免费医学论文发表-从女性生殖道中消除衣原体是IL-12p40依赖性的，但独立于Th1和Th2细胞

抽象

衣原体疫苗方法渴望诱导 Th1 细胞以获得最佳保护，尽管没有直接证据表明 Th1 介导的衣原体从女性生殖道 （FRT） 中清除。我们最近报道，缺乏T-bet的小鼠可以正常解决原发性衣原体感染，从而破坏了Th1细胞在衣原体免疫中的潜在保护作用。在这里，我们发现缺乏T-bet的小鼠产生强大的Th17反应，而缺乏Th17细胞的小鼠表现出延迟的细菌清除，这表明衣原体特异性Th17细胞代表了一个被低估的保护群体。此外，Th2缺陷小鼠可以胜任清除宫颈阴道感染。此外，我们发现非造血细胞对 IFN-γ 的感应对于衣原体免疫至关重要，但 FRT 中的细菌清除不需要 CD4 T 细胞分泌 IFN-γ。尽管Th1细胞不是衣原体清除所必需的，但对衣原体的保护性免疫仍然依赖于MHC II类限制性CD4 T细胞和IL-12p40。总之，这些数据表明 IL-12p40 依赖性 CD4 效应成熟对衣原体免疫至关重要，而 Th17 细胞在较小程度上至关重要，但 Th1 和 Th2 细胞发育都不重要。如果未来的衣原体疫苗接种工作专注于诱导这种保护性CD4 T细胞群，将更加有效。

作者摘要

CD4 T细胞介导女性生殖道衣原体感染清除的机制尚不清楚。与流行的观点相反，我们实验室以前的研究表明，以 T-bet 表达为特征的 Th1 亚群不需要清除。在这里，我们探索了其他辅助性 T 细胞亚群，并确定同样不需要 Th2 细胞，而 Th17 细胞有助于感染清除的早期阶段。最终，细胞因子亚基 IL-12p40 在驱动有效的 CD4 T 细胞反应中起着重要作用，而这种反应不是由典型的 CD4 亚群 Th1、Th2 或 Th17 身份明确定义的。因此，疫苗开发应侧重于这种 IL-12p40 驱动的 CD4 T 细胞反应，而不是依赖经典辅助性 T 细胞亚群的标志物。

数字

Fig 6Fig 7Fig 8图1图2图3Fig 4Fig 5Table 1Fig 6Fig 7Fig 8图1图2图3

引文： Rixon JA、Fong KD、Morris C、Nguyen AT、Depew CE、McSorley SJ （2024） 从女性生殖道消除衣原体依赖于 IL-12p40，但独立于 Th1 和 Th2 细胞。PLoS 病理学 20（1）： e1011914 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011914

编辑 器： Jorn Coers，美国杜克大学医学院

收到： 28年2023月19日;接受： 2023年2月2024日;发表： <>月 <>， <>

版权所有： ? 2024 Rixon et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。原始RNAseq数据可在NCBI的基因表达综合数据库中获得，并可通过GEO系列登录号GSE193909（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE193909）获得。

资金： 这项工作由 NIH-国家过敏和传染病研究所 （https://www.niaid.nih.gov/） 对 SJM（RO1 AI103422 和 T32 AI060555）的资助资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。

介绍

沙眼衣原体是生殖道感染的常见病因，在美国仍然是一个重要的公共卫生问题[1]。衣原体现在是CDC报告的最常见应报告的细菌感染，1年有超过6万例[2021]。这些生殖道感染在年轻女性（1-15岁）中大部分最初无症状，但如果未发现和治疗，可能会造成严重的生殖危害[24]。慢性衣原体感染是育龄妇女盆腔炎性疾病、异位妊娠和其他严重生殖并发症的主要原因[2]。不幸的是，目前预防沙眼衣原体感染的工具不包括有效的疫苗[2]。早期尝试开发沙眼衣原体疫苗或活疫苗时遇到了困难，因为临床试验发现一部分接种疫苗的个体的病理结局增加[3]。尽管这些疫苗不良事件的有效性受到质疑[4]，但人们认为全细胞衣原体疫苗可能对健康的年轻人造成生殖危害。了解衣原体病的发病机制和动物模型中的保护性免疫反应应该会发现新的预防方法。

小鼠模型为研究女性生殖道衣原体感染（Chlamydia infection of the female reproductive tract， FRT）的免疫反应提供了极好的机会[6\u8]。事实上，在小鼠生殖道中已经检测到疫苗介导的保护和某些免疫抑制因素[9]，这为该动物模型准确再现人类的临床观察结果提供了信心。鼠尾衣原体小鼠宫颈阴道感染引发上皮细胞上行生殖道感染[10]，引起与人类沙眼衣原体感染相似的严重病理[2,11]。在过去的几十年里，这种小鼠模型已被用于揭示对衣原体生殖器感染的基本免疫力的各个方面。

CD4 T细胞是FRT内宿主对衣原体免疫应答的关键组成部分，尽管B细胞也有助于保护[12,13]。SCID和RAG缺陷小鼠发生致死性播散性感染，而TCRα缺陷小鼠和MHC II类缺陷小鼠均不能解决FRT的原发性衣原体感染[14–18]。与此形成鲜明对比的是，缺乏B细胞或CD8 T细胞的小鼠可解决原发性衣原体感染，但缺乏B细胞的小鼠会出现在野生型小鼠中未检测到的短暂性全身感染[19]。虽然CD4 T细胞辅助活性似乎是衣原体免疫的基础，但要确定体内负责细菌杀伤的效应模块极为困难。活化的 CD4 T 细胞通常被认为会产生有限范围的效应反应，这些效应反应由基本效应模块（Th1/Th2/Th17、Tfh、Treg）总结。这些模块中的每一个都表达独特的效应分子，允许先天细胞协调以对抗不同类别的病原体[20]。为了介导对病原菌的免疫力，关键的效应模块包括Th1细胞，用于对抗巨噬细胞液泡内生长的细菌，以及Th17细胞，用于根除细胞外细菌。Th1细胞通常由主转录因子T-bet的表达以及IFN-γ的分泌来定义，IFN-是一种激活巨噬细胞以增加细胞内杀伤的关键细胞因子[21,22]。相比之下，Th17细胞由RORγt表达定义，并分泌IL-17，IL-23是一种细胞因子，可启动中性粒细胞募集，从而吞噬细胞外细菌[25\u1]。Th17和Th2细胞对抗细菌感染，而Th3细胞表达GATA26并分泌细胞因子，这些细胞因子可以协调肥大细胞和嗜酸性粒细胞对蠕虫的防御[<>]。尽管这种简单的 T 辅助框架可以基本了解宿主对许多病原体的反应，但 FRT 中负责衣原体杀伤的确切模块一直难以识别。

