真菌几丁质结合糖蛋白与几丁质协同诱导Dectin-2介导的过敏性气道炎症
村草康典 ，日野裕太郎，高冢翔吾，渡边晃，坂田惠美子，西条忍，宫崎骏，山崎翔，龟井克彦
抽象
尽管真菌细胞壁中的几丁质与过敏性气道炎症有关，但这种关联的确切机制尚未阐明。在这里，我们研究了真菌几丁质结合蛋白和几丁质在过敏性气道炎症中的参与。毕赤酵母中表达的重组烟曲霉 LdpA （rLdpA） 被证明是一种含有宿主 C 型凝集素受体 Dectin-2 识别的末端 α-甘露糖残基的 O 连接糖蛋白。几丁质颗粒被证明可以诱导急性中性粒细胞气道炎症介导的与细胞死亡相关的白细胞介素-1α （IL-1α） 的释放。此外，rLdpA-Dectin-2 相互作用被证明可促进 rLdpA-几丁质复合物的吞噬作用和小鼠骨髓来源的树突状细胞 （BMDC） 的活化。此外，我们发现 rLdpA 与几丁质协同有效诱导 T 辅助性 T 细胞 2 （Th2） 驱动的过敏性气道炎症，而 Dectin-2 缺乏减弱了体内 rLdpA-几丁质复合物诱导的免疫反应。此外，我们发现肺曲霉病患者的血清 LdpA 特异性免疫球蛋白水平升高。
作者摘要
哮喘是许多国家儿童中最常见的慢性疾病。虽然其根本原因尚不完全清楚，但吸入过敏原（包括真菌孢子）是哮喘发展的已知危险因素。最近的研究表明，对丝状真菌烟曲霉的致敏与过敏性哮喘和其他肺部疾病的恶化有关。尽管真菌细胞壁中的几丁质与过敏性气道炎症有关，但这种关联的确切机制尚未阐明。在这项研究中，我们发现 A.烟曲霉几丁质结合糖蛋白 LysM 结构域蛋白 A （LdpA） 与几丁质协同诱导 Dectin-2 介导的 Th2 驱动的气道炎症。因此，本研究为真菌诱导的过敏性气道疾病提供了新的见解。
数字
Fig 7Fig 8图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8图1图2图3
引文： Muraosa Y， Hino Y， Takatsuka S， Watanabe A， Sakaida E， Saijo S， et al. （2024） 真菌几丁质结合糖蛋白与几丁质协同诱导 Dectin-2 介导的过敏性气道炎症。PLoS 病理学 20（1）： e1011878 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878
编辑 器： Bruce S. Klein，威斯康星大学麦迪逊分校，美国
收到： 19年2023月1日;接受： 2023年3月2024日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2024 Muraosa et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金： 这项工作得到了JSPS KAKENHI（YM的授权号20K07476和23K06535）的支持。这项工作也得到了日本医学研究开发机构（AMED）的部分支持（批准号JP18ek0410026给KK）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
哮喘是儿童中最常见的慢性疾病，据报道，262年全球有超过2019.1亿人患有哮喘[2]。虽然其根本原因尚不完全清楚，但吸入过敏原，包括真菌孢子、花粉和室内尘螨，是哮喘发展的已知危险因素。最近的研究表明，对丝状真菌烟曲霉的致敏作用与过敏性哮喘和其他肺部疾病的加重有关[5\u6]。烟曲霉也可引起变应性支气管肺曲霉病（ABPA）和变应性曲霉鼻窦炎（AAS）[9–<>]。
既往研究表明，真菌细胞壁几丁质（一种N-乙酰基-D-氨基葡萄糖（GlcNAc）聚合物）与过敏性气道炎症有关[10,11]。甲壳素已被证明对先天免疫应答具有大小依赖性作用[12]。研究显示，可吞噬大小的几丁质颗粒在体外诱导促炎细胞因子的产生，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF）-α，而较大的几丁质颗粒则不诱导这种反应[13\u18]。在既往的体内研究中，非吞噬大小的几丁质颗粒被证明可诱导先天嗜酸性粒细胞浸润到小鼠肺部，这是由上皮细胞衍生的细胞因子（如胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）、白细胞介素-25（IL-25）和IL-33）的释放介导的，随后激活先天性淋巴细胞2型（ILC2）[13,19–21].此外，已知几丁质可作为免疫佐剂，增强适应性免疫应答[22\u27]。
C型凝集素受体（CLR）Dectin-2由多种髓系细胞群表达，包括巨噬细胞和几种树突状细胞亚群，它与真菌上的α-1,2-甘露糖结构和屋尘螨过敏原上的聚糖相互作用[28\u30] Dectin-2 对屋尘螨过敏原的识别被证明可诱导辅助性 T 细胞 2 （Th2） 细胞免疫 [31，32]，但 Dectin-2 参与真菌诱导的过敏免疫反应尚未阐明。
之前，我们报道过 A.烟曲霉细胞壁蛋白LysM结构域蛋白A（LdpA）具有多个几丁质结合LysM结构域，没有显示出影响真菌形态或致病性的功能特征[33]。菌丝、静息分生孢子和肿胀分生孢子显示ldpA mRNA表达，菌丝表达水平较高[33]。在这项研究中，我们使用重组 A 研究了真菌几丁质结合蛋白和几丁质在过敏性气道炎症中的参与。烟曲霉LdpA 在毕赤酵母 （rLdpA） 中表达。结果表明，rLdpA是一种O-连接糖蛋白，含有宿主CLR识别的末端α-甘露糖残基Dectin-2。可吞噬大小的几丁质颗粒被证明可以诱导由细胞死亡相关的 IL-1α 释放介导的急性中性粒细胞气道炎症。此外，我们发现 rLdpA-Dectin-2 相互作用促进了 rLdpA-几丁质复合物的吞噬作用和小鼠骨髓来源的树突状细胞 （BMDC） 的活化。最后，我们发现 rLdpA 协同诱导 Dectin-2 介导的几丁质驱动的 Th2 驱动的气道炎症。
结果
毕赤酵母重组LdpA的产生
C 末端 c-Myc- 和 6×组氨酸 （6×His） 标记的重组 LdpA （rLdpA） 蛋白，其中 A.烟曲霉天然信号肽已被酿酒酵母的α因子分泌信号所取代，在甲基营养酵母毕赤酵母中异源表达（图1A）。用甲醇诱导rLdpA表达后，LDPA转化体GS115-LdpA（S1A图）中培养上清液中的总蛋白水平增加。His标签纯化后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹分析（S1B和S1C图）确认了单个蛋白条带。
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图 1. rLdpA 是一种具有末端 α-甘露糖残基的糖蛋白，可诱导 Dectin-2 介导的促炎细胞因子和趋化因子。
（A） A的领域组织。烟曲霉原生 LdpA 和在毕赤酵母中表达的重组 LdpA （rLdpA）。（B） rLdpA 的糖蛋白染色。rLdpA 蛋白用高碘酸-希夫 （PAS） 和考马斯亮蓝 （CBB） 染色。分别使用牛胎球蛋白和牛血清白蛋白（BSA）作为糖蛋白和非糖蛋白对照。（C）N-连接聚糖的去糖基化。在用或没有PNGase F处理rLdpA后，对十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行CBB染色的凝胶迁移率位移测定。牛胎球蛋白被用作糖蛋白对照。（D）N-连接和O-连接聚糖的去糖基化。在用或不用三氟甲磺酸（TFMS）处理rLdpA后，在SDS-PAGE上进行CBB染色的凝胶淌度位移测定。牛胎球蛋白和BSA分别用作糖蛋白和非糖蛋白对照。（E） 凝集素结合测定。rLdpA （20 μg） 与 1 mg Dynabeads 反应生成 rLdpA–Dynabeads 复合物。将rLdpA-Dynabeads复合物与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的刀豆球蛋白A（ConA）（20μg）、FITC标记的小麦胚芽凝集素（WGA）（20μg）和FITC标记的花生凝集素（PNA）（20μg）孵育后，通过流式细胞术测量与rLdpA结合的凝集素。（F）α-甘露糖残基的去糖基化。在用或不用α-甘露糖苷酶处理 rLdpA 后，该酶具有外糖苷酶活性并从寡糖中去除末端 α1-2-、α1-3- 和 α1-6-连接的甘露糖残基，通过抗 c-Myc 抗体的蛋白质印迹分析确定 SDS-PAGE 上的凝胶迁移率变化。