厦门论文发表-刚地弓形虫琥珀酸脱氢酶复合物的功能和生化特征
抽象
线粒体电子传递链 （mETC） 是一系列膜嵌入的酶复合物，对能量转换和线粒体代谢至关重要。在通常研究的真核生物（包括人类和动物）中，复合物 II，也称为琥珀酸脱氢酶 （SDH），是一种必需的四亚基酶，通过从 TCA 循环中收集电子作为 mETC 的入口点。Apicomplexa是致病性寄生虫，对人类和动物健康有重大影响。该门包括弓形虫，可导致免疫功能低下人群的致命感染。大多数顶复合体，包括弓形虫，都依赖它们的mETC生存，但SDH在很大程度上仍未得到充分研究。先前的研究指出，弓形虫复合体具有九个亚基，而人类则为四个亚基。虽然九个中有两个是经过充分研究的SDHA和B的同源物，但其他七个在其他系统的SDH中没有同源物。此外，将 SDH 锚定在膜上并参与底物结合的 SDHC 和 D 在 Apicomplexa 中没有同源物。在这里，我们验证了七个提议的亚基中的五个作为真正的 SDH 组件，并证明了它们对 SDH 组装和活动的重要性。我们进一步发现，所有五个亚基对寄生虫的生长都很重要，并且SDH的破坏会损害线粒体呼吸并导致自发开始分化为缓殖子。最后，我们提供了五个亚基与膜结合的证据，这与它们在膜锚定中的潜在作用一致，并且我们证明了其中一个亚基 SDH10 中的 DY 基序对于复合物的形成和功能至关重要。我们的研究证实了弓形虫SDH与人类相比的不同组成，并开始探索谱系特异性亚基在SDH功能中的作用，为未来的机制研究铺平了道路。
作者摘要
伞形虫，如弓形虫，是人类和动物的寄生虫，可引起具有全球重要性的疾病，例如弓形虫病，对免疫功能低下者可能是致命的。线粒体电子传递链由一系列酶复合物组成，寄生虫需要这些复合物进行能量代谢和产生重要的代谢物。寄生虫与其人类宿主之间的链及其酶的组成是不同的。在这里，我们研究了链的琥珀酸脱氢酶复合物（复合物II），并确认弓形虫酶与人类相比具有不同的亚基，并且它们对其功能至关重要。我们进一步开始解开寄生虫亚基在酶作用机制中的作用。线粒体电子传递链是弓形虫和其他相关病原体（如引起疟疾的寄生虫）的有效药物靶标。我们在这里表明复合物II对寄生虫的生长很重要，并验证了它与人类版本的差异，从而增强了我们对这一关键寄生虫途径的理解。
数字
Fig 6图1表1图2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6图1表1图2
引文： Silva MF、Douglas K、Sandalli S、Maclean AE、Sheiner L （2023） 刚地弓形虫琥珀酸脱氢酶复合物的功能和生化特征。PLoS 病理学 19（12）： e1011867 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867
编辑 器： Michael L. Reese，UTSW：美国德克萨斯大学西南医学中心
收到： 2023年7月12日;接受： 2023年11月27日;发表： 12月 11， 2023
版权所有： ? 2023 Silva et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有数据均在手稿和/或支持信息文件中。
资金： 我们的工作由医学研究委员会 MR/W002221/1 到 LS 和 AM、Wellcome Trust UNS85804 到 LS 和 Wellcome Trust 221681/Z/20/Z 到 AM 的研究资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
线粒体电子传递链 （mETC） 由嵌入线粒体内膜的一系列蛋白质复合物组成，这些复合物将不同线粒体酶收集的电子通过复合物转移到氧气中。mETC活性对细胞存活至关重要，因为它能够或调节基本的代谢途径，如三羧酸（TCA）循环、嘧啶生物合成和线粒体ATP合成。由于其重要性，mETC已在常见的模型真核生物（主要是酵母和哺乳动物）中进行了广泛研究，并在这些系统中详细表征了其复合物的组成和功能[1\u20123]。最近，随着对更广泛的生物体库的研究，复合物的组成及其结构和调控特征的差异逐渐暴露出来[4\u20128]，这凸显了了解mETC在各种真核生物模型中如何起作用的必要性。这些研究的见解将加深我们对包括病原寄生虫在内的不同生物进化的理解。
顶复合体寄生虫是单细胞真核生物，与酵母和哺乳动物所属的真核生物的ophistoconnt分支不同。因此，对顶复合体线粒体生物学的理解为我们对真核生物的了解做出了重要贡献。此外，这些专性细胞内寄生虫是许多具有重大全球影响的人类和动物疾病的罪魁祸首。特别是，恶性疟原虫每年导致数十万人死于人类疟疾，主要发生在低收入国家，而弓形虫则在全球免疫功能低下的患者中造成危及生命的感染。尽管具有寄生生活方式，但具有mETC的顶复合物在其复杂的生命周期中依赖于电子的传输，并且其一些mETC复合物的活性是生存、传播和传输所必需的[9\u201218]。由于这些重要作用，mETC是抗寄生虫药物的靶标，抗疟药阿托伐醌提供了一个典型的例子，该药物靶向复合物III（细胞色素bc1复合物）[19\u201221]。尽管有这种潜力，但顶复合物mETC复合物如何工作的细节仍然大多未知。
最近的研究通过不同的生化和蛋白质组学方法探索了顶复合物mETC复合物的组成[10,13,14,22]。这些研究表明，每个mETC复合物都含有亚基，这些亚基在酵母和哺乳动物中无法明确识别，并且可能不存在。在大小、亚基数和亚基同一性方面差异最大的mETC复合体是复合体II。例如，在 T 中。刚地，我们之前的复合物组分析数据预测复合物II包含9个亚基，并在500 kDa时迁移[13]。这些发现得到了其他顶复合体的研究的支持[22,23]，这些研究共同指出，一种复合物比哺乳动物和酵母中甚至线粒体细菌祖先中可见的~130 kDa和4个亚基大得多。然而，这些发现尚未得到验证，新的亚基尚未进行功能研究。
复合物 II，也称为琥珀酸脱氢酶 （SDH），催化琥珀酸氧化为富马酸盐，从而从 TCA 循环中收集电子，然后将它们送入 mETC。因此，SDH是mETC和TCA循环之间的主要纽带，因此在线粒体代谢途径之间的协调中起着非常重要的作用[24]。此外，除了一系列脱氢酶外，SDH是电子进入链的首批入口之一。在SDH催化的反应中，从琥珀酸盐中利用的电子通过FAD辅因子和三个铁硫（2Fe-2S）团簇转移，将泛醌还原为泛醇，然后将电子穿梭到配合物III。因此，泛醌结合位点在SDH的整体催化反应中起着关键作用。
在ophistokonts和细菌中，SDH由四个亚基（SDHA-D或SDH1-4）组成，它们共同形成一个复合物，可以大致分为两个主要结构域：基质定位酶核心和膜锚定结构域。在哺乳动物中，SDHA 和 SDHB 构成面向基质的结构域，其中包含琥珀酸盐结合位点、FAD 辅因子（均在 SDHA 内）和三个 2Fe-2S 簇（在 SDHB 内）。SDHC和SDHD形成膜锚定结构域，并含有血红素b假体基团[25]。两个泛醌结合位点是通过来自多个亚基的氨基酸促成的相互作用形成的。一、高亲和力，位点（Qp-proximal）位于内膜的基质侧，由SDHB、C和D的残基以及另一个低亲和力位点（Qd-远端）更靠近膜间隙[25]。在顶复合物中，SDHA和SDHB的同源物很容易通过基于序列的搜索来识别[26,27]。然而，使用同源性搜索无法找到 SDHC 和 SDHD 的明确同源物。因此，人们很容易提出，在复合组研究中发现的假定的新亚基可能会取代SDHC和SDHD的作用。在这里，我们旨在验证 T 的新假定亚基。刚地SDH，研究它们对寄生虫生长和复合物组装和功能的重要性，并阐明它们在复合物中的作用。
结果
定位和原生迁移验证了五个新的弓形虫 SDH 亚基
