《免费医学论文发表-致病性和非致病性溶组织内阿米巴克隆之间差异表达的基因通过多种机制影响致病性相关表型》期刊简介
免费医学论文发表-致病性和非致病性溶组织内阿米巴克隆之间差异表达的基因通过多种机制影响致病性相关表型
抽象
最近，在小鼠模型中鉴定了两个参与阿米巴肝脓肿形成的基因，它们通过非致病性（A1NP型）和致病性（B2p）溶组织内阿米巴分离株HM：1-IMSS的克隆。虽然编码金属肽酶 EhMP8-2 的基因过表达会降低致病性克隆 B2 的毒力p，编码假设蛋白质的基因 ehi_127670 （ehhp127） 的过表达增加了非致病性克隆 A1 的毒力NP型，同时在致病性 B2 中沉默该基因p降低毒力。了解两种分子在确定 E 致病性中的作用。详细表征溶组织、沉默和过表达转染子。在非致病性 A8 中沉默 ehmp2-8、同源基因 ehmp1-1 或两者兼而有之NP型滋养体分别显著改变了347、216和58个基因的转录水平。ehmp8-1 和 ehmp8-2 沉默引起的表达谱的这种强烈变化意味着这些肽酶调节许多基因的表达。因此，许多表型特征，包括细胞病变、溶血和半胱氨酸肽酶活性，都因沉默而改变。致病性 B127 中 ehhp2 的沉默p滋养体不影响其他基因的表达，而其在非致病性A1中的过表达NP型滋养体导致大约 140 个基因的表达改变。EhHP127 对滋养体运动很重要，因为它的沉默减少，而它的过表达增强了运动活性。有趣的是，ehhp127 的特异性沉默也显着影响细胞病变、半胱氨酸肽酶和溶血活性。本研究中表征的所有三种分子，即 EhMP8-1、EhMP8-2 和 EhHP127，都存在于变形虫囊泡中。结果表明，ehmp8-2和ehhp127不仅在致病性和非致病性变形虫中差异表达，而且它们还以完全不同的机制显著影响变形虫致病性相关表型。这一观察结果表明，变形虫致病性的调节是通过复杂的分子机制网络实现的，而不是由单一因素实现的。
作者摘要
人类病原体溶组织内阿米巴可以在肠道中无症状地存活，也可以成为侵袭性并引起致命的肝脓肿。每年约有15,000人死于阿米巴感染。最近，两个具有不同致病性（A1NP型：无致病性;B2层p：致病性）来源于E。在转录组水平上比较溶组织分离株HM：1-IMSS。鉴定出两个高度差异表达的基因（ehhp127 编码假设蛋白质和ehmp8-2编码金属肽酶）。E. 分析。溶组织细胞转染剂显示 EHHP127 沉默和 EHMP8-2 在 B2 中过表达p滋养体减少了小鼠模型中阿米巴肝脓肿的形成。在这项研究中，我们表征了 E。 EHMP8-2 以及同源基因 EHMP8-1 和 EHHP127 的组织溶解沉默和过表达转染子。结果表明，金属肽酶基因表达的改变对大量基因的表达有很强的影响，因此表型发生了强烈的改变。ehhp127 的沉默不会影响整体表达谱。然而，特异性沉默会损害运动和细胞病变活性。所有三种分子都已被证明位于滋养体囊泡中。
数字
Fig 12图1图2图3Fig 4Table 1Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 9Fig 10Fig 11Fig 12图1图2图3
引文： Anders J， K?nig C， Lender C， Hellhund A， Nehls S， Shalabi I， et al. （2023） 致病性和非致病性溶组织内阿米巴克隆之间差异表达的基因通过多种机制影响致病性相关表型。PLoS 病理学 19（12）： e1011745 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745
编辑 器： Dominique Soldati-Favre，日内瓦大学医学院：瑞士日内瓦大学医学院
收到： 11年2023月2日;接受： 2023年22月2023日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 Anders et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据均在手稿、图表和支持信息中。
资金： 本出版物中报告的研究得到了德国Forschungsgemeinschaft的支持，奖项编号为BR 1744/17-1（I.B.），Jürgen Manchot Stiftung（C.K.）和Joachim Herz Stiftung（B.H.）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
溶组织内阿米巴是阿米巴病的病原体，每年导致约15,000人死亡[1]。溶组织大肠杆菌是一种肠道原生动物，由于尚不清楚的原因，它可以变得侵袭性，穿透肠粘膜，侵入组织，并通过血流迁移到肝脏。这种侵袭可导致阿米巴结肠炎的发展和阿米巴肝脓肿（ALA）的形成。
为了鉴定E的毒力因子。溶组织性参与ALAs的形成，近年来我们分析了变形虫克隆（A1NP型和 B2p）最初来源于相同的分离株（HM-1：IMSS），但其形成ALA的能力不同[2\u5]。将变形虫注射到小鼠肝脏中1天后，在感染A<>的动物中未检测到ALANP型滋养体，而ALA存在于感染B2的动物中p滋养体[4]。
非致病性克隆A1的转录组分析NP型和致病性克隆 B2p揭示了两个克隆之间差异表达的76个基因。其中包括 46 个在 A1 中表达更高的基因NP型滋养体和 30 个在 B2 中表达明显更高的基因p滋养体（褶皱变化> 3，PAdj < 0.05）[4]。
非致病性 A1 中第二高差异表达的基因NP型滋养体ehi_042870（倍数变化149），编码细胞表面蛋白酶gp63（金属肽酶EhMP8-2）[4]。ehmp8-2在致病性B2中的上调p滋养体导致这些转染子的毒力丧失，因此它们不再能够形成ALA[4]。沉默ehmp8-2表达不会改变A1的非致病性表型NP型 [5]. 最近，E.分析溶组织蛋白的肽酶编码基因。共鉴定出79个肽酶编码基因。拥有 45 个基因的最大组编码半胱氨酸肽酶 （CP）。其次是金属肽酶编码基因（21个成员）、丝氨酸肽酶编码基因（9个成员）和天冬氨酸肽酶编码基因（4个成员）[6]。金属肽酶的21个成员由11个家族组成，包括M8（利什曼溶菌素/gp63样）家族（EhMP8-1（EHI_200230）和EhMP8-2（EHI_042870））的6个成员[8]。在所有金属肽酶中，迄今为止只有EhMP1-7被表征[8]。在所有检查的滋养体的囊泡中检测到 EhMP1-7。此外，在一些滋养体的细胞表面也检测到了这种蛋白质[8]。沉默ehmp1-7导致细胞对单层细胞的粘附增加，细胞病变活性和运动性降低，吞噬作用增加[8]。EhMP1-8 和 EhMP2-8 包含 M8 家族保守的 HEXXH 基序和保守的 C 末端氨基酸组氨酸和蛋氨酸 [8]。EhMP1-643 由 15 个氨基酸、一个由 605 个氨基酸组成的推定信号肽和一个位于 627–8 位的推定跨膜结构域组成。EhMP2-662 由 16 个氨基酸、一个由 598 个氨基酸组成的推定信号肽和一个位于 620–32 位的推定跨膜结构域组成。两种金属肽酶仅具有 49% 的序列同一性（61% 的相似性）（AmoebaDB，第 15 版，2022 年 8 月 2 日）。而 ehmp1-<> 在 A<> 之间差异表达NP型和 B2p，如上所述，EHMP8-1并非如此[4]。有趣的是，在人类非致病性物种E中，M8家族只有一个成员。dispar，与 E 相同 92%。溶组织金属肽酶EhMP8-2[6]。因此，可以推测较低的毒力与ehmp8-2同系物的存在或表达相关。
致病性克隆 B127670 之间差异表达最多的基因 （ehi_2）p和非致病性克隆 A1NP型编码一种假设的蛋白质 （EhHP127），在致病性 B193 中的表达量高出 2 倍p滋养体[4]。致病性B2p滋养体中EHHP127的表达被沉默，其诱导小鼠ALA形成的能力显着受损[5]。ehhp127 在非致病性 A1 中的过表达NP型滋养体也增加了这些克隆的致病性，因为4只感染动物中有9只发生了脓肿，但这并不显著[4]。
与致病性 HM-127670：IMSS 分离株相比，分离株 G16（变形虫沉默）的 ehi_1 表达增加（3.1 倍）（主要联系人：弗吉尼亚大学医学院的 Carol Gilchrist;源版本： 2011-10-06;发布 # / 日期：AmoebaDB rel. 1.0， 2005-JAN-01），其中显示了致病因素的层次结构，其中变形虫是必不可少的。此外，E适应后检测到ehhp127的表达增加。溶组织至2μM金诺芬。然而，这种适应导致了数百个基因表达的调节，这表明这是一个非常复杂的适应机制。金诺芬是一种抗风湿药，靶向哺乳动物硫氧还蛋白还原酶（TrxR），但对多种病原菌和原生动物寄生虫也非常有效[9]。最近，一项研究分析了E的表达谱。从三名患者的临床标本中分离出溶组织性组织。在ALA患者的分离株Ax127中检测到ehhp19的表达，而在无症状携带者的分离株Ax11和阿米巴结肠炎患者的分离株Ax22中未检测到ehhp10的表达[<>]。
在这项研究中，我们旨在使用沉默和过表达转染子了解 EhMP8-1、EhMP8-2 和 EhHP127 的功能，并使用各种体外测定确定它们与毒力发展的相关性。我们的结果表明，A8中ehmp1-8和/或ehmp2-1的沉默NP型滋养体以及 EHHP127 在 A1 中的过表达NP型滋养体影响大量基因的表达，而 B127 中 ehhp2 的沉默p滋养体对其他基因的表达谱没有影响。因此，金属肽酶编码基因的沉默影响变形虫的几种表型特征也就不足为奇了，例如细胞病变、半胱氨酸肽酶和溶血活性。过表达和沉默 EhHP127 转染子的运动性受损，而沉默也对细胞病变、半胱氨酸和溶血活性产生负面影响。金属肽酶和 EhHP127 的共同点是它们可以在滋养体囊泡中检测到。
综上所述，EhHP127和金属蛋白酶EhMP8-2不仅在相反的方向上直接致病，而且它们还采用不同的机制诱导与致病性相关的不同表型。
结果
ehmp8-1 和 ehmp8-2 表达的实验操作改变了致病性和非致病性变形虫克隆的转录谱
最近，ehmp8-1 被证明在非致病性克隆 A1 中表达NP型与致病性克隆B2的水平几乎相同p（阅读：2028 年对 2228;ehmp4-8在无性系A2中的表达水平[1]）. ehmp<>-<>在无性系A<>中的表达水平NP型仅为ehmp8-1的一半左右（读数：1098），而ehmp8-2在克隆B2中几乎完全不表达p（阅读：7.4）[4].
