免费医学论文发表-哺乳动物正呼肠孤病毒可以在细胞外囊泡中排出细胞
抽象
已经为许多病毒定义了几种出口途径。在这些途径中，细胞外囊泡 （EV） 已被证明是非裂解病毒出口的载体。EV 是作为细胞间通讯形式从细胞释放的膜结合结构的异质群体。EV 介导的病毒出口可能使免疫逃避和病毒集体转运成为可能。无包膜哺乳动物正呼肠孤病毒（呼肠孤病毒）菌株的细胞裂解表型不同，T3D 比 T1L 更有效地破坏细胞膜。然而，呼肠孤病毒的出口机制和转运策略对感染的影响仅部分了解。为了阐明呼肠孤病毒的流出机制，我们用 T2L 或 T1D 呼肠孤病毒感染小鼠成纤维细胞（L 细胞）和非极化人结肠上皮 （Caco-3） 细胞，并富集了大 EV、中 EV、小 EV 和游离呼肠孤病毒的细胞培养上清液。我们发现呼肠孤病毒株都与大中型 EV 结合并作为游离病毒颗粒离开细胞，并且富含 EV 的部分具有传染性。虽然呼肠孤病毒在视觉上与大型和中型 EV 相关联，但只有中型 EV 才能防止抗体介导的中和作用。EV 介导的中和保护是病毒株和细胞类型特异性的，因为富含 L 细胞上清液的培养基 EV 可保护 T1L 和 T3D，而富含 Caco-2 细胞上清液的培养基 EV 在很大程度上不能保护 T3D，只能有效保护 T1L。使用基因条形码呼肠孤病毒，我们提供了证据，证明大中型 EV 可以将多个颗粒输送到受体细胞。最后，T1L 或 T3D 感染会增加 L 细胞中所有 EV 大小的释放。总之，这些发现表明，呼肠孤病毒除了作为游离颗粒退出细胞外，在裂解性或非裂解性感染期间还促进与大型和中型 EV 相关的不同细胞类型的排出，这是一种可以介导多颗粒感染的退出模式，在某些情况下，可以防止抗体中和。
作者摘要
许多病毒用来逃逸细胞的退出策略尚不清楚。呼肠孤病毒是一种无包膜的人类病毒，是了解病毒退出策略及其对感染影响的理想模型系统。我们发现两种不同的呼肠孤病毒株，一种破坏细胞膜，另一种使细胞基本完好无损，增加了细胞外囊泡（EVs）的释放。两种呼肠孤病毒株都以游离颗粒的形式从细胞中释放出来，并与 EV 结合，EV 是在细胞间通讯中起作用的膜结合结构。根据细胞类型和病毒类型，EV可以像“隐形斗篷”一样保护呼肠孤病毒免受抗体的侵害。EV 还可以在细胞之间捆绑和运送呼肠孤病毒颗粒。尽管我们使用细胞来检查呼肠孤病毒与EV结合的影响，但在哺乳动物宿主中，EV可能会保护呼肠孤病毒免受免疫防御，并通过“数量优势”策略促进更有效的传播和感染。基于这些发现的未来工作将测试EV封闭呼肠孤病毒的生物学意义，并可能为溶瘤呼肠孤病毒向肿瘤部位的递送策略提供信息。从广义上讲，这些发现增强了我们对病毒出口策略和感染原理的理解，这些策略和感染原理可能适用于在电动汽车中传播的其他病毒。
数字
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引文： Smith SC， Krystofiak E， Ogden KM （2024） 哺乳动物正呼肠孤病毒可以在细胞外囊泡中排出细胞。PLoS 病理学 20（1）： e1011637 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637
编辑 器： Guangxiang Luo，维克森林大学医学院，美国
收到： 25年2023月2日;接受： 2024年11月2024日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2024 Smith et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金： 这项工作中报告的研究得到了美国国立卫生研究院（R01AI155646 to KMO; 1F31AI167541 to SCS）、国家转化科学促进中心（CTSA 奖号）的支持。UL1 TR002243），并由 Dolly Parton 儿科传染病研究基金资助。SCS得到了传染病化学生物学培训计划（NIH T32AI112541）的支持。通过范德比尔特大学医学中心的消化疾病研究中心进行的范德比尔特细胞成像共享资源服务得到了美国国立卫生研究院资助P30DK058404核心奖学金的支持。细胞成像共享资源和EK也得到了NIH CA68485、DK20593、DK58404、DK59637和EY08126的支持。本出版物的内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院或国家转化科学促进中心的观点。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
多种病毒利用细胞外囊泡（extracellular vesics， EV）作为非裂解性细胞出口的载体[1,2]。EV是从细胞中释放出来的膜结合结构，它通过运输蛋白质、脂质和核酸等分子来清除细胞废物并在细胞间通讯中发挥作用[3\u5]。许多EV亚群已经过表征，通常根据其细胞来源、大小、组成和细胞生物发生途径进行分化[6]。尽管EV具有高度异质性，并且定义随着该领域知识的扩展而变化，但有三种被广泛认可的EV类别：i）小外泌体（30-150 nm），ii）中微泡（100-1000 nm）和iii）大凋亡泡（50–5000 nm）[6\u10]。几种病毒，包括BK多瘤病毒、甲型肝炎病毒和肠道病毒71型，在外泌体内流出[11–14]。肠道病毒（包括蓝舌病毒、脊髓灰质炎病毒和柯萨奇病毒）在分泌型自噬体内流出，分泌型自噬体是双膜自噬体与质膜融合释放单膜囊泡时形成的特殊培养基EV（300-900 nm）[15\u21]。迄今为止，体外和体内微囊泡中释放的唯一病毒是轮状病毒，它是Reovirales目的成员，主要在儿童中引起急性胃肠炎[22]。一些病毒（包括轮状病毒、寨卡病毒和EB病毒）能够上调EV的释放，这可能促进EV介导的病毒出口[23\u25]。尽管最近有所发现，但仍有许多病毒的出口机制知之甚少。
EV 介导的出口和运输是细胞出口的潜在有利策略。对于BK多瘤病毒、肠道病毒71型和甲型肝炎病毒等病毒，EV结合可以保护病毒颗粒免受抗体介导的中和作用[11\u13]。磷脂酰丝氨酸是一种显示在大多数EV表面的磷脂，可作为抗炎免疫反应的有效下调剂，并可作为吞噬摄取信号，增加EV相关病毒进入靶细胞的可能性[26,27]。EV还能够包裹多个病毒颗粒，这可能使同一受体细胞的病毒集体感染成为可能[17,28]。这种病毒在EV中的整体转运已在体外和体内得到证实[17,22,29]。
哺乳动物正呼肠孤病毒（呼肠孤病毒）是一种无包膜病毒，具有分段的双链 RNA 基因组。呼肠孤病毒出口的机制知之甚少。与轮状病毒和蓝舌病毒一样，呼肠孤病毒是呼肠孤病毒纲的成员，呼肠孤病毒纲包括在各种人类和动物宿主中引起疾病的病原体。呼肠孤病毒可感染人类，但很少与疾病相关[30,31]。基于其裂解肿瘤细胞的能力，呼肠孤病毒目前正作为溶瘤疗法进行临床试验[32]。呼肠孤病毒在细胞质中复制[33]。呼肠孤病毒与特定的细胞受体结合，并通过内吞途径进入细胞。菌株特异性抗体可中和结合呼肠孤病毒附着蛋白σ1[34,35]。摄取后，病毒被蛋白水解，通过去除和切割外衣壳蛋白转化为传染性亚病毒颗粒（ISVP），并渗透到细胞质中，核心合成病毒转录本，这些转录本被翻译[33]。病毒蛋白在细胞质中积累并形成复制工厂，作为颗粒组装和成熟的位点[33,36,37]。成熟颗粒以裂解或非裂解方式从细胞中释放出来，但目前尚不清楚控制这些出口表型的机制是什么[38]。呼肠孤病毒株，即1型朗（T1L）和3型迪林（T3D）在发病机制、嗜性和诱导细胞凋亡的能力方面存在差异，其中T3D诱导细胞凋亡的效率高于T1L[39–43]。细胞凋亡诱导与后代病毒产量之间似乎关系不大[40,44,45]。
呼肠孤病毒感染会引发某些类型细胞的裂解，包括HeLa细胞和Madin-Darby犬肾细胞[45,46];然而，在人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells， HBMECs）和原代人气道上皮细胞中，呼肠孤病毒在没有裂解的情况下会排出细胞[47\u49]。HBMECs和原代人气道上皮细胞可能比永生HeLa细胞系更接近模拟呼肠孤病毒在动物体内感染的细胞。在HBMEC中，溶酶体衍生的膜结构称为“分选细胞器”，似乎从呼肠孤病毒复制工厂收集成熟的呼肠孤病毒颗粒[48]。然后，呼肠孤病毒颗粒组以较小的“膜载体”穿梭到质膜上，这些载体与质膜融合并以非裂解方式释放游离呼肠孤病毒颗粒。虽然已经表征了一种细胞类型的非裂解流出机制，但其他细胞类型的非裂解流出途径仍然未知。
在这项研究中，我们试图确定呼肠孤病毒如何从感染细胞中释放，以及呼肠孤病毒出口策略如何影响受体细胞的下游感染。使用两种膜破坏效率不同的呼肠孤病毒株，T1L和T3D，以及我们设计为含有遗传条形码的病毒，我们发现呼肠孤病毒感染增强了EV的释放，并且呼肠孤病毒可以从细胞中排出与EV相关。在某些情况下，这些 EV 可保护呼肠孤病毒颗粒免受抗体介导的中和作用，并在细胞之间传播多种呼肠孤病毒颗粒。这项工作揭示了呼肠孤病毒可能逃避免疫系统防御并克服细胞感染阈值的潜在机制，从而增加了生产性感染的可能性。这些发现增强了我们对出口策略对病毒感染影响的理解，可能广泛适用于在电动汽车中释放并与电动汽车一起传播的病毒。进一步了解EV介导的病毒出口的机制和影响可能有助于为改进病毒疫苗接种策略和病毒载体的递送提供信息，包括溶瘤呼肠孤病毒疗法。
结果
呼肠孤病毒蛋白与细胞释放的富含 EV 的组分共分馏，与质膜完整性表型无关
