医学免费医学论文发表-阻断线粒体去极化并抑制 SARS-CoV-2 在体外和体内复制

抽象

COVID-19 大流行已在全球夺走了超过 6 万人的生命，并继续对世界医疗保健和经济系统产生持久影响。已经开发了几种已批准和紧急授权的抑制病毒复制周期早期阶段的疗法，但尚未确定有效的后期治疗靶点。为此，我们的实验室发现 5'，2' 环核苷酸 3'-磷酸二酯酶 （CNP） 抑制 SARS-CoV-3 病毒粒子组装。我们发现 CNP 抑制新的 SARS-CoV-2 病毒粒子的产生，在不抑制病毒结构蛋白翻译的情况下降低细胞内滴度。此外，我们表明，CNP 靶向线粒体对于抑制、阻断线粒体去极化是必要的，并暗示 CNP 作为线粒体通透化过渡孔 （mPTP） 抑制剂的拟议作用作为病毒粒子组装抑制的机制。我们还证明，表达人 ACE2 和 CNP 的腺病毒在小鼠肺部将 SARS-CoV-2 滴度抑制到无法检测到的水平。总的来说，这项工作显示了 CNP 成为新的 SARS-CoV-2 抗病毒靶点的潜力。

作者摘要

一旦进入细胞，病毒就会操纵细胞环境以利于其复制。我们发现，感染后，SARS-CoV-2 会诱导线粒体将活性氧 （ROS） 释放到细胞质中，这有利于病毒的复制。我们发现了一种称为CNP的磷酸二酯酶，它通过抑制称为线粒体通透性过渡孔或mPTP的诱导孔来阻断这种释放。我们还发现，靶向该孔的药物可抑制 SARS-CoV-2 复制。我们在体内测试了CNP的功能，发现如果我们在小鼠肺中过表达CNP，我们会抑制SARS-CoV-2的复制。总之，这证明了线粒体对 SARS-CoV-2 复制的关键功能，并且 ROS 的反作用释放增强了病毒复制。我们认为这在冠状病毒和潜在的其他病毒中很常见，从而为未来的治疗确定了新的靶点。

数字

Fig 4Fig 5图1图2图3Fig 4Fig 5图1图2图3

引文： Logue J、Melville VM、Ardanuy J、Frieman MB （2023） CNP 阻断线粒体去极化并抑制 SARS-CoV-2 在体外和体内复制。PLoS 病理学 19（12）： 编号：E1011870。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011870

编辑 器： Sabra L. Klein，约翰霍普金斯大学布隆伯格公共卫生学院，美国

收到： 16年2023月28日;接受： 2023年20月2023日;发表： <>月 <>， <>

版权所有： ? 2023 Logue et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 这份手稿的所有数据都可以在 https://osf.io/f6db3/ 的开放科学中心获得。

资金： 这项工作部分由 NIH R01 AI148166（给 MBF）资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 我阅读了该杂志的政策，这篇手稿的作者有以下相互竞争的利益：MBF是合气道制药的科学顾问委员会成员，并与诺瓦瓦克斯、阿斯利康、再生元和Irazu Bio签订了合作研究协议。这些对本手稿中介绍的作品的计划或解释没有任何影响。

介绍

SARS-CoV-2是2冠状病毒病（coronavirus 2019， COVID-19）的病原体，于2019年1月在中国湖北省武汉市首次报道[3–2]。从那时起，SARS-CoV-675感染已扩大到全球大流行，在撰写本文时已报告超过6.8亿例病例，报告死亡人数超过4万例[5,19]。在缺乏广谱、小分子抗病毒治疗的情况下，早期的COVID-6治疗研究主要集中在美国食品药品监督管理局（FDA）已批准用于其他疾病的化合物的潜在再利用上[8\u19]。尽管绝大多数化合物未被证明有效，但仍有少数化合物在临床试验中进行了测试，截至撰写本文时，只有核苷类似物瑞德西韦和莫努匹韦获得FDA紧急使用授权或完全批准用于治疗早期COVID-9[10,2]。除重新利用的化合物外，SARS-CoV-11特异性疗法也已获得FDA的授权或批准，包括口服蛋白酶抑制剂Paxlovid和几种单克隆抗体治疗药物[14\u<>]。

SARS-CoV-2感染始于表面蛋白刺突蛋白（Spike S）与细胞受体血管紧张素转换酶II.（ACE2）的结合，之后S可通过跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）或内体中的组织蛋白酶B或L在细胞表面裂解，以促进膜融合和病毒基因组释放到胞质溶胶中[15\u21]].然后，非结构蛋白立即被翻译成多蛋白，通过病毒介导的蛋白水解释放成单个蛋白质，导致复制细胞器（DMV）的形成[22\u25]。然后，RNA复制发生在这些细胞器中，导致新的病毒基因组的产生，并产生病毒亚基因组RNA（sgRNA），相当于mRNA的冠状病毒，被翻译成结构蛋白和辅助蛋白[22,26]。新的SARS-CoV-2病毒粒子在ER-高尔基体中间区室（ERGIC）组装，然后通过一种尚未确定的胞吐方法排出病毒[27\u29]。

有趣的是，目前 FDA 授权或批准的所有疗法都针对 SARS-CoV-2 生命周期的早期阶段（例如，进入、RNA 复制）。然而，SARS-CoV-2生命周期的后期阶段相对来说还不是很清楚，因此，缺乏可能被证明更有效或与早期抑制剂协同作用的晚期抑制剂。我们之前在2个干扰素刺激基因（ISG）的过表达筛选中发现3'，3'-环核苷酸2'-磷酸二酯酶（CNP）是生命周期晚期的SARS-CoV-399抑制剂[30]。CNP是一种脂质结合蛋白，在全身（包括肺组织）中表达，但在髓磷脂中的表达水平非常高[31\u33]。顾名思义，尽管早期的生化研究通过CNP水解2'，3'-环核苷酸的能力确定了CNP，但其确切的功能和潜在的细胞底物尚未在体外或体内得到证实[34]。然而，越来越多的证据已经开始确定线粒体靶向 CNP 亚型 （CNP2） 的潜在功能，CNP<> 已被证明可以抑制线粒体通透化过渡孔 （mPTP） 的打开，这一过程导致线粒体去极化以响应线粒体 Ca2+超负荷、细胞氧化应激或潜在的SARS-CoV-2感染[35–39]。在我们之前的研究中，我们发现CNP过表达抑制了所有测试细胞系中的SARS-CoV-2复制，包括原代人气管支气管上皮细胞，并进一步表明这种抑制发生在基因组复制后的复制生命周期阶段[30]。然而，受影响的确切生命周期阶段和作用机制尚未确定。

在这项研究中，我们证实 CNP 在体外过表达对 SARS-CoV-2 基因组复制没有影响，并进一步表明 CNP 既不影响亚基因组 RNA 的产生，也不影响结构蛋白翻译。然而，CNP 过表达降低了 SARS-CoV-2 N 定位到病毒粒子组装位点 （ERGIC） 并降低了细胞内 SARS-CoV-2 滴度，为病毒粒子组装受到抑制提供了强有力的证据。此外，我们发现 SARS-CoV-2 的 CNP 抑制需要线粒体靶向 CNP，从而减少 SARS-CoV-2 诱导的 mPTP 开放和线粒体活性氧 （ROS） 释放。事实上，通过过氧化物处理替换CNP稳定表达细胞中的活性氧可以挽救病毒滴度。最后，我们发现 Balb/c 实验室小鼠肺中的 CNP 过表达可保护小鼠免受 SARS-CoV-2 感染，将肺病毒滴度降低 1,000 倍以上。这项工作强调了胞质 ROS 对 SARS-CoV-2 病毒粒子组装的重要性，并将 CNP 确定为 COVID-19 的潜在治疗靶点。