人衣原体感染中的CD4 T细胞分泌显著水平的IFN-γ[27,28]。同样，从衣原体感染小鼠的FRT中回收的CD4 T细胞分泌IFN-γ[19]，而遗传缺陷IFN-γ或IFN-γR的小鼠则遭受压倒性的全身感染[29,30]。因此，CD4 T细胞和IFN-γ的产生都是衣原体免疫的重要组成部分，因此人们很容易将衣原体宿主防御归因于Th1细胞的活性[11,31–33]。然而，CD4 Th1细胞产生IFN-γ介导衣原体防御的观点并未得到实验数据的证实。首先，一些研究小组注意到，IFN-γ由衣原体感染的FRT中的多种先天淋巴细胞分泌[34,35]。因此，缺乏IFN-γ或IFN-γR的小鼠的极端易感性可能是由于非CD4 T细胞产生IFN-γ。此外，我们实验室最近的研究表明，衣原体特异性CD4 T细胞表达低水平的Th1转录因子T-bet，缺乏T-bet表达的小鼠正常消退感染[30]。总之，这些数据表明，虽然IFN-γ是衣原体免疫的必要组成部分，但FRT保护不是由经典Th1细胞介导的。

在目前的研究中，我们重新检查了 Th2 和 Th17 细胞在衣原体免疫中的作用，并研究了 FRT 中 Th1 和 Th17 细胞的贡献是否存在冗余。我们的数据消除了对Th2细胞的需求，但揭示了Th17细胞在加速细菌清除中的重要作用。此外，我们发现 IL-12p40 和非造血细胞对 IFN-γ 的感知对于衣原体清除至关重要，而 CD4 T 细胞产生 IFN-γ 是不需要的。Th1 和 Th17 反应之间的补偿不足以解释 CD4 T 细胞在衣原体清除中的保护作用。总之，我们的数据表明，IL-12p40依赖性保护性CD4模块的出现是为了对抗衣原体感染，这与描述良好的Th1和Th17效应子不同。

结果

Th2细胞缺陷的小鼠清除衣原体感染与野生型小鼠相似

人们一致认为，CD4介导的FRT衣原体免疫是由Th1细胞介导的[11,31–33]，Th36细胞通常由T-bet和IFN-γ的表达来定义[4]。然而，我们最近报道了CD30 T细胞缺乏T-bet的小鼠，或完全缺乏T-bet的小鼠，都可以解决衣原体FRT感染，类似于野生型对照[4]，这表明其他CD2效应模块的参与。先前的一项研究报道了衣原体感染患者的Th37样反应[2]，提高了2型反应参与细菌清除的可能性。事实上，在小鼠模型中，Th13反应与对病理的保护相关，而IL-38与清除率和感染易感性相关[40\u3]。虽然转录因子GATA2调节Th3发育，但Gata6无效突变小鼠在胚胎期是致命的，因此我们研究了缺乏Th2发育的STAT41缺陷小鼠的衣原体感染[42,6]。衣原体感染的STAT1缺陷小鼠从FRT中脱落细菌，其动力学与野生型小鼠相似（图6A）。此外，在STAT1缺陷和野生型小鼠中，FRT的细菌清除动力学相似，无论是表示为从阴道拭子中分离的IFU，还是在任何给定时间培养阳性小鼠的百分比（图1A和2B）。总之，这些数据表明，Th57 发育不是受感染的 C6BL/<> 小鼠 FRT 衣原体清除的关键组成部分。

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图 1. STAT6缺陷的小鼠在衣原体清除率方面没有表现出任何缺陷。

（A） 感染后不同时间点从阴道拭子中分离出的IFU。对于野生型小鼠 n = 10，STAT6 缺陷小鼠 n = 10，MHC II 类缺陷小鼠 n = 5。合并了两个实验的数据，其中一个实验中包括 MHC II 类缺陷组。图表显示为 SEM ±平均值。 野生型组与 STAT6 缺陷组无显著差异。对于野生型与MHC II类缺陷组，第0-05天p<9.45。对于 STAT6 缺陷组与 MHC II 类缺陷组，第 0-05 天 p<7.45（混合效应分析）。虚线表示检测限。（B） 来自 A 的数据表示为阴道拭子培养阳性的小鼠百分比。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011914.g001

衣原体特异性 CD4 T 细胞在 T-bet 缺陷小鼠中转变为 Th17 特征

衣原体感染小鼠的FRT中的大多数CD4 T细胞分泌高水平的IFN-γ但与沙门氏菌感染小鼠的经典Th1反应相比，T-bet表达异常低的水平（图2B和2C，以及S1中所示的流动门控）。事实上，CD4 T 细胞中 T-bet 在 FRT 和引流髂淋巴结 （ILN） 中的表达较低，但在 FRT 中 IFN-γ 分泌特别高（图 2B 和 2C）。Th17细胞（RORγt和IL-17A）在衣原体感染的C4BL / 57小鼠中占CD6 T细胞群的一小部分（图2D和2E）。然而，与野生型小鼠相比，从T-bet缺陷小鼠的FRT中分离的CD4 T细胞在细胞因子产生方面表现出显着差异。具体来说，在缺乏T-bet的小鼠中，产生CD4 T细胞的IFN-γ的比例下降到野生型小鼠中检测到的不到三分之一（图2B和2C），而RORγt和IL-17A的表达从FRT的不到5%增加到约60%和ILN的40%（图2D和2E）。因此，尽管野生型小鼠和T-bet缺陷小鼠之间的细菌脱落没有可检测到的差异[30]，但在没有T-bet的情况下观察到Th17型发育的显着增加。应该注意的是，Th17细胞反应的这种扩增与T-bet缺陷小鼠的病理增强无关[30]。

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图 2. T-bet缺陷小鼠表现出向Th17反应的显着转变。