我们评估了T1L和T3D复制对小鼠L929成纤维细胞（L细胞）质膜完整性的影响，这些细胞易受呼肠孤病毒感染并产生高病毒产量[50]。为了评估呼肠孤病毒的复制效率，我们用 T1L 或 T3D 呼肠孤病毒吸附 L 细胞，每 24 小时收获一次感染的细胞培养上清液，总共 96 小时。我们使用荧光聚焦测定 （FFA） 在每个时间点量化了病毒总滴度，包括细胞内病毒复制和细胞释放的病毒。尽管接种物含有相同的感染单位，但两种菌株之间的细胞结合似乎有所不同，因为吸附后立即的T1L滴度显着低于T3D（图1A）。然而，两种病毒的复制都是有效的，并且在感染后 48 小时 （p.i.） 时达到相似的峰值滴度。在用 T1L 或 T3D 呼肠孤病毒或单独培养基（模拟）吸附 L 细胞后，我们每 24 小时使用台盼蓝染色评估质膜破坏，持续 96 小时。与T1L感染和模拟感染的细胞相比，T3D感染的细胞明显更多为台盼蓝阳性，几乎所有细胞的质膜均被96小时破坏（图1B）。与 T3D 感染相比，T1L 感染产生的台盼蓝阳性细胞水平较低，在大多数时间点与模拟感染相当，表明质膜破坏最小。我们还使用乳糖酶脱氢酶（LDH）测定法评估了质膜损伤。使用台盼测定法观察到，基于荧光的LDH释放定量表明，T3D诱导的细胞毒性明显高于T1L，而T1L未能比单独培养基诱导更多的损伤（S1图）。因此，尽管 T3L 和 T<>D 都在 L 细胞中有效复制，但这些菌株在破坏细胞膜的能力方面表现出显着差异。因此，我们怀疑这些病毒可能采用不同的出口策略。
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图 1. 呼肠孤病毒蛋白与细胞释放的富集 EV 组分共分馏，而不考虑质膜完整性表型。
L 细胞吸附 1 个单独的 T3L 或 T1D 呼肠孤病毒克隆，MOI 为 24 PFU/细胞。（A）每3小时收集细胞裂解物，并通过FFA定量上清液中的病毒。误差线表示 SD。 n = 0。*，P < 05.0;**，P < 01.0;，P < 001.1 通过双样本不配对 T 检验。（B） 使用台盼蓝染色每 3 小时对 T24L、T96D 和模拟感染细胞的细胞膜破坏进行定量，持续 3 小时。误差线表示 SD。 n = 0。*，P < 05.0;**，P < 01.0;，P < 001.0;，P < 0001.24 通过单因素方差分析与 Tukey 的多重比较。（C）示意图，显示文中描述的EV馏分富集方案。使用 Biorender.com 创建。（D-G）每 96 小时收集一次感染细胞上清液，持续 96 小时。1 h收集模拟感染的上清液，但未检测到呼肠孤病毒蛋白。呼肠孤病毒蛋白与大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分的关联在 SDS-PAGE 和免疫印迹后进行定量。显示了使用呼肠孤病毒抗血清探测的 T3L （D） 和 T1D （F） 的代表性免疫印迹，以及显示 T3L （E） 和 T3D （G） 的三个独立免疫印迹定量结果的图表。星号表示用于定量的呼肠孤病毒λ3蛋白条带。误差线表示 SD。 n = 0。*，P < 05.0;，P < 001.72 通过归一化前的 Tukey 多重比较的单因素方差分析。通过将每个调整后的体积值除以印迹中的最高测量值，将蛋白质信号归一化为最大值的百分比。（H） 在 3 小时收获感染细胞上清液，并通过噬菌斑测定法定量与每个 EV 组分相关的病毒感染单位。误差线表示 SD。 n = 0。**，P < 01.<> 通过双向方差分析与 Tukey 的多重比较。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.g001
为了评估呼肠孤病毒与富集 EV 组分的关联，我们用 T1L 或 T3D 吸附 L 细胞，并使用序贯差速离心来分离 EV 群体。对于某些尺寸的电动汽车，所选择的离心条件会富集;大型电动汽车富集2,000 × g，中型电动汽车富集10,000 × g富集（图1C）[6]。预计以100,000×g离心可沉淀出混合的小EV和游离呼肠孤病毒颗粒[6,50]。这些部分不是任何一种电动汽车的“纯”种群;相反，它们代表了基于大小的丰富。然而，我们预计凋亡水泡主要富集于大 EV 部分、微泡富集于中 EV 部分，外泌体富集于 EV 部分[6]。由于游离呼肠孤病毒颗粒的大小和密度，预计不会在2,000 × g或10,000 × g时沉淀，除非它们与较大的结构直接相关[50]。为了确定呼肠孤病毒蛋白是否与每个富含 EV 的部分相关，我们每 24 小时从感染的 L 细胞中收获上清液，持续 96 小时，并富集大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分。我们通过SDS-PAGE和免疫印迹法分离了等体积的每个样品，并量化了与每个组分相关的呼肠孤病毒λ3结构蛋白信号。我们发现呼肠孤病毒结构蛋白与每种 EV 大小的富集组分相关，并且关联随着感染时间的增加而增加（图 1D-1G）。通过96小时p.i.，我们检测到与大EV，中EV和小EV /游离病毒组分相关的T1L蛋白比例大致相等（图1E）。同样，在 96 小时 p.i. 时，我们检测到 T3D 蛋白与培养基 EV 和小 EV/游离病毒组分的结合大致等效，尽管 T3D 蛋白与大 EV 组分的结合相对较低（图 1G）。因此，尽管呼肠孤病毒株之间存在一些菌株特异性蛋白关联差异，但我们检测到呼肠孤病毒结构蛋白与富集大 EV、中型 EV 和小 EV/游离病毒的上清液组分的关联。
为了确定呼肠孤病毒非结构蛋白是否与每个富含 EV 的部分相关，我们在 72 小时 p.i. 下从感染的 L 细胞中收获上清液，并富集大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分。我们选择72 h p.i时间点进行该分析，因为在3 h p.i.时，T96D诱导的几乎完全的质膜破坏，存在大量可检测到的呼肠孤病毒-EV关联（图1B，1E，1G和S1）。我们通过SDS-PAGE和免疫印迹分离了等体积的每个样品，并量化了与每个EV组分相关的呼肠孤病毒σNS非结构蛋白信号（S2A图）。我们观察到 T1L σNS 蛋白（S2B 图）仅与小的 EV/游离病毒组分相关，而 T3D σNS 蛋白（S2C 图）与中型和大 EV 级分相关。
为了确定与 EV 组分相关的呼肠孤病毒蛋白是否代表传染性呼肠孤病毒，我们使用斑块测定法来确定与大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分相关的 T1L 和 T3D 滴度。在72小时p.i.时，在所有EV组分中检测到传染性呼肠孤病毒（图1H）。对于 T3D，我们检测到与大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒富集的组分相关的高传染性病毒滴度，其中与大 EV 相关的高滴度最一致（图 1G–1H）。对于 T1L，与大 EV 和中 EV 富集组分相关的传染性病毒滴度是可变的，有时低于小 EV/游离病毒组分中的传染性病毒滴度，尽管滴度通常很高，并且差异无统计学意义（图 1H）。综合起来，这些数据表明，无论在感染过程中诱导细胞膜破坏的能力如何，传染性 T1L 和 T3D 呼肠孤病毒都会从细胞中释放出来，与在富集 EV 的条件下收获的细胞衍生结构相关。
细胞外呼肠孤病毒在视觉上与大中型 EV 相关联
为了对呼肠孤病毒相关的细胞衍生结构进行成像，我们用呼肠孤病毒吸附了 L 细胞。我们在 1 小时 p.i. 下收获细胞上清液，通过顺序离心富集大型 EV 或中型 EV，并使用负染色透射电子显微镜 （EM） 对每个馏分进行成像。大 EV 和中等 EV 组分通常针对目标 EV 大小富集，但不是均匀的（图 3）。从呼肠孤病毒感染的细胞上清液中纯化的大型 EV 包含直径数百至一千多纳米的包膜结构，其膜通常显得薄且不均匀，这可能是由于大型 EV 内的内容物丢失所致（图 72A–2B）。在某些情况下，该组分中的EV结构较小，似乎具有较厚的膜，并形成聚集体。我们观察到直径约为2纳米的呼肠孤病毒颗粒粘附在这些结构上，或者在某些情况下可能被封闭在这些结构中。当我们可视化从呼肠孤病毒感染细胞的上清液中纯化的培养基 EV 时（图 2C–80D），我们观察到直径为 ~ 2 nm 的囊泡。这些电动汽车往往具有更圆、更均匀的形状和明确的膜。我们观察到呼肠孤病毒颗粒与中等EV有关，尽管通常不清楚颗粒是在EV的内部还是外部。我们观察到单个病毒颗粒、成对颗粒和多颗粒簇（图 2A-600D）。尽管我们的方法旨在限制这种 EV 中断，但我们不能排除某些 EV 在 EM 成像的样品制备过程中被破坏并随后释放病毒颗粒的可能性。总体而言，这些发现表明离心可以富集大型和中型 EV，尽管这些馏分似乎至少包含部分异质 EV 群体。此外，T2L 和 T2D 呼肠孤病毒都与大中型 EV 有关;然而，目前尚不清楚呼肠孤病毒颗粒是结合在电动汽车的外部还是内部包装。
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图 2. 胞外呼肠孤病毒在视觉上与大型和中型 EV 相关联。
用呼肠孤病毒株 T1L 或 T3D 以 1 PFU/细胞的 MOI 吸附 L 细胞 72 h。收集细胞上清液并依次离心以富集大 EV （A-B） 或中 EV （C-D），使用阴性染色 EM 进行可视化。箭头表示病毒颗粒。比例尺 = 200 nm。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.g002
细胞外呼肠孤病毒不能与小EV结合
