免费医学论文发表-流产裂解周期通过募集单核细胞并调节其定向分化来促进鼻咽癌进展
抽象
EB 病毒 （EBV） 与多种类型的人类癌症有关，包括鼻咽癌 （NPC）。在晚期鼻咽癌中观察到EBV对裂解周期的激活，并被认为有助于晚期鼻咽癌的发展。然而，EBV裂解周期如何促进鼻咽癌进展仍然难以捉摸。临床鼻咽癌标本分析表明，晚期鼻咽癌标本中存在EBV再激活和免疫抑制，血管生成和侵袭性异常。为了研究EBV裂解周期在肿瘤发展中的作用，我们建立了一个由两个NPC细胞系组成的系统，分别在EBV流产裂解周期和潜伏期。在使用该系统的比较分析中，我们发现，与EBV阴性或EBV潜伏期的NPC细胞相比，EBV流产裂解周期中的NPC细胞系表现出卓越的趋化能力，可以募集单核细胞，并将其分化为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）样表型并远离DC。EBV 编码的转录激活因子 ZTA 负责通过上调 GM-CSF、IL-8 和 GRO-α 的表达来调节单核细胞趋化性和 TAM 表型。因此，EBV流产裂解周期诱导的TAM促进鼻咽癌血管生成、侵袭和迁移。总体而言，本研究阐明了EBV溶解生命周期在鼻咽癌晚期发展中的作用，并揭示了ZTA介导的肿瘤微环境（TME）建立促进鼻咽癌晚期进展的机制。
作者摘要
最近越来越多的证据表明，某些癌病毒的裂解生命周期有助于肿瘤发生。这与传统观点相反，即病毒相关的肿瘤主要归因于肿瘤病毒的潜伏周期，而不是裂解期，因为裂解病毒通常会导致宿主细胞的裂解和死亡。然而，病毒裂解周期在肿瘤发生中的矛盾作用仍然难以捉摸。在目前的研究中，我们研究了EBV裂解循环在鼻咽癌发展中的作用。在方法学上取得了突破，使我们能够建立EBV流产裂解期细胞模型，我们分别比较了潜伏期和流产期的NPC细胞，发现EBV流产裂解周期中的NPC细胞表现出卓越的趋化能力，可以募集单核细胞，并将其分化向TAM样表型并远离DCs。因此，EBV流产裂解周期诱导的TAM促进鼻咽癌血管生成、侵袭和迁移。我们的研究揭示了EBV裂解生命周期在鼻咽癌发育中的作用，鼻咽癌调节单核细胞以创造促进肿瘤的微环境，以及对治疗鼻咽癌晚期患者的新治疗策略的可能意义。
数字
Fig 7Fig 8图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8图1图2图3
引文： Xu X， Zhu N， Zheng J， Peng Y， Zeng M-S， 邓 K， et al. （2024） EBV流产裂解周期通过募集单核细胞并调节其定向分化来促进鼻咽癌进展。PLoS 病理学 20（1）： e1011934 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934
编辑 器： Benjamin E. Gewurz，美国布莱根妇女医院
收到： 16年2023月1日;接受： 2024年11月2024日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2024 Xu et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有数据都在手稿和支持信息文件中。
资金： 这项工作得到了国家自然科学基金（第81530069号、第81772177号）的支持。 此外，C.D在研究期间还报告了科学技术部（No.2020YFC2004505）、广东省自然科学基金（No.2020A1515011467）和广州市科学技术计划项目（No.202002030149）的资助。其他作者没有报告任何披露。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
EB病毒（EBV）是一种无处不在的人类病毒，感染了全球90%的人口。它是第一种被发现的人类肿瘤病毒，已知与多种类型的人类癌症有关，包括伯基特淋巴瘤（Burkitt's lymphoma， BL）、霍奇金淋巴瘤（hodgkin's lymphoma， HL）、鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）和胃癌（gastric carcinoma， GC）的一个亚群[1]。鼻咽癌是我国南方地区发病率较高的地方病[2]。
EBV的生命周期由裂解期和潜伏期组成[3]。鼻咽癌细胞中的EBV感染主要是潜伏的。对感染 EBV 的 NPC 细胞中的病毒基因表达的检查显示，具有代表性的 II 型潜伏性 EBV 感染，其表达 EBNA1、LMP1、LMP2A、两个小 RNA 和 BART 转录本。几十年来，人们一直在深入研究这些潜伏基因在致癌过程中的作用[4,5]。尽管长期以来人们一直认为EBV裂解周期不会促进肿瘤发生，因为裂解周期通常会导致宿主细胞的裂解和死亡，但如今，裂解周期和一些病毒裂解蛋白也被认为对肿瘤的发生和进展至关重要[3]。一项EBV转录组研究显示，EBV裂解基因与细胞癌相关通路共表达[6]。在鼻咽癌活检中发现EBV裂解循环[7]。EBV裂解循环和裂解蛋白在肿瘤发生中的矛盾作用仍然难以捉摸，但一种可能性是，一些裂解蛋白在传统裂解周期之外表达，这允许特定的裂解基因在没有完全裂解复制的情况下表达，从而导致病毒粒子的产生。这被称为流产性溶解循环[8,9]。这一观点得到了观察结果的支持，即在一小部分鼻咽癌细胞中检测到EBV裂解基因，通常是即时早期和早期基因，但缺乏晚期基因，尤其是那些编码晚期结构蛋白的基因，因此无法产生新的病毒粒子或引起细胞裂解。EBV在感染细胞后也具有较短的潜伏前流产溶解周期[10]。流产性溶解周期在EBV相关癌症中的生物学意义仍有待探索。
EBV相关鼻咽癌的另一个常见特征是白细胞大量浸润，尤其是晚期鼻咽癌[11]。肿瘤浸润的白细胞与EBV感染的鼻咽癌细胞共存，代表了一种独特的肿瘤微环境（TME），使肿瘤免疫逃避并促进鼻咽癌进展[11]。研究表明，EBV改变宿主细胞信号传导，促进肿瘤在细胞内发展[12]，EBV感染的癌细胞通过细胞间分泌细胞因子和趋化因子与基质细胞进行通讯，以抑制免疫监视并增强转移[13]。EBV感染使鼻咽癌细胞在TME体内具有生长优势[14]。在TME中，肿瘤免疫起始涉及通过专业抗原呈递细胞（APC）捕获和处理肿瘤抗原，以发挥细胞毒性抗肿瘤作用[15]。实体瘤中的APC主要是树突状细胞（DC）和巨噬细胞（Mφ），它们来源于循环血单核细胞迁移到组织并分化为常驻组织单核细胞来源的巨噬细胞[16]和单核细胞来源的DCs[17]。树突状细胞作为特化的抗原呈递细胞，可以特异性激活T细胞，启动抗肿瘤免疫。在鼻咽癌中，成熟DC与淋巴细胞浸润丰度呈正相关[18]。巨噬细胞可进一步分化为促炎型 M1 型或抗炎型 M2，后者在 TME 中被认为是肿瘤相关巨噬细胞 （TAM）。TAM具有促进癌细胞增殖、免疫抑制和血管生成的能力，以支持肿瘤生长和转移[19]。肿瘤中TAM的丰度通常与预后不良有关。在实体瘤中，TME促进单核细胞优先产生免疫抑制TAM和抑制DC，从而促进肿瘤进展和免疫逃逸[16,20]。尽管如此，鼻咽癌的分子基础在很大程度上是未知的。
鼻咽癌的远处转移伴血管生成是鼻咽癌死亡的主要原因之一，21/22的患者发生转移[<>]。据信，肿瘤血管生成导致肿瘤细胞进入血液循环，并在肿瘤进展和转移中起重要作用[<>]。因此，阐明鼻咽癌血管生成和转移的机制至关重要。在目前的研究中，我们试图研究EBV对形成独特TME的贡献，该TME被认为在支持患者鼻咽癌细胞的生长和进展中起着至关重要的作用。我们发现EBV的流产裂解周期可以特异性地募集单核细胞并将其分化为TAMs，从而促进鼻咽癌的血管生成和转移。
结果
EBV裂解基因表达与晚期鼻咽癌和免疫抑制有关
最近的转录组测序分析显示，在一些鼻咽癌细胞中，EBV基因组的表达不仅限于II型潜伏期，还表达III型潜伏期和裂解基因[23]。裂解基因在鼻咽癌发病机制中表达的意义尚不清楚。为了解决这个问题，我们分析了在不同TNM（肿瘤-淋巴结-转移）阶段诊断的46个鼻咽癌临床样本的转录谱。NPC51、53、1 处于 T2 或 T844 期，被认为是早期肿瘤，而 SRR757、764、52、NPC66 和 3 处于 T4 或 T507799 期，被认为是晚期肿瘤。当从这些鼻咽癌肿瘤中获得的RNA-Seq读段与EBV基因组（GenBank：AJ2.1）对齐，并通过病毒基因组中EBV转录本RPKMs（每千碱基每百万个映射读段的reads）的热图可视化时，发现在早期鼻咽癌样本中，EBV主要处于潜伏期，而在晚期鼻咽癌样本中， EBV裂解基因高表达，表明随着鼻咽癌从早期发展到晚期，EBV基因表达由潜伏期转为裂解期（图24A）。这一发现与既往一项临床统计研究一致，即鼻咽癌患者的血浆EBV-DNA拷贝数与TNM分期呈正相关[<>]。