从 FRT 和 ILN 中分离的淋巴细胞用 PMA 刺激，离子霉素用 Brefeldin A 刺激，然后染色用于流式细胞术。结果在 CD4+ CD44hi 细胞上设门。（A） 从 FRT 和 ILN 中分离出的活化 CD4 T 细胞总数的百分比和数量。（B） Th1 标志物 T-bet 和 IFN-γ 的表达。（C） B. （D） 显示 Th17 标志物 RORγt 和 IL-17A 表达的流式细胞术图。（E） D的汇总图。所有图形均显示为平均值±标差。 数据代表两个实验。

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缺乏IL-12p40的小鼠在衣原体清除方面存在明显缺陷

鉴于在没有 T-bet 的情况下 Th17 细胞发育增加，我们决定研究 IL-12p40 在衣原体清除中的作用。IL-12p40是Th1和Th17相关细胞因子IL-12和IL-23的组成部分，这意味着IL-12p40缺陷小鼠存在Th1和Th17缺陷[43]。事实上，缺乏IL-12p40的小鼠在衣原体清除方面表现出严重的缺陷，解决FRT感染的能力明显延迟（图3A和3B）。我们还观察到这些小鼠的 FRT 和 ILN 中 CD4 T 细胞的 IFN-γ 容量降低到野生型小鼠的一半左右（S2 图）。p40缺陷小鼠对FRT清除的延迟有些出乎意料，因为先前的一项研究表明，IL-12p40缺陷小鼠没有缺陷可解决衣原体感染[44]。这种差异可能是由于这些研究使用的衣原体菌株的相对致病性差异所致。事实上，当小鼠感染致病性较低的 Nigg 菌株时，我们复制了先前发表的数据显示不需要 IL-12p40，但仍然观察到对 IL-12p40 的明确要求使用源自我们研究中使用的 ATCC 原液（S3A 和 S3B）的致病性更强的菌株。

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图 3. IL-12p40缺陷小鼠在FRT中表现出衣原体清除的严重延迟。

（A） 感染后不同时间点从阴道拭子中分离出的IFU。n = 4 对于所有组。图形显示为 SEM ±平均值。对于野生型与IL-12p40-/-组，第0天和第05-3天的p<15.36。对于野生型与MHC II类缺陷组，第0天和第05-9天p<15.80。对于 IL12p40-/- 与 MHC II 类缺陷组，第 0-05 天的 p<27.80（混合效应模型）。（B） 来自 A 的数据表示为阴道拭子培养阳性的小鼠百分比。数据代表了两个实验。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011914.g003

缺乏Th17反应的小鼠表现出解决衣原体感染的能力受损

由于Th17细胞是T-bet缺陷小鼠中主要的CD4 T细胞反应，我们检查了该效应子集是否参与细菌清除。RORγt无效小鼠的淋巴结和T细胞发育受损，降低了其检查外周Th17缺乏症的效用[45,46]。然而，RORγt突变小鼠（RORγtM）具有两个氨基酸突变，可促进淋巴结和T细胞发育，但阻碍Th17反应的发展[47]。当这些小鼠感染衣原体时，与野生型小鼠相比，它们在细菌清除方面表现出显着延迟（图4A和4B）。然而，RORγt突变小鼠最终从FRT中清除了衣原体，表明非Th17效应机制也参与了衣原体感染的消退。总之，这些数据表明，在没有 T-bet 的情况下出现的 Th17 反应是有效清除 FRT 中衣原体所必需的。

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图 4. RORγt突变小鼠的衣原体清除延迟。

（A） 感染后不同时间点从阴道拭子中分离出的IFU。对于野生型小鼠 n = 10，RORγt 突变体 （RORγtM）小鼠n = 10，MHC II-/-类小鼠n = 5。数据来自两个实验，MHC II-/-组被纳入一个实验。图形显示为 SEM ±平均值。对于野生型与 RORγtM组，第 0 天和第 05-9 天的 p<16.25。对于野生型与MHC II类缺陷组，第0-05天和第7-11天p<16.39。对于 RORγtM与MHC II类缺陷组相比，第0、05和11-19天p<25.39（2因素方差分析）。（B） 来自 A 的数据表示为阴道拭子培养阳性的小鼠百分比。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011914.g004

为了更详细地研究这种效应机制，我们比较了 RORγt 突变小鼠和野生型小鼠的 FRT 中对衣原体的反应。RORγt突变小鼠ILN中活化的CD4 T细胞数量略有减少，但这不影响FRT中CD4 T细胞的总数（图4A）。在RORγt突变型和野生型小鼠的FRT和ILN中，表达IFN-γ的CD5 T细胞比例相似（图4B和5C）。正如预期的那样，在野生型小鼠的FRT中检测到的产生IL-5A的CD17 T细胞的低水平在RORγt突变小鼠中进一步减少（图4D和5E）。总体而言，这些数据表明，与野生型小鼠相比，RORγt突变小鼠在CD5发育方面表现出适度的差异。鉴于野生型和RORγt突变小鼠中CD4效应子反应之间细胞因子产生的这些微小差异，我们使用转录分析来更深入地了解。我们使用批量 RNA-seq 在感染后 4 天从野生型和 RORγt 突变小鼠的 FRT 中分离的 CD4 T 细胞中的整体基因特征。此时，野生型小鼠已成功清除衣原体感染，而RORγt突变小鼠保留了较高的细菌脱落率（图17）。野生型和RORγt突变型CD4 T细胞之间的前4个差异表达基因如表1所示。只有三个基因 Il1r1、Il17re 和 Ramp1 将 p 值调整到 0.05 以下，进一步表明这些 CD4 反应保持相似。 由于 Il22 与 Il0r087 和 Il1re 一起排名第四（p 值为 1.17），我们的转录数据支持我们的流式细胞术发现，即 RORγt 突变型 CD4 T 细胞具有较低的 Th17 反应。总体而言，这些数据表明，Th17细胞对于FRT中的有效细菌清除至关重要，尽管它们仅占CD4 T细胞对衣原体的整体反应的一小部分。

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图 5. 来自 RORγt 突变小鼠的 CD4 T 细胞具有与野生型小鼠相似的 Th1 和 Th17 标志物表达模式。

