医学免费医学论文发表-刚地弓形虫琥珀酸脱氢酶复合物的功能和生化特征
抽象
线粒体电子传递链 （mETC） 是一系列膜嵌入的酶复合物，对能量转换和线粒体代谢至关重要。在通常研究的真核生物（包括人类和动物）中，复合物 II，也称为琥珀酸脱氢酶 （SDH），是一种必需的四亚基酶，通过从 TCA 循环中收集电子作为 mETC 的入口点。Apicomplexa是致病性寄生虫，对人类和动物健康有重大影响。该门包括弓形虫，可导致免疫功能低下人群的致命感染。大多数顶复合体，包括弓形虫，都依赖它们的mETC生存，但SDH在很大程度上仍未得到充分研究。先前的研究指出，弓形虫复合体具有九个亚基，而人类则为四个亚基。虽然九个中有两个是经过充分研究的SDHA和B的同源物，但其他七个在其他系统的SDH中没有同源物。此外，将 SDH 锚定在膜上并参与底物结合的 SDHC 和 D 在 Apicomplexa 中没有同源物。在这里，我们验证了七个提议的亚基中的五个作为真正的 SDH 组件，并证明了它们对 SDH 组装和活动的重要性。我们进一步发现，所有五个亚基对寄生虫的生长都很重要，并且SDH的破坏会损害线粒体呼吸并导致自发开始分化为缓殖子。最后，我们提供了五个亚基与膜结合的证据，这与它们在膜锚定中的潜在作用一致，并且我们证明了其中一个亚基 SDH10 中的 DY 基序对于复合物的形成和功能至关重要。我们的研究证实了弓形虫SDH与人类相比的不同组成，并开始探索谱系特异性亚基在SDH功能中的作用，为未来的机制研究铺平了道路。
作者摘要
伞形虫，如弓形虫，是人类和动物的寄生虫，可引起具有全球重要性的疾病，例如弓形虫病，对免疫功能低下者可能是致命的。线粒体电子传递链由一系列酶复合物组成，寄生虫需要这些复合物进行能量代谢和产生重要的代谢物。寄生虫与其人类宿主之间的链及其酶的组成是不同的。在这里，我们研究了链的琥珀酸脱氢酶复合物（复合物II），并确认弓形虫酶与人类相比具有不同的亚基，并且它们对其功能至关重要。我们进一步开始解开寄生虫亚基在酶作用机制中的作用。线粒体电子传递链是弓形虫和其他相关病原体（如引起疟疾的寄生虫）的有效药物靶标。我们在这里表明复合物II对寄生虫的生长很重要，并验证了它与人类版本的差异，从而增强了我们对这一关键寄生虫途径的理解。
数字
Fig 6图1表1图2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6图1表1图2
引文： Silva MF、Douglas K、Sandalli S、Maclean AE、Sheiner L （2023） 刚地弓形虫琥珀酸脱氢酶复合物的功能和生化特征。PLoS 病理学 19（12）： e1011867 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867
编辑 器： Michael L. Reese，UTSW：美国德克萨斯大学西南医学中心
收到： 12年2023月27日;接受： 2023年11月2023日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 Silva et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有数据均在手稿和/或支持信息文件中。
资金： 我们的工作由医学研究委员会 MR/W002221/1 到 LS 和 AM、Wellcome Trust UNS85804 到 LS 和 Wellcome Trust 221681/Z/20/Z 到 AM 的研究资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
线粒体电子传递链 （mETC） 由嵌入线粒体内膜的一系列蛋白质复合物组成，这些复合物将不同线粒体酶收集的电子通过复合物转移到氧气中。mETC活性对细胞存活至关重要，因为它能够或调节基本的代谢途径，如三羧酸（TCA）循环、嘧啶生物合成和线粒体ATP合成。由于其重要性，mETC已在常见的模型真核生物（主要是酵母和哺乳动物）中进行了广泛研究，并在这些系统中详细表征了其复合物的组成和功能[1\u3]。最近，随着对更广泛的生物体库的研究，复合物的组成及其结构和调控特征的差异逐渐暴露出来[4\u8]，这凸显了了解mETC在各种真核生物模型中如何起作用的必要性。这些研究的见解将加深我们对包括病原寄生虫在内的不同生物进化的理解。
顶复合体寄生虫是单细胞真核生物，与酵母和哺乳动物所属的真核生物的ophistoconnt分支不同。因此，对顶复合体线粒体生物学的理解为我们对真核生物的了解做出了重要贡献。此外，这些专性细胞内寄生虫是许多具有重大全球影响的人类和动物疾病的罪魁祸首。特别是，恶性疟原虫每年导致数十万人死于人类疟疾，主要发生在低收入国家，而弓形虫则在全球免疫功能低下的患者中造成危及生命的感染。尽管具有寄生生活方式，但具有mETC的顶复合物在其复杂的生命周期中依赖于电子的传输，并且其一些mETC复合物的活性是生存、传播和传输所必需的[9\u18]。由于这些重要作用，mETC是抗寄生虫药物的靶标，抗疟药阿托伐醌提供了一个典型的例子，该药物靶向复合物III（细胞色素bc1复合物）[19\u21]。尽管有这种潜力，但顶复合物mETC复合物如何工作的细节仍然大多未知。
最近的研究通过不同的生化和蛋白质组学方法探索了顶复合物mETC复合物的组成[10,13,14,22]。这些研究表明，每个mETC复合物都含有亚基，这些亚基在酵母和哺乳动物中无法明确识别，并且可能不存在。在大小、亚基数和亚基同一性方面差异最大的mETC复合体是复合体II。例如，在 T 中。刚地，我们之前的复合物组分析数据预测复合物II包含9个亚基，并在500 kDa时迁移[13]。这些发现得到了其他顶复合体的研究的支持[22,23]，这些研究共同指出，一种复合物比哺乳动物和酵母中甚至线粒体细菌祖先中可见的~130 kDa和4个亚基大得多。然而，这些发现尚未得到验证，新的亚基尚未进行功能研究。
复合物 II，也称为琥珀酸脱氢酶 （SDH），催化琥珀酸氧化为富马酸盐，从而从 TCA 循环中收集电子，然后将它们送入 mETC。因此，SDH是mETC和TCA循环之间的主要纽带，因此在线粒体代谢途径之间的协调中起着非常重要的作用[24]。此外，除了一系列脱氢酶外，SDH是电子进入链的首批入口之一。在SDH催化的反应中，从琥珀酸盐中利用的电子通过FAD辅因子和三个铁硫（2Fe-2S）团簇转移，将泛醌还原为泛醇，然后将电子穿梭到配合物III。因此，泛醌结合位点在SDH的整体催化反应中起着关键作用。
在ophistokonts和细菌中，SDH由四个亚基（SDHA-D或SDH1-4）组成，它们共同形成一个复合物，可以大致分为两个主要结构域：基质定位酶核心和膜锚定结构域。在哺乳动物中，SDHA 和 SDHB 构成面向基质的结构域，其中包含琥珀酸盐结合位点、FAD 辅因子（均在 SDHA 内）和三个 2Fe-2S 簇（在 SDHB 内）。SDHC和SDHD形成膜锚定结构域，并含有血红素b假体基团[25]。两个泛醌结合位点是通过来自多个亚基的氨基酸促成的相互作用形成的。一、高亲和力，位点（Qp-proximal）位于内膜的基质侧，由SDHB、C和D的残基以及另一个低亲和力位点（Qd-远端）更靠近膜间隙[25]。在顶复合物中，SDHA和SDHB的同源物很容易通过基于序列的搜索来识别[26,27]。然而，使用同源性搜索无法找到 SDHC 和 SDHD 的明确同源物。因此，人们很容易提出，在复合组研究中发现的假定的新亚基可能会取代SDHC和SDHD的作用。在这里，我们旨在验证 T 的新假定亚基。刚地SDH，研究它们对寄生虫生长和复合物组装和功能的重要性，并阐明它们在复合物中的作用。
结果
定位和原生迁移验证了五个新的弓形虫 SDH 亚基
我们之前的复合组分析研究[13]根据它们与已知亚基SDHB的同源物的共迁移，确定了七个假定的新型SDH亚基（表1：总结了假定的亚基及其建议的名称）。在恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的类似复合组研究中，也发现了这22种蛋白质中28种蛋白的同源物[10]。我们试图验证这些预测。我们推断，所有新的SDH亚基都会在线粒体中发现。先前在弓形虫中进行的同位素标记细胞器蛋白超定位（HyperLOPIT）研究[13]以及线粒体基质蛋白质组[29]的数据支持了1个新亚基中15个的线粒体定位[40]。为了确认这五种蛋白质的线粒体定位并评估另外两种候选物的定位，我们在寄生虫中瞬时表达了七种蛋白质中每一种的异位 Ty 表位标记拷贝。然后，我们进行了免疫荧光测定，共染色了Ty和线粒体标志物TgMys[30]。所有亚基都与线粒体标记物共定位，表明线粒体定位（图1A）。我们进行了超分辨率显微镜检查了假定的SDH15和线粒体外膜蛋白TOM40的定位[1]。信号的叠加为线粒体定位提供支持。（S15A 图）。由于SDH嵌入线粒体内膜，我们预计其亚基将定位于该区室。我们进行了超扩增显微镜检查了假定的 SDH40 和 SDHB 与线粒体外膜蛋白 TOM1 的定位（图 <>B）。信号的叠加表明 SDH<> 和 SDHB 与 TOM<> 位于不同的区室中（S<>B 图），分别与线粒体内膜和外线粒体膜的定位一致。
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图 1. 假定的弓形虫 SDH 亚基定位于线粒体，是 ~500 kDa 复合物的一部分，SDH15 与 SDHB 相互作用。
