厦门医学论文发表-成丝和生物膜形成受白色念珠菌网络转录因子的相分离能力调节
抽象
真菌白色念珠菌丝丝和形成生物膜的能力导致其负担成为医院获得性感染的主要原因。生物膜开发涉及一个相互连接的转录调控网络 （TRN），该网络由九个转录因子 （TF） 组成，这些转录因子 （TF） 既与它们自己的调控区域结合，也与其他网络 TF 的调控区域结合。在这里，我们展示了 C 中的 9 个 TF 中的 7 个。白色念珠菌生物膜网络包含朊病毒样结构域 （PrLDs），这些结构域与形成相分离缩合物的能力有关。在四种生物膜TF中构建PrLD突变体表明，这些结构域对于C中的成丝和生物膜形成至关重要。白色念珠菌。此外，生物膜PrLDs促进活细胞核中相分离缩合物的形成，而消除相分离的PrLD突变（如去除芳香族残留物）也阻止了生物膜的形成。生物膜 TF 缩合物可以通过 PrLD-PrLD 相互作用选择性地募集其他 TF，并且可以共募集 RNA 聚合酶 II，从而在活性转录复合物的组装中涉及凝聚物的形成。最后，我们发现阻断生物膜TF相分离的PrLD突变也阻止了胃肠道定植体内模型中的成丝。总之，这些研究将转录凝聚物与 C 中丝化和生物膜形成的调节联系起来。白色念珠菌，并强调靶向 PrLD-PrLD 相互作用如何预防该物种的发病机制。
作者摘要
真菌C。白色念珠菌是危及生命的感染的普遍原因，这在很大程度上是由于其能够在生物或非生物表面形成耐药生物膜。生物膜的形成由九个TF组成的网络控制，这些TF组合起来调节自身以及下游基因的表达。我们发现，九个主生物膜TF中有七个含有PrLDs，这些结构域先前已被证明可以促进相分离为致密相以及更稀的周围相。重要的是，选择性 PrLD 残基的突变破坏了 TF 的相分离能力，从而阻断了 TF 在体外和宿主定植过程中的功能。PrLDs 还促进 TF 与 RNA 聚合酶 II 的相互作用，表明它们可以募集细胞转录机制的关键成分。因此，我们建议TF PrLDs是C的组成部分。白色念珠菌生物膜的形成是因为它们能够促进蛋白质-蛋白质相互作用和相分离，并且这些复合物的协调组装驱动基因表达程序。
数字
Fig 7Fig 8图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8图1图2图3
引文： Ganser C， Staples MI， Dowell M， Frazer C， Dainis J， Sircaik S， et al. （2023） 白色念珠菌中网络转录因子的相分离能力调节成丝和生物膜形成。PLoS 病理学 19（12）： E1011833 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011833
编辑 器： Joachim Morschh?user，德国维尔茨堡大学
收到： 3年2023月17日;接受： 2023年13月2023日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 Ganser et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 原始和处理过的测序数据可在 NCBI 基因表达综合 （GEO;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库，登录号GSE245897。所有其他相关数据均包含在手稿及其支持信息文件中。
资金： 这项工作得到了 NIH/NIAID 奖项的支持，AI081704并AI141893给 RJB;NIH/NIDCR F31 奖DE029680给 MIS，NIH/NIDCR F31 奖DE032591给 MD。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
白色念珠菌是一种机会性人类真菌病原体，在40-70%的健康成人中发现共生微生物[1]。这种真菌可以在人体内或人体上的多个部位定植，包括皮肤、口腔、胃肠道和生殖道[2,3]。虽然通常是人体微生物组的无害成员，但pH值、营养、疾病状态或免疫功能的变化会导致过度增殖，导致浅表黏膜感染或播散性血流感染[4,5]。局部感染也与植入的医疗器械和 C 的能力有关。在临床上，白色念珠菌在生物或非生物表面形成生物膜对疾病进展有显著贡献[3,6]。
白色念珠菌生物膜是多结构群落，与浮游生物相比，它们对抗真菌药物和物理干扰的抵抗力增强[7]。因此，除了移除医疗植入物或病变组织，或使用可能对患者产生负面副作用的更高剂量药物外，复发性生物膜感染的治疗选择有限[3]。生物膜是播种新感染部位的核心步骤，它们在宿主体内的持续存在可导致侵袭性念珠菌病（IC）[2,8]。IC是发达国家住院患者中最常见的侵袭性真菌病，死亡率接近40%[4]。对 C 语言有更好的理解。因此，白色念珠菌生物膜的形成对于治疗感染和管理有发展成IC风险的慢性病例至关重要。
C 中的单元格。白色念珠菌生物膜由三种不同的形态组成——酵母、假菌丝和真菌丝——它们被封装在细胞外基质（ECM）中[3,9]。 生物膜起始涉及酵母形式细胞粘附在宿主表面或医疗器械上[3]。成熟的特征是广泛的成丝和ECM发育，后者由蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸组成[3,9]。在生物膜生长的扩散阶段，酵母状细胞从成熟的菌丝结构中萌芽，并可以播种新的感染部位[3,10]。
基因筛选已经确定了 3 多种与 C 有关的转录调节因子。白色念珠菌生物膜形成[11,13–1]。这些调节因子中的任何一种的缺失都会产生粘附、菌丝发育或ECM产生缺陷的细胞。特别是，1种转录因子（TFs）被认为是生物膜发育的主要调节因子：Bcr1、Brg8、Efg4、Flo80、Gal1、Ndt2、Rob1、Rfx11和Tec12[11,12]。这些TF与自身基因上游的启动子以及高度互连的转录调控网络（TRN）中其他主调节因子的启动子结合[<>,<>]。这些蛋白质如何在这些调节区域组装以控制生物膜的形成尚不清楚，并且可能涉及蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质相互作用。
最近的研究推测，TFs可以通过相分离机制控制基因转录[14\u16]。相分离是指从单个混合相形成两个不同的相，类似于油滴从水中分离出来[17]。无膜细胞器包括核仁、副斑点和应激颗粒，是通过蛋白质和核酸的相分离形成的结构[18\u21]。在许多情况下，相分离与本甛无序区域（IDR）有关，这些区域可以促进生物分子缩合物的形成[17,22]。IDR的一个重要子集包括称为朊病毒样结构域（Prion-like domains， PrLDs）的低复杂度序列，这些序列含有高比例的甘氨酸和不带电荷的极性氨基酸，类似于经典酵母朊病毒[23,24]。几种含PrLD的蛋白容易发生液-液分解，也可能组装成淀粉样蛋白原纤维，包括与人类神经系统疾病相关的原纤维[23\u26]。重要的是，低复杂度结构域（LCD）中特定氨基酸的缺失或替换会限制体外和细胞内的相分离[25,27]。
最近的研究表明，TRN 调节 C.白色念珠菌的白色不透明开关涉及含PrLD的TF的相分离[28]。白不透明开关是两种替代细胞状态之间的双稳态、可遗传开关，与生物膜形成类似，涉及与大调节区域结合的主TF以调节网络输出[29\u33]。白色不透明TF中PrLDs的缺失或突变阻断了它们的相分离能力，并消除了它们在白色不透明转换中的功能[28]。生物膜网络中的九个TF中有七个也含有PrLDs，包括与白色不透明网络共享的TFs，这表明这些PrLDs可能在生物膜形成中同样发挥关键作用。
在这项研究中，我们从功能上分析了存在于多个 C 中的 PrLD。白色念珠菌生物膜TFs。我们发现，TF PrLDs的缺失，或这些PrLDs中关键氨基酸的替换，消除了生物膜的形成。这些 TF 中存在的 PrLD 在哺乳动物细胞核中表达时会发生相分离，阻断相分离的突变会阻断它们在 C 中的功能。白色念珠菌。两个生物膜 TF Efg1 和 Flo8 相分离形成液体缩合物，可以掺入 RNA 聚合酶 II 的纯化 C 末端结构域 （CTD），表明缩合物的形成能够组装活性转录复合物。有趣的是，PrLD交换实验表明，哺乳动物TAF15的PrLD可以替代Efg1的PrLD，但不能替代Flo8的PrLD，这表明某些PrLDs在功能上是可互换的。我们进一步表明，TFs的相分离能力是它们在定植动物模型中发挥作用所必需的。总之，这些发现表明TF PrLDs在调节真菌丝化和生物膜形成中起关键作用，并且破坏PrLDs的相分离能力可以消除C的致病性状。白色念珠菌。
结果
多个 C。白色念珠菌生物膜调节 TF 含有 PrLDs
TRN控制C中生物膜的形成。白色念珠菌由1个主TF组成，每个TF自动调节自身以及网络中其他基因的表达（图11A）[12,11]。染色质免疫沉淀分析已经证实，即使在没有共定结合基序的情况下，这些主TF也会在调节区域结合，这表明TF至少部分通过蛋白质-蛋白质相互作用被募集到DNA中[12,24]。鉴于蛋白质-蛋白质相互作用可以由支持复杂生物分子缩合物形成的PrLD介导[28,4]，我们评估了生物膜TFs是否存在这些结构域。1 个生物膜 TF 中有 1 个被发现含有大量 PrLDs，其中 Gal1 缺乏任何 PrLDs，而 Rob34 仅含有相对较短的 PrLDs（图 1B 和 S<>）。我们根据PLAAC的高评分（prion-l ike a mino acid composition scores）选择了<>个TFs[<>]，以评估PrLDs在真菌生物膜形成的转录调控中的作用（图<>B）。
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图 1. TRN 控制 C 中生物膜的形成。白色念珠菌含有 <> 个主 TF，其中 <> 个含有 PrLD。
（一） 丙。白色念珠菌生物膜TRN。虚线箭头表示自动调节;实心箭头表示蛋白质与给定基因位点的结合。绿色的 TF 含有 PrLD;灰色的TF不含PrLDs。 改编自Lohse等人。[3]. （B） PrLDs的PLAAC分析。隐马尔可夫模型（HMM）将蛋白质区域定义为PrLDs或背景[34]。图中显示了 PrLD 和 DNA 结合域 （DNA-BD） 的相对位置。
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TF PrLDs在生物膜形成中的功能分析
三个生物膜 TF（Bcr1、Brg1 和 Efg1）包含两个或多个 PrLD，而一个 TF （Flo8） 在其大部分序列中显示出高 PLAAC 评分，其最大的单个 PrLD 位于 N 末端区域（氨基酸 100-400;图1B）。我们构建了TF衍生物，这些衍生物缺乏最大的一个或两个PrLDs，或者在这些结构域内含有特定的氨基酸取代（图2A）。取代靶向PrLDs中的芳香族氨基酸酪氨酸（Y）和苯丙氨酸（F），它们可以通过pi-pi和阳离子-pi相互作用促进相分离[35\u37]，以及可以实现相分离和/或聚集的谷氨酸残基（polyQ束）[38\u41]。构建的PrLD突变体包括：（1）所有Y和F残基均变为丝氨酸（YF-to-S衍生物）;（2） 删除定义为连续三个或更多 Q 的 polyQ 区 （ΔpolyQ）;（3） 将 polyQ 束内的每隔 Q 改为甘氨酸 （polyQG）。野生型或突变型TF被整合到C中。缺乏相应TF的白色念珠菌菌株，并检查了它们在有机硅方块上形成生物膜的能力（参见材料和方法）。