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图 1. EBV裂解基因表达与晚期鼻咽癌和免疫抑制有关。
（A） 热图显示了不同TNM阶段的鼻咽癌样本中EBV基因的相对表达谱。通过完全连锁聚类进行基因（x轴）和鼻咽癌样本（y轴）的无监督聚类。（B）显示早期鼻咽癌样本和晚期鼻咽癌样本之间差异表达基因的热图。RNA-seq reads与hg19/GRCh37人类参考基因组比对，并在标准缩放上可视化。（三）采用DAVID-KEGG分析晚期鼻咽癌中下调的基因。显示前 10 条富集信号通路（横坐标为 -log10（P 值）;纵坐标为通路名称）。（D） 通过Metascape在晚期鼻咽癌中下调的基因的聚类网络图。颜色的深邃代表对途径或生物过程的富集。
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通过分析与EBV基因表达模式和鼻咽癌分期相对应的宿主转录组变化，探究不同EBV对鼻咽癌细胞表达谱的生物学意义。这些 NPC 样本的正确过滤和标准化 RNA-Seq reads 与人类基因组 （hg19/GRCh37） 比对。采用差异表达基因（DEGs）双尾T检验分析早期NPCs（NPC46、NPC51和NPC53）和晚期NPC（SRR844、SRR764、NPC66、SRR757和NPC52）各基因的RPKM。该分析鉴定了 1721 个早期与晚期 NPC 的差异表达基因。这些基因在标准缩放上可视化，其中1229个基因在晚期鼻咽癌样本中下调，492个基因在晚期鼻咽癌中与早期鼻咽癌相比上调（图1B）。对晚期鼻咽癌中1229个下调的DEGs进行DAVID KEGG通路分析和METASCAPE基因富集分析，鉴定富集基因集和信号通路。有趣的是，在早期和晚期鼻咽癌之间改变通路的富集列表中，免疫系统的调节术语排名第一，抗原呈递相关的信号通路在列表中排名第一。结果表明，抗原呈递信号通路在晚期鼻咽癌中下调或失活（图1C和1D）。
具有EBV流产裂解周期的鼻咽癌细胞表现出增强的趋化性能力，以募集单核细胞
RNA-Seq转录组研究表明，EBV裂解或流产的裂解复制发生在晚期鼻咽癌中，晚期肿瘤与显著的免疫抑制有关。现在的问题是EBV裂解周期（或流产裂解周期）是否有助于免疫抑制。为了解决这个问题，我们试图建立一个体外模型来概括细胞中裂解周期相关的免疫抑制过程。由于缺乏处于稳定流产裂解期的EBV阳性NPC细胞系，我们使用了两种感染EBV的NPC细胞系，但EBV分别处于短暂的潜伏前流产裂解期和潜伏期。通过将EBV阴性的CNE2与EBV阳性的Akata-BL细胞共培养，然后选择G418，选择7天来产生这样一对细胞系[25,26]。在EBV-BXLF1开放阅读框中插入GFP标签，使其在裂解循环中表达，但在EBV进入潜伏期后不再表达。在感染EBV后的第7天，89.3%的CNE2细胞表达高水平的GFP荧光素，表明细胞中的EBV处于短暂的潜伏前流产裂解周期。相比之下，在第 14 天，只有 11.7% 的 CNE2 表达弱 GFP，表明大多数 CNE2 细胞中的 EBV 已进入潜伏期（图 2A）。为了验证第 7 天和第 14 天 EBV 的阶段，我们通过蛋白质印迹检查了 ZTA（Z 转录激活因子）的表达（图 2B）。EBER1（Epstein-Barr编码的小RNA）是一种由EBV组成型表达的非编码小RNA，在EBV的整个潜伏期和裂解周期中连续转录。逆转录PCR（RT-PCR）检测EBV感染的CNE1细胞中EBER2的表达，以确认EBV的持久性（图2C）。Western blot和RT-PCR结果证明，EBV感染的CNE2细胞在第7天处于流产裂解期（ZTA/EBER1），在第1天处于潜伏期（ZTA/EBER14）。我们也用相同的方法感染了HK-1，并观察到类似的结果。HK-1在EBV感染后第7天处于流产的裂解周期，在EBV感染后第14天进入潜伏期（S1A–S1C图）。在 S1A 和 S2B 中定量 CNE1 和 HK-2 中 ZTA 和 EBER2 的表达 图 。以热图形式呈现了 CNE-EBV+D7 和 D14 中 EBV 基因表达的全谱图（S2C 图）。++-+
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图 2. EBV流产裂解期的CNE2细胞表现出增强的单核细胞趋化性能力。
（A） GFP流式细胞术呈现EBVCNE2-Day7和-Day14中EBV期的切换。（B） Western blotting分析ZTA在EBVCNE2-Day7和-Day14中的表达水平。（C） EBER1 表达水平通过逆转录 PCR 进行定量。（D） CNE2 在不同 EBV 期募集的免疫细胞数量 （n = 4）。（E）实时荧光定量PCR检测细胞因子mRNA水平变化趋势（n = 3）。数据以平均值±SEM. * P < 0 表示。05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，NS，不重要。++
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.g002
利用EBV流产的裂解/潜伏性CNE2细胞系统，我们建立了Transwell PBMC募集试验，以探索EBV裂解周期对免疫细胞趋化性的影响。潜伏EBVCNE2和流产的裂解EBVCNE2接种在Transwell的下腔室中，并将人外周血单核细胞（PBMC）加入Transwell插入物中。24小时后，收集募集到下腔室的免疫细胞，并通过流式细胞术进行分析，以确定每种类型的比例（图2D）。结果显示，免疫细胞对潜伏和裂解EBVCNE2的反应具有不同的趋化性模式。最突出的特征是，与 CNE2-EBVDay7 和 EBV 阴性的 CNE14 相比，CNE2-EBVDay14 细胞导致更多的 CD2 单核细胞趋化地向下腔室迁移（图 2E）。此外，为了完全规避EBV特异性T细胞的可能影响，我们使用永生化的人单核细胞系THP-1进行趋化性测定。如图3A所示，CNE2-D7明显促进了THP-1的迁移。++++++
采用实时荧光定量PCR技术比较流产性裂解性EBVCNE2-Day7和潜伏性EBVCNE2-Day14中趋化因子、炎症和生长因子的表达。结果表明，与CNE8-EBVDay2相比，CNE7-EBVDay2中GM-CSF、GRO-α和IL-14的细胞因子增加最显著（图2F）。众所周知，这些细胞因子和趋化因子在单核细胞分化和趋化性中起着至关重要的作用。GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）调节单核细胞分化为树突[27]或巨噬细胞[28]。另一方面，IL-8（白细胞介素-8，也称为CXCL8）[29]和GRO-α（人类生长调节癌基因α，也称为CXCL1）[30]对单核细胞来源的细胞具有趋化作用。因此，EBV流产裂解周期显然具有促进这些细胞因子表达、募集单核细胞和调节单核细胞分化的作用。EBV感染第1天的HK-7也增强了单核细胞募集的能力，单核细胞相关细胞因子的表达显著增加（S4A和S4B图）。综上所述，流产性裂解性EBV的鼻咽癌细胞表现出通过表达特定细胞因子特异性募集单核细胞的趋化能力。++++
EBV流产裂解周期中的NPC细胞调节单核细胞向TAM样表型分化