表征非致病性克隆 A1 的转染子金属肽酶NP型其中ehmp8-1（A1NP型MP8-1格式四）、ehmp8-2 （A1NP型MP8-2格式四）或两者兼而有之（A1NP型MP8-1+2格式四）被沉默了。此外，致病性克隆 B2 的转染子p其中ehmp8-1（B2pMP8-1格式四）沉默或ehmp8-2（B2pMP8-2格式OE系列）被过度表达。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）证实了转染子中相应基因的成功沉默和过表达（图1A和1B以及S1棱镜）。
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图 1.
A8 中 ehmp1-8 （A） 和 ehmp2-1 （B） 的 mRNA 表达谱NP型和 B2p通过RT-qPCR沉默和过表达转染子。 从滋养体中分离的RNA转录成cDNA，并用SYBR Green进行qPCR，以确定沉默转染子A8的ehmp1-8（A）和ehmp2-1（B）的相对mRNA浓度NP型MP8-1格式四， A1NP型MP8-2格式四， A1NP型MP8-1+2格式四、乙pMP8-1格式四和过表达转染子 B2pMP8-2格式OE系列.对照：未转染的 A1NP型或 B2p滋养体。肌动蛋白用作校准品，对照归一化为1。n = 2–4（一式两份）。ns：不显著，**p < 0.01，***p < 0.001（非参数方差分析检验和 Mann-Whitney U 检验）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.g001
转染子的转录组分析表明，沉默对其他基因的表达有显著影响（padj < 0.05，倍数变化> 1.8）。沉默非致病性克隆 A8 中 ehmp1-1NP型*如NP型MP8-1格式四转染剂）导致 216 个基因表达改变（38 个上调，178 个下调），EHMP8-2 沉默 （A1NP型MP8-2格式四转染）导致 347 个基因表达改变（70 个上调，277 个下调），两个金属肽酶基因沉默 （A1NP型MP8-1+2格式四转染剂）导致 58 个基因表达改变（12 个上调，46 个下调）（图 2、3A-3C 以及 S1 和 S1-S3 表）。根据转染源的不同，下调的基因是上调基因的 3.8 到 4.7 倍。基因本体（GO）分析显示，ehmp8-1的沉默显著影响了GO-bio过程（GO-BP）的五个术语，包括“过时的电子传递”和“细胞氧化还原稳态”（p < 0.01）（图4A和S4表）。在GO术语“细胞成分”（GO-CC）中，只有“质膜”和“细胞外周”受到显着影响（p < 0.01）（S4表）。GO术语“分子功能”（GP-MF）包含九个重要术语，主要涉及氧化还原酶和抗氧化活性（p < 0.01）（S4表）。
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图 2. 非致病性克隆A1金属肽酶沉默转染子中差异表达基因的维恩图NP型*如NP型MP8-1格式四， A1NP型MP8-2格式四， A1NP型MP8-1+2格式四).
Padj < 0.05，倍数变化> 1.8。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.g002
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图 3. 不同 E 中显着差异表达基因的热图（> 1.8 倍，p调整< 0.05）。与相应的对照相比，溶组织性转染子沉默或过表达 EHMP8-1、EHMP8-2 或两者兼而有之。最多显示 20 个倍数变化最大的上调或下调基因。
答：答1NP型（对照组）与 A1NP型MP8-1格式四， B. A1NP型（对照组）与 A1NP型MP8-2格式四，C.A1NP型（对照组）与 A1NP型MP8-1+2格式四，D.B2p（对照组）与 B2pMP8-1格式四.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.g003
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图 4.
（A） A1差异表达基因的GO-BP分析NP型MP8-1格式四转染剂，（B） A1NP型MP8-2格式四转染剂和 （C） A1NP型MP8-1+2格式四转染剂。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.g004
ehmp8-2 的沉默对 GO-BP 术语“过时的电子传递”、“细胞骨架组织”和“细胞器组织”有显着影响（图 4B 和 S5 表）。在 GO-CC 中，只有“染色体”受到显着影响 （p = 0.01），GO-MF 包括七个重要术语，例如“FMN 还原酶活性”、“氧化还原酶活性，作用于 CH-NH 供体组”和“肌动蛋白结合”（p < 0.01）（S5 表）。当ehmp8-1和ehmp8-2都沉默时，四个GO-BP术语受到显着影响，包括“粘附”和“氨基酸代谢”（图4C和S6表）。在 GO-CC 中，没有发现明显受监管的术语。对于GO-MF，观察到6个术语的影响，包括“GTP结合”和“金属肽酶活性”（S47表）。然而，需要注意的是，大约 1% 的差异表达基因编码假设的蛋白质（S3-S<> 表）。
单独观察这些基因，发现ehhp127是A1中第二大过表达基因NP型EHMP8-1型四转染子（22 倍变化，padj 1,67E-19;图3A和S1和S1表）。此外，编码抗氧化应激蛋白的基因的表达，如过氧化物还蛋白、NADPH依赖性FMN还原酶结构域蛋白、NADPH依赖性FMN还原酶结构域蛋白和含铁超氧化物歧化酶，显著上调。此外，编码肽酶CAAX异戊二烯基蛋白酶和EhCP-A7的基因显著上调，而ehcp-a4下调（图3A、S1和S1表）。20个下调最深的基因还包括5个aig基因（3.6-7.3倍）（图1A和S1以及表1和S<>）。
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表 1. Aig1基因在A1中表达显著差异NP型MP8-1格式四， A1NP型MP8-2格式四， A1NP型MP8-1+2格式四， B2层pMP8-1格式四和 A1NP型HP127型OE系列转染剂与相应对照的比较。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.t001
A1 中第二大上调基因NP型EHMP8-2型四转染子（EHI_180390;倍数变化8.7，P adj 4.9E-10）也编码AIG1家族的蛋白质（图3B和S1以及表1和S2）。 然而，共有 8 个编码 AIG1 家族蛋白的基因下调，其中 20 个位于 3 个下调最深的基因中（图 1B 和 S1 以及表 2 和 S1）。此外，如 A<>NP型EHMP8-1型四转染子，许多可以编码抗氧化剂的基因（含有蛋白质的 NADPH 依赖性 FMN 还原酶结构域、铁硫黄素、铁氢化酶、过氧化物还蛋白）上调。同样令人惊讶的是，许多编码与细胞骨架和表面蛋白相关的蛋白质的基因被下调（表面抗原 ariel1、肌管蛋白、钙调蛋白同源结构域蛋白、formin 同源 2 家族蛋白、caldesmon、肌动蛋白结合蛋白、Gal/GalNAc 凝集素 35 kDa 亚基、Gal/GalNAc 凝集素 170 kDa 亚基、丝状蛋白、绒毛蛋白、formin 同源 2 家族蛋白、绒毛蛋白、肌动蛋白样蛋白）（图 3B 和 S1 和 S2 表）。
看A1NP型EHMP8-1+2型四沉默转染子 令人惊讶的是，同时沉默两个金属肽酶基因对基因表达谱的影响最小，并且在所有三个沉默转染子的交叉点中发现很少的基因（图2）。然而，令人惊讶的是，20 个下调基因中有 48 个属于 aig1 家族，其中 20 个属于 3 个调控程度最高的基因（图 1C 和 S1 以及表 3 和 S2）。此外，编码Gal/GalNAc凝集素和半胱氨酸肽酶EhCP-B1大亚基和小亚基的基因也下调（S3图和S<>表）。
沉默致病性克隆 B8 中 ehmp1-2p仅调节少量基因的表达。共有26个基因的表达受到显著影响，其中9个基因表达上调，17个基因表达下调（图3D、S1和S7表）。同样，九个上调基因中的两个是 aig1 基因，而一个 aig1 基因下调（表 1 和 S7 以及图 3D 和 S1）。
金属肽酶基因的沉默和过表达影响细胞病变、半胱氨酸肽酶和溶血活性
获得沉默和过表达对E表型影响的信息。分析转染子的组织溶解、运动性、生长性、吞噬率、溶血活性、细胞病变活性和半胱氨酸肽酶活性。尽管沉默会影响许多基因的表达，但沉默和过表达对滋养体运动的影响很小，观察到 A0 的运动显着增加 （padj = 0347.1）NP型EHMP8-2型四转染子（图 5A–5C 和 S2 棱镜）。为了确定不同转染子的生长速率，在24小时内测定分裂速率（图5D-5F和S3棱镜）。与运动相反，ehmp8-1 的沉默导致非致病性 A1 的生长受到显着抑制NP型和致病性 B2p滋养体（p adj = 0.0008，p < 0.0001）（图5D和5E和S3棱镜）。同样，ehmp8-2 在 B2 中的过表达p导致生长明显更快 （p = 0.0031）（图 5F 和 S3 棱镜）。仅观察到 B0 的噬红细胞增多显着降低 （p = 0414.2）pEHMP8-2型OE系列转染子（图 6A–6C 和 S4 棱镜）。A1溶血活性显著降低NP型EHMP8-1型四 (padj = 0.0165） 和 A1NP型EhMP8-1+2 （padj < 0.0001） （图 6D 和 S5 棱镜），而在 B2 中没有观察到任何影响pEHMP8-1型四转染子（图 6E 和 S5 棱镜）。但是，B2p滋养体已经具有非常低的溶血活性（图 6E 和 S5 棱镜）。ehmp8-2基因在致病性B2中的过表达p滋养体导致溶血活性显着增加（B2pMP8-2格式OE系列，p = 0.0024）（图 6F 和 S5 棱镜）。
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图 5.