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图 2. 生物膜形成对主 TF PrLD 的依赖性。
（A） TF PrLDs中特定氨基酸残基的示意图。 显示了酪氨酸 （Y）、苯丙氨酸 （F） 和谷氨酰胺束 （polyQ） 的相对位置和数量。（B-E）WT 或突变菌株 （B， Efg1;C， Brg1;D， Bcr1;E，Flo8）评估有机硅方块上的生物膜质量。WT 和突变体（ΔN、ΔC 等）是指将一个 TF 拷贝整合到相应的 TF Δ/Δ 菌株中的菌株。实验一式三份，每次重复三次。所有统计检验均使用普通单因素方差分析与Dunnett多重比较检验进行，其中将每个突变菌株的平均值与对照的平均值进行比较。误差线显示没有误差线的 S.D. 突变体与 WT 对照没有显著差异。**P < 0.01;市<0.001;P < 0.0001。
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对于每个靶TFs，PrLDs的丧失基本上消除了它们支持生物膜形成的能力。例如，在 Efg1 的情况下，N 端 PrLD（ΔN 突变体）或 N 端和 C 端 PrLDs （ΔNC 突变体）的缺失阻止了生物膜的形成，而与全长对照相比，C 端 PrLD（ΔC 突变体）的缺失并没有显着降低生物膜质量（图 2B）。Efg1 的 YF-to-S、ΔpolyQ 和 polyQG 版本也显示出完全无法形成生物膜（图 2B）。Brg1 同样含有两个 PrLD，这些结构域的丢失导致无法形成生物膜，而 N 端或 C 端 PrLD 的缺失不会显着影响生物膜的形成（图 2C）。Brg1 YF-to-S、ΔpolyQ 和 polyQG 突变体在我们的检测中都存在高度缺陷（图 2C）。Bcr1 还显示所有 PrLD 缺失突变体（包括 ΔN 和 ΔC 突变体以及 ΔNC 突变体）的生物膜形成显着减少（图 2D）。然而，相比之下，虽然 Bcr1 YF-to-S 突变体的生物膜质量降低，但与野生型对照相比，ΔpolyQ 和 polyQG 突变体形成的生物膜没有显着减少（图 2D）。最后，与全长对照相比，TF Flo8中单个PrLD的缺失导致大部分生物膜形成的损失（图2E）。Flo8突变体也未能在任何PrLD取代突变体（YF-to-S、ΔpolyQ或polyQG;图2E）。我们注意到，与 Bcr1 和 Brg8（分别为 11 个和 1 个）相比，Efg1 和 Flo6 都具有更多的 polyQ 束（各 4 个），这可以解释为什么这些束的缺失在 Efg1/Flo8 中的影响大于在 Bcr1/Brg1 中。 总体而言，这些结果表明 PrLDs 对 C 中主 TF 的功能至关重要。白色念珠菌生物膜的形成，以及与相分离能力相关的PrLD氨基酸的替代减少或消除生物膜的形成。
我们还创建了两个TF嵌合体，以测试生物膜TF中的PrLDs是否可与不相关的PrLD互换。为此，使用来自人蛋白 Taf204 的 15 个残基 PrLD 替换 Efg1 中的两个 PrLD 或 Flo8 中的单个 PrLD（图 3A 和 3B）。有趣的是，Efg1-Taf15嵌合体形成的生物膜质量与表达WT Efg1的菌株相似（图3C），而Flo8-Taf15突变体无法形成生物膜（图3D）。这些结果表明，来自人类 TF 的 PrLD 有可能在功能上替代真菌生物膜 PrLD，但并非所有 PrLD 都是平等的，并且这种结构域交换与上下文相关。
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图 3. C支持的生物膜形成分析。白色TF-TAF15 PrLD嵌合体。
（甲，乙）Efg1 和 Flo8 序列的示意图，包括用 Taf15 PrLD 构建的嵌合体。 （C，D） Efg1- 和 Flo8-Taf15 嵌合体形成的生物膜。将 WT 或嵌合 TF 的一个拷贝整合到相应的 TF Δ/Δ 菌株中。所有统计检验均使用普通单因素方差分析与Dunnett多重比较检验进行，其中将每个突变菌株的平均值与对照的平均值进行比较。误差线显示 S.E.M. *P < 0.05;ns = 不显著。
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主TF PrLDs在成丝中的功能分析
成丝与C中的生物膜形成密切相关。白色念珠菌，以及组织侵袭和毒力的组成部分，以及许多生物膜调节TFs也控制着成丝程序[3,42,43]。因此，我们测试了生物膜TF PrLDs中的突变如何影响酵母菌丝的转变。将细胞在 30°C 的 YPD（酵母蛋白胨葡萄糖）培养基中生长过夜，然后稀释到 Spider 培养基中，Spider 培养基是一种强大的成导剂，也是用于生物膜测定的培养基。将细胞在 6°C 下在蜘蛛培养基中生长 37 小时，并分析酵母、菌丝和假菌丝形态。
一般来说，TF突变体表现出广泛的成丝表型。所有Efg1 PrLD缺失和氨基酸取代突变体均表现出明显的丝状缺陷。单个 PrLD 缺失菌株的菌丝形成减少，而 ΔNC 突变体或 YF-to-S、ΔpolyQ 或 polyQG 突变体未检测到菌丝细胞（图 4A）。尽管菌丝细胞丢失，但这些 Efg1 突变体仍然形成低百分比的假菌丝细胞。
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图 4. TF PrLD突变对成丝的影响分析。
（A-D）具有 Efg1 （A）、Brg1 （B）、Bcr1 （C） 和 Flo8 （D） 突变的菌株在菌导条件下生长 6 小时并测定细胞形态。包括具有代表性的显微镜图像。显示平均细胞计数值，误差条显示 S.D. 使用普通单因素方差分析和 Dunnett 多重比较检验进行统计分析，其中将平均细胞计数值与对照菌株进行比较。报告的P值是相对于酵母形式细胞计数（底行）和菌丝细胞计数（顶行）的对照的平均值。实验至少重复两次，n = 5，每张图像分析20个细胞，每个菌株总共200个细胞。*P < 0.05;**P < 0.01;市<0.001;P < 0.0001;ns = 不显著。比例尺;10微米。
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对于Brg1，除ΔpolyQ衍生物外，所有测试突变体的菌丝细胞形成均显著减少，而polyQG突变体显示出形成假菌丝细胞而不是菌丝细胞的趋势增加（图4B）。我们注意到，Brg1 ΔpolyQ突变体比YF-to-S和polyQG突变体表现出更高的生物膜质量（图2），因此形成菌丝细胞的倾向与Brg1突变体形成生物膜的能力相关。
大多数 Bcr1 变体仍然能够形成与对照菌株相似的菌丝细胞。只有 ΔN 和 ΔNC 缺失菌株的菌丝细胞形成显着减少（图 4C）。先前的研究报道了 Bcr1 在 C.白色念珠菌生物膜与其促进粘附的能力有关[44\u46]，我们的数据一致，Bcr1衍生物由于粘附缺陷而不是无法长丝而导致生物膜形成缺陷。
Flo8中单个PrLD的缺失导致菌丝形成的显着损失和酵母形式细胞的相应增加（图4D）。YF-to-S 和 ΔpolyQ Flo8 变体也基本上消除了菌丝细胞的形成（图 4D）。有趣的是，Flo8 polyQG细胞仍然能够细丝并形成真正的菌丝和假菌丝（图4D），但在生物膜形成方面存在缺陷（图2）。这表明 Flo8 polyQG 细胞在生物膜形成方面存在缺陷，其特征与它们的细丝倾向不同。
为了评估TF变体的表达和定位，用mNeonGreen对ORF进行C端标记，并通过显微镜观察（参见材料和方法）。这些测定表明，Efg1 和 Flo8 突变体正确定位于细胞核，并且表达量不明显低于 WT 对照组（S2 图），表明表型不是表达变化的结果。Bcr1 和 Brg1 的表达水平不够高，无法通过显微镜观察，因此使用蛋白质印迹法确定 Bcr1 变体的表达水平与野生型蛋白相似（S3 图）。Brg1蛋白即使通过蛋白质印迹也检测不到，尽管YF-to-S突变体显示出与WT对照相当的RNA表达（参见下面的RNA分析）。
总体而言，这些结果表明，生物膜TFs的PrLDs在调节C中起着关键作用。白色念珠菌丝状，特定 PrLD 氨基酸的替代可以消除菌丝形成和生物膜形成。
生物膜 TF YF-to-S 突变体表现出菌丝特异性基因表达降低
对 Efg1 和 Brg1 WT 和 YF-to-S 突变体进行 RNA 测序，以检查这些突变在导条件下（蜘蛛培养基在 37°C 下 6 小时）对基因表达的影响。如上所述，在这些条件下，Efg1 YF-to-S突变体显示出完全无法形成菌丝，而Brg1 YF-to-S突变体在菌丝形成方面显示出很大的减少，但不是完全阻断（图4A和4B）。82 个基因在 WT 和 YF-to-S Efg4 菌株之间差异表达 >0 倍（调整后的 P 值< 05.1）（突变体相对于 WT 向上 29 个基因，向下 53 个基因）。差异调控的 GO（基因本体）过程包括生物膜形成、蛋白水解和热驯化（图 5 和附录 S1）。相比之下，WT 和 YF-to-S Brg59 菌株之间有 1 个基因差异表达（相对于 WT 而言，突变体中向上表达 11 个基因，向下表达 48 个基因），唯一差异调控的 GO 过程是种间相互作用（图 5 和附录 S1）。有趣的是，Efg1 YF-to-S突变体未能表达两个主生物膜TF，BRG1和TEC1，以及两个关键的成丝特异性基因ALS3和ECE1[42]，其程度与WT菌株相同。在这四个基因中，Brg1 YF-to-S突变体仅显示出相对于WT对照的诱导ALS3的能力（图5和S1和S2附录）。这些数据表明，从TF PrLDs中去除芳香族残基可以抑制关键丝状基因的表达，并且Efg1突变对其他主生物膜TFs表达的影响大于Brg1突变，这与这些突变对丝状的影响更大一致。
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图 5. TF YF-to-S 突变体降低菌丝特异性基因表达。
（A） Efg1 和 Brg1 的 WT 和 YF-to-S 突变体之间差异表达基因的火山图（一式三份），红色基因显着上调或下调（与 WT 相比，YF-to-S 突变体的上调或下调）。重点介绍了几个关键的主生物膜TF和菌丝特异性基因。（B） Efg4 和 Brg1 的 WT 和 YF-to-S 突变体之间差异表达基因（>1 倍）的热图，箭头突出显示主生物膜 TF 或关键菌丝特异性基因。Benjamini-Hochberg调整
