《厦门免费医学论文发表-柑橘黄单胞菌的系统发育分析Citri 菌株揭开引入历史和传播路径》期刊简介
厦门免费医学论文发表-柑橘黄单胞菌的系统发育分析Citri 菌株揭开引入历史和传播路径
抽象
柑橘黄单胞菌柑橘（Xcc）会导致毁灭性的柑橘溃疡病。众所周知，Xcc 在 1915 年、1986 年和 1995 年至少三次不同的事件中被引入美国佛罗里达州，前两次声称已被根除。有人质疑1986年引入的Xcc是否已经成功根除。此外，目前尚不清楚Xcc是如何在佛罗里达州的柑橘园中传播的。在这项研究中，我们调查了Xcc的种群结构以解决这些问题。我们对 343 年至 1997 年间从佛罗里达树林收集的 2016 株 Xcc 菌株的全基因组进行了测序。我们的分析揭示了两个不同的Xcc集群。我们的数据有力地表明，声称根除 1986 年 Xcc 引入并未成功，1986 年引入的 Xcc 菌株存在于 8 年后收集的至少 1994 个县的样本中。重要的是，我们的数据显示，在佛罗里达州抽样的所有 2 个柑橘生产县中都存在的 Cluster 20 菌株起源于 1995 年在迈阿密地区的 Xcc 引入事件。我们的数据表明，波尔克县是第2组Xcc菌株扩散的中心，这与2004年三次主要飓风经过波尔克县的事实一致。由于铜基产品已被广泛用于控制柑橘溃疡病，我们还研究了Xcc菌株是否对铜产生了抗性。值得注意的是，343株菌株中没有一个含有已知的铜抗性基因。随机选择的<>种Xcc菌株对铜敏感。总体而言，本研究为佛罗里达州Xcc的引入、根除、扩散和铜抗性提供了有价值的见解。
作者摘要
对343年至1997年收集的2016株Xcc菌株的基因组进行测序和分析，使我们能够更深入地了解其引入、传播和根除。这些信息对于优化应对检疫病原体入侵的策略至关重要。我们已经最终证明，1986 年的 Xcc 引入并没有成功根除，2004 年的三次大飓风在 Xcc 在整个佛罗里达州的传播中发挥了关键作用，而波尔克县是 Xcc 扩散的中心。此外，没有一个测试的Xcc菌株表现出对铜的抗性，这与其基因组中没有铜抗性基因一致。
数字
Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3
引文： Xu J， Zhang Y， Li J， Teper D， Sun X， Jones D， et al. （2023） 343 柑橘黄单胞菌的系统发育分析。Citri 菌株揭示了引入历史和传播路径。PLoS 病理学 19（12）： e1011876 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876
编辑 器： Michelle Hulin，英国塞恩斯伯里实验室
收到： 18年2023月30日;接受： 2023年15月2023日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 Xu et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 基因组数据和组装基因组的原始测序读数被存放在NCBI数据库中，登录号为PRJNA833305。生物样本、原始数据和组装基因组的 NCBI 登录 ID 显示在 S1 数据集的 Tab B 中。基因组序列和分析脚本存放在Zenodo（https://zenodo.org/records/10015036）。
资金： 该项目得到了佛罗里达柑橘倡议计划、美国农业部国家粮食和农业研究所拨款 2021-67013-34588、2016-70016-24833、FDACS 特种作物整笔拨款计划 AM22SCBPFL1125 和 Hatch 项目 [FLA-CRC-005979] 的资助。资助者没有参与研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿的准备。
利益争夺： 作者声明没有竞争利益。
介绍
柑橘溃疡病，由柑橘黄单胞菌（Xanthomonas citri pv）引起。柑橘（Xcc）是全球最重要的植物病害之一。Xcc 感染叶子、果实和茎，引起口腔溃疡病变、小枝枯萎、叶果脱落以及树木衰退，导致产量和质量下降 [1]。Xcc通过伤口或自然开口（如气孔）感染植物[2]。Xcc最初来自亚洲，现已传播到大多数柑橘生产国，包括美国和巴西[3,4]。Xcc 包含多种病理类型，包括 A、A* 和 Aw.Xcc A是全球最流行的柑橘类病毒，可以感染所有商业柑橘品种。相比之下，Xcc AwXcc A*的寄主范围有限，主要影响墨西哥酸橙（Citrus aurantifolia）和大叶柑橘（Citrus macrophylla）[2,5,6]。除了Xcc，还有另一种病理，Xanthomonas citri pv。柑橘溃疡病（Xca）也会引起柑橘溃疡病。Xca在有限的宿主上诱导溃疡B和溃疡C，这些菌株仅在南美洲报道[7]。由于其对柑橘产业的重大影响，在地中海地区国家和澳大利亚等无溃疡柑橘产区实施了检疫措施。尽管澳大利亚和南非报道了柑橘溃疡病，但已成功根除[8]。在溃疡病流行地区，通常通过叶面喷洒抗菌药物（如铜制品或抗生素）、防风林、无病苗圃植物以及避免高架灌溉来控制[9]。