结果

CNP 抑制 SARS-CoV-2 病毒粒子组装

我们实验室先前的数据显示，CNP过表达抑制SARS-CoV-2生命周期阶段的基因组复制后[30]。为了进一步阐明受影响的阶段，通过慢病毒转导产生稳定表达 HA 标记的 CNP 或 HA 标记的 GFP 的 HEK293T/hACE2 细胞（S1 图）。然后用 SARS-CoV-2/WA1 感染细胞 45 分钟的吸收期，然后用细胞培养基洗涤以去除任何剩余的未结合病毒。然后使用各种测定法来评估 CNP 过表达对多个 SARS-CoV-2 生命周期阶段的影响。在感染后 6 小时 （hpi），我们确认 CNP 稳定细胞和 GFP 稳定细胞之间的 gRNA 水平没有显着差异（图 1A），并且进一步表明 CNP 不会改变 sgRNA 水平（图 1B）。在 12hpi 时，SARS-CoV-2 结构蛋白 S 和 N 的蛋白质印迹在 CNP 和 GFP 稳定细胞之间也没有定性差异，表明对结构蛋白翻译没有影响（图 1C）。然而，在 18hpi 时，当评估细胞内滴度（图 2D）和细胞外滴度（图 1E）时，SARS-CoV-1 滴度显着降低，这表明新的 SARS-CoV-2 病毒粒子的组装受到 CNP 的影响。当 SARS-CoV-2 病毒粒子组装在 ERGIC 时，将感染的稳定细胞系固定在 12hpi 上，并将免疫荧光染色ERGIC53并与 SARS-CoV-2 S 或 N 共染色。与GFP对照细胞相比，稳定表达CNP的HEK293T/hACE2细胞在ERGIC和SARS-CoV-2 S之间显示出更高的共定位性（图2A，在图2C中定量）。然而，与GFP对照组相比，表达CNP的细胞SARS-CoV-2 N和ERGIC标志物之间的共定位明显较低（图2B，在图2D中定量），表明N向病毒粒子组装位点的运输受到抑制。

缩略图 下载：

PPT格式PowerPoint 幻灯片

巴布亚新几内亚放大图像

TIFF格式原始图像

图 1. CNP 过表达抑制新的 SARS-CoV-2 病毒粒子的产生。

用 SARS-CoV-293/WA2 感染稳定过表达 CNP 或 GFP 的 HEK2T/hACE1 细胞 45 分钟，然后洗涤任何未结合的病毒。感染后 6 小时，通过 RT-qPCR 测定 （a） 基因组 RNA 和 （b） 亚基因组 RNA 的细胞内 SARS-CoV-2 RNA 水平。（c） 在感染后 12 小时，收集裂解物并对 SARS-CoV-2 S、SARS-CoV-2 N 和肌动蛋白进行蛋白质印迹染色作为上样对照。在感染后 18 小时，进行斑块测定以确定 （d） 细胞内 SARS-CoV-2 滴度和 （e） 细胞外 SARS-CoV-2 滴度。所有实验重复 2-3 次，如图中的点所示。**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001，“ns”：p > 0.5。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011870.g001

缩略图 下载：

PPT格式PowerPoint 幻灯片

巴布亚新几内亚放大图像

TIFF格式原始图像

图 2. CNP 过表达在病毒粒子组装过程中改变 SARS-CoV-2 结构蛋白定位。

用 SARS-CoV-293/WA2 感染稳定过表达 CNP 或 GFP 的 HEK2T/hACE1 细胞 45 分钟，然后洗涤任何未结合的病毒。在感染后 12 小时，固定细胞，进行免疫荧光染色，并收集 （a） ERGIC53（蓝色）和 SARS-CoV-2 S（红色）或 （b） ERGIC53（蓝色）和 SARS-CoV-2 N（红色）的共聚焦图像。在 ImageJ 中评估了 （c） SARS-CoV-53 S 或 （d） SARS-CoV-2 N 与 SARS-CoV-2 结构蛋白ERGIC2共定位。*p ≤ 0.1，**p ≤ 0.01。代表性图像显示了来自三个独立的重复实验。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011870.g002

CNP 抑制 SARS-CoV-2 诱导的线粒体去极化

为了评估 SARS-CoV-2 抑制所需的 CNP 的必要方面，创建了 HA 标记的 CNP 或 HA 标记的 CNP 突变/缺失构建体，包括已知催化位点（H251A、T253A、H330A、T332A）、异戊二烯化位点 （C418A） 和线粒体靶向序列缺失 （Δ1–20） 突变的构建体（S1B 图 和 S2 表).其他结构域缺失构建体（即 Δ p 环结构域、Δ 催化结构域）由于表达不良而被放弃，这可能是由蛋白质错误折叠引起的（S1B 图）。在分析它们对感染的影响之前，在转染细胞中测定它们的定位。hCNP 野生型以及催化位点和异戊二烯化位点突变体定位于线粒体，而 MTS 缺失突变体在细胞质中弥漫（S1C 图）。为了确定抑制 SARS-CoV-2 所需的 CNP 结构域，用 HA 标记的野生型和突变型 CNP 构建体转染 HEK293T/hACE2 细胞。转染后的第二天，用 SARS-CoV-2/WA1 （MOI = 0.01） 感染细胞 48 小时，然后收集上清液并通过噬菌斑测定法测定 SARS-CoV-2 滴度。如前所述，与 GFP 对照组相比，CNP 过表达导致 SARS-CoV-10 滴度降低 2 倍以上。然而，线粒体靶向序列的缺失导致 SARS-CoV-2 抑制的消融，表明 CNP 靶向线粒体是抗病毒活性所必需的（图 3A）。

缩略图 下载：

PPT格式PowerPoint 幻灯片

巴布亚新几内亚放大图像

TIFF格式原始图像

图 3. CNP 过表达抑制 SARS-CoV-2 诱导的线粒体去极化。

HEK293T/hACE2 细胞在转染指定质粒 2 小时后感染 SARS-CoV-1/WA24。（a） 感染后 48 小时，收集上清液，并通过斑块测定法测定 SARS-CoV-2 滴度。（b-c）感染后 6 小时，评估线粒体功能，以评估 （b） JC10 染色线粒体去极化或 （c） TMRM 染色打开 mPTP。（d） 用 SARS-CoV-293/WA2 （MOI = 2） 感染稳定过表达 CNP 或 GFP 的 HEK1T/hACE5 细胞 45 分钟，然后洗涤任何未结合的病毒。然后立即加入含有 10μM 环孢菌素 A 或 DMSO 的新鲜培养基，并在 2hpi 测定细胞内 SARS-CoV-18 滴度。**p ≤ 0.01。显示了来自三个重复的JC10和TMRM实验的代表性图像。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011870.g003

鉴于这一结果，我们旨在评估 CNP 过表达对 SARS-CoV-2 感染期间线粒体功能的影响。先前的研究表明，SARS-CoV-2感染导致mPTP诱导的线粒体去极化，最快可达3hpi[39]。此外，其他研究显示CNP抑制mPTP的形成和功能[36,37]。为了进一步评估这种关系，如上所述，用 hCNP、hCNPΔMTS 或空质粒构建体转染 HEK293T/hACE2 细胞，并在第二天感染 SARS-CoV-2/WA1 （MOI = 5）。在 6hpi 时，用 JC10 染料染色细胞以评估线粒体去极化或用 TMRM 染料评估 mPTP 开放。如前所述，对照转染细胞和 hCNPΔMTS 转染细胞中的 SARS-CoV-2 感染导致线粒体去极化，如 JC10 染色增加（图 3B）和 mPTP 开放所示，如 TMRM 染色丢失所示，与模拟感染细胞相比。然而，在 hCNP 转染的细胞中未观察到这些效应，这表明 hCNP 抑制 SARS-CoV-2 介导的线粒体去极化。