我们预计序贯离心方案的最后一步将富集小 EV 和游离呼肠孤病毒颗粒的混合群体。为了确定是否可以从游离呼肠孤病毒颗粒中分离出小的EV，我们用T1L或T3D感染L细胞72小时，收获上清液，并将大的EV耗尽和中等EV耗尽的上清液浓缩在碘克沙醇垫上（图3A）。我们将所得的小 EV/游离病毒沉淀物施加到碘克沙醇梯度中，并离心过夜。我们收集了 12 × 1 ml 馏分，馏分 1 代表梯度的顶部，馏分 12 代表梯度的底部。我们分离了收集的馏分，并对呼肠孤病毒蛋白和小EV蛋白标记物CD81进行了免疫印迹（图3B–3E）[6,51]。梯度分离的T1L感染的细胞上清液在组分81-7中产生强烈的CD9阳性小EV信号，这与组分10-12中检测到的呼肠孤病毒蛋白信号不同（图3B-3C）。梯度分离的T3D感染的细胞上清液表现出相似的表型;我们在组分 81-7 中检测到 CD10，在组分 9-12 中检测到呼肠孤病毒蛋白，每个组分的峰值信号（图 3D-3E）。对于T1L和T3D，第7组含有小EV，其体积小，呈杯状形态，与外泌体相似[52,53];我们没有检测到该组分中的呼肠孤病毒颗粒（图3F–3G）。馏分 10 主要包含蛋白质聚集体，一些小的 EV 稀疏地散布在整个过程中（图 3H–3I）。我们没有在这部分中检测到任何T1L颗粒，尽管我们确实检测到T3D颗粒，但我们没有观察到呼肠孤病毒颗粒与小EV的物理关联。组分 11 含有游离的 T1L 和 T3D 病毒颗粒，没有小的 EV（图 3J–3K）。这些发现表明，呼肠孤病毒后代的一个子集以游离病毒颗粒的形式从L细胞中排出，无法与任何EV群体结合。
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图 3. 细胞外呼肠孤病毒颗粒无法与小 EV 结合。
将 L 细胞吸附在呼肠孤病毒株 T1L 或 T3D 的三个单独克隆中，MOI 为 1 PFU/细胞 72 小时。从感染的细胞上清液中清除细胞碎片、大 EV 和中等 EV，如图 1C 所示。（A） 将所得上清液在 60% 碘克沙醇垫上离心，以浓缩小的 EV 和游离病毒颗粒。将沉淀上样到5–40%碘克沙醇梯度上。收集并分析了 1 个 1 ml 馏分。使用 Biorender.com 创建。（B-E）使用 SDS-PAGE 和免疫印迹分离 T3L 感染 （B-C） 或 T81D 感染 （D-E） 碘克沙醇梯度组分，以检测 CD81（绿色）和呼肠孤病毒蛋白（红色）。（乙，D）。在三个独立实验中定量了组分 6-12 中的相对 CD3 和呼肠孤病毒蛋白信号。星号表示用于定量的呼肠孤病毒λ7蛋白条带。（C，E）。误差线表示 SD。 （F-K） 组分 10 （F， G）、11 （H， I） 和 200 （J， K） 的含量使用负染色 EM 成像。指示用于感染收集梯度分离上清液组分的细胞的呼肠孤病毒株。比例尺 = <> nm。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.g003
呼肠孤病毒对大中型EV的非特异性粘附效率低下
接下来，为了确定呼肠孤病毒与大型或中型 EV 的结合是否主要通过非特异性外部粘附介导，我们评估了呼肠孤病毒与从模拟感染细胞中收获的 EV 组分结合的能力。我们在 1 小时 p.i 下从 T3L 感染、T72D 感染和模拟感染的 L 细胞中收集了大 EV 和中等 EV 组分。我们将游离的 T3D 和 T1L 病毒颗粒与从模拟感染细胞中收获的等体积的大型 EV 和中型 EV 或载体缓冲液一起孵育，并以各自的离心速度重新沉淀每个组分。使用库马西蓝染色，我们确定，与呼肠孤病毒感染的富集 EV 组分相比，每个未感染的富集 EV 组分中产生大致相等的蛋白质量需要三倍的未感染细胞数量（S3A–S3B 图）。使用SDS-PAGE和呼肠孤病毒蛋白免疫印迹，我们发现游离T1L病毒和游离T3D病毒中自发与未感染的大中型EV结合的蛋白质量明显低于感染期间与EVs结合的呼肠孤病毒量，尽管我们无法直接比较两种条件下的输入病毒（S3C和S3E图）。在没有EV的情况下，游离呼肠孤病毒颗粒在2,000 × g或10,000 × g时无法沉淀（S3C–S3F图）[50]。此外，我们观察到 T1L 病毒与来自模拟感染细胞的大中型 EV 的自发关联显着低于游离 T1L 病毒输入（S3D 图）。有趣的是，尽管 T3D 病毒与来自模拟感染细胞的大中型 EV 的自发关联也显着低于游离 T3D 病毒输入，但我们检测到的与 EV 相关的输入百分比更高，表明 T3D 比 T1L 更有效地粘附在囊泡上（S3F 图）。尽管在缔合效率方面存在菌株特异性差异，但非特异性病毒对大中型 EV 的粘附不太可能完全解释这些颗粒在出口过程中与 EV 的关联。
EV 介导的呼肠孤病毒出口与微囊泡生物发生一致
为了可视化细胞的 T1L 和 T3D 出口，我们用 T1L 或 T3D 呼肠孤病毒吸附 L 细胞，并使用薄片透射电子显微镜 （TEM） 成像（S4 图）。在极少数情况下，我们检测到单个T1L或T3D颗粒与质膜结构相关，这些结构似乎正在向外萌芽（S4A-S4B图，左两张图像）。我们观察到 T1L 或 T3D 病毒颗粒以单个颗粒、成对颗粒或多个颗粒簇的形式存在于 EV 样结构中，这些结构不同但靠近质膜（S4A-S4B 图，右两张图像）。这些EV样结构的直径范围从~400 nm到~600 nm，类似于微泡的大小。因此，至少3个呼肠孤病毒出口途径的表型似乎与微泡的生物发生一致，微泡在捏断和释放之前从质膜向外萌芽[7,10,<>]。
中型EV可保护呼肠孤病毒免受中和和蛋白水解
为了确定与EV的结合是否可以保护呼肠孤病毒免受抗体介导的中和作用，我们采用了噬菌斑减少中和试验。我们从感染T1L或T3D的L细胞的上清液中富集大EV，中EV和小EV/游离病毒组分，以及碘克沙醇梯度分离的游离病毒72小时（图4A）。我们用呼肠孤病毒株特异性中和抗血清或单独用培养基处理每个组分，并通过噬菌斑测定法测定滴度。我们假设，如果呼肠孤病毒以游离颗粒或粘附在 EV 外部的颗粒形式存在，则病毒将对中和敏感，并且处理过的样品滴度将相对于未处理的样品滴度降低。然而，如果呼肠孤病毒颗粒被封闭在EV中，那么病毒将受到保护，不会被中和，并且处理过的样品滴度将与未处理的样品滴度相当。我们发现，当呼肠孤病毒与大 EV 或小 EV/游离病毒组分相关时，T1L 和 T3D 都被中和到与游离呼肠孤病毒相似的水平，滴度平均降低 100 倍（图 4B-4E）。相比之下，当与中等 EV 分数结合时，T1L 和 T3D 滴度不受影响，显示出强大的中和保护作用。这些发现表明，从L细胞释放的T1L和T3D颗粒被特异性包装在中型EV内，而不是在大型EV内。
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图 4. 多种呼肠孤病毒颗粒可由保护性中型电动汽车和非保护性大型电动汽车运输。
（A） L细胞吸附呼肠孤病毒株T1L或T3D的三个单独克隆，MOI为1 PFU/细胞。如前所述，72小时后，使用顺序离心和碘克沙醇梯度分离富集EV相关和游离呼肠孤病毒颗粒，然后与σ1特异性呼肠孤病毒抗血清（处理）或稀释剂（未处理）一起孵育。通过噬菌斑测定法对感染单位进行定量。使用 Biorender.com 创建。（B-E）显示了每个样品的斑块滴度 （B、D） 和相对感染性百分比，通过将处理过的感染单位除以模拟处理的感染单位并乘以 100 （C， E） 来量化。误差线表示 SD。 “n.d.” = 未检测到。n = 三个独立实验中每个样品的两个滴度。*，P < 0.05;，P < 0.0001 通过双样本不配对 T 检验。（F） L 细胞与独立接种的 WT 或 BC T3D 呼肠孤病毒共感染，MOI 为 10 PFU/细胞。在 24 小时 p.i. 时，使用顺序离心从上清液中收获大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分，随后用于接种斑块测定。挑选并扩增代表单个感染单位的斑块，这些斑块可能是 EV 相关的束或游离病毒颗粒。使用 HRM 对病毒 RNA 进行基因分型。使用 Biorender.com 创建。（G） 显示了来自 WT（红色）、BC（蓝色）以及 WT 和 BC（绿色）RNA 的 2：1、1：1 和 1：2 混合物的对照 RNA 的归一化熔解曲线。（H） 大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分的基因型定量占所分析斑块总数的百分比。误差线表示 SD。 n = 24 个斑块，由四个独立实验中的每个数据点表示。**，P < 0.01;，P < 0.001 通过 Pearson 的卡方分析与成对比较。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.g004
作为一种互补的方法，我们使用蛋白酶糜蛋白酶，它可以在体外将呼肠孤病毒粒子隐蔽到 ISVP，以评估 EV 对病毒颗粒的保护能力。糜蛋白酶处理后，病毒粒子失去外衣壳蛋白σ3，μ1C被切割成包括δ的片段[33]。使用糜蛋白酶的浓度，我们观察到病毒粒子在小 EV/游离病毒组分中完全转化为 ISVP，我们用 20 μg/mL 糜蛋白酶处理从感染的 L 细胞中富集的大、中、小 EV。然后，我们通过SDS-PAGE和免疫印迹分离病毒结构蛋白，并定量了糜蛋白酶处理样品相对于模拟处理样品的σ3或μ1C蛋白信号（S5A和S5C图）。对于T1L和T3D，与中型EV相关的呼肠孤病毒，与模拟处理的信号相比，凝乳蛋白酶处理后保留的μ1C蛋白信号明显高于小型EV（S5B和S5D图）。对于T1L，该信号也明显高于与大型EV相关的信号。尽管与其他组分相比，凝乳蛋白酶处理后保留的 σ3 蛋白信号在中等 EV 组分中没有统计学意义，这可能是由于高度变异性，但它是唯一检测到 σ3 信号的 EV 组分。因此，中等 EV 似乎能够至少部分保护释放的呼肠孤病毒免受细胞外环境的两种成分（中和抗体和蛋白酶）的影响。
大、中型EV相关呼肠孤病毒可介导多颗粒感染