沉默转染子 A1 的运动性 （A-C） 和生长 （D-F） 的测定NP型MP8-1格式四， A1NP型MP8-2格式四， A1NP型MP8-1+2格式四和 B2pMP8-1格式四和过表达转染剂 B2pMP8-2格式OE系列.未转染的 A1NP型和 B2p滋养体用作沉默转染子和 B2 的对照p用对照质粒pNC转染的滋养体用作过表达转染子的对照。为了确定运动性（A-C），在10分钟后测量累积距离（μm）。对于每个转染子/对照组，分析了 60 个变形虫。对于每个实验，使用3个生物学重复，并确定20个变形虫的运动速度。为了确定生长速率（D-F），将每个克隆的500个滋养体接种到24孔板中，并在24小时内每72小时计数一次细胞。实验一式三份进行四次。使用单因素方差分析（A，D）和非配对t检验（B/C;E/F） （ns： 不显著， *p < 0.05， **p < 0.01， *** p < 0.001， **** p < 0.0001）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.g005
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图 6.
沉默转染子 A1 的噬红细胞增多 （A-C） 和溶血活性 （D-F） 的测定NP型MP8-1格式四， A1NP型MP8-2格式四， A1NP型MP8-1+2格式四和 B2pMP8-1格式四和过表达转染剂 B2pMP8-2格式OE系列.未转染的 A1NP型和 B2p滋养体用作沉默转染子和 B2 的对照p用对照质粒pNC转染的滋养体用作过表达转染子的对照。为了确定噬红细胞增多症 （A-C），滋养体 （2 x 105）和红细胞（2 x 108）在30°C下孵育37分钟，裂解非吞噬作用的红细胞，然后在1%Triton-X-100中裂解变形虫，并在405nm处测量吸光度。对照组的平均值定义为 100%，测得的 OD405海里样本的值与此相关。至少进行了六次生物学重复。溶血活性 （D-F），1.25 x 105将滋养体与 2.5 x 10 混合8红细胞在 1 ml PBS 中并在 37°C 下孵育 1 小时。孵育后，沉淀细胞，并在530nm处测量上清液中释放的血红蛋白。分别孵育的红细胞和滋养体用作阴性对照。确定 100% 血红蛋白释放，2.5 x 108将红细胞在1ml水中裂解。实验至少进行3次，一式四份。使用单因素方差分析（A，D）和非配对t检验（B/C;E/F） （ns： 不显著， *p < 0.05， **p < 0.01， **** p < 0.0001）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.g006
在两个克隆 A8 中单独沉默 ehmp1-8 或 ehmp2-1 NP型和 B2p导致细胞病变活性（细胞单层破坏）显着降低 33%-53% （A1NP型EHMP8-1型四，padj = 0.0007;答1NP型EHMP8-2型四，padj = 0.0002;B2层pEHMP8-1型四，p = 0.0014）（图 7A 和 7B 以及 S6 和 S7 棱镜）。然而，A1 中两个金属肽酶基因的沉默NP型滋养体对细胞病变活性没有影响（图7A和S6棱镜）。令人惊讶的是，ehmp8-2 在 B2 中的过表达p滋养体（B2pMP8-2格式OE系列）也导致单层破坏的显着减少（p = 0.0014）（图7C和S7棱镜）。此外，沉默导致所有沉默转染子中半胱氨酸肽酶活性显着降低（A1NP型EHMP8-1型四，padj = 0.01;答1NP型EHMP8-2型四，padj < 0.0001;答1NP型EHMP8-1+2型四，padj < 0.0001;B2层pEHMP8-1型四，p = 0.0012）（图 7D 和 7E 以及 S8 棱镜）。A1中的半胱氨酸肽酶活性NP型转染子从 10.3±1.4（对照）降至 7.4±2.7 mU/mg （A1NP型EHMP8-1型四）、4.3±1.9 mU/mg （A1NP型EHMP8-2型四）和 6.2±2.4 mU/mg （A1NP型EHMP8-1+2型四) (图 7D 和 S8 棱镜）。B2的半胱氨酸肽酶活性p滋养体为60±15 mU/mg，在ehmp43-11沉默后降至8±1 mU/mg（图7E和S8棱镜）。相反，ehmp8-2 在 B2 中的过表达p滋养体导致半胱氨酸肽酶活性显著增加（B2pMP8-2格式OE系列，p < 0.0001）（图 7F 和 S8 棱镜）。底物凝胶电泳证实了活性测定的结果。A1 活性的整体下降NP型MP8-1格式四与对照组相比，转染剂太小，无法在底物凝胶中检测到。但是，对于 A1NP型MP8-2格式四然而，转染剂的 EhCP-A1 和 EhCPA-7 条带的强度明显降低，而 A1 的强度NP型MP8-1+2格式四转染剂，所有条带均显示强度降低。B2也观察到类似的效果pMP-1型四转染剂。特别是，EhCP-A7的活性带显示出强度降低（图7G）。然而，该调节似乎发生在翻译水平上，因为与对照组相比，EHCP-a1、ehcp-a2、ehcp-a5 和 ehcp-a7 的表达在不同的转染子中没有显着改变。 唯一的例外是ehcp-a7，它在A1中显著上调了两倍NP型MP8-1格式四转染剂与对照组相比（Padj = 0.023）（S1、S2、S3、S7表）。
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图 7.