单核细胞是在血液中循环的髓系细胞，可被炎症因子募集到炎症部位，并根据炎症部位的微环境分化为巨噬细胞或树突状细胞[16]。在显示具有EBV流产裂解周期的NPC细胞募集单核细胞后，我们询问EBV流产裂解周期是否会影响单核细胞分化为DC或Mφs。为了解决这个问题，建立了两个允许单核细胞分化为DC和Mφs的系统，并用于测定鼻咽癌与EBV裂解期影响下的分化。首先，从人PBMC中分离的单核细胞（CD14/CD1a-）在含有GM-CSF和IL-1640的RPMI 4完全培养基中培养，这使得单核细胞从规则和均匀的球形细胞变为不规则的树突状细胞悬浮集落（CD14-/CD1a）[31]（图3A）。然后，将潜伏性EBVCNE2或流产性裂解性EBVCNE2的条件培养基（CM）分别加入到系统中。通过流式细胞术监测 DC 表面标志物表达的变化来确定这些 CM 对 DC 分化的影响。结果显示，与CNE2-EBV CM相比，CNE7-EBVDay2的CM显著降低了DCs的比例，而CNE2-EBV CM对DC分化无显著影响;而 CNE14-EBV Day3 的 CM 对 DC 分化的影响较弱（图 2B）。在CNE7-EBVDay14的CM治疗组中，部分单核细胞恢复了CD68的高表达，CD32的表达同时上调，我们将其视为DC衍生的巨噬细胞（DC-d-Ms）[14]，并提示EBV裂解周期增加了DC-d-Ms（CD68/CD2）的比例。相比之下，在CNE2-EBV组和CNE14-EBVDay3组中没有观察到这种现象（图2C）。综上所述，流产性裂解性EBV的CNE<>可以逆转单核细胞向DC的分化，进而促进部分DC向巨噬细胞样表型的转化，降低DC的产量。+++++-++++-+
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图 3. EBV流产裂解期的CNE2细胞促进单核细胞向TAM样表型分化，远离DCs。
（A） DC分化过程中细胞形态和细胞表面标志物的变化。比例尺，50μm。（B）和（C）采用不同EBV生命周期的CNE2上清液治疗DC。通过CD14&CD1a表达谱检查DCs产量的差异。通过CD14&CD68表达谱（n = 4）检查DC-d-Ms的比例。（D）Mφs分化过程中细胞形态和细胞表面标志物的变化。比例尺，50μm。（E）采用不同EBV生命周期的CNE2上清液处理Mφs，通过检测CD1和CD2确定M86和M163亚型的比例（n=4）。数据以平均值±SEM. * P < 0 表示。05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，NS，不重要。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.g003
其次，M-CSF可诱导单核细胞（CD14/CD68-）分化为Mφs（CD14/CD68）[33]，其大小增加并表现为不规则伪足（图3D）。巨噬细胞被脂多糖（LPS）激活，巨噬细胞亚型分化由CNE2的CM诱导。48小时后，获得不同比例的M1和M2巨噬细胞。M1（CD86 CD163-）是一种具有抗肿瘤活性的促炎表型，而M2（CD86-CD163）是一种免疫抑制细胞类型，被认为在实体瘤中具有TAMs（肿瘤相关巨噬细胞）表型，可促进肿瘤进展[34]。我们发现，与 CNE2-EBV 和 CNE7-EBVDay1 的 CM 相比，CNE2-EBVDay2 的 CM 显着降低了 M2 的比例，更重要的是，诱导了 M14 巨噬细胞分化（图 3E）。综上所述，我们验证了流产裂解性 EBV 的 CNE2 的 CM 在促进单核细胞向 TAM 样表型分化和远离 DC 方面表现出卓越的能力。HK-1-EBVDay7的CM显示出类似的功能（S4C-S4E图）。++++++-++
ZTA是EBV流产裂解周期调节单核细胞的病毒机制
我们发现 GM-CSF、GRO-α 和 IL-8 在流产裂解EBVCNE2中上调，并推测 EBV 流产裂解周期通过上调这些单核细胞相关细胞因子来调节单核细胞。因此，我们试图鉴定调节这些单核细胞相关细胞因子表达的病毒基因。EBV的流产裂解期表达一系列即刻-早期和早期裂解基因[23]。我们选择了鼻咽癌中常见的1个溶解基因进行研究：BZLF1（ZTA）、BRLF3（RTA）、BALF4、BALF5、BALF1、BILF1、LF2和LF2。将这些病毒基因的表达载体导入CNE8细胞，并通过实时荧光定量PCR分析单核细胞相关细胞因子表达的变化。结果显示，瞬时转染 ZTA 可使 GM-CSF、IL-4 和 GRO-α 的表达增加多达 <> 至 <> 倍（图 <>A）。+
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图 4. ZTA 表现出募集和诱导单核细胞定向分化的能力。
（A） 在表达 EBV 裂解基因的 CNE8 细胞中，通过实时荧光定量 PCR 测定 GM-CSF、IL-2 和 GRO-α 的 mRNA 表达水平，如图所示 （n = 3）。（B） 经Western blot证实的CNE2细胞中ZTA的稳定表达。（C）细胞因子抗体阵列鉴定CNE2-ZTA和CNE2-CTR上清液之间细胞因子分泌的差异。（D） 通过 ELISA 测量每个 CNE8 衍生细胞系的上清液中 GM-CSF、IL-2 和 GRO-α 的浓度 （n = 3）。（E） CNE2-ZTA 和 CNE2-CTR 募集的免疫细胞数量 （n = 4）。（F）和（G）用CNE2-ZTA和CNE2-CTR的上清液处理后，通过CD14和CD1a表达谱检查DCs的产量差异，用CD14和CD68检查DC-d-Ms的比例（n=4）。（H） 通过检测 CD1&CD2 （n = 86） 确定 M163 和 M4 亚型的比例。（I）中和抗体用于阻断单核细胞向CNE2-ZTA的募集。通过流式细胞术测定CD14细胞的比例（n = 4）。（J）中和抗体用于阻断CNE2-ZTA诱导TAMs的能力。通过流式细胞术测定CD163细胞的比例（n = 4）。数据以平均值±SEM表示;* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，NS，不重要。++
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.g004
为了确定ZTA是否确实负责募集单核细胞并调节其分化，我们构建了一种稳定表达ZTA的CNE2细胞系。通过蛋白质印迹验证ZTA的表达（图4B）。测定表达 ZTA 的 CNE2 细胞系的细胞因子表达谱和单核细胞趋化性。细胞因子抗体阵列表明，CNE2-ZTA的细胞因子表达谱与流产裂解EBVCNE2非常相似，其中GM-CSF、IL-8和GRO-α显著上调（图4C）。为确认ZTA是细胞因子诱导和单核细胞趋化性的主要调节因子，采用ELISA法比较EBV流产裂解期和ZTA对CNE8细胞中GM-CSF、IL-2、GRO-α的调节作用。结果证实，ZTA和EBV裂解期均显著增加GM-CSF、IL-8和GRO-α的分泌（图4D）。+
在促进单核细胞募集和单核细胞分化方面，CNE2-ZTA对单核细胞分化表现出深远的趋化能力（图4E），显著减少DCs的产生，上调DC-d-MS的比例（图4F和4G）。此外，CNE2-ZTA的CM显著降低了Mφs分化系统中M1的比例，并使CD163TAMs的比例增加了一倍（图4H）。同样，ZTA在HK-1-EBV Day7中也显著上调（S5A图）。ZTA稳定表达的HK-1细胞可诱导单核细胞相关细胞因子的表达，促进单核细胞趋化性，并调节其向TAMs和远离DCs的分化（S5B-S5G图）。++
上述结果表明，鼻咽癌细胞中的ZTA诱导GM-CSF、IL-8和GRO-α的表达，这与之前报道的ZTA可以促进IL-8[35]和GM-CSF[36]的分泌一致。首次发现ZTA对GRO-α诱导的调控作用。为了确定每种细胞因子在随后的单核细胞趋化性和靶向分化中的功能，我们在 CNE2-ZTA 细胞的 Transwell 募集测定中使用了针对这些细胞因子的中和抗体。我们发现针对 IL-8 和 GRO-α 的中和抗体显着抑制了单核细胞对 CNE2-ZTA 的趋化性（图 4I）。此外，CNE2-ZTA CM能够诱导TAMs的分化，而添加针对GRO-α和GM-CSF的中和抗体可显著降低CD163TAMs的表达。IL-8中和抗体对CD163TAMs的分化没有明显影响（图4J）。中和抗体对DCs分化的影响不明显，因此ZTA抑制DC分化的机制有待进一步探讨。结果表明，ZTA通过IL-8和GRO-α促进单核细胞募集，而ZTA通过GRO-α和GM-CSF诱导TAMs分化。++