（G） Dectin-2-NFAT-GFP 报告基因测定。将表达含或不含Dectin-2的FcRγ的NFAT-GFP报告细胞在涂有rLdpA（0.1,1和10μg/ mL）的平板上孵育24小时，并通过流式细胞术测量GFP阳性细胞。（H） 源自 C57BL/6 小鼠或 Dectin-2 的骨髓来源的树突状细胞 （BMDC） 后?/?小鼠与25 μg/mL FITC标记的rLdpA孵育1 h，流式细胞术测定细胞的平均荧光强度（MFI）。（I） 促炎细胞因子和趋化因子 mRNA 表达。将C57BL/6小鼠来源的BMDC与25 μg/mL rLdpA孵育1.5 h，然后通过实时荧光定量PCR检测Tnf-α、Il-1α、Il-1β、Il-6、Il-12 p35、Il-12 p40、Kc/Cxcl1和Mip-2/Cxcl2 mRNA表达水平。 mRNA表达水平相对于Gapdh mRNA进行归一化，并显示为相对于对照磷酸盐缓冲盐水（PBS）组的倍数变化。（J） 促炎细胞因子和趋化因子蛋白水平。源自 C57BL/6 和 Dectin-2 的 BMDC?/?小鼠用 0.2–25 μg/mL rLdpA 和 5 ng/mL 脂多糖 （LPS） 孵育 24 h，通过酶联免疫吸附测定 （ELISA） 测量培养上清液中的 TNF-α、KC/CXCL1 和 MIP-2/CXCL2 蛋白水平。数据显示为平均值±标准差 （SD）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，通过未配对的双尾 Student's t 检验（H 和 I）或单因素方差分析与 Dunnett 的多重比较检验（G 和 J）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.g001
rLdpA 是一种含有 α-甘露糖残基的 O-连接糖蛋白
使用NetOGlyc 4.0服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）预测O-连接糖基化[34]。烟曲霉 LdpA 在每个 LysM 结构域的 N 末端含有假定的 O-糖基化位点，这些位点富含丝氨酸 （Ser） 和苏氨酸 （Thr） 残基（图 1A）。Ser和Thr残基占Ser/Thr富集区氨基酸含量的56.2%–66.6%。对糖蛋白进行高碘酸-希夫 （PAS） 染色以确定 rLdpA 的糖基化。作为糖蛋白对照的rLdpA和牛胎球蛋白均显示PAS染色阳性，而作为非糖蛋白对照的牛血清白蛋白（BSA）未显示染色（图1B）。用PNGase F处理后，还通过凝胶迁移率位移测定法检查rLdpA的糖基化，PNGase F从糖蛋白中去除了几乎所有的N-连接寡糖。PNGase-F处理的rLdpA的SDS-PAGE显示凝胶上的迁移率没有变化，作为分子量变化的指标（Mr) (图1C），而rLdpA在用三氟甲磺酸（TFMS）处理后显示出明显的迁移率变化，TFMS已广泛用于从糖蛋白中化学去除N-和O-连接的寡糖（图1D）[35,36]。M型r用TFMS处理的去糖基化rLdpA与其预测的M相对应r38 kDa。其次，评估rLdpA与凝集素的结合能力。结果表明，异硫氰酸荧光素（FITC）标记的刀豆球蛋白A（ConA）是一种α甘露糖结合凝集素，与rLdpA结合，而FITC标记的小麦胚芽凝集素（WGA）和花生凝集素（PNA）没有结合（图1E）。接下来，我们通过用α-甘露糖苷酶处理来检查 rLdpA 的甘露糖基化，该酶具有外切糖苷酶活性并从寡糖中去除末端 α1-2-、α1-3- 和 α1-6-连接的甘露糖残基。用α-甘露糖苷酶处理后，rLdpA的M明显转变r (图 1F）。综上所述，这些观察结果表明，rLdpA是一种具有末端α甘露糖残基的O-连接糖蛋白。
rLdpA 是一种 Dectin-2 配体，可诱导促炎细胞因子和趋化因子
由于CLR（Dectin-2）可识别真菌α-甘露聚糖[28]，因此我们进行了Dectin-2-NFAT-GFP报告基因测定，以研究rLdpA和Dectin-2之间的相互作用[37]。结果表明，rLdpA通过Dectin-2传递剂量依赖性激活信号（图1G）。FITC 标记的 rLdpA 被源自 Dectin-2 的 BMDC 内化?/?与源自C57BL / 6小鼠的BMDC相比，小鼠减弱（图1H）。此外，rLdpA 可诱导促炎细胞因子 （Tnf-α、Il-1α、Il-1β、Il-6、Il-12 p40） 和趋化因子 （Kc/Cxcl1 和 Mip-2/Cxcl2） mRNA 表达 （图 1I），与 rLdpA 孵育 1 h 的 BMDC 培养上清液中的 TNF-α、KC/CXCL2 和 MIP-2/CXCL24 蛋白水平也以 rLdpA 剂量依赖性方式增加 （图 1J).上述结果表明，rLdpA 通过 CLR（Dectin-2）诱导促炎细胞因子和趋化因子表达。
BMDCs对几丁质颗粒的吞噬作用诱导细胞死亡后IL-1α的释放
在这里，我们检查了大小约为0.6-5.9μm的几丁质颗粒的吞噬作用（图2A）。Calcofluor白色（CFW）标记的几丁质颗粒被BMDC吞噬（图2B和2C），但不诱导TNF-α或KC / CXCL1的产生（图2D）。有趣的是，几丁质颗粒的吞噬作用诱导了IL-1α的产生，IL-2α是一种典型的警报素（图1D）。IL-38α在健康组织中的许多细胞类型中以稳定状态组成型表达，其表达可响应促炎刺激而增加[1]。损伤、应激或感染导致的坏死细胞死亡会诱导IL-1α释放到周围环境中，从而触发IL-38α驱动的炎症环[1]。在本研究中，BMDCs对几丁质颗粒的吞噬作用诱导IL-2α释放和细胞死亡（图2E和2D），细胞松弛素D抑制吞噬作用消除了几丁质颗粒诱导的细胞死亡（图1F）和IL-2α释放（图2G）。与几丁质颗粒相比，BMDC 容易吞噬聚苯乙烯和钴基珠子 （Dynabeads;Thermo Fisher Scientific， Waltham， MA， USA）（S1A图），其不诱导细胞死亡或IL-2α释放（S2B和S1C图）。综上所述，这些观察结果表明，几丁质颗粒的吞噬作用通过诱导IL-1α的产生和细胞死亡介导的IL-<>α释放来触发先天性炎症。
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图 2. 几丁质颗粒的吞噬作用诱导细胞死亡和急性中性粒细胞气道炎症后IL-1α的释放。
（A）几丁质粒径的流式细胞术分析。黄色峰表示几丁质颗粒。灰色峰表示 0.6、1 和 5.9 μm 乳胶珠。（乙，丙）几丁质颗粒的吞噬试验。将源自 C57BL/6 小鼠的骨髓来源的树突状细胞 （BMDC） 与 50 μg/mL 钙荧光白 （CFW） 标记的几丁质颗粒（蓝色）一起孵育。用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤后，用 Alexa Fluor 555 鬼笔环肽（黄色）染色细胞，用 NucRed Live 647 ReadyProbes 试剂（红色）对细胞核进行染色，并通过共聚焦激光扫描显微镜 （B） 观察。通过流式细胞术（C）测量具有吞噬几丁质颗粒的细胞的平均荧光强度（MFI）。（D、E）将 BMDC 与几丁质颗粒 （2–250 μg/mL）、rLdpA （25 μg/mL） 或 PBS（载体对照）一起孵育，通过酶联免疫吸附测定 （ELISA） 测量培养上清液中的 TNF-α、KC/CXCL1 和 IL-1α 水平以及细胞裂解物中的 IL-1α。通过测量乳酸脱氢酶 （LDH） （E） 的释放来评估细胞毒性。（女，女）将BMDC与1μM细胞松弛素D孵育30分钟，然后加入几丁质颗粒（250μg/ mL）。孵育24 h后，通过测定LDH（F）的释放来评估细胞毒性，并通过ELISA（G）测量培养上清液中的IL-1α蛋白水平。（H） C57BL/6 小鼠以单次鼻内剂量给予几丁质颗粒 （100 μg）、rLdpA （10 μg） 或 PBS（载体对照）。3、6、12 h后取支气管肺泡灌洗液（BAL）标本，流式细胞术测定中性粒细胞数。（I） 甲壳素颗粒 （100 μg） 和 rLdpA （10 μg） 以单次鼻内剂量给予 C57BL/6 小鼠。1 h后测定BAL液中中性粒细胞数量、IL-24α水平和LDH水平，（J）在鼻内几丁质颗粒给药前1 h以57 μg/小鼠的剂量将抗IL-6α中和抗体或同型对照抗体注射到C80BL/1小鼠腹膜腔中。24小时后测定BAL液中嗜中性粒细胞的数量。数据显示为平均值±标准差 （SD）。（H，n = 3只小鼠/组;I，n = 6只小鼠/组;J，n = 7-8只小鼠/组）。每个符号代表一个单独的样本（I 和 J）。*P < 0.05 和 **P < 0.01，通过单因素方差分析与 Dunnett 多重比较检验 （D-H） 或未配对的双尾学生 t 检验（I 和 J）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.g002