沉默转染子 A1 的细胞病变活性 （A-C） 和半胱氨酸肽酶活性 （D-G） 的测定NP型MP8-1格式四， A1NP型MP8-2格式四， A1NP型MP8-1+2格式四和 B2pMP8-1格式四和过表达转染剂 B2pMP8-2格式OE系列.未转染的 A1NP型和 B2p滋养体用作沉默转染子和 B2 的对照p用对照质粒pNC转染的滋养体用作过表达转染子的对照。为了确定细胞病变活性 （A-C），HepG2 细胞 （1 x 105）接种在24孔板中，培养48小时并用BCECF染色。随后，1 x 105将滋养体加入500μlDMEM培养基中的细胞中，并在37°下孵育1小时。然后，裂解细胞，离心，并在485nm吸光度和535发射光度下测量上清液。阴性对照设定为100%。实验至少进行 3 次，一式三份。以Z-Arg-Arg-pNA为底物测定半胱氨酸肽酶活性（D-G）。实验至少重复进行6次。使用单因素方差分析（A，D）和非配对t检验（B/C;E/F） （ns： 不显著， **p < 0.01， *** p < 0.001， **** p < 0.0001）。 （G）使用底物凝胶电泳测定半胱氨酸肽酶活性。来自对照的4μg变形虫提取物（A1NP型/B2层p）和转染子（A1NP型MP8-1格式四， A1NP型MP8-2格式四， A1NP型MP8-1+2格式四， B2层pMP8-1格式四）在与明胶共聚的SDS-Page上分离。为了可视化半胱氨酸肽酶活性，用考马斯蓝对凝胶进行染色。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.g007
EhMP8-1 和 EhMP8-2 位于滋养体囊泡中
确定两种金属肽酶的定位，非致病性 A1NP型用质粒瞬时转染滋养体，允许将相应的蛋白质翻译到C末端的c-Myc标签上。野生型 B2 的免疫荧光测定p用作对照的滋养体表明，α-myc 抗体未检测到皂苷处理细胞的细胞质或未皂苷处理的滋养体表面的任何蛋白质（S2 图）。
在 A1 中NP型转染子 A1NP型MP8-1格式米克和 A1NP型MP8-2格式米克，两种金属肽酶均在滋养体内的囊泡状结构中检测到。它们主要位于滋养体内质的囊泡中（图8A-8D）。在滋养体的细胞表面均未检测到EhMP8-1和EhMP8-2（S4A–S4C图）。
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图 8. A1的显微分析NP型MP8-1格式米克和 A1NP型MP8-2格式米克用于定位金属肽酶 EhMP8-1 和 EhMP8-2 的转染子。
The A1NP型用表达质粒 pNCMP8-1 转染滋养体米克或使用 pNCMP8-2米克，这允许产生金属肽酶-myc融合蛋白，并且myc标签可以用特定的α-myc抗体染色。对于免疫荧光分析，滋养体用PFA固定并用皂苷透化。MP8-1格式米克和 MP8-2米克融合蛋白用 ?-c-myc 一抗 （1：100） 和 ?-小鼠 Alexa Fluor 488（1：400，绿色）染色。A， C. A1 的单滋养体NP型MP8-1格式米克（A） 和 A1NP型MP8-2格式米克转染剂 （C）。图中显示了透射光图像 （DIC）、用 Hoechst 染料对细胞核进行染色、用 α-Myc 抗体对 EhMP8-1 和 EhMP8-2 进行染色，以及图像的叠加（合并）。B，D.A1滋养体的共聚焦显微照片的单张图像NP型MP8-1格式米克（B） 和 A1NP型MP8-2格式米克（四）转染剂。单幅图像显示了通过滋养体的0.38μm厚的切片。总共获得了 42 张图像，此处仅显示每两张图像。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.g008
EhMP8-1和EhMP8-2与不同生物的利什曼溶菌素和侵袭菌素的比较
比较EhMP8-1和EhMP8-2与不同生物体的利什曼溶菌素样肽酶的氨基酸序列，发现与肝吸虫华支睾吸虫、禽原生动物寄生虫Histomonas meleagridis和T.阴道炎范围为 16%-20%。L.主要为22%至23%。在各种后生动物入侵溶血素中发现最高身份（24%至28%），例如来自钩虫Ancylostoma caninum、鞭虫Trichuris suis、果蝇黑腹果蝇、Mus musculus、猕猴、人类和土壤变形虫Dictyostelium discoideum（S8表）。
ehhp127 的过表达（但不沉默）会影响其他基因的表达
研究表明，ehhp127几乎完全在克隆B2中表达p（阅读：B2p-2314.73 与 A1NP型12.01）[4]。与 ehmp8-1 和 ehmp8-2 基因的沉默相反，B127 中 ehhp2 的沉默p滋养体（B2pHP127型四）对其他基因的表达没有影响（图9A和S3和S9表）。然而，当ehhp127在克隆A1中过表达时，情况就不同了NP型（图 9B 和 S3 和 S9 表）。在 A1 中NP型HP127型OE系列转染子 ehhp127 过表达约 5500 倍。总体而言，17个基因显著上调超过3倍，40个基因显著上调超过2-3倍（padj < 0.05）（图9B和S3和S10表）。然而，当对照转染子A1的表达谱NP型将 pNC 与未转染的 A1 进行比较NP型滋养体，我们观察到六个最差异表达基因的 242 倍和 7 倍抑制，而在 A1NP型HP127型OE系列转染剂，表达水平恢复到野生型A1NP型 [所有六个基因都编码假设的蛋白质（S4表）。在模拟转染中产生这种效应的原因尚不清楚。
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图 9. 基因在不同E中显著差异表达的热图（>1.8倍，p调整<0.05）。与相应的对照相比，溶组织性转染子沉默或过表达 EHHP127。
最多显示 20 个倍数变化最大的上调和下调基因。答：B2p（对照组）与 B2pHP127型四， B. A1NP型pNC（对照组）与 A1NP型HP127型OE系列.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.g009
只有一个额外的差异表达基因（ehi_062680），编码一种假设的蛋白质，也被发现在野生型A1之间显着差异表达NP型和 B2p滋养体。该基因在 B20 中的表达量高 2 倍p比 A1NP型滋养体[4]。A1 的表达量增加NP型pNC 为 A1NP型HP127型OE系列是 2.5 倍（S10 表）。然而，对照质粒pNC的转染似乎也会影响表达。与野生型A1相比，许多基因的表达上调或下调NP型，但也与 A1 相比NP型EH127型OE系列转染剂（S10表）。总共有86个基因的表达显著下调。其中，43个基因下调>3倍，另有43个基因下调2-3倍（S10表）。同样，可以看出模拟转染的效果。通常在 A18 中不表达或仅弱表达的 1 个基因的表达NP型野生型滋养体出现在 A1 中NP型pNC的。然而，A1 的表达谱NP型HP127型OE系列转染子已恢复到 A1 中的低水平NP型滋养体。这里的表达差异在4200倍和6.7倍之间。除了一个 aig1 基因和一个编码假定 DNA 聚合酶的基因外，这些都是编码假设蛋白质的基因（表 1）。对于 A1 中显着下调的所有其他基因NP型HP127型OE系列转染子，在 A1 中的表达NP型pNC对照转染子与A1中的pNC对照转染子相关NP型野生型滋养体[4]。因此，这很可能是ehhp127过表达的特定效应。令人惊讶的是，总体而言，11 个 aig1 基因的表达显着下调（表 1）。此外，编码半胱氨酸肽酶 ehcp-a4 和 ehcp-a6 的基因、编码热休克蛋白的基因（HSP101、DNAJ 家族蛋白、HSP70）和编码抗氧化剂的基因（过氧化物还蛋白、铁硫黄素）的表达在 A1 中下调NP型HP127型OE系列转染剂（图9B和S3和S10表）。
对于1个基因，A<>的表达谱NP型pNC 转染子与 A1 的比较NP型HP127型OE系列转染子与A1相当NP型至 B2p滋养体。在 A1 中NP型HP127型OE系列转染子和 B2p滋养体，与 A1 相比，这些基因的表达较少NP型pNC 对照转染子和 A1NP型滋养体。这九个基因编码热休克蛋白（EHI_034710、EHI_022620）、AIG 家族蛋白（EHI_126560、EHI_126550）、DNA 错配修复蛋白 Msh2 （EHI_123830）、剪接因子 3B 亚基 1 （EHI_049170） 和三种假设蛋白（EHI_005657、EHI_075640、EHI_075690）（图 9B 和 S3 和 S10 表）。
ehhp127 的过表达仅显着调节一个 GO-BP 术语，即“过时的电子传递”（S11 表）。在 GO-CC 中没有发现显着调控的通路。GO-MF 则不同，其中 20 条通路受到影响，包括“鸟苷核糖核苷酸结合”、“溶菌酶活性”和“FMN 还原酶活性”（S11 表）。
ehhp127 表达的改变对运动和细胞病变活性有重大影响
对于EhMP8转染子，还分析了ehhp127过表达和沉默转染子（A1NP型HP127型OE系列， B2层pHP127型四).
ehhp127的沉默和过表达对E的总体影响较小，对E的影响较小。溶组织表型。对于沉默转染子来说，这并不奇怪，因为除了ehhp127本身之外，没有其他基因的表达受到影响。然而，令人惊讶的是，尽管许多基因的表达谱在过表达过程中受到调节，但这只会影响运动性（图10A和S9棱镜）。这在沉默转染子中也受到非常显着的影响（图 10B 和 S9 Prism）。虽然 ehhp127 在 A1 中过表达NP型*如NP型HP127型OE系列）261分钟后（p < 25.389）（图84A和S10棱镜），使B0中的ehhp0001沉默，将行进距离从10±9μm增加到127±2μm。p（B2层pHP127型四）导致行进距离从449±141 μm/10 min减少到270±38μm/10 min（p < 0.0001）（图10B和S9棱镜）。噬红细胞作用在ehhp127转染子A1中不受影响NP型HP127型OE系列和 B2pHP127型四 (图10C、10D和S10棱镜）。然而，与所有金属肽酶转染剂一样，我们观察到 ehhp127 的沉默降低了细胞病变活性。而74±8.6%的单层被对照（B2p滋养体）、ehhp127基因沉默（B2pHP128型四） 将破坏降低到 51±10% （p < 0.0001）（图 10F 和 S11 棱镜）。如前所述[5]，过表达对半胱氨酸肽酶活性没有显着影响（图10G和S12棱镜），而沉默ehhp127导致半胱氨酸肽酶活性显着降低（190±49 mU/mg vs 123±23 mU/mg，p = 0.024）（图10H和S12棱镜）。 关于溶血活性，仅B2显着降低p（2.6±1.2% vs 1.7±1%，p = 0.015）在ehhp127沉默后观察到（图10J和S13棱镜）。
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图 10.
