医学免费医学论文发表-去泛素化酶对致癌疱疹病毒再激活的非经典调节
抽象
去泛素化酶 （DUB） 从底物中去除泛素，并在各种生物过程中发挥关键作用。然而，我们对病毒复制中去泛素化的理解仍然有限。使用致癌人类疱疹病毒卡波西肉瘤相关疱疹病毒 （KSHV） 来探究蛋白质去泛素化的作用，我们发现卵巢肿瘤家族去泛素化酶 4 （OTUD4） 促进 KSHV 再激活。OTUD4 与复制和转录激活因子 （K-RTA） 相互作用，K-RTA 是控制 KSHV 再激活的关键转录因子，并通过促进其去泛素化来增强 K-RTA 的稳定性。值得注意的是，OTUD4 的 DUB 活性不是 K-RTA 稳定所必需的;相反，OTUD4 作为一种接头蛋白，募集另一种 DUB USP7 来去泛素化 K-RTA 并促进 KSHV 裂解再激活。我们的研究揭示了一种新的机制，即 KSHV 劫持 OTUD4-USP7 去泛素酶以促进裂解再激活，这可能被用于开发新的抗病毒疗法。
作者摘要
卡波西肉瘤相关疱疹病毒 （KSHV） 是一种与多种人类恶性肿瘤相关的致癌疱疹病毒。KSHV的生命周期包括潜伏期和裂解期。从潜伏期到裂解期的转变，称为再激活，对于病毒复制和发病机制至关重要。先前的研究已经确定，KSHV的再激活是由病毒转录因子RTA协调的。然而，控制RTA稳定性的具体分子机制仍然难以捉摸。在这项研究中，我们证明 KSHV RTA 招募两种宿主去泛素化酶 （DUB），OTUD4 和 USP7，以促进 RTA 去泛素化和稳定，促进病毒再激活。有趣的是，OTUD4 的 DUB 活性是可有可无的;相反，OTUD4 作为一种接头蛋白，可募集 USP7 以去泛素化和稳定 RTA。我们的研究不仅揭示了 KSHV 利用 OTUD4-USP7 去泛素化酶增强裂解再激活的机制，而且还为开发靶向宿主去泛素化酶复合物的新型抗病毒治疗策略提供了见解。
数字
Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3
引文： Wang S， Tian X， 周 Y， Xie J， Gao M， Zhong Y， et al. （2024） OTUD4-USP7去泛素化酶对致癌疱疹病毒再激活的非经典调控。PLoS 病理学 20（1）： e1011943 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011943
编辑 器： 朱凡秀，佛罗里达州立大学，美国
收到： 26年2023月3日;接受： 2024年12月2024日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2024 Wang et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其补充信息文件中。
基金资助：国家重点研发计划（2021YFC2701800、2021YFC2701804）、武汉大学启动基金、国家自然科学基金（82372241、31970156、82172261）资助，中央高校基本科研业务费专项资金（2042022dx0003）资助。公司获得国家重点研发计划（2022YFC3401500）资助。Q.Q.由中国病毒学国家重点实验室开放研究基金计划（2022KF010）资助。PF 得到了 NIH（R35DE027556、R01DE026003、R01CA221521、R21AI134105）的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
泛素化系统在控制靶蛋白的稳定性和调节多种细胞事件（如自噬、DNA损伤反应和抗病毒先天免疫）方面发挥着关键作用[1\u3]。大约 700 个 E3 连接酶负责将泛素与靶蛋白偶联，而只有 ~100 个去泛素酶 （DUB） 用于从底物中去除泛素，这表明 DUB 可能采用复杂的策略来靶向特定底物和生物学事件。迄今为止，这些细胞 DUB 已分为 1 个家族：泛素特异性蛋白酶 （USP）、卵巢肿瘤蛋白酶 （OTU）、泛素 C 末端水解酶 （UCH）、Machado-Josephin 结构域蛋白酶 （MJD）、含锌指的 Ub 肽酶 （ZUP1）、JAB34/MPN/MOV4 家族 （JAMMs） 以及与含 Ub 的新型 DUB 家族 （MINDYs） 相互作用的基序 [5， <>].这些 DUB 调节广泛的生理和病理过程，包括病毒感染和发病机制。
疱疹病毒在人群中非常普遍，疱疹病毒感染会导致严重的发病率和死亡率，尤其是在免疫功能低下的个体中。卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV），又称人疱疹病毒8型，是一种致癌疱疹病毒，病因学上与卡波西肉瘤（Kaposi's sarcoma， KS）、KSHV相关炎症细胞因子综合征（KICS）以及6种淋巴组织增生性疾病（primary effusion lymphoma， PEL）和多中心卡斯尔曼病（MCD）[10–11]。与其他疱疹病毒一样，KSHV的生命周期由两个不同的阶段组成：潜伏期和溶解期[12]。初次感染后，KSHV会建立潜伏期，以逃避宿主免疫检测并促进持续感染[13]。有趣的是，一小部分感染细胞自发启动裂解再激活，这为肿瘤发生提供了必要的旁分泌信号[14,15]。 此外，释放的KSHV后代病毒粒子能够感染邻近细胞，从而补充潜伏感染的细胞池[12]。由于KSHV再激活对病毒复制和肿瘤发生至关重要，因此人们一直在积极研究调节潜伏期和裂解期之间转换的病毒和细胞参与者[16,50]。这些研究表明，KSHV ORF12编码的复制和转录激活因子（K-RTA）是控制潜伏-裂解开关的主要转录因子[16,1]。进一步的研究表明，K-RTA的稳定性受泛素-蛋白酶体途径的调控。一种名为vSP-17的KSHV编码的微蛋白与K-RTA结合，并通过泛素-蛋白酶体途径阻止K-RTA降解，从而促进裂解物再激活[2]。MDM3已被确定为K-RTA的E18连接酶，可促进K-RTA泛素化和降解[2]。此外，宿主NCOA2蛋白与MDM19竞争K-RTA结合以稳定K-RTA，从而促进裂解再激活[<>]。然而，宿主去泛素化酶 （DUB） 是否以及如何调节 K-RTA 稳定性并控制 KSHV 裂解再激活仍然难以捉摸。
在这项研究中，OTU DUB 家族成员 OTUD4 已被确定为一种新的 K-RTA 结合伴侣，可促进 K-RTA 去泛素化和稳定，以促进 KSHV 裂解再激活。有趣的是，OTUD4 的 DUB 活性不是稳定 K-RTA 所必需的;相反，OTUD4 作为一种接头蛋白，募集属于 USP DUB 家族的另一种 DUB，USP7，以增强 K-RTA 水平并促进 KSHV 裂解复制。在OTUD4募集中具有K-RTA缺陷的KSHV突变体显示出裂解复制受损。总之，我们的研究揭示了一种新的机制，即KSHV劫持OTUD4-USP7去泛素酶以促进裂解物再激活，这可能被用于开发新的抗病毒疗法。
结果
KSHV K-RTA 与 OTUD4 相互作用
为了深入了解参与KSHV再激活的宿主因子，我们从HEK293T细胞中纯化了KSHV K-RTA，并通过质谱分析分析了K-RTA的相互作用伴侣。我们的蛋白质组学方法鉴定了先前的K-RTA相互作用蛋白，包括NCOA2[19]，验证了我们的分析。在我们的分析中，我们发现宿主去泛素化酶 （DUB） OTUD4 与 K-RTA 相关（S1A 图）。HA-OTUD4 在 HEK293T 细胞中过表达与 FLAG-K-RTA 相互作用，当我们在 SLK.iBAC 和 BCBL-4 细胞中诱导 KSHV 裂解再激活时，内源性 OTUD1 也与 K-RTA 形成复合物（图 1A、1B 和 S1B）。这些结果证实了K-RTA与OTUD4的相互作用。接下来，共聚焦显微镜分析表明，在KSHV潜伏感染的细胞中，OTUD4分布在细胞质和细胞核中，而在KSHV裂解再激活过程中，OTUD4的大部分易位到细胞核中（图1C）。值得注意的是，在病毒裂解复制过程中，K-RTA与OTUD4共定位在细胞核中（图1C）。这些数据表明，KSHV K-RTA和OTUD4在KSHV裂解复制过程中形成复合物。有趣的是，消除OTUD45 DUB活性的C4A突变体[20,21]仍然与K-RTA相互作用，表明OTUD4的DUB活性对于K-RTA结合是可有可无的（图1D）。
