免费医学论文发表-真菌RNA依赖性RNA聚合酶是植物感染和跨界RNA干扰的新参与者

抽象

小RNA充当真菌病原体效应子，使宿主靶基因沉默以促进感染，这是一种称为跨界RNA干扰（RNAi）的毒力机制。跨界小RNA生产的基本致病因子在很大程度上是未知的。我们在这里表征了真菌植物病原体灰霉菌中的 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 （RDR）1，这是致病性和跨界 RNAi 所必需的。灰芽孢杆菌 bcrdr1 敲除 （ko） 突变体表现出致病性降低和跨界小 RNA 丢失。我们开发了一种“开启”GFP报告基因，用于实时研究活植物组织中的跨界RNAi，这突出了bcrdr1 ko突变体在跨界RNAi中受到损害。此外，通过在转基因拟南芥中表达短串联靶标模拟RNA来阻断七种病原体跨界小RNA，导致真菌病原体B的感染水平降低。cinerea 和卵菌病原体 Hyaloperonospora arabidopsidis。这些结果表明，跨界RNAi对促进宿主感染具有重要意义，使病原体小RNA成为作物保护的有效靶标。

作者摘要

灰霉病是一种臭名昭著的植物病原体，只有化学杀菌剂才能有效控制。为了减少杀菌剂的使用，需要新的控制策略。跨界RNA干扰（RNAi）是植物病原体研究中的一个新兴领域。揭示跨界RNAi分子机制和功能的关键因素是开发基于RNA的创新作物保护策略的基础。灰芽孢杆菌产生细胞外小RNA，在植物宿主中诱导天然跨界RNAi进行感染。在这项研究中，我们描述了 B。孢BcRDR1 是小 RNA 生产和跨界 RNAi 所需的新型致病因子。通过建立先进的基于GFP的开启报告基因表达的转基因植物，我们可以可视化和记录感染过程中跨界RNAi的动态。我们将这些新获得的信息转化为设计病原体小RNA特异性靶标模拟物，即所谓的短串联靶标模拟物，以在转基因植物中表达，从而降低疾病的严重程度。我们的研究不仅扩展了对跨界RNAi分子功能的认识，而且还展示了这些获得的知识如何有助于干扰病原体跨界RNAi，从而更好地控制病原体。

数字

Fig 4Fig 5图1图2图3Fig 4Fig 5图1图2图3

引文： Cheng A-P， Lederer B， Oberkofler L， Huang L， Johnson NR， Platten F， et al. （2023） 真菌 RNA 依赖性 RNA 聚合酶是植物感染和跨界 RNA 干扰的新参与者。PLoS 病理学 19（12）： e1011885 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885

编辑 器： Eva H. Stukenbrock， CAU： Christian-Albrechts-Universitat zu Kiel， 德国

收到： 5年2023月5日;接受： 2023年20月2023日;发表： <>月 <>， <>

版权所有： ? 2023 Cheng et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 测序数据已存放在 NCBI SRA （BioProject ID PRJNA978613） 中。

资金： AW从德国研究基金会（DFG，www.dfg.de）获得了这项研究的资助，资助奖号。WE5707/2-1 作为研究单元的一部分FOR5116。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿的呈现中没有发挥任何作用。

利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。

介绍

RNA 依赖性 RNA 聚合酶 （RdRPs， RDR） 从初级 RNA 模板合成互补 RNA 链，无需任何游离 DNA 或 RNA 引物。已经描述了两类 RdRP/RDR。病毒型 RdRP 在病毒复制中得到了很好的表征，并且也被发现是逆转录转座子基因组的一部分。病毒型RdRP是治愈COVID-19和其他病毒感染的有希望的治疗靶点[1]。细胞型RDR在包括植物、动物和真菌在内的几个真核生物界中是保守的，并且在RNA干扰（RNAi）通路中起作用[2,3]。RDR 为 DICER 或一级和二级小干扰 （si） RNA 的 Dicer 样 （DCL） 依赖性生物发生产生双链 RNA 前体，这些 RNA 加载到 Argonaute （AGO） 蛋白中并形成 RNA 诱导的沉默复合物 （RISC），诱导转录或转录后基因沉默。

在模式植物拟南芥中，RDR2从DNA聚合酶IV依赖性RNA转录物合成双链RNA（dsRNA），其启动小RNA定向DNA甲基化（RdDM）。RDR2和RdDM通路主要负责转座子的转录调控，并参与转基因诱导的基因沉默[4]。A.拟南素RDR6 是产生二级 siRNA 所必需的，二级 siRNA 是一种扩增环，可促进 RNA 病毒和转基因的基因沉默，以及控制内源性基因表达。植物RDR2和RDR6都参与分子胁迫反应和对各种植物病原体的防御，包括病毒、细菌、真菌和卵菌[5,6]。

RNAi和真菌中各种小RNA的生物发生也需要RDRs[7]。在真菌 Neurospora crassa 中阐明了两种不同的 RDR 依赖性 RNAi 通路。RDR QDE-1 是淬灭途径的一部分，淬灭途径是一种控制转基因诱导基因沉默的 RNAi 机制。第二个 N。克拉萨RDR（SAD-1）产生dsRNA来诱导未配对DNA（MSUD）的减数分裂沉默，从而控制减数分裂后期异常RNA的积累[2]。转基因诱导的基因沉默的启动和扩增需要两种不同的基底真菌毛霉环状体RDR[8]。与植物一样，寄生虫（Cryphonectria parasitica）物种中的真菌RDR在抗病毒防御和转座子沉默中起作用[9];然而，在真菌中尚未发现植物中已知的 RdDM 途径。此外，RDRs已被提出用于调节影响真菌生长和发育的基因，但对真菌RDRs在致病性中的功能作用知之甚少。稻瘟病真菌米稻大叶中MoRdRP1的敲除导致水稻叶片生长、分生孢子形成和疾病症状减少[10]。同样，根除头枯病的fgrdrp2、fgrdrp3和fgrdrp4敲除菌株诱导真菌病原体禾谷镰刀菌表明，接种的小麦穗分生孢子、霉菌毒素产生和头枯病减少[11]。 虽然这些报告表明不同的真菌RDRs参与致病性，但其作用方式仍不清楚。