（A） 用 Ty 表位标签（青色）瞬时标记的假定 SDH 亚基的免疫荧光测定分析，显示与线粒体标记蛋白 MYS （TGME49_215430， [29]） （品红色）共定位。比例尺为5μM。（B） 超膨胀显微镜图像显示为 SDHB-HA 和 SDH3-Ty 的 Z 堆栈（左图和中图）和 15D 重建（右图），带有线粒体标记蛋白 TOM40。比例尺为3μM。（C） 来自 Ty 表位标记推定的 SDH 亚基和 SDHB-HA 的总裂解物，用 BN-PAGE 分离，印迹并用抗 Ty 或抗 HA 抗体进行免疫标记。所有样品均在同一凝胶上分离，为清晰起见，不同样品显示了不同的曝光量。S1D中完整的未处理凝胶图。（D） 对从 rSDH15/ SDHB-HA + SDH15-Ty 中提取并用抗 HA 或抗 Ty 抗体偶联微珠免疫沉淀的全细胞裂解物进行免疫印迹分析，以产生总裂解物 （T）、未结合 （UB） 和结合 （B） 馏分。样品通过SDS-PAGE分离，印迹，并使用抗HA和抗Ty抗体标记免疫沉淀蛋白，并使用抗TOM40作为无关线粒体蛋白对照进行检测。（E） SDHB-HA 和 QCR2-HA 免疫沉淀蛋白质组学数据的火山图，显示 -log10 p 值和对数2通过质谱法在四个独立实验中检测到的蛋白质的倍数变化。复合物III亚基用蓝色标记，复合物II亚基用红色标记。灰色虚线表示 p < 0.05）。
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表 1. 推定的 SDH 亚基的详细信息。
表型评分取自[31]。新亚基的名称被赋予前缀SDH，后跟近似分子量，但先前命名的亚基除外*[63]。使用 PRED-TMR [64]、CCTOP [65] 和 TMbed [66] 预测跨膜结构域 （TMD） 以及预测的 TMD 数量进行预测。
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我们进一步推断，任何SDH组分都会在~500 kDa时迁移，就像它们在络合组中所做的那样[13]。为此，我们构建了稳定的品系，其中每种蛋白质的异位Ty表位标记拷贝稳定表达。我们生成了编码五个假定亚基（SDH10、11、15、23 或 31）的基因的 Ty 标记的稳定系，免疫印迹分析证实异位 Ty 标记蛋白在其预测大小下被检测到（S2A 图）。对于每个品系，我们将寄生虫细胞溶解在非离子洗涤剂十二烷基-β-D-麦芽糖苷 （βDDM） 中，并进行蓝色天然 PAGE，然后用抗 Ty 抗体进行免疫印迹。虽然在假定的SDH11的情况下，天然PAGE上的信号不足以通过免疫印迹解析其迁移，但其他四条线显示出~500 kDa的单条带（图1C和S1D），与SDHB-HA对照的迁移一致，如先前所示的SDHB-HA [13]。这些观察结果表明，至少测试的四个亚基作为大分子量复合物的一部分迁移，与它们是SDH亚基一致。
为了提供其中一个新亚基与保守亚基SDHB之间相互作用的直接证据，我们进行了互惠共IP。我们构建了一个系，其中假定的 SDH15 表达为异位 Ty-表位标记的拷贝，在 SDHB 内源性 HA 标记的背景中 [13]。然后，我们使用 HA 琼脂糖微珠进行了 IP。在结合部分中，SDHB-HA和假定的SDH15-Ty均被回收（图1D）。在未结合部分中均未发现，仅在未结合部分中发现不相关的线粒体蛋白 TOM40，从而为 co-IP 特异性提供对照。使用 Ty 磁珠执行倒数 IP 返回相同的结果，在结合部分中回收了 SDHB-HA 和假定的 SDH15-Ty。这些结果表明，SDHB和假定的SDH15相互作用，或具有共同的相互作用伙伴，表明它们都是同一复合体的一部分。最后，为了提供进一步的相互作用证据，我们进行了SDHB-HA和复合物III的QCR2-HA的IP[13]，并将洗脱液送去质谱分析。在四个独立实验中，与QCR2-HA IP相比，我们确定了九个假定亚基中的八个在SDHB-HA IP中富集（图1E，S3A，S3B和S2表， PXD047027）。相反，与 SDHB-HA-IP 相比，我们检测到 QCR2-HA IP 中富集的 <> 个复合物 III 亚基。这些数据进一步支持新亚基与保守的复合物II亚基SDHB和SDHA属于同一复合物。
假定的新亚基是SDH稳定性和功能所必需的
线粒体定位和迁移的证据与弓形虫SDH的大小相符，为候选蛋白作为该复合物的一部分提供了支持。因此，我们探索了每种蛋白质对SDH组装和功能的贡献。为此，我们转向生成五个假定成分中的每一个的突变体，SDH10,11,15,23或31。先前的研究表明，弓形虫mETC复合物的成分通常对寄生虫适应性很重要，而复合物III和IV亚基的突变体在标准培养条件下无法生长[10,13,14,16]，这表明SDH亚基也可能对适应性很重要。与这一预期一致，弓形虫全基因组CRISPR对培养物生长的筛选预测，所有31个基因都可能有助于寄生虫适应性[13]。因此，我们选择为它们中的每一个生成条件突变体。使用父 T。刚地系，其中SDHB被内源性HA标记[2]作为背景，通过我们的启动子替换策略（S2B-S32C图）生成五个基因中每个基因的条件敲低系，其中添加脱水四环素（ATc）导致目的基因的下调[2].我们将这些行称为“r（子单位名称）/SDHB-HA”（r 表示可调节）。RT-qPCR证实，在加入ATc两天后，五个基因中的每一个的表达都显着下调（S<>D图）。每个细胞系还补充了稳定整合的 Ty 表位标记版本的基因，该基因在组成型启动子的控制下，不受 ATc 调节，作为对照。我们将这些行称为“r（子单位名称）/SDHB-HA–（子单位名称）-Ty”。
使用这些突变体，我们检查了任何新亚基的耗竭是否会影响SDH的稳定性。在不存在或存在 ATc 的情况下培养 rSDH15/SDHB-HA 寄生虫一、二或三天后，我们进行了蓝色天然 PAGE，然后用抗 HA 抗体进行免疫印迹以追踪 SDHB-HA 的迁移，SDHB-HA 可作为完全形成的 SDH 的指标。在第二天观察到~500 kDa的高分子量条带丢失，表明在此时间点没有形成或非常低水平的成熟复合物（图2A）。尽管SDHB-HA仍然可以在变性免疫印迹中检测到，尽管水平降低（图2A）。作为对照，用ATc处理亲本系SDHB-HA三天对SDHB天然迁移没有影响（图2B）。同样，当使用补补品系rSDH15/SDHB-HA–SDH15-Ty进行相同的实验时，SDHB-HA高分子量条带在ATc处理三天后仍然可见（图2C）。这些数据表明，假定的SDH15是SDH稳定性所必需的。敲除这些其他亚基后 SDHB-HA 水平的降低提出了 SDHB 稳定性可能取决于复合物完整性的可能性。为了控制该突变体中的一般线粒体缺陷，进行了蓝色天然 PAGE 和蛋白质输入转位子组分 TOM40 的免疫印迹，以及透明的天然 PAGE，然后进行凝胶内复合物 IV 活性测定。我们发现 TOM 复合物和复合物 IV 都不受假定的 SDH15 耗竭的影响，这表明其耗竭导致 SDH 特异性缺陷（图 2D–2E）。为了支持特定的SDH缺陷，该突变体的线粒体形态也保持不变，这与另一种线粒体突变体不同，该突变体对线粒体形态有已知影响（VDAC耗竭[33]）用作对照（S4图）。对其他500个亚基进行天然迁移实验。在所有病例中，ATc处理第2天亚基的耗竭导致2 kDa SDHB-HA条带消失，而在变性免疫印迹中仍然可见一条条带，并且这种复杂的稳定性缺陷在补体系中被挽救（图2F）。再次作为对照，我们发现TOM复合物和复合物IV都不受四个亚基中任何一个的耗竭的影响（图<>G和<>H），这表明它们的耗竭导致SDH特异性缺陷。
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图 2. 推定的弓形虫 SDH 亚基对其稳定性很重要。
（A） 通过 BN-PAGE 分离在不存在 （15） 或存在 ATc 0-40 天的情况下生长的 rSDH15/SDHB-HA 寄生虫的总裂解物，并使用抗 HA 抗体进行免疫印迹分析。样品也通过SDS-PAGE分离，并用抗HA和抗TOM0抗体进行免疫标记。（B） 用 BN-PAGE 和 SDS-PAGE 分离在不存在或存在 ATc 三天的情况下生长的 SDHB-HA 总裂解物，并按 （A） 进行免疫标记。（C） 在不存在 （15） 或存在 ATc 三天的情况下生长的 rSDH15/SDHB-HA 寄生虫的总裂解物，以及在存在 ATc 的情况下生长 15 天的 rSDH15/SDHB-HA -SDH0-Ty （cSDH15） 的总裂解物，由 BN-PAGE 和 SDS-PAGE 分离并进行免疫标记，如 （A） 所示。（D） 在不存在 （0） 或存在 ATc 三天的情况下生长的 rSDH40/SDHB-HA 寄生虫的总裂解物通过透明天然 PAGE 分离，并染色以检测复合物 IV 活性。（E） 在不存在 （10） 或存在 ATc 三天的情况下生长的 rSDH11/SDHB-HA 寄生虫的总裂解物，用 BN-PAGE 分离并用抗 TOM23 抗体免疫印迹。（FH） rSDH31、0、<> 或 <>/SDHB-HA 和补补品系在没有 （<>） 或存在 ATc 的情况下生长三天，并由天然 PAGE 隔开，如 A、C 和 D 中所述。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.g002
接下来，我们进行了分光光度法酶促测定，以确定每个新亚基耗尽时SDH的活性。将来自ATc处理和未处理的突变体以及处理过的互补系的裂解物与底物琥珀酸盐和泛醌类似物癸基泛醌（DUB）一起孵育。SDH 的琥珀酸氧化导致 DUB 的还原，进而还原染料 2,6-二氯苯酚吲哚酚 （DCPIP），然后改变颜色，提供 SDH 活性的代理。在五个突变体中的每一个中，用ATc处理三天导致活性降低，并且该缺陷在补系中得救（图3A和S3表）。作为对SDH活性测定特异性的对照，而不是寄生虫代谢的一般缺陷，我们对脱氢酶MQQ进行了活性测定，该测定使用苹果酸作为底物而不是琥珀酸盐。裂解物用苹果酸而不是琥珀酸盐供货，我们观察到每个亚基的耗竭不会像预期的那样影响酶活性（图3B和S3表）。这些观察结果表明，新蛋白质是SDH酶活性所必需的。