我们之前的复合组分析研究[13]根据它们与已知亚基SDHB的同源物的共迁移，确定了七个假定的新型SDH亚基（表1：总结了假定的亚基及其建议的名称）。在恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的类似复合组研究中，也发现了这7种蛋白质中5种蛋白的同源物[22]。我们试图验证这些预测。我们推断，所有新的SDH亚基都会在线粒体中发现。先前在弓形虫中进行的同位素标记细胞器蛋白超定位（HyperLOPIT）研究[28]以及线粒体基质蛋白质组[10]的数据支持了7个新亚基中5个的线粒体定位[13]。为了确认这五种蛋白质的线粒体定位并评估另外两种候选物的定位，我们在寄生虫中瞬时表达了七种蛋白质中每一种的异位 Ty 表位标记拷贝。然后，我们进行了免疫荧光测定，共染色了Ty和线粒体标志物TgMys[29]。所有亚基都与线粒体标记物共定位，表明线粒体定位（图1A）。我们进行了超分辨率显微镜检查了假定的SDH15和线粒体外膜蛋白TOM40的定位[30]。信号的叠加为线粒体定位提供支持。（S1A 图）。由于SDH嵌入线粒体内膜，我们预计其亚基将定位于该区室。我们进行了超扩增显微镜检查了假定的 SDH15 和 SDHB 与线粒体外膜蛋白 TOM40 的定位（图 1B）。信号的叠加表明 SDH15 和 SDHB 与 TOM40 位于不同的区室中（S1B 图），分别与线粒体内膜和外线粒体膜的定位一致。
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图 1. 假定的弓形虫 SDH 亚基定位于线粒体，是 ~500 kDa 复合物的一部分，SDH15 与 SDHB 相互作用。
（A） 用 Ty 表位标签（青色）瞬时标记的假定 SDH 亚基的免疫荧光测定分析，显示与线粒体标记蛋白 MYS （TGME49_215430， [29]） （品红色）共定位。比例尺为5μM。（B） 超膨胀显微镜图像显示为 SDHB-HA 和 SDH15-Ty 的 Z 堆栈（左图和中图）和 3D 重建（右图），带有线粒体标记蛋白 TOM40。比例尺为3μM。（C） 来自 Ty 表位标记推定的 SDH 亚基和 SDHB-HA 的总裂解物，用 BN-PAGE 分离，印迹并用抗 Ty 或抗 HA 抗体进行免疫标记。所有样品均在同一凝胶上分离，为清晰起见，不同样品显示了不同的曝光量。S1D中完整的未处理凝胶图。（D） 对从 rSDH15/ SDHB-HA + SDH15-Ty 中提取并用抗 HA 或抗 Ty 抗体偶联微珠免疫沉淀的全细胞裂解物进行免疫印迹分析，以产生总裂解物 （T）、未结合 （UB） 和结合 （B） 馏分。样品通过SDS-PAGE分离，印迹，并使用抗HA和抗Ty抗体标记免疫沉淀蛋白，并使用抗TOM40作为无关线粒体蛋白对照进行检测。（E） SDHB-HA 和 QCR2-HA 免疫沉淀蛋白质组学数据的火山图，显示 -log10 p 值和对数2通过质谱法在四个独立实验中检测到的蛋白质的倍数变化。复合物III亚基用蓝色标记，复合物II亚基用红色标记。灰色虚线表示 p < 0.05）。
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表 1. 推定的 SDH 亚基的详细信息。
表型评分取自[31]。新亚基的名称被赋予前缀SDH，后跟近似分子量，但先前命名的亚基除外*[63]。使用 PRED-TMR [64]、CCTOP [65] 和 TMbed [66] 预测跨膜结构域 （TMD） 以及预测的 TMD 数量进行预测。
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我们进一步推断，任何SDH组分都会在~500 kDa时迁移，就像它们在络合组中所做的那样[13]。为此，我们构建了稳定的品系，其中每种蛋白质的异位Ty表位标记拷贝稳定表达。我们生成了编码五个假定亚基（SDH10、11、15、23 或 31）的基因的 Ty 标记的稳定系，免疫印迹分析证实异位 Ty 标记蛋白在其预测大小下被检测到（S2A 图）。对于每个品系，我们将寄生虫细胞溶解在非离子洗涤剂十二烷基-β-D-麦芽糖苷 （βDDM） 中，并进行蓝色天然 PAGE，然后用抗 Ty 抗体进行免疫印迹。虽然在假定的SDH11的情况下，天然PAGE上的信号不足以通过免疫印迹解析其迁移，但其他四条线显示出~500 kDa的单条带（图1C和S1D），与SDHB-HA对照的迁移一致，如先前所示的SDHB-HA [13]。这些观察结果表明，至少测试的四个亚基作为大分子量复合物的一部分迁移，与它们是SDH亚基一致。
为了提供其中一个新亚基与保守亚基SDHB之间相互作用的直接证据，我们进行了互惠共IP。我们构建了一个系，其中假定的 SDH15 表达为异位 Ty-表位标记的拷贝，在 SDHB 内源性 HA 标记的背景中 [13]。然后，我们使用 HA 琼脂糖微珠进行了 IP。在结合部分中，SDHB-HA和假定的SDH15-Ty均被回收（图1D）。在未结合部分中均未发现，仅在未结合部分中发现不相关的线粒体蛋白 TOM40，从而为 co-IP 特异性提供对照。使用 Ty 磁珠执行倒数 IP 返回相同的结果，在结合部分中回收了 SDHB-HA 和假定的 SDH15-Ty。这些结果表明，SDHB和假定的SDH15相互作用，或具有共同的相互作用伙伴，表明它们都是同一复合体的一部分。最后，为了提供进一步的相互作用证据，我们进行了SDHB-HA和复合物III的QCR2-HA的IP[13]，并将洗脱液送去质谱分析。在四个独立实验中，与QCR2-HA IP相比，我们确定了九个假定亚基中的八个在SDHB-HA IP中富集（图1E，S3A，S3B和S2表， PXD047027）。相反，与 SDHB-HA-IP 相比，我们检测到 QCR2-HA IP 中富集的 6 个复合物 III 亚基。这些数据进一步支持新亚基与保守的复合物II亚基SDHB和SDHA属于同一复合物。
假定的新亚基是SDH稳定性和功能所必需的
线粒体定位和迁移的证据与弓形虫SDH的大小相符，为候选蛋白作为该复合物的一部分提供了支持。因此，我们探索了每种蛋白质对SDH组装和功能的贡献。为此，我们转向生成五个假定成分中的每一个的突变体，SDH10,11,15,23或31。先前的研究表明，弓形虫mETC复合物的成分通常对寄生虫适应性很重要，而复合物III和IV亚基的突变体在标准培养条件下无法生长[10,13,14,16]，这表明SDH亚基也可能对适应性很重要。与这一预期一致，弓形虫全基因组CRISPR对培养物生长的筛选预测，所有5个基因都可能有助于寄生虫适应性[31]。因此，我们选择为它们中的每一个生成条件突变体。使用父 T。刚地系，其中SDHB被内源性HA标记[13]作为背景，通过我们的启动子替换策略（S2B-S2C图）生成五个基因中每个基因的条件敲低系，其中添加脱水四环素（ATc）导致目的基因的下调[32].我们将这些行称为“r（子单位名称）/SDHB-HA”（r 表示可调节）。RT-qPCR证实，在加入ATc两天后，五个基因中的每一个的表达都显着下调（S2D图）。每个细胞系还补充了稳定整合的 Ty 表位标记版本的基因，该基因在组成型启动子的控制下，不受 ATc 调节，作为对照。我们将这些行称为“r（子单位名称）/SDHB-HA–（子单位名称）-Ty”。
使用这些突变体，我们检查了任何新亚基的耗竭是否会影响SDH的稳定性。在不存在或存在 ATc 的情况下培养 rSDH15/SDHB-HA 寄生虫一、二或三天后，我们进行了蓝色天然 PAGE，然后用抗 HA 抗体进行免疫印迹以追踪 SDHB-HA 的迁移，SDHB-HA 可作为完全形成的 SDH 的指标。在第二天观察到~500 kDa的高分子量条带丢失，表明在此时间点没有形成或非常低水平的成熟复合物（图2A）。尽管SDHB-HA仍然可以在变性免疫印迹中检测到，尽管水平降低（图2A）。作为对照，用ATc处理亲本系SDHB-HA三天对SDHB天然迁移没有影响（图2B）。同样，当使用补补品系rSDH15/SDHB-HA–SDH15-Ty进行相同的实验时，SDHB-HA高分子量条带在ATc处理三天后仍然可见（图2C）。这些数据表明，假定的SDH15是SDH稳定性所必需的。敲除这些其他亚基后 SDHB-HA 水平的降低提出了 SDHB 稳定性可能取决于复合物完整性的可能性。为了控制该突变体中的一般线粒体缺陷，进行了蓝色天然 PAGE 和蛋白质输入转位子组分 TOM40 的免疫印迹，以及透明的天然 PAGE，然后进行凝胶内复合物 IV 活性测定。我们发现 TOM 复合物和复合物 IV 都不受假定的 SDH15 耗竭的影响，这表明其耗竭导致 SDH 特异性缺陷（图 2D–2E）。为了支持特定的SDH缺陷，该突变体的线粒体形态也保持不变，这与另一种线粒体突变体不同，该突变体对线粒体形态有已知影响（VDAC耗竭[33]）用作对照（S4图）。对其他4个亚基进行天然迁移实验。在所有病例中，ATc处理第3天亚基的耗竭导致500 kDa SDHB-HA条带消失，而在变性免疫印迹中仍然可见一条条带，并且这种复杂的稳定性缺陷在补体系中被挽救（图2F）。再次作为对照，我们发现TOM复合物和复合物IV都不受四个亚基中任何一个的耗竭的影响（图2G和2H），这表明它们的耗竭导致SDH特异性缺陷。