在这项研究中，我们研究了 BcRDR1 基因在真菌灰霉病中的作用，灰霉病是一种多宿主植物病原体，感染了 1,000 多种不同的植物物种并导致毁灭性的灰霉病。作为其致病性的一部分，B.cinerea 释放细胞外小 RNA（Bc-sRNA），在感染期间进入植物细胞，并募集植物自身的 AGO1/RISC 诱导宿主基因沉默以促进感染 [12,13]。这种毒力现象被称为跨界RNAi，是多种动植物病原微生物以及共生微生物（包括真菌、卵菌和细菌）的一般感染策略[14\u16]。大多数诱导跨界RNAi的Bc-sRNA由GYPSY类长末端重复逆转录转座子编码，并由B产生。孢BcDCL1和BcDCL2[13,15,17]。我们在这里发现，B.孢BcRDR1 是一种致病因子，是 B 所必需的。cinerea诱导的跨界RNAi。

结果

灰芽孢杆菌 BcRDR1 是一种致病因子

为了鉴定参与跨界RNAi的未知基因，我们分析了B中的BcRDR家族。西内雷亚。通过与 N 的同源性搜索。克拉萨RDR，SAD-1，我们在 B 的基因组中鉴定了三个编码保守 RDR 的基因。cinerea 菌株 B05.10，此后命名为 BcRDR1 （Bcin01g01810）、BcRDR2 （Bcin08g02220） 和 BcRDR3 （Bcin07g01750）。全长氨基酸序列的系统发育分析表明，BcRDR1是N的直系同源物。克拉萨SAD-1参与MSUD[18]，BcRDR2是N的直系同源物。crassa quelling RDR， QDE-1 [19]。BcRDR3 是另一种功能未知的保守 RDR（S1A 图）。所有三种 BcRDR 都包含一个保守的 DxDGD 基序，表明它们具有 RNA 聚合酶的功能（S1B 图）。我们在培养 B 时检测到 BcRDR1、BcRDR2 和 BcRDR3 的转录本。 液体培养或番茄叶感染期间的cinerea;然而，在感染期间测量的任何 BcRDR都没有一致的上调（S2 图）。

为了研究 B.Cinerea 致病性，我们通过同源重组产生靶向基因敲除 （KO） 突变株。我们分离了两个独立的 bcrdr1 ko 和两个独立的 bcrdr2 ko 分离株（S3 图），而在尝试生成 bcrdr3 ko 突变体时，我们只获得了杂合分离株。因此，我们继续分析 bcrdr1 和 bcrdr2 ko 突变体。使用分离的 S 进行感染检测。lycopersicum 或 A.芥叶片显示，与B相比，BCRDR1 KO突变体诱导的病变尺寸更小。cinerea 野生型 （WT） 菌株（图 1A 和 1B）。这种表型伴随着较低的真菌生物量，如B的定量所估计的那样。cinerea 基因组 DNA 和 bcrdr1 ko 背景中的遗传互补 BcRDR1 （cBcRDR1） 菌株恢复到完全毒力（图 1C 和 S4）。bcrdr1 ko突变体和cBcRDR1菌株在无轴培养条件下均表现出WT样生长发育表型（图1A和S5）。bcrdr1 ko突变体在其他已知毒力基因的表达中不受影响[20]（S6图）。基于这些结果，我们得出结论，BcRDR1是B的致病因子。cinerea，可能与Bc-sRNAs有关。

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图 1. B. cinerea bcrdr1 ko 突变体在致病性方面受到损害。A） S上的感染系列。lycopersicum 或 A.拟南芥分离的叶子使用B。孢WT、两个 bcrdr1 ko 突变体 #2 和 #4、两个 bcrdr2 ko 突变体 #1 和 #2，以及两个 cBcRDR1 互补菌株 #1 和 #2。

对于每个菌株，20μl滴5 x 104/ml 或 2 x 105/ml分生孢子悬浮液置于S上。lycopersicum 或 A.分别是拟南芥的叶子。B） B诱导的病变大小。S 的 cinerea 感染测量值为 48 hpi。石蒜或 60 hpi 用于 A。拟南。S 上有 30 个病变。石蒜和 A 上的 10 个病变。测量拟南星，并使用方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 0.05。比例尺表示 1 厘米。 C） B。通过使用 Bc-微管蛋白 （BcTub）A 引物测量基因组 DNA 来估计 cinerea 生物量，并与使用 SlActin2 或 AtActin2 引物测量的植物基因组 DNA 相关，在 0 或 05 次生物学重复中测量。使用方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 1.<>。比例尺表示 <> 厘米。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.g001

逆转录转座子衍生的 Bc-sRNA 的生物发生需要 BcRDR1

一些植物、线虫和真菌 RDR 是 siRNA 生物发生所必需的，并消除了 B 中 Bc-sRNA 的产生。Cinerea BCDCL1DCL2 KO突变体由于跨界RNAi受损导致致病性降低[13]。为了研究 BcRDR1 在 Bc-sRNA 生物发生中的作用，我们进行了比较小的 RNA-seq 分析。将灰芽孢杆菌WT和1个独立的bcrdr1 ko突变体在液体培养基中培养3 d，收集菌丝体提取总RNA。通过PAGE分离小RNA后，克隆RNA文库用于Illumina测序。总的来说，小RNA文库的测序深度在4.9-1.2百万的范围内，这些文库被定位到B。Cinerea 参考基因组要么是唯一的，要么是多次的，因为同一读数映射到多个染色体区域。在两个bcrdr21 ko突变体中，多个映射reads的比例都减少了（图22A）。按大小绘制读长数显示，在两个 bcrdr1 ko 突变体中，5-2 个核苷酸 （nt） 长的 Bc-sRNA 减少，主要代表 2'prime 尿嘧啶核碱基、逆转录转座子 （RT） 衍生的 Bc-sRNA（图 7B-1D 和 S3）。该结果表明，主要定位于RT的Bc-sRNA的产生依赖于BcRDR17。长末端重复RT BcGypsy1先前被发现是植物侵染期间诱导的Bc-sRNAs的主要来源，并且是B的致病因子。Cinerea [3]。因此，BCRDR7 ko 突变体中 RT 衍生的 Bc-sRNA 积累减少导致 BcGypsy1 的 mRNA 水平增加（S7C 图），并且仅在番茄感染期间用 B 测量 BcGypsy mRNA 的上调。孢WT，但与 bcrdr7 ko 突变体无关（S1D–S<>E 图），这表明 BcRDR<> 在 RT 转录后沉默中的潜在作用。

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图 2. B的小RNA测序分析。孢WT 和 bcrdr1 ko 突变体。

A） Bc-sRNA 的分数唯一或多次映射到 B。Cinerea 参考基因组。B） 以百万分之一 （RPM） 为单位的定位 Bc-sRNA 读数的 Bc-sRNA 大小谱 （18–40 nt）。C） 四个 RNA 核苷酸 C、U、A、G 在 Bc-sRNA 的 5' 主要位置的百分比分布。D） 映射到不同 B 的 Bc-sRNA 百分比分布。孢RNA 基因位点：核糖体 RNA （rRNA）、转移 RNA （tRNA）、小核和核仁 RNA （sn（o）RNA）、信使 RNA （mRNA） 和逆转录转座子 （RT）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.g002