我们还采用了功能丧失方法来确认ZTA在调节单核细胞中的作用。CRISPR/Cas9介导的敲除用于建立ZTA缺陷EBVCNE2（CNE2-EBVSgZTA）[37]。ZTA敲除的效率由real-time PCR和Western测定（图5A和5B）。在无ZTA的情况下，GFP阳性CNE2的比例从94.9%下降到8.98%，而CNE1-EBVSgZTA组中EBER2的表达仅略有下降，证明在无ZTA的情况下，大部分EBV进入潜伏期而不是处于裂解期（图5C和5D）。然后，我们检查了 ZTA 敲除后 CNE2 调节单核细胞趋化性和分化的能力是否受到影响。我们发现（i）与CNE8-EBVSgCTR相比，CNE2-EBVSgZTA中GM-CSF、IL-2和GRO-α的表达显著降低（图5E和5F）;（ii）在Transwell募集实验中显示，CNE14-EBVSgZTA募集的CD2单核细胞比例降低（图5G）;（iii）与CNE2-EBVSgCTR的CM相比，CNE2-EBVSgZTA的CM导致DC的比例显着增加，DC-d-MS的比例降低（图5H和5I）。此外，CNE2-EBVSgCTR在CNE1-EBVSgZTA中失去了降低M2比值和增加M2比值的能力，M1和M2的比重恢复到正常水平（图5J）。在敲除ZTA的EBVHK-1细胞中也获得了类似的结果（S6A-S6J图）。综上所述，ZTA是EBV流产裂解周期调控单核细胞的病毒机制。++++++++++++
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图 5. ZTA敲除EBV失去了募集和极化单核细胞的能力。
（A） 和 （B） 通过测量 ZTA mRNA 表达 （n = 9） 以及 ZTA 蛋白水平来估计 CRISPR/Cas3 介导的 ZTA 敲除效率。（C） 通过RT-PCR定量敲除细胞和对照细胞中EBER1的表达水平。（D）流式细胞术检测ZTA缺失后EBVCNE2的GFP谱。（E）和（F）实时荧光定量PCR检测ZTA敲除细胞和对照EBVCNE8细胞中GM-CSF、IL-2、GRO-α的mRNA表达水平（n=3），ELISA检测上清液中GM-CSF、IL-8和GRO-α的mRNA表达水平（n=3）。（G） CNE2-EBVSgCTR 和 CNE2-EBVSgZTA 募集的免疫细胞数量 （n = 4）。（H）和（I）用CNE2-EBVSgCTR和CNE2-EBVSgZTA的上清液处理后，通过CD14和CD1a表达谱检测DCs的产量。通过 CD14 和 CD68 检查 DC-d-Ms 的比例 （n = 4）。（J） 通过 CD1 和 CD2 表达鉴定 M86 和 M163 比例 （n = 4）。数据以平均值±SEM. * P < 0 表示。05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，NS，不重要。++++++
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.g005
EBV流产裂解周期通过诱导TAMs分化促进鼻咽癌血管生成和侵袭
为探讨晚期鼻咽癌EBV溶解周期的临床意义，取患者采集临床标本，其中TNM早期6例，晚期1例，免疫组化分析。H&E染色显示，在晚期鼻咽癌中，肿瘤细胞深入黏膜下肌肉层，肿瘤组织结构相对疏松，具有许多腔隙结构（图163A）。另一方面，与早期鼻咽癌相比，晚期鼻咽癌的CD6a DC细胞浸润和CD6 TAMs浸润较低（图<>B和<>C），这验证了我们的结论，即溶解性或流产性溶解性EBV在促进单核细胞分化向TAM样表型和远离DCs方面表现出卓越的能力。++
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图 6. 晚期鼻咽癌样本中的EBV活化、TAM浸润和血管生成。
（A）临床鼻咽癌样本采用苏木精和伊红（H&E）染色（100X、400X）分析。（B） 和 （C） 显示 CD1a DC 和 CD163 TAM 的肿瘤代表性图像。用相应的抗体 （400X） 对细胞进行免疫染色。（D） 肿瘤的代表性图像显示 PAS（紫色）表达和 CD34 细胞（棕色）（400X）。黑色箭头表示经典血管生成 （PAS/CD34）。（E） 从医院信息系统获得的循环血浆中EBV-DNA滴度。（F） 在随机选择的 400X 场中使用 ImageJ 量化每个染色的阳性区域（每个样品 n = 3）。数据以平均值±SEM表示;* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，NS，不重要。+++++
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.g006
在晚期鼻咽癌中观察到的腔隙结构增加可能代表血管生成异常。CD34和PAS的双重染色证实了这一观点（CD34/PAS），确定了典型的血管生成[38]。CD34 标记血管生成尖端内皮样细胞，PAS（高碘酸-希夫染色）强调毛细血管基底膜。我们还观察到细胞在某些区域缺乏 CD34 标志物，但 PAS 呈阳性，表明血管模拟 （VM）。因此，在晚期鼻咽癌样本中观察到大量的新生血管生成，这在早期鼻咽癌样本中并不多见（图6D）。有些文章将EBV-DNA载量用作检测EBV裂解再激活的指标[39,40]。另一方面，抗ZEBRA（ZTA）IgG滴度最高与高病毒载量相关[41]。因此，我们选择EBV-DNA载量作为鼻咽癌患者EBV再激活程度的指标。循环血浆中的EBV滴度证实了晚期鼻咽癌样本中存在显着的EBV裂解激活（图6E），CD1a和CD163的阳性区域以及每个样本中的血管数量通过图J量化（图6F）。此外，我们使用Spearman秩相关检验来探索EBV-DNA负荷与TAM/血管密度之间的相关性。结果证明，较高的EBV滴度伴随着更强的TAM浸润和血管密度（S7图）。++
研究表明，TAMs在肿瘤组织中的浸润密度与肿瘤细胞增殖、血管密度和不良临床预后有关[42]。这促使我们询问，由于EBV流产的溶解周期导致的TAM浸润是否有助于鼻咽癌的血管生成和侵袭。我们假设晚期鼻咽癌样本中表现出的强侵袭性和血管生成与EBV裂解循环诱导的TAMs浸润有关。为了验证这一假设，我们分别使用 CNE2-EBV、CNE2-EBVDAY7 和 CNE2-EBVDAY14 的 CM 来诱导 M2 巨噬细胞分化。正如预期的那样，CNE2-EBVDAY7具有最强大的诱导TAMs分化的能力。然后，收集这些巨噬细胞的上清液（Mφ-CM），用于培养EBV阴性的CNE2。一周后，我们检查了这些 CNE2 在管形成、迁移和侵袭中的能力。结果表明，与CNE2-EBV和CNE2-EBVDAY7诱导Mφ的CM相比，在CNE2-EBVDAY2诱导的CM中培养的CNE14表现出显著增强的成管能力（图7A）。同样，Transwell迁移和侵袭试验也表明，EBV裂解循环诱导的TAM具有最强的致瘤能力，促进了NPC细胞的迁移和侵袭（图7B）。-++++-+
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图 7. EBV流产裂解循环诱导的TAMs促进鼻咽癌血管生成和侵袭。
（A） 不同基团的巨噬细胞上清液对体外基质凝胶管测定法分析的 CNE2 血管生成的影响 （n = 3）。（B） 不同组的巨噬细胞上清液对Transwell迁移试验和Transwell-Matrigel侵袭试验（每个样品n = 2）测定的CNE3细胞迁移和侵袭能力的影响。（C）至（E）通过苏木精和伊红（H&E）染色（100X）和血管免疫组织化学染色分析小鼠腹腔内的肿瘤异种移植物。呈现了显示 PAS（紫色）表达和 CD34 细胞（棕色）（400X）的肿瘤代表性图像。红色箭头表示VM通道（PAS/CD34-），黑色箭头表示经典血管生成（PAS/CD34）。在随机选择的视野中以 400 倍放大倍率（每个样品 n = 3）通过显微镜测定经典血管生成的定量。数据以平均值±SEM表示;* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，NS，不重要。++++
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.g007