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图 3. 假定的 SDH 亚基的耗竭导致 SDH 活性和耗氧量降低。
（A） 亲本、rSDH10、11、15、23 或 31/SDHB-HA 和补辅寄生虫的 SDH 活性，在存在或不存在 ATc 的情况下生长 100 天。图表显示了来自三个独立生物学重复的平均相对SDH活性-/+ S.D.。无 ATc 设置为 3%，并且通过单样本 t 检验比较加 ATc 条件。SDH 活动值位于 S10 表中。（B） 亲本、rSDH11、15、23、31 或 100/SDHB-HA 寄生虫的 MQO 活性，在存在或不存在 ATc 的情况下生长三天。图表显示了来自三个独立实验的平均相对MQO活性-/+ S.D.。无 ATc 设置为 3%，并且通过单样本 t 检验比较加 ATc 条件。S15 表中的 MQO 活动值。（D） 使用海马分析仪对 （i） 基础线粒体耗氧率 （OCR） 进行细胞外通量分析;（ii） SDHB-HA、rSDH15/SDHB-HA 和 rSDH15/SDHB-HA—SDH3-Ty 寄生虫的最大线粒体 OCR 和 （iii） 细胞外酸化率 （ECAR） 在存在或不存在 ATc 的情况下生长 <> 天。图表显示了来自三个独立生物学重复的平均值 -/+ S.D.。先进行方差分析，然后进行土耳其的多对比较，并显示相关对的 p 值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.g003
既往对弓形虫mETC的研究发现，mETC复合体中的突变体导致线粒体耗氧率（moochondrial oxygen consumption rate， mOCR）降低，mOCR可作为呼吸活动的替代测量指标[10,14]。作为电子进入mETC的切入点之一，预计SDH破坏将导致呼吸缺陷。我们再次关注假定的SDH15，并使用海马细胞外通量分析仪检查其耗竭对mOCR的影响，使用先前建立的测定方法[10,34]。我们最初测量了在存在或不存在 ATc 的情况下生长的寄生虫的基础 mOCR 三天。我们在亲本系中检测到基底mOCR没有差异，但在耗竭突变体中，我们看到显着减少，并且该缺陷在补补系中得救[图3C（i）]。在测量最大mOCR时也看到了类似的模式[图3C（ii）]，这是在添加原生载体FCCP后完成的，FCCP使耗氧量与ATP合成脱钩。我们同时测量了细胞外酸化率（ECAR）作为一般寄生虫代谢的代表。这在假定的 SDH15 耗竭时不受影响 [图 3C（iii）]），表明观察到的 mOCR 降低是由于 mETC 中的特定缺陷，而不是寄生虫代谢或活力的一般降低。这些数据表明，推定的SDH15对线粒体耗氧量很重要，尽管mOCR降低的幅度不如复合物III和复合物IV突变体明显[10,14]，这可能是由于其他脱氢酶的代偿作用。
综上所述，复杂稳定性和功能的定位、迁移和必要性验证了假定的 SDH10、11、15、23 或 31 是真正的 SDH 亚基。
SDH 对寄生虫适应性很重要，其破坏导致培养物中自发分化为缓殖子
SDH是电子进入mETC的首批入口之一，也是TCA循环和呼吸与ATP合成之间的重要协调。因此，正如上述CRISPR筛选所预测的那样，预计SDH对寄生虫的适应性很重要（表1）。为了验证这一假设，我们进行了斑块测定。我们发现 SDH10、11、15、23 和 31 的耗竭会导致严重的生长缺陷，导致斑块大小大大减小（图 4A 和 4B）。该表型在补色系中获救（图4C），证明了观察到的缺陷的特异性。因此，虽然所有新的亚基都有助于适应性，但它们可能不是绝对必要的，或者敲低可能不够严格，无法完全消融 SDH 活性。为了进一步表征 SDH 对寄生虫生长的重要性，我们对亲本和 rSDH11/SDHB-HA 寄生虫进行了复制测定。我们在存在或不存在 ATc 的情况下培养寄生虫两天，并允许寄生虫侵入 HFF 单层，在相同条件下再生长 24 小时，然后进行免疫荧光测定并评估寄生虫复制。我们量化了每个液泡的寄生虫数量，发现在ATc中生长的rSDH11品系中含有4个或更多寄生虫的液泡数量显着减少（图30D）。在无ATc对照中没有观察到这种表型，我们观察到所分析的液泡中有<>%由八个或更多的速殖子组成。这些结果表明，新的SDH亚基有助于寄生虫的生长和复制。
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图 4. 新型弓形虫SDH亚基对寄生虫生长很重要。
（A） 亲本和 rSDH10、11、15、23 或 31/SDHB-HA 寄生虫的斑块测定，在存在或不存在 ATc 的情况下生长 10 天。（B） （A） 进行三个独立实验并每次重复测量 100 个斑块的斑块大小的定量。将每个无 ATc 重复的平均值设置为 11%，并绘制每个加 ATc 重复的平均值。通过单样本 t 检验将每个加 ATc 重复的平均值与无 ATc 进行比较。（C） 补体系的斑块测定，在存在或不存在 ATc 的情况下生长 2 天。（D） 亲本寄生虫和 rSDH100 寄生虫每个液泡寄生虫数量的量化。寄生虫在存在或不存在 ATc 的情况下生长 1 天，然后接种到新鲜的 HFFs 细胞中，并在存在或不存在 ATc 的情况下再生长一天。值是来自三个独立实验的平均值 +/- S.D。>每次重复计数 35 个液泡。先进行方差分析，然后进行土耳其的多对比较，并显示相关对的 p 值。（E） 亲本 cKD-ISU1-HA [10] （rISU10）、rSDH10/SDHB-HA （rSDH10） 和 rSDH10/SDHB-HA—SDH45-Ty （cSDH5） 寄生虫的免疫荧光测定，用 ATc 处理 10 天，用 GAP1（品红色）标记以检测寄生虫和双花白桐凝集素 （DBL）（黄色）以勾勒出新生囊肿壁。比例尺为100μM。（E） 定量在 （D） 所示的 ATC 存在下生长的 rSDH<> 和 rISU<> 的 DBL 阳性液泡。数据来自三个独立实验;每次重复计数<>个液泡。值为平均值 -/+ S.D.，通过学生 t 检验进行比较。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.g004
最近的一项研究表明，线粒体功能受损与弓形虫阶段转换的启动之间存在联系[35]。具有呼吸、翻译和铁硫（Fe-S）簇生物合成等线粒体功能缺陷的突变体表现出不完全分化表型，形成囊状结构，并表达中间缓殖子标志物，但从未进展为成熟的缓殖子。为了检查在 SDH 破坏时是否也观察到类似的表型，我们分析了 SDH10 耗尽后培养物中发育迟小子的自发分化。通过免疫荧光测定法鉴定已开始分化的寄生虫，其中通过用双花多利库菌凝集素 （DBL） 染色来鉴定囊肿样结构，DBL 可识别新生囊肿壁中的糖蛋白。我们发现，在ATc存在下生长11天的SDH10突变体中，4%的液泡呈DBL阳性，这表明该突变体触发了阶段转换（图1E）。在互补系中未观察到DBL阳性液泡，在ATc中生长的亲本品系中只有不到4%的液泡为DBL阳性（S1表）。当我们生长在线粒体Fe-S生物发生中的突变体rISU35时，我们还看到了DBL阳性液泡，先前显示显示部分阶段转换[55]。DBL阳性液泡数量的定量显示rISU系中的液泡数量较高（11%对4%）（图4F和S30表），表明部分转化表型在SDH突变体中不太明显。我们的突变体中DBL阳性液泡的百分比也不如其他具有线粒体功能缺陷的突变体所见，例如复合物III亚基耗尽的寄生虫（35%）或线粒体亚基耗尽的寄生虫[35]，尽管它们是在两天的时间点测量的，然而，与之前的研究不同，在用ATc治疗的亲本品系中检测到5%的DBL阳性液泡，我们检测到不到1%（S4表），表明我们手上的灵敏度较低，这可能是一些观察到的差异的原因。
新亚基是将SDH锚定在膜中所需的完整膜蛋白
SDH10、11、15、23 和 31 对 SDH 的形成和功能至关重要，以及它们对寄生虫适应性的重要性，这一发现提出了它们在复合体中的作用问题。在植物拟南芥中，线粒体SDH也由四个以上的亚基（36个）组成，并且有人提出非催化亚基在膜中锚定复合物中发挥作用[5]。同样，纤毛虫嗜热四膜虫中的SDH包括37个亚基，结构研究表明，非催化亚基介导膜锚定[38]。因此，我们假设这里确定的亚基也是如此。为了验证这一假设，我们首先使用AlphaFold [10,11]进行了结构预测，我们模拟了弓形虫SDHA和SDHB同源物以及SDH15、23、31、39和2，并使用ChimeraX上的匹配工具将它们叠加到实验确定的真核生物SDH结构上[88]（禽SDH—PDB：40H5 [5]).正如预期的那样，SDHA和SDHB的折叠主要是保守的，尽管与鸟类结构相比，SDHB可能具有额外的突起（图5A-11C和S5）。此外，根据我们的假设，以及其他系统中提出的建议，这七个新组分形成了一个大小合适的结构域，并且处于介导膜锚定的正确位置，其中 1 个长螺旋垂直于 SDHA 和 SDHB 排列，并且每个新亚基都为可能与膜接触的区域贡献一些氨基酸（图 31C）).我们还使用各种预测算法评估了这些含有跨膜结构域的新SDH蛋白的可能性（表<>）。除SDH<>外，所有预测都包含跨膜结构域，但是预测工具之间存在很大程度的差异。
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Fig 5. Novel Toxoplasma SDH subunits are integral membrane proteins.