几丁质颗粒诱导IL-1α介导的急性中性粒细胞气道炎症
接下来，我们研究了几丁质颗粒和rLdpA对体内气道炎症的影响。甲壳素颗粒在鼻内单剂量给药后6小时诱导急性中性粒细胞浸润到小鼠气道中，而rLdpA不诱导急性中性粒细胞气道炎症（图2H）。在给予几丁质颗粒的小鼠中，BAL液中的乳酸脱氢酶（LDH）和IL-1α水平升高（图2I）。腹膜内用抗IL-1α中和抗体抑制了几丁质颗粒对急性中性粒细胞浸润的诱导（图2J）。这些结果表明，IL-1α是几丁质颗粒诱导的急性中性粒细胞气道炎症的关键细胞因子。
rLdpA-Dectin-2 相互作用促进 rLdpA-几丁质复合物的吞噬作用
LdpA包含三个几丁质结合LysM结构域，位于细胞壁和细胞外基质内[33]，表明LdpA是一种几丁质相关蛋白。在使用各种不溶性多糖的沉降测定中，rLdpA被证明与几丁质颗粒和几丁质珠结合，大约50%的rLdpA与壳聚糖结合，壳聚糖是甲壳素的80%脱乙酰产物（图3A）。这些观察结果表明，LdpA是一种几丁质结合蛋白。我们量化了 rLdpA 的几丁质结合能力，结果显示大约 10-20 μg rLdpA 与 1 mg 几丁质结合（S3 图）。接下来，我们研究了rLdpA-几丁质复合物对BMDCs的影响。首先，通过FITC 标记的 rLdpA 和 CFW 标记的几丁质颗粒反应产生荧光标记的 rLdpA-几丁质复合物（图 3B）。吞噬作用测定结果表明，与几丁质相比，BMDCs更容易吞噬rLdpA-几丁质复合物，表明rLdpA增强了rLdpA-几丁质复合物的吞噬作用（图3C和3D）。为了进一步研究 rLdpA 对吞噬作用的促进作用，将不同浓度的 rLdpA （0.0012–20 μg） 与特定量的 CFW 标记的几丁质反应。BMDCs对rLdpA-几丁质复合物的吞噬作用以rLdpA浓度依赖性方式增加（图3E）。接下来，我们研究了 LdpA-Dectin-2 相互作用是否有助于 rLdpA-几丁质复合物的吞噬作用。简而言之，在加入 rLdpA-几丁质复合物之前，将 BMDC 与 CLR 的各种碳水化合物配体一起孵育。BMDCs对rLdpA-几丁质复合物的吞噬作用被酿酒酵母的甘露聚糖Dectin-2配体抑制（图3F）。此外，rLdpA-几丁质复合物的吞噬作用在 Dectin-2 的 BMDC 中减弱?/?小鼠（图3G）。这些结果表明，rLdpA-Dectin-2相互作用促进了rLdpA-几丁质复合物的吞噬作用。
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图 3. rLdpA-Dectin-2 相互作用促进 rLdpA-几丁质复合物的吞噬作用。
（A） 重组 LdpA （rLdpA） 对不溶性多糖的亲和力，通过沉降法测定。将 rLdpA （10 μg） 和 BSA （10 μg） 与不溶性多糖、几丁质 （1 mg）、几丁质珠 （1 mg）、壳聚糖 （1 mg）（≥ 80.0% 脱乙酰化）和纤维素 （1 mg） 一起在 100 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中孵育。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测上清液（sup.）和沉淀物（sed.）中的rLdpA。（B） 异硫氰酸荧光素 （FITC） 标记的 rLdpA （20 μg） 与 1 mg 钙荧光白 （CFW） 标记的几丁质反应。通过共聚焦激光扫描显微镜观察所得的rLdpA-几丁质复合物。（C） rLdpA-几丁质复合物的吞噬作用测定。将来源于C57BL / 6小鼠的小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC）与FITC标记的rLdpA（1μg/ mL），CFW标记的几丁质（50μg/ mL）以及FITC和CFW标记的rLdpA-几丁质复合物（rLdpA，1μg/ mL;几丁质，50μg/ mL）一起孵育4小时。用 PBS 洗涤后，用 Alexa Fluor 555 鬼笔环肽（黄色）染色细胞，用 NucRed Live 647 ReadyProbes 试剂（红色）对细胞核进行染色，并通过共聚焦激光扫描显微镜观察。（D） 将来源于 C57BL/6 小鼠的 BMDC 与 CFW 标记的 rLdpA-几丁质复合物（rLdpA，1 μg/mL;几丁质，50 μg/mL）和 CFW 标记的几丁质 （50 μg/mL） 孵育 1-24 小时。用PBS洗涤后，通过流式细胞术测量rLdpA-几丁质复合物吞噬细胞的平均荧光强度（MFI）。（E） LdpA 对 rLdpA-几丁质复合物吞噬作用的影响。将 CFW 标记的几丁质 （1 mg） 与不同量的 rLdpA （0.16–20 μg） 反应 30 分钟。将所得的rLdpA-几丁质复合物与源自C57BL / 6小鼠的BMDC一起孵育4小时，然后用PBS洗涤。通过流式细胞术测量rLdpA-几丁质复合物吞噬细胞的平均荧光强度（MFI）。（F）rLdpA-几丁质复合物吞噬作用的抑制试验。将来源于 C57BL/6 小鼠的 BMDC 与 1 mg/mL 甘露聚糖、1 mg/mL 甘露糖、1 mg/mL 海带蛋白、1 mg/mL 葡聚糖、1 mg/mL N-乙酰氨基葡萄糖 （GlcNAc） 和 PBS 一起孵育 1 分钟，然后加入 CFW 标记的 rLdpA-几丁质复合物（rLdpA，30 μg/mL，几丁质，1 μg/mL）。孵育50 h后，通过流式细胞术测量rLdpA-几丁质复合物吞噬细胞的MFI。（G） 来源于 C4BL/57 小鼠和 Dectin-6 的 BMDC?/?将小鼠与CFW标记的rLdpA-几丁质复合物（rLdpA，1μg/mL;几丁质，50μg/mL）孵育1-24小时。用PBS洗涤后，通过流式细胞术测量rLdpA-几丁质复合物吞噬细胞的MFI。数据显示为平均值±标准差 （SD）。*P < 0.05、**P < 0.01 和 ***P < 0.001，通过未配对的双尾学生 t 检验（D 和 G）或单因素方差分析与 Dunnett 多重比较检验（E 和 F）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.g003
rLdpA–几丁质复合物以 Dectin-2 依赖性方式激活 BMDC
接下来，我们检查了rLdpA-几丁质复合物是否激活了BMDC。 与rLdpA-几丁质复合物一起孵育导致主要组织相容性复合物（MHC）II类、CD80、CD86和CD40的细胞表面表达上调（图4A）。此外，rLdpA-几丁质复合物显著增强了促炎细胞因子 Tnf-α、Il-1α、Il-1β、Il-6 和 Il-12 p40 以及趋化因子 Kc/Cxcl1 和 Mip-2/Cxcl2 的 mRNA 表达水平（图 4B），并增加了 TNF-α、IL-1α 和 KC/CXCL1 蛋白水平（图 4C）。 此外，rLdpA-几丁质复合物增加了几丁质颗粒诱导的细胞死亡（图4D）。rLdpA-几丁质复合物介导的促炎细胞因子和趋化因子诱导依赖于含半胱天冬酶募集结构域的蛋白 9 （Card9） 和 Dectin-2，并且与髓系分化标志物 88 （Myd88）、巨噬细胞诱导型 C 型凝集素 （Mincle）、巨噬细胞 C 型凝集素 （MCL） 和 Dectin-1 无关（图 4E、4F 和 4G）).综上所述，这些观察结果表明，rLdpA-Dectin-2相互作用对于rLdpA-几丁质复合物介导的BMDCs激活至关重要。
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图 4. rLdpA 与几丁质协同激活 BMDC。