测定 EhHP127 转染子的运动性 （A、B）、噬红细胞增多作用 （C、D）、细胞病变活性 （E、F）、半胱氨酸肽酶活性 （G、H） 和溶血活性 （I， J）（过表达转染剂：A1NP型HP127型OE系列，pNC 转染的 A1NP型以滋养体为对照;沉默转染剂：B2pHP127型四、未转染的 B2p以滋养体为对照）。甲、乙。为了确定运动性，在10分钟后测量累积距离（μm）。对于每个转染子/对照，分析了 30 个变形虫（两个生物学重复，每个 15 个变形虫）。使用非配对 t 检验 （****p < 0.0001） 确定显着性。C，D。为了确定噬红细胞增多，滋养体（2 x 105）和红细胞（2 x 108）在30°C下孵育37分钟，裂解非吞噬作用的红细胞，然后在1%Triton-X-100中裂解变形虫，并在405nm处测量吸光度。对照组的平均值定义为100%，测得的OD405海里样本值与100%相关。每个转染子/对照组至少进行五次生物学重复，并使用非配对 t 检验确定显着性（ns：不显着）。E，F。为了确定细胞病变活性，HepG2细胞（1 x 105）接种在24孔板中，培养48小时并用BCECF染色。随后，1x105将滋养体加入细胞中，放入500μlDMEM培养基中，并在1°C下孵育37小时。 然后，裂解细胞，离心，并在485nm吸光度和535nm发射下测量上清液。阴性对照设定为100%。实验至少重复进行3次。使用非配对 t 检验确定显着性（ns：不显著，****p < 0.0001）。以Z-Arg-Arg-pNA为底物测定半胱氨酸肽酶活性。实验对A1一式三份NP型HP127型OE系列（G） B2 一式五次pHP127型四使用非配对 t 检验确定显着性（ns：不显著，*p < 0.05）。我，J.确定溶血活性，1.25 x 105将滋养体与 2.5 x 10 混合8红细胞在 1 ml PBS 中并在 37°C 下孵育 1 小时。孵育后，沉淀细胞，并在530nm处测量上清液中释放的血红蛋白。分别孵育的红细胞和滋养体用作阴性对照。确定 100% 血红蛋白释放，2.5 x 108将红细胞在1ml水中裂解。实验一式两份（I）2次，一式三份（J）7次。使用非配对 t 检验确定显着性（ns：不显着，*p < 0.05）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.g010
EhHP127在滋养体囊泡中的定位
与假设蛋白 EhHP127 过表达的实验类似，变形虫用质粒瞬时转染，允许将 EhHP127 翻译到 C 末端的 c-Myc 标签上。在 B2 中pEHHP127型米克转染子， EhHP127米克也定位于滋养体囊泡。观察到滋养体内的均匀分布（图11A-11C）。在蛋白质印迹分析中，仅在不溶性颗粒部分中检测到EhHP127，而在可溶性部分中未检测到（图11D）。然而，在滋养体表面未检测到EhHP127（S4D图）。
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图 11. 假设蛋白质 EhHP127 的定位。
B2层p用表达质粒 pNCHP127 转染滋养体米克，这允许产生 EhHP127-Myc 融合蛋白，并且用特异性 α-myc 抗体染色 myc 标签。空调。对于免疫荧光分析，滋养体用PFA固定并用皂苷透化。EHHP127型米克融合蛋白用 ?-c-myc 一抗 （1：100） 和α小鼠 Alexa Fluor 488（1：400，绿色）染色。对于共定位，使用针对细胞质定位超氧化物歧化酶 （SOD） 和α兔 Alexa Fluor 594（1：400，红色）的抗体。细胞核用 Hoechst 染料（蓝色）染色。A.来自B2的单个滋养体pHP127型米克转染剂。B.B2滋养体的共聚焦图像pEh127Myc转染剂。10个截面的系列，从上到下的距离为1.9μm，覆盖细胞的主要部分。C.整个电池的侧视图，绿色，红色和合并三种模式，用于检测EHI_127670和SOD的单一和合并。对于侧视图，使用 Imaris 从 3 个单切片中构建了一个 55D 模型。D.使用?-c-myc一抗（13：1）和?-小鼠-HRP二抗（1000：1）对2000%Tricine-SDS-PAGE进行蛋白质印迹。对于蛋白质印迹，B2p滋养体独立转染两次（[1]，[2]），并从两种转染子中分别制备颗粒部分（P）和可溶性部分（S）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.g011
讨论
致病性和非致病性克隆的比较转录组分析，均来源于E。溶组织分离株HM-1：IMSS，除其他外，鉴定了两个差异表达的基因，其沉默或过表达会影响变形虫的毒力表型。编码金属肽酶 EhMP8-2 的基因 ehmp8-2 的过表达被证明会降低致病性克隆 B2 的毒力p，而编码假设蛋白质的基因 ehhp127 的过表达增加了非致病性克隆 A1 的毒力NP型在小鼠感染实验中[4,5]。为了更好地了解这两种蛋白质的功能，产生了相应的沉默或过表达转染子并分析了它们的表型。
两个 E.溶组织金属肽酶 EhMP8-1 和 EhMP8-2 属于 M8 肽酶家族（利什曼溶菌素/gp63 样）。该名称来源于利什曼原虫，利什曼原虫是利什曼原虫的重要致病因素[11]。这种利什曼原虫肽酶是寄生虫前乳腺突阶段细胞表面最丰富的蛋白质，与各种分子伴侣一起作为配体[12\u15]。参与发病机制的重要过程似乎是各种寄生虫中M8金属蛋白酶家族不同成员的特征[16\u21]。然而，利什曼溶菌素样肽酶并非寄生原生动物所独有，而是在许多不同的生物体中保守的，并且基因拷贝的数量可以有很大差异。与M8家族成员在其他原生动物寄生虫中的作用相比，令人惊讶的是，非致病性A1NP型滋养体同时表达两个基因，而致病性 B2p滋养体仍然有两个完整的基因，但不再表达EHMP8-2基因[4]。Leishmanolysin样蛋白在后生动物（如果蝇或人类）中也有描述，它们被称为侵袭性溶血素，每个只有22个代表[23,8]。 EhMP1-8和EhMP2-16与其他生物的利什曼溶菌素和侵袭溶菌素的同一性相对较低，即28%-8%。有趣的是，E.溶组织蛋白对后生动物的几种侵袭性溶血素具有最高的同一性（S22表）。果蝇的侵袭性溶血素参与发育，并显示出复杂的细胞定位[23]，即在细胞核和脂滴周围的结构中[<>]。
我们在变形虫的囊泡中检测到 EhMP8-1 和 EhMP8-2（图 8A-8F）。与Teixera及其同事[7]在变形虫细胞表面偶发检测到EhMP8-1相比，我们无法验证这种定位。目前尚不清楚E是哪种囊泡。溶组织金属蛋白酶存在于。也不知道它们是否是脂滴。在静息巨噬细胞中，侵袭溶血素定位于细胞质的脂滴中，但在主动迁移的巨噬细胞中，溶血素高度集中在细胞前缘，表明侵袭溶血素参与细胞迁移[22]。研究还表明，抑制细胞内膜运输可阻断侵袭伪足对细胞外基质的降解[24]，并且由于内吞作用与细胞迁移有关[25,26]，脂滴相关的侵袭溶血素可能通过侵袭伪足影响细胞迁移[23]。 这与对EhMP8-1的研究相似。Hasan及其同事表明，ehmp8-1（ehmsp-1）的沉默使滋养体具有超粘附性和运动性。他们还表明，ehmp8-1的沉默导致寄生虫在与人纤连蛋白相互作用时无法形成专门的点聚合肌动蛋白结构（F-肌动蛋白）。这些短寿命的F-肌动蛋白结构类似于哺乳动物细胞侵袭伪足的结构[27]。与Hasan及其同事的研究相比，我们没有发现沉默ehmp8-1对运动的任何影响;然而，沉默 ehmp8-2 导致运动性显着降低（图 5A）。此外，我们发现 ehmp8-2 及其同源基因 ehmp8-1 的沉默和过表达对半胱氨酸肽酶活性的影响最为显著（图 7D–7F）。沉默导致半胱氨酸肽酶活性降低，而过表达导致半胱氨酸肽酶活性增加。破坏单层的能力也明显受损，尽管过表达和沉默都会导致细胞病变活性降低（图7A-7C）。
为了确定改变的表型是否确实是由于相应ehmp8基因的沉默或过表达，通过RNAseq分析了不同转染子的表达谱。令人惊讶的是，沉默ehmp8-2，以及同源基因ehmp8-1或两个基因的沉默影响了转染子中数百个基因的表达。目前尚不清楚为什么沉默对许多其他基因的表达有如此强烈的影响。由于这些基因中有许多编码功能未知的蛋白质，因此无法确定对生物过程的全部影响。值得注意的是，ehmp8-1或ehmp8-2的沉默导致编码抗氧化剂的基因上调，包括编码铁硫黄素蛋白的基因。这与GO分析一致，GO-BP术语“过时的电子传递”和GO-MF术语“氧化还原酶活性”或“FMN还原酶活性”受到的影响最大（图4A和4B以及S1和S2表）。观察到两个金属肽酶基因的沉默调节较少的分析表型特性，这可以通过较少的基因在其表达中受到影响这一事实来解释。虽然我们不能明确地说出为什么沉默两个金属肽酶基因比两种单一沉默方法调节的基因更少，但这一结果表明两种金属蛋白酶之间存在复杂的相互作用。然而，将沉默单个金属蛋白酶基因与两个金属蛋白酶基因沉默的不同效果进行比较的这一令人惊讶的结果使得可以更仔细地研究它们的相似之处。主要相似之处是所有沉默转染子中半胱氨酸肽酶活性的降低。过表达转染子中半胱氨酸肽酶活性的增加进一步支持了半胱氨酸肽酶活性直接依赖于金属蛋白酶活性的观点。半胱氨酸肽酶活性的这种修饰可能发生在翻译后。因此，金属蛋白酶可能是激活E中半胱氨酸蛋白酶的分子。通过蛋白水解裂解从各自的propeptidass溶组织。其他蛋白酶控制蛋白酶活化的类似机制已经在其他系统中被描述（例如胰腺蛋白酶的激活，用于审查[28]，半胱天冬酶的激活，用于审查[29]），这使得我们的假设成为可能）。