为进一步验证EBV裂解循环在体内促进鼻咽癌血管生成和侵袭性的能力，将EBV阴性的CNE2和潜伏性EBV或流产性溶解性EBV的CNE2腹腔接种至C57 BL/6中。2 d后，将肿瘤异种移植物从腹腔内脂肪组织中分离出来，并通过免疫生物学分析进行分析。H&E染色显示，CNE7-EBVDAY2组肿瘤异种移植物呈现丰富的网状结构，提示CNE7-EBVDAY2肿瘤异种移植物脂肪组织中肿瘤细胞的侵袭和定植。CNE2-EBV组肿瘤异种移植结构致密，无网状结构;大多数细胞已经死亡，细胞核结构模糊而松散，只有少数活细胞在外边缘可见。CNE14-EBVDAY7组的肿瘤异种移植物表现出少量的网状结构（图2C）。H&E染色证实，流产性溶血性EBVCNE1形成的肿瘤表现出最强大的侵袭性。通过免疫组织化学染色分析ZTA和EBNA2，以确认这些异种移植物中的EBV生命周期，显示CNE7-EBVDAY1组中ZTA高表达，而EBNA8在每个EBV阳性异种移植物中均检测到（S<>图）。++-+++
通过对样本进行 CD34 和 PAS 双重染色来检查肿瘤异种移植物中的血管生成。结果表明，CNE2-EBVDAY7组肿瘤异种移植物具有大量的经典血管生成，表现为异种移植物中存在大量空隙（CD34/PAS），部分空腔内可见红细胞，而CNE2-EBV和CNE2-EBVDAY14组肿瘤异种移植物仅存在少量血管模拟（图7C）。ZTA过表达的CNE2也表现出最强大的血管生成和侵袭能力（图7D）。CNE2-EBV的血管生成能力在ZTA被敲除的CNE-EBVDAY7中减弱（图7E）。小鼠异种移植物的组织化学染色支持流产性溶解性EBV鼻咽癌表现出最强大的侵袭和血管生成能力的结论。+++-+++
综上所述，我们的研究结果证实了EBV流产裂解周期中的CNE2可以诱导TAMs分化，从而显著增强CNE2的侵袭和血管生成，从而促进肿瘤进展。
讨论
EB病毒的生命周期包括潜伏期和裂解期。II.型潜伏期是鼻咽癌中最常见的EBV转录模式[43]。然而，随着癌症的进展，溶解基因开始表达。EBV裂解循环在晚期鼻咽癌中的作用一直难以捉摸。在这项研究中，我们证明了EBV流产的溶解周期通过调节免疫微环境促进鼻咽癌的血管生成和侵袭。首先，对临床鼻咽癌样本的分析证实了晚期鼻咽癌中存在EBV裂解激活和免疫抑制，以及异常的血管生成和侵袭性。发现具有 EBV 流产裂解周期的 NPC 细胞募集单核细胞并诱导它们向 TAM 分化并远离 DC。其次，EBV即刻早期蛋白ZTA是EBV裂解周期调节单核细胞趋化性和向TAM分化的关键病毒机制。第三，EBV流产裂解周期诱导的TAMs反过来又促进肿瘤细胞血管生成和侵袭。我们的研究揭示了EBV流产裂解周期参与TAM的形成，导致晚期鼻咽癌的血管生成异常和侵袭性。
与传统观点相反，病毒相关肿瘤主要归因于肿瘤病毒的潜伏周期，而不是溶解期，因为裂解病毒通常会导致宿主细胞的裂解和死亡，越来越多的证据表明EBV裂解周期在EBV介导的肿瘤发生中起作用。支持这一观点的证据如下。（i）EBV相关鼻咽癌和淋巴瘤的转录组学研究总是显示EBV裂解基因与细胞癌相关通路共表达[6]。（ii）鼻咽癌患者循环血中EBV滴度高与鼻咽癌复发、转移和死亡率呈正相关[44]。鼻咽癌患者血清中抗ZTA IgG滴度高与不良临床结局相关[45];（iii）尽管感染水平相似，但与野生型病毒相比，裂解复制无能的EBV颗粒导致淋巴瘤发生的能力受损[46]。此外，还发现阿昔洛韦治疗阻止了病毒基因组复制但不能裂解基因表达，并不能阻止EBV相关淋巴瘤的发生。这一观察结果表明，裂解基因表达，而不是病毒基因组复制或病毒粒子产生，可能在肿瘤发生中起重要作用[46]。尽管在一小部分感染细胞中，EBV裂解复制的完整周期可能通过产生病毒颗粒并将其传播到更多的宿主细胞而促进肿瘤发展，但裂解基因的表达受限而不产生感染性颗粒，称为“流产裂解周期”，已成为病毒裂解周期相关癌症发展的主要机制[47，48]. 我们目前的研究为这一理论提供了进一步的证据，并揭示了EBV裂解周期如何促进鼻咽癌晚期发展的新见解。
在EBV裂解复制中，ZTA起着开关蛋白的作用，因为它启动EBV裂解基因表达级联，将EBV从潜伏期切换到裂解生命周期。作为一种转录激活因子，ZTA还激活许多宿主细胞基因。ZTA被认为具有显着的免疫抑制功能。ZTA是SCID小鼠肿瘤形成所必需的[46]。ZTA直接抑制干扰素反应信号通路[49]和MHC II呈递[50]。据报道，ZTA诱导宿主细胞分泌IL-8，从而促进鼻咽癌募集粒细胞[35]。ZTA还可以促进IL-10的分泌[51]，IL-2在肿瘤免疫逃避和促肿瘤免疫中起着至关重要的作用。ZTA还诱导GM-CSF和Cox-10表达，从而促进分泌IL-36的单核细胞[8]。作为调节单核细胞的关键病毒机制，我们研究了ZTA在调节单核细胞向TAM分化中的作用。敲除ZTA显著抑制单核细胞的募集和TAMs的分化，减弱肿瘤侵袭和体内血管生成。除了IL-<>和GM-CSF，我们还发现GRO-α也受ZTA调控，这可能有助于我们探索ZTA的更多功能。
CCL5在图2F中排名第四，由于以下原因未被纳入我们的研究：首先，虽然EBV感染确实促进了CCL5的表达，但7第日和 14 日第CNE2感染的天数很小，但差异具有统计学意义（S9A图）。其次，当我们分析晚期和早期临床样本之间的宿主基因表达差异时，我们发现CCL5表达在晚期临床样本中下调（EBV在这组样本中更活跃），如图S9B所示。此外，一些研究表明CCL5/RANTES受EBV潜伏膜蛋白LMP1的调控[52,53]。以上内容提示CCL5表达与晚期鼻咽癌EBV活化无关。
研究流产裂解复制的一大挑战是缺乏经历不完全裂解循环而没有产生和释放病毒颗粒的细胞系。在体外，EBV总是潜伏在B细胞系中，只表达少数潜伏基因。裂解循环可由TPA（12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯）和NAB（丁酸钠）等化学刺激人工诱导，这些刺激可以驱动EBV在B细胞和NPC细胞中进入完整的裂解周期[54]。然而，裂解周期诱导剂也会改变鼻咽癌细胞的炎症信号转导系统，掩盖裂解周期的免疫抑制功能[55]。另一方面，EBV病毒粒子释放引起的细胞死亡和崩解也会引起强烈的炎症反应。在我们的研究中，EBV溶解诱导剂和完整的EBV溶解周期都不适合探索EBV溶解周期与肿瘤发生之间的关系。众所周知，EBV在感染B细胞后会进入短暂的裂解周期，B细胞仅表达早期裂解基因促进DNA复制，但不产生病毒颗粒。这个56日窗口期称为潜伏前流产裂解周期，然后EBV进入总潜伏期[7]。我们在上皮细胞中发现了同样的现象：在第 7 天 EBV 感染的 NPC 上皮细胞系中，细胞内 EBV 维持流产的裂解激活。与TPA处理的细胞相比，EBV潜伏前裂解周期的NPC细胞系具有最佳的生长状态、低凋亡率和低免疫原性，准确模拟了晚期鼻咽癌中EBV流产裂解周期的激活状态。该系统包括第14天的NPC细胞（潜伏前流产裂解期）和第<>天的NPC细胞（真正的潜伏期），在我们的研究中得到了成功应用，为EBV流产裂解复制在NPC发病机制中的作用提供了新的见解体外和体内。
在我们的研究之前，有报道表明，EBV溶解周期或ZTA促进促血管生成因子VEGF和细胞因子IL-6、-8、-10和-13的分泌，以促进鼻咽癌的血管生成。通过VEGF，EBV感染的细胞募集单核细胞并将单核细胞激活为TAMs，最终促进肿瘤转移[14]。在鼻咽癌肿瘤微环境中，发现TAM浸润与鼻咽癌预后不良密切相关。然而，TAMs浸润与晚期鼻咽癌EBV裂解周期之间的关系尚不清楚。本研究通过调控晚期鼻咽癌TAMs的分化和促进血管生成，阐明了EBV流产性溶解周期在晚期鼻咽癌进展中的作用。裂解性EBV调节晚期鼻咽癌单核细胞分化和功能后果的模型如图8所示。
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图 8. EBV流产裂解循环在修饰单核细胞以建立促进鼻咽癌晚期进展的肿瘤促进微环境中的作用示意图模型。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.g008
肿瘤转移和复发是绝大多数癌症死亡的原因，取决于肿瘤组织中的血管生成或淋巴管生成。因此，血管生成在肿瘤进展中起着至关重要的作用。肿瘤细胞侵入管腔，扩散，并随体液循环沉降，从而产生新的转移性或复发性病变[57]。晚期鼻咽癌局部缺氧和酸性环境会导致EBV裂解循环的激活，从而促进TAMs的浸润，从而导致肿瘤的血管生成和侵袭。EBV流产裂解周期诱导TAMs分化，进而显著增强鼻咽癌侵袭、血管生成和肿瘤进展，为晚期鼻咽癌的晚期鼻咽癌治疗提供了一种新的策略，通过干预晚期鼻咽癌中的EBV活化来降低转移和复发率。此外，调强治疗一直是治疗鼻咽癌的主要方法[58]，但放化疗不仅会杀死肿瘤细胞，还会激活EBV溶解周期，从而导致肿瘤转移和复发。另一方面，一些报道表明，ZEBRA（ZTA）可以被感染的细胞释放到血液中，并有可能通过其细胞穿透结构域穿透靶细胞[59,60]。综上所述，我们认为靶向ZTA或GM-CSF、IL-8和GRO-α的抗体混合物可能会阻断鼻咽癌的血管生成，从而减少转移和复发，改善晚期鼻咽癌患者或放疗后患者的生活质量，但还需要进一步的临床研究。