（A） 将 C57BL/6 小鼠的骨髓来源的树突状细胞 （BMDC） 与重组 LdpA （rLdpA） （1 μg/mL）、几丁质 （50 μg/mL）、rLdpA-几丁质复合物 （rLdpA， 1 μg/mL;几丁质， 50 μg/mL）、脂多糖 （LPS） （100 ng/mL） 和磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 一起孵育 24 小时。 通过流式细胞术测量 MHC II 类、CD80、CD86 和 CD40 细胞表面表达。（B） 促炎细胞因子和趋化因子 mRNA 表达。将C57BL/6小鼠来源的BMDC与rLdpA（25 μg/mL）、几丁质（250 μg/mL）、rLdpA-几丁质复合物（rLdpA，1 μg/mL;几丁质，50 μg/mL）和PBS孵育1.5 h后，实时荧光定量PCR检测Tnf-α、Il-1α、Il-1β、Il-12 p35、Il-12 p40、Il-6、Kc/Cxcl1和Mip-2/Cxcl2的mRNA表达水平。 mRNA 表达水平相对于 Gapdh mRNA 水平进行归一化，并显示为相对于对照 PBS 组的倍数变化。（C，D）将来源于C57BL/6小鼠的BMDC与rLdpA（1μg/mL）、几丁质（50μg/mL）、rLdpA-几丁质复合物（rLdpA，1μg/mL;几丁质，50μg/mL）和PBS一起孵育24小时，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测量培养上清液中的TNF-α、IL-1α和KC/CXCL1蛋白水平（C）。通过测量乳酸脱氢酶 （LDH） （D） 的释放来评估细胞毒性。（英、女、女）源自 C57BL/6、Card9 的 BMDC?/?， Myd88?/?（E）， 明克尔?/?、内侧副韧带?/?（F）， Dectin-2?/?和 Dectin-1?/?（G）小鼠用rLdpA-几丁质复合物（rLdpA，1 μg/mL;几丁质，50 μg/mL）和PBS孵育24 h，ELISA测定培养上清液中的TNF-α、IL-1α和KC/CXCL1蛋白水平。数据显示为平均值±标准差 （SD）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，通过事后 Tukey-Kramer 检验 （B， C， D） 的单因素方差分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.g004
rLdpA-几丁质复合物诱导 Dectin-2 依赖性中性粒细胞气道炎症
为了研究 rLdpA-几丁质复合物对 Dectin-2 诱导的体内气道炎症的影响，将单剂量 rLdpA-几丁质复合物鼻内给药至 C57BL/6 和 Dectin-2?/?小 鼠。给药后24小时处死所有动物并收集BAL液体（图5A）。与 C57BL/6 小鼠相比，Dectin-2?/?小鼠气道中总细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润水平显着降低（图5B）。相比之下，在 Dectin-2 中?/?小鼠，与C57BL / 6小鼠相比，肺泡巨噬细胞的减少受到抑制（图5B）。单剂量鼻腔给药rLdpA-几丁质复合物也以Dectin-1依赖性方式诱导BAL液中TNF-α、IL-1α和KC/CXCL2的水平（图5C）。这些观察结果表明，rLdpA-几丁质复合物诱导 Dectin-2 依赖性中性粒细胞气道炎症。
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图 5. rLdpA-几丁质复合物诱导 Dectin-2 依赖性中性粒细胞气道炎症。
（A） 将单剂量重组 LdpA-几丁质复合物（rLdpA，10 μg;几丁质，100 μg）鼻内给药至 C57BL/6 和 Dectin-2?/?小 鼠。给药后24小时处死所有动物，并收集BAL液体。（B） 流式细胞术测量 BAL 液中总细胞数、中性粒细胞数、嗜酸性粒细胞数和肺泡巨噬细胞数。（C）ELISA法检测BAL液中TNF-α、IL-1α和KC/CXCL1水平。数据显示为平均值±标准差 （SD）。（n = 4只小鼠/组）。每个符号代表一个单独的样本。P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.g005
rLdpA 和几丁质协同诱导 Th2 气道炎症
为了研究rLdpA和几丁质颗粒对体内气道免疫反应的协同作用，BALB/c小鼠鼻内注射rLdpA-几丁质复合物、rLdpA、几丁质颗粒、CpG-ODN或rLdpA+CpG-ODN三次（图6A）。在给予rLdpA-几丁质复合物的组中，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润到气道中的水平显着增加（图6B）。鼻腔给药rLdpA-几丁质复合物还诱导嗜酸性粒细胞趋化蛋白CCL11/Eotaxin-1和中性粒细胞趋化蛋白KC/CXCL1的表达（图6C）。我们进一步检查了与 rLdpA-几丁质复合物相关的 Th1/Th2 适应性免疫反应。在用 rLdpA 进行离体再刺激后，给予 rLdpA-几丁质复合物的小鼠纵隔淋巴结细胞的培养上清液中 Th2 相关细胞因子 IL-4 和 IL-5 的水平升高，而 Th1 相关细胞因子 INF-γ 的水平没有增加（图 6D）。相反，在给予rLdpA + CpG-ODN的小鼠中，INF-γ水平升高（图6D）。肺组织的组织学检查显示，rLdpA-几丁质复合物诱导分泌粘蛋白的气道杯状细胞增生，在哮喘的气道重塑过程中发挥作用（图6E）。在rLdpA-几丁质复合物给药组中，肺中Muc5b和AMCase的mRNA表达水平升高（图6F）。在给予rLdpA-几丁质复合物的组中，血清LdpA特异性IgG1和IgE水平升高（图6G）。此外，在 C2BL/57 小鼠中也观察到 rLdpA-几丁质复合物诱导的 Th6 驱动的气道炎症，已知与 BALB/c 小鼠相比，这些小鼠对过敏原的免疫反应性存在差异（S4 图）。这些观察结果表明，rLdpA和几丁质以协同方式诱导Th2气道炎症。
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图 6. 用 rLdpA-几丁质复合物进行鼻腔免疫诱导 Th2 免疫反应。
（A） rLdpA（10μg）、几丁质（100μg）、rLdpA-几丁质复合物（rLdpA，10μg;几丁质，100μg）、CpG-ODN（20μg）、rLdpA+CpG-ODN（rLdpA，10μg;CpG-ODN，20μg）或载体（PBS）鼻内给药给BALB/c小鼠72次。在最后一次鼻腔给药后11小时处死所有动物，并获得样品。（B） 总细胞数、中性粒细胞 （CD<>c?西格莱克F?CD11b Ly-6G）和嗜酸性粒细胞（CD11c++?通过流式细胞术测量支气管肺泡灌洗液 （BAL） 中的 Siglec F）。（C） 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测肺中Kc/Cxcl1和Ccl11/Eotaxin-1的mRNA表达水平。这些基因的 mRNA 水平相对于 Gapdh mRNA 进行了标准化。表达了的倍数差异相对于载体对照组。（D） 有或没有 4 μg/mL rLdpA 的离体再刺激后纵隔淋巴结 （MLN） 细胞分泌的 IL-5、IL-10 和 IFN-γ。（E） 用高碘酸-希夫 （PAS） 染色的肺组织的组织学检查。比例尺，100μm。（F）qRT-PCR检测肺内Muc5b和AMCase的mRNA表达水平。这些基因的 mRNA 水平相对于 Gapdh mRNA 进行了标准化。表达了的倍数差异相对于载体对照组。（G） 通过间接 ELISA 测量的血清 LdpA 特异性 IgG1、IgG2a 和 IgE 水平。数据显示为平均值±标准差（SD）（n = 6-7只小鼠/组）。每个符号代表一个单独的样本。+
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.g006
Dectin-2 缺乏减弱 rLdpA-几丁质复合物诱导的免疫反应
嗜酸性粒细胞浸润气道（图7B），BAL液中的KC / CXCL1和CCL11 / Eotaxin-1水平（图7C），体外再刺激rLdpA后脾细胞培养上清液中的IL-4和IL-5水平（图7D），血清LdpA特异性IgG1，IgG2a和IgE水平（图7E）在Dectin-2中减弱?/?与 C57BL/6 小鼠相比，小鼠施用 rLdpA-几丁质复合物。这些观察结果表明，Dectin-2 对 LdpA-几丁质复合物诱导的免疫反应至关重要。