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图 1. KSHV K-RTA 与 OTUD4 相互作用。
（A） 用指定的质粒转染HEK293T细胞，并收集全细胞裂解物 （WCL） 进行抗 FLAG 亲和琼脂糖免疫沉淀。通过免疫印迹分析输入和沉淀的样品。（B）用多西环素（Dox，1μg/ml）诱导SLK.iBAC-GFP24 h触发裂解再激活，并用指定的抗体进行免疫共沉淀和免疫印迹。（C） 用 Dox （4 μg/ml） 诱导稳定表达载体对照或 FLAG-OTUD1 的 SLK.iBAC 细胞 24 小时，并使用抗 FLAG 和 K-RTA 抗体进行免疫荧光。比例尺，20 μm。（D-E）用指定的质粒转染HEK293T细胞，并收集WCLs进行抗FLAG亲和琼脂糖免疫沉淀，然后进行免疫印迹。（F） 在HEK1T细胞中通过免疫共沉淀评估 K-RTA 截断（包括 K-RTA（210–1）、K-RTA（489–211）、K-RTA（691–490） 和 K-RTA（691–4）与 OTUD293 之间的相互作用。（G）在HEK677T细胞中采用免疫共沉淀法评估K-RTA（G678A/T679A/L680A）、K-RTA（Y681A/Q682A/L683A）、K-RTA（H684A/Q685A/W686A）、K-RTA（R687A/N688A/Y689A）和K-RTA（F690A/R691A/D4A）与OTUD293的相互作用。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011943.g001
接下来，我们绘制了介导 K-RTA 和 OTUD4 之间相互作用的区域。首先，我们生成了一系列 OTUD4 截短突变体，发现包括 OTU 结构域在内的 OTUD4 （1-425aa） 介导了与 K-RTA 的相互作用（图 1E）。随后，我们生成了一系列 K-RTA 突变体，发现 K-RTA 的 C 末端反式激活结构域 （490-691aa） 负责与 OTUD4 结合（图 1F）。我们进一步截断了 K-RTA （490-691aa），发现 K-RTA （651-691aa） 是 OTUD4 结合所必需的（S1C 图）。此外，K-RTA（1-676aa）未能与OTUD4结合（S1D图），表明K-RTA（677-691aa）介导了与OTUD4的结合。然后我们在K-RTA（677-691aa）中进行了丙氨酸扫描，发现K-RTA的C端三个氨基酸（F689A/R690A/D691A）的三重突变消除了OTUD4的结合（图1G）。我们还生成了相应的三个单突变体（F689A、R690A 和 D691A），发现每个单突变部分减少了 OTUD4 结合（S1E 图）。我们得出结论，K-RTA 的 C 端 FRD 基序介导 OTUD4 结合。
总之，这些数据表明 K-RTA 与 OTUD4 相互作用，K-RTA 的 C 端 FRD 基序和 OTUD1 的 N 端 425-4aa 介导相互作用。
OTUD4 促进 KSHV 裂解复制，独立于其 DUB 活性
接下来，我们进一步表征了 OTUD4 在 KSHV 裂解再激活中的作用。SLK.iBAC 细胞中 OTUD4 的敲除显着损害了 KSHV 裂解再激活，如即刻早期基因 ORF50、早期基因 ORF56 和 ORF57 以及晚期基因 ORF25 和 ORF26 的转录减少所示（图 2A）。相比之下，在转录后水平上受OTUD2调控的MAVS、ALKBH3和ALKBH4[21,22]在敲低OTUD4后没有明显的转录变化（S2A图），表明敲除OTUD4不会全面影响细胞转录活性。 一致地，在OTUD57耗尽的细胞中，K-RTA、ORF45、ORF8和K4α的蛋白水平降低（图2B）。此外，沉默 OTUD4 可将传染性病毒粒子的产生减少约 8 倍（图 2C 和 2D）。接下来，我们使用了 BCBL-1-Tet-K-RTA，这是一种人原发性积液淋巴瘤 （PEL） 细胞系，在多西环素诱导时启动裂解再激活，并证实 OTUD4 的敲除极大地损害了 KSHV 裂解复制（图 2E、S2B 和 S2C）。然后我们询问 OTUD4 的异位表达是否促进 KSHV 再激活。事实上，OTUD4 和 C45A 突变体都促进了 KSHV 传染性病毒粒子的产生并增强了病毒蛋白的表达（S2D–S2E 图）。接下来，我们进行了挽救实验，以排除shRNA介导的OTUD4敲低的脱靶效应。我们用 shRNA 抗性 OTUD4 构建体或 C4A 突变体重建了 OTUD45 耗尽的 SLK.iBAC 细胞。虽然敲除 OTUD4 显着抑制了 KSHV 病毒滴度和病毒蛋白丰度，但 OTUD4 重建逆转了 OTUD4 缺陷对 KSHV 裂解复制的影响（图 2F 和 2G）。DUB缺陷突变体C45A也有效挽救了KSHV裂解物再激活（图2F和2G），证实OTUD4促进KSHV裂解物再激活，而与DUB活性无关。
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图 2. OTUD4 促进 KSHV 裂解再激活，与其 DUB 活性无关。
（A） 用 Dox （4 μg/ml） 诱导用 sh-Ctrl 或 sh-OTUD1 稳定转导的 SLK.iBAC-GFP 细胞 48 小时，然后通过 RT-qPCR 定量病毒基因表达。 （B）SLK.iBAC-GFP细胞的免疫印迹，如图2A所示，用Dox（2μg/ ml）和丁酸钠（1.0mM）诱导5小时。收集含有感染性病毒粒子的上清液并用于感染HEK48T细胞，并在感染后293 h对GFP表达进行成像。比例尺，48 μm。（D） 根据流式细胞术分析GFP阳性细胞百分比计算KSHV感染单位，如图100C所示。 （E） 用 Dox （2 μg/ml） 和丁酸钠 （1.4 mM） 诱导用 sh-Ctrl 或 sh-OTUD1 转导的 BCBL0-Tet-K-RTA 细胞 5 小时。 （F） OTUD48敲低SLK.iBAC细胞与对照载体稳定重构， OTUD4 或 OTUD4-C4A，并用 Dox （45 μg/ml） 和丁酸钠 （1.0 mM） 诱导。在诱导后 5 小时定量 KSHV 感染单位。（G）用Dox（48μg/ ml）诱导图2F中描述的SLK.iBAC稳定细胞1小时，然后进行免疫印迹分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011943.g002
总的来说，这些数据表明 OTUD4 促进 KSHV 裂解再激活，而与其 DUB 活性无关
OTUD4 通过促进 K-RTA K218 去泛素化来稳定 K-RTA
由于 K-RTA 在 KSHV 再激活中起着至关重要的作用，并且 OTUD4 与 K-RTA 相互作用，我们假设 OTUD4 可以调节 K-RTA 蛋白水平以促进裂解再激活。事实上，OTUD4 WT或C45A突变体表达以剂量依赖性方式增强K-RTA表达（图3A），这与我们之前的观察结果一致，即OTUD4的DUB活性不是促进KSHV裂解再激活所必需的。在此过程中，OTUD4 WT或C45A突变体表达以剂量依赖性方式促进K-RTA诱导的PAN启动子活性（图3B）。同样，当OTUD57 WT或C6A共表达时，K-RTA诱导的K4/vIL45启动子活性也显著增加（S3A图）。为了剖析 OTUD4 如何增强 K-RTA 表达，我们敲低了 OTUD4，然后用 MG132 阻断蛋白酶体降解或用巴弗洛霉素 A1 阻断溶酶体降解处理细胞。敲除 OTUD4 降低了 K-RTA 蛋白水平，MG132 处理大大增加了 OTUD4 和 OTUD4 耗尽细胞中的 K-RTA 丰度。相比之下，巴弗洛霉素 A1 治疗未能逆转由 OTUD4 缺乏引起的 K-RTA 下调（S3B 图）。这些数据表明，OTUD4 通过调节蛋白酶体降解途径来增强 K-RTA 蛋白水平。为了进一步排除自噬参与这一过程，我们利用自噬缺陷的 HEK293T ATG7 细胞系，发现 OTUD4 WT 和 C45A 仍然可以增强 ATG7 细胞中的 K-RTA 水平，表明自噬不参与 OTUD4 介导的 K-RTA 稳定（S3C 图）。接下来，我们询问 OTUD4 是否促进 K-RTA 去泛素化，发现 OTUD4 WT 和 C45A 都导致 K-RTA 去泛素化（图 3C）。此外，OTUD4 WT 和 C45A 都有助于去除 K48 连接的泛素化，但不能去除 K63 连接的泛素化（图 3D 和 S3D）。作为对照，OTUD4 有效降低了已知的 OTUD63 底物 Myd88 的 K4 泛素化 [20]，而 C45A 突变体表现出受损的 DUB 活性（S3E 图）。这些数据表明，OTUD4 促进 K-RTA 的 K48 连接泛素化的去除，与 OTUD4 的 DUB 活性无关。-/--/-