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011833.g005
Efg1、Brg1 和 Flo8 PrLD 促进活细胞核中的相分离
C的潜力。白色通过在哺乳动物 U2OS 细胞系中的表达来评估形成生物分子缩合物的 TF PrLD。该细胞系包含~50,000个整合到基因组中的Lac操作子（Lac operator， LacO）阵列拷贝，已被用于证明人和酵母TF的液-液相分离（LLPS）[14,28,35,47]。在该系统中，Lac阻遏蛋白（LacI）被募集到LacO阵列中，可用于可视化活细胞中与LacI-EYFP融合的TF PrLDs的定位（图6A）[35,47]。LacI-EYFP对照在芯片上形成单个斑点，而TF-LacI-EYFP融合蛋白的相分离在芯片上产生更大的病灶，通常在整个细胞核中具有额外的点状物[14,28,35]。
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图 6. 生物膜TF在U2OS细胞中形成液态、相分离的缩合物。
（A） U2OS 细胞中用于募集 LacI 和 LacI-PrLD 融合蛋白的 LacO 阵列示意图。使用 BioRender.com 创建。（B） 含有 LacO 阵列（以黄色圆圈显示）并表达 LacI-EYFP 对照或融合到 LacI-EYFP 的 Efg2、Brg1、Flo1 或 Bcr8 PrLD 的 U1OS 细胞的代表性图像。比例尺;10微米。（C） 定量与 LacI-EYFP 对照或 PrLD 构建体结合的 LacO 阵列的平均大小（顶部）和平均荧光强度（底部）。值显示 LacO 阵列处的平均面积和荧光强度，误差线显示用 10% 1,6-HD （D） 或 10% 2,5-HD （E） 处理前后细胞的 S.D. （D，E） 代表性图像。比例尺;10微米。图表跟踪随时间推移的幸存点状数量。误差线显示 S.E.M. （F） 左侧：表达 LacI-EYFP 对照或 Efg2 或 Brg1（WT 或 YF-to-S 突变体）PrLDs 与 LacI-EYFP 融合的 U1OS 细胞的代表性图像。黄色圆圈表示 LacO 阵列。比例尺;10微米。右侧：定量与 LacI 构建体结合的 LacO 阵列的平均大小（顶部）和荧光强度（底部）。值表示平均值，误差线表示 S.D.（G） C 的代表性图像。白色TF PrLD-LacI-EYFP 和 PrLD-mCherry 构建体在 U2OS LacO 细胞中共表达（左图）和 LacO 阵列上 mCherry 信号富集的定量（右图）。富集定义为阵列上的最大 mCherry 强度除以阵列外的平均强度。Null 构造是单独的 mCherry。富集大于 1 表示阵列上的 PrLD-PrLD 相互作用。显示平均富集值，误差线为 S.D.。所有统计分析均使用普通单因素方差分析和Dunnett多重比较检验进行，其中将平均富集值与对照Null/LacI构建体的平均富集值进行比较。报告的 P 值是相对于 Null/LacI 控件的平均值。实验至少重复两次，结果相似，n = 20-25，每个构建体分析25个单个细胞的图像。*P < 0.05;**P < 0.01;市<0.001;P < 0.0001。比例尺;10微米。
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先前显示，Efg1 PrLDs在U2OS细胞中形成相分离凝聚物，与此一致，与单独使用LacI-EYFP相比，在表达Efg1-LacI-EYFP的细胞中明显存在更大、更亮的LacO阵列斑点（图6B和6C）[28]。Brg1-和Flo8-LacI-EYFP构建体与LacI-EYFP对照组类似地形成了明显更大的LacO相关病灶（图6B和6C）。微分干涉对比（DIC）显微镜也观察到PrLD-LacI融合形成的病灶，表明它们的折射率和质量密度与周围细胞环境明显不同（图6B）[35]。除了阵列相关病灶外，Efg1、Brg1 和 Flo8 PrLDs 在整个细胞核中产生了额外的病灶（图 6B）。相比之下，Bcr1-LacI-EYFP仅在LacO阵列上形成病灶，并且这些病灶并不明显大于对照（图6B和6C），表明Bcr1 PrLDs促进相分离事件的能力较低。
脂肪醇1,6-己二醇（1,6-HD）优先破坏具有液态特性的冷凝物中的弱疏水相互作用，但对凝胶状或固体组装体影响不大[48\u50]。为了检查TF点状的物理性质，用2%的10,1-HD处理U6OS细胞5分钟，使Efg1，Brg1和Flo8缩合物迅速溶解，而LacI-EYFP控制信号不受影响（图6D）。化合物2,5-己二醇（2,5-HD）与1,6-HD密切相关，但不能有效地溶解液体冷凝物[35]。用 10% 2,5-HD 处理对 Efg1、Brg1 或 Flo8 冷凝物的影响程度与 1,6-HD 相同，这与这些液滴具有液滴特性的液滴一致（图 6E）。
还在 U1OS 细胞中测试了 Efg1 和 Brg2 PrLD 的 YF-to-S 衍生物，以评估相分离能力。YF-to-S突变体均未在LacO阵列上形成扩大/更亮的病灶（图6F）。此外，两种突变体均未在LacO病灶外形成额外的凝聚物。这些结果表明，虽然PrLDs可以增加相分离的倾向，但这些结构域中的关键残基（特别是芳香族残基）对于促进相分离事件至关重要。
PrLD 可实现 TF 之间的同型和异型相互作用
PrLDs在U2OS细胞中形成凝聚物的能力促使我们测试这些结构域是否可以介导同型或异型相互作用。TF PrLD 与 LacI-EYFP（如上）或 mCherry 融合，并在含有 LacO 阵列的 U2OS 细胞中共表达。然后将 EYFP 和 mCherry 信号在 LacO 阵列上的共定位用作 PrLD 依赖性相互作用的读数。
与对照组相比，来自 Efg1 和 Flo8 的 PrLD 都经历了同型（自身）相互作用，当与这些 PrLD 融合时，EYFP 和 mCherry 信号的显着重叠证明了这一点（图 6G）。PrLD介导的共定位不仅在LacO阵列上可见，而且在整个细胞核的多个其他位点上也可见（图6G）。当 Efg1 mCherry 信号被募集到 Flo1- 和 Bcr8-LacI-EYFP 病灶时，Efg1-PrLD 也与其他 TF PrLD 发生了异型相互作用（图 6G）。
这些结果表明，大多数（但不是全部）生物膜TF PrLDs可以在细胞中形成相分离的缩合物。他们还表明，这些 PrLD 可以介导生物膜 TRN 中 TF 之间的相互作用，包括涉及 Efg1 的相互作用。有趣的是，即使在没有扩大的凝聚物病灶的情况下，蛋白质-蛋白质相互作用也可以由PrLDs介导，因为Bcr1在LacO阵列上形成的小病灶仍然能够募集Efg1。
生物膜TF在体外进行相分离，这些缩合物可以掺入RNA聚合酶II的C末端结构域
通过从 E 中纯化 Efg1 和 Flo8 蛋白来检测这些蛋白质的生化性质。大肠杆菌。TFs表达为与麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白，以提高溶解度，并用TEV蛋白酶处理，从MBP中释放天然TFs（图7A）。如先前报道的那样，纯化的 Efg1 和 Flo8 很容易形成液态冷凝物（图 7B 和 7C），即使不包含分子拥挤剂，Efg1 也能形成浓度低至 5 μM 的液滴（图 7B）[28]。纯化的 Flo8 蛋白也形成液体缩合物，尽管这需要 5% 聚乙二醇 （PEG） 作为拥挤剂（图 7C）。当通过显微镜监测时，液滴经历连续的融合事件时，液体样行为是显而易见的。核酸可以促进某些相分离事件[22,51,52]，因此我们测试了C的影响。液滴形成上的白色念珠基因组DNA（gDNA）。加入gDNA导致更大的Efg1液滴（图7C），与先前的观察结果一致[28]。在gDNA存在下，Flo8液滴也更大，形成浓度低至1.25μM（图7C）。这些结果表明，Efg1 和 Flo8 在体外都容易发生液相分离，并且 DNA 促进了缩合事件。
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图 7. Efg1 和 Flo8 在体外形成相分离缩合物。
（A）重组蛋白纯化载体示意图。MBP，麦芽糖结合蛋白;TEV，烟草蚀刻病毒蛋白酶位点;TF ORF，转录因子开放阅读框。使用 BioRender.com 创建。（乙，丙）Efg1 （B） 和 Flo8 （C） 在有和没有 C 的情况下形成的蛋白质液滴的代表性图像。白色念珠菌gDNA。在 30°C 下，在含有 22 mM NaCl 的 10 mM Tris-HCl 缓冲液中用 TEV 蛋白酶处理蛋白质 150 分钟。Flo8缓冲液还包括5%的PEG-8000。gDNA的终浓度为50 nM。图像代表单个实验重复，实验至少重复两次。比例尺;5微米。（D） 添加 RNA Pol II GFP-CTD 或单独添加 GFP-CTD 的 Efg1 和 Flo8 蛋白液滴的代表性图像（左图）以及 TF 液滴中 GFP-CTD 富集的定量（右图）。将 Efg1 或 Flo8 与 GFP-CTD 或 GFP 混合，并将混合物在 30°C 下在含有 22 mM NaCl 和 10% PEG-150 的 5 mM Tris-HCl 缓冲液中处理 8000 分钟。Efg1 或 Flo8 的终浓度为 15 μM，GFP-CTD 的终浓度为 1.5 μM。为了定量，液滴位于DIC通道中，减去荧光背景后，液滴内部GFP信号的强度与液滴外部的强度信号相比。至少使用5张图像进行定量，每个TF总共测量了25个液滴。箱形图和晶须图显示了所有数据点，从最大值到最小值，并指示 Efg1 或 Flo8 液滴中 GFP-CTD 的富集率。对于每个图，数据为中位数（线）、平均值（“+”）、第 25-75 个百分位数（框）和第 5-95 个百分位数（晶须）。使用双尾 Mann-Whitney U 检验进行统计学显着性。P < 0.0001。比例尺;5微米。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011833.g007
RNA聚合酶II（RNA pol II）是转录所有蛋白质编码基因和大多数非编码RNA所必需的[53,54]。RNA pol II包含一个内在无序的C端结构域（CTD），该结构域由从酵母到人类的七重复序列组成[55,56]。CTD已被证明可以进行相分离，RNA Pol II可以与其他含IDR的转录调节因子形成组装体[35,55–58]。测试 C.白色RNA Pol II 可以掺入 Efg1 和 Flo8 液滴 C 中。白色CTD从E中纯化。大肠杆菌作为与MBP-TEV和GFP的融合蛋白，并在TEV处理前与纯化的TF混合。在蛋白水解处理后，GFP-CTD 很容易被募集到 Efg1 和 Flo8 液滴中，而单独使用 GFP 则不然（图 7D）。在我们的测定条件下，GFP-CTD本身没有形成冷凝物（图7D）。这些结果表明，生物膜TFs形成相分离液滴，可以结合C的固有无序CTD。白色RNA pol II.