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图 7. Dectin-2 的缺乏会减弱 rLdpA-几丁质复合物诱导的免疫反应。
（A） 重组 LdpA-几丁质复合物（rLdpA，10 μg;几丁质，100 μg）鼻内给药至 Dectin-2?/?和C57BL / 6小鼠72次。在最后一次鼻腔给药后1小时处死所有动物，并获得样品。（B）流式细胞术测量BAL液中总细胞数、中性粒细胞数和嗜酸性粒细胞数。（C） ELISA法检测BAL液中KC/CXCL11和CCL1/Eotaxin-4蛋白水平。（D） 有或没有 5 μg/mL rLdpA 的离体再刺激后脾细胞分泌 IFN-γ、IL-10 和 IL-1。（E） 通过间接 ELISA 测量的血清 LdpA 特异性 IgG2、IgG5a 和 IgE 水平。数据显示为平均值±标准差（SD）（n = 10-0只小鼠/组）。每个符号代表一个单独的样本。*P < 05.0，**P < 01.0，***P < 001.<>。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.g007
肺曲霉菌病患者的血清 LdpA 特异性免疫球蛋白水平升高
接下来，我们研究了三种肺曲霉病患者的血清 LdpA 特异性免疫球蛋白 （Ig） 水平，i。e.，侵袭性肺曲霉病 （IPA）、慢性肺曲霉病 （CPA） 和过敏性支气管肺曲霉病 （ABPA），通过间接酶联免疫吸附测定 （ELISA）。参与者和健康志愿者的人口统计学特征显示在 S1 表中。与健康对照组和IPA患者相比，CPA和ABPA患者的血清LdpA特异性IgG和IgE水平分别升高（图8）。这些观察结果表明，LdpA 被认为是慢性和过敏性肺 A 患者的抗原。烟曲霉感染。
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图 8. 肺曲霉病患者的血清 LdpA 特异性免疫球蛋白水平升高。
采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测侵袭性肺曲霉病（IPA）、慢性肺曲霉病（CPA）和过敏性支气管肺曲霉病（ABPA）患者和健康个体的血清LdpA特异性IgG和IgE水平。数据显示为平均值±标准差 （SD）（IPA 患者，n = 11;CPA 患者，n = 10;ABPM 患者，n = 5;健康个体，n = 10）。每个符号代表一个单独的样本。**P < 0.01 通过单因素方差分析和 Dunnett 的多重比较检验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.g008
讨论
酵母菌（如念珠菌属和酵母菌属）的外细胞壁含有高度甘露糖基化的糖蛋白，称为甘露糖蛋白[39,40]。甘露糖蛋白占人类致病酵母（白色念珠菌）细胞壁干重的40%[40]。与酵母相比，甘露糖链是丝状真菌A中细胞壁半乳甘露聚糖的组成部分。烟曲霉，与β-（1,3）-葡聚糖-几丁质核心的细胞内壁共价结合[39,41]。此外，A.烟曲霉细胞壁含有甘露糖链，作为O-连接糖蛋白和N-连接糖蛋白的聚糖[42]。糖蛋白上O-聚糖的结构在不同生物体之间甚至在真菌物种内也存在很大差异[43]。Trimble 等人。报道了重组人胆盐刺激脂肪酶中的O-聚糖在P中表达。pastoris拥有多达1个甘露糖残基的线性链，包括Man1-O、Manα2-1Man1-O和Manα2-1Manα2-1Man44-O[1]。在他们的研究中，最丰度的O-糖是Manα2-1Man1-O，其次是Manα2-1Manα2-1Man44-O[1]。与以往报道一致，重组A.烟曲霉LdpA 在酵母 P 中表达。pastoris 是一种具有末端 α-甘露糖残基的 O 连接糖蛋白。与P相反。pastoris，A糖蛋白中的O-聚糖。烟曲霉具有复杂的结构，但 A.烟曲虫包括Man1-O和Manα2-1Man45-O[<>]。这些报告表明，A.烟曲霉天然LdpA的免疫应答与P中表达的rLdpA相似。帕斯托里斯。
Ishikawa 等人。据报道，从致病真菌马拉色菌中分离出的O-连锁甘露糖蛋白W1是Dectin-2配体，W1的α-2,1-甘露糖基残基是Dectin-2识别的必要条件[37]。最近，Reedy 等人。报道 Dectin-2 是 A 的受体。烟曲半乳甘露聚糖[46]。在本研究中，我们发现rLdpA在P中表达。pastoris 是 Dectin-2 的配体，我们推测天然 LdpA 可能是 A 的 Dectin-2 配体的有力候选者。烟曲霉。
参与先天免疫的凝集素作为模式识别受体（PRR）不仅通过结合特异性，而且通过表面聚糖的密度依赖性识别来结合外来病原体[47,48]。向培养基中添加 rLdpA 不会将信号传递到 Dectin-2-NFAT-GFP 报告细胞，但当 rLdpA 固定在平板上时，rLdpA-Dectin-2 信号被传递。BMDC 中 Dectin-2 信号转导诱导炎性细胞因子需要高浓度 rLdpA 的刺激。相反，与几丁质颗粒结合的低浓度 rLdpA 强烈诱导吞噬作用以及细胞因子和趋化因子的表达，表明结合在几丁质颗粒表面的高密度 rLdpA 将信号传递到 Dectin-2。
据报道，Dectin-2可促进室内尘螨诱导的小鼠Th2型细胞分化和过敏性气道炎症[30,31,49]，但之前没有关于Dectin-2参与真菌诱导的过敏性气道炎症的研究。在这里，我们发现 rLdpA-几丁质复合物诱导了 Th2 型适应性免疫反应，而体内 Dectin-2 缺乏症减弱了这种免疫反应。此外，ABPA患者血清LdpA特异性IgE水平升高。这些观察结果强烈表明，天然LdpA与A有关。烟曲霉诱导的过敏性免疫反应。
甲壳素已被证明对先天免疫应答具有大小依赖性作用[12]。体外巨噬细胞中TNF-α的产生是由可吞噬大小的几丁质颗粒诱导的，而不是由大的非吞噬大小的几丁质颗粒诱导的[13\u18]。与这些发现相反，我们的体外结果表明，小的几丁质颗粒（0.6-5.9μm）不会诱导BMDC中TNF-α的产生。 低纯度的几丁质被认为可能导致对实验结果的误解，因为市售的几丁质含有微量的葡萄糖和蛋白质以及其他几种不明污染物[50].然而，迄今为止，许多研究并未描述用于纯化的方法或几丁质粒径，因此难以解释几丁质诱导的免疫反应。
在本研究中，我们发现BMDCs对几丁质颗粒的吞噬作用诱导了IL-1α的产生和细胞死亡介导的IL-1α的释放。此外，我们发现鼻内给药甲壳素颗粒在体内诱导IL-1α介导的急性中性粒细胞气道炎症，并且这种几丁质颗粒诱导的急性中性粒细胞气道炎症通过抗IL-1α中和抗体预处理而减弱。研究显示，IL-1α参与先天免疫系统的激活和炎症的诱导[38,51]。一些研究表明，IL-1α从肺泡巨噬细胞中预先存在的储备中迅速释放，并通过刺激IL-1β的产生来促进随后的肺部炎症，以响应小鼠气道中的细颗粒暴露[52,53]。IL-1α和IL-1β通过共享一个共同的受体IL-1 type 1受体（IL-1R1）表现出相同的功能[54]。Takeshige 等人。据报道，吸入几丁质会诱发气道炎症、气道高反应性和IL-1β的产生[55]。除了激活先天免疫外，IL-1（IL-1α和IL-1β）还具有激活适应性免疫系统的辅助作用[27,52,56]。Arae 等人。报道了几丁质和IL-33刺激的树突状细胞衍生的IL-1β促进OVA特异性Th2细胞活化，从而加重OVA诱导的气道炎症[27]。黑田东彦等据报道，气管内滴注IL-1α加OVA可诱导强烈的OVA特异性IgE反应[52]。Bueter 等人。据报道，几丁质不能激活炎症小体并诱导LPS引发的骨髓衍生巨噬细胞（BMM）中成熟的IL-1β分泌[57]。与他们的数据一致，rLdpA 和 rLdpA-几丁质复合物诱导 BMDC 中 IL-1β mRNA 表达，但未能诱导成熟 IL-1β 的分泌（S5 图），表明几丁质未能激活炎症小体。基于这些先前的报道和我们的数据，我们推测抗原呈递细胞对几丁质颗粒的吞噬作用可能诱导细胞死亡介导的 IL-1α 释放，IL-1α 随后在 rLdpA-几丁质复合物诱导的过敏性气道炎症中起重要作用。然而，这项研究的局限性在于，体内实验并未证明 IL-2α 是否参与 rLdpA-几丁质复合物诱导 Th<> 免疫反应。这个问题应该在将来得到解决。
De Silva 等人。据报道，几丁质的佐剂特性是由TLR2、MYD88和IL-17A参与和调节的途径介导的[22,58]。Fuchs 等人。据报道，几丁质低聚物直接与TLR2结合，并以寡聚体大小依赖性方式引发炎症[59]。他们的研究表明，几丁质低聚物污染甲壳素颗粒或宿主几丁质酶的存在，如壳三糖苷酶和酸性哺乳动物几丁质酶（AMCase）可能会影响实验结果。