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图 3. OTUD4 通过促进 K-RTA K218 去泛素化来促进 K-RTA 去泛素化和稳定性。
（A） HEK293T细胞共转染 HA-K-RTA 和不同量的 FLAG-OTUD4/C45A（0、0.5、1 或 2 μg），转染后 24 h 收集 WCL，并通过免疫印迹分析。（B）将细胞与由KSHV PAN启动子（PAN-Luc）、HA-K-RTA和不同量的FLAG-OTUD293 WT/C4A突变体（45、0.0、1.0或2.0μg）驱动的荧光素酶报告质粒共转染HEK5T条带。在转染后 24 小时测定荧光素酶活性。（C） 用 FLAG-K-RTA、HA-Ub 和 Myc-OTUD293/C4A 共转染HEK45T细胞，然后用 MG132 （10 μM） 处理。使用抗FLAG亲和琼脂糖进行变性免疫沉淀，然后进行免疫印迹。（D） HA-Ub（仅 K48）代替 HA-Ub 用于检测 K-RTA 泛素化，如图 3C 所示。 （E） HEK293T细胞与 PAN-Luc 报告基因、载体对照或 FLAG-OTUD4 以及 WT K-RTA 或指示的突变体共转染。荧光素酶活性在转染后 24 小时进行定量。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011943.g003
为了鉴定对 OTUD4 介导的去泛素化有反应的 K-RTA 赖氨酸残基，我们生成了两个覆盖 C 端 OTUD4 结合 FRD 基序的 K-RTA 截短突变体 （211-691aa 和 490-691aa）。OTUD211 有效提高了 K-RTA （691-4aa） 的蛋白水平，而 K-RTA （490-691aa） 的丰度不受 OTUD4 表达的影响，表明 K-RTA （211-489aa） 由对 OTUD4 介导的 K-RTA 稳定至关重要的关键赖氨酸残基组成（S3F 图）。为了进一步验证这一点，我们在 K-RTA 全长范围内用精氨酸替换了 12-1aa 中的所有 210 个赖氨酸残基，并验证了 OTUD12 增强了 K-RTA-K4R 突变体的蛋白质水平（S3F 图）。然后，我们生成了全长K-RTA突变体，其中7-211aa中的489个赖氨酸残基中的每一个都被精氨酸单独取代。K-RTA报告基因活性测定表明，K-RTA K218R突变体的活性对OTUD4表达没有反应，而其他突变体的活性则被OTUD4增强（图3E）。这些数据表明，OTUD4 促进 K-RTA K218 去泛素化以稳定 K-RTA。一致地，OTUD4 表达促进了 K-RTA 和其他 48 个 K-RTA KR 突变体的 K6 连接泛素化的去除，但不促进 K-RTA K218R 突变体的去除（S3G 图）。
总之，这些数据表明 OTUD4 通过促进 K-RTA K218 去泛素化来稳定 K-RTA。
在OTUD4募集中携带K-RTA缺陷的KSHV突变体的表征
由于K-RTA的C端FRD基序介导OTUD4结合，我们利用感染性细菌人工染色体（BAC）克隆（S689A图）[690,691]将F3A/R4A/D23A三重突变（以下简称K-RTA-24A）引入KSHV基因组。 与WT K-RTA相比，K-RTA-3A突变体在裂解再激活过程中未能与OTUD4结合（图4A）。一致地，K-RTA-3A 突变显着损害病毒蛋白表达和后代病毒粒子产生（图 4B、4C 和 S4B），并且敲低 OTUD4 不能像对抗 WT KSHV 那样损害 KSHV-K-RTA-3A 的再激活（S4C 和 S4D 图）。此外，OTUD4/C45A 未能像 WT KSHV 那样促进 KSHV-RTA-3A 的裂解再激活（图 4D）。这些数据表明，OTUD4 通过 K-RTA 的 C 末端 FRD 基序与 K-RTA 结合，以促进 KSHV 裂解再激活。
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图 4. 在OTUD4募集中具有K-RTA缺陷的KSHV突变体显示出裂解复制受损。
（A） 用 Dox （689 μg/ml） 诱导 SLK.iBAC-K-RTA-WT 或 SLK.iBAC-K-RTA-F690A/R691A/D3A （K-RTA-1A） 细胞 48 小时，然后进行免疫共沉淀和免疫印迹。（B）用Dox（3μg/ml）诱导SLK.iBAC-K-RTA-WT或SLK.iBAC-K-RTA-1A细胞48 h，收集WCLs，通过免疫印迹分析。（C） 用 Dox （3 μg/ml） 和丁酸钠 （1.0 mM） 诱导 SLK.iBAC-K-RTA-WT 或 SLK.iBAC-K-RTA-5A 细胞 48 h，定量 KSHV 感染单位。（D） 用 OTUD3 WT/C4A 稳定转导的 SLK.iBAC-K-RTA-WT 或 SLK.iBAC-K-RTA-45A 细胞，用 Dox （1 μg/ml） 和丁酸钠 （0.5 mM） 诱导 48 h，定量 KSHV 感染单位。收集WCLs，并通过免疫印迹法进行分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011943.g004
USP7 促进 KSHV 裂解物再激活
由于 OTUD4 促进 K-RTA 去泛素化并稳定 K-RTA，而与 OTUD4 的 DUB 活性无关，因此我们认为 OTUD4 可能会募集另一个 DUB 来催化 K-RTA 的去泛素化。我们分析了先前蛋白质组学研究中产生的OTUD4的所有结合伴侣，发现三种DUB（USP10、CYLD和USP7）可能与OTUD4相互作用[22,25–27]。 USP7 的过表达，而不是 USP10 或 CYLD，增强了 K-RTA 的蛋白水平（图 5A、S5A 和 S5B）。此外，敲低 USP7，而不是 USP10 或 CYLD，大大减少了 KSHV 后代病毒粒子的产生（图 5B 和 S5C–S5E）。这些结果表明，USP7 而不是 USP10 或 CYLD 在 KSHV 裂解再激活中起关键作用。然后我们确认 USP7 作为 DUB 发挥作用，并明显降低了 MDM48 的 K2 泛素化（S5F 图）。接下来，我们发现 HA-OTUD4 在 HEK7T 细胞中与 FLAG-USP293 相互作用，当我们在 SLK.iBAC 和 BCBL-7 细胞中诱导 KSHV 裂解再激活时，内源性 USP4 也与 OTUD1 形成复合物（图 5C 和 S5G）。结构域映射实验表明，OTUD4 （1-425aa） 的 N 端区域与 USP7 相互作用（S5H 图）。GST pulldown 测定表明，USP1 的 TRAF 结构域 （208-560aa） 能够结合 OTUD1102 （S7I），但串联 UBL 结构域 （4-5aa） 不能。敲低 USP7 极大地抑制了 KSHV 裂解复制，如 KSHV 裂解基因转录减少所示（图 5D）。相比之下，敲低 USP2 后，MAVS、ALKBH3 和 ALKBH7 没有显示出明显的转录变化（S5J 图），表明敲低 USP7 不会全面影响细胞转录活性。一致地，USP7耗尽的SLK.iBAC细胞中的病毒蛋白水平降低（图5E）。此外，USP7 敲低还显着降低了 BCBL-1-Tet-K-RTA 细胞中 KSHV 基因组复制和病毒蛋白表达（图 5F 和 S5K）。这些数据表明 USP7 促进 KSHV 裂解再激活。值得注意的是，在 OTUD7 耗尽的细胞中敲除 USP4 不能进一步减少 KSHV 后代病毒粒子的产生（图 5G 和 5H），这表明 OTUD4-USP7 轴在 KSHV 裂解再激活中起关键作用。
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图 5. USP7 与 K-RTA 相互作用并促进 KSHV 再激活。