(A) Schematic of the canonical SDH, with the matrix facing SDHA and SDHB subunits in light blue and red, and integral membrane SDHC and SDHD subunits in orange and pink. (B) Diagram of Avian SDH crystal structure, (PDB: 2H88 [40]), colour-coded as in A. (C) Space-filled and ribbon homology models of Toxoplasma SDH, generated using alphafold and matchmaker. SDHA (blue) and SDHB (red) are similar to the canonical structure, and the new subunits are placed in the membrane region. (D) Immunoblot analysis of rSDH15/ SDHB-HA—SDH15-Ty parasites treated with 1% Triton X-100 (TX-100) or sodium carbonate (Na2CO3) at pH 11.5 and separated by centrifugation to give a supernatant (S) and pellet (P) fraction. A total fraction, before treatment (T) is also analysed. SDH15-Ty is found in the pellet fraction of Na2CO3, like the integral outer membrane protein TOM40, whereas SDHB-HA is found in the soluble supernatant fraction, like the matrix subunit of ATP synthase, ATPβ. (E) Immunoblot analysis of whole cell lysate extracted with sodium carbonate from cells expressing SDHB-HA and either SDH10/11/23 or SDH31-Ty. TOM40 and ATP β are used as marker proteins for the pellet and supernatant fraction respectively. (F) 1% Triton X-100 (TX-100) extractions and immunoblot analysis of SDH10/11/23 or SDH31-Ty.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.g005
为了支持新确认的亚基的膜锚定作用，我们进行了碳酸钠提取，可以区分外周膜蛋白和整合膜蛋白[30]。碳酸钠萃取将样品分离成含有完整膜蛋白的沉淀部分和含有可溶性和外周结合膜蛋白的可溶性部分。我们最初在表达 Ty 标记版本的 SDH15 的行上进行提取，在表达 HA 标记的 SDHB 的行中。正如预期的那样，SDHB是其他系统和我们预测结构中的外周相关蛋白，与外周相关膜蛋白ATPβ一起作为对照（图5D）。在膜组分中检测到SDH15，以及用作对照的整合膜蛋白TOM40（图5D）。样品还用去污剂Triton X-100进行提取，以测试蛋白质本身不是不溶的。正如预期的那样，在可溶性馏分中检测到SDH15-Ty。当在SDHB-HA背景中用表达Ty标记的亚基SDH10、11、23和31的品系重复这些实验时，也获得了类似的结果（图5E和5F）。该数据表明，五个新的SDH亚基是完整的膜蛋白，这与将酶结构域锚定到膜中的作用一致。
A DY motif of SDH10 is required for SDH function and formation
In the commonly studied yeast and mammalian systems, the membrane anchoring domain of SDH contains the binding sites for ubiquinone. We reasoned that the new subunits would replace this critical function. However, our structural prediction did not reveal an identifiable binding site, and alignment of each of the new components with SDHC and SDHD homologs from different organisms failed to identify conserved motifs (S6 Fig). We therefore opted to focus on motifs that are strictly conserved among the myzozoan homologs of each of the five subunits. Sequence alignments performed for the myzozoan homologs of SDH11, 15, 23 and 31 did not identify amino acids that are both conserved among all homologs of a given subunit, and for which there is a proposed role in SDH from other organisms (S7 Fig). However, the alignment of myzozoan SDH10 homologs revealed a conserved DY motif (Fig 6A), the presence of which was also highlighted in the Plasmodium falciparum homolog, PF3D7_1448900, in a previous study [22]. A DY motif of SDHD was shown to contribute to one of the ubiquinone binding sites in mutational analysis of yeast SDH, whereby the tyrosine (Y) is forming a hydrogen bond with ubiquinone at the Qp site [41,42], and we thus hypothesised that it may play a similar role within SDH10. To test this hypothesis, we examined the effect of mutation in the DY motif on SDH activity, via complementation of rSDH10/SDHB-HA with a minigene encoding a mutant form of SDH10-Ty where the DY motif is mutated to AA. First, we performed immunoblot analysis of the new line with parasites grown in the presence or absence of ATc and showed the SDH10DY>AA-Ty protein is detected (Fig 6B). Notably, the protein levels of SDH10DY>AA-Ty were increased upon addition of ATc, suggesting possible post-translational regulation of subunit abundance. Next, we confirmed that the SDH10DY/AA-Ty is still localized to the mitochondrion (Fig 6C). Together these data suggests that the protein has likely not misfolded or degraded. Next, we performed the SDH enzymatic assay with the line complemented with the mutant subunit, rSDH10/SDHB-HA–SDH10DY/AA-Ty. Complementation with SDH10DY/AA-Ty was unable to restore SDH activity upon ATc treatment (Fig 6D). These observations suggest that the DY motif is required for SDH10 function. Finally, we tested the effect of the DY to AA mutation on complex formation. Native-PAGE and immuno-blotting revealed that the high-molecular weight band of SDHB-HA is reduced in the line complemented with SDH10DY/AA-Ty at day three of ATc treatment (Fig 6E), similar to what is seen when SDH10 is depleted. This observation suggests that the decrease in activity is accompanied with a decrease in complex formation, providing support for SDH10 fulfilling a role that replaces SDHD in yeast.
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图 6. SDH10 的 DY 基序对 SDH 的形成和活性至关重要。
（A） 来自myzozoa的SDH10同源物的比对，具有保守区域和DY基序。Tg弓形虫;Tp， 小蒲公英;Et， Eimeria tenella;Bb， 牛巴贝虫;PF， 恶性疟原虫;Pb， 白鲷（Plamodium baeghei）;下午，Perkinsus marinus。（B） rSDH10/ SDHB-HA—SDH10-DY>AA-Ty （cSDH10型号：DY>AA） 在不存在 （0） 或存在 ATc 的情况下生长 40 天，通过 SDS-PAGE 分离，并使用抗 Ty、抗 HA 和抗 TOM10 抗体进行免疫印迹分析。（C） rSDH10/SDHB-HA—SDH10-DY>AA-Ty （cSDH<>型号：DY>AA）在存在或不存在 ATc 的情况下生长 5 天，并用 Ty 和线粒体标记蛋白 MYS 的抗体标记。比例尺为10μM。（D） rSDH10/ SDHB-HA—SDH10-DY>AA-TY （cSDH0 DY>AA） 的 SDH 活性在不存在 （3） 或存在 ATc 的情况下生长 3 天。图表显示了来自 10 个独立实验的平均 SDH 活性 -/+ S.D.。无和加 ATc 条件通过学生 t 检验进行比较。（E） rSDH10/ SDHB-HA、rSDH10/ SDHB-HA—SDH10-Ty （cSDH<>WT型）和rSDH10/ SDHB-HA—SDH10-DY>AA-Ty （cSDH10型号：DY>AA）在没有 （0） 或存在 ATc 的情况下生长三天，通过 BN-PAGE 分离并用抗 HA 抗体进行免疫印迹分析。样品也通过SDS-PAGE分离，并用抗HA和抗TOM40抗体进行免疫标记。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.g006
讨论
SDH 是线粒体代谢网络中的重要参与者，是 mETC 和 TCA 循环共享的唯一酶。许多结构研究（例如[25,40,43,44]）表明，SDH在真菌和动物（opisthokonts）以及细菌中的整体结构和四个亚基组成具有显著的保守性，这最初表明了一种普遍保守的酶[45]。然而，对越来越多的生物体的研究，如胚胎植物（陆地植物）、锥虫（原生动物寄生虫）和纤毛虫（纤毛原生生物）揭示了不同成分的SDH复合物。在opisthokonts和细菌之外的许多情况下，已经描述了包含四个以上亚基的超分子复合物。与这些发现一致，先前的研究表明，顶复合体SDH由多达13个亚基组成，其中包括催化性SDHA和B的直系同源性亚基，以及多达22个非催化亚基，这些亚基在Myzozoan分支以外的生物体中未发现同源物[10,11]。我们在这里的工作验证了弓形虫SDH15、23、31、<>和<>中的七个中的五个。我们进一步证明，每个亚基对于复杂的形成和功能都很重要，因此对于寄生虫的适应性也很重要。这些发现将弓形虫添加到具有超分子SDH的不断增长的生物库中。
在不同系统中发现的发散性非催化亚基的作用是什么？鉴于两个催化亚基的普遍守恒，一种直观的可能性是，任何其他亚基都有助于形成负责膜锚定和泛醌结合的结构域。植物超分子SDH的研究结果支持这一选择：在四亚基模型中，膜结合域由两种跨膜蛋白SDHC-D / SDH3-4构建，它们包括三个平行的跨膜螺旋，共同形成一个六螺旋。在植物中，两个非催化亚基SDH6和7被证明介导膜锚定，并且提出这两个亚基在SDH3和4中提供缺失的螺旋，以产生与四个亚基复合物一样的六螺旋束[36]。在弓形虫的情况下，我们的结构预测指出非催化亚基贡献了 11 个螺旋，这与提出的六螺旋模型不同。然而，在预测的结构中，螺旋线彼此堆叠，这与四个亚基结构中描述的“笼状”束不同。这可能是预测算法的局限性，直接结构研究可能在未来能够解决。尽管如此，该预测为这里研究的所有五个亚基在膜锚定中的作用提供了支持，我们的实验为所有五种被膜结合的蛋白质提供了强有力的支持，这与这一作用一致。此外，五个亚基中每个亚基的耗竭导致SDHB与复合物的解离，如其天然凝胶迁移所示，这进一步支持了五个亚基中的每一个对于催化亚基与膜复合物的桴系都很重要。
The model whereby non-catalytic subunits form the membrane anchoring and substrate binding domain is further supported by our studied of SDH10. Our finding of a “DY motif” that is strictly conserved among all SDH10 myzozoan orthologs, along with its proposed role in ubiquinone binding in SDHD, pointed to the possibility that this subunit contributes to substrate binding. Our mutagenesis work then demonstrated a dependence of SDH structure and function on this DY motif. However, the interpretation of this latter finding is complicated due to an overall reduction of the fully formed SDH in this mutant, seen by native PAGE and immunoblot. The level of SDH10DY>AA-Ty protein is increased compared to the wild-type version expressed from the same promoter. This elevation could be a result of post-translational feedback response to the defect in SDH assembly. Further research is required to reveal the mechanism behind this observation. Using sequence alignments and the structural prediction we were unable to pinpoint other amino acids beyond this DY motif that are likely to contribute to substrate binding. Potentially, future structural studies may reveal the identity of these amino acids and define both the ubiquinone binding site and the site of heme binding. Structural studies may have additional benefits as, considering the different composition of apicomplexan and human SDH complexes, there is a potential that the precise mechanism of binding may also be divergent and create an opportunity for the development of selective inhibitors for apicomplexan SHD. While we have not shown that SDH is strictly essential for fitness, its depletion has a clear fitness cost, and therefore parasite specific SDH inhibitors may make potential leads for drugs that can work in combination with other drugs.
While our data provide support to the divergent non-catalytic subunits fulfilling similar roles as SDHC and D, why so many subunits are needed to fulfil this role remains an open question. It is possible that some of these components, or part of them, mediate organism/lineage/clade specific functions in addition to the oxidation of succinate and reduction of ubiquinone. There is a growing number of examples of other complexes of the mitochondrial oxidative phosphorylation pathway that have additional functional modules in different lineages. For example, complex I of plants [46] and of different unicellular eukaryotes [47–49] include a carbonic anhydrase domain that is not found in complex I of bacteria and opisthokonts. Similarly, complex III of plants includes subunits that perform the activity of the mitochondrial processing peptidase (MPP), namely excising the transit sequences that mediates preproteins mitochondrial import [50,51]. Likewise, mitochondrial ATP synthase from different unicellular eukaryotes incorporate additional subunits that stabilize monomer dimerization [52] and/or mediate higher order oligomerization [5,16,53]. Moreover, SDH was recently found in a respiratory super-complex for the first time, in the ciliate Tetrahymena thermophila [5,7]. From the SDH side, the interactions with the super-complex (specifically with complexes I and IV) are mediated by a 70-kDa module that is formed from species specific non-catalytic subunits. The new formation is proposed to induce membrane curvature that contributes to the shaping of the cristae and thus enable its bioenergetic functional specialization [5]. Thus, the SDH divergent non-catalytic components may mediate interactions that serve functions that are suitable to the specialised needs of the organism or clade. In support of this being the case also in Toxoplasma, our native migration and immunoblot experiments reveal complexes of higher-molecular weight than the ~500 kDa calculated by the complexome analysis but that still include SDHB. The identity of those complexes and of the subunits that mediate their formation remains to be explored.