总之，本研究结果表明，A.烟曲霉rLdpA在P中表达。pastoris 是一种 O-连接的糖蛋白，含有宿主 CLR 识别的末端 α-甘露糖残基 Dectin-2。几丁质颗粒诱导细胞死亡相关IL-1α释放介导的急性中性粒细胞气道炎症。rLdpA 与几丁质协同有效诱导 Th2 驱动的过敏性气道炎症。因此，本研究为真菌诱导的过敏性气道疾病提供了新的见解。
材料与方法
道德声明
在书面知情同意的情况下收集从每位患者和健康志愿者获得的血清样本，所有实验程序均获得千叶大学医学研究生院研究伦理委员会的批准（批准号：3237）。所有动物实验均由千叶大学动物实验委员会批准（批准号：2-326、2-327、3-272），并按照千叶大学动物实验规定进行。
动物
从日本Charles River Laboratories购买57-6周龄的无特异性病原体（SPF）雄性C5BL / 7和BALB / c小鼠。C2BL/1背景中Dectin-57和Dectin-6缺陷小鼠已有报道[28,60]。C57BL/6背景中缺乏Mincle和MCL缺陷的小鼠已有报道[61,62]。C88BL/57背景中Myd6缺陷小鼠[63]购自Oriental Bioservice（日本京都）。C9BL/57背景中的Card6缺陷小鼠在前面已有报道[64]。所有小鼠均饲养在SPF条件下，可随意获得食物和水。
真菌
S2 表显示了 P。本研究中使用的 Pastoris 菌株。将P. pastoris保持在25°C的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）上。
LdpA 特异性 Igs
96孔板（Nunc MaxiSorp;Thermo Fisher Scientific， Waltham， MA， USA）涂有 rLdpA（0.2 M 碳酸钠缓冲液中 0.05 μg/mL，pH 9.6），并在 4°C 下孵育过夜。 然后用含有 0% BSA 的磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（2.0 g/L 氯化钾、2.8 g/L 磷酸二氢钾、1 g/L 氯化钠、15.7 g/L 磷酸氢二钠，pH 4.2）封闭每个孔中的 rLdpA 蛋白。分别制备人血清样品（1：200 和 1：10）的稀释液用于 IgG 和 IgE。分别制备小鼠血清样品（1：65,536、1：512和1：10）的稀释液用于IgG1、IgG2a和IgE。使用生物素化的抗人 IgG 单克隆抗体 （mAb） （G18-145;BD Biosciences）、生物素化抗人IgE单克隆抗体（f0822;Biomatrix Research， Chiba， Japan）、生物素化抗小鼠 IgG1 mAb （A85-1;BD Pharmingen， San Diego， CA， USA）、生物素化抗小鼠 IgG2a mAb （R19-15;BD Pharmingen）和生物素化抗小鼠IgE单克隆抗体（R35-72;BD Pharmingen）。使用 Pierce 高灵敏度链霉亲和素-辣根过氧化物酶 （HRP）（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）和四甲基联苯胺底物（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）检测生物素化单克隆抗体。使用1N硫酸淬灭反应，并在490nm处测量吸光度（A490）使用自动酶标仪（Sunrise Rainbow Thermo RC;Tekan， M?nnedorf， 瑞士）。
重组LdpA
A.烟曲霉 ldpA缺乏信号序列的CDS通过pCR2.1-ldpA的PCR扩增[33]。使用 In-Fusion HD 克隆试剂盒 （Clontech Laboratories） 将 PCR 产物克隆到 c-Myc 标签和 6×His 标签的 N 末端的 pPICZαC 载体 （Thermo Fisher Scientific） 中。所得质粒pPICZαC-ldpA用于转化P。帕斯托里斯GS115（赛默飞世尔科技）通过电穿孔。通过添加甲醇诱导rLdpA分泌到培养物上清液中。去除P后。使用 Ni Sepharose 6 FF 填料（GE Healthcare，Wauwatosa，WI，USA）纯化培养上清液中的 pastoris 细胞、rLdpA。缓冲液交换至PBS后，使用带有Ultracel-15膜的Amicon Ultra-10离心过滤装置（Merck Millipore，Billerica，MA，USA）浓缩rLdpA。使用以 BSA 为标准品的 Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 （Thermo Fisher Scientific） 测定最终蛋白浓度。使用抗 c-Myc mAb （9E10;Sigma-Aldrich， St. Louis， MO， USA）和 HRP 偶联的抗小鼠 IgG 二抗 （A4416;西格玛-奥尔德里奇）。本研究中使用的质粒总结在S3表中。
rLdpA对不溶性多糖的亲和力
通过将 10 μg rLdpA 与甲壳素各 1 mg 孵育来测定 rLdpA 对不溶性多糖的亲和力 （C7170;Sigma-Aldrich）、甲壳素珠（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA），壳聚糖（≥80.0%脱乙酰）（FUJIFILM Wako Pure Chemical）和纤维素（FUJIFILM Wako Pure Chemical）在PBS（总体积= 100μL）中，在37°C下轻轻搅拌30分钟。将不溶性部分通过离心沉淀，并收集上清液。将不溶性馏分用PBS洗涤三次，并重悬于蒸馏水中。通过SDS-PAGE评估沉淀和上清液中的rLdpA，并用考马斯亮蓝（FUJIFILM Wako Pure Chemical，Osaka，Japan）对凝胶进行染色。BSA（FUJIFILM Wako Pure Chemical）用作对照，以确定非特异性结合。
糖蛋白染色
在SDS-PAGE之后，将rLdpA蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Merck Millipore）上。然后根据制造商的说明，使用糖蛋白蛋白质免疫印迹检测试剂盒（Takara Bio，Kyoto，Japan）用高碘酸-希夫（PAS）对膜进行染色。
化学去糖基化
如前所述，使用三氟甲磺酸（TFMS）（Sigma-Aldrich）对rLdpA进行化学去糖基化[35,36]。用TFMS处理后，蛋白M的转变r通过SDS-PAGE进行评估。牛胎球蛋白（Sigma-Aldrich）和BSA（Sigma-Aldrich）分别用作糖蛋白和非糖蛋白对照。
脱甘露糖基化
将 rLdpA 与 α1-2、-3 和 -6 甘露糖苷酶 （New England Biolabs） 在 37°C 下孵育 1 小时，蛋白 M 发生变化r通过 SDS-PAGE 进行检查，然后用抗 c-Myc mAb （9E10;Sigma-Aldrich）和HRP偶联的抗小鼠IgG二抗（A4416;西格玛-奥尔德里奇）。
凝集素结合测定
将 20 μg rLdpA 的等分试样与 1 mg Dynabeads（Dynabeads His-Tag Isolation & Pulldown kit;Thermo Fisher Scientific）生成 rLdpA-Dynabeads 复合物。将 rLdpA-Dynabeads 复合物与异硫氰酸荧光素 （FITC） 标记的刀豆球蛋白 A （ConA） （20 μg） （20 μg） （Sigma-Aldrich）、FITC 标记的小麦胚芽凝集素 （WGA） （20 μg） （Sigma-Aldrich） 和 FITC 标记的花生凝集素 （PNA） （<> μg） （Sigma-Aldrich） 孵育后，通过流式细胞术测量与 rLdpA 结合的凝集素。
Dectin-2-NFAT-GFP报告基因检测