B. cinerea bcrdr1 ko 突变体在跨界 RNAi 中受损

先前发现RT来源的Bc-sRNA可诱导跨界RNAi[13,17]。特别是，四种 Bc-sRNA、Bc-sRNA3.1、Bc-sRNA3.2、Bc-sRNA5 和 Bc-sRNA20 诱导了 S 的沉默。石蒜宿主基因液泡分选蛋白（SlVPS）（Solyc09g014790）、丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（SlMPKKK）4（Solyc08g081210）和C2H2锌指转录因子SlBhlh63（Solyc03g120530）和A。拟南芥宿主基因丝裂原活化蛋白激酶 （AtMPK）1 （AT1G10210）、AtMPK2 （AT1G59580）、细胞壁激酶 （WAK） （AT5G50290） 和过氧化物还蛋白 PRXIIF （AT3G06050） （图 3A）。我们证实 bcrdr1 ko 突变体失去了这些 Bc-sRNA 的积累，而它们在 B 中产生。孢通过茎环逆转录酶PCR显示番茄感染期间的WT和cBcRDR1菌株（图3B和S8）。接种S时。lycopersicum 或 A.拟南芥与B。孢WT或bcrdr1 ko突变体，与未接种的植物相比，我们观察到WT感染植物中Bc-sRNA靶基因的显着下调。在bcrdr1感染的植物中，靶基因下调被消除或强度降低（图3C和S9）。成功感染植物并诱导宿主防御反应由B引起。通过测量 S 的上调来验证 cinerea 感染。石蒜蛋白酶抑制剂 （SlPI）-I 和 SlPI-II 或 A。拟南芥植物防御素 （AtPDF）1.2个免疫基因（图3D）。这些结果表明，bcrdr1突变体可能在诱导跨界RNAi方面受到损害，这可以解释在S中观察到的致病性降低。lycopersicum 和 A.拟南。

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图 3. B. cinerea bcrdr1 ko突变体在植物靶基因抑制中受到损害。

A） 已知 S.lycopersicum 和 A.拟南芥靶基因通过跨界RNAi被Bc-sRNA沉默。B）对感染B的番茄叶样品进行Bc-sRNAs的茎环逆转录酶PCR。孢WT、bcrdr1 ko 突变体或 cBcRDR1 菌株在 48 hpi 时。用 20 ml 滴 5 x 10 的番茄叶接种4/ml 分生孢子悬浮液。BcTubA mRNA表达作为内控。C） 定量逆转录酶 PCR 测量 S 中 Bc-sRNA 靶基因的 mRNA 水平。lycopersicum 和 A.B感染期间的拟南芥。孢WT 或 bcrdr1 ko 突变体。D） 定量逆转录酶 PCR 测量免疫标志物基因 SlPI-I、SlPI-II 和 AtPDF1 的 mRNA 水平。 2. 在 C） 和 D） 中。用 20 μl 滴 5 x 10 的石蒜叶接种4/ml分生孢子悬浮液和样品在36 hpi下收集。将拟南芥叶接种20μl滴2×105/ml分生孢子悬浮液和样品在60 hpi下收集。散点图中的线表示均值和标准差。每个基因在至少四个生物学重复中测量。将 SlActin2 或 AtActin2 用作参考基因。使用方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.g003

为了进一步检验 bcrdr1 突变株在诱导跨界 RNAi 方面是否确实受到损害，我们设计了一种 GFP“开启”跨界 RNAi 报告基因，该报告基因专门响应 Bc-sRNA3.1 和 Bc-sRNA3.2 从 B 的易位。cinerea 进入植物寄主（图 4A）。在该报告基因构建体中，CRISPR 型 RNA 核酸内切酶 Csy4 [21] 与 GFP 版本共表达，GFP 版本在其 N 末端与 Csy4 识别基序融合，以适应先前设计的用于 A 卵菌病原体的跨界 RNAi 报告基因。拟南芥，Hyaloperonospora arabidopsidis [22]。在这个改编版本中，我们将 Bc-siRNA3.1 和 Bc-siR3.2 的天然靶位点分别融合到 Csy5 转基因的 3'prime 或 4' 末端，将 Csy4 转化为这些 Bc-sRNA 的靶基因。Csy4 不断抑制 GFP 的表达，除非当 Bc-sRNA 沉默 Csy4 时 GFP 表达被激活。该GFP开启报告基因在转基因A中稳定表达。拟南芥植物。有了这些报告植物，我们能够可视化B。通过荧光显微镜在感染的叶组织中诱导的跨界RNAi。用B接种报告植物的幼苗叶片。孢与接种 bcrdr1 #2 ko 突变体或用水处理的叶片相比，WT 分生孢子悬浮液导致 GFP 表达增强（图 4B 和 S10）。非侵入性GFP开启报告基因使我们能够通过终生成像来定量跨界RNAi。我们记录了接种B的报告植物中GFP活性的延时视频。孢WT 或 bcrdr1 ko #2 45 小时（S1 视频）。GFP信号在B中明显增加。孢WT感染的叶子在24 hpi后（图4C和S10）。该信号与植物自发荧光无关，因为在B中没有检测到GFP信号。孢WT 感染的 A.拟南素WT植物（S11图）。我们验证了使用抗GFP抗体通过定量逆转录酶PCR和蛋白质印迹分析测量GFP mRNA和GFP蛋白水平时通过荧光显微镜获得的结果（图4D和4E）。使用成虫A的莲座叶。在三个独立的感染系列中，我们确认了感染 B 后 GFP 信号的激活。孢WT，但不接种两个 bcrdr1 ko #2 和 #4 突变体的叶片，或者当感染先前表征的 bcdcl1/bcdcl2 双敲除 （bcdcl1/2） 突变株时（S12 图）。bcdcl1/2突变体不能产生报告基因激活的Bc-sRNA [13]。GFP 激活对 B 具有特异性。cinerea 感染，因为感染了 A 的卵菌病原体。拟南芥，Hyaloperonospora arabidopsidis，没有打开GFP报告基因（图S13和S14）。

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图 4. B. cinerea bcrdr1 ko 突变体在跨界 RNAi 中受损。