为了确定EV是否可以运输由多个呼肠孤病毒颗粒组成的感染单位，我们使用高分辨率熔解（HRM）分析来检测单个病毒颗粒的基因型[54]。我们将 L 细胞与野生型 （WT） 和遗传条形码 （BC） T3D 呼肠孤病毒共感染，在 24 小时 p.i. 时收集细胞培养上清液，并富集大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分（图 4F）。我们用连续稀释的完整 EV 组分或游离呼肠孤病毒颗粒吸附新鲜的 L 细胞单层和分离的单个斑块，我们在这里将其定义为单个感染单位。在游离病毒颗粒的情况下，单个感染单位可能是独立的WT颗粒或独立的BC颗粒。如果 EV 将多个颗粒捆绑在一起，则单个感染单位可能包含多个 WT、多个 BC 或多个 WT 和 BC 颗粒。我们使用 HRM 分析对单个病毒斑块感染单位进行基因分型，该分析根据条形码中遗传多态性赋予的熔解温度差异来区分 WT 和 BC RNA（图 4G）。同时包含 WT 和 BC 病毒的多颗粒群体预计将产生中间熔解曲线。仅包含WT或BC病毒的多颗粒群体将产生与单个病毒颗粒感染产生的熔解曲线无法区分的熔解曲线（S6图）。在四个独立实验中，我们检查了每个部分的 24 个斑块，总共有 96 个斑块代表三个部分中的每一个。虽然我们在小 EV/游离病毒组分中由病毒形成的斑块中没有检测到基因型混合物，但在大 EV 富集组分 （~ 6%） 中，呼肠孤病毒斑块的很大一部分包含多个基因组（图 4H）。在中等富含 EV 的部分中，我们检测到含有多个基因组的呼肠孤病毒斑块具有统计学意义且水平略高 （~ 11%）。相比之下，在由小型EV或游离病毒形成的斑块中从未检测到多个基因组。因此，我们的数据表明，很大一部分大型 EV 和中型 EV，而不是小型 EV，可以在细胞之间以传染性多颗粒束的形式运送呼肠孤病毒。
EV 介导的呼肠孤病毒出口发生在多种细胞类型中，但中和保护可能取决于细胞类型和病毒株
为了研究EV介导的呼肠孤病毒是否发生在L细胞鼠成纤维细胞以外的细胞类型中，我们使用了非极化Caco-2人结肠上皮细胞，其更接近于哺乳动物呼肠孤病毒感染的肠上皮细胞[33]。我们比较了Caco-1细胞感染后的T3L和T2D滴度与感染过程中L细胞感染后的滴度（图5A-5B）。尽管在感染多重性 （MOI） 为 1 PFU/细胞时，T2L 在 Caco-5 细胞中的复制效率明显低于在 MOI 为 1 PFU/细胞时在 L 细胞中的复制效率，但 T1L 滴度在整个时间过程中增加了 500 倍以上（图 5A）;Caco-3 细胞和 L 细胞中的 T2D 复制相当（图 5B）。两种病毒的质膜损伤和破坏表型相似，与T3L相比，T1D诱导的膜破坏水平明显更高（图1B，5C和S7）。虽然 L 细胞中所有组分的 T1L 蛋白结合相当，但 T1L 蛋白与 Caco-2 衍生的培养基 EV 组分的结合相对于小 EV/游离病毒组分显着降低（图 1E 和 5D）。虽然 T3D 结构蛋白与来自 L 细胞的大 EV 组分的结合相对于培养基 EV 和小 EV/游离病毒组分显着降低，但 T3D 蛋白与所有 Caco-2 衍生的富集 EV 组分的结合通常相当（图 1G 和 5E）。与我们之前在 L 细胞中观察到的表型相比，非结构蛋白 σNS 似乎与来自感染 T2L 或 T1D 的 Caco-3 细胞的任何 EV 组分无关（S2 和 S8 图）。与L细胞的观察类似，传染性呼肠孤病毒与Caco-2细胞释放的所有EV组分相关（图5F）。在大多数情况下，对于给定的病毒，与每个组分相关的传染性病毒滴度分布大致相同，但对于具有中等 EV 组分的 T1L 来说，分布显着较低。总体而言，我们观察到传染性呼肠孤病毒与小鼠 L 细胞和人 Caco-2 细胞释放的 EV 相关，这表明 EV 介导的呼肠孤病毒出口的这种机制并非 L 细胞所独有，可以发生在多种细胞类型中。
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图 5. EV 介导的呼肠孤病毒出口发生在多种细胞类型中，但对中和的保护可能取决于菌株。
（A-B）Caco-2 细胞被 T1L （A） 或 T3D （B） 的三个单独克隆感染，MOI 为 5 PFU/细胞 （Caco-2），在 L 细胞中定量。在指定的时间点，收集细胞裂解物，并通过FFA测定病毒滴度。在1 PFU /细胞的MOI下L细胞的T3L或T1D感染的结果与图1A重复进行比较。误差线表示 SD。 n = 3。*，P < 0.05;**，P < 0.01;，P < 0.001 通过双样本不配对 T 检验。（C） Caco-2 细胞吸附呼肠孤病毒株 T1L 或 T3D 的三个单独克隆，MOI 为 5 PFU/细胞。使用台盼蓝染色每 1 小时对 T3L、T24D 和模拟感染细胞的细胞膜破坏进行定量，持续 96 小时。误差线表示 SD。 n = 3。*，P < 0.05;**，P < 0.01;，P < 0.0001 通过单因素方差分析与 Tukey 的多重比较。（D—E）每 2 小时收集一次感染的 Caco-24 细胞上清液，持续 96 小时。96 h收集模拟感染的上清液，但未检测到呼肠孤病毒蛋白。在 SDS-PAGE 和 T1L （D） 或 T3D （E） 免疫印迹后，定量呼肠孤病毒蛋白与大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分的关联。误差线表示 SD。 n = 3。*，P < 0.05 通过归一化前的 Tukey 多重比较的单因素方差分析。通过将每个调整后的体积值除以印迹中的最高测量值，将蛋白质信号归一化为最大值的百分比。（F）在72小时时收获感染的细胞上清液，并通过噬菌斑测定法定量与每个EV组分相关的病毒感染单位。误差线表示 SD。 n = 3。*，P < 0.05 通过双向方差分析与 Tukey 的多重比较。（G-J）如图所示，用呼肠孤病毒株T2L或T1D的三个单独克隆吸附Caco-3细胞，MOI为1 PFU/细胞，并按图4A所述分离和处理上清液。通过噬菌斑测定法对感染单位进行定量。显示了每个样品的斑块滴度 （G， I） 和相对感染性百分比，通过将处理的感染单位除以模拟处理的感染单位并乘以 100 （H， J） 来量化。误差线表示 SD。 “n.d.” = 未检测到。n = 三个独立实验中每个样品的两个滴度。*，P < 0.05;，P < 0.0001 通过双样本不配对 T 检验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.g005
为了确定呼肠孤病毒颗粒是否被包装在 Caco-2 衍生的 EV 中并防止抗体中和，我们使用了噬菌斑减少中和试验（图 4A）。我们发现，当 T1L 与 Caco-2 衍生的大 EV 和小 EV/游离病毒相关时，它被中和到与游离呼肠孤病毒相似的水平，但当与中型 EV 相关时，它被保护免受中和（图 5G–5H）。有趣的是，当与任何 Caco-3 衍生的 EV 组分结合时，T3D 被有效地中和到与游离 T2D 呼肠孤病毒相似的水平（图 5I-5J）。这些发现表明，T1L颗粒被包装在两种细胞类型释放的培养基EV中。然而，EV 介导的保护似乎是病毒株和细胞类型依赖性的，因为 T3D 在与 L 细胞衍生的培养基 EV 结合时受到有效保护，但 T3D 在与 Caco-2 衍生的培养基 EV 结合时受到的保护效率低下。
呼肠孤病毒感染增强了EV的释放
为了了解呼肠孤病毒感染是否影响全细胞水平的EV释放，我们用培养基（模拟）或T1L或T3D呼肠孤病毒吸附L细胞，孵育细胞72小时，并使用顺序差速离心富集细胞培养上清液大EV，中EV和小EV/游离病毒组分，以等体积重悬每个。为了比较每个EV级分中存在的蛋白质的相对量，我们使用SDS-PAGE并解析了相等的样品体积（图6A）。与未感染的细胞相比，T1L或T3D感染的细胞释放的物质在大多数EV组分中含有显著增加的总蛋白信号（图6B）。平均而言，与模拟感染细胞相比，我们检测到感染细胞每个部分的释放蛋白增加了约两倍（图6C）。为了选择 EV，我们使用膜联蛋白 V 纳米珠免疫沉淀对大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分进行进一步分离。膜联蛋白 V 结合磷脂酰丝氨酸，磷脂酰丝氨酸存在于大多数 EV 的外部，但不显示在健康细胞的表面。在将等体积的免疫沉淀样品置于 SDS-PAGE 后，我们发现呼肠孤病毒感染增加了与释放的大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分相关的蛋白质量（图 6D）。虽然只有大 EV 部分的差异具有统计学意义，但平均而言，我们检测到感染细胞释放的 EV 部分的蛋白质信号比模拟感染细胞的相应部分增加 6 倍至 6 倍以上（图 1E-3F）。为了确保相关蛋白的增加是EV释放的结果，而不是呼肠孤病毒感染引发的总蛋白表达的一般变化，我们用单独培养基（模拟）或T72L或T9D呼肠孤病毒吸附L细胞，让感染进行9小时。然后，我们收获细胞单层，并通过SDS-PAGE和库马西蓝染色定量细胞裂解物中的总蛋白（S9A图）。我们没有检测到感染细胞和未感染细胞之间总蛋白表达变化的显着变化或趋势（S<>B–S<>C图）。
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图 6. 与未感染的细胞相比，呼肠孤病毒感染可增强 EV 的释放。
L细胞被培养基吸附（mock;M） 或 1 个单独的 T3L 或 T1D 呼肠孤病毒克隆，MOI 为 72 PFU/细胞 10 小时。 （A-C） 如前所述，使用顺序离心从上清液中收获富含大、中和小 EV 的馏分，然后裂解。通过SDS-PAGE和考马斯染色（A）分离等体积的裂解物，定量8个独立实验（B），并通过将平均病毒感染值除以平均模拟感染值（C）对其进行归一化。（D-F）如前所述，使用顺序离心从上清液中收获富含大、中和小 EV 的馏分。然后，使用与磷脂酰丝氨酸结合的膜联蛋白V纳米珠对EV进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE和考马斯染色（D）分离等体积的免疫沉淀材料，定量三个独立实验（E），并通过将平均病毒感染值除以平均模拟感染值（F）进行归一化。（G-H）如前所述，使用顺序离心从上清液中收获富含大、中和小 EV 的馏分。将每个样品重悬于等体积的盐平衡缓冲液中，使其与荧光脂质染料相互作用，加载到Mattek培养皿的孔中，用无菌玻璃盖玻片覆盖，并使用共聚焦显微镜成像。在 8 个随机视场中对 EV 进行计数，每个视场代表一个 0 x 05 的平铺成像结构 （G），并通过将平均病毒感染值除以平均模拟感染值 （H） 进行归一化。误差线表示SD.*，P<0.01;**，P < 0.001;，P < <>.<> 通过单因素方差分析和 Tukey 的多重比较。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.g006