Through the oxidoreduction of succinate and ubiquinone, SDH shuttles electrons into the mETC, where they are transferred to ultimately use oxygen as their acceptor. This electron transfer is required to maintain an electrochemical gradient through the coupled pumping of protons in complexes III and IV, which is necessary for ATP production by FoF1ATP合酶。考虑到mETC的这一重要作用，预计SDH功能对寄生虫适应性很重要。耗竭突变体仍然可以在宿主细胞单层中形成斑块，尽管比亲本系小得多，这表明尽管SDH功能降低，但寄生虫仍然可以生长。寄生虫的活力与我们在耗氧量测定中观察到的残余呼吸一致。在弓形虫中，其他四种脱氢酶可以作为链的电子源。面向基质的单亚基II型NADH脱氢酶（NDH2），从NADH的氧化中获取电子;二氢乳清酸脱氢酶（DHODH），催化嘧啶合成途径中将二氢乳清酸氧化为乳清酸的限速步骤;FAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶（G3PDH）;以及参与丙酮酸代谢的苹果酸：醌氧化还原酶（MQO）。因此，观察到的残余呼吸和生长可归因于这些脱氢酶的活性。
关于SDH的一种新观点是，其真正的生物学功能远远超出了呼吸[45]，其他功能已被归因于SDH亚基。例如，SDH亚基可以参与替代组装，如酵母SDH3与线粒体蛋白输入机制的相互作用所证明的那样，这是蛋白质输入复合物亚基Tim54和Tim22的生物发生以及通过TIM22复合物导入前体蛋白所必需的[54]。为了支持SDH亚基可能参与其他复合物的假设情景，我们在分析其天然凝胶迁移时，在额外的高分子条带中观察到至少两个亚基（SDH23（图1B），SDHB（图2A，2C和2F））。未来对使用不同洗涤剂提取的SDH进行蛋白质组学和结构分析可能会为这种有趣的可能性提供见解。
总之，我们的工作验证了超分子弓形虫SDH复合物的组成，并证明了它对这些寄生虫中功能齐全的mETC的重要性，从而证明了它们的适应性。我们的观察结果引发了新的问题，即每种成分在SDH作为氧化还原酶的活性机制中的确切作用，并可能超越该作用。
材料与方法
细胞培养
弓形虫速殖子在人包皮成纤维细胞 （HFF） 中培养，来源于 ATCC （SCRC-1041）。HFF 和寄生虫在含有 4.5 gL 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中培养-1葡萄糖，补充有 10% （v/v） 胎牛血清、4mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素抗生素，并在 37°C 下用 5% CO 生长2.需要时，将脱水四环素（ATc）以0.5μM的最终配合加入培养基中。
寄生虫基因操作
在TatiΔKu80细胞系中进行CRISPR引导的启动子置换[32]。使用 ChopChop 工具 （https://chopchop.cbu.uib.no/） 围绕每个基因的起始密码子区域设计 gRNA。使用BsaI限制性位点将每个gRNA（S1表）克隆到含有U6启动子并表达CAS9-GFP（Tub-Cas9-YFP-pU6-ccdB-tracrRNA）的载体中[32,55]。根据制造商的方案，使用DNA midi-prep（Qiagen）纯化最终质粒。pDTS4myc质粒[32]被用作模板，通过PCR扩增DHFR可选择的盒和ATc可抑制启动子。通过电穿孔将 gRNA 和盒整合插入 TatiΔKu80/SDHB-HA [13] 细胞系中。选择用乙胺嘧啶 （1 μM） 进行盒整合，并通过连续稀释进行克隆。使用S1表中的引物通过PCR检测阳性克隆。
为了互补启动子替代细胞系，通过EcoRI、MfeI和NsiI限制性位点将cDNA（S1表中的引物）克隆到pTUB8mycGFPMyoATy表达载体中[56]。将载体电穿孔到各自的启动子置换系中，并与霉酚酸 （25 mg/mL） 和黄嘌呤 （50 mg/mL） 进行整合。根据制造商的说明，使用商业 QuikChange II 定点诱变试剂盒 （Stratagen） 在 pTUB10-SDH8-Ty 载体（如上所述生成）中10_DY>，使用商业 QuikChange II 定点诱变试剂盒 （Stratagen） 将 DY 基序突变为 rSDH227920/SDHB-HA 的 AA。
qRT-PCR检测
为了测量基因下调水平，在rSDH10、11、15、23、31/SDHB-HA细胞系中进行qRT-PCRs，这些细胞系在不存在或存在ATc的情况下生长2 d。收获寄生虫，并通过3μm聚碳酸酯过滤器除去宿主细胞碎片。使用RNeasy试剂盒（Qiagen）提取RNA，并添加DNAseI步骤。cDNA 是用高容量 RNA-to-cDNA 试剂盒 （AppliedBiosystems） 制备的。使用 PowerSYBR 绿色预混液 （ThermoFisher） 建立 qRT-PCR，使用 10 ng cDNA 作为模板。使用每个基因和肌动蛋白的特异性引物（S1表）。使用7500实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）进行了13个循环。为了计算用ATC处理或未处理样品的相对表达，使用双ΔCt法[9]，肌动蛋白mRNA作为内部对照。进行了三个独立的实验。使用GraphPad Prism 2.0.<>软件进行数据绘图。
Immunofluorescence assays
To assess subunit localization, parasites were transfected with pTUB8-subunit-Ty expression vector outlined above and inoculated onto HFFs grown on glass coverslips. After 1-day cells were fixed with 4% paraformaldehyde. Cells were labelled with primary antibodies against TY (1:800, anti-mouse, [57]) and the mitochondrial protein MYS (1:1000, anti-rabbit,[29]), before being labelled with secondary antibodies (Alexa Fluor Goat anti-mouse 488 A11029, 1:1000 and Alexa Fluor Goat anti-Rabbit 568 A11036, 1:1000). Slides were imaged on a DeltaVision Core microscope (Applied Precision) using the 100x objective and z-stacking. Imaged were deconvolved using SoftWoRx software and processed using FIJI software.
Super resolution microscopy: slides were imaged using Elyra PS.1 super-resolution microscope (Zeiss, Jena, Germany) with a 63×/1.4 NA oil-immersion objective using ZEN black software (Zeiss). Vacuoles with 4 tachyzoites were captured with depth in 0.091μm increments. Images were acquired with 3 phase settings and structure illuminated and aligned in the imaging software. The 3D models were reconstructed in Imaris software (Oxford Instruments).
Expansion microscopy: Ultrastructure Expansion Microscopy (U-ExM) was performed according to [58] with some modifications: the parasites were grown in an HFF monolayer on glass coverslip in 24-well plates. The gels were denatured at 85°C for 90 min. Primary antibodies used were rat anti-HA (1:250, Sigma, Merck, Gillingham, UK), mouse anti-Ty (1:250, [57]) and rabbit anti-TOM40 (1:250, [30]). Secondary antibodies used in this study were Alexa Fluor Goat anti-mouse 488 A11029, 1:250, Alexa Fluor Goat anti-Rat 594. 1:250 and Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit-IgG, 1:250. Images were acquired using Elyra PS.1 super-resolution microscope (Zeiss, Jena, Germany) with a 63×/1.4 NA oil-immersion objective using ZEN black software (Zeiss). Vacuoles with two tachyzoites were captured with depth in 0.091μm increments. Images were acquired with 3 phase settings and structure illuminated and aligned in the imaging software. Images were processed and distance measured in FIJI. The 3D models were reconstructed in Imaris software (Oxford Instruments). Expansion factor was 3x and was determined after the first round of expansion. The distances measured were divided by the expansion factor.