从 FRT 和 ILN 中分离的淋巴细胞用 PMA 刺激，离子霉素用 Brefeldin A 刺激，然后染色用于流式细胞术。结果在 CD4+ CD44hi 细胞上设门。（A） 从 FRT 和 ILN 中分离出的活化 CD4 T 细胞总数的百分比和数量。（B） Th1 标志物 T-bet 和 IFN-γ 的表达。（C） B. （D） Th17 标志物 RORγt 和 IL-17A 表达的流式细胞术。（E） D的汇总图。所有图形均显示为平均值±标差。 数据代表两个实验。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011914.g005

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表 1. 来自ROR?t突变小鼠FRT的CD4 T细胞上的批量RNA-seq与野生型小鼠几乎没有差异。

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同时阻断 Th1 和 Th17 通路并不能阻止细菌清除

虽然Th17细胞是衣原体感染快速消退所必需的（图4），但我们的数据还表明，衣原体的完全清除发生在缺乏三种常见CD4模块（Th1，Th2和Th17）之一的小鼠中。鉴于野生型小鼠中 CD4 T 细胞产生高水平的 IFN-γ、T-bet 缺陷小鼠的代偿性 IL-17 反应以及 IL-12p40 缺陷小鼠中观察到的清除严重延迟，我们假设 Th1 样和 Th17 样细胞提供重叠保护，任何一种反应都足以清除细菌。为了研究这种可能性，我们使用两种方法来限制受感染小鼠的Th1和Th17程序。首先，我们使用针对 IL-6 和 TGF-β 的中和抗体来抑制 T-bet 缺陷小鼠的 Th17 发育，同时对对照小鼠施用同型抗体。野生型或T-bet缺陷小鼠均未给予IL-6/TGF-β耗竭抗体，显示出FRT细菌清除延迟的证据（图6A和6B）。因此，Th1/Th17 反应的减少不足以阻止衣原体从 FRT 中清除。作为一种补充方法，我们将RORγt突变小鼠回交到T-bet缺陷背景中，以产生具有Th1和Th17缺陷的小鼠。流式细胞术分析证实，与T-bet缺陷小鼠相比，这些小鼠的IL-17A产量急剧减少，尽管并未完全消除（S2图）。同样，这些双重缺陷小鼠的细菌清除率与C57BL / 6小鼠没有显着偏离，其中细菌负荷在感染的第二周开始减少（图6C）。然而，在感染的第三周，即第 24 天（图 6D）的后期，清除细菌出现了延迟，这与我们的发现一致，即快速消退需要 Th17 细胞。总之，这些数据无法支持Th1和Th17反应在衣原体清除过程中可以互换补偿的模型。需要注意的是，鉴于细菌清除对IL-12p40的明确要求，这一结果令人惊讶（图3）。

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图 6. 耗竭 Th1 和 Th17 细胞不会影响衣原体的 FRT 清除。

（A 和 C）在感染后的不同时间点从阴道拭子中分离出的IFU。图表显示为SEM±平均值。 （B 和 D） 来自 A 和 C 的数据表示为阴道拭子培养阳性小鼠的百分比。（A 和 B）野生型或T-bet-/-小鼠给予IL-6和TGF-β同型或耗竭抗体。（C 和 D）T-bet-/-小鼠与RORγt突变小鼠育种并感染衣原体。（A） 同型处理组 n = 3，抗体处理组 n = 4。除了野生型同种型与T-bet-/-同种型的第18天和T-bet-/-同种型与T-bet-/-抗IL-18抗TGF-β的第6天（2因素方差分析）外，所有时间点和比较均无显著差异。（B）合并了两个实验的数据。n = 7 表示野生型，n = 6 表示 T-bet-/- x RORγtM.第 0-05 天和第 9 天的 p<12.24（混合效应分析）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011914.g006

IFN-γ的非造血细胞感应对衣原体清除至关重要

我们的实验室和其他实验室的研究表明，IFN-γ和IFN-γ-R缺陷小鼠在解决衣原体感染方面表现出严重缺陷，并可能发展为播散性感染，通常被证明是致命的[29,30,34]。鉴于这些感染的全身性，我们假设衣原体生长在吞噬细胞中，需要IFN-γ信号传导来控制细菌生长，类似于沙门氏菌免疫模型[48]。另一种假设是，FRT上皮细胞而不是吞噬细胞需要IFN-γ信号来限制局部FRT感染，从而减少细菌全身传播的可能性。这些模型并不相互排斥，而是提出了两种不同的机制来解释IFN γ介导的播散性感染控制。为了研究这个问题，我们生成了骨髓嵌合小鼠，其中造血细胞或非造血细胞缺乏IFN-γR，并用衣原体感染这些小鼠。正如预期的那样，用野生型骨髓重建的野生型小鼠保持了正常的体重（图7A，左），没有明显的全身性疾病迹象（图7B），全身性细菌水平低（图7C），并解决了FRT衣原体感染（图7D）。相比之下，用IFN-γR缺陷骨髓重建的IFN-γR缺陷小鼠体重显着减轻（图7A，左），最终死于与IFN-γ缺陷对照组相似的动力学感染（图7B），脾脏，肺和肾脏中有细菌（图7C），并且FRT感染的消退延迟（图7D).有趣的是，用IFN-γ受体缺陷骨髓重建的野生型小鼠没有减轻体重（图7A，右），表现出疾病迹象或显示全身感染的证据（图7B和7C），并控制了FRT内的细菌生长（图7D）。因此，衣原体感染的消退不需要骨髓来源的细胞感应IFN-γ。与此形成鲜明对比的是，用野生型骨髓重建的IFN-γ受体缺陷小鼠体重减轻、早期死亡和全身播散（图7A右、7B和7C），清楚地表明非造血细胞的IFN-γ信号传导对于衣原体清除至关重要。

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图 7. 骨髓嵌合体小鼠需要受体宿主组织表达IFN-γ受体，但不需要供体骨髓细胞来控制全身性衣原体感染。