在确定呼肠孤病毒感染对 EV 释放影响的平行方法中，我们使用亲脂性染料 DiI 来量化呼肠孤病毒感染细胞与未感染细胞相比释放的 EV。在用 T1L、T3D 或培养基（模拟）吸附后，我们富集了大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分。我们将馏分与DiI混合以染色膜，然后通过共聚焦显微镜对6个随机选择的视场进行成像，并使用EVAnalyzer FIJI插件对DiI阳性点进行计数，这些点可能代表EV（图10G和S55）[3]。尽管视野各不相同，但呼肠孤病毒感染细胞的脂质染色 EV 总数明显高于未感染细胞的 EV 计数。T1D感染细胞释放的大EV的平均倍数变化明显高于T6L感染细胞，分别是3倍变化和3倍变化（图6H）。我们假设，由于 T6D 导致 L 细胞的质膜破坏和凋亡，因此 T<>D 感染的 L 细胞可能会释放更多的凋亡泡和质膜碎片，这些泡和质膜碎片最有可能在大 EV 部分中沉淀。与免疫沉淀测定的结果一致，用亲脂性染料染色的 EV 的定量表明，呼肠孤病毒感染通常会使大多数大小的 EV 从 L 细胞中释放出一倍或三倍（图 <>F 和 <>H）。总的来说，这些数据表明呼肠孤病毒感染增强了各种大小的EV的释放。
讨论
我们试图了解呼肠孤病毒出口的机制，并确定呼肠孤病毒出口策略是否会影响受体细胞的下游感染。我们发现，呼肠孤病毒除了以游离颗粒的形式离开细胞外，还可以从两种不同的细胞类型中排出，与大型EV和中型EV有关。对于在感染过程中有效或低效地破坏或破坏细胞膜的呼肠孤病毒株来说，情况确实如此。呼肠孤病毒对大中型 EV 的非特异性粘附不太可能完全解释这些颗粒在出口过程中与 EV 的关联。与未感染的细胞相比，呼肠孤病毒还增强了感染细胞中所有 EV 大小的脱落。EV介导的呼肠孤病毒转运可以在细胞之间传递集体的多颗粒呼肠孤病毒群，并且可以从抗体介导的中和作用中启动病毒株依赖性和细胞类型特异性呼肠孤病毒保护（图7）。目前，我们无法描述呼肠孤病毒相关的特定 EV 亚群，尽管 T1L 和 T3D 已在类似于微囊泡的 EV 中可视化（图 2 和 S4）。分子和成像方法将揭示未来对 EV 相关呼肠孤病毒出口的详细机制的更多见解。
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图 7. 呼肠孤病毒释放和感染与 EV 相关的模型。
我们的研究表明，除了以游离颗粒的形式退出外，有效或低效破坏膜的呼肠孤病毒株还可以与EV相关，从小鼠成纤维细胞和人结肠上皮细胞中排出。呼肠孤病毒颗粒是菌株特异性的，细胞类型依赖性地封闭在内，并受到培养基 EV 的保护，免受抗体介导的中和作用。大型和中型EV都可以将多个呼肠孤病毒颗粒转运到受体细胞。此外，与未感染的细胞相比，呼肠孤病毒感染增强了各种大小的EV的细胞释放。使用 Biorender.com 创建。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.g007
我们设想了一种模型，其中呼肠孤病毒可以使用至少三种不同的途径排出受感染的细胞：（i）通过膜裂解，（ii）封闭在培养基EV中，或（iii）使用涉及“分选细胞器”和“膜载体”的机制[38,48]。每个细胞中可能有多个呼肠孤病毒出口通路起作用，并且使用的通路可能因细胞类型而异。蓝舌病毒使用裂解和非裂解策略退出细胞;除了诱导细胞裂解外，蓝舌病毒还以非裂解方式从携带溶酶体和外泌体标志物的多颗粒EV的质膜中萌芽[15,16]。在 L 细胞和 Caco-2 细胞中，T3D 呼肠孤病毒可能采用类似的策略，其中游离病毒颗粒通过裂解释放，而其他病毒则排出封闭在培养基 EV 中的细胞。与 T3D 相比，T1L 呼肠孤病毒出口发生在几乎完全没有膜破坏的情况下（图 1B 和 5C），这与培养基 EV 中的封闭一致，但无法解释游离病毒释放。我们提出，另一种宿主细胞辅助机制，可能类似于HBMEC中呼肠孤病毒的非裂解呼肠孤病毒出口策略，可促进非裂解性T1L游离病毒出口[48]。游离 T3D 病毒也有可能使用非裂解机制出口。T3D在48小时p.i.时不诱导显着的膜破坏;然而，我们在这个时间点检测到 T3D 蛋白与小 EV/游离病毒部分的关联（图 1B、1G 和 S1）。尽管 T1L 和 T3D 蛋白以及传染性呼肠孤病毒与源自 L 细胞和 Caco-2 细胞的大 EV 相关（图 1D-1H 和 5D-5F），但我们假设游离呼肠孤病毒颗粒在从细胞释放后粘附在释放的细胞碎片和大 EV 上，这与先前的观察结果一致，即大量传染性病毒在细胞死亡诱导后仍与细胞碎片相关 [56].T3D 与来自模拟感染细胞的大中型 EV 的更有效结合表明，T3D 的这种粘附可能比 T1L 更明显（S3C–S3F 图）。
与EV相关的病毒释放可以保护呼肠孤病毒免受宿主免疫防御和细胞外环境的影响。从 L 细胞释放的 T1L 和 T3D 呼肠孤病毒部分屏蔽抗体介导的中和和蛋白水解，因此可能被封闭在培养基 EV 群体中（图 4B-4E 和 S5）。我们的研究结果与BK多瘤病毒、肠道病毒71型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和甲型肝炎病毒的发现相呼应，这些病毒在EV细胞中退出细胞时也可以逃避抗体介导的中和作用[11–13,57]。因此，EV屏蔽病毒免受细胞外因素（包括免疫防御和蛋白酶）的影响是一种反复出现的策略，通过该策略，来自不同家族的病毒（包括呼肠孤病毒）可以更有效地建立或延长感染。鉴于呼肠孤病毒作为一种溶瘤治疗药物正在临床试验中，EV中的递送可能通过使病毒逃避中和抗体来提高呼肠孤病毒作为抗癌剂的有效性[32,58–60]。
与培养基 EV 相关的呼肠孤病毒的菌株特异性和细胞类型依赖性中和保护对出口具有潜在影响。虽然 T1L 和 T3D 呼肠孤病毒在 L 细胞来源的培养基 EV 中都受到保护，但只有 T1L 在 Caco-2 来源的培养基 EV 中受到保护（图 4B-4E 和 5G-5J）。T3D 从 Caco-2 细胞中退出可能不涉及 EV;然而，呼肠孤病毒结构蛋白和传染性呼肠孤病毒与感染后释放的 EV 组分的关联提示 EV 受累（图 5E–5F）。T3D 可能以不同的 EV 亚型释放，这些亚型彼此不同，但在 L 细胞和 Caco-2 细胞的培养基 EV 组分中具有相似的富集度。在这种情况下，T3D 可以在 L 细胞衍生的培养基 EV 亚型中内部包装，并在 Caco-2 衍生的培养基 EV 亚型上外部结合。脑心肌炎病毒存在“双EV出口”策略的先例，该病毒以两种不同的EV亚型排出细胞，其中一种携带源自质膜的标记物，另一种携带与分泌型自噬体相关的标记物[61]。然而，鉴于我们目前无法仅富集含呼肠孤病毒的 EV，需要进一步研究以辨别源自 L 细胞或 Caco-1 细胞的 T3L 相关和 T2D 相关培养基 EV 之间的差异。另一种可能性是，T3D与EV生物发生途径相互作用的效率因细胞类型而异，并可能导致T2D协调内部或外部培养基EV包装的能力不同。诱导细胞凋亡的能力也可能影响 EV 中的病毒逃逸。呼肠孤病毒诱导L细胞凋亡，L细胞是一种非癌细胞系，与起源于人结直肠腺癌的Caco-5细胞有很大不同[3,3,2]。由于bcl-40家族中抗凋亡分子的过表达和p62等抑癌基因的突变，Caco-63细胞缺乏完全完整的细胞凋亡途径[2\u53]。Sindbis 病毒诱导的 HeLa 细胞凋亡导致病毒核衣壳和病毒抗原仅与从凋亡细胞质膜萌芽的 EV 样结构共定位 [2]。基孔肯雅热病毒诱导的细胞凋亡导致类似凋亡小体的EV结构的形成，当细胞凋亡和EV生物发生的各个步骤受到抑制时，病毒向邻近细胞的传播受到阻碍[64]。因此，T68D与L细胞和Caco-69细胞凋亡通路相互作用的差异可能会影响与EV生物发生途径和呼肠孤病毒出口策略的相互作用。
检测呼肠孤病毒非结构蛋白σNS与EV相关的菌株特异性和细胞类型依赖性差异可能反映了呼肠孤病毒生物学或对释放和保护具有潜在影响。在 L 细胞中，我们观察到 σNS 与来自 T1L 和 T3D 感染细胞的小 EV/游离病毒组分的关联，以及 σNS 与来自 T3D 感染细胞的大和中 EV 组分的关联（S2 图）。在 Caco-2 细胞中，我们观察到与任何 EV 组分完全缺乏 σNS 关联（S8 图）。T3D 比 T1L 更有效地诱导细胞凋亡和膜损伤（图 1B、5C、S1 和 S7）。凋亡性水疱的大小差异很大，可以在任何富含 EV 的部分中检测到。在L细胞的大中型EV组分中检测到的σNS信号可能主要来自掺入凋亡泡中的病毒工厂片段，这可以解释它们在相应的T1L组分中不存在的原因。T3D形成球状工厂，而T1L形成与微管结合的丝状工厂[71,72]。工厂形态和宿主蛋白相互作用也可能改变σNS摄取到释放的EVs中，特别是从质膜释放的大中型EVs。在任何一种情况下，如果将T3D颗粒包装到与σNS相同的EV中，它们可能会被非结构蛋白保护免受环境的影响。然而，这种机制并不能解释 T1L 在源自 L 细胞或 Caco-2 细胞的培养基 EV 中的保护作用（图 4B-4C、5G-5H、S2 和 S8）。T3D感染的Caco-2细胞来源的大中型EV组分中缺乏σNS存在的原因尚不清楚，但可能与细胞凋亡途径的差异有关[64\u68]。σNS蛋白可以结合细胞RNA[73,74]。RNA结合、蛋白质错误折叠或泛素化以及ESCRT复合蛋白的分选可作为将T1L或T3D σNS加载到小EV中的机制，这些EV已知可以包装RNA和蛋白质货物[75\u77]。尽管外泌体货物可能因细胞类型而异，但尚不清楚为什么呼肠孤病毒感染的 L 细胞衍生的小 EV 组分中存在 σNS，而不存在于任何 T1L 或 T3D 感染的 Caco-2 细胞衍生的 EV 组分中（S2 和 S8 图）。