（A）HEK293T细胞用HA-K-RTA和FLAG-USP7（0、0.5、1或2μg）共转染，然后在转染后24小时进行免疫印迹。（B） 用 Dox （7 μg/ml） 和丁酸钠 （1.0 mM） 诱导用 sh-Ctrl 或 sh-USP5 转导的 SLK.iBAC-GFP 细胞 48 小时。收集含有KSHV子代病毒粒子的上清液，用于感染HEK293T细胞，基于流式细胞术分析GFP阳性细胞百分比计算KSHV感染单位。（C）用Dox（1μg/ml）诱导SLK.iBAC-GFP24小时以触发裂解再激活，用Dox（1μg/ml）和丁酸钠（1.0mM）诱导BCBL5-Tet-K-RTA细胞48小时。对指定抗体进行免疫共沉淀和免疫印迹。（D） 用 Dox （7 μg/ml） 诱导用 sh-Ctrl 或 sh-USP1 稳定转导的 SLK.iBAC-GFP 细胞 48 小时，然后通过 RT-qPCR 定量病毒基因表达。 （E） SLK.iBAC-GFP 细胞的免疫印迹，如图 5D 所示。 （F） 用 Dox （1 μg/ml） 和丁酸钠 （7.1 mM） 诱导用 sh-Ctrl 或 sh-USP0 转导的 BCBL5-Tet-K-RTA 细胞 48 小时。 对上清液中的KSHV基因组拷贝进行定量。（G-H）用 sh-Ctrl 或 sh-OTUD4 转导的 SLK.iBAC-GFP 细胞进一步用 sh-Ctrl 或 sh-USP7 转导，用 Dox （1 μg/ml） 和丁酸钠 （0.5 mM） 诱导稳定细胞 48 h，收集 WCL 并通过免疫印迹 （G） 分析，定量 KSHV 感染单位 （H）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011943.g005
OTUD4 桥接 K-RTA 和 USP7 之间的相互作用，促进 KSHV 裂解再激活
接下来，我们进一步探讨了 OTUD4 和 USP7 如何调节 K-RTA 水平以促进 KSHV 裂解再激活。首先，我们发现K-RTA与USP7相互作用（图6A和S6A）。值得注意的是，OTUD4 表达以剂量依赖性方式增强了 K-RTA 和 USP7 之间的相互作用（图 6B），表明 OTUD4 弥合了 K-RTA 和 USP7 之间的相互作用。与此一致，敲除 OTUD4 消除了 K-RTA 和 USP7 之间的相互作用（图 6C），表明 OTUD4 作为 K-RTA 和 USP7 之间的衔接蛋白发挥作用。此外，OTUD4/C45A 未能去除 USP48 耗尽细胞中 K-RTA 的 K7 连接泛素链（S6B 和 S6C 图）。在功能上，OTUD4 WT 或 C45A 突变体在报告基因测定中促进了 K-RTA 活性，然而，随着 USP7 的耗竭，促进作用被消除（图 6D）。OTUD4/C45A的表达一致地促进了KSHV后代病毒粒子的产生，而USP7的敲低抵消了OTUD4/C45A的促进作用（图6E）。此外，USP7 未能去除 OTUD48 耗尽细胞中 RTA 的 K4 连接泛素链（图 6F）。这些数据表明，OTUD4 桥接了 K-RTA 和 USP7 之间的相互作用以稳定 K-RTA，从而促进 KSHV 裂解再激活。
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图 6. OTUD4 桥接 K-RTA 和 USP7 的结合以促进 KSHV 裂解再激活。
（A） 用 Dox （1 μg/ml） 诱导 BCBL-1 Tet-K-RTA 24 小时以触发裂解再激活。对指定抗体进行免疫共沉淀和免疫印迹。（B） 用指定的质粒转染HEK293T细胞。收集 WCL 用抗 FLAG 亲和琼脂糖进行免疫沉淀，然后进行免疫印迹分析。（C） 用 sh-Ctrl 或 sh-OTUD293 转染HEK4T细胞，用指定的质粒转染，然后在转染后 24 小时进行免疫沉淀和免疫印迹分析。（D） 用 sh-Ctrl 或 sh-USP293 转导HEK7T细胞与 PAN-Luc、HA-K-RTA 和 FLAG-OTUD4 WT/C45A 共转染。在转染后 24 小时测定荧光素酶活性。（E） 用 sh-Ctrl 或 sh-USP7 转导的 SLK.iBAC-GFP 细胞进一步稳定地转导载体对照、OTUD4 WT 或 C45A 突变体。然后用Dox（1μg/ ml）和丁酸钠（0.5mM）诱导稳定细胞，触发裂解再激活48小时。（F） 用 FLAG-K-RTA、HA-Ub（仅 K293）和 Myc-USP293 共转染 HEK4T 对照或 HEK48T-shOTUD7 细胞，然后用 MG132 （10 μM） 处理。使用抗FLAG亲和琼脂糖进行变性免疫沉淀，然后进行免疫印迹。（G） 用 FLAG-USP293、HA-K-RTA 和 HA-OTUD7 （4-1aa）（425、2 或 4 μg）转染HEK6T细胞。收集 WCL 用抗 FLAG 亲和琼脂糖进行免疫沉淀，然后进行免疫印迹分析。（H） HEK293T细胞与 PAN-Luc、FLAG-K-RTA 和 OTUD4 WT 或 OTUD4 （1-425aa） 共转染。在转染后 24 小时测定荧光素酶活性。（I） OTUD4 敲低 SLK.iBAC-GFP 细胞与对照载体 OTUD4 或 OTUD4 （1-425aa） 稳定复溶。用Dox（1μg/ ml）和丁酸钠（0.5mM）诱导稳定细胞以诱导裂解再激活。在诱导后 48 小时定量 KSHV 感染单位。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011943.g006
由于我们发现 OTUD4 （1-425aa） 足以与 K-RTA 和 USP7 结合（图 1E 和 S5H），如果 OTUD4 作为接头发挥作用，我们推测 OTUD4 （1-425aa） 足以稳定 K-RTA 并促进 KSHV 裂解复制。基于这一概念，OTUD4 （1-425aa） 的表达以剂量依赖性方式加强了 K-RTA 和 USP7 之间的相互作用 （图 6G）。此外，OTUD4 （1-425aa） 增强了 K-RTA 的蛋白水平和 K-RTA 的转录活性，与 WT OTUD4 的作用相似（图 6H 和 S6D）。OTUD4 （1-425aa） 与 OTUD4 一样有效地促进了 K-RTA 去泛素化 （S6E 图）。与 K-RTA 相比，K-RTA-K218R 的泛素化降低，当与 OTUD218 和 OTUD4 4-1aa 共表达时，K-RTA-K425R 的泛素化保持不变（S6E 图）。OTUD4 耗尽细胞中 OTUD1 （425-4aa） 的重建挽救了受损的 KSHV 裂解再激活，如后代病毒粒子产生增加和病毒蛋白（K-RTA 和 K8α）表达增强所示（图 6I 和 S6F）。最后，我们评估了OTUD4和OTUD4（1-425aa）的二聚化/寡聚化活性，发现OTUD4和OTUD4（1-425aa）都可以形成二聚体/低聚物（S6G图）。这些数据进一步支持了我们的模型，即 OTUD4 形成二聚体/低聚体以促进 K-RTA 和 USP7 之间的相互作用，导致 USP7 对 K-RTA 的去泛素化和稳定，以促进 KSHV 裂解复制。
讨论
泛素化-蛋白酶体系统在控制靶蛋白的稳定性中起关键作用。E3 泛素连接酶是这一关键过程的核心，催化泛素与靶蛋白的偶联，而去泛素化酶则从底物中去除泛素链。泛素化-蛋白酶体系统广泛参与包括病毒感染在内的生理和病理事件[28,29]。 KSHV作为一种致癌疱疹病毒，数千年来一直与宿主共同进化，越来越多的证据表明，KSHV劫持宿主泛素系统以促进感染[30]。值得注意的是，KSHV 编码多种靶向多种底物的 E3 连接酶。例如，KSHV编码的E3连接酶K-RTA催化IRF7多泛素化，并靶向IRF7进行蛋白酶体降解，以抑制抗病毒先天免疫[31]。K-RTA还促进Hey1阻遏蛋白和SMC5/6的降解，促进裂解复制[32,33]。 KSHV编码的两种膜结合泛素E3连接酶K3和K5介导了一长串底物的泛素化和降解[34]，其中MHC-I是研究最多的[23,35–38]。此外，KSHV编码DUB ORF64，可有效去除K48和K63连接的泛素链[39]。ORF64催化RIG-I去泛素化，抑制RIG-I介导的抗病毒先天免疫信号传导[40]。