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图 2. 推定的弓形虫 SDH 亚基对其稳定性很重要。
（A） 通过 BN-PAGE 分离在不存在 （0） 或存在 ATc 1-3 天的情况下生长的 rSDH15/SDHB-HA 寄生虫的总裂解物，并使用抗 HA 抗体进行免疫印迹分析。样品也通过SDS-PAGE分离，并用抗HA和抗TOM40抗体进行免疫标记。（B） 用 BN-PAGE 和 SDS-PAGE 分离在不存在或存在 ATc 三天的情况下生长的 SDHB-HA 总裂解物，并按 （A） 进行免疫标记。（C） 在不存在 （0） 或存在 ATc 三天的情况下生长的 rSDH15/SDHB-HA 寄生虫的总裂解物，以及在存在 ATc 的情况下生长 3 天的 rSDH15/SDHB-HA -SDH15-Ty （cSDH15） 的总裂解物，由 BN-PAGE 和 SDS-PAGE 分离并进行免疫标记，如 （A） 所示。（D） 在不存在 （0） 或存在 ATc 三天的情况下生长的 rSDH15/SDHB-HA 寄生虫的总裂解物通过透明天然 PAGE 分离，并染色以检测复合物 IV 活性。（E） 在不存在 （0） 或存在 ATc 三天的情况下生长的 rSDH15/SDHB-HA 寄生虫的总裂解物，用 BN-PAGE 分离并用抗 TOM40 抗体免疫印迹。（FH） rSDH10、11、23 或 31/SDHB-HA 和补补品系在没有 （0） 或存在 ATc 的情况下生长三天，并由天然 PAGE 隔开，如 A、C 和 D 中所述。
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接下来，我们进行了分光光度法酶促测定，以确定每个新亚基耗尽时SDH的活性。将来自ATc处理和未处理的突变体以及处理过的互补系的裂解物与底物琥珀酸盐和泛醌类似物癸基泛醌（DUB）一起孵育。SDH 的琥珀酸氧化导致 DUB 的还原，进而还原染料 2,6-二氯苯酚吲哚酚 （DCPIP），然后改变颜色，提供 SDH 活性的代理。在五个突变体中的每一个中，用ATc处理三天导致活性降低，并且该缺陷在补系中得救（图3A和S3表）。作为对SDH活性测定特异性的对照，而不是寄生虫代谢的一般缺陷，我们对脱氢酶MQQ进行了活性测定，该测定使用苹果酸作为底物而不是琥珀酸盐。裂解物用苹果酸而不是琥珀酸盐供货，我们观察到每个亚基的耗竭不会像预期的那样影响酶活性（图3B和S3表）。这些观察结果表明，新蛋白质是SDH酶活性所必需的。
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图 3. 假定的 SDH 亚基的耗竭导致 SDH 活性和耗氧量降低。
（A） 亲本、rSDH10、11、15、23 或 31/SDHB-HA 和补辅寄生虫的 SDH 活性，在存在或不存在 ATc 的情况下生长 3 天。图表显示了来自三个独立生物学重复的平均相对SDH活性-/+ S.D.。无 ATc 设置为 100%，并且通过单样本 t 检验比较加 ATc 条件。SDH 活动值位于 S3 表中。（B） 亲本、rSDH10、11、15、23 或 31/SDHB-HA 寄生虫的 MQO 活性，在存在或不存在 ATc 的情况下生长三天。图表显示了来自三个独立实验的平均相对MQO活性-/+ S.D.。无 ATc 设置为 100%，并且通过单样本 t 检验比较加 ATc 条件。S3 表中的 MQO 活动值。（D） 使用海马分析仪对 （i） 基础线粒体耗氧率 （OCR） 进行细胞外通量分析;（ii） SDHB-HA、rSDH15/SDHB-HA 和 rSDH15/SDHB-HA—SDH15-Ty 寄生虫的最大线粒体 OCR 和 （iii） 细胞外酸化率 （ECAR） 在存在或不存在 ATc 的情况下生长 3 天。图表显示了来自三个独立生物学重复的平均值 -/+ S.D.。先进行方差分析，然后进行土耳其的多对比较，并显示相关对的 p 值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.g003
既往对弓形虫mETC的研究发现，mETC复合体中的突变体导致线粒体耗氧率（moochondrial oxygen consumption rate， mOCR）降低，mOCR可作为呼吸活动的替代测量指标[10,14]。作为电子进入mETC的切入点之一，预计SDH破坏将导致呼吸缺陷。我们再次关注假定的SDH15，并使用海马细胞外通量分析仪检查其耗竭对mOCR的影响，使用先前建立的测定方法[10,34]。我们最初测量了在存在或不存在 ATc 的情况下生长的寄生虫的基础 mOCR 三天。我们在亲本系中检测到基底mOCR没有差异，但在耗竭突变体中，我们看到显着减少，并且该缺陷在补补系中得救[图3C（i）]。在测量最大mOCR时也看到了类似的模式[图3C（ii）]，这是在添加原生载体FCCP后完成的，FCCP使耗氧量与ATP合成脱钩。我们同时测量了细胞外酸化率（ECAR）作为一般寄生虫代谢的代表。这在假定的 SDH15 耗竭时不受影响 [图 3C（iii）]），表明观察到的 mOCR 降低是由于 mETC 中的特定缺陷，而不是寄生虫代谢或活力的一般降低。这些数据表明，推定的SDH15对线粒体耗氧量很重要，尽管mOCR降低的幅度不如复合物III和复合物IV突变体明显[10,14]，这可能是由于其他脱氢酶的代偿作用。
综上所述，复杂稳定性和功能的定位、迁移和必要性验证了假定的 SDH10、11、15、23 或 31 是真正的 SDH 亚基。
SDH 对寄生虫适应性很重要，其破坏导致培养物中自发分化为缓殖子
SDH是电子进入mETC的首批入口之一，也是TCA循环和呼吸与ATP合成之间的重要协调。因此，正如上述CRISPR筛选所预测的那样，预计SDH对寄生虫的适应性很重要（表1）。为了验证这一假设，我们进行了斑块测定。我们发现 SDH10、11、15、23 和 31 的耗竭会导致严重的生长缺陷，导致斑块大小大大减小（图 4A 和 4B）。该表型在补色系中获救（图4C），证明了观察到的缺陷的特异性。因此，虽然所有新的亚基都有助于适应性，但它们可能不是绝对必要的，或者敲低可能不够严格，无法完全消融 SDH 活性。为了进一步表征 SDH 对寄生虫生长的重要性，我们对亲本和 rSDH11/SDHB-HA 寄生虫进行了复制测定。我们在存在或不存在 ATc 的情况下培养寄生虫两天，并允许寄生虫侵入 HFF 单层，在相同条件下再生长 24 小时，然后进行免疫荧光测定并评估寄生虫复制。我们量化了每个液泡的寄生虫数量，发现在ATc中生长的rSDH11品系中含有8个或更多寄生虫的液泡数量显着减少（图4D）。在无ATc对照中没有观察到这种表型，我们观察到所分析的液泡中有30%由八个或更多的速殖子组成。这些结果表明，新的SDH亚基有助于寄生虫的生长和复制。
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图 4. 新型弓形虫SDH亚基对寄生虫生长很重要。
（A） 亲本和 rSDH10、11、15、23 或 31/SDHB-HA 寄生虫的斑块测定，在存在或不存在 ATc 的情况下生长 8 天。（B） （A） 进行三个独立实验并每次重复测量 10 个斑块的斑块大小的定量。将每个无 ATc 重复的平均值设置为 100%，并绘制每个加 ATc 重复的平均值。通过单样本 t 检验将每个加 ATc 重复的平均值与无 ATc 进行比较。（C） 补体系的斑块测定，在存在或不存在 ATc 的情况下生长 8 天。（D） 亲本寄生虫和 rSDH11 寄生虫每个液泡寄生虫数量的量化。寄生虫在存在或不存在 ATc 的情况下生长 2 天，然后接种到新鲜的 HFFs 细胞中，并在存在或不存在 ATc 的情况下再生长一天。值是来自三个独立实验的平均值 +/- S.D。>每次重复计数 100 个液泡。先进行方差分析，然后进行土耳其的多对比较，并显示相关对的 p 值。（E） 亲本 cKD-ISU1-HA [35] （rISU1）、rSDH10/SDHB-HA （rSDH10） 和 rSDH10/SDHB-HA—SDH10-Ty （cSDH10） 寄生虫的免疫荧光测定，用 ATc 处理 4 天，用 GAP45（品红色）标记以检测寄生虫和双花白桐凝集素 （DBL）（黄色）以勾勒出新生囊肿壁。比例尺为5μM。（E） 定量在 （D） 所示的 ATC 存在下生长的 rSDH10 和 rISU1 的 DBL 阳性液泡。数据来自三个独立实验;每次重复计数100个液泡。值为平均值 -/+ S.D.，通过学生 t 检验进行比较。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.g004