材料与方法
道德声明
在研究中使用鼻咽癌临床标本获得中山大学肿瘤医院批准（批准号。YB2016-076），符合国际协调良好临床实践会议 （ICH GCP） 指南、政府法规和法律。研究参与者提供了书面知情同意书。患者临床特征及血浆中EBV滴度均来自中山大学肿瘤医院医院信息系统（HIS）。外周血单核细胞（PBMCs）的采集和应用已获得中山大学医学伦理审查委员会的批准（批准号：2018ZX10302-103）。研究参与者提供了书面知情同意书。本研究的动物实验经中山大学动物伦理审查委员会批准（批准号。SYSU-IACUC-2021-000478），严格按照中华人民共和国科学技术部发布的《关爱实验动物指导建议》执行。
细胞和培养条件
CNE2、HK-1 和 Akata 细胞系由中山大学肿瘤中心的 Mu-Sheng Zeng 博士提供。CNE2 及其衍生细胞系在含有 1640% 胎牛血清和 5% 青霉素/链霉素的 RPMI 1 培养基中生长。HK-1 及其衍生细胞系以及重组 EBV 的 Akata 细胞系维持在含有 1640% FBS 的 RPMI 10 中。每 418-700 代在 G2（3 g/mL，GIBCO）存在下培养含有 rEBV 的细胞系，以维持 EBV 游离型基因组。人胚胎肾 （HEK） 293T 细胞 （ATCC） 在补充有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中培养。所有细胞均在湿润的 5% CO 中培养237°C的气氛。
EBV阳性鼻咽癌细胞系的建立
重组EBV携带的GFP荧光素基因位于BXLF1开放阅读框上。EBV裂解周期激活后，GFP开始在宿主细胞中表达。将rEBV感染的Akata悬浮在含有1640%FBS的3培养基中，密度为5×106/毫升。将IgG（山羊抗人，8‰）加入培养基中以诱导EBV裂解复制和病毒粒子的产生。将 CNE2 种植在 T25 烧瓶上并培养过夜。然后用2ml活化的rEBV-Akata细胞悬液和另外2ml完成的RPMI 3培养基的混合物取代CNE1640的上清液。每隔一天更换一半的上清液。共培养2-4天后，用PBS洗去Akata，G2筛选后获得GFP阳性EBV CNE418。+
质粒和细胞转染
质粒pEGFP-C3（#VT1109）购自中国优必生物。使用一步克隆试剂盒（#C3-112，Vazyme）分别将一系列EBV裂解基因克隆到pEGFP-C02载体的EcoRI和XbaI位点。从EBV阳性NPC细胞系C666-1制备的总DNA和S1表中列出的引物中扩增EBV裂解基因的PCR片段。
细胞转染：胰蛋白酶消化后，将CNE2悬浮并种植在6孔板上，在37°C下培养过夜，直至细胞密度达到70%。将 peGFP-C3 转染到 CNE2 中（2 μg/孔）。48 h后，用蔡司观察器Z1观察GFP表达的细胞，实时荧光定量PCR检测病毒原表达。
稳定表达ZTA的鼻咽癌细胞株的建立
质粒pLVX-EF1α -LUC-N1 （#VT9009）购自Ubio China。从C1-666细胞的总DNA中扩增BZLF1（ZTA）的PCR片段，引物如下：BZLF1-F-BAMHI：5'-GGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCACCTTTGCTATCTTTGCTGA-3'，BZLF1-R-XBAI：5'-TACCCGGTAGAATTATCTAGAAACAAGTGCGATGGCGGTA-3'。使用一步克隆试剂盒 （#C1-1， Vazyme） 将 BZLF1 片段亚克隆到 plVX-EF112 α-Luc-N02 载体的 BAMHI 和 XbaI 位点。将pLVX-EF1α-ZTA-N1载体和对照慢病毒载体应用于包装慢病毒颗粒。将慢病毒载体与包装质粒 psPAX2 （#12260， Addgene） 和 pMD2G （#12259， Addgene） 以 293：4：3 的比例共转染到 HEK1T 细胞中，然后孵育 72 小时。收获含有慢病毒的培养基，并用超速离心机测定慢病毒浓度。慢病毒用于感染的鼻咽癌细胞系，然后进行嘌呤霉素筛选 1 周。获得CNE2-ZTA和CNE2-CTR细胞系。
CRISPR-Cas9介导的EBV BZLF1表达敲除
使用在线 CRISPR 设计工具 （http://crispr.mit.edu） 设计引导序列 （gRNA） 靶向 BZLF5 的 3' 和 1' 区域。5' 和 3' 区域的序列如下：
BZLF1-SG1-F：5'-CACCGCAACTGACTAACCAAGCCGG-3';BZLF1-SG1-R：5'-AAACCCGGCTTGGTTAGTCAGTTGC-3';BZLF1-SG2-F：5'-CACCGGATTTGGCAGAAGCCACCTG-3';BZLF1-SG2-R：5'-AAACCAGGTGGCTTCTGCCAAATCC-3';
将 gRNA 序列亚克隆到 CRISPR/Cas9 载体 lentiCRISPR v2 （#52961， Addgene） 的 BsmBI 限制性位点。对 293T 细胞进行三重转染，产生慢病毒，其 sgRNA 表达为 LentiCRISPR-v2 载体，包装质粒为 psPAX2 和 pMD2G，比例为 4：3：1。将这两种表达gRNA/Cas9的慢病毒转导为EBV阳性的CNE2，然后进行嘌呤霉素筛选1周，获得EBVCNE2-sgZTA和EBVCNE2-sgCTR细胞系。++
实时荧光定量PCR
使用Ultrapure RNA Kit（#CW0581，CWBIO）提取总RNA，并根据制造商的说明使用逆转录试剂盒（Promega）将其转化为cDNA。使用LightCycler 480 SYBR Green I Master （Roche）对相对mRNA表达水平进行实时PCR定量，并针对目的基因进行特异性引物，并归一化为GAPDH。用于实时荧光定量PCR的引物序列列于S2表中。所有实时荧光定量PCR均一式三份完成。
EBER1逆转录PCR（RT-PCR）
提取EBV阳性细胞系的RNA，并逆转录成DNA片段。使用两对引物扩增EBER1和β-肌动蛋白的DNA序列。通过将琼脂糖和水混合来制备琼脂糖凝胶。向每个 DNA 样品中加入至少十分之一体积的 10X 琼脂糖凝胶上样染料 （#9157， Takara），混合并上样到凝胶孔中。在 150–200 mA 下电泳凝胶，直到达到所需的分离。在长波紫外灯箱上可视化DNA片段，并用宝丽来相机拍照。
引物的顺序如下：
EBER1-F：5'-CCCAGATCTAGGACCTACGCTGCCC-3';
EBER1-R：5'-CCCAAGCTTAAAACATGCGGACCACCAGC-3';
β-肌动蛋白-F：5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3';
β-肌动蛋白-R 5'-CTGGGTCATCTTTTCACGGT-3'。
蛋白质印迹
如前所述进行全细胞蛋白裂解物的制备和蛋白质印迹分析[5]。将40 μg蛋白质的全细胞提取物在SDS-PAGE中分离并转移到硝酸纤维素膜上。膜用 5% 脱脂牛奶/PBS 封闭 30 分钟，并与一抗在 4°C 下孵育过夜。 本研究使用抗β肌动蛋白（#A5441，Sigma）和抗EBV ZEBRA（BZLF1）（#sc-53904，Santa Cruz）作为一抗。使用抗IR Dye 800或Dye 680抗兔或抗小鼠IgG抗体（LI-COR Biosciences）作为二抗。Odyssey 系统 （LI-COR Biosciences） 用于检测目标蛋白。
人-单核细胞分离和分化
使用 EasySep Human CD14 Positive Selection Kit II （#14， Stemcell） 从健康人外周血单核细胞 （PBMC） 中分离 CD17858 单核细胞，并在含有 1640% FBS 的 RPMI 10 中培养。+