PrLD突变减弱了哺乳动物宿主定植过程中的丝状化
上述数据表明，PrLDs对于生物膜TFs在实验室条件下的成丝和生物膜形成功能至关重要。然而，实验室中菌株的丝状化并不总是反映它们在哺乳动物宿主中的丝状作用[59,60]。定义 TF PrLDs 对 C 的贡献。白色念珠菌在体内的行为，我们评估了表达 PrLD 的突变菌株在小鼠胃肠道定植期间的丝状能力。用抗生素预处理小鼠（以促进真菌定植），然后用C管饲。表达 Efg1 或 Brg1 的 WT 或 YF-to-S 变体的白色念珠菌菌株。 实验进行7天，并通过用抗念珠菌抗体染色检查结肠中真菌细胞的形态（参见材料和方法）。用对照菌株定植的小鼠显示出酵母和菌丝细胞的混合物，这与先前的研究一致[59,61–63]。相比之下，Efg1 和 Brg1 的 YF-to-S 突变体几乎完全在该生态位中形成酵母细胞（图 8A 和 8B）。这些结果表明，PrLD突变可以预防C。白色在实验室条件下形成菌丝细胞的TF也会阻断这些TF在哺乳动物肠道定植中的功能。
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图 8. 从 Efg1 或 Brg1 PrLDs 中去除芳香族氨基酸可阻断 C。白色念珠菌在小鼠肠道中的丝状。
（甲，乙）用指示的 C 定植的小鼠的代表性图像（左）和细胞类型计数（右）。白色念珠菌菌株，Efg1（A，顶部）或Brg1（B，底部）。将小鼠定植 7 天，然后准备结肠切片进行成像。在图像中，C.白色念珠菌细胞是绿色的，肠粘液是红色的，上皮细胞是蓝色的。黄色箭头表示丝状细胞。每种菌株使用2-4只小鼠，合并结肠切片的细胞计数。每个酵母菌株至少计数 300 个细胞。图表显示细胞计数，误差线表示 S.D.使用单样本 T 检验计算统计显着性。报告的P值是相对于酵母形式细胞计数（底行）和菌丝细胞计数（顶行）的对照的平均值。*P < 0.05;P < 0.0001;ns = 不显著。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011833.g008
讨论
白色念珠菌的丝状化和生物膜形成对于宿主入侵和设备相关感染至关重要。生物膜的发育受11个主TF的TRN调控，这些TF与整个基因组的关键调控区域结合，包括这些TF中的一个或多个通常缺乏共识结合基序的位置[12,<>]。因此，可以设想生物膜TFs之间的物理相互作用是其调节靶基因表达功能不可或缺的一部分。
在这项研究中，我们发现24个主生物膜TF含有内在无序的PrLDs，可促进分子间相互作用和相分离缩合物的形成[25,1]。详细检查了四种生物膜TFs，即Bcr1、Brg1、Efg8和Flo1，并去除了它们各自的PrLDs，完全阻断了它们支持生物膜形成的能力。除Bcr1外，去除PrLD也会抑制成丝形成，这与先前的报道一致，即Bcr11影响细胞粘附而不是成丝[46,1]。对于Efg64，先前有报道删除亚结构域可减少或消除菌丝细胞的形成[<>]，这与本文提供的数据一致。
PrLDs的突变研究表明，芳香族残基可以通过pi-pi或阳离子-pi相互作用促进蛋白质的分子间相互作用和相分离[36\u37]。我们发现 Efg1、Bcr1、Brg1 和 Flo8 的 PrLD 中的 YF-to-S 取代都会导致有缺陷的 TF，从而确定芳香族残基对其细胞功能的重要性。聚谷氨酰胺序列也会影响LLPS，亨廷顿外显子1蛋白中较长的polyQ束与相分离、聚集和与其他LCD相互作用的增加有关[40,49,65]。PolyQ-ataxin-1是一种与神经退行性疾病脊髓小脑性共济失调1相关的蛋白，同样含有一个扩展的polyQ区，介导凝聚物的形成[41,66]。与这些例子一致，聚谷氨酰胺延伸（ΔpolyQ 或 polyQG 突变体）的破坏限制了 Efg1、Brg1 和 Flo8 在生物膜形成中的功能，但不限制 Bcr1。
Efg1突变体的生物膜和丝状缺陷之间也存在明显的联系。Efg1 YF-to-S、ΔpolyQ 和 polyQG 变体在生物膜形成和成丝方面都存在完全缺陷。相比之下，Brg1 ΔpolyQ 和 Flo8 polyQG 突变体在生物膜形成方面存在缺陷，但在浮游培养物中仍以接近对照菌株的频率形成菌丝。这些结果表明，Brg1和Flo8可能通过丝状作用以外的机制影响生物膜的发育，或者生物膜内的丝状作用与浮游生物条件下的丝状作用不同。WT和突变TF菌株的RNA测序证实了表型结果。因此，在丝状方面存在实质性缺陷的 Efg1 和 Brg1 YF-to-S 突变体也表现出菌丝特异性基因表达的缺陷。此外，与等效的Brg1突变体相比，Efg 1突变体显示出更完全的菌丝形成缺失，并且对基因表达的影响更大，尤其是在菌丝相关基因中。
检查了两种嵌合 TF Efg1-Taf15 和 Flo8-Taf15 的功能，其中 C.白色TF 被人蛋白 TAF15 的 TF 取代。有趣的是，Efg1-Taf15嵌合体在生物膜测定中显示出几乎野生型的活性，而Flo8-Taf15蛋白基本上是无功能的。这些结果表明，PrLDs之间存在一定的可塑性，但并非所有PrLDs在功能上都是可互换的。这显然是进一步调查的一个重要领域，以了解 PrLD 的特性，使它们能够在 TF 之间交换时保持功能。
通过在哺乳动物 U2OS 细胞中的表达来检查生物膜 PrLD 形成相分离缩合物的潜力。Efg1、Brg1 和 Flo8 的 PrLD，而不是 Bcr1，支持在 LacO 阵列和整个原子核的其他位置形成液体冷凝物。用1,6-HD处理这些缩合物比用2,5-HD处理时溶解得更快，表明弱疏水相互作用有助于它们的相分离[48,50]。至关重要的是，Efg1 和 Brg1 中的 YF-to-S 取代阻止了凝聚物的形成（在 LacO 阵列和细胞核的其他位置），表明这些突变阻断了 TF 功能和相分离。我们注意到，PrLDs可以促进同型相互作用（例如，Efg1-Efg1或Flo8-Flo8相互作用），而某些PrLDs通过异型相互作用被招募到其他PrLDs形成的病灶中（例如，Efg1被招募到Flo8或Bcr1病灶）。虽然我们专注于TF PrLDs在相分离中的作用，但DNA结合结构域也可能影响这些事件，因为结构化结构域/基序可以增强蛋白质凝聚[22,67]，因此该模型中全长TFs的分析可能在未来引起人们的兴趣。
生化分析表明，纯化的Flo8与Efg1一样[28]，在体外容易形成液滴，并且液滴的形成受到DNA的刺激。这与其他关于核酸促进蛋白质凝聚事件的报道一致[15,16,68]。 我们还表明，C.白色RNA Pol II 掺入 Efg1 或 Flo8 形成的液滴中，但自身不易形成液滴。最近的研究表明，S.酿酒酵母和人RNA Pol II都形成液体缩合物（在分子拥挤剂存在下），这可能有助于启动基因表达[55,69]。 我们的数据同样表明，PrLD-CTD 相互作用对于将 RNA Pol II 募集到 C 可能很重要。白色念珠菌启动子，用于诱导基因表达。鉴于RNA Pol II的磷酸化可以改变其相分离的倾向[55,69]，现在还必须研究翻译后修饰对C的作用。白色RNA Pol II 和转录。
目前，已经提出了两种相互竞争的转录激活模型，其中转录机制通过形成相分离凝聚物或形成不涉及相分离事件的瞬时“枢纽”来组装[70\u71]。两种模型都调用了TFs、Mediator复合物和RNA pol II之间的“模糊”相互作用，尽管它们在组分是否达到相分离所需的浓度阈值方面存在差异[56,72–74]。我们的实验表明，促进 PrLD-PrLD 相互作用的力对 C 中的 TF 功能至关重要。白色念珠菌。然而，PrLD仍然有可能支持瞬态TF集线器的形成，而不是更稳定的相分离冷凝物来调节C。白色念珠菌基因表达。在这方面，值得注意的是，与 Efg1、Flo1 或 Brg8 不同，Bcr1 PrLDs 不会在 U2OS 细胞中形成凝聚物，但仍能与 Efg1 PrLDs 相互作用。因此，我们建议 C.白色念珠菌生物膜TFs可以通过PrLDs相互作用，通过形成瞬时枢纽和形成相分离的凝聚物，这取决于所涉及的TFs的组合及其在基因组中不同位点的浓度水平。需要更多的实验来解决这些可能性，与高等真核生物相比，真菌核的尺寸相对较小。
最后，我们讨论了在体外培养条件下消除TF功能的PrLD突变是否同样影响其在宿主感染期间的功能。这很重要，因为 C 的属性。宿主中的白色念珠菌细胞并不总是反映培养物中的细胞，因此需要直接评估体内形态[59,60]。白色念珠菌定植于多种哺乳动物生态位，包括胃肠道，以酵母细胞和菌丝形式存在[59,75]。我们评估了 Efg1 和 Brg1 的 YF-to-S 突变体，它们在体外的丝状化都具有高度缺陷，并确定它们在胃肠道定植期间也存在丝状缺陷。这些实验表明，从TF PrLDs中去除芳香族残留物可以防止C。宿主中的白色念珠菌丝状，是生物膜形成和发病机制不可或缺的特征[1,59,76]。
结论
高度互连的 TF 网络调节 C 中的成丝和生物膜形成。白色念珠菌。我们证明，这些主 TF 中存在的 PrLD 是其功能不可或缺的一部分，因为它们能够实现蛋白质-蛋白质相互作用，包括同型相互作用、异型 TF-TF 相互作用以及与 RNA Pol II 的 CTD 相互作用。因此，PrLD-PrLD接触的破坏可以消除对真菌行为和发病机制至关重要的关键性状。充分了解PrLD对转录和相分离行为的贡献，可以为禁用TRN的新治疗方法铺平道路，这不仅对真菌疾病的治疗具有深远的影响，而且对改变异常TRNs（例如与人类疾病（包括癌症）相关的TRNs）具有深远的影响[77\u79]。
材料与方法
质粒构建