A） 适用于植物表达的基于 GFP 的开启跨界 RNAi 报告基因的示意图概述。B） 来自 B 的荧光显微镜图像。孢WT、bcrdr1#2或水处理GFP报告植株幼苗在不同时间点。5 μl 5 x 10 的液滴5将/ml分生孢子悬浮液置于叶片的中心，然后在顶部放置玻璃覆盖玻片，将分生孢子悬浮液分散在整个叶片表面上。比例尺代表 1 毫米。 C） WT 和 bcrdr1 ko #2 感染的幼苗叶片或水处理叶片的 GFP 定量为 6-51 hpi。对于归一化，GFP荧光信号强度在不同时间点（It）减去初始GFP信号强度（I0).D） B期间跨界RNAi报告植物中相对GFP mRNA表达的定量逆转录酶PCR分析。Cinerea 感染。AtActin2 用作参考基因。使用方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 0.05。“-”符号代表经过水处理的叶子。E） B期间跨界RNAi报告植物中GFP表达的蛋白质印迹分析。使用@GFP抗体的 Cinerea 感染。考马斯亮蓝（CBB）染色检测的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCo）信号作为上样对照。数字表示FIJI软件估计的GFP和RuBisCo信号强度。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.g004

参考本研究的早期，我们观察到由于毒力降低，bcrdr1突变体在感染期间产生的生物量较少（图1C）。为了排除减少的 B.在接种跨界RNAi报告植物时，cinerea bcrdr1生物量可能导致较低的GFP活性，与B相比，我们使用的分生孢子悬浮液高10倍。孢WT接种发现，随着分生孢子浓度的增加，bcrdr1 ko的GFP活性仍然显著降低（S15图）。有趣的是，GFP活性在B感染前沿和感染前沿以外最强。cinerea （S15 和 S16 图）。这可能表明跨界RNAi在新感染的叶细胞中最强，并可能扩散到未感染的植物细胞层中。

灰芽孢杆菌小RNA易位到植物中促进感染

几项独立研究表明，DCLs的敲除或敲低导致B的Bc-sRNA生物发生丧失和致病性降低。灰尾草和其他真菌病原体[11,13,23–29]。在这里，我们证明了敲除 BcRDR1 会导致 Bc-sRNA 产生丢失，损害跨界 RNAi 并降低致病性。然而，BcRDR1缺失可能影响了真菌中与感染相关的其他内源性小RNA调节过程[30]。因此，我们旨在进一步验证跨界RNAi是B的一部分。Cinerea 致病性。产生小RNA海绵的转基因，例如RNA短串联靶标模拟物（STTM），可以阻断microRNA和siRNA诱导的植物内源性和外源性靶基因的沉默[22,31]。 我们克隆了 Bc-siRNA3.2/Bc-sRNA5 双 STTM（图 5A）并将其转化为 A。拟南芥用于稳定表达。我们可以分离出三个独立的 A。拟南素STTM T2 线并用 B 感染这些线。 Bc-sRNAs STTM植株表现出B诱导的病变大小减小。cinerea，与 A 相比。拟南素WT 或转基因 A。表达无义RNA-STTM的拟南星系（图5B和S17A）。一致地，Bc-sRNA3.2 和 Bc-sRNA5 靶基因位于 A 中。拟南芥、AtMPK1、AtMPK2 和 AtWAK 在 A 中被抑制。 拟南素WT 或 A。拟南芥在 B 上表达无义的 RNA STTM。cinerea 感染，但在 Bc-sRNA STTM 植物系中消除了对这些宿主靶基因的抑制（图 5C 和 S17B）。成功感染所有植物品系导致由B诱导的宿主防御反应。cinerea 感染，通过测量的 A 上调来验证。拟南芥免疫相关基因 AtBAK1 和 AtPDF1。2.这些结果证实了跨界RNAi是B的重要组成部分。Cinerea 致病性。

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图 5. 表达 Bc-sRNA STTM 的植物阻断跨界 RNAi 并减少 B。Cinerea 致病性。

A） STTM 构建体在植物中阻断 Bc-sRNA3.2 和 Bc-sRNA5 的示意图概述。B） A.使用20μl滴2 x 10的拟南芥分离叶接种测定5/ml分生孢子悬浮液B。孢WT，将三个独立的 Bc-sRNA STTM T2 植物系（#3、#4、#6）与 A 进行比较。拟南素WT 和无意义的 STTM T2 工厂生产线作为阴性对照。在 60 hpi 时测量病变大小，使用方差分析对每个植物品系至少 15 个病变进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 0.05。比例尺代表 1 厘米。 C） 定量逆转录酶 PCR 测量 A 中 Bc-sRNA 靶基因的 mRNA 水平。拟南芥 AtMPK1、AtMPK2 和 AtWAK 比较 B 期间的 STTM 系和 WT。 在 48 hpi 下 WT 植物（红点）或表达 STTM 的植物（蓝点）的 cinerea 感染。散点图中的线表示均值和标准差。每个基因至少在五个生物学重复中测量。At-肌动蛋白被用作参考基因。AtBAK1 和 AtPDF1。2个被测定为植物免疫标记基因诱导的B期。Cinerea 感染。使用方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.g005

我们之前发现，在 A 中表达三重 STTM。芥芥阻断卵菌病原体Hyaloperonospora arabidopsidis的小RNA导致疾病水平降低[22]。我们假设，将不同类型病原体和寄生虫小RNA的结合位点结合起来，这些RNA已知可以诱导跨界RNAi，可能会产生一种多病原体抗性植物基因型。我们设计了一个“主”STTM 来阻断两个 B。孢Bc-sRNA3.2 和 Bc-siRNA5，两个 H.拟南花形小RNA、Hpa-sRNA2和Hpa-sRNA90[22]，以及两种Cuscuta campestris ccm-miR12497b和ccm-miR12480 [32]和致染疫霉Pi-miRNA8788[33]。拟南芥主STTM植株生长发育正常，未出现任何多效性缺陷（S18图）。我们用 B 接种了三个独立的 T2 主 STTM 植物系。发现所有转基因品系都表现出减小的真菌病变大小（S17A和S17B图）和植物靶基因去抑制（S17C图），证实了我们用Bc-sRNA STTM植物获得的结果。有趣的是，当接种卵菌H时，STTM主植物也显示出疾病水平降低。拟南花芋（S17E图）。根据 AtPR1 或 AtPFD1 的非诱导表达，感染的减少并不是由于植物免疫力的不断增强。2 在未处理的植物中（S17D 图）。此外，用细菌病原体丁香假单胞菌 DC3000 接种 Bc-sRNA 或主 STTM 植物系不会导致细菌菌落数量减少（S17F 图）。基于这些观察结果，我们提出STTMs可能是未来针对病原体小RNA的应用，以设计多病原体抗性植物。