该数据表明，CNP可能直接调控了ROS的mPTP打开和释放。虽然 mPTP 的成分尚未达成一致，但环孢菌素 A 对 mPTP 开放的抑制作用是。我们假设，如果 hCNP 调节 mPTP 开放，那么环孢菌素 A 的进一步抑制不会导致病毒滴度的额外降低。然而，如果 CNP 靶向线粒体中的不同过程，那么在感染前添加环孢菌素 A 将加法或协同导致对 SARS-CoV-2 复制的抑制增加。为了进一步评估 hCNP 对 mPTP 功能的影响，用 SARS-CoV-293 感染稳定表达 hCNP 或 GFP 的 HEK2T/hACE2 细胞，然后用 10μM 环孢菌素 A（一种已建立的 mPTP 功能抑制剂）或 DMSO 作为载体对照。与载体对照组相比，当对GFP稳定细胞施用环孢菌素A治疗时，细胞内SARS-CoV-2滴度显着降低，但hCNP稳定细胞的滴度不低（图3D）。我们得出结论，这意味着环孢菌素 A 和 hCNP 可能靶向线粒体中的相同复合物，即 mPTP。

有效的 SARS-CoV-2 病毒粒子组装需要线粒体活性氧释放

我们已经证实 SARS-CoV-2 感染可以诱导线粒体功能障碍，并进一步表明这种功能障碍可以被 hCNP 抑制。持续线粒体去极化的一个主要后果是 ROS 的产生和释放。为了评估 ROS 对 SARS-CoV-2 病毒粒子组装抑制的重要性，将 HEK293T/hACE2 细胞转染 hCNP、hCNPΔMTS、催化位点突变体 （hCNP/Cat）、异戊二烯化位点突变体 （hCNP/Pren） 或如上所述的空质粒构建体，并在第二天用 SARS-CoV-2/WA1 感染 （MOI = 5）。在 6hpi 时，用 H 染色细胞2DCFDA可视化胞质ROS（图4A）。如前所述，与模拟感染细胞相比，对照转染细胞和 hCNPΔMTS 转染细胞中的 SARS-CoV-2 感染导致 ROS 产生增加。hCNP/Cat突变体在感染后维持对ROS产生的抑制，类似于野生型hCNP。hCNP/Pren 突变具有中等表型。ROS生成的抑制反映了图3中所示的病毒抑制。该数据表明，hCNP抑制线粒体去极化可能导致ROS产生和释放到胞质溶胶中的抑制。

thumbnail 下载：

PPT格式PowerPoint 幻灯片

巴布亚新几内亚放大图像

TIFF格式原始图像

图 4. 活性氧对 SARS-CoV-2 病毒粒子组装很重要。

(a） HEK293T/hACE2 细胞在转染指定质粒 2 小时后感染 SARS-CoV-1/WA24。感染后 6 小时，通过 H 评估胞质活性氧的存在2DCFDA染色。（b-c）用 SARS-CoV-293/WA2 （MOI = 2） 感染稳定过表达 CNP 或 GFP 的 HEK1T/hACE5 细胞 45 分钟，然后洗涤任何未结合的病毒。在感染后 3 小时，用浓度范围的过氧化氢处理细胞。在感染后 18 小时，进行斑块测定以确定 （b） 细胞内 SARS-CoV-2 滴度和 （c） 细胞外 SARS-CoV-2 滴度。*p ≤ 0.1， **p ≤ 0.01， *** p ≤ 0.001， ****p ≤ 0.0001.显示了 H 的代表性图像2三次重复的DCFDA染色。显示了三个实验的病毒滴度数据。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011870.g004

为了进一步确认 ROS 产生对 SARS-CoV-2 复制的重要性，我们用 SARS-CoV-293/WA2 （MOI = 2） 感染稳定表达 hCNP 或 GFP 的 HEK1/hACE5 细胞 45 分钟的吸收期，然后用细胞培养基洗涤以去除任何剩余的未结合病毒。在 3hpi 时，然后用亚致死浓度范围的过氧化氢（线粒体去极化后释放的 ROS 之一）处理细胞，并在 2hpi 时评估细胞内/细胞外 SARS-CoV-18 滴度。在评估细胞内（图293B）或细胞外（图2C）滴度时，与GFP对照细胞相比，将ROS添加到hCNP稳定的HEK2T/hACE4细胞中导致SARS-CoV-4滴度的剂量依赖性挽救。该数据表明，SARS-CoV-2 病毒粒子组装和释放需要从线粒体释放 ROS。

CNP 减少 COVID-2 小鼠模型中的 SARS-CoV-19 感染

为了评估 CNP 对 COVID-2 小鼠模型中 SARS-CoV-19 感染的影响，生成了 rAd5 载体以双表达 hACE2、SARS-CoV-2 进入受体和 HA 标记的 hCNP 或 HA 标记的 eGFP。为了验证 rAd5 转导效率，Balb/c 实验室小鼠用 1 x 10 鼻内转导8在转导后 2 天评估每只小鼠的病毒颗粒 （VP） 以及对体重变化以及 hCNP 和 hACE3 表达的影响（S3A 图）。rAd5 转导导致转导后 3 天体重减轻最小（S3B 图），我们观察到肺部炎症没有组织学显示的定性差异。通过肺组织学切片的免疫荧光染色，任一 rAd5 载体转导导致 hACE2 （图 5C） 和 HA 标记的 hCNP 或 HA 标记的 eGFP （S3D 图） 的表达增加。此外，由于 rAd2 转导，hACE5 mRNA 水平升高（图 5E），而 rAd5/hCNP 转导动物的 hCNP mRNA 水平升高（S3F 图）。

thumbnail 下载：

PPT格式PowerPoint 幻灯片

巴布亚新几内亚放大图像

TIFF格式原始图像

图 5. CNP 转导可减少 Balb/c 实验室小鼠的 SARS-CoV-2 感染。

(a） 用 rAd5 载体鼻内转导小鼠组 （1 x 108病毒颗粒/小鼠）在鼻内感染 SARS-CoV-2/WA3 前 2 天双表达 hACE1 和 HA 标记的 CNP 或 HA 标记的 eGFP（1 x 103或 1 x 105PFU/鼠标）。使用 BioRender 创建的图像。b-c 在 SARS-CoV-2 攻击后 4 天或 2 天通过斑块测定法测定肺匀浆的传染性病毒载量，用于 （b） 1 x 103PFU/鼠标或 （c） 1 x 105PFU/小鼠激发组。d-e 病毒滴度也通过 RT-qPCR 测定 （d） 1 x 10 的 sgRNA3PFU/鼠标或 （e） 1 x 105PFU/小鼠激发组。p ≤ 0.001，****p ≤ 0.0001。显示了三个实验的病毒滴度数据。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011870.g005

使用这些经过验证的 rAd5 载体，我们接下来评估了 CNP 对动物 COVID-2 疾病模型中 SARS-CoV-19 感染的影响。Balb/c 实验室小鼠用 rAd5 载体鼻内转导 （1 x 108VP/小鼠）鼻内攻击前 3 天 - SARS-CoV-2/WA1 （1 x 103PFU/鼠标或 1 x 105pfu/mouse）（图 5A）。重要的是，SARS-CoV-1 的 WA2 毒株不能使用小鼠 ACE2 进入细胞，只能感染表达 hACE5 的 rAd2 转导细胞。hCNP 过表达导致活病毒滴度降低 1000 倍以上，达到 2 x 4 dpi 下小鼠肺匀浆检测不到的水平3pfu/鼠标（图 5B）或 1 x 105pfu/小鼠（图5C）攻击组。此外，与对照动物相比，hCNP 转导动物肺部的 SARS-CoV-2 sgRNA 显着降低 1 x 103pfu/鼠标（图 5D）或 1 x 105pfu/小鼠（图5E）攻击组。

