厦门医学论文发表-钩虫对 2 型免疫压力的丧失做出动态反应
抽象
宿主免疫环境对寄生虫转录和适应性的影响目前尚不清楚。人们普遍认为，钩虫感染对宿主有免疫调节作用，但反之亦然尚不清楚。对成虫期钩虫的免疫主要由转录因子信号转导和转录激活因子 6 （STAT6） 驱动的 2 型免疫反应介导。本研究调查了啮齿动物钩虫Nippostrongylus brasiliensis在STAT6缺陷小鼠（STAT6 KO）中的连续传代是否引起寄生虫随时间的变化。适应 STAT6 KO 主机后，N.巴西人增加了它们的繁殖能力、摄食能力、能量含量和体型。使用改进的 N。我们发现，这些生理变化与转录景观的戏剧性变化相对应，包括与产卵相关的基因通路表达增加，但编码神经肽、蛋白酶、SCP/TAPS 蛋白和转甲状腺素蛋白样蛋白的基因减少;后三类在与免疫抑制有关的钩虫排泄/分泌蛋白 （ESP） 中反复观察到。尽管在未成熟和成熟成虫阶段的 STAT6 KO 宿主的第一代传代中开始出现转录变化，但只有在这种免疫缺陷环境中经过多代后才观察到推测参与免疫抑制的基因的下调。当 STAT6 KO 适应 N.巴西在多达 26 代后被重新引入幼稚的 WT 宿主，宿主适应的这种渐进性变化对应于 WT 宿主产生炎性细胞因子的增加。然而，令人惊讶的是，STAT6 KO 适配的 N 的单次曝光。巴西对WT宿主的感染导致蠕虫在形态学和转录上与WT适应的寄生虫难以区分。这项工作揭示了钩虫适应宿主能力的显着可塑性，这可能呈现寄生线虫的一般特征。
作者摘要
钩虫感染全球1.7亿至4.4亿人。我们在这项研究中的目的是了解宿主免疫环境如何影响钩虫适应性和基因表达。众所周知，对钩虫的保护性免疫取决于信号转导和转录激活因子 6 （STAT6） 控制的机制。因此，我们使用缺乏STAT6（STAT6 KO）的小鼠作为啮齿动物钩虫Nippostrongylus brasiliensis生存的宽松环境。一次进入 STAT6 KO 宿主的传代导致立即的转录变化，包括喂养和产卵途径增加，对应于在额外传代后观察到的繁殖力、存活率、体型和喂养量的测量增加。STAT6 KO宿主需要多代（最多26代）才能看到被认为介导宿主免疫系统逃避的基因转录减少。尽管 WT 宿主对 STAT6 KO 适应的 N 具有增强的免疫反应。brasiliensis，这一系列蠕虫以及 WT 适应的 N.brasiliensis 并很快失去了它们在通过 STAT6 KO 宿主期间获得的变化。我们的研究结果表明，钩虫会动态改变其转录谱以适应其直接宿主免疫环境。
数字
Fig 7Fig 8Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Ferguson AA， Inclan-Rico JM， Lu D， Bobardt SD， Hung L， Gouil Q， et al. （2023） 钩虫对 2 型免疫压力的丧失做出动态反应。PLoS 病理学 19（12）： e1011797 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797
编辑 器： Thomas B. Nutman，美国国立卫生研究院
收到： 2023年5月3日;接受： 2023年11月2日;发表： 12月 11， 2023
版权所有： ? 2023 Ferguson et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 巴西奈瑟菌基因组组装及其测序数据已存放在GenBank中，BioProject登录号为PRJNA994163，基因组组装存放为GCA_030553155.1，RNA-seq读段存放在NCBI序列读取档案（SRA）中，BioSample登录号为SAMN37187590、SAMN37187592、SAMN37187594、SAMN37187619、SAMN37187621、SAMN37187623、SAMN37203688、SAMN37203689、SAMN37203690和SAMN37203691。在GenBank提交之前，本分析中使用的确切蛋白质编码基因预测、编码DD（CDS DD）和预测的蛋白质序列已永久存档在OSF中 https://osf.io/gpyuc。
资金： 计算是通过 NSF XSEDE （TG-MCB190010） 对 EMS 的研究分配来实现的。AAF 得到了 NIH T32 （AI007532-25） 的支持。这项工作的资金被授予EMS（康奈尔启动基金），MGN和ARD（NIH R21AI142121）以及DRH（NIH R01AI164715 U01AI163062）。ARJ得到了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（Investigator Grant APP1194330）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
成功的寄生虫通常会随着时间的推移与宿主共同进化，通过在病原体毒力和宿主存活之间实现最佳平衡的过程。通过这种方式，宿主免疫反应可以成为协同进化的关键驱动力。许多研究描述了寄生虫逃避和操纵宿主免疫的适应性机制，从而对病原体具有适应性益处[1]。对于寄生蠕虫等真核后生动物，许多效应机制已被证明具有直接的免疫调节功能[2\u20126]。然而，由于蠕虫的多细胞性质和复杂的蠕虫生命周期，通常需要多个宿主才能成功进行实验，因此很少有研究关注宿主免疫如何影响蠕虫寄生虫适应性的进化[3]。尽管在某些蠕虫物种的遗传操作方面取得了进展，但对宿主适应的分子和生化特征仍然知之甚少[7\u20129]。