柑橘溃疡病最初于1910年在美国佛罗里达州报道，源于从日本进口的幼苗，并于1933年被宣布成功根除[7]。然而，在1986年，柑橘溃疡病再次在佛罗里达州海牛县被发现，并于1994年正式宣布根除[2]。此后，这一声明受到质疑[10]。1995年，迈阿密地区报道了柑橘溃疡病的第三次引入[2]。尽管州和联邦机构（佛罗里达州农业和消费者服务部 （FDACS）、植物工业部 （DPI） 和美国农业部动植物卫生检验局 （APHIS））进行了广泛的根除工作，但事实证明，1995 年在佛罗里达州引入的完全根除柑橘溃疡病是无法实现的。由于多种因素，佛罗里达州柑橘溃疡病的强制性根除计划于2006年终止。到2006年;柑橘溃疡病已蔓延到全州;耗尽分配给根除的资金。此外，佛罗里达居民对根除计划提起了许多诉讼。从那时起，佛罗里达柑橘产业采用了综合柑橘管理方法，包括铜应用来控制溃疡病[1]。此外，自2012年和2016年以来，链霉素和四环素已分别用于在佛罗里达州通过叶面喷洒柑橘来控制溃疡病或黄龙病[11,12]。
本研究的主要目的是解决以下问题：1986 年引入的 Xcc 菌株是否被完全根除，Xcc 菌株如何传播到佛罗里达州的各个地点，以及 Xcc 菌株是否具有铜抗性基因。为了解决这些问题，我们采用了系统发育分析[13]。Xcc基因组的测序于2002年首次完成[14]，标志着首批测序的植物病原体之一。此后，更多的Xcc基因组和相关菌株被测序[15\u28]。在这项研究中，我们对 343 年至 1997 年间从佛罗里达柑橘园收集的 2016 株 Xcc 菌株进行了基因组测序。我们的基因组分析为Xcc根除、扩散和铜抗性提供了宝贵的见解。
结果
343 年至 1997 年在佛罗里达州收集的 2016 株 Xcc 菌株的基因组测序
总的来说，我们对343年来（从20年到1997年）从佛罗里达州2016个县的各种柑橘园收集的20个Xcc菌株的基因组进行了测序（S1数据集中的图1和选项卡A）。基于BGISEQ短读长测序，平均测序覆盖深度为272.2 ×。每个菌株平均有 4 个支架（范围：3 至 20 个），基因组大小为 5.21 Mb（范围：5.18 Mb 至 5.38 Mb），获得了从头组装的基因组。通过与Xcc 98和单拷贝标记基因的参考基因组进行比较，每个菌株的基因组完整性平均值分别为3.97%（范围：43.98%至44.100%）和99%（范围：64.100%至306%）（S1数据集中的选项卡B）。这一结果表明，组装的基因组符合基因组序列（MIGS）规范的最低信息[29]。平均而言，每个基因组预测了 4445 个基因（S1 数据集中的选项卡 B）。343 株新测序菌株和 Xcc 306 的平均核苷酸同一性 （ANI） 值为 99.96–99.99%（S1 数据集中的表 C）。343 种新测序菌株和病理型 Xcc A 中的 ANI 值w或 Xcc A* 的范围分别为 99.54% 至 99.56% 和 99.61% 至 99.64%（S1 数据集中的选项卡 C）。343 株 Xcc 菌株不含 xocc A 中存在的 avrGf1 （syn. xopAG）w和 X。维斯卡托里亚LMG911 [30]、xopC1（存在于 Xcc A* 中）和 xopAF（存在于 Xcc A 中）w和 Xcc A*，但在 Xcc A 中没有 [23]。这些结果表明，343株Xcc菌株属于A型病理。尽管这些菌株在不同时间和不同位置从不同的柑橘品种中分离出来，但在基因组序列上表现出高度的保守性（S2数据集中的图1和表A）。
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图 1. 来自佛罗里达的 343 株 Xcc A 菌株的样本信息。
a， 采样点的地理分布。b， 343个样本的宿主分布。c， 343个样本的时间分布。图1A的底图来自美国人口普查局（https://www2.census.gov/geo/maps/general_ref/stco_outline/cen2k_pgsz/stco_FL.pdf）的公共领域网站。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.g001