讨论

针对 COVID-19 的疗法仍然仅限于早期的 SARS-CoV-2 复制周期靶点，包括阻断进入的单克隆抗体治疗和抑制病毒 RNA 复制的核苷类似物。这在一定程度上是由于对SARS-CoV-2生命周期后期阶段的理解存在相对差距。我们的工作旨在进一步确定潜在的晚期 SARS-CoV-2 抑制剂 CNP 的作用机制，以评估其治疗潜力并进一步研究 SARS-CoV-2 生命周期后期阶段。与我们之前发表的工作一致，我们证实 CNP 过表达对 SARS-CoV-2 基因组复制没有影响，但导致细胞外 SARS-CoV-2 滴度显着降低，再次表明 CNP 抑制了这些病毒生命周期步骤之间的某个部分。我们进一步表明，sgRNA（相当于病毒 mRNA）的产生和 SARS-CoV-2 结构蛋白的翻译同样不受 CNP 过表达的影响。然而，在CNP过表达细胞中，细胞内SARS-CoV-2滴度显着降低，这表明在CNP存在的情况下，新制造的病毒粒子的产生受到阻碍。事实上，CNP 过表达导致 N 定位到病毒粒子组装位点 ERGIC 的减少，并导致 ERGIC 处的 S 定位量增加，这表明未掺入的 S 可能被隔离在等待与 N 组装的 ERGIC 上。

我们的工作还证明了线粒体去极化对有效病毒粒子组装的重要性。SARS-CoV-2感染既往已被证明会导致线粒体功能障碍和ROS释放，但与病毒复制没有特异性联系[39]。我们的研究表明，CNP 靶向线粒体对于抑制 SARS-CoV-2 至关重要，并且这种靶向减少了 SARS-CoV-2 诱导的线粒体去极化和 ROS 释放。有趣的是，CNP的催化活性似乎对SARS-CoV-2抑制有些可有可无，这表明mPTP抑制可能不需要催化活性，正如先前所指出的那样[36,37]。此外，mPTP 开放引起的 ROS 产生和释放的抑制似乎正在推动 SARS-CoV-2 抑制，因为通过过氧化物处理将 ROS 添加到感染的表达 CNP 的细胞中可以挽救 SARS-CoV-2 细胞内和细胞外滴度。我们还表明，环孢菌素 A 将 SARS-CoV-2 复制抑制到与 CNP 过表达相同的水平，并且它们现在一起显示出额外的抑制作用，表明它们抑制了相同的靶标。我们假设，如果它们改变了不同的靶点，那么我们将看到对病毒复制的累加或协同效应，但我们没有。需要进一步的研究来评估ROS释放如何导致更有效的病毒粒子组装。胞质ROS可能为调节病毒粒子组装的SARS-CoV-2结构蛋白的翻译后修饰提供更有利的环境，例如提议对N进行修饰以调节N相分离以促进病毒粒子组装[40]。或者，ROS信号转导的增加可以促进病毒粒子组装。

这项研究还显示了 CNP 开发成一种有效的 COVID-19 疗法的潜力。我们的小鼠数据显示，在整个感染过程中，用 CNP 预处理将 SARS-CoV-2 感染抑制到肺部可检测水平以下。此外，当在小鼠鼻内给药时，CNP的过表达没有显示出实质性的副作用，如通过体重减轻测量或通过组织学观察肺部炎症，表明CNP治疗可以很好地耐受。此外，在人类中观察到急性COVID-19期间全身ROS升高，并与一些“长期COVID”症状的发生有关[41]。CNP治疗有可能减轻其中一些长期影响。然而，需要进一步开发才能将潜在的 CNP 治疗从 rAd5 转导转变为更可行的治疗选择。或者，与体外已经证明的相比，其他mPTP抑制剂（如环孢菌素A）在体内作为COVID-19治疗药物的前景可能更大[39]。总的来说，这项工作显示了 mPTP 抑制和减少 ROS 产生作为 COVID-19 治疗的潜力，以及 CNP 成为新的 SARS-CoV-2 抗病毒靶点的潜力。

材料与方法

道德声明

所有实验均由马里兰大学巴尔的摩分校、机构生物安全委员会和机构动物护理与使用委员会批准。所有活病毒实验均在马里兰大学巴尔的摩分校的生物安全3级设施中进行。

细胞

过表达TMPRSS6的VeroE2细胞由Makoto Takeda博士慷慨提供（VeroT，[42]）。HEK293T HEK2T在补充有 293% （vol/vol） 热灭活 FBS （Sigma）、2% （vol/vol） 青霉素-链霉素 （Gemini Bio-Products）、52511% （vol/vol） 青霉素-链霉素 （Gemini Bio-Products）、10% （vol/vol） l-谷氨酰胺（1 mM 终浓度;Gibco）和1%（体积/体积）HEPES缓冲液（2mM终浓度;Gibco）。

病毒

SARS-CoV-2 的所有工作均在 A/BSL3 实验室进行，并得到我们的机构生物安全委员会 （IBC# IBC-00005484） 和机构动物护理和使用委员会 （IACUC# 1120004） 的批准。SARS-CoV-2 的原始毒株是由 CDC 在从华盛顿州 （WA-1;BEI 编号 NR-52281）。通过疾病预防控制中心获得正式同意进行采样。当细胞病变效应开始显现时，通过感染VeroT细胞制备储备液两天。收集培养基并通过离心澄清，然后分装储存在-80°C下。 通过使用VeroT细胞的噬菌斑测定法测定原液的滴度。

慢病毒和腺病毒购自VectorBuilder Inc.并由其制备。任何慢病毒和腺病毒感染均在 A/BSL2 或 A/BSL3 实验室进行，并经我们的机构生物安全委员会 （IBC# IBC-00005484） 和机构动物护理和使用委员会 （IACUC# 1120004） 批准。

半固体 Avicel 噬菌斑检测

斑块检测方法与前文所述类似[43]。简而言之，在 12 孔板上接种 2.5 x 105处理前一天的VeroT细胞/孔。在处理当天，从 12 孔板中取出培养基，并向每个孔中加入 200μL DMEM 中样品稀释液。将板在 37°C （5% CO2） 每 1 分钟摇晃一次 15 小时。孵育后，向每个孔中加入 2mL 噬菌斑测定培养基，即含有 0.1% 琼脂糖 （UltraPure） 和 2% FBS （Gibco） 的 DMEM，并在 2°C 下孵育 37 天（5% CO2).孵育后，用 4% 多聚甲醛固定板，用 0.25% 结晶紫 （w/v） 染色，计数斑块，滴度计算为斑块形成单位 （PFU）。

RT-qPCR检测

如前所述，对细胞裂解物和小鼠肺匀浆进行RT-qPCR处理[43]。根据制造商的说明，使用 Direct-zol RNA Miniprep Kit （Zymo Research） 提取 RNA。将RNA转化为cDNA（Thermo RevertAid逆转录酶）并用作qPCR的模板（Qiagen RT2 SYBR green qPCR Mastermix）。引物列在S1表中。在7500 Fast Dx实时荧光定量PCR仪器（Applied Biosystems）上收集数据。

质 粒

如前所述，将全长、结构域缺失和功能突变的人CNP基因版本克隆到pCAGGS-HA中[44]。简而言之，将基因克隆到 EcoR1/Xma1 位点的 pCAGGS-HA 载体中，从而产生 C 端 HA 表位标签。根据制造商的说明，用引物（S2表）对基因或基因片段进行PCR扩增，以便进行In-Fusion基因克隆（Takara Bio）。对于功能突变克隆，在融合克隆过程中进行引物定向诱变，并结合基因片段。