此外，在不同的 EhMP1 沉默转染子中，许多 aig8 基因的表达降低（表 1）。在 EhHP127 中也观察到对 aig 基因表达的影响OE系列过表达转染子。在这些基因中，1个aig1基因的表达显著下调（表1）。AIG30蛋白最早是在植物免疫防御的背景下被描述的[1]。E大家族的功能意义。溶组织性AIG45蛋白由超过2个基因编码，但尚未完全了解，尽管许多研究已经解决了这个问题[1]。E.溶组织性AIG1蛋白与AIG31样GTP酶的免疫相关蛋白（GIMAPS）/免疫相关核苷酸结合蛋白（IAN）家族的GTP酶具有结构相似性，后者在脊椎动物和被子植物之间是保守的[1]。将致病性和非致病性HM-34：IMSS细胞系（本文研究的克隆来源于此）进行比较，结果表明，在检测到的1个aig18基因中，2个基因在致病细胞系B中表达更高，只有1个基因在非致病性细胞系A中表达水平更高[1]。一些 AIG176590 蛋白被发现具有特定功能。例如，研究表明，菌株HM-1：IMSS cl6中aig32基因EHI_1的过表达导致细胞表面突起的形成增加，滋养体与人红细胞的粘附性增加[180390]。在非致病性菌株UG10的滋养体中EHI_33 aig1基因过表达导致毒力增加[1]。此外，致病性HM-10：IMSS与大肠杆菌共培养可降低体外毒力并下调aig1基因表达。相比之下，菌株UG33与E共培养的毒力。大肠杆菌增加，AIG1表达上调[<>]。研究还表明，aig<> 基因在 H 存在下表达上调2O2 [[34]在耐12μM甲硝唑的变形虫中，有1个aig35基因差异表达[36]。同样，在 E 期间检测到差异表达。溶组织炎侵袭小鼠肠道[1]，AIG37基因在阿米巴肝脓肿分离的滋养体中下调[38]。AIG家族的1个成员也被鉴定为囊肿特异性基因[<>]。综上所述，这些单独的报告表明，aig<>表达的调节对致病性和致病性相关表型有显着影响。
然而，特别是在 EhHP127OE系列过表达转染子，很明显，尽管1个AIG127基因的表达下调，并且多种其他基因的表达发生了变化，但这对本文检查的大多数表型没有显着影响。ehhp127 的过表达仅导致运动的显着增加。相反，ehhp127的沉默不会改变其他基因的表达，会显着降低运动性。因此，EhHP12很可能直接影响变形虫的运动性（图39）。此外，沉默还导致细胞病变活性的显着降低。E对细胞单层的破坏。溶组织通常归因于其半胱氨酸肽酶。然而，一些研究明确驳斥了这一点[40,127]。 由于滋养体的运动，细胞单层的破坏更有可能是一种机械效应，这可能与ehhp127转基因观察到的细胞病变效应直接相关。EHHP127 的沉默也会导致半胱氨酸肽酶和溶血活性降低。Matthiesen及其同事先前证实了ehhp5的沉默对半胱氨酸肽酶活性有影响，并在此得到证实[127]。然而，没有关于EhHP<>的分子和生物学功能的信息。该基因在动物界中没有明确的同源物，也没有确定特定的结构域，因此无法假设其功能。
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图 12.
由 EhMP8-1 和/或 EhMP8-2 （A） 和 EhHP127 （B） 的过表达和沉默引发的表型变化的示意图。蓝色变形虫代表所研究表型的减少，红色变形虫代表增加。如果对照组和转染子之间没有差异，则变形虫显示为灰色。此外，还显示了由单因素方差分析或非配对 t 检验确定的显著性 （*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001）。*增长，数据来自 [5]。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.g012
E的细胞质。溶组织细胞含有大量的液泡和囊泡。关于这些结构的蛋白质组知之甚少。除了本文研究的EhHP127、EhMP8-1和EhMP8-2蛋白外，还在囊泡样结构中检测到几种半胱氨酸肽酶和半胱氨酸肽酶抑制剂[41\u47]。
总之，这项研究提供了一些意想不到的见解。首先，在致病性和非致病性克隆之间差异表达的两个基因ehhp127和ehmp8-2强烈影响与致病性相关的表型，但似乎以完全独立的方式进行。未知基因ehhp127似乎主要影响滋养体迁移率，而金属蛋白酶ehmp8-2产生高度复杂和多样化的反应（图12）。这项研究的结果表明，这两个基因可以在不同的水平上起作用。虽然ehhp127影响流动性的复杂性，从而间接影响致病性，但金属蛋白酶似乎直接影响半胱氨酸蛋白酶活性，从而直接影响致病性。
材料与方法
溶组织埃希菌细胞培养和转染子的产生
栽培E.使用TYI-S-37培养基，在33°C的塑料培养瓶（Corning，Kaiserslautern，Germany）中，在微需氧和无轴条件下进行溶组织滋养体[48]。非致病性E。溶组织细胞克隆A1NP型和致病性 E。溶组织细胞克隆 B2p来源于细胞系HM-1：IMSS-A和HM-1：IMSS-B[4]。
如上所述产生过表达和沉默的转染子[4,5]。 综上所述，用于克隆B8中ehmp2-042870（ehi_2）的过表达p和克隆 A127 中的 ehhp127670 （ehi_1）NP型，在E的控制下，用含有目的基因的表达质粒pNC转染滋养体。溶组织凝集素启动子（B2pMP8-2格式OE系列， A1NP型HP127型OE系列).作为对照 B2p或 A1NP型用质粒pNC转染滋养体[4]。过表达转染子在含有 33 μg/ml G-20 的 TY-I-S-418 培养基中培养（Gibco，Thermo Fisher Scientific，Schwerte，Germany）。
用于沉默克隆 A8 中的 ehmp1-200230 （ehi_8） 或 ehmp2-1NP型，滋养体分别用含有ehmp8-1（267 bp）或ehmp8-2（1989 bp）的沉默质粒pSiA转染，触发区为ehi_169670（A1NP型MP8-1格式四， A1NP型MP8-2格式四).用于沉默克隆 B8 中的 ehmp1-127 或 ehhp2p，用含有ehmp8-1（268 bp）或ehhp127（917 bp）的沉默质粒pSiB转染滋养体，触发区域为ehi_074080（B2pMP8-1格式四) [5]. 沉默转染子在含有 33 μg/ml G-20 的 TY-I-S-418 培养基中生长 3 周。通过有限稀释克隆转染子后，将细胞不经选择地培养至少 4 个月，直到质粒完全丢失。通过在20μg/ ml G418存在下培养变形虫来证明质粒丢失[5]。生产 A1NP型EHMP8-1+2型四转染剂，成功沉默 ehmp8-1 后，A1NP型EHMP8-1型四转染含有ehmp8-2的沉默质粒pSiA转染转染物。随后，如上所述进行选择和培养。答1NP型和 B2p滋养体用作对照。通过特异性qRT-PCR（S12表）确认过表达和沉默。
对于定位研究，ehhp127 （ehi_127670） 在其自身启动子下使用含有表达载体的 myc 标签 （pNC米克） 在克隆 B2 中p.pNC米克质粒基于pNC表达质粒。myc标签通过Bam HI/BglII整合到BamHI限制位点。生成 pNC米克载体，编码c-Myc标签（Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu）的两种互补寡核苷酸和5'端的限制性位点KpnI、NheI、BamHI、XhoI和BglII杂交（S12表）。然后，通过5'端的KpnI限制性位点和3'端的BglII限制性位点将所得DNA片段克隆到pNC载体中。
生成质粒pNC_HP127米克，起始ATG上游的500 bp长序列，可能包含启动子区域，并且使用含有KpnI限制性位点的正向引物和含有BamHI限制性位点的反向引物（S127670表）通过PCR扩增ehi_12的整个开放阅读框。克隆 B2 的 DNAp被用作模板。扩增的插入片段被克隆到pNC中米克具有 KpnI 和 BamHI 限制性位点的载体。
ehmp8-1 和 ehmp8-2 的表达也在它们自己的启动子下进行 （pNCMP8-1 米克、pNCMP8-2米克).为此，使用含有 KpnI 限制性位点的正向引物和含有 BamHI 限制性位点的反向引物（S500 表）通过 PCR 扩增起始 ATG 上游的 8 bp 长序列，其中可能包含启动子区域和 ehmp1-200230 （ehi_8） 和 （ehmp2-042870） ehi_12的整个开放阅读框。
RNA提取和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