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图 2. 351 株 Xcc A 菌株的泛基因组。
a， 基于100倍置换采样顺序的泛基因组中检测到的基因的稀疏曲线，中心值表示检测到的基因的中位数。b， 351株Xcc A菌株的泛基因组和核心基因组数量。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.g002
在佛罗里达分离株中发现了两组Xcc菌株
利用通过BGISEQ短读长测序获得的343株新测序菌株的基因组，以及先前报道的来自佛罗里达的23株Xcc菌株[306]和参考菌株Xcc 2，我们推断了Xcc菌株的泛基因组（图4）。泛基因组包括 020,655 个核心基因（存在于所有基因组中）和 2 个辅助基因（图 216A）。在这些辅助基因中，177 个仅存在于一个菌株中，306 个是参考菌株 Xcc 1 独有的（S2 数据集中的选项卡 D）。泛基因组的稀疏分析以及堆定律估计（alpha 值 = 0.2）表明，Xcc 菌株的基因含量达到了平台期（图 <>B），进一步支持 Xcc A 菌株中高度保守的基因组序列的性质。
通过ClonalFrameML估计的重组率与突变率（ρ/θ）的平均比率为0.0264（SD：0.0046）;重组片段（δ）的平均长度为98.3 bp（SD：18.6 bp）;重组和突变的平均相对贡献（r/m）为0.286（SD：0.0005）。这些值表明，佛罗里达的Xcc种群在结构上实际上是克隆的（S1表）。使用 FUBAR（快速无约束贝叶斯近似）方法进行选择检验，鉴定出 20 个经过正选择的基因（S2 表）。通过将原始读数与 Xcc 306 的参考基因组作图，我们鉴定了 2 个新测序的 Xcc 菌株的 146,343 个突变，包括单核苷酸多态性 （SNP）、插入和缺失 （INDEL）。这些突变主要集中在质粒和非编码区（S3表）。基于使用基因组突变和基因存在/不存在图谱的变异参与分析（VPA）（S4表），我们发现时间和地理位置都显着促进了佛罗里达州Xcc A菌株中观察到的基因组变异。
为了更好地了解佛罗里达州Xcc A菌株的进化及其与该州Xcc引入事件的关系，我们采用了系统发育树分析和无监督机器学习方法，如主坐标分析（PCoA）来推断种群结构。除了新测序的 343 个菌株外，还包括来自佛罗里达州的 10 个公开可用的 Xcc 基因组进行分析（S1 数据集中的选项卡 A）。在这 10 个公开可用的佛罗里达 Xcc 基因组中，有两个起源于 1986 年在海牛中引入的 Xcc 菌株，即 LMG9322（1986 年收集）和 MN11（1989 年收集）。在我们新测序的343株菌株中，有1997年在迈阿密地区收集到的菌株，与1995年在迈阿密引入的Xcc菌株接近[10]。不幸的是，没有与1910年在佛罗里达州的第一次Xcc引入事件相关的Xcc基因组。基于SNP（351株）和单拷贝核心基因（353株）序列的系统发育分析均表明，来自佛罗里达的Xcc A菌株聚类为两组（图3和S1）。基于基因组SNP突变谱（351株）的PCoA分析也支持分为两组（图4）。聚类 1 和聚类 2 分别包含 21 和 332 株菌株（选项卡 A S1 数据集）。第2组（包含1997-2016年收集的菌株）包括与1995年在迈阿密发生的Xcc引入事件相关的菌株[10]，例如989年在迈阿密收集的FL1997。相比之下，簇 1（1986 年至 2012 年的菌株）形成了一个遗传上与迈阿密菌株相距甚远的单一分支。该集群还包括与1986年海牛Xcc引入事件相关的菌株，例如LMG9322（1986年收集）和MN11（1989年收集）（图3、4A、4B和S1）。第 1 类中的大多数菌株来自海牛县、德索托县、波尔克县和科利尔县，而第 2 类菌株在所有 20 个采样县中均被发现（图 4C）。此外，我们从世界各地收集了 431 个公开可用的 Xcc A 菌株基因组（S1 数据集中的选项卡 E）。在全球范围内，基于基因组SNP突变的系统发育和PCoA分析也表明，来自佛罗里达的Xcc A菌株分为两组（图5）。来自第1类的菌株与来自东亚和东南亚的菌株密切相关，而来自第2类的菌株与来自南美洲的菌株聚集在一起（图5）。
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图 3. 基于系统发育关系的Xcc A佛罗里达菌株种群结构.