最近的一项研究表明，线粒体功能受损与弓形虫阶段转换的启动之间存在联系[35]。具有呼吸、翻译和铁硫（Fe-S）簇生物合成等线粒体功能缺陷的突变体表现出不完全分化表型，形成囊状结构，并表达中间缓殖子标志物，但从未进展为成熟的缓殖子。为了检查在 SDH 破坏时是否也观察到类似的表型，我们分析了 SDH10 耗尽后培养物中发育迟小子的自发分化。通过免疫荧光测定法鉴定已开始分化的寄生虫，其中通过用双花多利库菌凝集素 （DBL） 染色来鉴定囊肿样结构，DBL 可识别新生囊肿壁中的糖蛋白。我们发现，在ATc存在下生长4天的SDH10突变体中，11%的液泡呈DBL阳性，这表明该突变体触发了阶段转换（图4E）。在互补系中未观察到DBL阳性液泡，在ATc中生长的亲本品系中只有不到1%的液泡为DBL阳性（S4表）。当我们生长在线粒体Fe-S生物发生中的突变体rISU1时，我们还看到了DBL阳性液泡，先前显示显示部分阶段转换[35]。DBL阳性液泡数量的定量显示rISU系中的液泡数量较高（55%对11%）（图4F和S4表），表明部分转化表型在SDH突变体中不太明显。我们的突变体中DBL阳性液泡的百分比也不如其他具有线粒体功能缺陷的突变体所见，例如复合物III亚基耗尽的寄生虫（30%）或线粒体亚基耗尽的寄生虫[35]，尽管它们是在两天的时间点测量的，然而，与之前的研究不同，在用ATc治疗的亲本品系中检测到5%的DBL阳性液泡，我们检测到不到1%（S4表），表明我们手上的灵敏度较低，这可能是一些观察到的差异的原因。
新亚基是将SDH锚定在膜中所需的完整膜蛋白
SDH10、11、15、23 和 31 对 SDH 的形成和功能至关重要，以及它们对寄生虫适应性的重要性，这一发现提出了它们在复合体中的作用问题。在植物拟南芥中，线粒体SDH也由四个以上的亚基（8个）组成，并且有人提出非催化亚基在膜中锚定复合物中发挥作用[36]。同样，纤毛虫嗜热四膜虫中的SDH包括15个亚基，结构研究表明，非催化亚基介导膜锚定[5]。因此，我们假设这里确定的亚基也是如此。为了验证这一假设，我们首先使用AlphaFold [37,38]进行了结构预测，我们模拟了弓形虫SDHA和SDHB同源物以及SDH10、11、15、23和31，并使用ChimeraX上的匹配工具将它们叠加到实验确定的真核生物SDH结构上[39]（禽SDH—PDB：2H88 [40]).正如预期的那样，SDHA和SDHB的折叠主要是保守的，尽管与鸟类结构相比，SDHB可能具有额外的突起（图5A-5C和S5）。此外，根据我们的假设，以及其他系统中提出的建议，这七个新组分形成了一个大小合适的结构域，并且处于介导膜锚定的正确位置，其中 11 个长螺旋垂直于 SDHA 和 SDHB 排列，并且每个新亚基都为可能与膜接触的区域贡献一些氨基酸（图 5C）).我们还使用各种预测算法评估了这些含有跨膜结构域的新SDH蛋白的可能性（表1）。除SDH31外，所有预测都包含跨膜结构域，但是预测工具之间存在很大程度的差异。
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图 5. 新型弓形虫 SDH 亚基是完整的膜蛋白。
（A） 典型SDH示意图，基质朝向SDHA和SDHB亚基为浅蓝色和红色，整体膜SDHC和SDHD亚基为橙色和粉红色。（B） 禽SDH晶体结构图，（PDB：2H88 [40]），颜色编码如A所示。（C） 弓形虫 SDH 的空间填充和带状同源模型，使用 alphafold 和匹配器生成。SDHA（蓝色）和SDHB（红色）与规范结构相似，新的亚基被放置在膜区域。（D） 用 1% Triton X-100 （TX-100） 或碳酸钠 （Na2一氧化碳3）在pH 11.5下，通过离心分离，得到上清液（S）和沉淀（P）馏分。还分析了治疗前的总分数 （T）。SDH15-Ty 存在于 Na 的颗粒部分中2一氧化碳3，如完整的外膜蛋白 TOM40，而 SDHB-HA 存在于可溶性上清液部分，如 ATP 合酶的基质亚基 ATPβ。（E） 对用碳酸钠从表达 SDHB-HA 和 SDH10/11/23 或 SDH31-Ty 的细胞中提取的全细胞裂解物进行免疫印迹分析。TOM40 和 ATP β分别用作沉淀和上清液部分的标记蛋白。（F） SDH10/11/23 或 SDH31-Ty 的 1% Triton X-100 （TX-100） 提取和免疫印迹分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.g005
为了支持新确认的亚基的膜锚定作用，我们进行了碳酸钠提取，可以区分外周膜蛋白和整合膜蛋白[30]。碳酸钠萃取将样品分离成含有完整膜蛋白的沉淀部分和含有可溶性和外周结合膜蛋白的可溶性部分。我们最初在表达 Ty 标记版本的 SDH15 的行上进行提取，在表达 HA 标记的 SDHB 的行中。正如预期的那样，SDHB是其他系统和我们预测结构中的外周相关蛋白，与外周相关膜蛋白ATPβ一起作为对照（图5D）。在膜组分中检测到SDH15，以及用作对照的整合膜蛋白TOM40（图5D）。样品还用去污剂Triton X-100进行提取，以测试蛋白质本身不是不溶的。正如预期的那样，在可溶性馏分中检测到SDH15-Ty。当在SDHB-HA背景中用表达Ty标记的亚基SDH10、11、23和31的品系重复这些实验时，也获得了类似的结果（图5E和5F）。该数据表明，五个新的SDH亚基是完整的膜蛋白，这与将酶结构域锚定到膜中的作用一致。
SDH10 的 DY 基序是 SDH 功能和形成所必需的
在常用的酵母和哺乳动物系统中，SDH的膜锚定结构域包含泛醌的结合位点。我们推断，新的亚基将取代这一关键功能。然而，我们的结构预测没有揭示出可识别的结合位点，并且每个新组分与来自不同生物体的 SDHC 和 SDHD 同源物的比对未能识别保守基序（S6 图）。因此，我们选择专注于在五个亚基中每个亚基的myzozoan同源物中严格保守的基序。对 SDH11、15、23 和 31 的真菌同源物进行的序列比对没有鉴定出在给定亚基的所有同源物中都是保守的氨基酸，并且对于这些氨基酸，它们在其他生物体的 SDH 中具有重要作用（S7 图）。然而，myzozoan SDH10同源物的比对揭示了一个保守的DY基序（图6A），在之前的一项研究中，恶性疟原虫同源物PF3D7_1448900也强调了该基序的存在[22]。在酵母SDH的突变分析中，SDHD的DY基序被证明有助于泛醌结合位点之一，其中酪氨酸（Y）在Qp位点与泛醌形成氢键[41,42]，因此我们假设它可能在SDH10中发挥类似的作用。为了验证这一假设，我们检查了 DY 基序突变对 SDH 活性的影响，通过将 rSDH10/SDHB-HA 与编码突变形式的 SDH10-Ty 的微型基因互补，其中 DY 基序突变为 AA。首先，我们对在存在或不存在 ATc 的情况下生长的寄生虫的新品系进行了免疫印迹分析，并显示 SDH10型号：DY>AA检测到 -Ty 蛋白（图 6B）。值得注意的是，SDH10 的蛋白质水平型号：DY>AA-Ty 在加入 ATc 后增加，表明可能对亚基丰度进行翻译后调节。接下来，我们确认 SDH10DY/AA型-Ty 仍定位于线粒体（图 6C）。总之，这些数据表明蛋白质可能没有错误折叠或降解。接下来，我们进行了 SDH 酶促测定，该细胞系补充了突变亚基 rSDH10/SDHB-HA–SDH10DY/AA型-泰。与SDH10互补DY/AA型-Ty 在 ATc 治疗后无法恢复 SDH 活性（图 6D）。这些观察结果表明，DY基序是SDH10功能所必需的。最后，我们测试了DY到AA突变对复合物形成的影响。Native-PAGE和免疫印迹分析显示，SDHB-HA的高分子量条带在SDH10补辅酶系中减少DY/AA型-ATc处理第三天的Ty（图6E），类似于SDH10耗尽时看到的情况。这一观察结果表明，活性的降低伴随着复合物形成的减少，为SDH10在酵母中取代SDHD的作用提供了支持。