树突状细胞培养：将分离的单核细胞悬浮至密度为1×106/mL，400 μl/孔，种植在48孔中，将GM-CSF（50 ng/mL，Peprotech）和IL-4（20 ng/mL，R&D）加入体系中，每隔一天更换一半的培养基。4-5天后，获得树突状细胞。第50天，用不同组的鼻咽癌细胞上清液置换48%的培养基。<> 小时后使用 CytoFLEX 流式细胞仪测定 DC 产量。
巨噬细胞培养：用 M-CSF（10 ng/mL，Peprotech）培养单核细胞 4-5 天以获得巨噬细胞。第四天，彻底弃去上清液，完全除去M-CSF。将巨噬细胞以1640：1的比例培养在1个完全培养基和不同组的NPC细胞上清液的混合物中，将LPS（1μg/mL）作为巨噬细胞活化剂加入体系中。1 小时后用 CytoFLEX 测定 M2/M48 巨噬细胞的比例。
流式细胞术
细胞 （1x106）悬浮于100μlPBS中，并与流动抗体（5μl/100μl）在黑暗中孵育20分钟。将细胞重悬于PBS中，并使用CytoFLEX流式细胞仪进行分析。
CD68染色：将细胞以1：1的比例重悬于PBS和IC固定中，并在室温下孵育2小时。洗去 IC 固定 （#00-8222-49， eBioscience），将细胞重新悬浮于含有 CD00 抗体 （8333 μg/mL） 的破膜溶液 （#56-68-10， eBioscience） 中，并将细胞在室温下黑暗孵育 90 分钟，使用 CytoFLEX 流式细胞仪检测 CD68 表达。
本研究中使用的流动抗体如下。APC 抗人 CD14 （#17-0149-42， eBioscience）;APC 抗人 CD3 （#17-0037-42， eBioscience）;APC-eFluor780 抗人类 CD19 （#47-0199-41， eBioscience）;PerCP/Cyanine5.5 抗人 CD1A （#300129， Biolegend）;PE 抗人 CD68 （#12-0689-41， eBioscience）;PE 抗人 CD86 （#12-0869-41， eBioscience）;APC 抗人 CD163 （#333609， Biolegend）。
Transwell PBMC募集测定
将 CNE2 来源的细胞消化成悬浮液 （4×105/mL）。将 1 mL 细胞转移到 Transwell 的底部腔室中，并在 37°C 下用 5% CO 孵育2一 夜 之间。1 mL PBMC 悬浮液 （5×106细胞）被添加到Transwell插入物（#6，Corning）的上腔室（3孔，3422μm）中。然后将细胞孵育 18-24 小时。收集底室上清液，对悬浮细胞进行流式细胞术检测免疫细胞类型比例。
动物研究
雄性C57 BL/6小鼠（6-8周龄）购自中山大学实验动物中心，并按照机构指南进行处理。将CNE2注射到小鼠腹腔（1x107每次进样的细胞数）。7 d后，暴露小鼠腹腔，取出肿瘤异种移植物进行免疫组化分析。
细胞因子抗体阵列和ELISA
细胞因子抗体阵列：根据制造商的说明，使用人细胞因子阵列 C2 试剂盒（#AAH-CYT-2-5，RayBiotech）分析其培养基，确定 CNE5-pLVX-CTR 和 CNE2-pLVX-ZTA 的细胞因子谱。采用化学发光检测器（ChemiDoc XRS）检测细胞因子阵列结果，并利用Image J软件进行定量分析。+
ELISA：采用人GRO-α ELISA Kit（#E-EL-H2C，Elabioscience）、人GM-CSF ELISA Kit（#RK0045，克隆）、人IL-00045 ELISA Kit（#EHC8.008，Neobioscience）对CNE96上清液中分泌的细胞因子进行定量，每个ELISA实验均按照制造商提供的方案进行。
组织学分析
临床鼻咽癌标本和C57 BL/6肿瘤异种移植物采用组织化学染色法分析。简而言之，将肿瘤组织的石蜡包埋切片脱蜡并再水化。用 0.1M 柠檬酸盐缓冲液 （pH 6.0） 修复抗原后，用 5% BSA 封闭切片 30 分钟。将肿瘤样品与一抗在 4°C 下孵育过夜。抗EBV ZEBRA（BZLF1）（#sc-53904，Santa Cruz），抗EBV EBNA1（ab20870，Abcam），抗CD34（#ZA-0550，ZSGB-bio），抗CD163（#GB113152，Servicebio），抗CD1a（#MA5-12526，Invitrogen）作为一抗。使用 PAS 染色试剂盒 （#G1008， Servicebio） 进行 PAS 染色。使用蔡司观察器Z1获取图像，从三个随机选择的视野中计算经典血管生成的数量。通过 IMAGE J 的 IHC Profiler 功能对 CD1a 与 CD163 的阳性区域进行定量。
迁移和侵袭检测
将CNE2在含有30%巨噬细胞上清液的培养基中培养一周。然后将细胞消化成悬浮液（5×105/mL）。对于迁移测定，将 100 ul 细胞悬液加入 Transwell 插入物 （#24， Corning） 的上腔室（8 孔，3422μm），并将 20% FBS RPMI 1640 培养基加入底部腔室。将细胞在 37°C 培养箱中孵育 18–24 小时。对于侵袭测定，transwell 插入物（#24，Corning）的上腔（8孔，3422μm）涂有50μl稀释的（1：5）基质胶。每孔将 200 μl 细胞悬液加入基质胶的上层，并在 37°C 下孵育 18–24 小时。侵入多孔膜下表面的细胞用乙醇固定15分钟，并用结晶紫染色。侵入的细胞由蔡司观察者Z1可视化。
体外管形成试验
将 1 孔板涂有基质胶（1：1640 稀释，100 不含 FBS，37 μl/孔），并在 1°C 下孵育 2 小时，以促进凝胶凝固并避免起泡。将CNE30在含有2%巨噬细胞上清液的培养基中培养一周，然后将CNE3酶解成悬浮液（10×<>5/mL）。每孔将200μl细胞悬液加入基质胶的上层。将细胞在 37°C 下孵育 2-4 小时，并使用蔡司荧光显微镜捕获管形成图像。图像 J 用于测量管子的总长度。
病毒基因和宿主基因的聚类分析
鼻咽癌样本的RNA-Seq数据由中山大学肿瘤医院的曾木生博士捐赠。RNA-Seq数据的原始读长被统一处理并转换为RPKM（reads Per Kilobase of exon model Per million mapped reads）值[23]。宿主基因和EBV基因的RPKM分别存放在S3和S4表中。对鼻咽癌标本中的EBV基因和宿主基因进行聚类分析。对于所有样本中的每个基因，将所有基因的RPKM加到1，然后除以样本中的平均基因表达。然后，我们对基因表达的倍数变化进行了对数转换，并使用 R 语言工具包创建了基因表达热图。规范化表达式数据通过分层聚类方法进行聚类。
统计分析
使用GraphPad prism 6.0进行双尾学生t检验的统计分析，以确定实验组和对照组之间的统计学意义。P<0.05被认为具有统计学意义。* P<0.05， ** P<0.01 和 *** P<0.001;P<0.001;NS，不显著（P>0.05）。数据以平均值 ±SEM 绘制。
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建立EBV流产裂解期的HK-1细胞系。
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S1 图。 建立EBV流产裂解期的HK-1细胞系。
（A） 通过 GFP 流式细胞术呈现 EBV+ HK-1-Day7 和 -Day14 中 EBV 期之间的切换。（B） Western blotting分析EBV+ HK-1-Day7和-Day14中ZTA的表达水平。（C）通过RT-PCR定量EBER1表达水平。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.s001
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S2 图。 EBV 感染的 D7 和 D14 中的 EBV 裂解基因表达。
（A）和（B）EBV感染后不同时间点鼻咽癌细胞系ZTA和EBER1的相对定量表达。（C） 热图显示了 CNE2-EBV 感染的 D7 和 D14 中相对 EBV 基因表达谱。采用完全连锁聚类方法对不同EBV分期（x轴）的基因（y轴）和CNE2进行无监督聚类。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.s002