96孔板（Nunc MaxiSorp;Thermo Fisher Scientific）包被 rLdpA（0.1、1 和 10 μg/mL，溶于 0.05 M 碳酸钠缓冲液，pH 9.6）中，并在 4°C 下孵育过夜。 用PBS洗涤2次后，将表达FcRγ（含或不含Dectin-65）的NFAT-GFP报告细胞[24]培养10 h。通过流式细胞术（BD FACSVerse;BD Biosciences）。使用FlowJo version <>（BD Biosciences）分析数据。
通过qRT-PCR进行基因表达分析
使用 RNAiso plus （Takara Bio） 和 Direct-zol RNA MiniPrep （Zymo Research， Orange， CA， USA） 分离总 RNA，并使用 Turbo DNA-free 试剂盒 （Thermo Fisher Scientific） 用 DNase 处理以去除 DNA 污染。随后，根据制造商的说明，使用 PrimeScript RT 预混液 （Takara Bio） 合成 cDNA。在 Applied Biosystems StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统 （Thermo Fisher Scientific） 上使用 TB Green Fast qPCR 混合物 （Takara Bio） 和基因特异性引物（S4 表）进行定量实时 PCR （qRT-PCR）。基因表达水平相对于 Gapdh mRNA 水平进行归一化，并显示为相对于载体对照组的倍数变化。
甲壳素纯化
甲壳素按照 Roy 等人的描述纯化。[66]. 简而言之，几丁质（C7170;Sigma-Aldrich）溶于12.5M HCl中，并在40°C下孵育30分钟。将溶液转移到冷却的烧杯中，然后用冰冷的氢氧化钠（NaOH）缓慢中和。收集不溶性馏分，以1000 × g离心30 s，用水洗涤10次，用乙醇洗涤<>次。纯化的几丁质颗粒通过<>μm尼龙过滤器过滤。将滤液离心，沉淀物在干燥器中干燥。通过流式细胞术评估几丁质粒径。在实验中使用甲壳素颗粒之前进行超声处理。
rLdpA-几丁质复合物的制备
通过将 20 μg rLdpA 与 1 mg 几丁质混合用于体外实验，将 100 μg rLdpA 与 1 mg 甲壳素混合用于体内实验来生成 rLdpA-几丁质复合物。将每种混合物在室温下孵育30分钟。
rLdpA和几丁质的荧光标记
根据制造商的说明，rLdpA用FITC异构体-I（Dojindo，Kumamoto，Japan，Kumamoto，Japan）标记。用 25 μg/mL 钙荧光白 （CFW） 标记甲壳素（荧光增白剂 28;Sigma-Aldrich）在室温下30分钟，用PBS洗涤1次，然后重悬于PBS中。为了生成 rLdpA-FITC-几丁质-CFW 复合物，将 20 mg CFW 标记的几丁质与 30 μg FITC 标记的 rLdpA 在室温下孵育 <> 分钟。
荧光显微镜
使用共聚焦激光扫描显微镜（STELLARIS 5;徕卡显微系统公司，Wetzlar，德国）和倒置荧光显微镜（BZ-9000;基恩士）。
小鼠BMDCs
小鼠骨髓来源的树突状细胞 （BMDC） 如 Lutz 等人所述获得。[67]. 简而言之，小鼠骨髓是从小鼠的胫骨和股骨中获得的。骨髓细胞在RPMI 1640（R8758;Sigma-Aldrich）补充 100 U/mL GM-CSF（Peprotech，Rocky Hill，NJ，USA）、10% （v/v） 热灭活胎牛血清 （FBS）（Thermo Fisher Scientific）、0.1% （v/v） 2-巯基乙醇 （Thermo Fisher Scientific）、1mM 丙酮酸钠 （Thermo Fisher Scientific）、1× MEM 非必需氨基酸 （Thermo Fisher Scientific）、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素（FUJIFILM Wako Pure Chemical）。在第 2、4 和 6 天补料培养物，替代约 75% 的培养基。在 6 ± 1 天时，收获松散贴壁和非贴壁细胞作为 BMDC。
吞噬作用测定
通过将小鼠BMDC以24.2×5的浓度分配到10孔板中进行吞噬测定5细胞/孔，并与 FITC 和 CFW 标记的 rLdpA-几丁质复合物（rLdpA，1 μg/mL;几丁质，50 μg/mL）、FITC 标记的 rLdpA （1 μg/mL） 或 CFW 标记的几丁质 （50 μg/mL） 在 37°C 的 5% CO 气氛下孵育2在指定的时间内。通过流式细胞术（BD FACSVerse;BD Biosciences）。使用FlowJo version 10（BD Biosciences）分析数据。
吞噬作用抑制试验
通过将小鼠BMDC以24.2×5的浓度分配到10孔板中进行吞噬抑制测定5细胞/孔，并与来自酿酒酵母 （Sigma-Aldrich） 的 1 mg/mL 甘露聚糖、1 mg/mL d（+）-甘露糖 （FUJIFILM Wako Pure Chemical）、1 mg/mL 海带多糖（Nacalai Tesque，京都，日本）、1 mg/mL 葡聚糖（来自明串珠菌属 （Mr450000–650000;Sigma-Aldrich）、1 mg/mL d（+）-半乳糖（FUJIFILM Wako Pure Chemical）、1 mg/mL N-乙酰基-d（+）-氨基葡萄糖（FUJIFILM Wako Pure Chemical）或 PBS，在 37°C 的 5% CO 气氛下230 分钟，然后加入 CFW 标记的 rLdpA-几丁质复合物（rLdpA，1 μg/mL，几丁质，50 μg/mL）。孵育4 h后，通过流式细胞术（BD FACSVerse;BD Biosciences）。使用FlowJo version 10（BD Biosciences）分析数据。
细胞因子和趋化因子的测量
使用小鼠 TNF-α、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、KC/CXCL1、Mip-2/CXCL2 和 CCL11/Eotaxin1 ELISA 试剂盒（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）测定细胞因子和趋化因子水平。
共刺激分子的表达
将小鼠BMDC以12×5的浓度分配到10孔板中5细胞/孔并与 rLdpA （1 μg/mL）、几丁质 （50 μg/mL）、rLdpA-几丁质复合物 （rLdpA，1 μg/mL;几丁质，50 μg/mL） 或脂多糖 （LPS， 10 ng/mL） （eBioscience， San Diego， CA， USA） 孵育 16 小时。将细胞悬浮在FACS缓冲液中（2%热灭活的FBS和1mM EDTA的PBS溶液，pH 7.4）。Fc受体被抗小鼠CD16/32 mAb阻断（93;eBioscience）。用荧光染料偶联的单克隆抗体 （mAb） 混合物对细胞进行染色，这些抗体是针对 CD11c （N418; eBioscience）、MHC II 类 （M5/114.15.2;Miltenyi Biotec）、CD40（FGK45.5;Miltenyi Biotec）、CD80（16-10A1;Miltenyi Biotec）和CD86（PO3.3;Miltenyi Biotec）在FACS缓冲液中。对CD11c细胞进行门控，流式细胞术检测MHC II类、CD40、CD80和CD86细胞表面表达（BD FACSVerse;BD Biosciences）。使用FlowJo version 10（BD Biosciences）分析数据。+
细胞毒性试验
通过使用细胞毒性 LDH 检测试剂盒-WST（Dojindo Laboratories）测量受损细胞释放的乳酸脱氢酶 （LDH） 活性来分析细胞毒性。
动物模型
用异氟醚麻醉小鼠，鼻内给予含有20μgrLdpA（rLdpA组），10μg几丁质（几丁质组），100μgrLdpA和10μg几丁质（rLdpA-几丁质复合物组）的混合物，100μgCpG-ODN（K20;GeneDesign，日本大阪）（CpG-ODN 组），3 μg rLdpA 和 10 μg CpG-ODN 的混合物（rLdpA+CpG-ODN 组），或 PBS 作为对照（载体对照组）。在鼻内几丁质给药前20小时，将抗IL-1α单克隆抗体（ALF-161;eBioscience）或亚美尼亚仓鼠IgG同型对照（eBio299Arm;eBioscience）注射到小鼠腹膜腔中[80]。小鼠在图中所示的时间点用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉下通过心脏穿刺实施安乐死。