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图 6. SDH10 的 DY 基序对 SDH 的形成和活性至关重要。
（A） 来自myzozoa的SDH10同源物的比对，具有保守区域和DY基序。Tg弓形虫;Tp， 小蒲公英;Et， Eimeria tenella;Bb， 牛巴贝虫;PF， 恶性疟原虫;Pb， 白鲷（Plamodium baeghei）;下午，Perkinsus marinus。（B） rSDH10/ SDHB-HA—SDH10-DY>AA-Ty （cSDH10型号：DY>AA） 在不存在 （0） 或存在 ATc 的情况下生长 3 天，通过 SDS-PAGE 分离，并使用抗 Ty、抗 HA 和抗 TOM40 抗体进行免疫印迹分析。（C） rSDH10/SDHB-HA—SDH10-DY>AA-Ty （cSDH10型号：DY>AA）在存在或不存在 ATc 的情况下生长 3 天，并用 Ty 和线粒体标记蛋白 MYS 的抗体标记。比例尺为5μM。（D） rSDH10/ SDHB-HA—SDH10-DY>AA-TY （cSDH10 DY>AA） 的 SDH 活性在不存在 （0） 或存在 ATc 的情况下生长 3 天。图表显示了来自 3 个独立实验的平均 SDH 活性 -/+ S.D.。无和加 ATc 条件通过学生 t 检验进行比较。（E） rSDH10/ SDHB-HA、rSDH10/ SDHB-HA—SDH10-Ty （cSDH10WT型）和rSDH10/ SDHB-HA—SDH10-DY>AA-Ty （cSDH10型号：DY>AA）在没有 （0） 或存在 ATc 的情况下生长三天，通过 BN-PAGE 分离并用抗 HA 抗体进行免疫印迹分析。样品也通过SDS-PAGE分离，并用抗HA和抗TOM40抗体进行免疫标记。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.g006
讨论
SDH 是线粒体代谢网络中的重要参与者，是 mETC 和 TCA 循环共享的唯一酶。许多结构研究（例如[25,40,43,44]）表明，SDH在真菌和动物（opisthokonts）以及细菌中的整体结构和四个亚基组成具有显著的保守性，这最初表明了一种普遍保守的酶[45]。然而，对越来越多的生物体的研究，如胚胎植物（陆地植物）、锥虫（原生动物寄生虫）和纤毛虫（纤毛原生生物）揭示了不同成分的SDH复合物。在opisthokonts和细菌之外的许多情况下，已经描述了包含四个以上亚基的超分子复合物。与这些发现一致，先前的研究表明，顶复合体SDH由多达9个亚基组成，其中包括催化性SDHA和B的直系同源性亚基，以及多达7个非催化亚基，这些亚基在Myzozoan分支以外的生物体中未发现同源物[13,22]。我们在这里的工作验证了弓形虫SDH10、11、15、23和31中的七个中的五个。我们进一步证明，每个亚基对于复杂的形成和功能都很重要，因此对于寄生虫的适应性也很重要。这些发现将弓形虫添加到具有超分子SDH的不断增长的生物库中。
在不同系统中发现的发散性非催化亚基的作用是什么？鉴于两个催化亚基的普遍守恒，一种直观的可能性是，任何其他亚基都有助于形成负责膜锚定和泛醌结合的结构域。植物超分子SDH的研究结果支持这一选择：在四亚基模型中，膜结合域由两种跨膜蛋白SDHC-D / SDH3-4构建，它们包括三个平行的跨膜螺旋，共同形成一个六螺旋。在植物中，两个非催化亚基SDH6和7被证明介导膜锚定，并且提出这两个亚基在SDH3和4中提供缺失的螺旋，以产生与四个亚基复合物一样的六螺旋束[36]。在弓形虫的情况下，我们的结构预测指出非催化亚基贡献了 11 个螺旋，这与提出的六螺旋模型不同。然而，在预测的结构中，螺旋线彼此堆叠，这与四个亚基结构中描述的“笼状”束不同。这可能是预测算法的局限性，直接结构研究可能在未来能够解决。尽管如此，该预测为这里研究的所有五个亚基在膜锚定中的作用提供了支持，我们的实验为所有五种被膜结合的蛋白质提供了强有力的支持，这与这一作用一致。此外，五个亚基中每个亚基的耗竭导致SDHB与复合物的解离，如其天然凝胶迁移所示，这进一步支持了五个亚基中的每一个对于催化亚基与膜复合物的桴系都很重要。
我们对SDH10的研究进一步支持了非催化亚基形成膜锚定和底物结合域的模型。我们发现在所有 SDH10 myzozoan 直系同源物中严格保守的“DY 基序”，以及它在 SDHD 中泛醌结合中提出的作用，表明该亚基可能有助于底物结合。然后，我们的诱变工作证明了SDH结构和功能对该DY基序的依赖性。然而，对后一个发现的解释很复杂，因为该突变体中完全形成的 SDH 总体减少，通过天然 PAGE 和免疫印迹可见。SDH10的水平型号：DY>AA-与由同一启动子表达的野生型版本相比，Ty 蛋白增加。这种升高可能是对 SDH 组装缺陷的平移后反馈响应的结果。需要进一步的研究来揭示这一观察背后的机制。使用序列比对和结构预测，我们无法确定除该 DY 基序之外可能有助于底物结合的其他氨基酸。潜在的结构研究可能会揭示这些氨基酸的身份，并定义泛醌结合位点和血红素结合位点。结构研究可能具有额外的好处，因为考虑到顶复合物和人 SDH 复合物的不同组成，结合的精确机制也可能是不同的，并为开发顶复合物 SHD 的选择性抑制剂创造了机会。虽然我们还没有证明SDH对健身是绝对必要的，但它的消耗有明显的健身成本，因此寄生虫特异性SDH抑制剂可能成为可以与其他药物联合使用的药物的潜在线索。
虽然我们的数据为履行与SDHC和D类似作用的不同非催化亚基提供了支持，但为什么需要这么多亚基来履行这一作用仍然是一个悬而未决的问题。除了琥珀酸的氧化和泛醌的还原外，这些成分中的一些或部分可能介导生物体/谱系/分支特异性功能。线粒体氧化磷酸化途径的其他复合物的例子越来越多，它们在不同的谱系中具有额外的功能模块。例如，植物[46]和不同单细胞真核生物[47\u201249]的复合物I包括一个碳酸酐酶结构域，该结构域在细菌和opisthokonts的复合物I中没有发现。类似地，植物的复合物III包括执行线粒体加工肽酶（MPP）活性的亚基，即切除介导前蛋白线粒体输入的转运序列[50,51]。同样，来自不同单细胞真核生物的线粒体ATP合酶包含额外的亚基，这些亚基稳定单体二聚化[52]和/或介导高级寡聚化[5,16,53]。此外，最近首次在纤毛虫嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）的呼吸超复合体中发现了SDH[5,7]。从SDH方面来看，与超复合物（特别是与复合物I和IV）的相互作用是由70 kDa模块介导的，该模块由物种特异性非催化亚基形成。新形成的提议是为了诱导膜曲率，有助于嵴的塑造，从而实现其生物能量功能专业化[5]。因此，SDH发散的非催化成分可以介导相互作用，这些相互作用具有适合生物体或分支特殊需求的功能。为了支持弓形虫的情况，我们的天然迁移和免疫印迹实验揭示了分子量高于通过络合组分析计算的~500 kDa的复合物，但仍包括SDHB。这些复合物和介导其形成的亚基的身份仍有待探索。
通过琥珀酸和泛醌的氧化还原，SDH将电子穿梭到mETC中，在那里它们被转移，最终使用氧气作为其受体。这种电子转移需要通过复合物 III 和 IV 中质子的耦合泵浦来维持电化学梯度，这对于 F 产生 ATP 是必要的oF1ATP合酶。考虑到mETC的这一重要作用，预计SDH功能对寄生虫适应性很重要。耗竭突变体仍然可以在宿主细胞单层中形成斑块，尽管比亲本系小得多，这表明尽管SDH功能降低，但寄生虫仍然可以生长。寄生虫的活力与我们在耗氧量测定中观察到的残余呼吸一致。在弓形虫中，其他四种脱氢酶可以作为链的电子源。面向基质的单亚基II型NADH脱氢酶（NDH2），从NADH的氧化中获取电子;二氢乳清酸脱氢酶（DHODH），催化嘧啶合成途径中将二氢乳清酸氧化为乳清酸的限速步骤;FAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶（G3PDH）;以及参与丙酮酸代谢的苹果酸：醌氧化还原酶（MQO）。因此，观察到的残余呼吸和生长可归因于这些脱氢酶的活性。