细胞外通量分析
使用 Seahorse XF HS 迷你分析仪（安捷伦技术）测量耗氧率 （OCR） 和细胞外酸化率 （ECAR）。该方法改编自[34]，以便与8孔板形式兼容。简而言之，在收获前，将寄生虫在存在或不存在ATc的情况下孵育三天。将完全裂解的寄生虫通过 3 μm 聚碳酸酯过滤器，洗涤并用补充有 5 mM 葡萄糖和 1 mM 谷氨酰胺的 Seahorse XF DMEM 基础培养基和 1.5 x106每孔加入到用聚-L-赖氨酸处理的平板中。然后使用Seahorse XF HS迷你分析仪测量寄生虫OCR和ECAR。背景，在加入 1 μM 阿托伐醌后，将非线粒体 OCR 作为 OCR 测量。通过分别在加入 1 μM FCCP 之前或之后进行 OCR 测量并减去背景速率来计算基础和最大线粒体 OCR。每次实验运行都是在不存在或存在ATc的情况下生长的单系进行，并具有三个技术重复。每条生产线进行3个独立实验。
增长分析
对于噬菌斑测定，用 6-100 个速殖子感染 200 孔板中的单层 HFFs 细胞，并在存在和不存在 ATc 的情况下生长 8 天。细胞用甲醇固定，并用0.4%结晶紫溶液染色。使用图像 J 从三个生物学重复中测量每种条件下 10 个斑块。
对于囊肿定量，在存在或不存在ATc的情况下，在玻璃盖玻片上生长的HFF上生长相应的细胞系rSDH10/SDHB-HA、rSDH10/SDHB-HA-SDH10-Ty、亲本细胞系和cKD-TgISU1-HA [35]4 d，然后进行IFA。用 GAP45 抗体 （1：1000， [59]） 和标记新生囊肿壁的双花多利果凝集素 （DBL） 标记物对寄生虫进行染色（1：500，FL-1031，载体实验室）。为了量化阳性囊肿的百分比，从三个生物学重复中计数了 100 个液泡。
复制测定是通过在没有或存在 ATc 的情况下培养亲本和 rSDH11/SDHB-HA 寄生虫两天，然后在相同条件下感染汇合的 HFF 24 小时进行复制测定。用PBS洗涤细胞以去除细胞外寄生虫，并用4%PFA固定。如上所述，使用 GAP45 抗体进行免疫荧光测定。对 100 个液泡中含有 <>、<>、<> 或 <>+ 寄生虫的液泡数量进行计数。进行了三个独立的实验。
SDS-PAGE和免疫印迹分析
将寄生虫样品重悬于补充有 1% v/v β-巯基乙醇或 Laemmli 缓冲液（5% （w/v） SDS、2 mM Tris–HCl pH 125.6、8% （w/v） 甘油、10.0% （v/v） β-巯基乙醇和 04.0% （w/v） 溴酚蓝的 002 × NuPAGE LDS 上样染料（Invitrogen，Paisley，UK）中，在 95°C 下加热 5 分钟，并在 SDS-PAGE 凝胶上分离， 使用 EZ-Run 预染 Rec 蛋白分子量标准作为分子量标记物。在半干燥条件下将蛋白质在Towbin缓冲液（0.025M Tris 0.192M甘氨酸10%甲醇）中转移到硝酸纤维素膜（0.45μm Protran，Merck，Gillingham，UK）上。然后用相关的一抗标记膜：抗HA（1：500，大鼠，Sigma，Merck，Gillingham，UK），抗TOM40（1：2000，兔，[30]），抗TY（1：1000，小鼠，[57]）和抗ATPβ（1：2000，兔，Agrisera AS05 085），然后用二抗荧光抗体IRDye 800CW和IRDye 680RD（1：10,000，LIC-COR，Lincoln，NE，USA）标记，并用Odyssey CLx成像系统可视化。
免疫沉淀
对于免疫共沉淀和免疫印迹分析：9 x 107将 rSDHB15/ SDHB-HA +SDH15-Ty 寄生虫分成三等分试样，并在 1% 洋地黄皂苷、50 mM Tris-HCL pH 7.4、150 mM NaCl、2 mM EDTA 中裂解。保留一份等分试样作为起始样品，而另外两份则通过以 18,000 x g 离心清除，并将上清液与抗 HA 或抗 Ty 琼脂糖珠在 4°C 下孵育过夜。 将琼脂糖珠沉淀，并将上清液沉淀成TCA，得到“未结合”部分。然后将珠子在含有0.1%洋地黄皂苷的裂解缓冲液中洗涤，并重悬于laemmli缓冲液中，得到“结合”部分。然后对所有馏分进行免疫印迹分析，如上所述。
质谱鉴定：5 x 108将SDHB-HA或QCR2-HA[13]的细胞在1%βDDM裂解缓冲液（50mM Tris-HCL pH 7.4,150mM NaCl，2mM EDTA）中裂解，并用抗HA琼脂糖珠（Pierce）免疫沉淀。用含有 0.05% βDDM 结合蛋白的缓冲液洗涤珠子两次，用 50 mM NaoH 洗脱。取总馏分、未结合馏分和洗脱馏分进行免疫印迹分析。洗脱对应于 ~1.2 x 108将细胞送去通过质谱分析。
质谱分析
样品处理：使用2–4%凝胶通过SDS-PAGE分离12 cm的样品。用快速考马斯染色剂（Generon）染色后，切除2cm泳道并切丁。然后用碘乙酰胺（Sigma-Aldrich）对凝胶片进行烷基化，然后使用1 mg/ml胰蛋白酶（Thermo Scientific）进行凝胶内消化，终浓度为12.5 μg/ml。然后使用真空离心将消化的肽干燥，并用50%甲酸（Fisher Chemical）重悬至1μl。
LC-MS分析：LC-MS分析由FingerPrints蛋白质组学设施（邓迪大学）进行。在 Q Exactive plus 质谱仪 （Thermo Scientific） 和 Dionex Ultimate 3000 RS （Thermo Scientific） 上进行肽读数分析。使用的LC缓冲液如下：缓冲液A（0.1%甲酸的Milli-Q水溶液（v/v））和缓冲液B（80%乙腈和0.1%甲酸的Milli-Q水溶液（v/v）。将甲酸中的复溶样品以 15 μl 的等分试样以 10μL/min 的速度加载到捕集柱（100 μm × 2 cm，PepMap nanoViper C18 柱，5 μm，100 ?，Thermo Scientific）上，该柱用 0.1% 三氟乙酸平衡。在相同流速下洗涤捕集柱 3 min，然后将捕集柱与 Thermo Scientific 联用，分离 C18 色谱柱（75 μm × 50 cm，PepMap RSLC C18 色谱柱，2 μm，100 ?），在 2% 缓冲液 B 中平衡 17 分钟。肽以300 nl/min的恒定流速从色谱柱中洗脱，线性梯度从2%缓冲液B到5%缓冲液B，在3min内，5%缓冲液B到35%缓冲液B，在64 min内，然后在35 min内从98%缓冲液B洗脱到2%缓冲液B。然后用98%缓冲液B洗涤色谱柱15分钟。在每个样品之间运行两个空白，以减少残留。色谱柱保持在50°C的恒温下。 Q-exactive plus 在数据依赖型正电离模式下运行。源电压设置为3.0 kV，毛细管温度为250°C。
A scan cycle comprised MS1 scan (m/z range from 350–1600, ion injection time of 20 ms, resolution 70 000 and automatic gain control (AGC) 1x106) acquired in profile mode, followed by 15 sequential dependent MS2 scans (resolution 17500) of the most intense ions fulfilling predefined selection criteria (AGC 2 x 103, maximum ion injection time 100 ms, isolation window of 1.4 m/z, fixed first mass of 100 m/z, spectrum data type: centroid, intensity threshold 2 x 104, exclusion of unassigned, singly and >5 charged precursors, peptide match preferred, exclude isotopes on, dynamic exclusion time 45s). The HCD collision energy was set to 27% of the normalized collision energy. Mass accuracy was checked before the start of samples analysis.
Data analysis: Label-free analysis was performed in MaxQuant version 2.0.3.0 using the RAW files generated with data manipulation in Microsoft Excel Office 365 to provide comparisons between control and treated samples. Further data analysis was performed on proteins detected in all four independent experiments for each sample using Perseus version 1.6.15.0 to generate volcano plot data and perform student t-tests. Final volcano plot figures were generated using GraphPad Prism 8.4.3.
The full data in deposited in PRIDE database. Project Name: Immunoprecipitation of Toxoplasma gondii succinate dehydrogenase complex. Project accession: PXD047027.
Blue and clear-native PAGE
Blue-native page (BN-PAGE) was performed as described previously [13] Briefly, parasites were resuspended in solubilization buffer (750 mM aminocaproic acid, 0.5 mM EDTA, 50 mM Bis-Tris-HCl ph 7.0, 1% (w/v) n-dodecylmaltoside), incubated for 10 min on ice and then centrifuged at 18,000 x g at 4°C for 30 minutes. The resulting supernatant was combined with Coomassie G250 (NativePAGE) to a final concentration of 0.25% detergent and 0.0625% Coomassie G250. Samples were separated on a Native PAGE 4–16% Bis-Tris gel using NativeMark (ThermoFisher) as a molecular weight marker. The gel was run at 80 V for 60 minutes using a dark cathode buffer (5% of blue cathode buffer (Invitrogen, BN2002) and 5% of 20x Running buffer (Invitrogen, BN2001) followed by 90 minutes at 250 V in a light cathode buffer (0.5% of blue cathode buffer (Invitrogen, BN2002) and 5% of 20x Running buffer (Invitrogen, BN2001). Proteins were transferred onto a PVDF membrane (0.45 μm, Hybond, Merck) via wet transfer in Towbin buffer (0.025 M TRIS 0.192 M Glycine 10% Methanol) for 60 min at 100 V. Immunolabelling was carried out with appropriate primary antibodies: anti-HA (1:1000, rat, sigma), anti-TOM40 (1:2000, rabbit, [30]), and anti-TY (1:800, [57]) and detected using anti-rat (ab6845, abcam), anti-rabbit (1:10000, W4011, Promega) and anti-mouse (1:10000, W4021, Promega) secondary horseradish peroxidase-conjugated antibodies. Detection was through chemiluminescence using Pierce ECL Western Blotting Substrate and an x-ray film.
Clear-native Page (CN-Page) followed by complex IV activity assay were performed according to [60]. Parasites were resuspended in solubilization buffer (50 mM NaCl, 2 mM 6-aminohexanoic acid, 50 mM imidazole, 2% (w/v) n-dodecylmaltoside, 1 mM EDTA–HCl pH 7.0) and incubated in ice for 10 min, centrifugated at 18,000 x g at 4°C for 15 minutes. Supernatants were then mixed with glycerol and ponceau S to a final concentration of 6.25% and 0.125% respectively. Samples were separated on a pre-cast Native PAGE 4–16% Bis-Tris gel using NativeMark (ThermoFisher) as a molecular weight marker. Complex IV oxidation activity was shown by incubating gels in a 50 mM KH2PO4，pH 7.2,1mg ml ?1细胞色素c，0.1%（w / v）3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐溶液，直至可见棕色沉淀。
酶活性测定
使用改编自[61]的分光光度法测定琥珀酸脱氢酶（SDH）活性。在收获细胞外寄生虫之前，在没有ATc和存在的情况下培养弓形虫寄生虫3天，并用3μm聚碳酸酯过滤器除去宿主细胞碎片。3 x 107寄生虫重悬于100μl线粒体测定溶液裂解缓冲液（70mM蔗糖，220mM甘露醇，10mM KH2采购订单4，5毫米氯化镁2，2 mM HEPES、1 mM EGTA、0.2% w/v 牛血清白蛋白 （BSA） 和 0.2% w/v 洋地黄皂苷，pH 7.2），并在 1°C 下孵育 4 小时。 然后将所得寄生虫裂解物加入含有 1 mM 琥珀酸酯、20 mM KH 的测定缓冲液（最终体积 25 mL）中2采购订单4，0.002175% w/v DCPIP，1μM阿托伐醌，2.5mg / mL BSA和40μM去环泛醌（DUB）），每600分钟测量一次2nM的吸光度，持续40分钟。每次重复使用来自相同起始数量的寄生虫的裂解物。使用相同的方案测量MQO活性，除了使用20mM苹果酸而不是琥珀酸盐。使用19.1 mM的DCPIP消光系数计算酶活性-1厘米-1.