CNP 缺失/突变构建体对 SARS-CoV-2 的抑制

所有 CNP 介导的 SARS-CoV-2 抑制分析均使用 HEK293T/hACE2 细胞进行。根据制造商的说明，将 HEK293T/hACE2 细胞接种在预涂有 24μg/mL 大鼠尾胶原 I （Gibco） 的 50 孔板中。接种时，每 1μg 质粒使用 2020μL TransIT 100 （Mirus） 转染 pCAGGS-HA 质粒并孵育过夜。然后用 SARS-CoV-2/WA1 感染细胞 （MOI = 0.01）。感染后 48 小时收集上清液，并通过 VeroT 斑块测定法测定 SARS-CoV-2 滴度。

稳定细胞系生成

表达 HA 标记的 CNP 或 HA 标记的 GFP 的慢病毒购自 VectorBuilder， Inc. 用用 293μg/mL 聚凝胺预处理的慢病毒 （MOI = 2） 转导 HEK3T/hACE10 细胞 （VectorBuilder， Inc.）。通过对 10μg/mL 杀稻瘟菌素 （InvivoGen） 的耐药性选择转导细胞 10 天，然后在补充有 10μg/mL 杀稻瘟菌素 （InvivoGen） 的细胞培养基中继续维持。

SARS-CoV-2生命周期抑制分析

根据制造商的说明，将稳定表达 CNP/HA 或 GFP/HA 的 HEK293T/hACE2 细胞接种在预涂有 24μg/mL 大鼠尾胶原 I （Gibco） 的 50 孔板中，或接种在 Tab-Tek II CC2 腔室载玻片 （Thermo Fisher Scientific） 中。为每次测定进行处理接种单独的孔。第二天，用 SARS-CoV-2/WA1 （MOI = 5） 感染细胞，吸收期为 45 分钟，然后取出接种物并用新鲜细胞培养基洗涤。然后将细胞保持在细胞培养条件下直至收集。

感染后 6 小时，用完全细胞培养基洗涤细胞，然后在 TRIzol （Ambion） 中裂解。裂解物在 -80°C 下储存，直至进行 RT-qPCR 处理。

感染后 12 小时，用完全细胞培养基洗涤细胞，然后在含有 20mM Tris-HCl、150mM NaCl、1% Nonidet P-40 （v/v）、0.5% 十二烷基硫酸钠 （w/v）、5mM EDTA 和 1 X 完全蛋白酶抑制剂 （Roche） 的完全裂解缓冲液中裂解，在室温下裂解 5 分钟。收集裂解物，然后在 95°C 下煮沸两次，每次 30 分钟。然后将裂解物以21,000×g离心20分钟，然后收集上清液。将上清液储存在 -80°C 下，直至准备通过蛋白质印迹法处理（下图）。

感染后 12 小时，将细胞在 2°C 下在 1% 多聚甲醛中固定 4 小时，然后用 1 x PBS 洗涤一次。将固定细胞储存在 4°C 下，直至进行免疫荧光显微镜和共聚焦显微镜处理。

感染后 18 小时，收集上清液用于细胞外 SARS-CoV-2 滴度测定，并在 -80°C 下储存直至 VeroT 噬菌斑测定处理。然后用完全细胞培养基洗涤细胞一次，然后加入 120μL 完全细胞培养基。然后将细胞冻融三次至爆裂细胞，并收集裂解物用于细胞内 SARS-CoV-2 滴度测定，并储存在 -80°C 直至 VeroT 斑块测定处理。

蛋白质印迹

Western blot的操作与之前描述的相似[45]。细胞裂解物在Mini-PROTEAN TGX预制凝胶（BioRad）上电泳，并根据制造商的说明将电泳槽印迹到PVDF膜上。印迹后，将膜在封闭缓冲液TBST（TBS（从哪里？）中封闭，含0.1%吐温20（v/v）（从哪里））和5%牛奶（w/v）（从哪里），在室温下封闭1小时。然后将膜在一抗中在 4°C 下孵育过夜，然后用 TBST 洗涤 3 x 10 分钟。然后将膜与稀释的二抗在室温下孵育 1 小时，然后用 TBST 洗涤 5 x 10 分钟。然后用ECL（Cytiva）显影膜，并用CCD相机成像。所有抗体（S3表）均在封闭缓冲液中稀释。

免疫荧光显微镜和共聚焦显微镜

在室温下，将多聚甲醛固定细胞在含有 0.3% Triton-100 的 PBS 中透化 30 分钟。然后将细胞在封闭缓冲液（含有 5% BSA （w/v）的 PBS 中封闭 1 小时，在室温下封闭 4 小时。然后将细胞与稀释的一抗在 3°C 下孵育过夜，然后用含有 10% BSA （w/v） 和 1.0% 吐温-1 （v/v） 的洗涤缓冲液、PBS 洗涤 20 x 1 分钟。然后将细胞与稀释的二抗在室温下孵育 3 小时，然后用洗涤缓冲液洗涤 10 x 2 分钟，在 PBS 中洗涤 10 x 30 分钟。然后用含 NucBlue （Invitrogen） 的 ProLong 玻璃抗淬灭封片剂在室温下封片盖玻片至少 3 分钟。所有抗体（S<>表）均在封闭缓冲液中稀释。

使用旋转荧光显微镜（Echo）或W-1转盘共聚焦显微镜（尼康）观察染色的载玻片。使用W-2转盘软件对共聚焦显微镜收集的图像进行二维去卷积，并使用共定位阈值共定位插件使用ImageJ（NIH）进行分析。在三个独立的图像场中分析每种条件至少 1 个细胞进行共定位测定，并报告了 SARS-CoV-100、S 或 N 与 ERGIC2共定位的阈值以上强度百分比。数据代表了两个独立的实验。

线粒体功能检测设计

将 HEK293T/hACE2 细胞接种到 Tab-Tek II CC2 腔室载玻片 （Thermo Fisher Scientific） 中。接种时，每 1μg 质粒使用 2020μL TransIT 100 （Mirus） 转染 pCAGGS-HA 质粒，并在细胞培养条件下维持过夜。然后用 SARS-CoV-2/WA1 感染细胞 （MOI = 0.1）。然后在感染后 6 小时进行线粒体功能测定（如下所述）。

JC-10染色

感染后 6 小时，根据制造商的说明使用线粒体膜电位试剂盒 （Sigma-Aldrich） 完成 JC-10 染色。然后用 1 x HBBS 洗涤载玻片一次，并在室温下用 2% 多聚甲醛固定 30 分钟。然后用含 NucBlue 的 ProLong 玻璃抗淬灭封片剂 （Invitrogen） 在室温下封片盖玻片 30 分钟，并立即使用 Revolve 荧光显微镜 （Echo） 进行可视化。

TMRM染色

感染后 6 小时，通过四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐 （TMRM） 染色 （Sigma） 观察线粒体通透转化孔 （mPTP） 的打开。用 1 x HBBS （Gibco） 洗涤细胞一次，然后在 100°C 下用 1 x HBBS 稀释的 30 nM TMRM 孵育 37 分钟。 然后用 1 x PBS 洗涤载玻片一次，并在室温下固定在 2% 多聚甲醛中 30 分钟。然后用含 NucBlue 的 ProLong 玻璃抗淬灭封片剂 （Invitrogen） 在室温下封片盖玻片 30 分钟，并立即使用 Revolve 荧光显微镜 （Echo） 进行可视化。