对于RNA分离，收获滋养体，用磷酸钠缓冲盐水（NaPBS;4°C;6.7mM NaHPO）洗涤两次4，3.3毫米NaH2采购订单4，140 mM NaCl，pH 7.2），并用Trizol试剂（QIAzol Lysis reagent，QIAgen，Hilden，Germany）裂解。使用 Direct-zol RNA MiniPrep 试剂盒（Zymo Research，Irvine，CA，USA）进行总 RNA 分离和 DNA 消化。所有步骤均按照制造商的说明执行。使用 NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，Schwerte，Germany）测定 RNA 浓度和纯度。根据制造商的说明，使用 SuperScriptIII 第一链合成系统试剂盒（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Dreieich，Germany）从分离的 RNA 中合成 qRT-PCR 所需的 cDNA。
设计用于qRT-PCR实验的正义和反义引物，以扩增目的基因的80-120 bp片段（S12表）。Luna Universal qPCR 预混液试剂盒（New England Biolabs，法兰克福，德国）用于进行 qRT-PCR。每次重复分析2-4个生物学重复。使用2-ΔΔCT方法和 Rotor Gene 软件（Rotor Gene 6，Corbett Research）。答1NP型， B2层p和 B2ppNC用作校准器（对照），并设置为1。肌动蛋白被用作正常化的管家基因。
二代测序
使用 Agilent 2100 生物分析仪系统（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，United States）和 Agilent RNA 6000 Pico 试剂盒（Agilent Technologies）评估纯化 RNA 的质量。根据制造商的说明，使用QIAseq FastSelect RNA Removal Kit（Qiagen，Hilden，Germany）去除核糖体RNA。根据制造商的说明，使用QIAseq Stranded mRNA Library Kit（Qiagen，Hilden，Germany）制备每个样品的RNA，用于测序。使用NextSeq 500/550 Mid OutputKit v2.5（Illumina，San Diego，CA，USA）在NextSeq 150平台上进行2个循环（75 × 550 bp双端）的归一化文库合并和测序，每个样本产生5-16万个双端读长深度。使用Trimmomatic[49]对读数进行修整和滤波，并将读数与E对齐。使用 RSEM [61] 和 Bowtie15 [2022] 软件进行溶组织转录组（AmoebaDB，第 50 版，2 年 51 月 2 日）。使用DEseq52测试差异表达，以对原始数据进行归一化[<>]。
运动性的测定
实验前24小时，2.5x105将滋养体接种到T25培养瓶（Sarstedt，Nümbrecht，Germany）中。对于金属肽酶转染剂，使用三个生物学重复，并使用 Evos FL Auto 显微镜 （Thermo Fisher Scientific） 确定每个 20 个变形虫的运动速度。对于 Eh127 转染子，使用了两个生物学重复，并确定了每个 15 个变形虫的运动。录制视频 10 分钟（每 5 秒一帧）。使用 ImageJ 版本 2.0.0-rc-43/1.51d 对变形虫进行手动跟踪，并带有用于手动跟踪和趋化性的插件。
噬红细胞增多试验
用不完全的 TY-I-S-0 培养基（33 x g，200 分钟，10°C）洗涤待检查的人红细胞（汉堡-埃彭多夫大学医学中心血库捐赠的 4+ 型血）和待检查的滋养体两次。随后，2 x 108红细胞和 2 x 105将滋养体（比例为1000：1）加入到总体积为5μl不完全TY-I-S-400培养基的33ml管中。在 37°C 下孵育 30 分钟后，ddH 各 1 ml2加入O两次并孵育1 min以裂解非吞噬细胞化的红细胞。然后将细胞在400ml管中以4×g离心15分钟，并用NaPBS洗涤两次。然后裂解变形虫以释放吞噬红细胞的血红蛋白。为此，将1ml 1%Triton-X 100加入滋养体中。对于光度测量，将200μl裂解的滋养体移液到96孔板中，并在405nm处测量。每个对照的平均值定义为100%，测得的OD值以该值为参考。对于金属肽酶转染子，至少进行了六次生物学重复。对于 Eh127 转染子，至少进行了 <> 次生物学重复。
细胞病变活性的测定（单层破坏）
确定 E 的细胞病变活性。溶组织，1 x 105将肝细胞系HepG2（默克，达姆施塔特，德国）的细胞接种在实验前24小时的48孔板的孔中，并在37°C下在2ml HepG2细胞培养基（Advanced DMEM;Gibco，Thermo Fisher Scientific，Schwerte，Germany）补充 10% 胎牛血清 （FCS;摩羯座，汉堡，德国）和1x青霉素/链霉素（摩羯座），培养基在24小时后更换一次。48 h后，形成汇合的细胞单层。在实验前12小时将滋养体接种到T5.24培养瓶中，以便在第二天形成汇合的单层。在实验开始时，从HepG2细胞中取出HepG2细胞培养基，然后用NaPBS洗涤。为了对HepG2细胞进行染色，加入200μL NaPBS + 10μM荧光染料BCECF，AM（2'，7'-双-（2-羧乙基）-5-（和-6）-羧基荧光素，乙酰氧基甲酯）。将细胞在 37°C 下孵育 30 分钟。之后，除去BCECF/NaPBS，并用NaPBS（37°C）洗涤细胞两次。然后，1 × 105将500μl的滋养体加入到染色的HepG2细胞中。作为阴性对照，染色的HepG2细胞与500μlAdvanced DMEM培养基一起孵育，而作为阳性对照，染色的HepG2细胞用500μlDMEM + 1%Triton X-100裂解。然后将 24 孔板在 37°C 下孵育 1 小时。随后，将板置于冰上20分钟以溶解滋养体。用NaPBS（4°C）洗涤两次后，将1ml 1%Triton X-100 PBS移液到每个孔中以裂解HepG2细胞，并将板在37°C下孵育30分钟。 将150μl上清液移液到黑色96孔板（Greiner，Frickenhausen，Germany）中，将其以1400×g离心30秒并用荧光酶标仪（GENios， TECAN，Fornax Technologies GmbH，Uetikon am See，瑞士），吸光度为485 nm，发射波长为535 nm。阴性对照值设置为 100%。然后将样品的值与阴性对照相关。最后，从100%中减去结果，以确定滋养体从细胞层分离的细胞百分比。实验至少进行 3 次，一式三份。
半胱氨酸肽酶活性和底物凝胶电泳的测定
在实验开始前25小时将变形虫接种在T24细胞培养瓶中，以在第二天形成单层。为了制备用于测定半胱氨酸肽酶活性和底物凝胶电泳的变形虫提取物，将变形虫在液氮中裂解 3 次冻融循环，并在 12°C 下以 000,15 x g 沉降 4 分钟。 上清液用于相应的实验。根据制造商的说明，使用 Pierce BCA 蛋白质检测试剂盒 （Thermo Fisher Scientific） 测量蛋白质浓度。
在96孔板中测量半胱氨酸肽酶活性，最终体积为200μl（148μlCP测定缓冲液（0.1M KH2采购订单4，2mM EDTA，1mM DTT），2μl变形虫提取物和50μl合成肽Z-Arg-Arg-pNA（浓度400μM;Bachem， Bubendorf， Switzerland）作为底物。一个单位的酶活性定义为在1分钟内催化形成1mmol对硝基苯胺的酶量。对于金属肽酶转染子，实验至少重复进行六次，并使用非配对 t 检验确定显着性。对于过表达的转染子 A1NP型HP127型OE系列实验一式两份进行四次，沉默转染剂B2pHP127型四实验一式五次。
底物凝胶电泳如前所述进行[4,53]。简而言之，在与4.12%明胶共聚的0%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离1μg变形虫提取物。随后与 2.5% Triton X-100 孵育 1 小时，然后在 100°C 下与 4 mM 乙酸钠 （pH 5.1）、100% Triton X-20 和 3 mM DTT 孵育 37 小时。 用考马斯对凝胶进行染色，以可视化半胱氨酸肽酶活性。
溶血活性的测定
溶血活性测定按照Biller等人的描述进行。[3]. 对于测定，滋养体和红细胞以 1：2000 （1.25 x 105变形虫 2.5 x 108每ml NaPBS的红细胞），然后在37°C下孵育1小时。孵育后，沉淀细胞，并在分光光度计中测量上清液中释放的血红蛋白在530nm处。分别孵育的红细胞和滋养体用作阴性对照。确定 100% 血红蛋白释放，2.5x108将红细胞在1ml水中裂解。金属肽酶转染子至少进行三次，一式四份，过表达转染子A1两次NP型HP127型OE系列沉默转染子 B2 一式三份 <> 次pHP127型四.