45组骨髓嵌合体小鼠分别：将CD1.45野生型骨髓转入CD2.45野生型受体（WT→WT），将CD1.45野生型骨髓转入CD2.1 IFNγR1-/-受体（WT→IFNγ R45-/-），将CD2.1 IFNγR45-/-骨髓转入CD1.1野生型受体（IFNγ R45-/-→WT），将CD2.1 IFNγR45-/-骨髓转入CD2.1 IFNγR1-/-受体（IFNγ R1-/-→IFNγ R21-/-）。这些组与另外一组未经操作的IFNγ-/-小鼠同步和感染。在实验过程中监测每只小鼠的体重，如果小鼠的体重低于起始值的80%或病情变得过于严重，则在感染后第21天之前对小鼠实施安乐死。所有剩余的小鼠在第1天被安乐死。安乐死后，收集脾脏、肺和肾脏用于计算衣原体负担。（A） 图表显示了每只鼠标随时间推移的起始重量百分比± SD.为了便于阅读，对照组和实验组显示在单独的图中。WT→WT与IFNγ R1-/-→WT无显著差异。对于WT→WT与WT→IFNγ R0-/-，第05天和第11-14天的p<20.1。对于WT→WT与IFNγ R1-/-→IFNγ R0-/-，第05、6-10和11-16天p<21.0。对于WT→WT与IFNγ-/-，第05-12天和第19天p<21.1。对于WT→IFNγ R1-/-与IFNγ R0-/-→WT相比，第05、11、14和17-20天的p<21.1（混合效应分析）。（B）生存曲线。通过Bonferroni校正进行多重比较，WT→WT与IFNγ R1-/-→WT没有显著差异，而与WT→WT相比，所有其他组均有显著差异。（C） 安乐死时在每个器官中测量的细菌载量± SD（1 因素方差分析）。（D） 在感染过程中从阴道拭子中分离出的 IFU ± SEM。对于WT→WT与IFNγ R0-/-→WT的比较，第05天p<15.1。对于WT→WT与WT→IFNγ R0-/-，第05-9天p<21.1。对于WT→WT与IFNγ R1-/-→IFNγ R0-/-，第05-9天p<18.0。对于WT→WT与IFNγ-/-，第05-12天p<21.9（混合效应分析）。合并了两个实验的数据，WT→WT的总n为7，WT→IFNγ R1-/-为5，IFNγ R1-/-→WT为10，IFNγ R1-/-→IFNγ R1-/-为8，IFNγ-/-为<>。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011914.g007

衣原体清除不需要 IFN-γ 的 CD4 T 细胞表达

如上所述，既往研究表明，CD4 T细胞和IFN-γ都是宿主对衣原体免疫的重要组成部分[29,30,34,35]。通常认为，这些数据支持衣原体防御中产生IFN γ的CD4 Th1细胞[11,31–33]，但这一假设尚未得到直接检验。为了研究这个问题，我们利用Cre/lox系统（CD4-Cre/IFN-γ-flox/flox）[49]来探索CD4 T细胞分泌IFN-γ是否是FRT内衣原体清除所必需的。我们用这些小鼠产生骨髓嵌合体，其中T细胞缺乏IFN-γ。正如预期的那样，与不表达Cre的小鼠相比，来自CD4-Cre/IFN-γ-flox/flox骨髓的野生型小鼠的活化CD4 T细胞显著降低了IFN-γ的产生（图8A）。尽管存在这种缺陷，CD4-Cre/IFN-γ-flox/flox 嵌合体与非 Cre 表达嵌合体相似地解决了衣原体感染（图 8B 和 8C），并且没有发生全身细菌感染，因为在第 21 天在小鼠的脾脏、肺或肾脏中没有检测到细菌（每组 n = 5），表明来自 CD4 T 细胞的 IFN-γ不是 FRT 中衣原体免疫的重要组成部分。

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图 8. CD4 T 细胞来源的 IFN-γ 不是 FRT 中细菌清除所必需的。

生成两组骨髓嵌合小鼠：CD4-Cre+ IFN-γ floxed 骨髓转移到 CD45.1 受体 （Cre+， n = 11） 和 IFN-γ floxed 骨髓转移到 CD45.1 受体 （Cre-， n = 10）。小鼠在感染前同步并称重。第21天对每组4只小鼠实施安乐死，采集脾脏、肺和肾脏以计数衣原体负荷，并采集FRT以评估CD21 T细胞中IFN-γ表达。定期从所有小鼠身上采集阴道拭子，直到第21天，并在第21天之后的剩余小鼠中采集阴道拭子。四只Cre +小鼠在第24天和实验结束（第27、31、40和4天）之间死亡。（A） FRT CD4+ T 细胞中 IFN-γ 的表达。 结果在 CD44+ CD0hi 细胞上设门。（B）每只小鼠随时间推移的起始重量百分比±SD.组在第05-19天显着不同（p<21.<>）（混合效应分析）。（C） 在感染过程中从阴道拭子中分离出的 IFU ± SEM。 两组之间没有显著差异（混合效应分析）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011914.g008

讨论

衣原体感染通常被描述为Th1病，这意味着保护性Th1细胞产生IFN-γ以限制女性生殖道上皮中的衣原体生长[11,31–33]。尽管这是一个合理的假设，但鉴于CD4 T细胞和IFN-γ在解决原发性感染方面的基本性质，它尚未经过严格的测试。在这里，我们表明，缺乏分泌IFN-γ能力的CD4 T细胞的小鼠仍能解决FRT的衣原体感染。这一结果与我们之前的报告非常吻合，该报告显示，在小鼠模型中，T-bet表达不是解决衣原体感染所必需的[30]。Mercado等人的实验进一步支持了这一点。研究表明，将IFN-γ缺陷的CD4 T细胞转移到TCRβ缺陷小鼠中足以控制FRT感染并保护小鼠免受致命感染[34]。因此，CD1 T 细胞的 Th4 谱系发育和 IFN-γ 的产生都不是 FRT 中衣原体免疫的重要组成部分。 总之，这些数据为重新评估衣原体感染中的 CD4 效应免疫提供了令人信服的理由。然而，需要注意的是，这个结果与C的小鼠模型不同。沙眼感染，其中CD4 T细胞产生IFN-γ似乎是必不可少的[50]，这可能是由于C之间病原体对不同宿主的适应性存在差异。muridarum 和 C.沙眼。