EV 可能导致呼肠孤病毒多颗粒感染。我们观察到，从感染细胞释放的 ~ 18% 的测试感染单位含有多种呼肠孤病毒基因型，在中等 EV 组分中检测到更多的混合基因型信号，在大 EV 组分中检测到一些，在小 EV/游离病毒组分中没有检测到混合基因型信号（图 4H）。为了最大限度地提高形成混合病毒种群的机会，我们使用了MOI，在该MOI中，大多数细胞可能与WT和BC呼肠孤病毒共同感染。在先前使用相同实验条件的研究中，我们的实验室观察到WT和BC RNA共占据呼肠孤病毒工厂，即出口前的组装位点，并且在高多重性共感染后，WT和BC呼肠孤病毒重组似乎几乎没有限制[54]。然而，我们的 HRM 基因分型策略存在局限性，因为只有含有相对均匀的 WT 和 BC RNA 混合物的感染单位才可能被检测到。如果 EV 包含同一亲本基因组的多个颗粒，或者一种基因组相对于另一种基因组的比率要高得多，则很可能会被遗漏。我们观察到，2：1、1：1 和 1：2 的 WT：BC RNA 混合物产生的熔解曲线与 WT 和 BC 对照的熔解曲线不同，而 8：1、4：1、1：4 和 1：8 RNA 比率更难区分（S6 图）。因此，我们的技术方法可能低估了EV介导的呼肠孤病毒多颗粒感染。此外，含有柯萨奇病毒的EV选择性地包装相同亲本起源的“兄弟”病毒，我们的系统中可能存在类似的未知EV包装偏差[18]。EV 引发的多颗粒感染可能会增强生产性病毒感染。少数呼肠孤病毒颗粒被认为具有传染性[78,79]。研究显示，多颗粒聚集可增加感染期间呼肠孤病毒的互补，并且通过挽救有害突变，可以增强病毒种群的整体适应性[79\u82]。当进入细胞的颗粒太少时，宿主屏障可能会阻止病毒复制[17,83–87]。与游离病毒相比，当多颗粒BK多瘤病毒、轮状病毒、诺如病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒和JC多瘤病毒与EV结构相关时，病毒感染性增强[17,18,22,88,89]。对于呼肠孤病毒，细菌的存在会增强毒力，通过与细菌粘附介导的多颗粒感染是一种机制[81,90]。虽然需要体内研究来确定 EV 相关感染的生物学相关性，但 EV 介导的多颗粒转运可能允许呼肠孤病毒补充有缺陷的基因组并克服宿主细胞屏障，介导更具生产力的感染。
在全细胞水平上，T1L 和 T3D 感染增强了所有 EV 大小的释放（图 6 和 S10）。已证明对多种病毒具有大规模病毒调节作用：脊髓灰质炎病毒重塑细胞内膜和脂质池，肠道病毒71感染诱导自噬体形成，柯萨奇病毒蛋白增加自噬体形成，寨卡病毒调节外泌体生物发生蛋白，EB病毒诱导全细胞EV蛋白分泌上调[17,24,25,91–93].目前尚不清楚呼肠孤病毒上调 EV 释放是特异性反应还是一般细胞应激反应。然而，轮状病毒感染会上调EV的释放，轮状病毒蛋白与EV生物发生蛋白在体外和人类患者样本中的共沉淀表明轮状病毒与EV生物发生途径分子在细胞内结合，这可能暗示了EV调节的机制[23]。通过上调EV的释放，呼肠孤病毒可能会促进其自身的出口。如果释放的EV在呼肠孤病毒感染期间也能调节宿主免疫系统，就像轮状病毒一样，则EV释放的上调也可能促进呼肠孤病毒从免疫防御中逃逸并延长感染时间[23,94]。进一步的实验将揭示呼肠孤病毒介导的 EV 释放上调的机制和影响。
总而言之，我们的研究表明，除了以病毒株和细胞类型依赖性方式作为游离独立颗粒退出外，呼肠孤病毒还从两种不同的细胞类型中排出，这些细胞类型被包裹在中等大小的免疫和蛋白酶保护EV中，可以促进多颗粒感染。虽然我们还不知道这种呼肠孤病毒出口策略是否发生在人类或其他动物身上，但EV相关的出口很可能具有生物学意义，因为EV介导的出口被进化中的多种病毒所利用。包括轮状病毒、脊髓灰质炎病毒、诺如病毒、腺病毒、柯萨奇病毒和甲型肝炎病毒在内的致病病毒均已证明以 EV 相关形式排出。随着越来越多的研究支持EV介导的出口是致病性病毒转运的可行途径，对EV相关病毒释放和传播的影响有更深入的了解将继续改善公共卫生[2]。EV 也可以用于治疗目的，肿瘤微环境中 EV 研究的兴起以及最近 FDA 批准使用甲型肝炎病毒作为破坏皮肤癌细胞的工具就证明了这一点。对于呼肠孤病毒，基于现有研究结果的研究可能有助于将溶瘤呼肠孤病毒递送至肿瘤部位[95]。
材料与方法
细胞。在补充含有 5% 胎牛血清 （FBS;Gibco）、2 mM L-谷氨酰胺（康宁）、100 U/ml 青霉素（康宁）、100 mg/ml 链霉素（康宁）和 25 ng/ml 两性霉素 B（康宁）。在感染和 EV 采集期间，将 L 细胞在无血清 JMEM 中培养。将 Caco-2 细胞维持在最低必需培养基 （MEM;Corning）补充含有 20% FBS、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 链霉素、100 U/ml 非必需氨基酸 （Corning）、100 U/ml HEPES 缓冲液 （Corning）、100 U/ml 丙酮酸钠 （Corning） 和 25 ng/ml 两性霉素 B。在感染和 EV 收集过程中，将 Caco-2 细胞在无血清 MEM 中培养，并通过维持分裂和亚汇合水平的接种保持非极化、非分化状态。表达由巨细胞病毒启动子 （BHK-T7） 控制的 T7 RNA 聚合酶的小仓鼠肾细胞维持在 Dulbecco 的最低必需培养基 （DMEM;Corning）补充含有5%FBS，100 U / ml青霉素，100 mg / ml链霉素和1 mg / ml Geneticin，每隔一次传代添加一次。所有细胞均保持在 37°C 和 5% CO2.
病毒
呼肠孤病毒株 rsT1L （T1L）、rsT3D我（T3D 或 WT）和 rsT3D我BC（BC）使用基于质粒的反向遗传学进行工程改造[96,97]。应变 rsT3D我是亲本rsT3D原型株的变体，含有T249I突变，使病毒附着蛋白σ1对蛋白水解裂解产生抗性[96]。应变 rsT3D我BC 与 rsT3D 相同我除了每个片段中工程化的沉默遗传“条形码”突变[54]。简而言之，在 7 孔板中转染 6 种编码 T10L 和 T1D 呼肠孤病毒 RNA 的质粒构建体的 BHK-T3 细胞的半汇合单层。在37°C下孵育数天后，对细胞进行两个循环的冻融。将所得裂解物连续稀释并进行噬菌斑测定[50]。每个重组病毒株选择三个单独的斑块，并在 L 细胞中扩增以构建克隆病毒储备液。通过噬菌斑测定法对病毒原液滴度进行定量。
抗体
兔多克隆呼肠孤病毒抗血清[98]、针对T1L或T3D σ1头部结构域的兔多克隆抗血清[99]、靶向T2D σNS的小鼠单克隆抗体7H3和靶向T1L σNS的豚鼠多克隆抗血清[98,100]是Terence Dermody博士的礼物。CD81小鼠单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology;sc-166029）已上市。
病毒复制检测
L 细胞 （2 x 105细胞/孔）或 Caco-2 细胞 （4.2 x 105将完全培养基中的细胞/孔）接种在 12 孔板中并孵育直至达到 ~ 90% 汇合度。将细胞一式三份地吸附，单独使用培养基（模拟）或三个 T1L 或 T3D 克隆，MOI 为 1 PFU/细胞（L 细胞）或 5 PFU/细胞（Caco-2 细胞）。吸出上清液，并用无血清培养基吸附后代替。每 24 小时，总共 96 小时，将板储存在 -80°C 下。 然后，在-80°C和室温下冻融两次。通过FFA[101]测定所得裂解物中的病毒滴度，并根据重复孔中每孔在四个可计数视野中量化的感染细胞数计算，其中可计数视野包含~50–500个呼肠孤病毒阳性细胞。
台盼蓝膜破碎试验
L 细胞 （2 x 105细胞/孔）或 Caco-2 细胞 （4.2 x 105将完全培养基中的细胞/孔）接种在 12 孔板中并孵育直至达到 ~ 90% 汇合度。细胞用单独培养基吸附一式三份（模拟），三个 T1L 或 T3D 克隆，MOI 为 1 PFU/细胞（L 细胞）或 5 PFU/细胞（Caco-2 细胞）。吸出上清液，并用无血清培养基吸附后代替。每 24 小时，总共 96 小时，将细胞在 37°C 下轻轻胰蛋白酶化，并通过 100 × g 离心收集。将细胞重悬于等体积的不含钙的PBS中2+或 Mg2+和0.4%台砼蓝溶液（Corning），在室温下孵育3分钟，然后使用血细胞计数器和复合光学显微镜手动定量一式两份。台盼阳性细胞被认为具有破坏的质膜。
乳糖酶脱氢酶膜损伤试验
L 细胞 （2 x 104细胞/孔）或 Caco-2 细胞 （1.9 x 105将完全培养基中的细胞/孔）接种在 96 孔黑壁板 （Greiner） 中并孵育直至达到 ~ 90% 汇合度。细胞用单独培养基吸附一式三份（模拟），三个 T1L 或 T3D 克隆，MOI 为 1 PFU/细胞（L 细胞）或 5 PFU/细胞（Caco-2 细胞）。接种一式三份未感染细胞孔，用于其他试剂盒特异性对照，包括自发 LDH 释放和最大 LDH 释放。吸出上清液，并用无血清培养基吸附后代替。每 24 小时共 96 小时，收获细胞上清液并量化质膜损伤，与仅培养基阴性对照和基于制造商方案（ThermoFisher Scientific，CyQUANT LDH 细胞毒性测定）的试剂盒提供的阳性对照进行比较。在490和680处的吸光度在测定完成后使用Biotek Synergy Neo 2和随附的Gen 5.309软件直接测量。
细胞外囊泡富集
收集无血清细胞培养上清液。在以 300 × g 离心 10 分钟后，将细胞碎片沉淀并丢弃。将所得上清液以 2,000 × g 离心 25 分钟以沉淀大型 EV，然后以 10,000 × g 离心 30 分钟以沉淀培养基 EV，然后以 100,000 × g 沉淀 2 小时以沉淀小 EV 和游离病毒颗粒的混合群体。将沉淀的 EV 馏分重悬于 EV 储存缓冲液（5M NaCl、1M MgCl2，1M Tris pH 7.4），并在 4°C 下短暂储存或立即用于测定。