除了 KSHV 编码的 E3 连接酶和 DUB 外，细胞对应物也参与 KSHV 复制和发病机制。MDM2是一种泛素E3连接酶，已被发现与K-RTA相互作用并促进K-RTA泛素化和降解[18]。USP7是USP DUB家族的成员，最初被命名为疱疹病毒相关泛素特异性蛋白酶（HAUSP），因为它最初是HSV-0的ICP1蛋白的强结合伴侣[41,42]。 早期研究表明，USP7稳定ICP0以促进HSV-1复制，ICP0募集USP7以拮抗病毒先天免疫[43\u45]。有趣的是，多种KSHV蛋白也与USP7相互作用，加强了USP7在疱疹病毒感染中的关键作用。KSHV vIRF1和vIRF4与USP7结合，抑制p53介导的抗病毒反应[46,47]。 此外，KSHV ORF45桥接USP7和KSHV ORF33之间的结合，导致ORF33稳定，这是产生传染性病毒粒子所必需的[48]。作为OTU DUB家族成员，卵巢肿瘤家族去泛素化酶4（OTUD4）与斑马鱼胚胎发育有关，并与人类患者的共济失调、痴呆和低促性腺激素有关[49]。先前的研究表明，OTUD4参与调节抗病毒先天免疫和DNA烷基化引起的DNA损伤修复[20\u22\u1]。有趣的是，最近的一项研究表明，HSV-0 ICP4与OTUD4相互作用，表明OTUD50与疱疹病毒感染有关[4]。在这项研究中，我们提出了一个独特的例子，其中 KSHV 劫持了两个 DUB，OTUD7 和 USP4，以促进裂解再激活。有趣的是，在这个过程中不需要OTUD4的DUB活性;相反，OTUD7 作为一种接头蛋白来弥合 K-RTA 和 USP4 之间的相互作用。OTUD4 的非典型支架功能先前已在 DNA 修复调控中观察到。OTUD7已被证明可以募集两种去泛素化酶USP9和USP2X，它们直接作用于DNA去甲基化酶ALKBH3和ALKBH22，以促进DNA烷基化修复[18]。去泛素化酶USP20在先天免疫调节中提出了类似的接头模型，该酶通过去泛素化STING/MITA来募集另一种去泛素化酶USP51来促进先天抗病毒反应[7]。我们的结构域映射结果表明，USP7的TRAF结构域介导了USP4与OTUD7之间的相互作用。先前的研究已经确定，USP4 的 TRAF 结构域可识别其底物中保守的 P/A/EXXS（X 代表任何氨基酸）基序。目前，我们正在筛选 OTUD7 中的 P/A/EXXS 基序，以确定这些基序是否在 USP4 结合中起关键作用。此外，OTUD4 在 KSHV 裂解再激活后易位到细胞核中，并与 K-RTA 共定位。然而，KSHV 裂解再激活后 OTUD4 易位到细胞核的机制仍然未知。一个合理的假设是 K-RTA 与 OTUD<> 相互作用，促进其易位到细胞核中，促进 KSHV 裂解再激活。需要进一步的研究来检验这一假设。
值得注意的是，KSHV vIRF1 和 vIRF4 抑制 USP7 的 DUB 活性以抑制 p53 并促进肿瘤发生 [46， 47]，而 USP7 DUB 活性是 KSHV 裂解再激活期间 K-RTA 稳定性和有效病毒复制所必需的。 这些看似的差异可以用两种非相互排斥的可能性来解释。首先，USP7 在 KSHV 潜伏期和裂解复制过程中可能具有不同的作用。vIRF1 和 vIRF3 在潜伏期表达，抑制 USP7 DUB 活性对于抑制 p53 抑癌基因活性和实现 KSHV 潜伏感染细胞的有效复制至关重要。相比之下，在 KSHV 裂解再激活期间，需要 OTUD4-USP7 轴来稳定 K-RTA 并促进病毒复制。或者，在裂解复制过程中，K-RTA-OTUD7-USP4 复合物中的 USP7 被激活以实现有效的病毒复制，而 USP7-p7 复合物中的 USP53 可能被 vIRF1 和 vIRF3 特异性靶向，以抵消 p53 信号传导的抗病毒作用。由于 USP7 耗竭极大地损害了 KSHV 裂解再激活，因此我们认为 K-RTA-OTUD7-USP4 轴中的 USP7 激活在裂解再激活期间是有利的，尽管 vIRF1 和 vIRF3 仍可能同时抑制 USP7 和 p53 信号传导。在KSHV裂解再激活过程中，USP7活性是否在不同复合物中受到明显调节，值得进一步研究。
我们的研究揭示了新型抗病毒策略的发展。在小鼠中敲除Usp7会导致胚胎致死[52]，因为USP7具有广泛的底物，在许多生理过程中起着关键作用[53]。因此，尽管有许多有效的USP7小分子抑制剂可用，但由于潜在的毒性，USP7 DUB抑制作为一种抗病毒方法可能不可行[53]。根据我们的研究结果，我们建议开发一种肽或肽样抑制剂来破坏 OTUD4 和 USP7 之间的相互作用，作为一种潜在的抗病毒策略。这种抑制剂可以特异性靶向 OTUD4-USP7 轴，这对 KSHV 裂解再激活至关重要，同时保留了 USP7 的其他重要功能。例如，两种vIRF4衍生的肽可有效抑制USP7的DUB活性，导致小鼠模型中的p53依赖性细胞周期停滞和肿瘤消退[47]。OTUD4-USP7 和拟议的抗病毒策略是否会影响其他疱疹病毒，包括 MHV68 和 EBV，值得进一步研究。
总之，我们报道了 OTUD4 与 K-RTA 相互作用并通过促进 K-RTA 去泛素化来增强 K-RTA 稳定性。OTUD4 的 DUB 活性不是 K-RTA 稳定所必需的;相反，OTUD4 作为一种接头蛋白，募集 USP7 使 K-RTA 去泛素化并促进 KSHV 裂解再激活。我们的研究揭示了一种新的机制，即 KSHV 劫持 OTUD4-USP7 去泛素化酶以促进裂解物再激活，这可能被用于开发新的抗病毒疗法。
材料与方法
细胞培养
HEK293T细胞在补充有 10% 胎牛血清 （FCS） 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） （Sigma）（Lonsera，Shuangru Biotech，Shanghai，China）和 1% 青霉素-链霉素 （HyClone） 中培养。携带多西环素诱导型K-RTA的iSLK细胞（由克利夫兰诊所的Jae Jung博士和斯坦福大学的Kevin Brulois博士友情提供）维持在补充有10% FCS、1%青霉素-链霉素、嘌呤霉素（1μg/ml）和G418（250μg/ml）的DMEM中[23]。在补充有10% FCS、1%青霉素-链霉素和潮霉素B（500μg/ml）的DMEM中维持携带KSHV克隆iBAC（SLK.iBAC-GFP;由佛罗里达州立大学朱凡秀博士友情提供）的SLK细胞系[24]。BCBL1细胞（由武汉大学Ke Lan博士友情提供）维持在补充有1640%FCS和10%青霉素-链霉素的RPMI-1（HyClone）中。BCBL1-Tet-K-RTA细胞系是通过用多西环素诱导的K-RTA构建体稳定转导BCBL-1产生的[54]。
抗体和其他摄制剂
以下抗体和试剂用于免疫印迹和免疫沉淀：小鼠抗FLAG单克隆抗体（1：10000;Dia-An Biotechnology，中国武汉，目录号2064）;小鼠抗HA单克隆抗体（1：3000;Dia-An Biotechnology，中国武汉，目录号2063）;小鼠抗β肌动蛋白单克隆抗体（1：5000;Dia-An Biotechnology，中国武汉，目录号2060）;兔抗K-RTA单克隆抗体（1：1000，Mabnus biotechnology，武汉，中国）;小鼠抗KSHV ORF45单克隆抗体（1：1000;Santa Cruz， sc-53883）;小鼠抗KSHV ORF57单克隆抗体（1：1000;Santa Cruz， sc-135746）;小鼠抗c-Myc单克隆抗体（1：1000;圣克鲁斯，sc-40）;小鼠抗KSHV K8.1A/B单克隆抗体（1：1000;Santa Cruz， sc-65446）;小鼠抗K8α单克隆抗体（1：1000;Santa Cruz， sc-69797）;兔IgG（Proteintech，20010049）;兔抗OTUD4多克隆抗体（1：1000;蛋白质技术，25070-1-AP）;小鼠抗HAUSP/USP7单克隆抗体（1：500;Santa Cruz， sc-137008）;IRDye 800CW 山羊抗兔和抗小鼠二抗 （1：10000;LI-COR）;山羊抗兔和抗小鼠HRP偶联二抗（Bio-Rad）;Anti-FLAG磁珠（Bimake，上海，中国）;抗HA磁珠（Bimake）;Poly FLAG肽（100μg/ ml;比马克）;抗FLAG微球（Dia-An Biotechnology，武汉，中国）;蛋白 A/G 琼脂糖（GE 医疗保健）;谷胱甘肽-琼脂糖微珠（Smart-lifesciences）;还原型L-谷胱甘肽（Solarbio，北京，中国）;DAPI Fluoromount-G 封片培养基 （SouthernBiotech， 0100–20）。