关于SDH的一种新观点是，其真正的生物学功能远远超出了呼吸[45]，其他功能已被归因于SDH亚基。例如，SDH亚基可以参与替代组装，如酵母SDH3与线粒体蛋白输入机制的相互作用所证明的那样，这是蛋白质输入复合物亚基Tim54和Tim22的生物发生以及通过TIM22复合物导入前体蛋白所必需的[54]。为了支持SDH亚基可能参与其他复合物的假设情景，我们在分析其天然凝胶迁移时，在额外的高分子条带中观察到至少两个亚基（SDH23（图1B），SDHB（图2A，2C和2F））。未来对使用不同洗涤剂提取的SDH进行蛋白质组学和结构分析可能会为这种有趣的可能性提供见解。
总之，我们的工作验证了超分子弓形虫SDH复合物的组成，并证明了它对这些寄生虫中功能齐全的mETC的重要性，从而证明了它们的适应性。我们的观察结果引发了新的问题，即每种成分在SDH作为氧化还原酶的活性机制中的确切作用，并可能超越该作用。
材料与方法
细胞培养
弓形虫速殖子在人包皮成纤维细胞 （HFF） 中培养，来源于 ATCC （SCRC-1041）。HFF 和寄生虫在含有 4.5 gL 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中培养-1葡萄糖，补充有 10% （v/v） 胎牛血清、4mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素抗生素，并在 37°C 下用 5% CO 生长2.需要时，将脱水四环素（ATc）以0.5μM的最终配合加入培养基中。
寄生虫基因操作
在TatiΔKu80细胞系中进行CRISPR引导的启动子置换[32]。使用 ChopChop 工具 （https://chopchop.cbu.uib.no/） 围绕每个基因的起始密码子区域设计 gRNA。使用BsaI限制性位点将每个gRNA（S1表）克隆到含有U6启动子并表达CAS9-GFP（Tub-Cas9-YFP-pU6-ccdB-tracrRNA）的载体中[32,55]。根据制造商的方案，使用DNA midi-prep（Qiagen）纯化最终质粒。pDTS4myc质粒[32]被用作模板，通过PCR扩增DHFR可选择的盒和ATc可抑制启动子。通过电穿孔将 gRNA 和盒整合插入 TatiΔKu80/SDHB-HA [13] 细胞系中。选择用乙胺嘧啶 （1 μM） 进行盒整合，并通过连续稀释进行克隆。使用S1表中的引物通过PCR检测阳性克隆。
为了互补启动子替代细胞系，通过EcoRI、MfeI和NsiI限制性位点将cDNA（S1表中的引物）克隆到pTUB8mycGFPMyoATy表达载体中[56]。将载体电穿孔到各自的启动子置换系中，并与霉酚酸 （25 mg/mL） 和黄嘌呤 （50 mg/mL） 进行整合。根据制造商的说明，使用商业 QuikChange II 定点诱变试剂盒 （Stratagen） 在 pTUB8-SDH10-Ty 载体（如上所述生成）中227920_DY>，使用商业 QuikChange II 定点诱变试剂盒 （Stratagen） 将 DY 基序突变为 rSDH10/SDHB-HA 的 AA。
qRT-PCR检测
为了测量基因下调水平，在rSDH10、11、15、23、31/SDHB-HA细胞系中进行qRT-PCRs，这些细胞系在不存在或存在ATc的情况下生长2 d。收获寄生虫，并通过3μm聚碳酸酯过滤器除去宿主细胞碎片。使用RNeasy试剂盒（Qiagen）提取RNA，并添加DNAseI步骤。cDNA 是用高容量 RNA-to-cDNA 试剂盒 （AppliedBiosystems） 制备的。使用 PowerSYBR 绿色预混液 （ThermoFisher） 建立 qRT-PCR，使用 10 ng cDNA 作为模板。使用每个基因和肌动蛋白的特异性引物（S1表）。使用7500实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）进行了25个循环。为了计算用ATC处理或未处理样品的相对表达，使用双ΔCt法[13]，肌动蛋白mRNA作为内部对照。进行了三个独立的实验。使用GraphPad Prism 9.2.0软件进行数据绘图。
免疫荧光检测
为了评估亚基定位，用上述pTUB8-亚基-Ty表达载体转染寄生虫，并接种到玻璃盖玻片上生长的HFF上。1天后，用4%多聚甲醛固定细胞。细胞用针对TY的一抗（1：800，抗小鼠，[57]）和线粒体蛋白MYS（1：1000，抗兔，[29]）标记，然后用二抗（Alexa Fluor 山羊抗小鼠488 A11029,1：1000和Alexa Fluor Goat抗兔568 A11036,1：1000）标记细胞。在DeltaVision Core显微镜（Applied Precision）上使用100倍物镜和z轴堆叠对载玻片进行成像。使用SoftWoRx软件对成像进行去卷积处理，并使用FIJI软件进行处理。
超分辨率显微镜：使用Elyra PS.1超分辨率显微镜（蔡司，耶拿，德国）和63×/1.4 NA油浸物镜，使用ZEN黑色软件（蔡司）对载玻片进行成像。以0.091μm的增量捕获具有4个速殖子的液泡。在成像软件中，通过3相设置和结构照明和对齐来采集图像。在Imaris软件（Oxford Instruments）中重建了3D模型。
扩增显微镜：根据[58]进行超微结构扩增显微镜（U-ExM），并进行了一些修改：寄生虫在24孔板的玻璃盖玻片上的HFF单层中生长。凝胶在85°C下变性90分钟。使用的一抗是大鼠抗HA（1：250，Sigma，Merck，Gillingham，UK），小鼠抗Ty（1：250，[57]）和兔抗TOM40（1：250，[30]）。本研究中使用的二抗是 Alexa Fluor Goat 抗小鼠 488 A11029， 1：250、Alexa Fluor Goat 抗大鼠 594。1：250 和 Alexa Fluor 488 偶联山羊抗兔 IgG，1：250。使用Elyra PS.1超分辨率显微镜（Zeiss，Jena，Germany）和63×/1.4 NA油浸物镜，使用ZEN黑色软件（Zeiss）采集图像。以0.091μm的增量捕获具有两个速殖子的液泡。在成像软件中，通过3相设置和结构照明和对齐来采集图像。在斐济处理图像并测量距离。在Imaris软件（Oxford Instruments）中重建了3D模型。膨胀系数为3倍，在第一轮膨胀后确定。测量的距离除以膨胀系数。
细胞外通量分析
使用 Seahorse XF HS 迷你分析仪（安捷伦技术）测量耗氧率 （OCR） 和细胞外酸化率 （ECAR）。该方法改编自[34]，以便与8孔板形式兼容。简而言之，在收获前，将寄生虫在存在或不存在ATc的情况下孵育三天。将完全裂解的寄生虫通过 3 μm 聚碳酸酯过滤器，洗涤并用补充有 5 mM 葡萄糖和 1 mM 谷氨酰胺的 Seahorse XF DMEM 基础培养基和 1.5 x106每孔加入到用聚-L-赖氨酸处理的平板中。然后使用Seahorse XF HS迷你分析仪测量寄生虫OCR和ECAR。背景，在加入 1 μM 阿托伐醌后，将非线粒体 OCR 作为 OCR 测量。通过分别在加入 1 μM FCCP 之前或之后进行 OCR 测量并减去背景速率来计算基础和最大线粒体 OCR。每次实验运行都是在不存在或存在ATc的情况下生长的单系进行，并具有三个技术重复。每条生产线进行3个独立实验。
增长分析
对于噬菌斑测定，用 100-200 个速殖子感染 6 孔板中的单层 HFFs 细胞，并在存在和不存在 ATc 的情况下生长 8 天。细胞用甲醇固定，并用0.4%结晶紫溶液染色。使用图像 J 从三个生物学重复中测量每种条件下 10 个斑块。
对于囊肿定量，在存在或不存在ATc的情况下，在玻璃盖玻片上生长的HFF上生长相应的细胞系rSDH10/SDHB-HA、rSDH10/SDHB-HA-SDH10-Ty、亲本细胞系和cKD-TgISU1-HA [35]4 d，然后进行IFA。用 GAP45 抗体 （1：1000， [59]） 和标记新生囊肿壁的双花多利果凝集素 （DBL） 标记物对寄生虫进行染色（1：500，FL-1031，载体实验室）。为了量化阳性囊肿的百分比，从三个生物学重复中计数了 100 个液泡。
复制测定是通过在没有或存在 ATc 的情况下培养亲本和 rSDH11/SDHB-HA 寄生虫两天，然后在相同条件下感染汇合的 HFF 24 小时进行复制测定。用PBS洗涤细胞以去除细胞外寄生虫，并用4%PFA固定。如上所述，使用 GAP45 抗体进行免疫荧光测定。对 100 个液泡中含有 1、2、4 或 8+ 寄生虫的液泡数量进行计数。进行了三个独立的实验。
SDS-PAGE和免疫印迹分析