讨论

在这项研究中，我们证明了 BcRDR1 是真菌植物病原体 B 中跨界 RNAi 所需的致病因子。西内雷亚。此前，BCDCL1/2突变体的致病性、Bc-sRNA生物发生和跨界RNAi均受损[13,26]。该 dcl1dcl2 ko 突变体在无轴培养物和植物叶片上表现出生长减少，转基因 A 中的异位 Bc-sRNA 表达可以部分补充。拟南[13]。通过宿主诱导的基因沉默或 RNA 喷雾诱导的基因沉默有效的 BcDCL1/BcDCL2 基因敲低足以降低 B。不同植物物种和组织上的灰脑病症状支持BcDCL在致病性中的功能作用[23,24,26]。最近，在ku1 ko背景下产生的bcdcl2dcl70 ko的影响存在争议，即在无轴培养中没有表现出任何生长缺陷，并且对植物叶片的致病性没有或仅轻度降低[34\u35]。本文表征的bcrdr1 ko突变体在无轴培养中生长时未表现出任何生长缺陷，但在植物侵染期间病变大小形成显着减少，在感染两种植物宿主物种S时，植物真菌生物量减少。lycopersicum 和 A.拟南。此外，bcrdr1 ko 突变体在激活转基因 A 中表达的 Bc-sRNAs 响应性跨界 RNAi 报告基因方面受损。拟南。此外，我们用进一步的证据证实了跨界RNAi在B中的重要性。使用 STTM 方法的 cinerea 致病性。通过 A 中的 STTM 表达阻断 Bc-sRNA。拟南芥导致B减少。Cinerea 病症状。类似的方法证明了跨界RNAi在卵菌病原体H中的相关性。拟南糖感染A。拟南芥[22]。

不同真菌植物病原体中的RDR敲除导致生长、发育和致病性的多效性缺陷。稻瘟病真菌M.oryzae 由三个名为 MoRDRP1-MoRDRP3 的 RDR 组成，MoRDRP1 是 BcRDR1 最接近的直系同源物。 分离出的mordrp1 ko突变体在水稻叶片上表现出生长、分生孢子形成和疾病症状的减少[10]。与 bcrdr1 不同，mordrp1 仅显示小 RNA 产生的适度变化，但 mordrp2 ko 在逆转录转座子和基因间衍生的 21-23 nt 小 RNA 产生中受到严重损害。 因此，MoRDRP1在致病性中的潜在作用方式仍然不明确。在头部枯萎病诱导真菌病原体F。禾谷虫鉴定出1个RDR，命名为FgRdRP5-FgRdRP11。两项独立研究报道了FgRdRP在真菌发育和致病性中的不同作用[36,36]。研究显示，fgrdrp ko突变体在感染开花麦穗时既没有改变黑星病症状，也没有改变番茄果实的腐烂症状，也没有在正常或非生物胁迫生长条件下出现营养发育缺陷[2]。相反，不同的fgrdrp ko突变体在无性和有性发育方面表现出改变。此外，在接种后3天用fgrdrp4、fgrdrp9和fgrdrp11 ko突变体感染小麦穗状细胞可减轻头枯病症状，这与病原体DNA含量和每种子干重霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇水平较低有关[2]。 FgRdRPs在小RNA生物发生中的作用尚未得到研究。不同真菌物种中RDR同源物的交替数量及其在小RNA生物发生和致病性中的不同作用表明真菌中RNAi组分的快速RDR新功能化。BcRDR3 和 BcRDR<> 在 B 中的未知作用。Cinerea 需要在未来的研究中进行调查。

已经多次观察到真菌和植物之间小RNA的运动[37]。在其他植物或动物相关真菌、卵菌和细菌微生物中也发现了跨界RNAi，用于病原体和共生体[14,16]。研究微生物RDRs是否在各种植物-微生物相互作用和跨界RNA通讯中发挥更广泛的作用，以及通过基于RNAi的作物保护策略的实际实施，将会很有趣。

材料与方法

真菌和植物材料及生长条件

本研究使用灰霉菌（Pers.： Fr.）菌株B05.10。在HA培养基（10 g/L麦芽提取物、4 g/L酵母提取物、4 g/L葡萄糖、15 g/L琼脂）上进行标准培养。在补充有 1 μg/mL 潮霉素 B （Carl Roth GmbH） 的 HA 培养基上生长 B. cinerea bcrdr1 ko 和 bcdcl2dcl70 ko 突变株。将真菌平板在室温下在生长室中长波长紫外光（EUROLITE;20 W）下孵育以刺激孢子形成。本研究中使用的番茄（Solanum lycopersicum （L.） cultivar Heinz）在24°C，16 h光照/8 h黑暗，60%湿度的条件下在生长柜中生长。拟南芥（L.）生态型Col-0在短日照条件下（10小时光照/14小时黑暗，22°C，60%相对湿度）生长，用于灰霉病感染。对于 H。拟南芥感染，拟南芥Col-0在长日照条件下（16小时光照/ 8小时黑暗，22°C，60%相对湿度）生长。转基因 T1 和 T2 A。在补充有卡那霉素（Carl Roth;1 μg/mL）的2/100 Murashige和Skoog（MS）培养基上选择拟南星品系。指出了独立的植物转化株系（例如，STTM #3）。

bcrdr ko 和 cBcRDR1 互补载体、植物 STTM 和跨界 RNAi 报告基因的克隆

如Binder等人所述，Golden Gate克隆策略用于按照指令克隆真菌基因ko和基因互补盒以及植物表达载体。[38]. 如前所述[31]，设计了STTM序列，并引入了具有BsaI识别位点的侧翼区域。先前设计的转基因 A。表达 STTM 的拟南虫系，随机序列为 H。在本研究中，拟南糖小RNA靶位点[22]被用作无义的STTM对照。

对于一个。如前所述，采用MWG Eurofins合成了拟南星报告系，并结合密码子优化在植物中的表达，组装了报告盒[4]。利用Bc-sRNA22.3靶基因AtPRXIIF的天然启动子来控制Csy1转基因的转录水平，以模拟天然的Bc-sRNA靶标表达。

真菌和植物转化

如前所述[39]，B. cinerea进行了转化，并进行了细微的修改。将转化的真菌原生质体与SH琼脂（0.6 M蔗糖，5 mM Tris-HCl（pH 6.5），1 mM（NH4）H2采购订单4，8 g/L 琼脂），不含任何抗生素，在黑暗中孵育 24 小时。预孵育后，向顶部加入含有潮霉素B（25μg/ ml）的第二层新鲜SH琼脂。将平板进一步在黑暗中孵育，直到分离出真菌转化体。对于一个。使用了先前描述的一种花浸法，即拟南转化[40]。