碘克沙醇梯度分离小EVs和游离病毒
如上所述，通过顺序差速离心从上清液中清除细胞碎片、大 EV 和中等 EV。将所得上清液浓缩在2ml 60%碘克沙醇垫上，溶于0.25M蔗糖和10mM Tris，pH 7.5,100,000 × g，4小时[102]。超速离心后，从超速离心管底部收集3ml碘克沙醇垫加浓缩上清液并混合。将所得的小型 EV/free 病毒悬浮液加载到单独的超速离心管的底部。依次加入20%、10%和5%碘克沙醇层以形成梯度。将梯度以100,000 × g离心18 h。然后，从梯度顶部开始抽取 12 × 1 ml 馏分。将所得的1ml级分用PBS洗涤，以100,000×g浓缩2小时，轻轻移液以重新分布碘克沙醇，然后再次以100,000×g浓缩1小时。将颗粒状的 EV 馏分重悬于 EV 储存缓冲液中。
呼肠孤病毒-EV 免疫印迹检测
为了确定呼肠孤病毒蛋白与大 EV、中 EV 和小 EV 的关联，L 细胞 （1.5 x 106细胞/烧瓶）或 Caco-2 细胞 （2.5 x 106将完全培养基中的细胞/烧瓶）接种在 T25 细胞培养瓶中并孵育至 ~ 90% 汇合。用单独培养基（模拟）吸附细胞一式三份，用三个 T1L 或 T3D 克隆，MOI 为 1 PFU/细胞（L 细胞）或 5 PFU/细胞（Caco-2 细胞），然后吸出接种物并用无血清培养基替换。每 24 小时收集一次细胞培养上清液，持续 96 小时。如上所述，在每个时间点，通过顺序差速离心富集 EV 组分。将样品以等体积重悬，用 SDS-10% PAGE 分离，转移到硝酸纤维素中，并使用 Pierce 无蛋白 PBS 封闭缓冲液 （ThermoScientific） 封闭。使用多克隆呼肠孤病毒抗血清 （1：1000） 和 LI-COR IRDye 680LT 山羊抗兔 （1：15,000） 检测呼肠孤病毒蛋白。使用单克隆抗 CD81 抗体 （81：1） 和 LI-COR IRDye 400LT 山羊抗小鼠 （800：1,15） 检测小 EV 标志物 CD000。使用豚鼠多克隆抗σNS抗血清（1：1,1）和LI-COR IRDye 000LT山羊抗豚鼠（680：1,15）检测T000L非结构蛋白σNS[100]。使用小鼠单克隆抗σNS抗体3H2（7：1,1）和LI-COR IRDye 000LT山羊抗小鼠（800：1,15）检测T000D非结构蛋白σNS[98]。使用 Bio-Rad ChemiDoc MP 成像系统检测信号。使用 BioRad ImageLab 分析软件对呼肠孤病毒 λ3、σNS 和 CD81 蛋白条带进行定量，并调整背景。为了比较来自多个实验的信号，将小EV/游离病毒样本的96小时时间点值设置为100%，并根据该值调整所有其他样本。
呼肠孤病毒-模拟 EV 关联检测
L 细胞 （1.5 x 107细胞/烧瓶）在完全培养基中接种在 T150 培养瓶中并孵育至 ~ 90% 汇合度。细胞要么用 T1L 或 T3D 吸附，MOI 为 1 PFU/细胞，要么仅用培养基吸附（模拟）;对于每个 T1L 感染或 T3D 感染的烧瓶，接种并吸附三个模拟感染的烧瓶。抽吸接种物并用无血清培养基代替。72 小时后，收集呼肠孤病毒感染的细胞培养上清液，并通过顺序差速离心等体积富集大 EV 和中等 EV 组分，以构成“病毒感染的 EV”组分。同时，收集模拟感染的细胞培养上清液，并通过顺序差速离心等体积富集大 EV 和中等 EV 组分。将这些模拟感染的 EV 组分在 4°C 下以 2 x 1 的等体积孵育 10 小时9通过代表“FV 输入”的碘克沙醇梯度离心或用 EV 储存缓冲液收获的游离呼肠孤病毒颗粒。然后以各自的离心速度对样品进行重新沉淀，得到“FV + mock EV”和“FV + buffer”样品。使用带有库马西蓝染色的 SDS-PAGE 或使用多克隆呼肠孤病毒抗血清 （1：1000） 和 LI-COR IRDye 680LT 山羊抗兔 （1：15,000） 的 SDS-PAGE 分离相同体积的样品体积。使用 Bio-Rad ChemiDoc MP 成像系统检测信号。使用 BioRad ImageLab 分析软件对呼肠孤病毒 λ3 蛋白条带进行定量，并调整背景。
负染色透射电子显微镜
L 细胞 （1.5 x 107细胞/烧瓶）或 Caco-2 细胞 （2.0 x 107细胞/烧瓶）在完全培养基中接种在 T150 培养瓶中并孵育至 ~ 90% 汇合度。用 T1L 或 T3D 吸附细胞，MOI 为 1 PFU/细胞，然后抽吸接种物并用无血清培养基替换。72小时后，收集细胞培养上清液，并通过顺序差速离心富集大EV和中等EV组分。如前所述，使用密度依赖性梯度分离分离富集小 EV 和游离病毒的 L 细胞衍生级分。将纯化的样品粘附在新鲜发光放电的碳涂层 300 目铜网格中 30 秒，然后使用 2% 醋酸铀酰进行负染色。使用在12 keV下工作的Tecnai T100和AMT nanosprint5 CMOS相机进行透射电子显微镜。
薄片电子显微镜
L 细胞 （3.8 x 106将完全培养基中的细胞/培养皿）接种在 200 mM 培养皿中并孵育直至汇合。细胞单独用培养基吸附或用 T1L 或 T3D 吸附，MOI 为 1 PFU/细胞。24小时后，用预热的不含Ca的PBS洗涤细胞三次2+或 Mg2+并用2.5%戊二醛在室温下固定1小时。固定后，轻轻提起样品并包埋在2%低熔点琼脂中。样品在甘油含量高达30%的分级步骤中进行冷冻保护，并在液态乙烷中冷冻。冷冻后，将样品在-80°C的1.5%醋酸铀酰甲醇溶液中冷冻取代48小时，然后逐渐升温至-30°C。 样品在氮气气氛下用HM-20 Lowicryl浸润，并用紫外光聚合48 h。聚合后，在徕卡 UC70 超薄切片机上以 7 nm 的标称厚度切片样品，并如上所述成像。
释放的细胞外囊泡的定量
L 细胞 （1.5 x 107将细胞/烧瓶）在完全培养基中接种在 T150 培养瓶中并孵育至 ~ 90% 汇合度。用单独培养基（模拟）或三个 T1L 或 T3D 克隆吸附细胞，MOI 为 1 PFU/细胞，然后吸出接种物并用无血清培养基替换。72 小时后，收集细胞培养上清液，并通过序数差离心富集大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分。将一部分样品重悬于等体积的 EV 储存缓冲液中，用 SDS-10% PAGE 分离，并用 PageBlue 蛋白染色溶液 （Thermo） 染色。使用 Bio-Rad ChemiDoc MP 成像系统对凝胶进行成像，并使用 Bio-Rad ImageLab 分析软件对整个泳道中的蛋白质进行定量。为了比较来自多个实验的信号，通过将每个调整的体积值除以印迹中的最高测量值，将蛋白质信号归一化为最大值的百分比。
将一部分样品进行膜联蛋白 V 免疫沉淀（Miltenyi Biotec Annexin V Microbead Immunoprecipitation kit），重悬于 Annexin V 结合缓冲液中，并与 Annexin V 微珠在 2°C 下旋转孵育 4 小时。将样品应用于Miltenyi Biotec MiniMACS分离器上的Miltenyi Biotec MS色谱柱上，并在等体积的EV储存缓冲液中洗脱。洗脱液用SDS-10% PAGE分离，用PageBlue蛋白染色液染色，并按上述方法定量。
使用共聚焦显微镜分析的样品子集被重悬于等体积的EV存储缓冲液中并储存在冰上。将样品分别与等体积的 1 μg/ml 1,1'-二十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐 （DiI;Invitrogen），在冰上孵育15分钟，然后用35.1mm玻璃盖玻片装入Mattek 4 mm培养皿的孔中。将每个培养皿在室温下孵育5分钟，然后在蔡司LSM 880显微镜上用63倍油透镜成像。每个样本总共有 10 个视场，每个视场包括一个 8 x 8 的拼接瓷砖。使用EVAnalyzer Fiji软件插件[55]对每个田间的DiI阳性点进行计数，阈值设置在T1L感染、T3D感染和模拟感染样本的单独EV组分上均匀应用。
EV中和保护试验
L 细胞 （1.5 x 107细胞/烧瓶）或 Caco-2 细胞 （2.0 x 107细胞/烧瓶）在完全培养基中接种在 T150 培养瓶中并孵育至 ~ 90% 汇合度。用单独培养基（模拟培养基）或三个 T1L 或 T3D 克隆吸附细胞，MOI 为 1 PFU/细胞（L 细胞）或 5 PFU/细胞（Caco-2 细胞），然后吸出接种物并用无血清培养基替换。72 小时后，通过序贯差速离心富集细胞培养上清液以富集大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒。将样品重悬于EV储存缓冲液中并分开。一半样品用无血清培养基模拟处理，另一半样品在1°C下用T3L或T1D σ1头部特异性抗血清（100：2）处理4小时。 然后，使用稀释液通过噬菌斑测定对每个样品中的病毒滴度进行定量，产生 40-70 个噬菌斑以计算滴度。通过将处理过的样品滴度除以未处理的样品的滴度来确定中和后保留的感染性水平百分比。
EV 蛋白酶保护检测