活性氧染色 （H2DCFDA）

在感染后 6 小时，细胞内活性氧水平由 H 可视化2DCFDA染色（Invitrogen）根据制造商的说明。简而言之，用 1 x HBBS （Gibco） 洗涤细胞两次，然后用 2.5μM H 孵育2DCFDA 在 1°C 下用 30 x HBBS 稀释 37 分钟。 然后用 1 x PBS 洗涤载玻片 2 次，并在室温下在 30% 多聚甲醛中固定 <> 分钟。使用旋转荧光显微镜（Echo）立即观察细胞。

活性氧添加和环孢菌素-A处理实验

将稳定表达 CNP/HA 或 GFP/HA 的 HEK293T/hACE2 细胞接种并感染 SARS-CoV-2/WA1，如“SARS-CoV-2 生命周期抑制分析”中所述。在感染后 3 小时，向感染细胞中加入浓度范围的过氧化氢 （Sigma Aldrich） 或载体 （水）。在感染后 18 小时，收集上清液和细胞裂解物用于细胞外/细胞内 SARS-CoV-2 滴度测定，如“SARS-CoV-2 生命周期抑制分析”中所述，并储存在 -80°C 直至进一步处理。

对于环孢菌素 A 治疗研究，将稳定表达 CNP/HA 或 GFP/HA 的 HEK293T/hACE2 细胞接种并感染 SARS-CoV-2/WA1，如“SARS-CoV-2 生命周期抑制分析”中所述。洗去未结合的病毒后，将含有 10μM 环孢菌素 A （SelleckChem） 或 0.01% DMSO 作为载体对照的新鲜培养基加入细胞中。在感染后 18 小时，收集细胞裂解物用于细胞内 SARS-CoV-2 滴度测定，如“SARS-CoV-2 生命周期抑制分析”中所述，并在 -80°C 下储存直至进一步处理。

CNP过表达抗病毒体内检测

由VectorBuilder Inc.制备并获得两种哺乳动物基因表达重组腺病毒血清型5（rAd5）病毒载体，用于双表达hACE2和：（1）HA标记的hCNP（Ad/CNP）;或 （2） HA 标记的增强型绿色荧光蛋白 （Ad/eGFP）。为了确认 rAd5 转导，用甲苯噻嗪和氯胺酮的混合物麻醉 8-10 周龄的 BALB/c 实验室小鼠，在鼻内转导之前用磷酸盐缓冲盐水稀释的甲苯噻嗪和氯胺酮的混合物麻醉8记录Ad/CNP或Ad/eGFP的PFU和权重（图5A）。在 rAd3 转导后 5 天，再次记录重量并采集肺并切片进行以下检查：（1） 固定在 4% 多聚甲醛中用于组织病理学分析和免疫荧光染色;（2）在TRIzol中匀浆用于RT-qPCR分析。使用 1.0 mm 玻璃珠 （Sigma Aldrich） 和珠子 （Omni International Inc.） 进行均质化。

对于 SARS-CoV-2 抗病毒检测，在鼻内转导之前，用甲苯噻嗪和氯胺酮的混合物麻醉 8-10 周龄的 BALB/c 实验室小鼠，在磷酸盐缓冲盐水中稀释8Ad/CNP 或 Ad/eGFP 的 PFU。三天后，再次用甲苯噻嗪和氯胺酮的混合物麻醉小鼠，在用磷酸盐缓冲盐水稀释后鼻内接种1 x 103PFU 或 1 x 105SARS-CoV-2/WA1 的 PFU（图 5A）。对照小鼠也被1 x PBS模拟感染。SARS-CoV-2 感染后每天收集体重，每个治疗组分别以 5 dpi 和 2 dpi 处死 4 只小鼠。采集肺并切片如下：（1）固定在4%多聚甲醛中用于组织病理学分析;（2）在TRIzol中匀浆用于RT-qPCR分析;（3）在PBS中匀浆用于噬菌斑测定处理。使用 1.0 mm 玻璃珠 （Sigma Aldrich） 和珠子 （Omni International Inc.） 进行均质化。

组织病理学

组织病理学检查方法如前所述[46]。将肺切片固定在磷酸盐缓冲盐水中的 4% 多聚甲醛中至少 48 小时，然后将它们送到马里兰大学巴尔的摩分校的组织学核心进行石蜡包埋和切片。组织学核心服务部门制备了五微米切片，用于苏木精和伊红 （H&E） 染色。在10倍放大倍率下对截面进行成像，并使用Adobe Photoshop和Illustrator软件组装成图形。

小鼠肺组织学载玻片的免疫荧光染色

将肺切片固定在磷酸盐缓冲盐水中的 4% 多聚甲醛中至少 48 小时，然后将它们送到马里兰大学巴尔的摩分校的组织学核心进行石蜡包埋和切片。然后用二甲苯（Sigma Aldrich）洗涤2 x 5分钟对载玻片进行脱蜡，然后用降低水溶液中乙醇的浓度进行再水化。再水化后，通过将样品在柠檬酸盐缓冲液 （Millipore Sigma） 中煮沸 5 分钟，然后除去热量并额外孵育 15 分钟来完成抗原修复。然后用ddH 2 O洗涤样品两次。

然后对载玻片进行染色以进行免疫荧光成像。所有孵育均在加湿室中进行。载玻片被封闭在封闭缓冲液 PBS++ （1 x PBS with 1mM MgCl 和 1mM CaCl2）与1%（w/v）BSA，在室温下放置1小时。封闭后，将载玻片在 4°C 下与稀释的一抗一起孵育过夜，然后用 PBS++ 洗涤 3 x 10 分钟。然后将载玻片在室温下与稀释的二抗孵育 1 小时，然后用 PBS++ 洗涤 3 x 10 分钟。然后用含 NucBlue （Invitrogen） 的 ProLong 玻璃抗淬灭封片剂在室温下封片盖玻片至少 30 分钟，并使用 Revolve 荧光显微镜 （Echo） 进行可视化。所有抗体（S3表）均在封闭缓冲液中稀释。

支持信息

CNP过表达验证。

显示 1/6： ppat.1011870.s001.tif

跳到无花果共享导航

https://ndownloader.figstatic.com/files/43777033/preview/43777033/preview.jpg

1 / 6

下载

无花果份额

S1 图。 CNP过表达验证。

(a） 用表达 HA 标记的 CNP 或 HA 标记的 eGFP 的慢病毒载体转导的 HEK293T/hACE2 细胞的 HA 标签染色，并在选择培养基下维持。（b） 转染 CNP 突变和缺失质粒构建体的 HEK293T/hACE2 细胞的蛋白质印迹，这些构建体染色为 HA 标签或肌动蛋白对照。（c） HA 标记的 CNP 构建体在 A549/hACE2 细胞中的共定位，并通过线粒体追踪器进行线粒体染色。合并的图像显示 DAPI、抗 HA 和 mitotracker 共定位。图像代表一式三份的样本。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011870.s001

（TIF）

S2 图。 线粒体功能染色与 MOCK 感染图像。

图像与图 3 相对应。HEK293T/hACE2 细胞在转染指定质粒后 2 小时感染 SARS-CoV-1/WA24 或 MOCK 感染。感染后 6 小时，评估线粒体功能，包括 （a） 用 TMRM 染色打开 mPTP，（b） 用 H 染色活性氧2DCFDA 或 （c） JC10 染色的线粒体去极化。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011870.s002

（TIF）

S3 图。 在Balb/c实验室小鼠中验证双表达腺病毒载体。

(a） 用 rAd5 载体鼻内转导小鼠组 （1 x 108每只小鼠的病毒颗粒）双表达 hACE2 和 HA 标记的 CNP 或 HA 标记的 eGFP。使用 BioRender 创建的图像。（b） 在转导后 3 天确定体重变化，绘制为组均值，误差条表示 ±SD。 c-d 在转导后 3 天收集肺，并通过免疫荧光染色共染色 （c） 细胞核（蓝色）和 hACE2（绿色）或 （d） 细胞核（蓝色）和 HA 标签（紫色）。对转导后 3 天收集的 （e） hACE2 和 （f） CNP 肺匀浆进行 e-f RT-qPCR。*p ≤ 0.1，**p ≤ 0.01。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011870.s003