BAL 液中白细胞总数和白细胞计数差异
通过安装和取出 0.7 mL 无菌 PBS 回收气道内容物。离心BAL液，将细胞沉淀重悬于PBS中。在光学显微镜下使用血细胞计数器对细胞进行计数。为了确定白细胞计数差异，将细胞重悬于 FACS 缓冲液中，并用抗小鼠 CD16/32 mAb 封闭 Fc 受体 （93; eBioscience）。用荧光染料偶联的单克隆抗体混合物对细胞进行 CD11c （N418; eBioscience）、CD11b （M1/70; eBioscience）、Siglec F （E50-2440;BD Biosciences）和FACS缓冲液中的Ly-6G（1A8-Ly;eBioscience）。在红细胞裂解缓冲液（eBioscience）中裂解红细胞后，将细胞重悬于FACS缓冲液中。通过流式细胞术（BD FACSVerse;BD Biosciences）。中性粒细胞被鉴定为 CD11c?西格莱克F?CD11b Ly-6G细胞，嗜酸性粒细胞被鉴定为CD11c++?Siglec F 细胞和肺泡巨噬细胞被鉴定为 CD11c Siglec F 细胞。使用FlowJo version 10（BD Biosciences）分析数据。+++
LdpA 特异性再刺激脾脏和纵隔淋巴结细胞
如上所述气道暴露后，分离小鼠脾脏或纵隔淋巴结 （MLN） 细胞，并在补充有 1640% 热灭活 FBS、10 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 RPMI 100 培养基中培养，含或不含 rLdpA （10 μg/mL） 在 37°C 下，在 5% CO 气氛下272小时。收集细胞培养上清液，通过ELISA测定细胞因子。
肺部组织病理学
将小鼠肺固定在缓冲的10%福尔马林中。固定肺通常包埋在石蜡中，并切成 4-5 μm 厚的切片，用 PAS 染色。
定量和统计分析
使用GraphPad InStat 3软件（GraphPad Software， San Diego， CA， USA）进行统计分析。在所有分析中，P<0.05表示统计学意义。统计检验和样本量的详细信息在图例中标明。P值如图所示。
支持信息
参与者和健康对照的人口统计学特征。
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1附表S1.D情绪学C哈拉克学Participants 和H艾尔西缺点小车组不。患者数量年龄（平均值± 标清）性（M啤酒/Female)异丙醇1150.1± 11.75/6注册 会计师1065.1± 9.53/7阿巴558.4± 12.01/4C安特罗尔1044.6± 14.26/4ABPA，过敏性支气管肺曲霉病;CPA，慢性肺曲霉病;IPA，侵袭性肺曲霉病.
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S1 表。 参与者和健康对照的人口统计学特征。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.s001
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S2 表。 本研究中使用的毕赤酵母菌株列表。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.s002
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S3 表。 本研究中使用的质粒。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.s003
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S4 表。 本研究中用于定量 RT-PCR 的引物。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.s004
（PDF格式）
S1 图。 烟曲霉LdpA在毕赤酵母中的表达。
（A） 培养上清液中的总蛋白水平。将帕斯托里斯 GS115 和 ldpA 转化体 GS115-LdpA 在缓冲甲醇培养基 （BMM） 中培养，加入甲醇诱导蛋白表达。通过BCA蛋白测定法测量培养上清液中的总蛋白水平。（乙，丙）使用抗 c-Myc 抗体和 HRP 偶联的二抗 （C） 通过 SDS-PAGE （B） 和蛋白质印迹分析确认纯化的重组 LdpA （rLdpA）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.s005
（TIF）
S2 图。 Dynabeads 的吞噬作用不能诱导细胞死亡和 IL-1α 释放。
将 C57BL/6 小鼠的 BMDC 与 Dynabeads、几丁质或 PBS 孵育 24 小时。 （A） 用 PBS 洗涤后，用 Alexa Fluor 555 鬼笔环肽（黄色）染色细胞，用 NucRed Live 647 ReadyProbes 试剂（红色）染色细胞核，并通过共聚焦激光扫描显微镜观察。（B） 通过测量 LDH 的释放来评估细胞毒性。（C）ELISA法测定培养上清液中IL-1α蛋白水平。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.s006
（TIF）
S3 图。 rLdpA的几丁质结合能力。
在2 μL PBS中连续稀释的rLdpA（5.40–1 μg）与几丁质（100 mg）孵育后，通过SDS-PAGE评估上清液（sup.）和沉淀物（sed.）中的rLdpA。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.s007
（TIF）
S4 图。 用 rLdpA-几丁质复合物鼻腔免疫诱导 C2BL/57 小鼠的 Th6 免疫反应。
（A） 重组 LdpA （rLdpA） （10 μg）、几丁质 （100 μg） 和 rLdpA-几丁质复合物 （rLdpA，10 μg;几丁质，100 μg） 鼻内给药 C57BL/6 小鼠 8 次。在最后一次鼻腔给药后72小时（B）或1小时（B，C，D，E和F）处死所有动物，并获得样品。（B）流式细胞术测定支气管肺泡灌洗液（BAL）中总细胞数、中性粒细胞数和嗜酸性粒细胞数。（C） 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肺组织裂解物中KC/CXCL11和CCL1/Eotaxin-4蛋白水平。（D） 有或没有 5 μg/mL rLdpA 的离体再刺激后脾细胞分泌的 IL-10、IL-100 和 IFN-γ。（E） 用高碘酸-希夫 （PAS） 染色的肺组织的组织学检查。比例尺，1μm。（F） 通过间接 ELISA 测量的血清 LdpA 特异性 IgG2、IgG6a 和 IgE 水平。数据显示为平均值±标准差（SD）（n = 0只小鼠/组）。每个符号代表一个单独的样本。*P < 05.0，**P < 01.0，***P < 001.<>，通过事后 Tukey-Kramer 检验的单因素方差分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.s008
（TIF）
S5 图。 BMDCs中IL-1β的分泌不是由rLdpA-几丁质复合物诱导的。
将BMDC与rLdpA（0.2-25μg/mL）、几丁质颗粒（2-250μg/mL）、rLdpA-几丁质复合物（rLdpA，0.008-1μg/mL;几丁质，50μg/mL）或PBS（载体对照）一起孵育，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测量培养上清液中的IL-1β水平。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011878.s009
（TIF）
确认
作者感谢 M. Yahiro、R. Seki 和 I. Koga（日本千叶大学医学真菌学研究中心）提供的技术援助。
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