将寄生虫样品重悬于补充有 5% v/v β-巯基乙醇或 Laemmli 缓冲液（2% （w/v） SDS、125 mM Tris–HCl pH 6.8、10% （w/v） 甘油、0.04% （v/v） β-巯基乙醇和 0.002% （w/v） 溴酚蓝的 1 × NuPAGE LDS 上样染料（Invitrogen，Paisley，UK）中，在 95°C 下加热 5 分钟，并在 SDS-PAGE 凝胶上分离， 使用 EZ-Run 预染 Rec 蛋白分子量标准作为分子量标记物。在半干燥条件下将蛋白质在Towbin缓冲液（0.025M Tris 0.192M甘氨酸10%甲醇）中转移到硝酸纤维素膜（0.45μm Protran，Merck，Gillingham，UK）上。然后用相关的一抗标记膜：抗HA（1：500，大鼠，Sigma，Merck，Gillingham，UK），抗TOM40（1：2000，兔，[30]），抗TY（1：1000，小鼠，[57]）和抗ATPβ（1：2000，兔，Agrisera AS05 085），然后用二抗荧光抗体IRDye 800CW和IRDye 680RD（1：10,000，LIC-COR，Lincoln，NE，USA）标记，并用Odyssey CLx成像系统可视化。
免疫沉淀
对于免疫共沉淀和免疫印迹分析：9 x 107将 rSDHB15/ SDHB-HA +SDH15-Ty 寄生虫分成三等分试样，并在 1% 洋地黄皂苷、50 mM Tris-HCL pH 7.4、150 mM NaCl、2 mM EDTA 中裂解。保留一份等分试样作为起始样品，而另外两份则通过以 18,000 x g 离心清除，并将上清液与抗 HA 或抗 Ty 琼脂糖珠在 4°C 下孵育过夜。 将琼脂糖珠沉淀，并将上清液沉淀成TCA，得到“未结合”部分。然后将珠子在含有0.1%洋地黄皂苷的裂解缓冲液中洗涤，并重悬于laemmli缓冲液中，得到“结合”部分。然后对所有馏分进行免疫印迹分析，如上所述。
质谱鉴定：5 x 108将SDHB-HA或QCR2-HA[13]的细胞在1%βDDM裂解缓冲液（50mM Tris-HCL pH 7.4,150mM NaCl，2mM EDTA）中裂解，并用抗HA琼脂糖珠（Pierce）免疫沉淀。用含有 0.05% βDDM 结合蛋白的缓冲液洗涤珠子两次，用 50 mM NaoH 洗脱。取总馏分、未结合馏分和洗脱馏分进行免疫印迹分析。洗脱对应于 ~1.2 x 108将细胞送去通过质谱分析。
质谱分析
样品处理：使用4–12%凝胶通过SDS-PAGE分离2 cm的样品。用快速考马斯染色剂（Generon）染色后，切除2cm泳道并切丁。然后用碘乙酰胺（Sigma-Aldrich）对凝胶片进行烷基化，然后使用1 mg/ml胰蛋白酶（Thermo Scientific）进行凝胶内消化，终浓度为12.5 μg/ml。然后使用真空离心将消化的肽干燥，并用1%甲酸（Fisher Chemical）重悬至50μl。
LC-MS分析：LC-MS分析由FingerPrints蛋白质组学设施（邓迪大学）进行。在 Q Exactive plus 质谱仪 （Thermo Scientific） 和 Dionex Ultimate 3000 RS （Thermo Scientific） 上进行肽读数分析。使用的LC缓冲液如下：缓冲液A（0.1%甲酸的Milli-Q水溶液（v/v））和缓冲液B（80%乙腈和0.1%甲酸的Milli-Q水溶液（v/v）。将甲酸中的复溶样品以 15 μl 的等分试样以 10μL/min 的速度加载到捕集柱（100 μm × 2 cm，PepMap nanoViper C18 柱，5 μm，100 ?，Thermo Scientific）上，该柱用 0.1% 三氟乙酸平衡。在相同流速下洗涤捕集柱 3 min，然后将捕集柱与 Thermo Scientific 联用，分离 C18 色谱柱（75 μm × 50 cm，PepMap RSLC C18 色谱柱，2 μm，100 ?），在 2% 缓冲液 B 中平衡 17 分钟。肽以300 nl/min的恒定流速从色谱柱中洗脱，线性梯度从2%缓冲液B到5%缓冲液B，在3min内，5%缓冲液B到35%缓冲液B，在64 min内，然后在2 min内从35%缓冲液B洗脱到98%缓冲液B。然后用98%缓冲液B洗涤色谱柱15分钟。在每个样品之间运行两个空白，以减少残留。色谱柱保持在50°C的恒温下。 Q-exactive plus 在数据依赖型正电离模式下运行。源电压设置为3.0 kV，毛细管温度为250°C。
扫描周期包括在剖面模式下采集的 MS1 扫描（m/z 范围为 350–1600，离子注入时间为 20 ms，分辨率为 70 000，自动增益控制 （AGC） 为 1x106），然后对满足预定义选择标准（AGC 2 x 103，最大离子注入时间 100 ms、 隔离窗口为 1.4 m/z，固定第一质量数为 100 m/z，光谱数据类型：质心，强度阈值 2 x 104，排除未分配的、单电荷和 >5 电荷前驱体，首选肽匹配，排除同位素开启，动态排除时间 45s）。HCD碰撞能量设置为归一化碰撞能量的27%。在样品分析开始前检查质量精度。
数据分析：在MaxQuant版本2.0.3.0中使用Microsoft Excel Office 365中的数据操作生成的RAW文件进行无标记分析，以提供对照样品和处理样品之间的比较。使用 Perseus 版本 1.6.15.0 对每个样品在所有四个独立实验中检测到的蛋白质进行进一步的数据分析，以生成火山图数据并执行学生 t 检验。最终的火山图是使用GraphPad Prism 8.4.3生成的。
存放在PRIDE数据库中的完整数据。项目名称：刚地弓形虫琥珀酸脱氢酶复合物的免疫沉淀。项目加入：PXD047027。
蓝色和透明原生的页面
如前所述进行蓝原生页面（BN-PAGE）[13]，简而言之，将寄生虫重悬于增溶缓冲液（750mM氨基己酸，0.5mM EDTA，50mM双三盐酸，ph 7.0,1%（w/v）正十二烷基麦芽糖苷）中，在冰上孵育10分钟，然后在4°C下以18,000×g离心30分钟。将所得上清液与考马斯G250（NativePAGE）混合至终浓度为0.25%去污剂和0.0625%考马斯G250。使用NativeMark（ThermoFisher）作为分子量标记物，在Native PAGE 4–16% Bis-Tris凝胶上分离样品。使用深色阴极缓冲液（5% 的蓝色阴极缓冲液 （Invitrogen，BN2002）和 5% 的 20x 电泳缓冲液 （Invitrogen， BN2001） 在 80 V 下电泳 60 分钟，然后在 250 V 下在轻阴极缓冲液（0.5% 的蓝色阴极缓冲液 （Invitrogen， BN2002）和 5% 的 20x 电泳缓冲液 （Invitrogen， BN2001）。将蛋白质在 100 V 下通过在 Towbin 缓冲液（0.025 M TRIS 0.192 M 甘氨酸 10% 甲醇）中湿转印 60 分钟转移到 PVDF 膜（0.45 μm，Hybond，Merck）上。 使用适当的一抗进行免疫标记：抗 HA（1：1000，大鼠，sigma）、抗 TOM40（1：2000，兔，[30]）和抗 TY（1：800，[57]），并使用抗大鼠 （ab6845， abcam）、抗兔（1：10000，W4011，Promega）和抗小鼠（1：10000，W4021，Promega）二期辣根过氧化物酶偶联抗体。使用 Pierce ECL 蛋白质印迹底物和 X 射线胶片通过化学发光进行检测。
根据[60]进行透明天然Page（CN-Page），然后进行复合IV活性测定。将寄生虫重悬于增溶缓冲液（50 mM NaCl、2 mM 6-氨基己酸、50 mM 咪唑、2% （w/v） 正十二烷基麦芽糖苷、1 mM EDTA-HCl pH 7.0）中，并在冰中孵育 10 分钟，在 4°C 下以 18,000 x g 离心 15 分钟。然后将上清液与甘油和ponceau S混合至终浓度分别为6.25%和0.125%。使用NativeMark（ThermoFisher）作为分子量标记物，在预制的Native PAGE 4–16% Bis-Tris凝胶上分离样品。通过在 50 mM KH 中孵育凝胶来显示复合物 IV 氧化活性2采购订单4，pH 7.2,1mg ml ?1细胞色素c，0.1%（w / v）3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐溶液，直至可见棕色沉淀。