重要的是，我们的数据仍然支持IFN-γ是全身细菌清除的重要因素。事实上，缺乏IFN-γ或IFN-γR的小鼠无法解决衣原体，并迅速屈服于播散性感染。然而，需要IFN-γ反应性的细胞是非造血细胞，而免疫细胞不需要IFN-γR。这有点出乎意料，因为体外研究表明，除非被IFN-γ激活，否则衣原体具有感染巨噬细胞并在巨噬细胞内存活的能力[51,52]。从形式上讲，FRT中的一些宿主免疫细胞可能对辐射具有抵抗力，并为细菌生长提供了生态位。然而，对我们数据的最简单解释支持一种模型，即感染的上皮细胞需要先天细胞产生的IFN-γ，如前所述[34,35]。未来的Cre/flox研究应该能够确定在FRT中产生IFN-γ所需的细胞。目前尚不清楚非造血细胞对IFN-γ的感知如何导致衣原体在FRT内的遏制，但一种可能性是传播本身通过非造血细胞（如内皮细胞）发生。迄今为止，衣原体所占据的全身性细胞生态位尚未得到仔细描述，尤其是在继发感染部位。最近的研究表明，野生型小鼠胃肠道的衣原体感染，CD4 T细胞的IFN-γ清除了小肠的衣原体，但不能清除大肠的衣原体[53]。需要更多的工作来了解 CD4 衍生的 IFN-γ 在限制肠道内复制和其他这些播散感染部位的作用。

尽管对多种转录因子和细胞因子进行了检查，但衣原体免疫中 CD4 效应模块的确切性质仍然难以捉摸。从我们的研究中，似乎很明显Th1和Th2细胞在衣原体免疫中都不起专性作用。因此，缺乏 T-bet、STAT6 或 CD4 衍生的 IFN-γ 的小鼠可以完全解决 FRT 中的衣原体感染。然而，有趣的是，具有Th17缺陷的小鼠在细菌清除方面表现出一致的延迟。鉴于野生型小鼠FRT中Th17细胞的百分比较低，这一结果有些出乎意料，但可能表明Th17细胞在协调中性粒细胞流入吞噬性衣原体中的关键作用。另一种可能性是IL-22分泌是上皮活化的重要介质，目前正在进行实验以测试这种可能性。当野生型小鼠被施用中和抗IL-6和抗TGF-β以防止Th17发展时，在RORγt突变小鼠中观察到的脱落延迟没有复制，这可能是由于Th17程序的不完全阻断。在比较来自感染野生型和RORγt突变小鼠的CD4 T细胞之间的mRNA表达时，两个具有显着调整p值的基因是Il1r1和Il17re。Il1r1已被证明直接受RORγt调控[54]，证实了该模型中的突变直接影响该调控通路。Il17re是IL-17C受体的一部分，IL-1C由上皮细胞产生，也可被IL-55刺激[56]。类似于 C 的小鼠模型。啮齿动物感染[17]，IL-1C可能是衣原体感染FRT上皮细胞的早期信号。有趣的是，另一个差异表达的基因是Ramp57，它编码一种受体活性修饰蛋白，已知该蛋白可调节多种G蛋白偶联受体（包括趋化因子受体）的信号传导和转运[58,1]。RAMP1可以在T细胞中表达，RAMP59缺陷会改变T细胞的运输模式[1]。此外，RAMP17缺乏与Th17功能抑制和IL-60生成有关[1]。因此，RORγt 突变小鼠中较低的 RAMP-4 表达可能会阻碍反应性衣原体特异性 CD17 T 细胞定位于 FRT，或者可能仅与有助于细菌清除的较低 Th<> 型效应器功能有关。

这项研究的一个有趣的结果是，在IL-12p40缺陷小鼠中发现的严重缺陷解决了衣原体感染。这很有趣，因为与先前的报道明显脱节，该报道显示p40不是衣原体免疫的重要组成部分[44]。事实上，我们证实，p40缺陷小鼠的这种主要缺陷取决于用于实验研究的衣原体菌株。这开辟了一种可能性，即由于感染低致病性菌株的小鼠，衣原体免疫的其他方面也被低估了。这一结果也很有趣，因为它揭示了由于缺乏通常驱动 Th1 或 Th17 反应的细胞因子而导致的主要缺陷，但 Th1/Th17 亚群中的单独或联合缺陷不会产生相同的结果。我们得出结论，IL-12p40 在衣原体免疫中起着关键作用，但目前对 CD4 亚群极化的理解并不能完全解释 CD4 介导的衣原体清除。在这一点上，任何依赖 p40 但 Th1/Th17 非依赖性衣原体清除的模型都是推测性的。然而，令人感兴趣的是，IL-12R 下游的转录网络并不总是线性的，并且可能发生不依赖 T-bet 的 STAT4 激活。事实上，Th1样细胞中某些基因的转录激活是STAT4依赖性的，但与T-bet表达无关[61]。目前正在进行研究，以评估 CD4 T 细胞中 STAT4 的表达是否是衣原体免疫所必需的，与 T-bet 无关，以及其中一些 STAT4 脱肽基因是否调节独立于 IFN-γ 产生的额外效应通路。

总之，我们的数据表明，普遍接受的产生 IFN-γ 的 CD1 T 细胞是 FRT 中衣原体清除所必需的 Th4 范式没有得到实验证据的支持。相反，我们提出衣原体特异性CD4 T细胞产生IL-12p40依赖性效应模块，该模块与目前接受的Th1，Th2或Th17亚群不同，但该模块导致粘膜上皮的强大防御。虽然 IFN-γ 仍然是这种 CD4 介导的防御的重要贡献者，但它来源于先天免疫细胞，被 FRT 内外的非免疫细胞感知，并且主要起到预防全身感染的作用。IFN-γ似乎可能诱导MHC II类的上皮表达，从而允许通过细胞毒性CD4 T细胞或其他效应模块对上皮层进行主动监测。未来针对衣原体感染的疫苗工作应避免将重点放在诱导衣原体特异性Th1或Th17细胞上，因为允许从上皮细胞中消除衣原体的适当模块是一种独特的CD4 T细胞成熟途径，仍有待确定。

材料与方法

道德声明

本研究严格按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。加州大学戴维斯分校获得了实验动物护理评估和认证协会 （AAALAC） 的认可。所有动物实验均获得加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（协议编号21869）。