以下抗体用于免疫荧光显微镜（IF）：小鼠抗FLAG单克隆抗体（1：400;帝安生物技术，中国武汉，#2064）;兔抗K-RTA单克隆抗体（1：400，Mabnus biotechnology，武汉，中国）;Alexa Fluor 647偶联山羊抗小鼠二抗（1：1000;Invitrogen #A10680） 和 Alexa Fluor 594 偶联山羊抗兔二抗 （1：1000;Invitrogen #A11012）。
多西环素（Dox）、甲醛和丁酸钠购自Sigma-Aldrich;嘌呤霉素、潮霉素B和G418购自Invivogen;MG132 是从 MedChemExpress 订购的;Bafilomycin-A1 （Baf-A1） 购自 Selleck。
质 粒
采用标准分子生物学技术将WT ORF50和突变体亚克隆到pEF-FLAG-N、pEF-HA-N或pcDNA3.1-FLAG-HA中。pHAGE-OTUD4 WT、C45A突变体和缺失突变体由Bo Zhong博士（武汉大学）友情提供[21]。将OTUD4 WT亚克隆到pEF-HA-N或pEF-Myc-N中，通过定点诱变引入点突变。pRK-FLAG-Myd88 由 Qing Yang 博士和 Hong-Bing Shu 博士（武汉大学）友情提供。pCMV-FLAG/Myc-USP7 和 pEF-FLAG-MDM2 构建体由 Jinfang Zhang 博士（武汉大学）友情提供，USP7 被亚克隆到 pEF-HA-N 载体中。将 USP7 （1-208aa） 和 USP7 （560-1102aa） 亚克隆到 pGEX-6p-1 中。HA-Ub、HA-Ub（仅限 K48）和 HA-Ub（仅限 K63）由 Bo Zhong 博士（武汉大学）友情提供。KSHV PAN、K57和vIL-6启动子荧光素酶报告质粒由Pinghui Feng博士（南加州大学）友情提供[55,56]。 靶向 OTUD4、USP7 和 CYLD 的短发夹 RNA （shRNA） 被构建到 pLKO.1 （Addgene） 中。本研究使用了以下shRNA序列：
shOTUD4 #1：5′-CAAGTCGAGAATCTAACTATT-3′;
shOTUD4 #2：5′-TATGCAATGCCTTAGTCATAA-3′;
shUSP7 #1：5′-CAAGCAGTGCTGAAGATAATA-3′;
shUSP7 #2：5′-AGCCTGCTACAGACGTTATTT-3′;
shCYLD #1：5′-GAGGACAGTCTCCGGAATATT-3′;
shCYLD #2：5′-AGGTTCATCCAGTCATAATAA-3′;
shUSP10 #1：5′-GCCTTTGAGCCCACATATATT-3′;
shUSP10 #2：5′-CCTATGTGGAAACTAAGTATT-3′。
K-RTA的纯化和质谱分析
收集用 FLAG-HA-K-RTA 转染HEK293T细胞，并在转染后 40 小时在补充有蛋白酶抑制剂的 Nonidet P-40 （NP-150） 裂解缓冲液（50 mM NaCl、7 mM Tris-HCl、pH 4.1、40% NP-1、24 mM EDTA）中裂解。将细胞裂解物在 13°C 下以 000,10 rpm 离心 4 分钟，并将上清液与 50 μl 抗 FLAG 磁珠 （Bimake） 在 4°C 下孵育 12 小时。用磁分离装置收获抗FLAG微珠，然后用NP-40裂解缓冲液充分洗涤。Poly FLAG肽（100μg/ ml;Bimake）在TBS缓冲液（150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.4）中稀释，用于在6小时4°C下洗脱融合蛋白。 第一次洗脱后，收集上清液，并与50μl抗HA磁珠（Bimake）在6°C下再孵育4小时。酶解结合蛋白，并通过质谱分析（华大基因，中国深圳）。MS 结果汇总在 S1 表中。
RNA提取和RT-qPCR
用 Dox （1 μg/ml） 处理 SLK.iBAC-GFP 或 BCBL1-Tet-K-RTA 细胞 24 小时。使用TRIzol试剂（Takara）提取总RNA，并根据制造商的说明使用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Vazyme，Nanjing，China）合成cDNA。然后将cDNA混合物稀释40倍，并用SYBR green qPCR预混液（Bimake，上海，中国）进行qPCR分析。将靶基因的相对定量归一化为 ATCB。引物序列列在S2表中。
荧光素酶报告基因检测
采用双荧光素酶报告基因法评估K-RTA的转录活性[57]。接种到 7 孔板中的 WT 或 USP293 敲低HEK24T细胞，用 50 ng TK-肾荧光素酶报告质粒和 50 ng PAN-Luc、K57-Luc 或 vIL-6-Luc 荧光素酶报告质粒、50ng HA-K-RTA 和不同量的 FLAG-OTUD4（100、200 或 500 ng）、OTUD4-C45A（100、200 或 500 ng）或 OTUD4 1-425AA（100、200、 500 或 24 ng）。转染后 <> 小时使用双荧光素酶报告基因测定试剂盒（Vazyme，南京，中国）测定荧光素酶活性。
免疫沉淀
对于免疫沉淀，用指定的构建体转染HEK293T细胞，并在转染后 40 小时收集细胞并在补充有蛋白酶抑制剂混合物的 NP-24 裂解缓冲液中裂解细胞。将细胞裂解物在 12°C 下以 000,10 rpm 离心 4 分钟，然后将上清液与抗 FLAG 微珠（Dia-An Biotechnology，Wuhan，China）在 4°C 下孵育 4 小时。对于内源性蛋白的免疫沉淀，用Dox（1μg/ ml）诱导SLK.iBAC-GFP细胞24小时，并如上所述制备全细胞裂解物。将细胞裂解物与兔 IgG 对照品 （Proteintech） 或指定的抗体 （2 μg） 一起孵育 6 小时，然后与 10 μl 蛋白 A/G 琼脂糖 （GE healthcare） 在 8°C 的滚筒上再孵育 10-4 小时。 通过在 4°C 下以 000,2 rpm 离心 4 分钟来收获 FLAG 珠子或蛋白 A/G 琼脂糖， 并用NP-40裂解缓冲液充分洗涤。结合蛋白在SDS样品缓冲液中煮沸15 min释放，SDS-PAGE分离，免疫印迹分析。
GST下拉
GST、GST-USP7（1-208aa）或GST-USP7（560-1102aa）在E中表达。大肠杆菌BL21（DE3） 在 0°C 下用 IPTG （5.18 mM） 诱导过夜。收获细胞并在裂解缓冲液（20 mM Tris-Cl，pH 8.0,137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1% Triton X-100,0.2 mM PMSF）中超声处理15分钟。收集上清液，并与谷胱甘肽-琼脂糖珠（Smart-lifesciences，Changstate，China）在4°C下孵育4小时。用洗涤缓冲液（20 mM Tris-Cl，pH 8.0,137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1% Triton X-100）充分洗涤后，用洗脱缓冲液（20 mM Tris-Cl，pH 8.0,137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM还原L-谷胱甘肽）在4°C下洗脱结合蛋白20分钟。将洗脱的蛋白质用透析缓冲液（20 mM Tris-Cl，pH 8.0,150 mM NaCl，10% 甘油）透析，并与在 4°C 下在谷胱甘肽珠 （293 μl） 存在下在HEK4T细胞中表达的 FLAG-OTUD4 一起孵育 20 小时。用洗涤缓冲液洗涤后，将谷胱甘肽珠在95°C下煮沸20 min，并通过免疫印迹分析释放的蛋白质。