碳酸钠萃取
为了从外周膜蛋白中分离整合膜蛋白，用 100 mM Na 处理寄生虫2一氧化碳3并在 4°C 下孵育 2 小时。通过189,000×g的超速离心分离沉淀和上清液部分。上清液部分在TCA之前沉淀，沉淀部分重悬于laemmli缓冲液中。为了测试蛋白质的溶解度，将寄生虫重悬于1%triton X-100中，在4°C下孵育2小时，并通过16,000 x g离心分离沉淀和上清液级分。然后通过免疫印迹分析测试馏分以及总寄生虫样品。
结构预测
每个 T 的预测结构。刚地SDH亚基取自AlphaFold数据库[37,38]。使用MitoProt[62]预测线粒体靶向序列并去除线粒体靶向序列。然后使用UCSF ChimeraX中的匹配工具将截断的序列与鸟类复合物II结构（PDB 2H88）对齐[39]。
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S1 图。
（A） 超分辨率显微镜图像显示为 SDHB-HA 和 SDH3-Ty 的 Z 堆栈（左图和中图）和 15D 重建（右图），线粒体标记蛋白 TOM40。比例尺为2μM。（B）图1B中的超膨胀显微镜图像。左图：SDHB-HA/SDH15-TY（橙色）和TOM40（粉色）的合并，突出显示了插图区域，右图：插图特写，白线表示强度计算区域。比例尺是来自 B 部分的 SDHB-HA/SDH1-TY 和 TOM15 信号的 40 μM （C） 强度图。（D）图1C所示数据的全免疫印迹。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s001
（TIF）
S2 图。
（A） 对使用抗 Ty 抗体表达 SDH10、SDH11、SDH15、SDH23 或 SDH31-Ty 的细胞中提取的全细胞裂解物进行免疫印迹分析。（B） 启动子替代策略示意图，允许通过添加脱水四环素 （ATc） 敲低目的基因 （GOI）。（i） CRISPR/CAS9 引导切割在预测的启动子/ATG 边界处，（ii） 在同源序列引导的切割修复过程中，在启动子和 GOI 之间插入含有 ATc 可抑制启动子 （T7S4）、二氢叶酸还原酶 （DHFR） 选择标记物以及与启动子/ATG 边界同源的修复盒， （iii） GOI，在 ATc 可抑制启动子的控制下， 添加 ATc 时下调。黑色箭头代表用于通过PCR确认整合的引物（S1表中的引物）。（C） 使用 B 中的引物对 rSDHB10、11、15、23 或 31 进行 PCR 分析，以确认 DHFR 和可抑制启动子的整合。（D） qRT-PCR分析在ATc中生长10天后，将无ATc设置为11，加ATc条件后，通过单样本t检验比较相应启动子替代系中SDH15、23、31、3或<>的相对转录水平。条形表示 S.D. ±平均值 （n = <>）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s002
(TIF)
S3 Fig.
Immunoblot analysis of whole cell lysate extracted from SDHB-HA (A) or QCR2-HA (B) and immunoprecipitated with anti-HA beads, to produce total lysate, unbound and elute fractions. Samples were separated by SDS-PAGE, blotted, and detected using anti-HA antibody to label immunoprecipitated proteins, and anti-TOM40 as an unrelated mitochondrial protein control.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s003
(TIF)
S4 Fig. Immunofluorescence assay analysis of parental, rSDH15 and rVDAC [33] parasites grown in the absence or presence of ATc for three days.
Mitochondrial morphology is visualised with antibodies against the mitochondrial marker protein TOM40. Scale bar is 5 μM.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s004
(TIF)
S5 图。
（A） 弓形虫 SDH 的带状同源模型，前视图和后视图，使用 alphafold 和 matchmaker 生成。单个亚基采用颜色编码。（B）亚基SDHA和SDHB的同源模型 （C）新型SDH亚基的同源模型。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s005
（TIF）
S6 图。 MPOD、SDH10、SDH11、15、23、31 与 SDHC 和 SDHD 的比对来自具有典型 SDH 复合物的物种。
Gg， Gallus gallus;Bt， Bos taurus;Hs： 智人;Dm： 黑腹果蝇;Bs： 缓根瘤菌属;Bj： 日本缓根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）;Ra： 美洲斜单胞菌;Rp， 普罗瓦泽基立克次体;As，蛔虫;Ps： 副球菌属;Pd： 反硝化副球菌;Rr： 红螺杆菌;Ec： 大肠杆菌;Sc： 酿酒酵母;Pp， 紫紫薇。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s006
（PDF格式）
S7 图。 来自myzozoa的SDH11,15,23,31同源物的比对。
Tg弓形虫;Tp， 小蒲公英;Et， Eimeria tenella;Bb， 牛巴贝虫;PF， 恶性疟原虫;Pb， 白鲷（Plamodium baeghei）;下午，Perkinsus marinu;Po， Perkinsus olseni.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s007
（TIF）
S1 表。 引物表：本研究中使用的引物摘要。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s008
（XLSX）
S2 表。 来自 SDHB 和 QCR2 免疫沉淀的质谱数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s009
（XLSX）
S3 表。 SDH 和 MQO 酶活性测量。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s010
（XLSX）
S4 表。 定量父母、rISU1、rSDH10 和 cSDH10 寄生虫中 DBL 阳性液泡。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s011
（XLSX）
确认
We thank Leandro Lemgruber from the imaging facilities of the Wellcome Centre for Integrative Parasitology for support for the microscopy work. We thank Giel van Dooren and Soraya Zwahlen of the Australian National University for sharing their protocol for complex II activity assay using T. gondii cell lysate. We thank EupathDB and ToxoDB for providing useful and free access to genome databases. We would like to acknowledge Alan Score of the FingerPrints Proteomics Facility at the University of Dundee, which is supported by the ’Wellcome Trust Technology Platform’ award [097945/B/11/Z].
References
1.Lemire BD, Oyedotun KS. The Saccharomyces cerevisiae mitochondrial succinate:ubiquinone oxidoreductase. Biochim Biophys Acta. 2002;1553: 102–16. pmid:11803020
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
2.Rutter J, Winge DR, Schiffman JD. Succinate dehydrogenase—Assembly, regulation and role in human disease. Mitochondrion. 2010;10: 393–401. pmid:20226277
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
3.Hadrava Vanova K, Kraus M, Neuzil J, Rohlena J. Mitochondrial complex II and reactive oxygen species in disease and therapy. Redox Rep. 2020;25: 26–32. pmid:32290794
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
4.Morales J, Mogi T, Mineki S, Takashima E, Mineki R, Hirawake H, et al. Novel mitochondrial complex II isolated from Trypanosoma cruzi is composed of 12 peptides including a heterodimeric Ip subunit. J Biol Chem. 2009;284: 7255–63. pmid:19122194
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
5.Mühleip A, Flygaard RK, Baradaran R, Haapanen O, Gruhl T, Tobiasson V, et al. Structural basis of mitochondrial membrane bending by the I-II-III2-IV2 supercomplex. Nature. 2023;615: 934–938. pmid:36949187
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
6.Eubel H, J?nsch L, Braun H-P. New insights into the respiratory chain of plant mitochondria. Supercomplexes and a unique composition of complex II. Plant Physiol. 2003;133: 274–86. pmid:12970493
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
7.Han F, Hu Y, Wu M, He Z, Tian H, Zhou L. Structures of Tetrahymena thermophila respiratory megacomplexes on the tubular mitochondrial cristae. Nat Commun. 2023;14: 2542. pmid:37248254
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
8.Zhou L, Maldonado M, Padavannil A, Guo F, Letts JA. Structures of Tetrahymena’s respiratory chain reveal the diversity of eukaryotic core metabolism. Science. 2022;376: 831–839. pmid:35357889
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
9.Huet D, Rajendran E, van Dooren GG, Lourido S. Identification of cryptic subunits from an apicomplexan ATP synthase. Elife. 2018;7.
View ArticleGoogle Scholar
10.Seidi A, Muellner-Wong LS, Rajendran E, Tjhin ET, Dagley LF, Aw VY, et al. Elucidating the mitochondrial proteome of Toxoplasma gondii reveals the presence of a divergent cytochrome c oxidase. Elife. 2018;7. pmid:30204084
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
11.Sturm A, Mollard V, Cozijnsen A, Goodman CD, McFadden GI. Mitochondrial ATP synthase is dispensable in blood-stage Plasmodium berghei rodent malaria but essential in the mosquito phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112: 10216–23. pmid:25831536
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
12.Painter HJ, Morrisey JM, Mather MW, Vaidya AB. Specific role of mitochondrial electron transport in blood-stage Plasmodium falciparum. Nature. 2007;446: 88–91. pmid:17330044
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
13.Maclean AE, Bridges HR, Silva MF, Ding S, Ovciarikova J, Hirst J, et al. Complexome profile of Toxoplasma gondii mitochondria identifies divergent subunits of respiratory chain complexes including new subunits of cytochrome bc1 complex. PLoS Pathog. 2021;17: e1009301. pmid:33651838
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
14.Hayward JA, Rajendran E, Zwahlen SM, Faou P, van Dooren GG. Divergent features of the coenzyme Q:cytochrome c oxidoreductase complex in Toxoplasma gondii parasites. PLoS Pathog. 2021;17: e1009211. pmid:33524071
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
15.Usey MM, Huet D. Parasite powerhouse: A review of the Toxoplasma gondii mitochondrion. J Eukaryot Microbiol. 2022;69: e12906. pmid:35315174
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
16.Maclean AE, Hayward JA, Huet D, van Dooren GG, Sheiner L. The mystery of massive mitochondrial complexes: the apicomplexan respiratory chain. Trends Parasitol. 2022;38: 1041–1052. pmid:36302692
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
17.Hino A, Hirai M, Tanaka TQ, Watanabe Y, Matsuoka H, Kita K. Critical roles of the mitochondrial complex II in oocyst formation of rodent malaria parasite Plasmodium berghei. J Biochem. 2012;152: 259–68. pmid:22628552
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
18.Ke H, Lewis IA, Morrisey JM, McLean KJ, Ganesan SM, Painter HJ, et al. Genetic investigation of tricarboxylic acid metabolism during the Plasmodium falciparum life cycle. Cell Rep. 2015;11: 164–74. pmid:25843709
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
19.Siregar JE, Kurisu G, Kobayashi T, Matsuzaki M, Sakamoto K, Mi-ichi F, et al. Direct evidence for the atovaquone action on the Plasmodium cytochrome bc1 complex. Parasitol Int. 2015;64: 295–300. pmid:25264100
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