植物感染检测

对 4 至 5 周龄植株的脱落叶片进行 S. lycopersicum 致病性测定。将灰芽孢杆菌重悬于1%麦芽提取物中，终浓度为5×104分生孢子/毫升。用20μl分生孢子悬浮液接种石蒜叶，并接种在潮湿的塑料盒中。将分离的叶子放在潮湿的滤纸上，然后在密闭的塑料盒中孵育。对5周龄植株脱落叶片进行拟南芥致病性测定，接种2×105分生孢子/ml B.Cinerea 分生孢子重悬于 1% 麦芽提取物中。将15μl分生孢子悬浮液滴在每片叶子的中心，并接种在潮湿的塑料盒中。对受感染的叶片进行拍照，并使用Fiji软件（ImageJ 2.1.0/1.53c版）测量病变面积。

Hyaloperonospora arabidopsidis （G?UM.） 分离株 Noco2 保持在 A 上。拟南素Col-0 WT植物。2周龄植株接种10×<>4分生孢子/ML 悬浮液。将样品以 7 dpi 收集到 10 ml 无菌水中。使用双目显微镜对分离的子叶进行孢子囊数量计数。

丁香假单胞菌 pv.番茄在 3000°C 下用利福平在 LB 琼脂平板上划线 DC2 28 天。 将来自平板的单个菌落接种含利福平的 LB 液体培养基过夜。收获假单胞菌细胞并重悬于10mM MgCl中2含 0.04% Silwet L-77 并调整至外径600= 0.02。5 周大 A.向拟南芥植株喷洒假单胞菌悬浮液。以 3 dpi 收获样品，每株植物收集 4 个叶盘，然后在 10 mM MgCl 中匀浆2对于一个生物重复。用利福平在LB琼脂平板上进行连续稀释以计数菌落形成单位。

开启GFP跨界RNAi报告基因的显微分析

用于记录跨界RNAi报告植物中开启的GFP时间感染过程，3周龄A。将拟南芥幼苗培养在1/2 MS+10%蔗糖琼脂平板上，接种在<>x<>平板上5分生孢子/ml B.Cinerea 重悬于 1% 麦芽提取物培养基中，预孵育 1 小时。将预孵育的分生孢子悬浮液用无菌水洗涤两次，然后将5μl滴在每株幼苗一片叶子的中心。对于时程视频，使用了配备徕卡 DFC8 GT 相机的徕卡 DMi9000 雷霆成像仪，并对整个幼苗进行了成像。成像设置为分生孢子接种后 6 小时开始，并以 22.5 分钟的周期拍摄图像，总共 45 小时。使用徕卡LAS X显微镜软件处理原始成像数据。使用 Adobe Premiere Pro CC 版本 13.0 执行视频编辑。GFP荧光强度原始数据在给定时间点（It） 通过减去初始 GFP 强度 （I0).

为了记录成年报告植物中的GFP信号，从5周龄的A中分离出莲座叶。拟南芥植株接种2×105分生孢子/ml B.将分生孢子重悬于1%麦芽提取物中1小时。分生孢子悬浮液用无菌水洗涤，并将20μl滴在叶片上。GFP 信号和明场 （BF） 的单叶图像记录在配备徕卡 DFC6 GT 相机的徕卡 DM9000 B 正置显微镜上。

台盼蓝染色

如前所述，收集叶片样品并用台盼蓝溶液染色[41]。在CTR 450显微镜上使用DFC6000 CCD相机（徕卡）拍摄显微图像。

GUS染色

叶片样品用GUS染色液（0.5 mg/ml X-Gluc、100 mM 磷酸盐缓冲液pH 7.0、10 mM EDTA pH 7.0、1 mM K3[Fe（CN）6]、1 mM K4[Fe（CN）6]、0.1% Triton X-100）真空浸润，并在37°C下孵育过夜。 叶片用70%乙醇脱色过夜，并在CTR 450显微镜上的DFC6000 CCD相机（徕卡）下拍摄显微图像。

基因分型PCR

采用CTAB法，然后进行氯仿提取和异丙醇沉淀，从真菌菌丝体中提取DNA[42]。GoTaq G2聚合酶（Promega）用于使用S1表中所列的PCR引物对PCR进行基因分型。

定量PCR

对于真菌生物量定量，使用CTAB方法分离基因组DNA[43]。使用BcTubA引物（S1表）通过qPCR估计相对真菌生物量。使用AtActin2或SlActin2引物对原始数据进行归一化，以估计植物基因组DNA（S1表）。

对于基因表达分析，使用CTAB方法提取总RNA[44]。按照制造商的说明，通过DNase I（Sigma-Aldrich）处理去除基因组DNA。使用SuperScriptIII逆转录酶（ThermoFisher Scientific）将来自每个样品的1μg总RNA用于cDNA合成。使用Primaquant low ROX qPCR预混液（Steinbrenner，Laborsysteme）通过定量实时PCR测量基因组DNA数量和基因表达。使用2-ΔΔCt方法[45]。用于定量RT-PCR的引物列在S1表中，原始数据列在S3表中。

茎环逆转录PCR

如前所述，按照方案通过茎环逆转录酶PCR检测小RNA[46]。1 μg 总 RNA 用于小 RNA 特异性 RT 和 PCR。逆转录酶PCR产物在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后进行溴化乙锭染色。用于茎环逆转录酶PCR的引物列于S1表中。

小RNA测序

使用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳从总RNA提取物中分离小RNA。使用Next Small RNA Prep试剂盒（NEB）对分离的小RNA进行文库克隆，并在Illumina NextSeq 2000平台上进行测序。使用GALAXY Biostar服务器分析Illumina测序数据[47]。对原始数据进行多路复用解复用（Illumina Demultiplex，Galaxy版本1.0.0），并删除适配器序列（Clip适配器序列，Galaxy版本1.0.0）。序列原始数据存放在NCBI SRA服务器（BioProject ID PRJNA978613）。然后将读段映射到 B 的参考基因组组装。cinerea （ASM14353v4） 在端到端对齐模式下使用 BOWTIE2 算法（Galaxy 版本 2.3.4.2），无需设置 – k 或 – a 选项。为了将 Bc-sRNA 分配给不同类型的 RNA 编码基因，B.从Ensembl数据库下载了cinerea核糖体RNA、转移RNA、小核和核仁RNA以及mRNA。反转录转座子序列在先前的研究中被注释[17]。对总 B 的读数进行计数和归一化。cinerea 每百万次读取 （RPM）。

从上述 sRNA 比对中产生小 RNA 覆盖图，按比对链和读取长度分离覆盖率（分组读长 < 20 个，> 25 个核苷酸长）。覆盖率值表示每个读取位置上各个组的累积深度，按每百万次对齐的读取数 （RPM） 进行归一化。