使用BEAST程序基于来自佛罗里达州的351株Xcc A菌株的SNP序列进行系统发育树。*，代表与佛罗里达州Xcc引入事件相关的菌株。绿色和紫色分别表示聚类 1 和聚类 2。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.g003
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图 4. 使用 PCoA 方法的 Xcc A Florida 菌株的种群结构。
使用来自佛罗里达州的 351 株 Xcc A 菌株的基因组 SNP 突变谱，根据样本之间的 Bray 距离进行 PCoA 检测 （a）。b， 两簇Xcc A菌株的时间分布。c， 两簇Xcc A菌株的地理分布。绿色和紫色椭圆分别表示聚类 1 和聚类 2。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.g004
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图 5. 全球Xcc A菌株的种群结构。
使用BEAST程序基于782株Xcc A菌株的SNP序列进行系统发育树（a）。使用 782 株 Xcc A 菌株的基因组学 SNP 突变谱 （b） 根据样本之间的 Bray 距离进行 PCoA。CAC： 中美洲加勒比地区;EA，东亚;FL1： 佛罗里达集群 1;FL2， 佛罗里达集群 2;NIOI，北印度洋岛屿;OP： 大洋洲太平洋;SAM，南美洲;SAS，南亚;东南亚;SWIOI，西南印度洋岛屿;WF，西非。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.g005
佛罗里达Xcc菌株的系统发育关系中存在显著的时间信号（即遗传变异随时间增加）（R2= 0.19，P 值 = 0.036）。因此，我们采用贝叶斯分析来重建佛罗里达州Xcc的地理分布。然而，由于 Cluster1 的样本量较小，信号相对较弱，并且表明 Cluster1 的扩散事件很少。相比之下，对于集群 2，观察到 Xcc 菌株从东部和东北部（拿骚、奥兰治和奥西奥拉县）传播到佛罗里达州中部（波尔克县），并从那里向多个方向传播。第2组的这些多重扩散事件表明，波尔克县是Xcc扩散的中心点（图6A）。这一观察结果与2004年三次大飓风经过波尔克县及其邻近县的事实相吻合（图6B）。值得注意的是，大约81.6%的集群2菌株是在2004年或之后收集的。
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图 6. Xcc 菌株在佛罗里达州第 2 集群中的移动。
a， 佛罗里达Xcc地理扩散的决定因素。使用BEASTv.1.10中实现的马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）在不对称扩散模型下进行离散系统发育扩散分析。采用贝叶斯随机搜索变量选择（BSSVS）方法，利用spreaD3 v0.9.6确定空间扩散的重要路径。这条线旁边的数字是后验概率的值。箭头表示位置之间的传输方向。箭头的颜色表示Xcc传输的资源位置。b，2004年佛罗里达州三次大飓风的路径。图6的底图是从公共领域的美国人口普查局（https://www2.census.gov/geo/maps/general_ref/stco_outline/cen2k_pgsz/stco_FL.pdf）的网站生成的。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.g006
两簇Xcc菌株中与致病性和适应性有关的基因突变
三个Xcc簇的基因含量相似，每个簇都鉴定出一些独特的基因。此外，每个簇都显示出许多独特的基因组突变，包括SNP和INDEL（S2图）。我们对 343 株毒株的致病性和适应性相关基因的突变进行了详细评估。含有 SNP 和 INDEL 的基因在双组分系统、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、群体感应和蛋白激酶等类别中明显过高（Fisher 精确检验，p 值< 0.05）。然而，在已知的致病性基因（如III型分泌系统和效应子）中没有观察到这种过度表达（Fisher精确检验，p值>0.05）。在编码与细菌运动、肽酶、趋化性、转录因子、ABC 转运蛋白和细菌分泌系统相关的蛋白质的基因中也发现了编码区的突变（S5表）。此外，与致病性和适应性相关的基因，包括涉及趋化性、T3SS 和效应子、T2SS、T4SS、T6SS、T4 菌毛、鞭毛、rpf 调节剂、铁代谢、多糖利用酶、生物膜形成和激酶的基因，包含非同义的 SNP 或 INDEL（S1 数据集中的选项卡 F）。值得注意的是，这些SNP或INDEL均不普遍存在于所有343株菌株中，这表明突变是随机的。