L 细胞 （1.5 x 107细胞/烧瓶）在完全培养基中接种在 T150 培养瓶中并孵育至 ~ 90% 汇合度。用单独培养基（模拟）或三个 T1L 或 T3D 克隆吸附细胞，MOI 为 1 PFU/细胞，然后吸出接种物并用无血清培养基替换。72 小时后，通过序贯差速离心富集细胞培养上清液以富集大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒。将样品重悬于EV储存缓冲液中并分开。一半样品用无血清培养基模拟处理，另一半样品用 20 μg/mL 糜蛋白酶 （Sigma Aldrich） 在 1°C 下处理 37 小时。 孵育后，使用2%总体积的100mM PMSF中和糜蛋白酶活性。将样品以等体积重悬，用 SDS-10% PAGE 分离，转移到硝酸纤维素中，并使用 Pierce 无蛋白 PBS 封闭缓冲液 （ThermoScientific） 封闭。使用 SDS-PAGE 和多克隆抗呼肠孤病毒血清 （3：1） 进行免疫印迹，对 EV 相关呼肠孤病毒从病毒粒子向 ISVP 的转化进行定量，表现为 σ1 和 μ1000C 蛋白的丢失。使用 Bio-Rad ChemiDoc MP 成像系统检测信号。使用 BioRad ImageLab 分析软件对呼肠孤病毒 σ3 和 μ1C 蛋白条带进行定量，并调整背景。通过将处理过的样品蛋白质信号除以未处理的样品的蛋白质信号来确定蛋白酶处理后保留的 σ3 和 μ1C 蛋白质的百分比。
基因型混合的高分辨率熔解分析
L 细胞 （4 x 105将完全培养基中的细胞/孔）接种在 6 孔板中并孵育至 ~ 90% 汇合度。细胞单独吸附培养基（模拟培养基）或以 MOI 为 10 PFU/细胞的 WT 和 BC 呼肠孤病毒的三种独立稀释液混合感染，然后抽吸接种物并用无血清培养基替换。24 h后，收集细胞培养上清液，通过序贯差速离心富集大EV、中EV和小EV/游离病毒组分。然后通过噬菌斑测定分离感染单位。在 24 孔板中，每次重复每个馏分共挑选 24 个分离良好的斑块，并在 L 细胞单层中扩增 2 天。如前所述，使用TRIzol（Invitrogen）提取RNA，使用随机六聚体进行逆转录，并使用HRM进行基因分型，使用L2片段特异性引物[54]。每个样品基因型均由 Applied Biosystems 高分辨率熔解软件 v3.2 调用，并通过与含有 WT RNA、BC RNA 以及 WT 和 BC RNA 混合物（1：2、1：1 和 2：1）的对照反应进行比较进行目视验证。
统计分析
GraphPad Prism 版本 10 用于所有统计分析。所使用的统计分析在每个图例中标明，并针对每个数据集单独表示。在与生物统计学家协商后选择了统计检验。
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呼肠孤病毒质膜破坏在 L929 细胞中具有菌株特异性。
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S1 图。 呼肠孤病毒质膜破坏在 L929 细胞中具有菌株特异性。
L细胞被培养基（模拟）或三个单独的T1L或T3D呼肠孤病毒克隆吸附，MOI为1 PFU/细胞。使用 LDH 测定每 1 小时对 T3L、T24D 和模拟感染细胞的细胞膜破坏进行定量，持续 96 小时。显示了仅在培养基的阴性对照和试剂盒特异性阳性对照，在96小时时一式三份定量。误差线表示 SD。 n = 3。**，P < 0.01;，P < 0.0001 通过单因素方差分析与 Tukey 的多重比较。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.s001
（TIF）
S2 图。 呼肠孤病毒非结构蛋白以菌株特异性方式与 EV 组分结合。
（空调）L细胞被三个单独的T1L或T3D呼肠孤病毒克隆（C1-C3）吸附，MOI为1 PFU/细胞72小时。在 SDS-PAGE 和免疫印迹 （A） 对 T1L σNS （B） 或 T3D σNS （C） 进行定量后，呼肠孤病毒与大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分的关联。误差线表示 SD。 n = 3。*，P < 0.05;，P < 0.001;，P < 0.0001 通过归一化前的 Tukey 多重比较的单因素方差分析。通过将印迹中每个调整的体积值除以印迹中每个克隆的最高测量值，将蛋白质信号归一化为最大值的百分比。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.s002
（TIF）
S3 图。 呼肠孤病毒很少自发地与EV相关联。
（A-F）L 细胞吸附 1 个单独的 T3L 或 T1D 呼肠孤病毒克隆，MOI 为 72 PFU/细胞。同时，用培养基（模拟）吸附三倍量的L细胞。1 h后，从呼肠孤病毒感染的细胞中离心收获大中型EV，构成“病毒感染的EV”样品和模拟感染的细胞。10 x <>9将游离呼肠孤病毒颗粒的总PFU与来自模拟感染细胞（模拟EVs）的大中型EVs或EV储存缓冲液（buffer）混合孵育，然后以各自的离心速度重新沉淀。通过SDS-PAGE和考马斯染色（A-B）或使用抗呼肠孤病毒血清（C-F）进行免疫印迹SDS-PAGE分离所有T1L（A，C，D）和T3D（B，E，F）样品的等体积。量化游离呼肠孤病毒与模拟大中型EV的自发关联，并与游离T1L病毒输入（D）或游离T3D病毒输入（F）进行比较。误差线表示 SD。 n = 3。，P < 0.0001 通过双样本不配对 T 检验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.s003
（TIF）
S4 图。 EV 介导的呼肠孤病毒出口与微囊泡生物发生一致。
T1L 感染 （A） 或 T3D 感染 （B） L 细胞的透射电子显微镜检查，每次 24 小时箭头指向在细胞内或细胞周围的质膜萌芽的气泡状结构附近观察到的病毒颗粒。比例尺 = 200 nm。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.s004
（TIF）
S5 图。 EV可以部分保护呼肠孤病毒免受蛋白酶治疗。
（A-D）L细胞以1 PFU/细胞的MOI吸附3个T1L或T72D呼肠孤病毒克隆20小时。通过离心收获大、中、小 EV/游离病毒组分，每个组分成两个等分试样，含有等体积。一个等分试样未经处理 （-），另一个等分试样用 1 μg/mL 糜蛋白酶 （+） 处理。呼肠孤病毒 T3L （A-B） 和 T3D （C-D） σ1 和 μ3C 蛋白通过 SDS-PAGE 和抗呼肠孤病毒血清免疫印迹可视化和定量。图中显示了每种病毒株的代表性免疫印迹以及三个克隆的定量值。误差线表示 SD。 n = 0。*，P < 05.0;**，P < 01.<> 通过单因素方差分析与 Tukey 的多重比较。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.s005
（TIF）
S6 图。 高分辨率熔体分析的灵敏度。
图中显示了来自WT（红色）、BC（蓝色）以及WT和BC（绿色）混合物的对照RNA以指定比例的归一化熔解曲线。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.s006
（TIF）
S7 图。 呼肠孤病毒质膜破坏在 Caco-2 细胞中具有菌株特异性。
Caco-2 细胞被培养基（模拟）或 T1L 或 T3D 呼肠孤病毒的三个单独克隆吸附，MOI 为 5 PFU/细胞。使用 LDH 测定每 1 小时对 T3L、T24D 和模拟感染细胞的细胞膜破坏进行定量，持续 96 小时。显示了仅在培养基的阴性对照和试剂盒特异性阳性对照，在96小时时一式三份定量。误差线表示 SD。 n = 3。，P < 0.001;，P < 0.0001 通过单因素方差分析与 Tukey 的多重比较。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.s007
（TIF）
S8 图。 呼肠孤病毒与 EV 组分的非结构蛋白关联与细胞类型有关。
Caco-2 细胞被 T1L 或 T3D 呼肠孤病毒的三个单独克隆 （C1-C3） 吸附，MOI 为 5 PFU/细胞 72 小时。呼肠孤病毒非结构蛋白与大 EV、中 EV 和小 EV/游离病毒组分的关联在 SDS-PAGE 和 T1L σNS 或 T3D σNS 免疫印迹后进行定量。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.s008
（TIF）
S9 图。 呼肠孤病毒感染不会显著改变全细胞蛋白的表达。
将L细胞用培养基（模拟）或三个单独的T1L或T3D呼肠孤病毒克隆吸附，MOI为1 PFU/细胞72 h（A-C）细胞在RIPA缓冲液中裂解，裂解物通过SDS-PAGE和考马斯染色（A）分离，定量3个独立实验（B），并将平均病毒感染值除以平均模拟感染值（C）进行归一化。误差线表示 SD，n = <>。单因素方差分析与Tukey的多重比较。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.s009
（TIF）
S10 图。 呼肠孤病毒感染可增强 EV 的释放。
图6G–6H中描述的代表性共聚焦图像显示在单个视场下，该视场由8X油浸下的8 x 63平铺成像结构组成。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637.s010
（TIF）
确认
我们感谢范德比尔特大学细胞成像共享资源核心的 Jenny Schafer 在样本制备、成像和分析方面的帮助。我们感谢范德比尔特高通量筛选设施和 VUMC 细胞和发育生物学资源核心的培训和设备使用。我们感谢 Terence Dermody 博士的实验室提供呼肠孤病毒抗体、抗血清和 LDH 检测咨询，感谢 Alissa Weaver 博士提供碘克沙醇梯度分离咨询，感谢 Geoffrey Holm 博士咨询膜联蛋白 V 免疫沉淀。我们感谢James C. Slaughter博士的生物统计学专业知识。我们感谢 Terence Dermody 博士、Julia Diller、Alejandra Flores、Danica Sutherland 博士、Gwen Taylor 博士和 Timothy Toner 博士对手稿的严格审查。
引用
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