液洗涤色谱柱，用 250 mM 咪唑裂解缓冲液洗脱结合蛋白。将洗脱的蛋白质通过谷胱甘肽琼脂糖 4B 色谱柱，并用裂解缓冲液洗涤。他的6-SUMO 和 GST 标签通过 PreScission 蛋白酶切割 16 小时，该蛋白酶由 GST-PreScission 融合表达质粒内部生产。将蛋白质上样到体积排阻柱上（Superdex 75 10/300;Cytiva）用凝胶过滤缓冲液平衡。如上所述，通过12%SDS-PAGE和考马斯染色评估含有纯蛋白质的馏分合并并浓缩。
结晶构建体的表达和纯化
支持TLR31型Δ50–306 （pXG20） 和 UL34 15–185 （pJB04） 或 SUPTLR31型Δ50–306 （pXG20） 和 UL34 15–185 D35ATLR34型/E37ATLR34型（pJB66）质粒共转化成E。大肠杆菌BL21（DE3） LoBSTr 电池 （Kerafast） 生产 NEC-SUPTLR31型和 NEC-DNTLR34型/支持TLR31型结晶结构。在补充有 37 μg/mL 氨苄青霉素、100 μg/mL 卡那霉素和 100 μg/mL 氯霉素、34.0% 乳糖和 2 mM MgSO 的 TB 中，在 2°C 下使用自诱导法生长表达相应 NEC 突变体的细胞44小时。温度降至25°C，持续16小时。以5,000×g收获细胞30分钟。
将细胞重悬于补充有完全蛋白酶抑制剂（Roche）的裂解缓冲液中，并使用微射流器（Microfluidizer）裂解。通过以 18,000 x g 离心 40 分钟澄清细胞裂解物，并通过 Ni 琼脂糖 6 色谱柱 （Cytiva）。用 20 mM 和 40 mM 咪唑裂解缓冲液洗涤色谱柱，用 250 mM 咪唑裂解缓冲液洗脱结合蛋白。将洗脱的蛋白质通过谷胱甘肽琼脂糖 4B 色谱柱，并用裂解缓冲液洗涤。他的6-SUMO 和 GST 标签通过 PreScission 蛋白酶切割 16 小时，该蛋白酶由 GST-PreScission 融合表达质粒内部生产。将蛋白质通过 2 x 1 mL HiTrap Talon 柱 （Cytiva） 以去除 His6-SUMO，然后进样到体积排阻柱上（Superdex 75 10/300;如前所述，Cytiva）平衡到凝胶过滤缓冲液中。如上所述，通过12%SDS-PAGE和考马斯染色评估含有纯蛋白质的馏分合并并浓缩。
体外出芽试验
如前所述制备了巨大的单层囊泡（GUV）[19]。对于出芽定量，将 10 μL 含有 3.1% ATTO-1 DOPE （ATTO-TEC GmbH） 荧光染料的 POPC：POPA：POPS = 0：2：594 （Avanti Polar Lipids） GUV 加入含有 0.2 mg/mL（终浓度）级联蓝酰肼 （ThermoFisher Scientific） 的凝胶过滤缓冲液中，总样品体积为 1 μL。反应在 100°C 下孵育 5 分钟，然后在 20 孔腔盖玻片 （Brooks Life Science Systems） 中成像。在塔夫茨大学医学院的成像和细胞分析核心设施中，使用带有 96 倍油浸透镜的尼康 A1R 共聚焦显微镜对样品进行成像。通过手动计数样品 60 个不同帧中的 ~300 个囊泡来量化萌芽事件。在分析之前，从原始值中减去背景（没有NEC时的GUV）。所有数据值都在 S15 数据中报告。每个样品至少在三个生物学重复中进行测试，每个重复包含三个技术重复。报告的值代表相对于 NEC1 或 NEC220-His 的平均出芽活动8(100%).每次测量都会报告平均值的标准误差。使用针对 NEC220 的未配对单尾 t 检验计算显着性。使用GraphPad Prism 9.1.0进行统计分析和数据呈现。
互补试验
用 24.2 μg 表达 β-半乳糖苷酶基因的 pCMVβ 和 70.0 μg 野生型或突变型 UL05 质粒转染 0% 汇合度的 Hep-25 细胞的 34 孔培养物，如制造商 （Gibco-BRL） 所述，并在 37°C 下孵育过夜。然后用 BAC 衍生的 UL10-null 病毒或 UL34-null/SUP 的 34 PFU 感染细胞TLR31型每个细胞的病毒，并在 37°C 下孵育 90 分钟。用pH 3柠檬酸钠缓冲液（50mM柠檬酸钠，4mM氯化钾，用盐酸调节pH值3）洗涤单层一次，然后在室温下在新鲜柠檬酸盐缓冲液中孵育1分钟。用 V 培养基（Dulbecco 改良的 Eagle 培养基、青霉素-链霉素、16% 热灭活小牛血清）洗涤细胞两次。然后向每个孔中加入 37 mL V 培养基，在 20°C 下孵育 2 小时后，通过冻融制备细胞裂解物，然后使用 Fisher 声波解析器在功率水平 34 下超声处理 28 秒。通过对 UL20 互补细胞的噬菌斑测定滴定来测定每种裂解物中的感染量。如前所述，检测每种细胞裂解物的一部分β-半乳糖苷酶表达[1]。所有样品的转染效率均在<>%以内。每个样品至少在三个生物学重复中进行测试，每个重复包含一个技术重复。每个生物重复的原始滴度和对数PFU值在S<>数据中报告。