白色念珠菌TF构建体是在pSFS2A[80]或该质粒的衍生物中创建的，如下所示。所述构建含有全长Efg1的质粒pRB360[81]。Efg1 ΔN PrLD 质粒 （pRB630） 是通过融合 PCR 对从 pRB360 扩增的两个片段产生的：（1） Efg1 5' 侧翼与寡核苷酸 1838/3916;（2） Efg1 ΔN PrLD ORF 与寡核苷酸 3915/1839。用寡核苷酸1838/1839对两个片段进行重叠延伸（SOE）-PCR剪接，并将所得片段用ApaI/KpnI克隆到pSFS2A中[82]。Efg1 ΔC PrLD 质粒 （pRB632） 是通过融合 PCR 对从 pRB360 扩增的两个片段创建的：（1） Efg1 5' 侧翼和 ΔC ORF 与寡核苷酸 1838/3918;（2）剩余的Efg1 ΔC ORF和3'侧翼，寡核苷酸3917/1839。片段与SOE-PCR融合，产物用ApaI/KpnI克隆到pSFS2A中。对从 pRB1 扩增的三个片段进行融合 PCR 技术，可制备 Efg634 ΔNC PrLD 质粒 （pRB360）：（1） Efg1 5' 侧翼，寡核苷酸 1838/3916;（2） Efg1 DNA与寡核苷酸3915/3918结合结构域;（3） Efg1 3'侧翼，寡核苷酸 3917/1839。通过SOE-PCR融合片段，并使用ApaI/KpnI克隆到pSFS2A中。
对于Efg1 PrLD氨基酸突变体，通过BioBasic合成PrLD序列，通过Golden Gate Assembly（GGA）组装质粒。通过对寡核苷酸 2/1397 进行退火，生成了 pSFS6048A （pRB6049） 的金门组装 （GGA） 适应版本，以产生包含两个朝外的 BsaI 位点的短双链 DNA 片段，以及允许连接到 apaI/XhoI 消化的 pSFS2A 的粘性末端。Efg1 3'侧翼序列从C扩增而来。白色SC5314 gDNA 与寡核苷酸 6422/6423，并用 SacII/SacI 克隆到 pRB1397 中，生成 pRB1763。然后将所得质粒用作所有Efg1 PrLD氨基酸突变GGA反应的目的载体。Efg1 YF-to-S PrLD 构建体 （pRB1610） 是通过四个 PCR 片段的 GGA 创建的：（1） 来自寡核苷酸 1/5 的 gDNA 的 Efg6376 6377' 侧翼;（2） 来自 pRB1 的 Efg1858 N 端 YF-to-S PrLD，寡核苷酸 6378/6379;（3） gDNA 与寡核苷酸 1/6380 的 Efg6381 DNA 结合域;（4） 来自 pRB1 的 Efg1858 C 端 YF-to-S PrLD，寡核苷酸 6382/6383。片段通过GGA和BsaI-HFv2（NEB）组装。Efg1 ΔpolyQ PrLD 构建体 （pRB1612） 是用 1 个 PCR 片段的 GGA 创建的：（1） 来自 gDNA 的 Efg5 6376' 侧翼，寡核苷酸 6391/2;（1） 来自pRB1860的Efg6392 N端ΔpolyQ PrLD，寡核苷酸6393/3;（1） gDNA 与寡核苷酸 6394/6395 的 Efg4 DNA 结合结构域;（1） 来自 pRB1860 的 Efg6396 C 端 ΔpolyQ PrLD，寡核苷酸 6397/2。通过GGA反应与BsaI-HFv1组装片段。Efg1611 polyQG PrLD 构建体 （pRB1） 是通过 GGA 对四个 PCR 片段产生：（1） 来自寡核苷酸 5/6376 的 gDNA 的 Efg6384 2' 侧翼;（1） 来自 pRB1859 的 Efg6385 N 端 polyQG PrLD，寡核苷酸 6386/3;（1） gDNA 与寡核苷酸 6387/6388 的 Efg4 DNA 结合域;（1） 来自 pRB1859 的 Efg6389 C 端 polyQG PrLD，寡核苷酸 6390/2。片段由GGA与BsaI-HFv1组装。Efg15-Taf1946 质粒 （pRB4） 通过 GGA 创建，共有 1 个片段：（1） Efg5 6376' 侧翼从 gDNA 中扩增，寡核苷酸 6377/2;（15）用寡核苷酸1210/7771从pRB7772扩增Taf3 PrLD;（1）从寡核苷酸7775/7776的gDNA中扩增Efg4 DBD;（15） Taf1210 IDR 从 pRB7773 中扩增，寡核苷酸 7774/2。片段通过GGA和BsaI-HFv<>组装到载体中。
通过PCR制备Brg1和PrLD突变衍生物，并克隆到pSFS2A中。所有这些构建体的骨架包括Brg1 3'侧翼，用寡核苷酸6103/6104从gDNA扩增，然后用SacII/SacI克隆到pSFS2A中。对于全长构建体 （pRB1601），用寡核苷酸 1/5 从 gDNA 中扩增 BRG6099 ORF（具有 6102' 侧翼），然后用 KpnI/ApaI 克隆到 pSFS2A 载体中。对于Brg1 ΔN PrLD质粒（pRB1602），从gDNA中扩增了两个片段：（1）5'侧翼，ORF（无N端PrLD），寡核苷酸6099/6113;（2）剩余的ORF寡核苷酸6112/6102。SOE-PCR将片段融合在一起，所得产物用KpnI/ApaI酶解并克隆到pSFS2A中。对于Brg1 ΔC PrLD质粒（pRB1603），用寡核苷酸6099/6105从gDNA中扩增不含C端PrLD的ORF，并用KpnI/ApaI将片段克隆到pSFS2A载体中。Brg1 ΔNC PrLD 质粒 （pRB1604） 是通过两个片段的融合 PCR 产生的：（1） 使用寡核苷酸 5/6099 与 ORF（无 N 端 PrLD）的 6113' 侧翼;（2） 剩余的 ORF（无 C 端 PrLD）寡核苷酸 6112/6105。通过SOE-PCR将片段缝合在一起，并用ApaI/KpnI将产物克隆到pSFS2A中。
对于Brg1 PrLD突变体，使用带有Brg2 1'侧翼的修饰pSFS3A质粒，通过BioBasic合成PrLD序列，并通过GGA组装质粒，用寡核苷酸6103/6104从gDNA中扩增，并用SacII/SacI克隆到pRB1397中。Brg1 YF-to-S PrLD 质粒 （pRB1739） 通过四个片段的 GGA 制备：（1） Brg1 5'侧翼，用寡核苷酸 6569/6570 从 gDNA 扩增;（2） 用寡核苷酸 1862/6571 扩增自 pRB6572 的 YF-to-S N 端 PrLD;（3）从gDNA中扩增出的Brg1 DNA结合域，寡核苷酸为6573/6574;（4） 用寡核苷酸 1862/6575 从 pRB6576 扩增的 YF-to-S C 端 PrLD。片段通过 GGA 和 BsaI-HFv2 组装。Brg1 ΔpolyQ PrLD 质粒 （pRB1740） 通过四个片段的 GGA 制备：（1） Brg1 5' 侧翼，用寡核苷酸 6569/6570 扩增自 gDNA;（2） 用寡核苷酸 1864/6571 扩增自 pRB6572 的 ΔpolyQ N 端 PrLD;（3）从gDNA中扩增的Brg1 DNA结合域，寡核苷酸为6573/6614;（4） 用寡核苷酸 1864/6615 从 pRB6583 扩增的 ΔpolyQ C 端 PrLD。片段由GGA与BsaI-HFv2组装。Brg1 polyQG PrLD 质粒 （pRB1741） 是通过 GGA 的四个片段制备的：（1） Brg1 5' 侧翼，由 gDNA 和寡核苷酸 6569/6570 扩增;（2） 用寡核苷酸 1863/6571 扩增自 pRB6577 的 polyQG N 端 PrLD;（3）用寡核苷酸1/6573扩增的gDNA结合域Brg6578;（4） 用寡核苷酸 1863/6579 扩增自 pRB6580 的 polyQG C 端 PrLD。片段由GGA与BsaI-HFv2组装。
所有 Bcr1 质粒均由 GGA 构建。野生型基因和PrLD突变体的骨架质粒是修饰的pSFS2A GGA质粒，其Bcr1 3'侧翼序列，从gDNA中用寡核苷酸6095/6096扩增，并用SacII/SacI克隆到pRB1397中。对于全长 Bcr1 质粒 （pRB1742），BCR1 ORF（具有 5' 侧翼）从含有寡核苷酸 6622/6625 的 gDNA 中扩增，并通过 GGA 与 BsaI-HFv2 组装所得产物。Bcr1 ΔN PrLD 质粒 （pRB1743） 由两个 PCR 片段组装而成：（1） Bcr1 5' 侧翼，用寡核苷酸 6622/6623 扩增自 gDNA;（2）用寡核苷酸1/6624从gDNA扩增的BCR6625 ORF（无N端PrLD）。通过GGA反应与BsaI-HFv2组装片段。Bcr1 ΔC PrLD质粒（pRB1744）由两个PCR片段组装而成：（1）从gDNA扩增的Bcr1 5'侧翼，寡核苷酸为6626/6627;（2）BCR1 ORF（无C端PrLD）从寡核苷酸6628/6629的gDNA中扩增。片段由GGA与BsaI-HFv2组装。Bcr1 ΔNC PrLD质粒（pRB1745）由三个PCR片段组装而成：（1）从gDNA扩增的Bcr1 5'侧翼寡核苷酸寡核苷酸6630/6631;（2）用寡核苷酸1/6632从gDNA扩增的BCR6633 ORF（无N端PrLD）;（3） 用寡核苷酸 1/6634 从 gDNA 扩增的 BCR6635 ORF（无 C 端 PrLD）。片段由GGA与BsaI-HFv2组装。