铜电阻
自 2006 年柑橘溃疡病根除计划结束以来，铜基抗菌产品已在佛罗里达州柑橘园中广泛使用。我们首先分析了铜抗性基因。copL、copA、copB、copM、copG、copC、copD 和 copF 基因，据报道这些基因是铜抗性的原因。其中，copL、copA和copB被认为是主要贡献者（S6表）[31]。值得注意的是，在343株Xcc菌株中均未鉴定出这些铜抗性基因。随后，我们对 20 种随机选择的佛罗里达 Xcc 分离株进行了测试，以评估它们对铜的敏感性（S7 表）。20株佛罗里达Xcc菌株对铜的敏感性与Xcc306相似，最低抑菌浓度（MIC）为CuSO4浓度为100μg/mL（S7表）。这一发现表明，至少通过众所周知的抗性基因，Xcc菌株尚未对铜基抗菌剂产生耐药性。
讨论
在这项研究中，我们将美国佛罗里达州的 Xcc 人群分为两个集群，表明了两个不同的 Xcc 引入事件。据报道，Xcc被引入佛罗里达三次：第一次是在1910年佛罗里达 - 佐治亚州边境附近，然后是1986年在坦帕湾地区，最后是1995年在迈阿密地区[2]。前两次引入分别于1933年和1994年被宣布根除[2]。由于缺乏 1910 年第一次 Xcc 引入事件的基因组序列，我们无法确定是否有任何 Xcc 菌株与该引入事件相关。然而，1986年Xcc的根除受到质疑，因为Xcc是在2年后在同一地区发现的[10,18]。我们的研究用1994年之后收集的1986个样本验证了这一推测，当时声称根除已经完成。1 年发现的 Xcc 菌株可能属于第 11 类，这从9322 年左右分离出的两个菌株（MN1986 和 LMG2）的存在以及它们主要分布在坦帕湾地区的海牛、德索托和波尔克表明。第 989 组包括 1997 年收集的迈阿密菌株 （FL1995），表明它是 1995 年在迈阿密地区引入 Xcc 的结果。之前的一项研究表明，1996年在迈阿密地区引入的Xcc最初传播到佛罗里达州北部或东北部。据报道，在32年2月的暴雨期间，龙卷风在西南到东北的轨道上穿过迈阿密的柑橘溃疡病感染地区[2]。与此一致，我们的研究结果表明，集群 2004 菌株从北部或东北部传播到佛罗里达州中部及其他地区。波尔克县被认为是第2类毒株的传播中心，可能是由2004年经过波尔克县的三次主要飓风传播的。在我们的研究中，第 1 类菌株的大多数采样点都在 2 年或之后。在这项研究中，我们缺乏来自几个柑橘生产县的Xcc基因组，这些县曾经并且可能仍然受到感染，例如棕榈滩县和布劳沃德县。重要的是，第1957类菌株与来自东亚和东南亚的菌株密切相关，而第1974类菌株与来自南美洲的菌株密切相关，这表明这两个Xcc引入事件可能起源于佛罗里达州。根据这种潜在的Xcc从南美洲传播的途径，柑橘溃疡病于33年在巴西和<>年在阿根廷首次报道[<>]。
根除已成功用于多种入侵植物病害的管理。例如，柑橘溃疡病在1991年、2004年和2018年引进后，在澳大利亚已成功根除三次[34]。然而，在佛罗里达，三次根除Xcc运动中只有一次成功，而1986年和1995年引入Xcc的运动失败了。造成这种情况的一个潜在原因可能是佛罗里达州的飓风，正如我们的研究和其他地方所分析的那样，飓风在2004年广泛传播了Xcc[32,35]。值得注意的是，在6年至1986年间，至少有1994次飓风经过佛罗里达州，包括1992年的安德鲁飓风，这可能促成了1986年引入的Xcc的分布。因此，需要研究如何有效地根除佛罗里达等地的入侵病原体。
在阿根廷[31]、法国留尼汪岛[36]和马提尼克岛[37]有抗铜Xcc菌株的报道，但在佛罗里达州尚未报道这种耐药性。尽管自 2006 年以来在佛罗里达柑橘园中频繁使用铜产品，但在这个阶段，我们在收集的 Xcc 菌株中没有发现任何证据表明它们已经进化出对铜的抗性，至少不是通过众所周知的抗性基因。已知植物病原菌中的大多数铜抗性基因是质粒传播的，包括 X 的铜抗性菌株。Citri PV.柑橘A44 和 X。Euvesicatoria 光伏柑橘 1381 [38]。因此，通过偶联实现铜抗性基因的水平转移是细菌获得铜抗性的主要机制。在佛罗里达州，已经发现了多种耐铜细菌，包括X。