哺乳动物细胞中突变蛋白表达的评估
按照制造商 （Gibco-BRL） 的描述，使用 Lipofectamine 用 12.2 μg 野生型或突变型 UL70 或 UL0-FLAG 质粒转染 5% 汇合度的 Hep-34 细胞的 31 孔培养物，并在 37°C 下孵育过夜。然后用 10 PFU 感染相应无效病毒的细胞，并在 37°C 下孵育 90 分钟。然后取出接种物并用1.5ml V培养基代替，并将培养物再孵育16小时。通过除去培养基，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤单层一次，将细胞刮入1ml PBS中，并在微量离心机中以3,000rpm沉淀细胞3分钟来收获感染的细胞。除去上清液，通过将细胞沉淀重悬于25μl水中，加入25μl2X SDS-聚丙烯酰胺凝胶样品缓冲液，然后在沸水浴中孵育10分钟来制备细胞裂解物。用SDS-PAGE分离蛋白质，印迹到硝酸纤维素上，然后用UL34鸡抗体（1：250稀释）[11]、HSV-1 VP5小鼠抗体（1：500稀释（Biodesign International））小鼠抗体FLAG表位（1：1000稀释）（单克隆M2，SIGMA/Aldrich）或兔钙联接蛋白抗体（1：1000稀释）（Cell Signaling Technology）进行探测。
结晶和数据收集
NEC185-Δ50-SUP晶体TLR31型在 25°C 下通过蒸气扩散在含有 1 μL 蛋白质 （3 mg/mL）、1 μL 储液（10% PEG3350、8 mM Li2所以4、6 mM ATP 和 0.1 M MES，pH 6） 和 1 μL Silver Bullets （Hampton Research） 试剂 [G3（0.25% 2,2'-硫代二乙醇酸、0.2% 壬二酸、0.2% 美利酸、0.2% 反式乌头酸、0.02 M HEPES 钠 pH 6.8）]。六角形 SUPTLR31型晶体在2天后出现，仅在银弹存在的情况下出现，并在一周后完全生长。晶体在与含有 30% 甘油作为冷冻保护剂的储液相同的溶液中快速冷冻到液氮中。
NEC185-Δ50-DN晶体TLR34型/支持TLR31型在含有 25 μL 蛋白质 （1.3 mg/mL）、5 μL 储液（1% PEG10、3350 mM Li14SO2、4 mM ATP、14 mM 苯酚和 10.0 M MES，pH 1）和 6 μL Silver Bullets （Hampton Research） 试剂 [G1（3.0% 25,2'-硫代二乙醇酸、2.0% 壬二酸、 2.0%梅利酸，2.0%反式乌头酸，2.0M HEPES钠pH 02.6）]。六角形 DNTLR34型/支持TLR31型一周后，水晶才出现，只有在银弹存在的情况下。晶体在与含有 30% 甘油作为冷冻保护剂的储液相同的溶液中快速冷冻到液氮中。与SUP相比TLR31型晶体，DNTLR34型/支持TLR31型晶体需要额外的添加剂苯酚，并且需要更长的时间才能出现（一周对两天）。
冷冻电镜网格制备和图像采集
将 10 μL 体积的 1 nm 和 1 nm 大单层囊泡 （LUV） 的 400：800 混合物在室温下与 NEC60-SE10 混合，该混合物由 10% POPC/10% POPS/5% POPE/5% 胆固醇/19% Ni-DGS [如前所述制备 [220]] 制成TLR31型-他8最终蛋白浓度为 1 mg/mL。孵育 15 分钟后，将 3 μL 样品施加到辉光放电 （45 秒） Quantifoil （2/2;电子显微镜科学）网格。以6印迹力在两侧吸干网格0秒，并立即通过浸入液氮冷却的液态乙烷（Vitrobot）中冷冻玻璃化，然后储存在液氮中。使用冷冻支架（Gatan）（布兰迪斯大学电子显微镜设施）将网格加载到带有FEG和Compustage的Tecnai F20透射电子显微镜（FEI）中，该显微镜配备了Gatan Oneview CMOS相机。显微镜在200 keV的低剂量模式下使用SerialEM操作。以 19,000 倍（像素尺寸：5.6 nm）放大倍率和 -4 μm 的散焦记录图像。使用ImageJ [50]显示图像。
CryoET 网格准备