（TIF）

S1 表。 RT-qPCR引物。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011870.s004

（文件）

S2 表。 输注克隆引物。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011870.s005

（文件）

S3 表。 用于体外蛋白质印迹和免疫荧光染色的抗体。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011870.s006

（文件）

确认

作者要感谢马里兰大学巴尔的摩分校的组织学核心进行组织学处理。

引用

1.黄C， 王莹， 李旭， 任 L， 赵杰， 胡莹， 等.中国武汉2019年新型冠状病毒感染者的临床特征。柳叶 刀。2020;395(10223):497–506.Epub格式 2020/01/28.PMID：31986264。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

2.周萍， 杨伟， 王旭光， 胡斌， 张玲， 张伟， 等.与可能起源于蝙蝠的新型冠状病毒相关的肺炎疫情。自然界。2020;579(7798):270–3.Epub格式 2020/02/06.PMID：32015507;PubMed Central PMCID：PMC7095418。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

3.Zhu N， Zhang D， Wang W， Li X， Yang B， Song J， 等.2019年中国肺炎患者的新型冠状病毒。N Engl J Med. 2020;382(8):727–33.Epub格式 2020/01/25.PMID：31978945;PubMed Central PMCID：PMC7092803。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

4.董娥， 杜 H， Gardner L.一个基于 Web 的交互式仪表板，用于实时跟踪 COVID-19。《柳叶刀感染》杂志，2020 年;20(5):533–4.Epub格式 2020/02/23.PMID：32087114;PubMed Central PMCID：PMC7159018。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

5.Dong E， Du H， Gardner L. 19 年 COVID-2020 仪表板 [引用于 2023 年 02 月 <> 日]。可从： https://coronavirus.jhu.edu/map.html.

查看文章Google 学术搜索

6.Dittmar M、Lee JS、Whig K、Segrist E、Li M、Kamalia B 等。药物再利用筛选揭示了细胞类型特异性进入途径和 FDA 批准的对 SARS-Cov-2 有活性的药物。2021 年细胞代表;35(1):108959.Epub 格式 2021/04/04.PMID：33811811;PubMed Central PMCID：PMC7985926。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

7.Riva L， Yuan S， Yin X， Martin-Sancho L， Matsunaga N， Pache L， et al.通过大规模化合物再利用发现 SARS-CoV-2 抗病毒药物。自然界。2020;586(7827):113–9.Epub格式 2020/07/25.PMID：32707573;PubMed Central PMCID：PMC7603405。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

8.Weston S， Coleman CM， Haupt R， Logue J， Matthews K， Li Y， et al. 美国食品和药物管理局批准的针对 SARS-CoV-2 体外和 SARS-CoV 体内的广泛抗冠状病毒活性。J 维罗尔。2020;94(21).Epub格式 2020/08/21.PMID：32817221;PubMed Central PMCID：PMC7565640。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

9.美国食品和药物管理局。FDA 批准 19 年 COVID-2020 的首例治疗 [引用于 2023 年 7 月 19 日]。可从： https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-first-treatment-covid-<>.

查看文章Google 学术搜索

10.美国食品和药物管理局。Lagevrio （molnupiravir） 2022 年授权书。可从： https://www.fda.gov/media/155053/download.

查看文章Google 学术搜索

11.美国食品和药物管理局。Paxlovid（奈玛特韦片和利托那韦片，联合包装口服） 2022 年授权书 [引自 2023 年 7 月 155049 日]。可从： https://www.fda.gov/media/<>/download.

查看文章Google 学术搜索

12.美国食品和药物管理局。Bamlanivimab 和 Etesevimab 2022 年授权书 [引自 2023 年 7 月 145801 日]。可从： https://www.fda.gov/media/<>/download.

查看文章Google 学术搜索

13.美国食品和药物管理局。Evusheld（tixagevimab 与 cilgavimab 共同包装）2022 年授权书 [引自 2023 年 7 月 154704 日]。可从： https://www.fda.gov/media/<>/download.

查看文章Google 学术搜索

14.美国食品和药物管理局。2022 年 Sotrovimab 授权书 [引用于 2023 年 7 月 149532 日]。可从： https://www.fda.gov/media/<>/download.

查看文章Google 学术搜索

15.Belouzard S， Chu VC， Whittaker GR. 通过两个不同位点的连续蛋白水解裂解激活 SARS 冠状病毒刺突蛋白。美国国家科学院院刊，2009年;106(14):5871–6.Epub 格式 2009/03/27.PMID：19321428;PubMed Central PMCID：PMC2660061。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

16.Gierer S、Bertram S、Kaup F、Wrensch F、Heurich A、Kr?mer-Kühl A 等。新出现的β冠状病毒EMC的刺突蛋白利用一种新型冠状病毒受体进入，可被TMPRSS2激活，并被中和抗体靶向。J 维罗尔。2013;87(10):5502–11.Epub格式 2013/03/08.PMID：23468491;PubMed Central PMCID：PMC3648152。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

17.Hoffmann M， Kleine-Weber H， Schroeder S， Krüger N， Herrler T， Erichsen S， et al. SARS-CoV-2 细胞进入依赖于 ACE2 和 TMPRSS2，并被临床证明的蛋白酶抑制剂阻断。细胞。2020;181（2）：271–80.e8.Epub格式 2020/03/07.PMID：32142651;PubMed Central PMCID：PMC7102627。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

18.Letko M， Marzi A， Munster V. SARS-CoV-2 和其他谱系 B β 冠状病毒的细胞进入和受体使用的功能评估。Nat 微生物。2020;5(4):562–9.Epub格式 2020/02/26.PMID：32094589;PubMed Central PMCID：PMC7095430。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

19.Matsuyama S， Nagata N， Shirato K， Kawase M， Takeda M， Taguchi F. 跨膜蛋白酶TMPRSS2有效激活严重急性呼吸系统综合症冠状病毒刺突蛋白。J 维罗尔。2010;84(24):12658–64.Epub格式 2010/10/12.PMID：20926566;PubMed Central PMCID：PMC3004351。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

20.欧晓， 刘莹， 雷斌， 李萍， 米D， 任 L， 等.SARS-CoV-2 刺突糖蛋白在病毒进入时的表征及其与 SARS-CoV 的免疫交叉反应性。国家通讯社。2020;11(1):1620.Epub格式 2020/03/30.PMID：32221306;PubMed Central PMCID：PMC7100515。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

21.Walls AC、Park YJ、Tortorici MA、Wall A、McGuire AT、Veesler D. SARS-CoV-2 刺突糖蛋白的结构、功能和抗原性。细胞。2020;181（2）：281–92.e6.Epub格式 2020/03/11.PMID：32155444;PubMed Central PMCID：PMC7102599。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

22.Chan JF， Kok KH， Zhu Z， Chu H， To KK， Yuan S， et al.2019 年新型人病性冠状病毒的基因组特征，该冠状病毒是从访问武汉后分离的非典型肺炎患者身上分离出来的。新兴微生物感染。2020;9(1):221–36.Epub格式 2020/01/29.PMID：31987001;PubMed Central PMCID：PMC7067204。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

23.Finkel Y、Mizrahi O、Nachshon A、Weingarten-Gabbay S、Morgenstern D、Yahalom-Ronen Y 等。SARS-CoV-2 的编码能力。自然界。2021;589(7840):125–30.Epub 格式 2020/09/10.PMID：32906143。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