酶活性测定
使用改编自[61]的分光光度法测定琥珀酸脱氢酶（SDH）活性。在收获细胞外寄生虫之前，在没有ATc和存在的情况下培养弓形虫寄生虫3天，并用3μm聚碳酸酯过滤器除去宿主细胞碎片。3 x 107寄生虫重悬于100μl线粒体测定溶液裂解缓冲液（70mM蔗糖，220mM甘露醇，10mM KH2采购订单4，5毫米氯化镁2，2 mM HEPES、1 mM EGTA、0.2% w/v 牛血清白蛋白 （BSA） 和 0.2% w/v 洋地黄皂苷，pH 7.2），并在 4°C 下孵育 1 小时。 然后将所得寄生虫裂解物加入含有 20 mM 琥珀酸酯、25 mM KH 的测定缓冲液（最终体积 1 mL）中2采购订单4，0.002175% w/v DCPIP，1μM阿托伐醌，2.5mg / mL BSA和40μM去环泛醌（DUB）），每2分钟测量一次600nM的吸光度，持续40分钟。每次重复使用来自相同起始数量的寄生虫的裂解物。使用相同的方案测量MQO活性，除了使用20mM苹果酸而不是琥珀酸盐。使用19.1 mM的DCPIP消光系数计算酶活性-1厘米-1.
碳酸钠萃取
为了从外周膜蛋白中分离整合膜蛋白，用 100 mM Na 处理寄生虫2一氧化碳3并在 4°C 下孵育 2 小时。通过189,000×g的超速离心分离沉淀和上清液部分。上清液部分在TCA之前沉淀，沉淀部分重悬于laemmli缓冲液中。为了测试蛋白质的溶解度，将寄生虫重悬于1%triton X-100中，在4°C下孵育2小时，并通过16,000 x g离心分离沉淀和上清液级分。然后通过免疫印迹分析测试馏分以及总寄生虫样品。
结构预测
每个 T 的预测结构。刚地SDH亚基取自AlphaFold数据库[37,38]。使用MitoProt[62]预测线粒体靶向序列并去除线粒体靶向序列。然后使用UCSF ChimeraX中的匹配工具将截断的序列与鸟类复合物II结构（PDB 2H88）对齐[39]。
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S1 图。
（A） 超分辨率显微镜图像显示为 SDHB-HA 和 SDH15-Ty 的 Z 堆栈（左图和中图）和 3D 重建（右图），线粒体标记蛋白 TOM40。比例尺为2μM。（B）图1B中的超膨胀显微镜图像。左图：SDHB-HA/SDH15-TY（橙色）和TOM40（粉色）的合并，突出显示了插图区域，右图：插图特写，白线表示强度计算区域。比例尺是来自 B 部分的 SDHB-HA/SDH15-TY 和 TOM40 信号的 1 μM （C） 强度图。（D）图1C所示数据的全免疫印迹。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s001
（TIF）
S2 图。
（A） 对使用抗 Ty 抗体表达 SDH10、SDH11、SDH15、SDH23 或 SDH31-Ty 的细胞中提取的全细胞裂解物进行免疫印迹分析。（B） 启动子替代策略示意图，允许通过添加脱水四环素 （ATc） 敲低目的基因 （GOI）。（i） CRISPR/CAS9 引导切割在预测的启动子/ATG 边界处，（ii） 在同源序列引导的切割修复过程中，在启动子和 GOI 之间插入含有 ATc 可抑制启动子 （T7S4）、二氢叶酸还原酶 （DHFR） 选择标记物以及与启动子/ATG 边界同源的修复盒， （iii） GOI，在 ATc 可抑制启动子的控制下， 添加 ATc 时下调。黑色箭头代表用于通过PCR确认整合的引物（S1表中的引物）。（C） 使用 B 中的引物对 rSDHB10、11、15、23 或 31 进行 PCR 分析，以确认 DHFR 和可抑制启动子的整合。（D） qRT-PCR分析在ATc中生长2天后，将无ATc设置为1，加ATc条件后，通过单样本t检验比较相应启动子替代系中SDH10、11、15、23或31的相对转录水平。条形表示 S.D. ±平均值 （n = 3）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s002
（TIF）
S3 图。
对从 SDHB-HA （A） 或 QCR2-HA （B） 中提取并用抗 HA 微球免疫沉淀的全细胞裂解物进行免疫印迹分析，以产生总裂解物、未结合和洗脱级分。样品通过SDS-PAGE分离，印迹，并使用抗HA抗体标记免疫沉淀蛋白，并使用抗TOM40作为无关线粒体蛋白对照进行检测。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s003
（TIF）
S4 图。 对在无或存在 ATc 三天的情况下生长的亲本、rSDH15 和 rVDAC [33] 寄生虫进行免疫荧光测定分析。
线粒体形态通过针对线粒体标记蛋白 TOM40 的抗体可视化。比例尺为5μM。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s004
（TIF）
S5 图。
（A） 弓形虫 SDH 的带状同源模型，前视图和后视图，使用 alphafold 和 matchmaker 生成。单个亚基采用颜色编码。（B）亚基SDHA和SDHB的同源模型 （C）新型SDH亚基的同源模型。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s005
（TIF）
S6 图。 MPOD、SDH10、SDH11、15、23、31 与 SDHC 和 SDHD 的比对来自具有典型 SDH 复合物的物种。
Gg， Gallus gallus;Bt， Bos taurus;Hs： 智人;Dm： 黑腹果蝇;Bs： 缓根瘤菌属;Bj： 日本缓根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）;Ra： 美洲斜单胞菌;Rp， 普罗瓦泽基立克次体;As，蛔虫;Ps： 副球菌属;Pd： 反硝化副球菌;Rr： 红螺杆菌;Ec： 大肠杆菌;Sc： 酿酒酵母;Pp， 紫紫薇。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s006
（PDF格式）
S7 图。 来自myzozoa的SDH11,15,23,31同源物的比对。
Tg弓形虫;Tp， 小蒲公英;Et， Eimeria tenella;Bb， 牛巴贝虫;PF， 恶性疟原虫;Pb， 白鲷（Plamodium baeghei）;下午，Perkinsus marinu;Po， Perkinsus olseni.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s007
（TIF）
S1 表。 引物表：本研究中使用的引物摘要。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s008
（XLSX）
S2 表。 来自 SDHB 和 QCR2 免疫沉淀的质谱数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s009
（XLSX）
S3 表。 SDH 和 MQO 酶活性测量。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s010
（XLSX）
S4 表。 定量父母、rISU1、rSDH10 和 cSDH10 寄生虫中 DBL 阳性液泡。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011867.s011
（XLSX）
确认
我们感谢惠康综合寄生虫学中心成像设施的 Leandro Lemgruber 对显微镜工作的支持。我们感谢澳大利亚国立大学的 Giel van Dooren 和 Soraya Zwahlen 分享他们使用 T 进行复杂 II 活性测定的方案。刚地细胞裂解物。我们感谢 EupathDB 和 ToxoDB 提供对基因组数据库的有用和免费访问。我们要感谢邓迪大学指纹蛋白质组学设施的 Alan Score，该设施得到了“惠康信托技术平台”奖 [097945/B/11/Z] 的支持。
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