Euvesicatoria 光伏柑橘 1381， X.Euvesicatoria 光伏Euvesicatoria，X。 Euvesicatoria 光伏穿孔菌[38]和柑橘附生菌株Stenotrophomonas maltophilia[39]。许多耐铜细菌与佛罗里达州的 Xcc 不同，也不发生在相同的宿主或相同的位置。例如，X。Euvesicatoria 光伏柑橘 1381 在苗圃树中引起柑橘细菌斑，而 X.Euvesicatoria 光伏euvesicatoria 和 X.Euvesicatoria 光伏穿孔菌会感染辣椒或西红柿，但不会感染柑橘。在佛罗里达州，Xcc菌株对铜的敏感性表明，铜基产品仍然是控制柑橘溃疡病的可行解决方案[1]。另一方面，在佛罗里达鉴定出耐铜柑橘附生细菌表明，需要密切监测Xcc的铜抗性发展，并开发其他有效和可持续的控制方法，例如通过突变溃疡病易感基因LOB1来产生抗溃疡病柑橘品种[40\u45]。
总之，我们对 343 年至 1997 年收集的 2016 株 Xcc 菌株进行了基因组测序。我们已经证明，佛罗里达州的 Xcc 种群可以分为两类，1 年引入的 1986 类菌株和 2 年引入的 1995 类菌株。我们已经表明，1986 年的 Xcc 引入并没有成功根除，2004 年的三次飓风在佛罗里达州传播 Xcc 方面发挥了至关重要的作用，波尔克县是 Xcc 传播的中心。
材料与方法
DNA测序和基因组组装
先前通过DPI在佛罗里达柑橘园收集的具有溃疡病症状的柑橘叶中分离出的Xcc菌株的甘油储备储存在-80°C冰箱中。将这些分离株接种在营养琼脂培养基上并划线三次以获得纯菌落。根据制造商的说明，使用Wizard Genomic DNA纯化试剂盒（Promega，Madison，WI）对每种菌株进行基因组DNA提取。使用 Nanodrop One 微量紫外-可见分光光度计（Thermo-Fisher Scientific，Waltham，MA）并在 0.8% 琼脂糖凝胶上电泳测定 DNA 质量和数量。然后将DNA样品储存在-80°C直至进一步使用。
如前所述，使用中国深圳华大基因的BGISEQ343平台，按照制造商的方案对1个样本（S500数据集中的Tab A）进行鸟枪法基因组文库制备和测序[46]。简而言之，将 500 ng 起始 DNA 用于文库生成，并通过超声片段化以产生 400 至 600 个碱基对 （bp） 的片段。然后对DNA片段进行末端修复和A尾，并添加具有特定条形码的接头。对DNA片段进行PCR扩增，生成单链环状DNA文库。BGISEQ500使用双端 100 bp 测序策略对 DNA 文库进行测序。平均而言，每个菌株生成了超过 1.435 亿 bp （Mb） 的原始数据（S1 数据集中的选项卡 B）。
从BGISEQ50测序中获得的原始读长用于通过去除接头序列、修剪和去除低质量读长（具有 N 个碱基和最低质量阈值为 20 的读长）来生成干净的读长。使用Sickle软件[47]进一步修整干净的读长，并丢弃<50 bp的修整读长。使用SPAdes版本3.13.0和默认参数[48]进行从头基因组组装。使用具有默认参数的MEDUSA 306.1版本，基于Xcc 6的参考基因组进一步搭建SPAdes组装的基因组[49]。使用QUAST 2.3版[50]与Xcc 306和CheckM程序1.1.2版的参考基因组使用单拷贝标记基因[51]进行比较评估基因组质量。使用Prokka自动管道版本1.14.6对每个基因组进行基因预测[52]。S343 数据集的 Tab B 中提供了 1 个 Xcc A 菌株的基因组测序、组装和基因预测摘要。
比较基因组分析
我们对 351 株 Xcc 菌株（S1 数据集中的 Tab A）进行了基因组比较分析，包括本研究中来自 BGISEQ 的 343 株新测序菌株、来自先前研究的 7 株菌株 [23] 和参考菌株 Xcc 306。基因组之间的平均核苷酸同一性（ANI）值使用成对原始细胞比对计算。基于Prokka预测的基因，使用Roary程序3.12版本[53]构建了Xcc的泛基因组和核心基因组，参数的同一性设置为90%。基于100倍置换采样顺序对泛基因组中检测到的基因进行稀疏化，如其他专题所述[54]。泛基因组的堆定律估计是在R程序2.1版中使用micropan包55.4版[2]进行的。为了计算重组率与突变率的比值（ρ/θ）以及重组和突变的相对贡献（r/m），我们使用ClonalFrameML程序版本1.11[56]进行了重组分析，共计3,776个单拷贝核心基因。使用MUSCLE版本3.8.31[57]对核心基因的核苷酸序列进行比对，使用trimAl v1.2[58]去除未对齐的区域，然后使用FastTree 2.1.7版本构建最大似然系统发育树[59]。FastTree生成的核心基因组的级联比对和ML系统发育树被用作ClonalFrameML的输入。为了评估正选择对Xcc菌株的贡献，在HYPHY 60.2软件中对Xccc菌株基因组中的2,4个共享基因进行了无约束贝叶斯应用氧化（FUBAR）[021]分析。为了验证分析的可靠性，对 400 个网格点、2 次独立运行和 000,000,<> 次迭代进行了 FUBAR 分析。