泛素化测定
HEK293T细胞转染 FLAG-K-RTA WT 或 K-R 突变体、HA-Ub（仅 WT、仅 K48 或仅 K63）和 Myc-OTUD4 WT、C45A 突变体或 1-425aa 突变体。转染后16小时后，用MG132（10μM）再处理细胞10小时。用补充有 1% SDS 的 100% Triton X-150 裂解缓冲液（50 mM NaCl、7 mM Tris-HCl pH 4.1、100% Triton X-1、1 mM EDTA、蛋白酶抑制剂）裂解细胞，并将上清液煮沸 5 分钟以使蛋白质变性。然后将样品稀释 10 倍，将 SDS 的浓度降至 0.1%。然后按上述方法进行FLAG微球免疫沉淀和免疫印迹。
iBAC-K-RTA-3A的产生
如前所述，K-RTA-3A KSHV-iBAC由两步Red介导的重组产生[23,58]。简而言之，以 pEP-KanaS 为模板，对含有卡那霉素抗性盒、I-SceI 限制性内切酶位点和源自 KSHV 基因组的侧翼序列的线性 DNA 片段进行 PCR 扩增。将纯化的PCR产物电穿孔成E。大肠杆菌GS1783菌株中含有KSHV iBAC的引入第一轮重组。通过对提取的 BAC 和 PCR 进行限制性酶切，然后进行 Sanger 测序来验证 Kan/Isce-I 盒的整合。然后将含有修饰的 KSHV iBAC 的 GS1783 菌株与 1% L-阿拉伯糖 （Sigma） 一起孵育以诱导 I-SceI 的表达，然后进行第二轮重组以消除 Kan/I-SceI 盒。挑选卡那霉素敏感和氯霉素耐药菌落，并精确测定 KSHV iBAC。通过对提取的 iBAC 进行限制性酶切和突变区域的 PCR 扩增，然后进行 Sanger 测序，证实了突变的成功引入。
该研究使用了以下PCR引物：
GTCCGGCACACTGTACCAGCTGCACCAATGGCGTAATTACGCTGCGGCCTGAAGTGTTCGCAAGGGCGT AGGATGACGACGATAAGTAGGG;
GGAAGTTAACGCAGGCACAGACGCCCTTGCGAACACTTCAGgccgcagcGTAATTACGCCATTGGTGCA AACCAATTAACCAATTCTGATTAG.
KSHV感染单位的定量
用 Dox （1 μg/ml） 和丁酸钠 （0.5 mM） 处理 SLK.iBAC-GFP 细胞以触发裂解再激活。在指定的时间点收集上清液，并在适当的稀释度下用于感染HEK293T细胞。然后收集、固定感染的细胞并进行流式细胞术分析。使用 FlowJo 10.0 分析流式细胞术数据，并根据 GFP 阳性细胞百分比定量 KSHV 感染单位。
病毒基因组拷贝数的定量
KSHV基因组拷贝数的定量如前所述[54]。简而言之，用 Dox （1 μg/ml） 和丁酸钠 （1.0 mM） 处理 BCBL5-Tet-K-RTA 48 小时以诱导裂解再活化，收集上清液 （500 μl） 并用 7.5 U DNase I（Solarbio，北京，中国）在 1°C 下处理 37 小时。 然后将30μl蛋白酶K（20mg / ml，Solarbio，北京，中国）和50μl20%SDS加入混合物中。在65°C下孵育1小时后，通过苯酚-氯仿提取基因组DNA，并将DNA沉淀在50μlTE缓冲液中分离。将基因组DNA稀释20倍，通过qPCR对KSHV基因组DNA进行定量。使用pEF-FLAG-K-RTA质粒的连续稀释液生成林分曲线。用于定量的引物在S2表中提供。
稳定细胞系的产生
在HEK293T细胞中产生含有指定基因或shRNA的慢病毒[59]。SLK.iBAC-GFP、BCBL1、iSLK或HEK293T感染指定的慢病毒，感染后1 h后用嘌呤霉素（2μg/ml）选择转导细胞48 d。在重构实验中，SLK.iBAC-GFP OTUD4敲低细胞被含有载体对照的慢病毒、OTUD4 WT、OTUD4-C45A或OTUD4 1-425aa突变体感染。将稳定的细胞维持在含有潮霉素B（500μg/ml）或嘌呤霉素（1μg/ml）的培养基中。
为了生成含有K-RTA指示突变体的SLK.iBAC-GFP稳定细胞，将BAC DNA（10μl，~2μg）转染到接种在6孔板（1.5 * 105）使用5μlFugene HD（Promega）。转染后 48 小时后，将细胞转移到 T25 烧瓶中，并在补充有 1% 青霉素-链霉素、10% FCS 和 500 μg/ml 潮霉素 B 的 DMEM 存在下培养。然后将细胞传代培养到适当的平板中，直到GFP阳性集落充分扩增。
免疫荧光
用 Dox （1 μg/ml） 诱导 SLK.iBAC-GFP 细胞 24 小时以触发裂解再激活。然后用PBS洗涤细胞三次，并用4%（w / v）多聚甲醛（PFA）（#DF0131，LEAGENE，北京，中国）固定10分钟。接下来，将固定细胞用PBS洗涤1次，用100%Triton X-5透化10分钟，并在室温下用1%山羊血清（Antgene，武汉，中国）封闭1小时。用洗涤缓冲液（含 0.1% 吐温 20 的 1X PBS）洗涤 4 次后，将细胞与兔抗 K-RTA 或小鼠抗 FLAG 抗体一起在含有 0% BSA 的 PBS 中稀释 05°C 过夜。用洗涤缓冲液（含有 20.647% 吐温-1 的 PBS）洗涤细胞，然后与 Alexa Fluor 1000 偶联山羊抗小鼠二抗 （594：1;Invitrogen）和Alexa Fluor 1000偶联山羊抗兔二抗（1：5;Invitrogen）在室温下放置 60 小时。用洗涤缓冲液和超纯水洗涤后，用DAPI Fluoromount-G封片介质（SouthernBiotech）封片载玻片。最后，使用激光扫描共聚焦显微镜（Leica Stellaris <>）采集图像，并使用Image J和Leica图像浏览器[<>]进行处理。
统计分析
GraphPad Prism（第8版）用于分析所有统计数据。数据表示至少三个独立实验的平均值，误差线表示标准偏差 （S.D.）。采用双尾学生t检验或方差分析（ANOVA）进行统计学分析。显著性差异由 p 值表示 （*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001）。
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KSHV K-RTA 与 OTUD4 相互作用。
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S1 图。 KSHV K-RTA 与 OTUD4 相互作用。
（A） 亲和纯化，然后进行质谱分析以鉴定 K-RTA 结合蛋白。总结了与K-RTA、NCOA2和OTUD4相对应的鉴定肽的数量。（B） 用 Dox （1 μg/ml） 和丁酸钠 （1.0 mM） 诱导 BCBL5-Tet-K-RTA 细胞 48 h，并用指定的抗体进行免疫共沉淀和免疫印迹。（中至英文）用指定的质粒转染HEK293T细胞，并收集WCLs进行抗FLAG亲和琼脂糖免疫沉淀，然后进行免疫印迹。通过免疫共沉淀在HEK490T细胞中评估 K-RTA 截断（包括 K-RTAΔ535–536、K-RTAΔ589–590、K-RTAΔ650–651 和 K-RTAΔ691–4）与 OTUD293 之间的相互作用 （C）。通过免疫共沉淀 （D） 评估 K-RTA 截断（包括 K-RTA （1-650）、K-RTA （1-663） 和 K-RTA （1-676））与 OTUD4 之间的相互作用。采用免疫共沉淀法（E）评估K-RTA（F689A）、K-RTA（R690A）和K-RTA（D691A）等K-RTA点突变与OTUD4的相互作用。
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S2 图。 OTUD4 促进 KSHV 裂解再激活，与其 DUB 活性无关。