小 鼠

C57BL/6（JAX 库存号 000664）、STAT6 缺陷（JAX 库存号 005977）、Tbx21 缺陷（JAX 库存 004648）、IL-12p40 缺陷（JAX 库存 002693）、ROR?t 突变体（JAX 库存 031393）[62]、IFN-γ R1 缺陷（JAX 库存 003288）、CD45.1（JAX 002014）、IFN-γ 缺陷（JAX 002287）、MHC II 类缺陷（JAX 003584）和 CD4-Cre（JAX 017336）小鼠在 6-8 周龄时从杰克逊实验室（巴港， ME），并在 7-12 周龄时用于实验。IFN-γ floxed 小鼠是从爱荷华大学的 Harty 博士那里获得的。对于其中许多菌株，建立了繁殖菌落以提供实验。小鼠根据加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会的规定进行处理和使用。

衣原体感染

感染前一周，给予小鼠2.5mg Depo-Provera（醋酸甲羟孕酮，辉瑞）皮下注射，体积为0.1mL。小鼠接受 1x105在 5μL SPG 缓冲液中阴道内对 Chlamydia muridarum 进行 IFU。用于所有实验的菌株均来自ATCC原液，除非另有说明为Nigg。

沙门氏菌感染

感染鼠伤寒沙门氏菌菌株BMM50（SL1344 ΔaroA）的小鼠接受5x105CFU 静脉注射将原液细菌悬浮液划到MacConkey琼脂上，从中使用一个菌落接种Luria-Bertani肉汤的过夜培养物。该培养物用于制备感染悬浮液，稀释到 1X PBS 中，总进样体积为 0.2mL。

计算衣原体负荷

为了监测衣原体的阴道脱落，取阴道拭子并将其放入含有 2μL SPG 缓冲液和两个玻璃珠的 500mL 微量离心管中。将试管在 1400°C 下以 5rpm 振荡 4 分钟，随后丢弃拭子。将样品在-80°C下冷冻，直至用于计数方案。为了确定从感染小鼠中获取的器官脾脏、肺和肾脏中的 IFU 负荷，将器官在 2mL SPG 中匀浆。将1mL转移至装有两个玻璃珠的2mL微量离心管中，样品以1400rpm和4°C振荡5min。为了去除悬浮液中的碎屑，将样品在500g和4°C下离心10min，除去上清液并在-80°C下冷冻。 为了对细菌进行计数，将样品稀释在一系列用于感染 96 孔板中的单层 HeLa 细胞中。将这些培养成内含物过夜，然后固定和染色，然后计数以计算每个拭子的IFU。

流式细胞术

为了从淋巴结中分离淋巴细胞，使用磨砂载玻片分解淋巴结并洗涤含有 2% 胎牛血清的愿望 PBS。为了从女性生殖道中分离淋巴细胞，将FRT收获成完全RPMI，然后切碎成小块，并与胶原酶IV（386mg / L MP Biomedicals）在1°C下孵育37小时。 将所得悬浮液过滤（70μm细胞过滤器，Corning）并在Percoll梯度上分离淋巴细胞（GE Healthcare）。对于细胞内染色，在刺激条件下用PMA（0.2 mM，Millipore Sigma）和离子霉素（1μg/mL，Millipore Sigma）以及Brefeldin A（71.4μM Millipore）在3°C 5%CO下培养细胞37.5小时2.首先使用僵尸黄（BioLegend）进行活力染色，然后对表面标记物进行染色，包括B220-APC-eF780（RA3-6B2，eBioscience）、CD11b-APC-eF780（M1/70，eBioscience）、CD11c-APC-eF780（N418，eBioscience）、F4/80-APC-eF780（BMB，eBioscience）、CD4-PE（RM4-4，eBioscience）、CD4-eF450（RM4-5，eBioscience）、CD8-PerCPCy5.5（2.43，Tonbo）、CD44-APC（IM7，eBioscience）和CD62L-PETexasRed（MEL-14，Invitrogen）。然后将细胞内染色剂IFN-γ-BV785（XMG1.2，BioLegend）、T-bet-PECy7（4B10，eBioscience）、RORγt-BV421（Q31-378，BD Biosciences）和IL-17A-FITC（17B7，eBioscience）与Foxp3转录因子染色试剂盒（eBioscience）一起使用。在 LSRFortessa （BD） 上采集数据，并使用 FlowJo（Tree Star， San Carlos， CA）进行分析。等值线图显示有 5% 的异常值。

批量RNA-seq

与先前的研究一样进行了批量RNA-seq实验[30]。对于每组，通过合并每只单独的小鼠来制备五个样品。如上所述，从FRT中分离淋巴细胞。在 LS 色谱柱上使用阴性 MACS CD4 T 细胞分离试剂盒富集 CD4 T 细胞 （Miltenyi Biotech）。使用活性染色剂僵尸黄 （BioLegend） 和表面标记物 APC-B220 （RA3-6B2， eBioscience）、APC-F4/80 （BM8.1， Tonbo Biosciences）、APC-CD11b （M1/70， Tonbo Biosciences）、APC-CD11c （N418， Tonbo Biosciences， eF450-CD4 （RM4-5， eBioscience） 和 PerCP-Cy5.5-CD8a （53–6.7， eBioscience） 的抗体对这些细胞进行染色以进行后续的 FACS 分选。收集单细胞、活细胞、转储阴性（B220、CD11b、CD11c、F4/80）和CD4+CD8-通过顺序门的事件进行处理，以分离RNA（Qiagen RNeasy Mini Kit）。使用 3'Tag-RNA-Seq 方案进行基因表达谱分析。使用QuantSeq FWD试剂盒（Lexogen，Vienna，Austria）制备条形码测序文库，根据制造商的建议，同时使用UMI第二链合成模块（Lexogen）进行多重测序。在生物分析仪 2100（Agilent，Santa Clara，CA）上通过微毛细管凝胶电泳验证文库的片段大小分布。在Qubit荧光计（LifeTechnologies，Carlsbad，CA）上通过荧光法对文库进行定量，并以等摩尔比合并。在HiSeq 4000测序仪（Illumina，San Diego，CA）上，每个泳道可测序多达100个文库，每个样本的单端读长为4 bp，读长为7-1万个。测序数据和差异基因表达的分析由加州大学戴维斯分校生物信息学核心进行。使用 HTStream v.1.0.4 （https://s38hts.github.io/HTStream/） 处理原始读长，以执行原始序列数据 QA/QC，去除适配器污染和低质量碱基/序列。使用比对器 STAR v. 23.2.7f [0] 将修剪后的读段与具有 GENCODE v.M63 注释的 Mus musculus GRCm64 初级组装基因组进行比对，以生成每个基因的原始计数。使用limma-voom[3]（edgeR版本20.9.3，limma版本34.9.3，R版本4.4.65）进行差异表达分析。limma 中使用的模型包括治疗效果、RNA 提取批次、细胞数量和死亡年龄。肌肉本研究使用了Ensembl基因标识符和注释[66]。原始数据可以通过NCBI的基因表达综合[193909]通过GEO系列登录号GSE<>获得。