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S3 图。 EBV 感染的 D2 中的 CNE7 对 THP-1 具有更强的募集作用。
（A） CNE2 通过 Transwell 迁移测定法对募集 THP-1 的影响（每个样品 n = 3）。数据以平均值±SEM表示;* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，NS，不重要。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.s003
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S4 图。 处于EBV流产裂解期的HK-1细胞系表现出募集单核细胞并诱导其定向分化的能力。
（A） HK-1 在不同 EBV 期募集的每种免疫细胞的数量 （n = 4）。（B）实时荧光定量PCR检测细胞因子mRNA水平变化趋势（n = 3）。（C）和（D）采用不同EBV生命周期的HK-1上清液治疗DC。通过CD14&CD1a表达谱检查DCs产量的差异。通过CD14&CD68表达谱（n = 4）检查Mφs比例的差异。（E）采用不同EBV生命周期的HK-1上清液治疗Mφs，通过检测CD1和CD2确定M86和M163亚型的比例（n=4）。数据以平均值±SEM表示;* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，NS，不重要。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.s004
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S5 图。 ZTA 具有募集和诱导 HK-1 中单核细胞定向分化的能力。
（A）实时荧光定量PCR检测病毒基因的mRNA表达水平（n = 3）。（B） 经蛋白质印迹证实 HK-1 细胞中 ZTA 的稳定表达。（C）实时荧光定量PCR检测GM-CSF、IL-8、GRO-α的mRNA表达水平（n = 3）。（D） HK-1-ZTA 和 HK-1-CTR 募集的每个免疫细胞的数量 （n = 4）。（E）和（F）通过CD1和CD1a表达谱检测HK-14-ZTA和HK-1-CTR上清液处理后DCs产量的变化。通过 CD14 和 CD68 检查 DC-d-Ms 的比例 （n = 4）。（G） 通过检测 CD1&CD2 确定 M86 和 M163 亚型的比例 （n = 4）。数据以平均值±SEM表示;* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，NS，不重要。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.s005
（PDF格式）
S6 图。 ZTA-Knockout EBV+HK-1细胞失去了募集和极化单核细胞的能力。
（A） 采用流式细胞术分析ZTA缺失后EBV+ HK-1的GFP谱。（B） 通过测量 ZTA 蛋白表达 （n = 9） 来估计 CRISPR/Cas3 介导的 ZTA 敲除效率。（C） 通过RT-PCR定量敲除细胞和对照细胞中EBER1的表达水平。（D）和（E）ZTA和EBER1在敲除ZTA后不同时间点鼻咽癌细胞系的相对定量表达。（F） 实时荧光定量PCR检测ZTA敲除细胞和对照细胞中EBV+ HK-8中GM-CSF、IL-1、GRO-α的mRNA表达水平（n = 3）。（G） HK-1-EBVSgCTR 和 HK-1-EBVSgZTA 募集的每个免疫细胞的数量 （n = 4）。（H）和（I）用HK-1-EBV+ SgCTR和HK-1-EBV+ SgZTA上清液处理后DCs的产量通过CD14和CD1a表达谱进行检测。通过 CD14 和 CD68 检查 DC-d-Ms 的比例 （n = 4）。（J） 通过 CD1 和 CD2 表达鉴定 M86 和 M163 比例 （n = 4）。数据以平均值±SEM表示;* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，NS，不重要。++
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.s006
（PDF格式）
S7 图。 EBV-DNA载量与TAM和血管密度呈正相关。
采用（A）和（B）Spearman秩相关检验探讨EBV-DNA载量与TAM/血管密度的相关性。* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，NS，不重要。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.s007
（PDF格式）
S8 图。 采用免疫组化染色法分析HK-1异种移植肿瘤的EBV生命周期。
（A）和（B）不同EBV期HK-1异种移植物的代表性图像，显示ZTA和EBNA1表达。用相应的抗体 （400X） 对细胞进行免疫染色。（C） 使用图像 J（400X，每个样本 n = 3）分析随机选择的磁场中免疫染色阳性细胞的百分比。（D）和（E）HK-1-CTR和HK-1-ZTA异种移植的代表性图像，显示ZTA表达（400X）。使用图像 J（每个样本 n = 3）量化随机选择的字段中 ZTA 阳性细胞的百分比。（F）和（G），HK-1-EBV+ SgCTR和HK-1-EBV+ SgZTA异种移植的代表性图像，显示ZTA和EBNA1的表达。使用图像 J 量化随机选择的磁场中免疫染色阳性细胞的百分比（每个样品 n = 3）。数据以平均值±SEM表示;* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，NS，不重要。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.s008
（PDF格式）
S9 图。 CCL5不受EBV流产裂解周期的调控。
（A）图5F中CCL2的qPCR分析和ct值。（B）CCL5在晚期临床样本中的表达下调。* 第 < 页 0。05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，NS，不重要。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.s009
（PDF格式）
S1 表。 EBV裂解基因的PCR引物列表。
引物序列由PRIMER PREMIE5设计，并通过对最终构建的质粒进行测序进行验证。S1 表格以 excel 文件的形式单独上传。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.s010
（XLSX）
S2 表。 实时荧光定量PCR的引物列表。
对于每个靶基因，我们设计了PRIMER BANK的引物序列，扩增的片段约为100bp。 S2 表作为 excel 文件单独上传。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.s011
（XLSX）
S3 表。 RNA-Seq数据中宿主基因的RPKM值。
这部分RNA-Seq数据由中山大学肿瘤中心的曾木生博士捐赠。RNA-Seq数据的原始读长被统一处理并转换为RPKM值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.s012
（XLSX）
S4 表。 RNA-Seq数据中EBV基因的RPKM值。
这部分RNA-Seq数据由中山大学肿瘤中心的曾木生博士捐赠。RNA-Seq数据的原始读长被统一处理并转换为RPKM值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011934.s013
（XLSX）
确认
我们感谢中山大学肿瘤中心的曾木生博士在临床样本和细胞系方面的支持和帮助。我们感谢中山大学光华口腔医学院王燕博士的支持和帮助。
引用
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