RDR 同源性搜索

Neurospora crassa 克拉萨神经孢子虫QDE-1 和 SAD-1 氨基酸序列（S2 表）用于对 B 进行 Blastp 搜索。Uniprot中的cinerea菌株B05.10（分类群ID：332648）蛋白质参考数据库。使用 CLC Main Workbench（版本 20.0.4）对 RDR 活动站点进行对齐。

发展史

采用CLC Main Workbench（20.0.4版本）进行系统发育分析，并组成DNA序列标记。使用默认的多种比对算法对每个RDR的氨基酸序列进行比对。缺口开放成本设置为15.0，缺口扩展成本设置为1.0。系统发育树采用邻域连接算法，2000次重复引导。Kimura 蛋白质距离用于蛋白质距离测量。

数据绘图和统计分析

使用GraphPad Prism 9软件进行绘图和统计分析。多样本比较采用Tukey多重比较检验（p值<0.05）进行单因素方差分析。对于 H。进行拟南糖感染试验，进行未配对T检验。双尾 p 值的统计显著性为 < 0.05 （*），p 值< 0.01 （**）。

数据可访问性

测序数据已存放在 NCBI SRA （BioProject ID PRJNA978613） 中。

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S1 图。

真菌RDR系统发育分析（A）和RDR活性位点（B）的氨基酸序列比对。（A）中的条形表示分支的长度。最小值和最大值是指（B）中的守恒水平。本分析中使用的氨基酸序列在S2表中给出。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s001

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S2 图。 三种 BcRDR的表达水平。

使用 BcTubA 作为参考基因，通过 qRT-PCR 在两个独立的重复中测量 BcRDR的 mRNA 水平。散点图中的线表示均值和标准差。使用方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s002

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S3 图。 bcrdr ko 突变体和 cBcRDR1 基因互补菌株的产生。

A） bcrdr1 ko 和 cBcRDR1 互补克隆策略的示意图概述。B） 评估 bcrdr1 基因 ko 的基因分型 PCR 并将 ko 盒插入 BcRDR1 基因组环境中。C） 基因分型 PCR 评估 cBcRDR1 盒插入 bcrdr1 ko 基因组背景和 RT-PCR 评估 BcRDR1 在 WT、bcrdr1 ko 突变体和 cBcRDR1 互补菌株中的表达。D） bcrdr2 ko克隆策略的示意图概述。E） 基因分型 PCR 评估 bcrdr2 基因 ko。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s003

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S4 图。

B感染系列的重复。孢WT 和 bcrdr1 ko 突变体在分离的 S 上。lycopersicum （A） 和 A.拟南芥（B）叶子。20μl滴5 x 104/ml将condidiospores置于叶子上。比例尺表示 1 厘米。B诱导的病变大小。在 48 HPI 时测量 Cinerea 感染。每个图中给出的分析病变的数字。使用方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s004

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S5 图。 B. cinerea WT、bcrdr1 ko、bcrdr2 ko 突变体和 cBcRDR1 在 1% 麦芽提取物琼脂上的生长。

A） 在 4 天时拍摄平板生长图像。比例尺代表 1 厘米。 B） 要测量生长曲线，下降 2 x 105/ml 将10μl分生孢子悬浮液置于琼脂平板的中心，并在3,4和5天时测量菌落直径。数据表示 5 次重复。使用方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s005

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S6 图。 已知B的表达分析。BCRDR1 KO突变体中的Cinerea Virulence基因。

比较 B 中 BcPG1 （Bcin14g00850）、BcNEP1 （Bcin06g06720）、BcSpl1 （Bcin03g00500）、BcXyn11A （Bcin03g00480） 和 BcHIP1 （Bcin14g01200） 的 mRNA 水平。孢WT 和 bcrdr1 ko 突变体 #2 和 #4 在 0 个生物学重复中在无轴培养中生长。BcTubA被用作参考基因。使用方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 05.<>。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s006

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S7 图。

A） 从 B 获得的 BcGyspy1 和 BcGypsy3 位点的映射结果。孢WT 和 bcrdr1 ko 突变体小 RNA 测序数据。每百万次读取数 （RPM） 值> 0 表示检测对齐，RPM 值< 0 表示反义对齐。颜色代码表示 Bc-sRNA 大小。B） 映射到 B 中 BcGypsy1 和 BcGypsy3 位点的 Bc-sRNA 的大小谱。孢WT 或 bcrdr1 ko 突变体 #2 和 #4。C） B中BcGypsy1和BcGypsy3 mRNA的表达水平。孢WT 和 bcrdr1 ko 突变体在无轴培养物中生长。D） B中BcGypsy1和BcGypsy3 mRNA的表达水平。孢WT在无轴培养条件下和番茄感染期间以48 hpi生长。E） BcGypsy1 和 BcGypsy3 mRNA 在 B 中的表达水平比较。孢WT 与 bcrdr1 ko 突变体 #2 和 #4 在无轴培养条件下或番茄感染期间以 48 hpi 生长时。在C）、D）和E）中，BcTubA mRNA用作参考基因表达。散点图中的线表示均值和标准差。使用方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s007

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S8 图。 比较 B. 的 Bc-sRNA 的茎环 RT-PCR。孢WT 和 bcrdr1 ko 突变体。

在感染B的番茄叶样品中检测到Bc-sRNA。Cinerea 为 48 hpi。图为结果的全尺寸凝胶图像，如图3B所示。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s008

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S9 图。

S 中已知 Bc-sRNA 靶基因的 mRNA 表达测量的生物学重复。lycopersicum （A） 和 A.拟南芥 （B） 感染 B 期间。孢WT 和 bcrdr1 ko 突变体。在 36 hpi 或 60 hpi 下采集 S 样品。lycopersicum 和 A.分别是 thaliana。将 SlActin2 或 AtActin2 用作参考基因。散点图中的线表示均值和标准差。使用方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s009

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S10 图。 使用GFP开启跨界RNAi报告植物幼苗感染B的独立感染时间序列。孢WT、bcrdr1 ko 突变体 #2 或水处理。

A）不同感染时间点的荧光显微镜图像。5 μl 滴 2 x 105将/ml分生孢子悬浮液置于叶片的中心，然后在顶部放置玻璃覆盖玻片，分散孢子悬浮液并导致整个叶片上的GFP活化。比例尺表示 1 毫米。 B） 在 6-42 hpi 的时间序列内对整个幼苗叶片进行归一化 GFP 信号定量。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s010

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S11 图例. A的荧光显微成像。拟南素感染 B 的 WT 幼苗。cinerea WT.