通过使用bowtie343版本439.1.306[2]和samtools版本2.2[6]将原始短读长映射到Xcc 61的参考基因组，鉴定了1个新测序的Florida Xcc菌株和2个公开可用的Xcc菌株（S62数据集中的选项卡A和E）基因组中的SNP和INDELs。简而言之，使用具有默认参数的 bowtie306 将 BGISEQ 的原始读段与 Xcc 2 的参考基因组进行比对。BAM 格式的比对文件用于使用 mpileup 管道和质量过滤以及集成在 samtools 程序中的 bcftools 来调用 SNP 和 INDEL。根据Xcc 306参考基因组的基因注释获得SNPs和INDELs的注释。使用Fisher精确检验对含有SNP和INDEL的基因进行KEGG通路富集分析。使用R软件中的VEGAN软件包，基于泛基因存在和基因组突变谱，使用PERMANOVA分析进行时间和地理位置的变异参与分析[63]。采用PCoA和系统发育关系方法测定了Xcc菌株的群体结构。使用R软件中的WGCNA软件包，基于基因组SNP突变谱，使用Bray距离对Xcc菌株进行PCoA分析[64]。使用FastTree 2.1.7版本构建了基于Florida Xcc A菌株SNP序列和单拷贝核心基因的最大似然系统发育树，然后使用TempEst 1.5.3版本检查了时间信号[65]。我们使用基于SNP序列的BEAST2程序2.6版[66]进一步评估了佛罗里达Xcc A菌株的种群结构和进化动态。使用TreeAnnotator v2.6.6 [66]生成了最大分支可信度树，并在FigTree v1.4.4 [66]中可视化。在BEASTv.1.10中实现的马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）的不对称扩散模型下进行离散系统发育扩散分析[67]。采用贝叶斯随机搜索变量选择（BSSVS）方法，利用spreaD3 v0.9.6确定空间扩散路径[68\u69]。
铜电阻基因鉴定
为了鉴定潜在的铜抗性基因，我们使用343株Florida Xcc A菌株和Xcc 306的DNA和蛋白质序列，使用NCBI爆炸工具的blastn和blastp程序（e值小于31e-1）将它们与铜抗性基因的参考基因[5]进行比对[70]。
最低抑菌浓度 （MIC） 的测定
使用肉汤微量稀释法测定铜（CuSO4）对20种随机选择的Florida Xcc分离株的MIC[71]。Xcc 306 作为对照进行比较。简而言之，细菌在 28°C 的营养肉汤 （NB） 中以 200 rpm 振荡 6-8 小时，生长至指数期。将培养物标准化为 OD600 为 0.03（5 × 107 个菌落形成单位 [CFU]/mL），然后分装到 96 孔板的孔中，每孔 180 μL。将化合物的初始测试浓度在培养物中稀释（1：10）（将 20 μL 化合物加入 180 μL 细菌培养物中），并在 28°C 下在固定条件下孵育。在OD 24下监测培养物的48和600小时，与对照样品相比，48小时后没有生长的最低浓度被定义为Xcc的MIC。 使用不含待测化合物的细菌悬浮液和不含细菌培养物的NB培养基作为细菌生长的阳性和阴性对照， 分别。所有测定均在<>个重复孔中进行，并重复<>次。
细菌对铜测定的敏感性
通过测定CuSO的最小抑制浓度（MIC）来检查Xcc菌株对铜的敏感性4使用肉汤微量稀释法对细菌菌株进行消毒[71]。简而言之，细菌在 28°C 下在 NB 中生长至指数期，并以 200 rpm 振荡 6-8 小时。将培养物标准化为OD600纳米的 0.03 （5 × 107CFU/mL）并在NB中分装到96孔板的孔中，每孔180μL。将化合物的初始测试浓度在细菌培养物中稀释（1：10）（将20μL化合物加入180μL细菌培养物中），并在28°C下在固定条件下孵育48小时。在OD下测量细菌生长600纳米，与对照样品相比，导致无生长的最低浓度被认为是细菌的MIC。不含待测化合物的细菌悬浮液和不含细菌培养物的NB培养基分别用作细菌生长的阳性和阴性对照。所有测定均在 4 个重复孔中进行，并重复 <> 次。