将体积为 10 μL 的 1 nm 和 1 nm 大单层囊泡 （LUV） 的 400：800 混合物与 WT-NEC3、NEC-SUP 在冰上混合TLR31型或 NEC-DNTLR34型/支持TLR31型，每种最终蛋白质浓度为 1 mg/mL。孵育 30 分钟后，将样品与 5 nm 基准金珠混合，并将 3 μL 样品施加到辉光放电 （30 s） Lacey 碳网格上制备 cryoET 网格（电子显微镜科学）。以 6 印迹力在两侧印迹网格 0 秒，并使用 FEI Mark IV Vitrobot 冷冻样品柱塞将栅极速冻入液氮冷却的液态乙烷中，立即玻璃化。将玻璃化的冷冻ET网格储存在液氮杜瓦瓶中直至使用。
CryoET 数据收集和断层扫描重建
Tilt系列在加州纳米系统研究所（CNSI）的Titan Krios电子显微镜上收集。数据收集参数列在 S11 表中。在配备Gatan成像滤光片（GIF）和后GIF后K51直接电子检测器的Titan Krios仪器中使用SerialEM [3]在电子计数模式下收集Tilt系列。原始倾斜系列的每部电影中的帧都进行了对齐、漂移校正，并使用Motioncor2进行了平均[51]。使用IMOD软件包[3]对齐倾斜系列显微照片并将其重建为52D断层图，然后通过IsoNet [53]校正缺失楔形图以进行颗粒拾取。
亚断层扫描平均
NEC六边形涂层的曲率变化使得难以识别颗粒拾取所需的六边形重复单元。为了克服这个问题，使用源自电子断层扫描粒子估计（PEET）软件[54]的Python脚本进行粒子拾取。首先，如前所述[55]，通过手动拾取~100个颗粒并使用PEET进行子断层图平均，生成初始模型。这样就可以精确测量NEC晶格的六边形几何参数，包括重复距离和方向。其次，对于每个断层扫描，手动挑选一小部分颗粒作为“种子”颗粒，稀疏地覆盖所有含有NEC的区域。然后，根据上面获得的六边形几何形状，通过在每个已知粒子附近添加未知粒子来扩展“种子”粒子集。对膨胀的颗粒进行PEET对齐，以匹配局部构象变化。最后，迭代进行粒子集展开和PEET对齐，得到完整的粒子集。相邻粒子少于三个的粒子被排除在最终粒子集之外，以去除异常值。最终粒子组的坐标和方向被格式化并导入到Relion[56]中进行进一步处理。在 bin3 像素大小下进行一轮 4D 细化，在 bin3 像素大小下进行几轮 2D 细化和分类，以及重复删除，得出最终的掩膜分辨率：WT NEC （5.9 ?），NEC-DNTLR34型/支持TLR31型（5.4 ?） 和 NEC-SUPTLR31型（13.1 安）。上述平均结构的分辨率基于“黄金标准”细化程序和 0.143 傅里叶壳相关 （FSC） 标准（S5 图）。
3D 可视化
UCSF ChimeraX [57] 用于可视化生成的三维子断层图平均值、密度图的分割以及 NEC 不同组件的表面渲染。
支持信息
本研究中介绍的用于反式互补测定的 Hep-31 细胞中 WT UL34、WT UL2 和相应突变蛋白的表达水平。
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矢量（无UL34）UL34 WT认证D35A型TLR34型/E37ATLR3型4K13型7一个TLR34型/R139ATLR34型D35A型TLR34型E3系列7一个TLR34型T123型QTLR34型K137型一个TLR34型R139安培TLR34型未转染TLR31型WTR229L型TLR31型E153R型TLR31型F252Y型TLR31型F252Y型TLR31型/R229LTLR31型E153R型TLR31型/R229LTLR31型钙联接蛋白pUL31-旗补充的数字S1.表达水平之WT型UL认证31,WT型UL认证34和相应突变体蛋白质在肝炎-2细胞使用为反式互补检测提出在这研究.肝炎-2细胞是转染跟也野生-类型或突变体UL认证34（一）或UL认证31-旗（二）质 粒以后由感染跟这相应零病毒.后孵化细胞是收获裂解，和分析通过西方杂交跟这相应抗体.副总裁5和钙联接蛋白蛋白质是使用如阳性控制.一个bTLR31型-旗TLR34型
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S1 图。 本研究中介绍的用于反式互补测定的 Hep-31 细胞中 WT UL34、WT UL2 和相应突变蛋白的表达水平。
Hep-2 细胞用野生型或突变型 UL34 （a） 或 UL31-FLAG （b） 质粒转染，然后感染相应的无效病毒。孵育后，收获、裂解细胞，并用相应的抗体通过蛋白质印迹分析。VP5和钙联接蛋白作为阳性对照。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s001
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S2 图。 SDS-PAGE分析来自体积排阻色谱（Superdex S75）的馏分。