对于Bcr1 PrLD氨基酸突变质粒，采用BioBasic合成了PrLD序列。Bcr1 YF-to-S PrLD 质粒 （pRB1746） 通过五个片段的 GGA 制备：（1） Bcr1 5' 侧翼，用寡核苷酸 6863/6864 从 gDNA 扩增;（2） 用寡核苷酸 1865/6865 扩增自 pRB6866 的 YF-to-S N 端 PrLD;（3）寡核苷酸1/6867扩增gDNA扩增的Bcr6868 DNA结合域;（4） 用寡核苷酸 1865/6869 从 pRB6870 扩增的 YF-to-S C 端 PrLD;（5）剩余的BCR1 ORF从gDNA中扩增，寡核苷酸为6871/6872。片段由GGA与BsaI-HFv2组装。Bcr1 ΔpolyQ PrLD 质粒 （pRB1747） 是通过 1 个片段的 GGA 制备的：（1） Bcr5 6873' 侧翼，由 gDNA 和寡核苷酸 6874/2 扩增;（1864） 用寡核苷酸 6875/6876 扩增自 pRB3 的 ΔpolyQ N 端 PrLD;（1）从gDNA扩增的Bcr6877 DNA结合域，寡核苷酸6878/4;（1864） 用寡核苷酸 6879/6880 扩增自 pRB5 的 ΔpolyQ C 端 PrLD;（1）剩余的BCR6881 ORF从寡核苷酸6882/2的gDNA扩增。片段由GGA与BsaI-HFv1组装。Bcr1748 polyQG PrLD 质粒 （pRB1） 通过五个片段的 GGA 制备：（1） Bcr5 6883' 侧翼，由 gDNA 扩增，寡核苷酸 6884/2;（1866）用寡核苷酸6885/6886扩增自pRB3的polyQG N端PrLD;（1）寡核苷酸6887/6888从gDNA扩增的Bcr4 DNA结合域;（1866） 用寡核苷酸 6889/6890 扩增自 pRB5 的 ΔpolyQ C 端 PrLD;（1）剩余的BCR6891 ORF从寡核苷酸6892/2的gDNA扩增而来。片段由GGA与BsaI-HFv<>组装。
所有 Flo8 构建体均通过 PCR 创建并克隆到 pSFS2A 骨架中。骨架包括 Flo8 3' 侧翼，用寡核苷酸 6089/6090 从 gDNA 扩增，然后用 SacII/SacI 克隆到 pSFS2A 中。对于全长 Flo8 质粒 （pRB1790），用寡核苷酸 8/5 从 gDNA 中扩增 FLO6085 ORF（具有 6088' 侧翼），并使用 ApaI/XhoI 将产物克隆到 pSFS2A 中。Flo8 ΔN PrLD DNA序列由Twist BioScience合成。Flo8 ΔN PrLD 质粒 （pRB1791） 是通过两个片段的融合 PCR 制备的：（1） 用寡核苷酸 8/5 从 gDNA 扩增的 Flo6085 6086' 侧翼;（2） 用寡核苷酸 8/1871 从 pRB6108 扩增的 Flo6088 ΔN PrLD。将产物与SOE-PCR融合在一起，并用ApaI/XhoI克隆片段到pSFS2A载体中。Flo8 PrLD氨基酸突变体由BioMatik合成。通过PCR制备Flo8 YF-to-S PrLD质粒（pRB1793），用寡核苷酸5/1867从pRB6085扩增YF-to-S PrLD（包括6088'侧翼），然后用ApaI/XhoI克隆到pSFS2A载体中。通过PCR制备Flo8 ΔpolyQ PrLD质粒（pRB1794），用寡核苷酸5/1868从pRB6085扩增ΔpolyQ PrLD（包括6088'侧翼），然后用ApaI/XhoI克隆到pSFS2A载体中。通过PCR制备Flo8 polyQG PrLD质粒（pRB1795），用寡核苷酸5/1869从pRB6085扩增polyQG PrLD（包括6088'侧翼），然后用ApaI/XhoI克隆到pSFS2A载体中。Flo8-Taf15质粒（pRB2042）以pSFS3A载体为骨架，以Flo2 8'侧翼为骨架，用GGA组装3个。（1）用寡核苷酸8/5从gDNA扩增Flo7777 7780'侧翼和N末端区;（2）用寡核苷酸15/1210从pRB7783扩增Taf7772 IDR;（3） 用寡核苷酸 8/7781 从 gDNA 扩增 Flo7782 C 末端区。片段由GGA与BsaI-HFv2组装。
对于蛋白质测定，EFG1 和 FLO8 ORF 对密码子优化以在 E 中表达。大肠杆菌。然后将合成的ORF与限制性内切酶NdeI/XhoI克隆到质粒pRP1B–MBP/THMT（pRB523）中，分别创建质粒pRB514和pRB971[83,84]。 RNA Pol II 的 GFP-CTD 是通过 2 个片段的融合 PCR 产生的：（1） GFP 用寡核苷酸 690/4877 从 pRB4878 扩增;（2）RNA Pol II的C端结构域从pRB984扩增（密码子优化E.大肠杆菌表达，由 Biomatik 合成）与寡核苷酸 5084/5085。进行SOE PCR以将两个片段与寡核苷酸4877/5085融合。将所得产物与限制性内切酶 NheI/XhoI 克隆到 pRB523 中，生成 pRB1034。pMBP-GFP 质粒 （pRB723） 是通过 PCR 扩增 pRB690 （寡核苷酸 4122/4123） 的 GFP 而产生的，该 GFP 用 NheI/XhoI 克隆到 pRB523 中。
用于 C 的表达。白色U2OS LacO 细胞中的 TF PrLD，作为 LacI-EYFP 或 mCherry 融合，质粒使用密码子优化序列构建，用于在 E 中表达。大肠杆菌。Efg1-PrLD-LacI-EYFP质粒（pRB1222）是先前构建的[28]。Flo8-PrLD-LacI-EYFP 质粒 （pRB1262） 通过使用寡核苷酸 8/960 扩增 pRB5680 的 FLO5681 PrLD 来构建。将所得插入片段酶解并用 BsrGI/BspEI 克隆到 pRB1208 中。Brg1-PrLD-LacI-EYFP （pRB1595） 构建体是通过三个片段的融合 PCR 创建的：（1） Brg1 的 N 端 PrLD 用寡核苷酸 832/6502 从 pRB6503 扩增;（2）用寡核苷酸1208/6518从pRB6519扩增EYFP;（3）Brg1的C端PrLD从pRB832中扩增，寡核苷酸为6504/6505。用寡核苷酸 6502/6505 进行 SOE PCR。用 SpeI/BspEI 消化片段，并用 NheI/BspEI 克隆到 pRB1208 中（SpeI 和 NheI 产出相容的粘性末端用于连接反应）。Bcr1-PrLD-LacI-EYFP 质粒 （pRB1597） 是通过三向融合 PCR 产生的：（1） 用寡核苷酸 1/841 从 pRB6510 扩增 Bcr6511 N 端 PrLD;（2）用寡核苷酸1208/6518从pRB6519扩增EYFP;（3） 用寡核苷酸 1/841 从 pRB6512 扩增 Bcr6513 C 端 PrLD。用寡核苷酸 6510/6513 进行 SOE PCR 得到融合产物，用 NheI/BspEI 消化并克隆到 pRB1208 中。
Efg1 YF-to-S PrLD-LacI-EYFP 质粒 （pRB2046） 由 GGA 和 pSFS2a 使用以下方法创建：（1） Efg1 YF-to-S N PrLD 扩增自 pRB1789 寡核苷酸 7897/7898;（2）寡核苷酸1222/7899从pRB7825扩增的EYFP;（3） 用寡核苷酸 1/1789 从 pRB7826 扩增的 Efg7900 YF-to-S C PrLD。片段由GGA与BsaI-HFv2组装。通过PCR用寡核苷酸8030/8031扩增盒，用BspEI和NheI-HF消化并克隆到pRB1208中。Brg1 YF-to-S PrLD-LacI-EYFP 质粒 （pRB2045） 由 GGA 和 pSFS2a 使用以下方法创建：（1） Brg1 YF-to-S N PrLD 扩增自 pRB1785 寡核苷酸 7746/7747;（2）寡核苷酸1222/7744从pRB7745扩增的EYFP;（3） Brg1 YF-to-S C PrLD 从 pRB1785 扩增，寡核苷酸 7806/7807。片段由GGA与BsaI-HFv2组装。通过PCR用寡核苷酸8028/8029扩增盒，用AgeI和BspEI消化并克隆到pRB1208中。
Efg1-PrLD-mCherry质粒（pRB1224）的构建方式如上所述[28]。Flo8-PrLD-mCherry 质粒 （pRB1264） 是通过使用寡核苷酸 8/960 对 pRB5680 的 Flo5682 PrLD 进行 PCR 扩增而产生的。将所得产物与 BsrGI/BspEI 克隆到 pRB1207 中。
白色念珠菌菌株结构
含有 WT EFG1 的质粒或具有 PrLD 缺失的质粒用独特的 HpaI 位点消化以靶向内源性 EFG1 位点，并使用醋酸锂/PEG/热休克法转化。将质粒整合到 efg1Δ/Δ 菌株 （CAY3009） 中以产生菌株：Efg1 WT （CAY9725）;Efg1 ΔN PrLD （CAY9728）;Efg1 ΔN PrLD （CAY9730）;Efg1 ΔNC PrLD （CAY9732）;和 Efg1-Taf15 （CAY13647）。通过PCR与寡核苷酸1840/2933确认构建体的整合。用 ApaI/SacI 消化 Efg1 PrLD 氨基酸突变质粒并整合到内源性 EFG1 位点中。将质粒整合到 efg1Δ/Δ 菌株 （CAY3009） 中以产生菌株：Efg1 YF-to-S PrLD （CAY11947）;Efg1 ΔpolyQ PrLD （CAY11949）;和 Efg1 polyQG （CAY11948）。携带WT EFG1（CAY12633）或YF-to-S突变体（CAY14163）的第二个等位基因的菌株是通过从各自的单个加回菌株（CAY1和CAY9725）中回收SAT11947盒并将质粒整合到第二个等位基因上来创建的。通过PCR检查菌株，寡核苷酸为1838/4438（5'结）和4439/6458（3'结）。