（A） 用 Dox （4 μg/ml） 诱导用 sh-Ctrl 或 sh-OTUD1 稳定转导的 SLK.iBAC-GFP 细胞 48 h，并通过 RT-qPCR 定量检测指定基因的表达。 （B） 用 Dox （1 μg/ml） 诱导用 sh-Ctrl 或 sh-OTUD4 稳定转导的 BCBL1-Tet-K-RTA 细胞 48 小时，然后通过 RT-qPCR 定量病毒基因表达。 （C） BCBL1-Tet-K-RTA 细胞的免疫印迹，如图 S2B 所示。（D） 用 Dox （4 μg/ml） 诱导稳定表达 OTUD45 WT 或 C1A 突变体的 SLK.iBAC 48 h，然后进行免疫印迹分析。（E）用Dox（2μg/ ml）和丁酸钠（1.0mM）诱导S5D图中描述的SLK.iBAC-GFP稳定细胞48小时，测定上清液中的KSHV感染单位。
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S3 图。 OTUD4 通过促进 K-RTA K218 去泛素化来促进 K-RTA 去泛素化和稳定性。
（A） PAN-、K57-或vIL-6-报告基因与HA-K-RTA和FLAG-OTUD4 WT或C45A突变体在HEK293T细胞中共表达。在转染后 24 小时测定荧光素酶活性。（B） 用 sh-Ctrl （Scramble） 或 sh-OTUD4 转导的 iSLK 细胞用 DMSO、Baf-A1 （1 mM） 或 MG132 （10 μM） 处理，然后用 Dox （0.2 μg/ml） 诱导 12 小时。（C） 用靶向 ATG293 转导的 sgRNA 转导HEK7T细胞共转染 K-RTA 和 FLAG-OTUD4/C45A（0、0.5、1 或 2 μg），然后在转染后 24 小时进行免疫印迹。（D） 用 FLAG-K-RTA、HA-Ub（仅 K293）和 Myc-OTUD63/C4A 共转染HEK45T细胞，然后用 MG132 （10 μM） 处理。使用抗FLAG亲和琼脂糖进行变性免疫沉淀，然后进行免疫印迹。（E） HEK293T细胞共转染 FLAG-Myd88、HA-Ub（仅 K63）和 Myc-OTUD4/C45A。使用抗FLAG亲和琼脂糖进行变性免疫沉淀，然后进行免疫印迹。（F） HEK293T细胞与 HA-OTUD4 和 FLAG-K-RTA 或指定的突变体共转染，然后在转染后 24 小时进行免疫印迹。（G） FLAG-K-RTA WT 或指示的突变体在HEK48T细胞中与 HA-Ub（仅 K293）共表达。然后按照S3D图中的描述进行变性免疫沉淀。
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S4 图。 在OTUD4募集中具有K-RTA缺陷的KSHV突变体显示出裂解复制受损。
（A）通过Sanger测序分析从KSHV-K-RTA-3A的K-RTA位点扩增的PCR产物。（B） 用 Dox （3 μg/ml） 和丁酸钠 （1.0 mM） 诱导 SLK.iBAC-K-RTA-WT 或 SLK.iBAC-K-RTA-5A 细胞 48 小时。收集含有感染性病毒粒子的上清液，用于感染HEK293T细胞，感染后24 h采用流式细胞术分析感染细胞。（C） 用 sh-Ctrl 或 sh-OTUD3 转导 SLK.iBAC-K-RTA-WT 或 SLK.iBAC-K-RTA-4A 细胞，并通过免疫印迹分析 WCL。（D） 用 Dox （3 μg/ml） 和丁酸钠 （4.1 mM） 诱导用 sh-Ctrl 或 sh-OTUD0 转导的 SLK.iBAC-K-RTA-WT 或 SLK.iBAC-K-RTA-5A 细胞 48 小时，并定量 KSHV 感染单位。
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S5 图。 USP7 与 K-RTA 相互作用并促进 KSHV 再激活。
（A-B）HEK293T细胞用 HA-K-RTA 和 FLAG-USP10/CYLD（0、0.5、1 或 2 μg）共转染，并在转染后 24 小时进行免疫印迹。（C-D）用 sh-Ctrl、sh-USP10 （C） 或 sh-CYLD （D） 转导 SLK.iBAC-GFP 细胞，用 Dox （1 μg/ml） 和丁酸钠 （0.5 mM） 诱导稳定细胞。通过RT-qPCR定量检测指示基因的表达，并在诱导后48 h定量上清液中的KSHV感染单位。（E） 用 sh-Ctrl 或 sh-USP7 转导 SLK.iBAC-GFP 细胞，并在转导后 1 小时用 Dox （0 μg/ml） 和丁酸钠 （5.48 mM） 诱导稳定细胞。通过RT-qPCR定量USP7的表达。 （F） HEK293T细胞共转染 FLAG-MDM2、HA-Ub（仅 K48）和 Myc-USP7。使用抗FLAG亲和琼脂糖进行变性免疫沉淀，然后进行免疫印迹。（G） HEK293T细胞与 FLAG-USP7 和 HA-OTUD4 共表达，转染后 24 h 进行免疫共沉淀和免疫印迹。（H） HEK293T细胞与 HA-USP7 和 FLAG-OTUD4 或指定的突变体共表达，并在转染后 24 小时收集 WCL 进行抗 FLAG 亲和琼脂糖免疫沉淀。通过免疫印迹分析输入和沉淀的样品。（I） GST 或 GST 融合蛋白 [GST-USP7 （1-208aa） 或 GST-USP7 （560-1102aa）] 与在HEK4T细胞中表达的 FLAG-OTUD293 一起孵育。通过免疫印迹分析结合组分，并通过考马斯亮蓝染色观察纯化的 GST 和 GST 融合蛋白。（J） 用 Dox （7 μg/ml） 诱导 sh-Ctrl 或 sh-USP1 稳定转导的 SLK.iBAC-GFP 细胞 48 h，并通过 RT-qPCR 定量检测指示基因的表达。 （K） 用 Dox （1 μg/ml） 诱导用 sh-Ctrl 或 sh-USP7 转导的 BCBL1-Tet-K-RTA 细胞 48 小时。 收集WCLs，并通过免疫印迹法进行分析。
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S6 图。 OTUD4 桥接 K-RTA 和 USP7 的结合以促进 KSHV 裂解再激活。
（A） 从转染有指定质粒的 HEK293T 个细胞中收集 WCL，然后用抗 FLAG 亲和琼脂糖进行免疫沉淀，然后进行免疫印迹。（B） 对用 sh-Ctrl 或 sh-USP293 转导的 HEK7T 细胞进行免疫印迹分析。（C） 如图293B所示的HEK7T-shUSP6细胞。用 FLAG-K-RTA、HA-Ub（仅 K48）和 Myc-OTUD4/C45A 共转染，然后用 MG132 （10 μM） 处理。使用抗FLAG亲和琼脂糖进行变性免疫沉淀，然后进行免疫印迹。（D） HEK293T细胞用 FLAG-OTUD4 全长 （FL） 或 1-425aa 与 HA-K-RTA 共转染，然后在转染后 24 小时进行免疫印迹。（E） 用 FLAG-K-RTA 或 FLAG-K-RTA-K293R、HA-Ub（仅 K218）和 Myc-OTUD48 全长或 4-1AA 共转染HEK425T细胞，然后用 MG132 （10 μM） 处理。使用抗FLAG亲和琼脂糖进行变性免疫沉淀，然后进行免疫印迹。（F）用Dox（6μg/ ml）诱导SLK.iBAC-GFP稳定细胞，如图1I所述48小时，并通过免疫印迹分析WCL。（G） FLAG-OTUD4 和 HA-OTUD4 或 FLAG-OTUD4 （1-425aa） 和 HA-OTUD4 （1-425aa） 在HEK293T细胞中共表达，转染后 24 h 进行免疫共沉淀和免疫印迹。
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S1 表。 质谱数据。
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S2 表。 引物信息。
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确认
我们感谢 Hong-Bing Shu、Ming-Ming 胡、Qing Yang、Jinfang Zhang（武汉大学）、Fanxiu Zhu（佛罗里达州立大学）、Jae Jung（克利夫兰诊所）和 Kevin Brulois（斯坦福大学）的试剂。我们感谢武汉大学医学研究院的核心设施提供了出色的技术支持。
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