a） NEC-R139A型TLR34型，b） NEC-K137ATLR34型和 c） NEC-K137ATLR34型/R139ATLR34型.含有等摩尔量的 UL31 和 UL34（蓝色）、不等量的 UL31 和 UL34（绿色）以及游离 UL34（品红色）的馏分装箱。仅将含有等摩尔量的UL31和UL34（蓝色）的馏分合并用于下游研究。UL31 为 ~34 kDa，UL34 为 ~25 kDa。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s002
（PDF格式）
S3 图。 尺寸排阻色谱（S75）馏分的SDS-PAGE分析。
a） NEC-K137ATLR34型/支持TLR31型及 b） NEC-K137ATLR34型/R139ATLR34型/支持TLR31型.含有等摩尔量的 UL31 和 UL34（蓝色）、不等量的 UL31 和 UL34（绿色）以及游离 UL34（品红色）的馏分装箱。仅将含有等摩尔量的UL31和UL34（蓝色）的馏分合并用于下游研究。UL31 为 ~34 kDa，UL34 为 ~25 kDa。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s003
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S4 图。 六个突变体 NEC-SUPTLR31型异二聚体彼此相似，与WT NEC异二聚体相似。
a） WT NEC的二级结构覆盖层血型和WT NEC光盘到六个 NEC-SUPTLR31型异二聚体。彩色圆圈表示 UL31 中的可变区域：aa 194–198（绿色）、129–134（桃色）和 261–268（深紫色）。浅紫色圆圈表示在 NEC-SUP 中分离的其他 UL34 C 端残基 （aa 175–178）TLR31型在WT NEC结构中未解析的异二聚体。b） WT-NEC的晶体结构外商直接投资NEC-SUP的光盘、NEC-SUP英 孚、NEC-SUP生长激素、NEC-SUPIJ和 NEC-SUP吉隆坡异二聚体。WT-NEC公司血型和 NEC-SUP血型如图 7 所示。R229 在 WT NEC 中的位置或 L229 在 NEC-SUP 中的位置以洋红色显示。UL31/UL34球状界面处的残留物以蓝色显示。插图显示了动态循环的已分辨部分 129TLR31型-134TLR31型和 261TLR31型-268TLR31型分别呈桃红色和深紫色。HSV-1 NEC晶体结构（PDB：4ZXS）用于生成a）和b）中的图。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s004
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S5 图。 NEC晶格的断层扫描平均值的方向傅里叶壳相关（FCS）曲线。
a） WT NEC，b） NEC-SUPTLR31型和 c） NEC-DNTLR34型/支持TLR31型.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s005
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S1 表。 本研究中用于 WT 和突变 NEC 涂层的 cryoET 数据收集和处理的条件。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s006
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S2 表。 NEC185Δ50-SUP的数据收集和改进统计TLR31型和 NEC185Δ50-DNTLR34型/支持TLR31型晶体结构。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s007
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S3 表。 WT NEC 中参与六聚体相互作用的残基A/B（共客）， WT NECC/D和 NEC-SUPTLR31型格。
使用PDBePISA分析了UL31和UL34（蓝绿色阴影的盒子）之间以及UL34和UL34（深绿色阴影的盒子）之间的界面[1]。结构中未分离的残基表示为 NR。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s008
（PDF格式）
S4 表。 NEC-SUP内六聚体界面处残留物的保存TLR31型相对于 WT NEC 的晶格一个/B和WT NECC/D格。
使用PDBePISA分析[1]分析界面。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s009