生长速率的测定
为了确定生长速率，将每个变形虫细胞系的500个滋养体接种到24孔板上，并在24小时内每72小时计数一次细胞。实验一式三份进行四次。
统计学
数据以箱形图的形式显示，显示最小值、最大值、中位数和所有单独的测量点。首先检查数据的正态分布和方差的同质性。在正态分布的情况下，采用非配对t检验比较两组，采用普通单因素方差分析比较三组或多组。对于方差分析检验，将Bonferroni校正后的显著性阈值调整为每次比较的对照水平。如无正态分布，则采用Mann-Whitney检验比较两组，非参数方差分析检验采用三组或更多组。根据 Benjamini 和 Hochberg 进行多重比较测试。所有统计分析均使用 Prism 9，版本 9.3.1 （350），7 年 2021 月 <> 日进行。
蛋白质印迹
为了制备用于蛋白质印迹的变形虫提取物，用NaPBS洗涤滋养体两次，并通过在400°C下以2×g离心4分钟沉淀。 为了最大限度地减少蛋白水解，加入20μM反式环氧琥珀酰基-L-亮氨酰胺（4-胍基）丁（E64，Sigma-Aldrich，Merck，Taufkirchen，Germany）。裂解时，将滋养体在液氮中交替速冻4次。将裂解物在 40°C 下以 000,1 x g 离心 4 小时。 上清液含有PBS可溶性蛋白。将沉淀在冰冷的NaPBS中洗涤两次，并溶解在补充有1%Triton X-100的NaPBS中。在还原条件下，在50% SDS-PAGE凝胶上分离提取物（13 μg/泳道）。通过湿印迹技术将蛋白质转印到硝酸纤维素膜上，以 25 mM Tris-HCl、192 mM 甘氨酸、1.3 mM SDS、pH 8.3 和 20% 甲醇作为转印缓冲液。对于蛋白质印迹分析，使用1：1000稀释度的一抗c-myc一抗（Sigma-Aldrich）和1：5000稀释度的二抗小鼠辣根过氧化物酶（HRP）抗体（Sigma-Aldrich）。印迹是使用 GE Healthcare Amersham ECL Prime Western 印迹检测试剂（fisher scientific，Thermo Fisher Scientific，Schwerte，Germany）开发的。
免疫荧光分析
为了定位待分析的蛋白质，收获表达相应c-myc融合蛋白的转染子，用NaPBS洗涤1次，然后重悬于1ml NaPBS中。在400°C下以4×g离心5分钟后，弃去上清液，将细胞沉淀物重悬于1ml 4%多聚甲醛（PFA;Hatfield， PA， USA）在NaPBS中，并将滋养体在NaPBS / 30%PFA溶液中在滚动培养箱上室温育4分钟。该和所有后续培养步骤均在滚动培养箱上进行。在400×g离心3分钟后，弃去上清液，将滋养体重悬于500μlNaPBS / 0.05%皂苷（用于细胞膜的透化（Sigma-Aldrich，Merck，Taufkirchen，Germany）中，并孵育5分钟。在400×g离心3分钟后，弃去上清液，将滋养体重悬于500μl50μM氯化铵溶液中以阻断游离醛基团，并在室温下再孵育15分钟。随后用500μlNaPBS / 0.05%皂苷或500μlNaPBS（400×g，持续3分钟）进行两个洗涤步骤，并用10μlNaPBS / 500%FCS重悬孵育2分钟。在额外的洗涤步骤之后，在室温下与原代小鼠抗c-myc抗体（1μl，500：1，Sigma Aldrich）孵育100小时。此外，按照上述三个洗涤步骤进行。然后将细胞沉淀物在含有二荧光标记抗体（500：1，抗小鼠Alexa Fluor 400，Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany）的488μlNaPBS中在室温下再孵育1小时。
对于共定位，靶向含细胞质含铁的超氧化物歧化酶（SOD;稀释度为1：200;[54]）和抗兔Alexa Fluor 594抗体（稀释度1：400;Thermo Fisher Scientific，不来梅，德国）和靶向 α-Gal/GalNAc 凝集素的抗体（稀释度 1：200;[55]）和抗兔Alexa Fluor 594抗体（稀释度1：400）。再次洗涤滋养体三次后，用Hoechst-33342（1：400;Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany）在室温下用 500 μl NaPBS 稀释 10 分钟。在最后的洗涤步骤后，将滋养体重悬于50μlNaPBS中，并可在4°C下避光储存直至分析。作为每个实验的对照，未转染的 A1NP型或 B2p滋养体与抗 Myc 抗体和二荧光抗小鼠 Alexa Fluor 488 标记抗体在相同条件下与转染子相同的条件下孵育。使用蔡司Axio Imager M2显微镜和奥林巴斯FluoView1000共聚焦显微镜进行显微镜检查。
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不同 E 中显着差异表达基因的热图（> 1.8 倍，p调整< 0.05）。与相应的对照相比，溶组织性转染子沉默或过表达 EHMP8-1、EHMP8-2 或两者兼而有之。
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S1 图。 不同 E 中显着差异表达基因的热图（> 1.8 倍，p调整< 0.05）。与相应的对照相比，溶组织性转染子沉默或过表达 EHMP8-1、EHMP8-2 或两者兼而有之。
最多显示 50 个倍数变化最大的基因。答：答1NP型与 A1NP型MP8-1格式四， B. A1NP型与 A1NP型MP8-2格式四，C.A1NP型与 A1npMP8-1+2型四，D.B2p与 B2pMP8-1格式四.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s001
（TIF）
S2 图。 免疫荧光分析：α-myc抗体的对照。
为确保 α-myc 抗体不会导致非特异性信号，对克隆 B2p 的野生型变形虫进行有皂苷和无皂苷处理，并用 ?-c-myc 一抗 （1：200） 和α小鼠 Alexa Fluor 488（1：400，绿色）染色。细胞核用 Hoechst 染料（蓝色）染色。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s002
（TIF）
S3 图。 不同 E 中显着差异表达基因的热图（> 1.8 倍，p调整< 0.05）。与相应的对照相比，溶组织性转染子沉默或过表达 EHMP8-1、EHMP8-2 或两者兼而有之。
最多显示 50 个倍数变化最大的基因。答：答1NP型与 A1NP型MP8-1格式四， B. A1NP型与 A1NP型MP8-2格式四，C.A1NP型与 A1NP型MP8-1+2格式四，D.B2p与 B2pMP8-1格式四.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s003
（TIF）
S4 图。 免疫荧光分析（IFA）：固定对照。
收获和洗涤后，将滋养体用4%多聚甲醛在室温下固定30分钟，然后将一半的滋养体重悬于0.05%皂苷（用于细胞膜的透化）中，孵育5分钟，并用50μM氯化铵溶液处理以封闭游离醛基团。然后用2%FCS封闭滋养体±用皂苷（-皂苷;+皂苷）处理，然后与一代小鼠α-c-myc抗体（1：1）和荧光标记的二抗（100：1，抗小鼠Alexa Fluor 400）在室温下再孵育488小时。对于共定位，靶向 α-Gal/GalNAc 凝集素的抗体（稀释度 1：1;[200]）和抗兔Alexa Fluor 55抗体（稀释度594：1）。用 Hoechst-400（33342：1 稀释）孵育细胞核。A. A400的IFA分析NP型MP8-1格式米克滋养体。B. A1的IFA分析NP型MP8-2格式米克滋养体。C. A1的IFA分析NP型MP8-2格式米克滋养体;与表面定位的Gal/GalNAc凝集素共定位。D B2的IFA分析pEHHP127型米克滋养体;与表面定位的Gal/GalNAc凝集素共定位。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s004
（TIF）
S1 表。 克隆 A1 的 RNAseq 分析NP型和 A1NP型MP8-1格式四沉默转染剂。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s005
（XLSX）
S2 表。 克隆 A1 的 RNAseq 分析NP型和 A1NP型MP8-2格式四沉默转染剂。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s006
（XLSX）
S3 表。 克隆 A1 的 RNAseq 分析NP型和 A1NP型MP8-1+2格式四沉默转染剂。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s007
（XLSX）
S4 表。 A1 之间比较的差异表达基因的 GO 术语分析（GO-BP、GO-MF、GO-CC）NP型和 A1npMP8-1四沉默转染剂。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s008
（XLSX）
S5 表。 A1 之间比较的差异表达基因的 GO 术语分析（GO-BP、GO-MF、GO-CC）NP型和 A1npMP8-2四沉默转染剂。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s009
（XLSX）
S6 表。 A1 之间比较的差异表达基因的 GO 术语分析（GO-BP、GO-MF、GO-CC）NP型和 A1NP型MP8-1+2格式四沉默转染剂。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s010
（XLSX）
S7 表。 克隆 B2 的 RNAseq 分析p和 B2pMP8-1格式四沉默转染剂。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s011
（XLSX）
S8 表。 各种利什曼溶菌素和侵袭溶菌素与EhMP8-1和EhMP8-2的氨基酸序列比较。显示以 % 为单位的标识。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s012
（TIF）
S9 表。 克隆 B2 的 RNAseq 分析p和 B2pEHHP127型四沉默转染剂。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s013
（XLSX）
S10 表。 A1的RNAseq分析NP型pNC 和 A1NP型HP127型OE系列转染剂。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s014
（XLSX）
S11 表。 A1 之间比较的差异表达基因的 GO 术语分析（GO-BP、GO-MF、GO-CC）NP型pNC 和 A1NP型HP127型OE系列转染剂。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s015
（XLSX）
S12 表。 用于qRT-PCR和pNC-GOI生成的寡核苷酸米克.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s016
（文件）
S1棱镜。 图1A和1B的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s017
（PZFX）
S2棱镜。 图5A–5C的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s018
（PZFX）
S3棱镜。 图 5D–5F 的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s019
（PZFX）
S4棱镜。 图6A–6C的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s020
（PZFX）
S5棱镜。 图 6D–6F 的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s021
（PZFX）
S6棱镜。 图 7A 的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s022
（PZFX）
S7棱镜。 图7B和7C的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s023
（PZFX）
S8棱镜。 图7E和7F的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s024
（PZFX）
S9棱镜。 图10A和10B的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s025
（PZFX）
S10棱镜。 图10C和10D的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s026
（PZFX）
S11棱镜。 图10E和10F的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s027
（PZFX）
S12棱镜。 图10G和10H的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s028
（PZFX）
S13棱镜。 图 10I 和 10J 的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011745.s029
（PZFX）
引用
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2.Biller L、Davis PH、Tillack M、Matthiesen J、Lotter H、Stanley SL Jr. 等。两种遗传相关的溶组织内阿米巴细胞系的转录组特征的差异，这些细胞系来源于具有不同致病特性的同一分离株。BMC 基因组学。2010;11:63.PMID：20102605。
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