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佛罗里达XccA群体基因组的重组率。
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一个 B C D E
1 S1 表。佛罗里达XccA群体基因组重组率
2 R/θ 三角洲 纽 均转/分钟
3 意味 着 0.026497 98.27606 0.109761 0.285824
4 标清 0.004587 18.60789 0.006287 0.000537
5 注：R/theta为重组率除以突变率;delta 是碱基对中重组片段的大小;nu 是每个位点重组的概率;R/m 是重组相对于突变的影响（或通过重组的每碱基对替换与突变的比率。 r/m=（R/theta）*delta*nu。
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S1 表。 佛罗里达XccA群体基因组的重组率。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.s001
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S2 表。 来自XccA菌株的基因在正选择下。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.s002
（XLSX）
S3 表。 343株XccA菌株的基因组突变总结。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.s003
（XLSX）
S4 表。 时间和地点对基因组变异的贡献。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.s004
（XLSX）
S5 表。 343 株 XccA 菌株中含有突变的基因的 KEGG 通路富集分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.s005
（XLSX）
S6 表。 佛罗里达分离的343株柑橘黄单胞菌柑橘亚种铜抗性基因分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.s006
（XLSX）
S7 表。 通过最低抑菌浓度 （MIC） 测定确定的 20 种佛罗里达 Xcc 菌株对铜的敏感性。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.s007
（XLSX）
S1 图。 353株佛罗里达Xcc A菌株的系统发育树。
采用fasttree程序，基于353株Florida Xcc A菌株的核心基因DNA序列进行系统发育树。*，代表与佛罗里达州Xcc引入事件相关的菌株。绿色和紫色分别表示聚类 1 和聚类 2。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.s008
（TIF）
S2 图。
维恩图描绘了两个 Xcc A 菌株簇中的基因 （a） 和基因组突变 （b） 的数量。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.s009
（TIF）
S1 数据集。 一个。本研究中使用的 343 个新测序的佛罗里达 Xcc A 菌株基因组和 10 个公开可用的基因组的样本信息。
B.343株XccA菌株的基因组测序、组装、基因预测和NCBI入藏信息摘要。C.343个佛罗里达XccA和参考菌株基因组的平均核苷酸同一性。D.350株佛罗里达XccA菌株泛基因组的核心和辅助基因。E.来自公共数据库的全球431株Xcc A菌株的样本信息。F.来自343株XccA菌株的致病性或适应性相关基因的突变信息。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011876.s010
（XLSX）
确认
我们感谢Wang实验室成员的建设性建议和有见地的讨论。
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