（PDF格式）
S5 表。 NEC-SUP内六聚体间界面残留物的保存TLR31型相对于 WT NEC 的晶格一个/B和WT NECC/D格。
使用PDBePISA分析[1]测定界面残基。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s010
（PDF格式）
S6 表。 WT NEC 中参与六聚体间（三聚体）相互作用的残基一个/B， WT NECC/D和 NEC-SUPTLR31型格。
使用PDBePISA分析界面残基（浅橙色阴影的框）[1]。结构中未分离的残基表示为 NR。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s011
（PDF格式）
S7 表。 参与 WT NEC 中六聚体间（二聚体）相互作用的残基A/B（共客）， WT NECC/D和 NEC-SUPTLR31型格。
界面残留物以浅橙色（二聚体 1：UL31/UL31 和 UL34/UL34）和深橙色（二聚体 2：UL31/UL31）着色。使用PDBePISA分析[1]分析界面。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s012
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S8 表。 NEC34Δ31-SUP 中每条 UL185（顶部）和 UL50（底部）链的分离残基TLR31型晶体结构。
每条链都列出了已分离的残基以及已分离的百分比。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s013
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S9 表。 非对称单元中 NEC-SUPUL31异二聚体的结构排列。
UL31/UL34 异二聚体以及单独的 UL34 和 UL31 链对齐。RMSD值（?）使用WinCoot [1]中的“SSM叠加”计算。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s014
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S10 表。 WT NEC 中参与异二聚体相互作用的残基A/B（共客）， WT NECC/D和 NEC-SUPTLR31型异二聚体。
使用PDBePISA分析[31]分析了异二聚体UL34/UL1界面、钩形界面（浅绿色阴影框）和球状界面（蓝色阴影框）。结构中未分离的残基表示为 NR。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s015
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S11 表。 NEC-SUP的结构对齐TLR31型前往文晔NEC一个/B和WT NECC/D异二聚体。
NEC-SUPTLR31型异二聚体和单个 UL34 和 UL31 链与两个 WT NEC 异二聚体和相应的 WT 单个链对齐。RMSD （?） 值是使用 WinCoot [1] 中的“SSM 叠加”报告和计算的。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s016
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S12 表。 六聚体界面处的埋藏表面积。
PDBePISA分析[1]用于计算WT NEC内六聚体界面（UL31/UL34或UL34/UL34之间）的埋藏表面积血型， WT NEC光盘和 NEC-SUPTLR31型格。通过将UL31/UL34和UL34/UL34表面积相加来计算六聚体界面处的总埋藏表面积。对于WT NEC，使用了RSCB PDB 4ZXS结构。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s017
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S13 表。 WT NEC 和 NEC-SUP 的接触比较TLR31型晶格六聚体界面。
使用PDBePISA分析了六聚体界面（蓝色阴影）处异二聚体之间的原子接触（氢键或盐桥）[1]。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s018
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S14 表。 六聚体间界面处的埋藏表面积。