WT Brg1质粒、所有Brg1 PrLD缺失质粒和所有Brg1 PrLD氨基酸突变质粒用KpnI/SacI酶切并整合到内源性BRG1位点中。将质粒整合到 brg1Δ/Δ 菌株 （CAY3004） 中以产生菌株：Brg1 WT （CAY11942）;Brg1 ΔN PrLD （CAY11943）;Brg1 ΔC PrLD （CAY11944）;Brg1 ΔNC PrLD （CAY11945）;Brg1 YF-to-S PrLD （CAY12228）;Brg1 ΔpolyQ PrLD （CAY12222）;和 Brg1 polyQG （CAY12225）。使用寡核苷酸 6429/4438 和 4439/6430 进行连接检查。
WT Bcr1互补质粒、所有Bcr1 PrLD缺失质粒和所有Bcr1 PrLD氨基酸突变质粒用KpnI/SacI酶切并整合到内源性BCR1位点中。将质粒整合到 bcr1Δ/Δ 菌株 （CAY3008） 中以产生菌株：Bcr1 WT （CAY12231）;Bcr1 ΔN PrLD （CAY12234）;Bcr1 ΔC PrLD （CAY12237）;Bcr1 ΔNC PrLD （CAY12240）;Bcr1 YF-to-S PrLD （CAY12394）;Bcr1 ΔpolyQ PrLD （CAY12398）;和 Bcr1 polyQG （CAY12402）。使用寡核苷酸 6431/6092 和 4439/6432 进行连接检查。
WT Flo8 质粒、Flo8 PrLD 缺失质粒和所有 Flo8 PrLD 氨基酸突变质粒用 ApaI/SacI 消化并整合到内源性 FLO8 位点中。将质粒整合到 flo8Δ/Δ 菌株 （CAY9742） 中以产生菌株：Flo8 WT 加回 （CAY12701）;Flo8 ΔN PrLD （CAY12462）;Flo8 YF-to-S PrLD （CAY12697）;Flo8 δpolyQ PrLD （CAY12699）;Flo8 polyQG（CAY12700）;和 Flo8-Taf15 （CAY14266）。通过PCR检查寡核苷酸6425/4438和4439/6426的正确整合。
对于 mNeonGreen 标记的菌株，mNeonGreen with 从 pRB895 中扩增，并带有相应 TF 的寡核苷酸，以产生同源臂，用于在 ORF 的 C 末端整合：Efg1、4446/3685（Efg8314 ΔC 为 3685/1）;Brg1， 8312/8313 （Brg8315 ΔC 为 8313/1）;Flo8,4994/4995;Bcr1,8310/8311。对 Efg1 与寡核苷酸 4478/4438、Flo8 与寡核苷酸 5032/4438、Brg1 与寡核苷酸 8339/4438 和 Bcr1 与寡核苷酸 6854/4438 进行 PCR 检测。
如前所述，在用于生物膜和成丝测定之前，使用FLP介导的切除术从所有菌株中切除SAT1盒[80]。
生物膜检测
C的干重测量。如前所述，对白色念珠菌生物膜进行了检测[46]。简而言之，将尺寸为 1.5 cm x 1.5 cm 的预称重无菌硅胶方块 （Bentec） 与胎牛血清在 37 孔塑料板中振荡孵育过夜。用PBS洗涤处理过的方块，并置于新的12孔培养皿中，每孔12ml Spider培养基。将白色念珠菌菌株在YPD培养基和2 x 27将细胞添加到每个孔中。然后将板在 37°C 下孵育并振荡 90 分钟，使细胞粘附在硅胶方块上。用PBS洗涤方块，放入装有新Spider培养基的新鲜平板中，并在48°C下振荡继续孵育37小时。取出硅胶方块，干燥过夜，然后称重。从最终质量中减去每个方块的原始质量，以确定生物膜干重。控件 C。这些测定中使用的白色念珠菌菌株是指未整合质粒的 TF 缺失亲本菌株（Efg3010、Brg1 和 Bcr1 的菌株CAY1;CAY9746 用于 Flo8）。
成丝测定
将白色念珠菌菌株在 30°C 的 YPD 培养基中生长过夜。 然后将过夜培养物在新鲜蜘蛛培养基中以 1：30 稀释，并在 6°C 下生长 37 小时以诱导菌丝细胞形成。收集细胞，重悬于PBS中，并立即成像。使用蔡司 Axio Observer Z1 倒置显微镜在 40 倍放大倍率下使用 DIC 成像采集图像。显微镜配备了AxioVision软件（v.4.8）和Zen软件（v.3.0蓝色版）。在不同视野下测试的每个酵母菌株至少拍摄 10 张图像，并且每个菌株至少重复实验两次。在FIJI（ImageJ v.1.52p）中，从每个实验每个菌株（总共5个细胞）的200个独立图像中进行成像后处理和细胞计数，并分类为酵母菌、假菌丝或菌丝。
酵母细胞成像和荧光定量
将白色念珠菌mNeonGreen标记的突变菌株在22°C的SCD（合成完全葡萄糖）培养基中生长过夜。 将过夜培养物制成湿片载玻片，并在蔡司 Axio Observer Z1 倒置荧光显微镜上成像，以 ×63 倍放大倍率和 1.6 倍 OptoVar 进行荧光和 DIC 成像。显微镜配备了AxioVision软件（v.4.8）和Zen软件（v.3.0蓝色版）。在斐济进行成像后处理（ImageJ v.1.52p）。
为了量化TF表达，在FIJI的荧光标记细胞核周围绘制了一个周长，并分析了平均荧光强度。通过在细胞质的一部分中绘制相同大小的周长并从核荧光强度中减去来校正背景荧光。
蛋白质印迹
将 mNeonGreen 标记的 TF 突变体在 30°C 的 YPD 中生长过夜，稀释至 0.25 OD600在 3 mL YPD 中，并在 30°C 下孵育 5 小时以达到对数中期。通过在含有蛋白酶抑制剂 （Thermo Fisher） 的 RIPA 缓冲液中打动微珠从对数中期培养物中分离蛋白质裂解物，并使用 DC 蛋白测定法 （BioRad） 进行定量。将 50 μg 蛋白质上样到 4–15% 10 孔 Mini-PROTEAN TGX 无染色凝胶 （BioRad） 上，其中一块作为蛋白质上样对照，另一块用于转移到 PVDF （Millipore） 后进行印迹。一抗抗mNeonGreen （32F6， ChromoTek， 1：1000） 用于 mNeonGreen 检测。二抗山羊抗小鼠 IgG （H+L）-HRP 偶联物 （Jackson Immunoresearch， 1：10000） 之后是增强的 pico PLUS 化学发光 （Thermo Fisher）。结果通过两个独立实验得到证实。使用FIJI（ImageJ v.1.52p）对蛋白质印迹进行定量。
RNA测序分析
将白色念珠菌菌株在 30°C 的 YPD 培养基中生长过夜。 将过夜培养物在新鲜蜘蛛培养基中以 1：30 稀释，并在 6°C 下生长 37 小时。 使用 MasterPure 酵母 RNA 纯化试剂盒（LGC Biosearch Technologies）和 DNAse I 处理从细胞中纯化 RNA。使用NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina with NEBNext Poly（A） mRNA Magnetic Isolation Module （NEB）分离PolyA RNA，并用于使用NEBNext Multiplex Oligos for Illumina （Index Primers Set 1） （NEB）创建多重文库。在NovaSeq 6000上对样本进行合并和测序。
为了测量基因表达，对reads进行修剪并与C对齐。白色SC5314 A21参考基因组，并使用STAR（版本21.2.7a）分配给单个A11基因组特征[85]。使用HTSeq 2.0（2.0.4版）[86]量化计数，作为每百万个转录本。使用 DESeq2 鉴定差异表达基因，padj < 0.05 和 log2foldchange > 2（Bioconductor 3.17版）[87]。原始和处理后的测序数据已提交给 NCBI 基因表达综合 （GEO;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库，登录号GSE245897。
哺乳动物细胞培养、活细胞成像和 LacO 阵列分析
人U2OS LacO细胞系是Tjian实验室的礼物，之前已有报道[35,47]。将细胞培养在补充有 10% 胎牛血清 （Thermo Fisher Scientific） 和 1% 青霉素-链霉素 （Thermo Fisher Scientific） 的低葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM， Thermo Fisher Scientific） 中，并维持在 37°C 和 5% CO2.将细胞接种到带有玻璃底的 24 孔板 （Cellvis） 中，用于活细胞成像实验。根据制造商的说明，使用 Lipofectamine 3000 （Thermo Fisher Scientific） 将适当的质粒构建体转染到每个孔中。转染后细胞生长过夜，培养基改为新鲜DMEM，并使用蔡司Axio Observer Z1倒置荧光显微镜在×40放大倍率下进行荧光（EYFP和mCherry）和DIC成像。显微镜配备了AxioVision软件（v.4.8）和Zen软件（v.3.0蓝色版）。在斐济进行成像后处理（ImageJ v.1.52p）。
为了量化不同生物膜PrLD LacI-EYFP构建体结合的LacO阵列斑点，在FIJI的阵列周围绘制了一个周界，并分析了斑点的荧光强度和面积。通过减去细胞核中阵列斑点外的荧光信号来校正背景荧光强度。如前所述，确定了与PrLD-LacI-EYFP构建体结合的LacO阵列上mCherry信号的定量[35]。简而言之，阵列斑点位于EYFP通道中，然后测量mCherry信号，以获得阵列上的最大荧光强度（I峰).在mCherry通道中测量了半径~2 μm内与阵列相邻的两个位置，并平均了它们的荧光强度（I外围）表示细胞核中的背景荧光。计算LacO阵列的mCherry-PrLD富集为峰值信号除以背景信号（I峰/我外围).