24.Snijder EJ、Limpens R、de Wilde AH、de Jong AWM、Zevenhoven-Dobbe JC、Maier HJ 等。冠状病毒复制细胞器的统一结构和功能模型：追踪RNA合成。PLoS Biol. 2020年;18（6）：e3000715.Epub格式 2020/06/09.PMID：32511245;PubMed Central PMCID：PMC7302735。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

25.Wolff G、Limpens R、Zevenhoven-Dobbe JC、Laugks U、Zheng S、de Jong AWM 等。分子孔跨越冠状病毒复制细胞器的双膜。科学。2020;369(6509):1395–8.Epub格式 2020/08/09.PMID：32763915;PubMed Central PMCID：PMC7665310。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

26.Viehweger A、Krautwurst S、Lamkiewicz K、Madhugiri R、Ziebuhr J、H?lzer M 等。冠状病毒全长基因组的直接RNA纳米孔测序为结构变异提供了新的见解，并实现了修饰分析。基因组研究 2019;29(9):1545–54.Epub格式 2019/08/24.PMID：31439691;PubMed Central PMCID：PMC6724671。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

27.德哈恩 CA，罗蒂尔 PJ。冠状病毒组装中的分子相互作用。Adv Virus Res. 2005;64:165–230.Epub 格式 2005/09/06.PMID：16139595;PubMed Central PMCID：PMC7112327。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

28.Klein S， Cortese M， Winter SL， Wachsmuth-Melm M， Neufeldt CJ， Cerikan B， et al. SARS-CoV-2 结构和复制，以原位冷冻电子断层扫描为特征。国家通讯社。2020;11(1):5885.Epub 格式 2020/11/20.PMID：33208793;PubMed Central PMCID：PMC7676268。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

29.Stertz S、Reichelt M、Spiegel M、Kuri T、Martínez-Sobrido L、García-Sastre A 等。SARS冠状病毒早期复制和出芽的细胞内位点。病毒学。2007;361(2):304–15.Epub 格式 2007/01/11.PMID：17210170;PubMed Central PMCID：PMC7103305。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

30.Martin-Sancho L、Lewinski MK、Pache L、Stoneham CA、Yin X、Becker ME 等。SARS-CoV-2 细胞限制的功能景观。摩尔细胞。2021;81（12）：2656–68.e8.Epub格式 2021/05/01.PMID：33930332;PubMed Central PMCID：PMC8043580。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

31.德·莫纳斯特里奥-施拉德 P、扬 O、坦泽 S、威切特 SP、帕齐格 J、维尔纳 HB。中枢神经系统髓鞘的系统方法。细胞分子生命科学 2012;69(17):2879–94.Epub格式 2012/03/24.PMID：22441408。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

32.R?sener M， Muraro PA， Riethmüller A， Kalbus M， Sappler G， Thompson RJ， et al. 2'，3'-环核苷酸 3'-磷酸二酯酶：脱髓鞘疾病中的新型候选自身抗原。神经免疫学杂志。1997;75(1–2):28–34.Epub 格式 1997/05/01.PMID：9143234。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

33.Uhlén M， Fagerberg L， Hallstr?m BM， Lindskog C， Oksvold P， Mardinoglu A， et al. 蛋白质组学.基于组织的人类蛋白质组图谱。科学。2015;347(6220):1260419.Epub格式 2015/01/24.PMID：25613900。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

34.Drummond GI， Perrott-Yee S. 腺苷 3'，5'-磷酸的酶水解。生物化学杂志 1961;236:1126–9.Epub 格式 1961/04/01.PMID：13724509。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

35.阿扎拉什维利 T、克雷斯蒂尼娜 O、加尔维塔 A、格拉乔夫 D、巴布里纳 Y、斯特里克 R 等人。2'，2'-环核苷酸和3'，2'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶对大鼠脑线粒体的Ca3+依赖性通透性过渡调控。Am J Physiol 细胞生理学 2009;296（6）：C1428-39。Epub格式 2009/04/10.PMID：19357238。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

36.Baburina Y、Azarashvili T、Grachev D、Krestinina O、Galvita A、Stricker R 等人。线粒体 2'，3'-环核苷酸 3'-磷酸二酯酶 （CNP） 与 mPTP 调节剂和功能复合物 （I-V） 相互作用，并释放凋亡因子。神经化学国际 2015;90:46–55.Epub格式 2015/07/19.PMID：26188334。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

37.Baburina Y， Odinokova I， Azarashvili T， Akatov V， Lemasters JJ， Krestinina O. 2'，3'-环核苷酸 3'-磷酸二酯酶作为衰老褪黑激素治疗期间线粒体功能保护的信使。Biochim Biophys Acta Biomembr.2017;1859(1):94–103.Epub格式 2016/11/12.PMID：27836641;PubMed Central PMCID：PMC5539527。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

38.McFerran B， Burgoyne R. 2'，3'-环核苷酸 3'-磷酸二酯酶与多种肾上腺细胞类型的线粒体相关。细胞科学杂志 1997;110（第 23 页）：2979–85。Epub格式 1998/02/07.PMID：9359886。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

39.Shang C， Liu Z， Zhu Y， Lu J， Ge C， Zhang C， et al. SARS-CoV-2 导致线粒体功能障碍和线粒体自噬障碍。前微生物。2021;12:780768.Epub格式 2022/01/25.PMID：35069483;PubMed Central PMCID：PMC8770829。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

40.Lu S， Ye Q， Singh D， Cao Y， Diedrich JK， Yates JR 3rd， et al.SARS-CoV-2 核衣壳磷蛋白与 RNA 和膜相关 M 蛋白形成相互排斥的缩合物。国家通讯社。2021;12(1):502.Epub格式 2021/01/23.PMID：33479198;PubMed Central PMCID：PMC7820290。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

41.凯尔 DB，比勒陀利乌斯 E.缺血再灌注损伤在类风湿性关节炎、Long COVID 和 ME/CFS 等慢性复发性疾病中的潜在作用：证据、机制和治疗意义。生化杂志 2022;479(16):1653–708.Epub 格式 2022/09/01.PMID：36043493;PubMed Central PMCID：PMC9484810。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

42.Matsuyama S、Nao N、Shirato K、Kawase M、Saito S、Takayama I 等。通过表达TMPRSS2的细胞增强对 SARS-CoV-2 的分离。美国国家科学院院刊 2020;117(13):7001–3.Epub格式 2020/03/14.PMID：32165541;PubMed Central PMCID：PMC7132130。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

43.科尔曼 CM，弗里曼 MB。中东呼吸综合征冠状病毒感染的生长和定量。Curr Protoc 微生物。2015;37（1）：15e.2.1-9。Epub格式 2015/09/08.PMID：26344219;PubMed Central PMCID：PMC4735735。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

44.韦斯顿 S、巴拉科 L、凯勒 C、马修斯 K、麦格拉思 ME、洛格 J 等人。SKI复合物是针对冠状病毒、流感和丝状病毒的广谱、宿主导向的抗病毒药物靶点。美国国家科学院院刊 2020;117(48):30687–98.Epub格式 2020/11/14.PMID：33184176;PubMed Central PMCID：PMC7720140。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

45.Weston S、Matthews KL、Lent R、Vlk A、Haupt R、Kingsbury T 等人。酵母抑制基因筛选，用于鉴定哺乳动物 SIRT1 作为中东呼吸综合征冠状病毒复制的前病毒因子。J 维罗尔。2019;93(16).Epub 格式 2019/05/31.PMID：31142674;PubMed Central PMCID：PMC6675885。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

46.Schultz DC、Johnson RM、Ayyanathan K、Miller J、Whig K、Kamalia B 等人。嘧啶抑制剂与核苷类似物协同阻断 SARS-CoV-2。自然界。2022;604(7904):134–40.Epub 格式 2022/02/08.PMID：35130559。

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索