体内细胞因子耗竭

给小鼠各给予250μg抗IL-6（MP5-20F3，cat.BE0046，BioXCell）和抗TGF-β（1D11.16.8，货号。BE0057，BioXCell）或同型对照 IgG1 抗辣根过氧化物酶（HRPN，cat.BE0088，BioXCell）和 IgG1 未知特异性（MOPC-21，货号。BE0083，BioXCell）腹膜注射从第 0 天开始，每隔一天一次，持续 6 周。

骨髓嵌合体的产生

在X射线照射器中以800rad照射受体小鼠，并将6mL小儿悬浮樱桃味（NDC 65862-496-47）稀释到250mL水瓶中，给予抗生素。大约 16 小时后，通过用 PBS 中的 2.5% FBS 冲洗股骨、胫骨和肱骨的骨髓，从供体小鼠中获取骨髓。将细胞悬液通过70μm细胞过滤器，并在室温下用ACK裂解缓冲液处理2min裂解红细胞，然后在PBS中进一步加入2.5%FBS停止裂解。用PBS洗涤细胞悬液两次，然后悬浮在PBS中，通过尾静脉注射。接受小鼠接受 6x106供体骨髓细胞总体积为 0.2mL。小鼠服用抗生素6周。为了通过同源标志物评估嵌合体，在第 8 周通过受体小鼠的眶后出血收集血液，如上所述用 ACK 裂解缓冲液裂解红细胞，并对样本进行染色以进行流式细胞术。使用的标记物包括CD8-BV785（53-6.7，BioLegend）、CD4-BV786（RM4-5，BD Biosciences）、CD11b-FITC（M1/70，Tonbo）、CD11c-PECy7（N418，Biolegend）、B220-FITC（RA3-6B2，eBioscience）、CD45.1-PerCPCy5.5（A20，BioLegend）和CD45.2-PE（104，eBioscience）。

统计学

使用GraphPad Prism版本9（GraphPad Software，LLC）进行统计。使用t检验、单因素方差分析、双因素方差分析或混合模型。* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.01 和 **** p<0.0001。

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流式细胞术设门策略示例。

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S1 图。 流式细胞术设门策略示例。

图2中具有代表性的野生型FRT样品的门控示例。细胞依次在淋巴细胞上门控，单细胞，活/死染色阴性，转储阴性（B220，CD11b，CD11c，F4 / 80），CD4 + CD8-，CD44hi CD62L-，然后T-bet与IFN-γ或RORγt与IL-17A。

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S2 图。 T-bet缺陷的X RORγt突变小鼠和IL-12p40缺陷小鼠显示出Th1和Th17标志物模式的改变。

从 FRT 和 ILN 中分离的淋巴细胞用 PMA 刺激，离子霉素用 Brefeldin A 刺激，然后染色用于流式细胞术。结果在 CD4+ CD44hi 细胞上设门。除RORγt突变体ILN外，所有组均为n = 3，其中n = 2，因为ILN无法在一只小鼠中恢复。A） Th1 标志物 T-bet 和 IFN-γ 的表达。B） Th17 标志物 RORγt 和 IL-17A 的表达。C 和 D） A 和 B 的汇总图。 E） CD44hi CD4 T 细胞总数的百分比和数量。所有图形均显示为平均值±标差。 数据代表两个实验。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011914.s002

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S3 图。 IL-12p40缺陷小鼠清除的严重延迟取决于所使用的衣原体菌株，尽管MHC II类缺陷小鼠现在确实显示出反应的差异。

A） 野生型或 IL-12p40 缺陷小鼠感染了源自 ATCC 原液或 Nigg 菌株的衣原体。在感染过程中，从阴道拭子中计数IFU。两个野生型组均为 n = 3，IL-3p12KO-ATCC 为 n = 40，IL-2p12KO-Nigg 为 n = 40。野生型ATCC与IL12p40KO-ATCC在第0-05天的p<18.27。对于野生型 ATCC 与 IL12p40KO-Nigg 相比，第 0 天的 p<05.3。IL12p40KO-ATCC 与野生型黑鬼在第 0、05 和 3-12 天的 p<22.27 比较。IL12p40KO-ATCC与IL12p40KO-Nigg相比，第0-05天p<3.6，第0天p=07.30，第0天p=06.35。对于野生型 Nigg 与 IL12p40KO-Nigg，第 0 天 p<05.3。野生型-ATCC与野生型-Nigg不显著（混合效应分析）。B） 野生型或 MHC II 类缺陷小鼠感染了源自 ATCC 原液或 Nigg 菌株的衣原体。在感染过程中，从阴道拭子中计数IFU。野生型 ATCC 为 n = 2，MHCIIKO ATCC 为 n = 4，野生型 Nigg 为 n = 3，MHCIIKO Nigg 为 n = 4。野生型ATCC与野生型黑鬼、MHCII KO-ATCC与MHCII KO-Nigg、野生型ATCC与MHCII KO-Nigg无显著差异。对于野生型 ATCC 与 MHCII KO-ATCC 相比，第 0 天和第 05 天的 p<22.34。对于 MHCII KO-ATCC 与野生型黑鬼，第 0、05 和 16 天的 p<22.34。对于野生型 Nigg 与 MHCII KO-Nigg，第 0-05 天的 p<9.19（2 因素方差分析）。图形显示为 SEM ±平均值。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011914.s003

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确认

我们要感谢以下人员和团体对这项工作的帮助。IFN-γ的floxed小鼠由爱荷华大学的John Harty博士与我们分享。北卡罗来纳大学的 Toni Darville 博士与我们分享了 Chlamydia muridarum 菌株 Nigg。加州大学戴维斯分校的DNA技术和生物信息学核心协助了bulk-RNA-seq实验的测序和数据处理。中佛罗里达大学的 Kai McKinstry 博士为我们提供了阻断 Th17 发育的消耗性抗体方案。

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