比例尺表示 1 毫米。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s011

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S12 图。 使用成年GFP开启跨界RNAi报告植物的分离莲座叶的三个独立感染系列和荧光显微成像。

用20μl滴2×10的叶子接种5/ml分生孢子悬浮液B。孢WT、bcrdr1 ko 突变体和 bcdcl1/2 突变体。拟南芥WT植株感染B.孢WT评估自发荧光，并评估水处理的GFP报告植物的报告自活性。比例尺表示 500 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s012

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S13 图。 GFP报告幼苗植株感染卵菌病原体Hyaloperonospora arabidopsidis。

10毫升2 x 104将/ml分生孢子悬浮液喷洒在叶片上。台盼蓝染色可视化受感染叶片中的卵菌菌丝。轮廓表示荧光和台盼蓝染色图像中的相同叶面积。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s013

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S14 图。 转基因A的感染。拟南芥跨界RNAi报告基因系与GUS报告基因。

该报告基因系先前设计用于展示由卵菌 H 分泌的小 RNA 触发的跨界 RNAi。拟南花纹（Dunker等人，2020 [22]）。A） GUS 报告系感染 H。拟南珠菌在感染卵菌菌丝时显示GUS。B） GUS 报告系感染 B.cinerea 显示感染部位没有 GUS 激活（由绿松石箭头表示）。C） 感染带有 H 扰乱小 RNA 靶位点的 GUS 报告系。拟南糖苷没有GUS活性。D） 加扰的 GUS 报告系感染 B。cinerea 在感染部位没有 GUS 活性（用绿松石箭头表示）。对于 B。Cinerea 接种，20 μl 滴 2 x 105将分生孢子放在叶子上。对于 H。拟南花芹梨感染，10毫升2 x 104将分生孢子悬浮液/ml喷洒到叶片上。比例尺表示 100 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s014

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S15 图例. 荧光显微镜成像，mRNA和蛋白质表达测量，使用10x分生孢子浓度进行bcrdr1接种的GFP开启跨界RNAi报告植物的成年莲座叶。

A） 24 hpi 的荧光显微镜图像表明 B 感染部位报告植株的 GFP 表达增强。孢WT 与 GFP 非表达 A 形成对比。拟南素WT植株、水处理的GFP报告植株或感染bcrdr1 ko突变体的GFP报道植株。B）中的绿松石箭头表示B的感染前沿。孢WT接种。A） 和 B） 中的比例尺表示 500 μm。C） A中的GFP mRNA表达水平。拟南素WT植物（红点），A。拟南素GFP报告植物（蓝点）感染B。孢WT、bcrdr1 ko突变体或水处理。AtActin2 用作参考基因。D） 使用 @GFP 抗体对 GFP 表达进行蛋白质印迹分析。RuBisCo信号通过考马斯亮蓝染色可视化。数字表示FIJI软件估计的GFP和RuBisCo强度。E） B.感染 A 中的 cinerea 基因组 DNA。拟南素使用BcTubA基因的引物通过qPCR测量WT或GFP报告植物。使用 AtActin2 引物将原始数据归一化为植物 DNA。C）和B的qPCR数据散点图中的线。E）中的cinerea基因组DNA表示平均值和标准差。使用方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s015

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S16 图。 来自感染 B 的 GFP 开启跨界 RNAi 报告植株的成年莲座叶的荧光显微镜成像。孢WT 为 36 hpi。

灰芽孢杆菌菌丝体通过台盼蓝染色观察。图像中的方块表示放大区域。红色星号表示合并的BF/GFP和台盼蓝图像中的相同叶毛状体。绿松石箭头表示 B。Cinerea 菌丝体。比例尺表示 500 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s016

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S17 图例. B. 感染系列。西内雷亚，H.arabidopsidis 和 P.丁香科DC3000 在转基因 T2 A 中。表达 Bc-sRNA 或主 STTM 的拟南芥品系。

A） A的叶片图像。拟南素B 上的 STTM。Cinerea 感染 2 x 105分生孢子/ml，60 hpi。中的比例尺代表 1 厘米。 B） B） B引起的病变区域。在 48 HPI 时测量 Cinerea 感染。C） A中Bc-sRNA靶基因AtMPK1和AtWAK的mRNA表达水平。拟南。AtActin2 用作参考基因。散点图中的线表示均值和标准差。使用方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 0.05。D） A的半定量RT-PCR。拟南芥免疫相关基因 AtPR1 和 AtPDF1。2. 乙。Cinerea 感染的叶子被用作免疫原性对照。E） 主 STTM 系 #3 感染卵菌 H。拟南芹花。在7个重复接种实验中，卵菌孢子囊的计数为3000 dpi。f） 甲型感染。拟南素STTM系与细菌病原体丁香假单胞菌DC3。菌落形成单位 （cfu） 的计数为 0 dpi。使用方差分析进行 B）、C）、E）、F） 中的统计分析，然后进行 Tukey 事后检验，p 值阈值 p < 05.1。E）重复#2和重复#0采用双尾p值<05.0（*），p值<01.<>（**）的非配对t检验进行统计分析。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s017

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S18 图。 植物图像显示 A 未改变的生长表型。拟南素STTM工厂。

照片是在短日照条件下生长后 38 天拍摄的。比例尺表示 1 厘米。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s018

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S1 视频。

GFP跨界RNAi报告基因活性在A上的时间过程。拟南芥叶接种量为6-51 hpi，含B。孢WT（左位点）或 bcrdr1 ko 突变体 #2（右位点）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s019

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S1 表。 本研究中使用的 DNA 寡核苷酸。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s020

（XLSX）

S2 表。 用于系统发育分析的氨基酸序列。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s021

（XLSX）

S3 表。 qPCR 和 qRT-PCR 原始数据 2-ΔΔCt值。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011885.s022

（XLSX）

确认

我们感谢克劳德·贝克尔（Claude Becker）博士对这项工作的批判性校对。我们要感谢慕尼黑基因中心提供的Illumina NextSeq测序服务。我们要感谢 Martin Parniske 博士的科学讨论和提供对 Golden Gate 克隆系统的访问，感谢 Silke Robatzek 博士和 Eliana Mor 博士对 DMi8 Thunder Imager 显微镜的访问和技术援助，以及 Dagmar Hann 博士与我们分享 Pst DC3000 菌株。我们感谢 Annika Lübbe 对 GUS 染色的支持。我们感谢 Verena Klingl 为分离灰霉菌 bcrdr1 ko 转化体提供的技术支持，并感谢 Ignacio Mohr 对 H 的帮助。拟南珠菌接种。我们感谢 Franz Oberkofler 的视频编辑。

引用

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