己二醇处理U2OS核凝聚物
用 PrLD LacI-EYFP 构建体转染的 U2OS LacO 细胞用 1,6-己二醇 （Sigma-Aldrich） 或 2,5-己二醇 （Thermo Fisher Scientific） 处理。化合物在预热的DMEM中以20%的质量体积浓度制备。从在 2 孔玻璃底培养皿中生长的 U24OS LacO 细胞中取出培养基，并用 1 ml 新鲜 DMEM 代替，以便加入 1 ml 己二醇培养基产生 10% 1,6- 或 2,5-己二醇的终浓度。在己二醇处理前和处理后5分钟直接对细胞进行成像，每10秒使用蔡司Axio Observer Z1显微镜以×40放大倍率进行荧光（EYFP）和DIC成像。时间点 t = 0 s 对应于己二醇添加前的细胞，t = 300 s 对应于己二醇处理 5 分钟后的细胞。与阵列斑点无关的冷凝物通过在FIJI中计数进行定量（ImageJ v.1.52p）。
蛋白纯化
将 6xHis-MBP-TEV 蛋白酶位点表达载体中的蛋白构建体转化到 BL21 （DE3） Star E 中。大肠杆菌细胞。细胞在 37°C 下在 Luria 肉汤 （LB） 培养基中生长过夜，第二天在新鲜 LB 中以 1：100 稀释，在 37°C 下生长至外径6000.5–0.7，并用 1 mM 异丙基 β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷诱导。MBP-Efg1 在 25°C 下诱导过夜。MBP-Flo8，MBP-GFP-CTD（26个七重复序列加上C的12个残基C末端序列。白色Rpo21 CTD、ORF 碱基 4605–5187） 和 MBP-GFP 在 30°C 下诱导 4 小时。然后用溶菌酶裂解细胞，并在由 10 mM Tris（pH 7.4、1 M NaCl、1 mM 苯甲基磺酰氟）和蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Scientific Pierce 蛋白酶抑制剂）组成的裂解缓冲液中超声处理。所得蛋白质通过镍亲和柱层析纯化，然后在 Sephacryl S300 26/60 色谱柱 （GE Healthcare） 上进行体积排阻柱层析。收集蛋白质组分并将其浓缩在Amicon Ultra 50K浓缩仪（Millipore）中，然后在液氮中冷冻并储存在-80°C下，直至用于相分离测定。
相分离分析
将蛋白质在 22°C 下解冻并稀释到 10 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl 缓冲液中。将蛋白质浓缩在Amicon Ultra 0.5ml离心过滤装置（Millipore）中至100μl的体积，并使用Nanodrop 2000c（Thermo Fisher Scientific）测定浓度。将蛋白质在含有 10 mM NaCl 的 150 mM Tris-HCl 缓冲液中进一步稀释至每次测定的适当浓度。将与TEV的反应建立为10μl总体积（9.5μl蛋白质与0.5μl0.3mg / mlTEV），并在30°C下孵育22分钟。 其中，5%PEG-8000作为分子拥挤剂被包括在内。对于gDNA相分离测定，将SC5314 gDNA稀释在与蛋白质相同的缓冲液中，并在TEV处理前以50nM的浓度加入。孵育后，立即在 10 孔室载玻片 （Polysciences） 中对蛋白质进行成像，每孔 2.5 μl 蛋白质溶液密封在玻璃盖玻片下。使用蔡司 Axio Observer Z1 倒置荧光显微镜采集图像，以 63 倍放大倍率进行荧光和 DIC 成像。在斐济进行成像后处理（ImageJ v.1.52p）。
将 RNA Pol II GFP-CTD 分配到 Efg1 和 Flo8 液滴中
将GFP-CTD融合蛋白浓缩在10 mM Tris-HCl（pH 7.4）150 mM NaCl缓冲液中，然后用10 mM NaCl和150%PEG-5稀释8000 mM Tris-HCl缓冲液至15 μM。如上所述，将 Efg1 和 Flo8 浓缩并稀释，向蛋白质缓冲液中加入 5% PEG-8000。Efg1 和 Flo8 以 15 μM 存在，GFP-CTD 蛋白（或单独作为对照）以 1：10 稀释度加入，终浓度为 1.5 μM。将蛋白质在 22°C 下以 30 μl 体积与 TEV 一起孵育 10 分钟，并在腔室载玻片中成像。使用蔡司Axio Observer Z1倒置荧光显微镜采集图像。FIJI（ImageJ v.1.52p）用于计算荧光信号。为了计算GFP富集率，在减去背景荧光信号后，将每个Efg1或Flo8冷凝物内每单位面积的平均荧光强度信号除以冷凝物外的平均荧光强度信号。计算没有GFP-CTD的Efg1或Flo8凝聚物图像的背景信号。
小鼠感染和组织切片成像
为了分析胃肠道定植，使用菌株 CAY12633/CAY14163 评估 EFG1（WT 和 YF-to-S 突变体），使用菌株 CAY11942/CAY12228 评估 BRG1（WT 和 YF-to-S 突变体）。我们注意到，EFG1菌株在efg1Δ/Δ突变体上添加了两个拷贝，因为携带一个EFG1拷贝的菌株可以通过重组迅速失去该拷贝[81]。
将酵母菌株在 30°C 下在 3 ml YPD 培养基中生长过夜。第二天，将500μl过夜培养物加入9.5ml YPD中并生长4小时。将细胞沉淀，用H洗涤2O，并重悬于1ml H2O.通过血细胞计数器计数细胞和2 x 10的接种物8对每种菌株进行细胞/mL。BALB / c小鼠（每株2只小鼠）接种500μl制备的酵母稀释液。给小鼠喂食标准食物和抗生素处理的水（2mg / mL链霉素，1.5mg / mL青霉素，2.5%葡萄糖）。让酵母菌株定植 7 天，然后处理结肠进行成像。
将组织切片浸入甲基卡恩中 24 小时，用 70% 乙醇洗涤两次并包埋在石蜡块中。将组织切片在二甲苯和随后的乙醇洗涤中再水化，然后在室温下在封闭缓冲液（PBS中的1%马血清）中孵育30分钟。将 1：500 稀释的抗白色念珠菌抗体 （Fitzgerald Industries International） 加入组织切片中，并在 4°C 下孵育过夜。 将组织切片在 22°C 下洗涤并染色 1 小时，在 PBS 中以 1：250 稀释的 WGA1 和 UEA1 与罗丹明 （Vector Laboratories） 偶联，并在 PBS 中以 1：500 稀释的 DAPI （Thermo Fisher Scientific）。孵育后，用PBS冲洗组织，并用抗褪色封固剂（Thermo Fisher Scientific）封片在载玻片上。使用蔡司 Axio Observer Z40 倒置荧光显微镜以 1 倍放大倍率对载玻片进行成像。对每只小鼠至少 3 个组织切片中的每种酵母菌株进行细胞计数，每个菌株至少计数 300 个细胞。在斐济（ImageJ v.1.52p）中进行了图像后处理。
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9 个生物膜网络 TF 中有 7 个含有 PrLD。
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S1 图。 <> 个生物膜网络 TF 中有 <> 个含有 PrLD。
使用PLAAC算法分析每个生物膜TF以鉴定PrLDs。
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S2 图。 TF PrLD突变体显示出相似的核定位和强度。
（A） 用mNeonGreen对WT和突变TF进行C端标记，并通过显微镜观察。比例尺;10微米。（B） 通过从细胞核内直径为 5 像素的圆的强度中减去细胞核外直径为 5 像素的圆的强度，用 FIJI 量化平均荧光强度。对每种菌株的 15 个不同细胞进行定量。所有统计检验均使用普通单因素方差分析与Dunnett多重比较检验进行，其中将每个突变菌株的平均值与对照的平均值进行比较。误差线显示 S.E.M. *P < 0.05;P < 0.0001;ns = 不显著。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011833.s002
（TIF）
S3 图。 Bcr1 TF PrLD突变体在C中的表达分析。白色念珠菌。
（A） Bcr1 PrLD突变体的代表性蛋白质印迹。突变菌株的过夜培养物在 30°C 下生长至对数中期，在 YPD 中生长 5 小时。用抗mNeonGreen抗体进行蛋白质印迹分析蛋白裂解物，检测Bcr1-mNeonGreen表达。（B） Bcr1 PrLD 突变体的代表性蛋白上样对照，用于校正 Bcr1 定量中的表达。（C） Bcr1 PrLD 突变体的定量，显示为 Bcr1 突变体表达与蛋白上样对照的比率。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011833.s003
（TIF）
S1 附录。 差异表达基因> Efg4 和 Brg1 的 WT 和 YF-to-S 突变体之间变化 1 倍。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011833.s004
（XLSX）
S2 附录。 Efg1 和 Brg1 的 WT 和 YF-to-S 突变体的标准化基因计数。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011833.s005
（XLSX）
S3 附录。 本研究中使用的质粒、寡核苷酸和菌株。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011833.s006
（XLSX）
确认
我们感谢Joachim Morschhauser（维尔茨堡大学）、Aaron Hernday（加州大学默塞德分校）、Steven Sandler（马萨诸塞大学阿默斯特分校）和Nicolas Fawzi（布朗大学）的质粒。我们还要感谢 Clarissa Nobile（加州大学默塞德分校）和 Deb Hogan（达特茅斯学院）的菌株，以及 Robert Tjian（加州大学伯克利分校）的 U2OS 细胞。
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