20.Srivastava IK, Morrisey JM, Darrouzet E, Daldal F, Vaidya AB. Resistance mutations reveal the atovaquone-binding domain of cytochrome b in malaria parasites. Mol Microbiol. 1999;33: 704–11. pmid:10447880
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
21.Fry M, Pudney M. Site of action of the antimalarial hydroxynaphthoquinone, 2-[trans-4-(4’-chlorophenyl) cyclohexyl]-3-hydroxy-1,4-naphthoquinone (566C80). Biochem Pharmacol. 1992;43: 1545–53. pmid:1314606
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
22.埃弗斯 F、Cabrera-Orefice A、Elurbe DM、Kea-Te Lindert M、Boltryk SD、Voss TS 等。恶性疟原虫中线粒体复合物的组成和阶段动力学。国家通讯社。2021;12: 3820.PMID：34155201
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
23 分钟Matsubayashi M， Inaoka DK， Komatsuya K， Hatta T， Kawahara F， Sakamoto K， et al. 来自Eimeria tenella的线粒体电子传递链的新特征.基因（巴塞尔）。2019;10.PMID：30626105
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
24 分钟Bezawork-Geleta A、Rohlena J、Dong L、Pacak K、Neuzil J. 线粒体复合物 II：处于十字路口。趋势生物化学科学 2017;42: 312–325.PMID：28185716
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
25 分钟孙芳， 霍旭， 翟莹， 王A， 徐建， 苏D， 等.线粒体呼吸膜蛋白复合物II.的晶体结构。细胞。2005;121: 1043–57.PMID：15989954
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
26 分钟Danne JC， Gornik SG， Macrae JI， McConville MJ， Waller RF. 肺泡线粒体代谢进化：甲藻迫使重新评估寄生作为顶复合体变化驱动因素的作用。Mol Biol Evol.2013;30: 123–39.PMID：22923466
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
27 分钟Seeber F， Limenitakis J， Soldati-Favre D. 顶复合体线粒体代谢：一个关于收益、损失和保留的故事。趋势 Parasitol。2008;24: 468–78.PMID：18775675
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
28 分钟Barylyuk K、Koreny L、Ke H、Butterworth S、Crook OM、Lassadi I 等。通过hyperLOPIT获得弓形虫蛋白质组的综合亚细胞图谱，为蛋白质功能提供了空间背景。细胞宿主微生物。2020;28：752-766.e9。PMID：33053376
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
29 分钟Ovciarikova J， Lemgruber L， Stilger KL， Sullivan WJ， Sheiner L. 弓形虫整个裂解周期的线粒体行为。2017 年 Sci Rep.7: 42746.PMID：28202940
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
30 分钟van Dooren GG、Yeoh LM、Striepen B、McFadden GI。将蛋白质导入弓形虫的线粒体。生物化学杂志 2016;291: 19335–50.PMID：27458014
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
31 分钟Sidik SM、Huet D、Ganesan SM、Huynh MH、Wang T、Nasamu AS 等。弓形虫中的全基因组CRISPR筛选可识别必需的顶复合体基因。细胞。2016;166：1423-1435.e12。PMID：27594426
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
32 分钟Sheiner L、Demerly JL、Poulsen N、Beatty WL、Lucas O、Behnke MS 等。用于发现和分析顶质体蛋白的系统筛选可识别保守且必需的蛋白质输入因子。PLoS 病理学。2011;7：e1002392。PMID：22144892
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
33 分钟Mallo N、Ovciarikova J、Martins-Duarte ES、Baehr SC、Biddau M、Wilde ML 等。弓形虫孔蛋白的耗竭导致线粒体形态缺陷并与内质网接触。细胞科学杂志 2021;134。PMID：34523684
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
34 分钟Hayward JA， Rajendran E， Makota FV， Bassett BJ， Devoy M， Neeman T， et al. 使用 Seahorse XFe96 细胞外通量分析仪实时分析刚地弓形虫寄生虫的线粒体电子传递链功能。生物原型。2022;12：E4288。PMID：35118179
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
35 分钟Pamukcu S， Cerutti A， Bordat Y， Hem S， Rofidal V， Besteiro S. 两种内共生来源的细胞器对弓形虫中铁硫簇合成和整体适应度的不同贡献。PLoS 病理学。2021;17：e1010096。PMID：34793583
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
36 分钟Schikowsky C， Senkler J， Braun HP.SDH6 和 SDH7 有助于将琥珀酸脱氢酶锚定到拟南芥的线粒体内膜上。植物生理学. 2017;173: 1094–1108.PMID：28039307
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
37 分钟Varadi M， Anyango S， Deshpande M， Nair S， Natassia C， Yordanova G， et al. AlphaFold 蛋白质结构数据库：通过高精度模型大规模扩展蛋白质序列空间的结构覆盖范围。核酸研究 2022;50：D439–D444。PMID：34791371
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
38 分钟Jumper J、Evans R、Pritzel A、Green T、Figurnov M、Ronneberger O 等。使用 AlphaFold 进行高精度蛋白质结构预测。自然界。2021;596: 583–589.PMID：34265844
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
39 分钟Pettersen EF， Goddard TD， Huang CC， Meng EC， Couch GS， Croll TI， et al. UCSF ChimeraX：面向研究人员、教育工作者和开发人员的结构可视化。蛋白质科学 2021;30: 70–82.PMID：32881101
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
40.Huang L-S, Shen JT, Wang AC, Berry EA. Crystallographic studies of the binding of ligands to the dicarboxylate site of Complex II, and the identity of the ligand in the “oxaloacetate-inhibited” state. Biochim Biophys Acta. 2006;1757: 1073–83. pmid:16935256
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
41.Silkin Y、Oyedotun KS、Lemire BD。Sdh4p Tyr-89 在酿酒酵母琥珀酸脱氢酶还原泛醌中的作用。Biochim Biophys Acta.2007;1767: 143–50.PMID：17208193
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
42 分钟Oyedotun KS，Lemire BD。酿酒酵母琥珀酸-泛醌氧化还原酶的醌结合位点。J Biol Chem. 2001;276: 16936–43.PMID：11279023
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
43 分钟扬科夫斯卡娅 V、霍斯菲尔德 R、托恩罗斯 S、卢娜-查韦斯 C、三好 H、莱热 C 等。琥珀酸脱氢酶的结构和活性氧的产生。科学。2003;299: 700–4.PMID：12560550
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
44 分钟杜珑， 周旭， 赖莹， 徐军， 张莹， 周淑， 等.人体呼吸复合体II.的结构。美国国家科学院院刊 2023;120：e2216713120。PMID：37098072
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
45 分钟艾弗森TM。复合物II酶的催化机制：结构视角。Biochim Biophys Acta.2013;1827: 648–57.PMID：22995215
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
46 分钟桑德豪斯 S、杜德金娜 N V、扬施 L、克洛德曼 J、海涅迈尔 J、佩拉莱斯 M 等人。碳酸酐酶亚基形成基质暴露结构域，附着在线粒体复合物 I 的膜臂上。生物化学杂志 2006;281: 6482–8.PMID：16407270
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47 分钟Gawryluk RMR，灰色 MW。γ型碳酸酐酶作为线粒体呼吸复合物I.组分的早期进化出现的证据。 BMC Evol Biol. 2010;10: 176.PMID：20546574
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48 分钟Cainzos M， Marchetti F， Popovich C， Leonardi P， Pagnussat G， Zabaleta E. γ 碳酸酐酶是硅藻线粒体复合物 I 的亚基。摩尔微生物。2021;116: 109–125.PMID：33550595
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49 分钟Miranda-Astudillo H V、Yadav KNS、Colina-Tenorio L、Bouillenne F、Degand H、Morsomme P 等。呼吸复合体 I 和 IV 的非典型亚基组成与眼虫的原始额外结构域有关。科学代表 2018;8: 9698.PMID：29946152
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50 分钟马尔多纳多 M， 郭 F， 莱茨 JA.来自维管植物的呼吸复合物III2、复合物IV和超复合物III2-IV的原子结构。生命。2021;10.PMID：33463523
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51 分钟博朗惠普复合物III在植物中的两个作用。生命。2021;10.PMID：33463522
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52 分钟比亚维森西奥-奎耶罗 A、巴斯克斯-阿塞维多 M、卡诺-埃斯特拉达 A、扎尔科-萨瓦拉 M、图埃纳德戈麦斯 M、米尼亚科 JA 等。Polytomella sp. 的线粒体 ATP 合酶的完全活性和结构稳定形式是二聚体。J Bioenerg Biomembr.2009;41: 1–13.PMID：19242783
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53 分钟Gahura O、Mühleip A、Hierro-Yap C、Panicucci B、Jain M、Hollaus D 等。祖先相互作用模块促进不同线粒体 ATP 合酶的寡聚化。国家通讯社。2022;13: 5989.PMID：36220811
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54 分钟Gebert N、Gebert M、Oeljeklaus S、von der Malsburg K、Stroud DA、Kulawiak B 等人。Sdh3 在呼吸链中的双重功能和线粒体内膜的 TIM22 蛋白转位酶。摩尔细胞。2011;44: 811–8.PMID：22152483
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55 分钟Curt-Varesano A、Braun L、Ranquet C、Hakimi MA、Bougdour A.天冬氨酰蛋白酶 TgASP5 介导弓形虫 GRA16 和 GRA24 效应子输出到宿主细胞中。细胞微生物。2016;18: 151–167.PMID：26270241
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56 分钟Herm-G?tz A、Weiss S、Stratmann R、Fujita-Becker S、Ruff C、Meyh?fer E 等。刚地弓形虫肌球蛋白A及其轻链：一种快速的、单头的、正端导向的马达。EMBO J. 2002 年;21: 2149–58.PMID：11980712
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57 分钟巴斯汀 P、巴格尔扎德 Z、马修斯 KR、海鸥 K.一种新型表位标签系统，用于研究布氏锥虫的蛋白质靶向和细胞器生物发生。Mol Biochem Parasitol。1996;77: 235–9.PMID：8813669
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58 分钟Liffner B， Absalon S. 扩增显微镜显示恶性疟原虫血液阶段寄生虫在没有微型染色体维持复合物结合蛋白的情况下经历染色质桥的后期。微生物。2021;9.PMID：34835432
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59 分钟Plattner F、Yarovinsky F、Romero S、Didry D、Carlier MF、Sher A 等。弓形虫谱蛋白对于宿主细胞侵袭和 TLR11 依赖性诱导白细胞介素 12 反应至关重要。细胞宿主微生物。2008;3: 77–87.PMID：18312842
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60 分钟Lacombe A、Maclean AE、Ovciarikova J、Tottey J、Mühleip A、Fernandes P 等人。线粒体核糖体弓形虫的鉴定，以及线粒体翻译所必需的蛋白质的表征。摩尔微生物。2019;112: 1235–1252.PMID：31339607
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61 分钟Spinazzi M， Casarin A， Pertegato V， Salviati L， Angelini C. 评估组织和培养细胞上的线粒体呼吸链酶活性。Nat Protoc.2012;7: 1235–46.PMID：22653162
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62 分钟Claros MG， Vincens P. 预测线粒体输入蛋白及其靶向序列的计算方法。Eur J 生化。1996;241: 779–786.PMID：8944766
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63 分钟克鲁格 D、梅尔 GR、弗里施克内希特 F、道格拉斯 RG。存在于真菌中的小线粒体蛋白对疟疾传播至关重要。开放生物学 2016;6: 160034.PMID：27053680
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64 分钟帕斯奎尔 C、普罗姆波纳斯 VJ、帕莱奥斯 GA、哈莫德拉卡斯 JS、哈莫德拉卡斯 SJ。一种基于SwissProt数据库统计分析的蛋白质跨膜片段预测的新方法：PRED-TMR算法。蛋白质工程 1999;12: 381–5.PMID：10360978
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65 分钟Dobson L， Reményi I， Tusnády GE.CCTOP：共识约束的 TOPology 预测 Web 服务器。核酸研究 2015;43：W408-12。PMID：25943549
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66 分钟Bernhofer M， Rost B. TMbed：通过语言模型嵌入预测的跨膜蛋白。BMC生物信息学。2022;23: 326.PMID：35941534
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