PDBePISA分析[1]用于计算WT NEC内六聚体间界面（UL31三聚体或UL31二聚体之间）的埋藏表面积血型， WT NEC光盘和 NEC-SUPTLR31型突变晶格。通过在三聚体内添加UL31/UL31表面积来计算三聚体界面处的总埋表面积。对于WT NEC，使用了RCSB PDB 4ZXS结构。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s019
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S15 表。 WT NEC 和 NEC-SUP 中六聚体间界面的接触比较TLR31型格。
使用PDBePISA [1]分析了六聚体间界面（蓝色阴影）处异二聚体之间的原子接触（氢键或盐桥）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s020
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S16 表。 UL31 和 UL34 之间的球状、钩形和总异二聚体界面的埋界面表面积。
PDBePISA分析[1]用于计算WT NEC内球状、钩状和总异二聚体界面之间的埋藏表面积血型， WT NEC光盘和六个 NEC-SUPTLR31型异二聚体。在PDBePISA分析之前，通过删除UL31钩状区域（残基54-88）来确定球状界面区域。钩界面是通过从总异二聚体界面面积中减去球状面积来确定的。从整个晶体结构计算出总异二聚体界面面积。对于WT NEC，使用了RSCB PDB 4ZXS结构。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s021
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S17 表。 材料和方法中描述的用于克隆程序的引物列表。
所有引物均按5'-3'方向列出。限制性位点用下划线标出，突变以粗体标出。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s022
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S18 表。 用于创建本研究中使用的NEC构建体的质粒列表，以前未描述。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s023
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S1 数据。 用于生成图 1–4 的数据的源文件。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011936.s024
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确认
我们感谢 Janna Bigalke（塔夫茨大学）克隆了 SUPTLR31型、SE6TLR31型和 UL34 15–185 结构;Xuanzong Guo（塔夫茨大学）克隆UL31Δ50–306 SUP质粒并纯化NEC-R139ATLR34型/支持TLR31型和 NEC-D35ATLR34型/支持TLR31型构建。我们还要感谢NE-CAT（高级光子源）的工作人员在收集X射线衍射数据方面的帮助;Peter Cherepanov（弗朗西斯·克里克研究所）赠送了GST-PreScission蛋白酶表达质粒;以及麻省理工学院的Thomas Schwartz，以表彰LoBSTr细胞的礼物。我们感谢Rob Jackson（塔夫茨大学医学院）和Martin Hunter（马萨诸塞大学工程学院）在荧光显微镜实验方面的帮助。共聚焦显微镜在塔夫茨大学医学院神经科学研究中心的成像和细胞分析核心设施进行，该设施得到了 NIH 资助 P30 NS047243 （Rob Jackson） 的支持。CryoEM 样品在布兰代斯电子显微镜设施制备和成像。这项工作基于东北协作接入团队光束线进行的研究，该光束线由美国国立卫生研究院（P30 GM124165）的国立普通医学科学研究所资助。16-ID-E光束线上的艾格峰24M探测器由NIH-ORIP HEI资助（S10OD021527）。这项研究使用了先进光子源的资源;美国能源部 （DOE） 科学用户设施办公室，由阿贡国家实验室根据 Contract No.DE-AC02-06CH11357型所有软件均由SBGrid安装和维护[58]。
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