实验进化可以识别适应性特征，是对在环境参数和受试者种群受到严格控制的环境中驱动物种进化过程的对照研究[10]。这种方法源于理查德·伦斯基（Richard Lenski）小组的一项典型研究，该研究显示，多种多样和趋同的遗传性状在E中出现和灭绝。适应不同培养基条件时的大肠杆菌[11,12]。因此，病原体对宿主免疫的适应通常通过在明确定义的宿主或一组培养条件下的连续传代来研究。以胃肠道（GI）寄生线虫Heligmosomoides polygyrus为中心的系列传代实验显示，经过6代或更多代的选择后，免疫野生型小鼠的存活率和繁殖力有所提高[13]。此外，选择大鼠适应胃肠道寄生虫Strongyliodes ratti的晚期感染卵与早期感染卵，可改善免疫WT宿主中接种的晚期蠕虫的寄生虫适应性和转录变化[14,15]。然而，胃肠道寄生虫（尤其是钩虫）在寄生于免疫功能低下的宿主后是否会发生表型或转录适应，尤其是缺乏免疫类型的宿主，而这种免疫类型可能已经专门进化为消除多细胞寄生虫，目前仍未得到检验[16]。最近的一项案例研究表明，如果寄生虫遇到免疫抑制宿主，宿主特异性边界会扩大[17]。
巴西圆线虫是一种大鼠钩虫，在生命周期和吸血方面与人类钩虫相似[18,19]。巴西奈瑟菌通过穿透皮肤、通过脉管系统迁移、感染后第2天通过肺部迁移、第3天咳嗽和吞咽进入胃肠道、附着在胃肠道上、在第5天成为性成熟的死亡成虫，繁殖和产卵，直到被宿主排出[20].宿主对人和小鼠钩虫的保护的关键机制是 2 型免疫，其特征是 CD4 T 辅助细胞、先天淋巴组 2 细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、IgE 和白细胞介素 IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-25 和 IL-33。总的来说，这些反应针对蠕虫感染的不同阶段，并通过多种机制限制其生存。对人类钩虫感染的研究表明，IL-5的产生与驱虫治疗后防止再次感染相关[21]，实验性或自然感染的特征是嗜酸性粒细胞增多以及产生钩虫抗原特异性IgE和IgG抗体[22]。尽管如此，免疫力并不能杀菌或持久，驱虫治疗后患者仍易发生再感染[23–25]。与其他蠕虫感染不同，钩虫在儿童早期至成年期的负荷增加，在成人中仍然很高[26]。这表明钩虫可能具有独特的能力，能够对具有不同免疫压力水平的宿主做出适应性反应。+
小鼠研究表明，IL-4/IL-13受体信号转导对钩虫清除至关重要，并且该受体募集经典转录因子STAT6[27]。STAT6结合许多2型免疫靶基因的启动子区域，这些基因是消除肺和肠蠕虫的效应反应所必需的[28,29]。在 N.巴西模型显示，缺乏STAT6的小鼠在第11-15天时无法清除蠕虫，这可能是由于已知STAT6在驱动IL-4Rα下游的IL-4/IL-13信号传导方面具有重要作用，导致粘液积聚、M2巨噬细胞分化、平滑肌收缩和簇状细胞扩增[27,30–38]。然而，目前尚不清楚寄生宿主中的 STAT6 缺陷是否会影响钩虫表型，如钩虫的大小、摄食能力或基因表达。
本研究测试了N.巴西通过顺序通过STAT6 KO宿主传代，当重新引入WT宿主时，将对整体蠕虫适应性产生功能性、潜在的遗传影响。结果显示，在传代宿主内将钩虫适应 STAT6 KO 小鼠后，蠕虫大小、繁殖力和采血量显着增加。这些变化的发生明显是以表达编码不同信号转导和发育途径的转录本为代价的。有趣的是，经过 15 代后，我们注意到编码蛋白酶、SCP/TAPS 蛋白和转甲状腺素蛋白样蛋白的转录本显着下降;在钩虫和其他寄生线虫的排泄/分泌蛋白（ESP）中经常观察到这些类别的蛋白质，这些蛋白质被怀疑具有免疫调节功能[39,40]。事实上，当接种到 WT 宿主中时，STAT6 KO 适应的寄生虫会引起 1 型、2 型和 3 型炎症反应的增加。然而，几乎没有证据表明 STAT6 KO 适应蠕虫中发生了任何可遗传的适应，因为在接种到 WT 宿主后，它们与 WT 适应的蠕虫一样存活，并将其转录谱恢复到 WT 适应蠕虫的转录谱。这些结果表明，释放2型免疫的选择压力可能会改变钩虫的一些宿主调节性状，但钩虫会迅速调整其表型和基因表达谱以适应即时宿主免疫反应。
结果
N. brasiliensis 在 STAT6 缺陷小鼠中发展出更高的生殖适应性
清除 N 需要 STAT6 依赖性免疫活性。来自啮齿动物寄主的巴西虫[27]。我们假设 STAT6 KO 免疫环境会增加 N 的生殖适应性。巴西相对于WT免疫环境。为了解决这个问题，我们从 WT 大鼠维持的 N 中分离出 500 只感染期幼虫 （iL3）。巴西人（亲本N。brasiliensis），用它们感染WT或STAT6 KO小鼠，然后连续传代来自这些小鼠的后续iL3，以产生WT或STAT6 KO适应的N。brasiliensis（图1A）。我们发现，在WT或STAT6 KO中分别选择16或15代后，STAT6 KO适应了N。巴西每克粪便（EPG）的卵数增加，曲线下面积（AUC;即观察到的总EPG）增加10倍以上（图1B和1C）。由于EPG可以通过小肠中繁殖阶段蠕虫的数量或单个雌性蠕虫的繁殖力来确定，因此我们试图确定STAT6驱动的免疫是否对单个蠕虫的繁殖力有影响。分离单个雌性蠕虫并将其放入培养基中，并在 24 小时后计算每个个体释放的卵。我们发现，与WT对照蠕虫相比，STAT6 KO适应蠕虫在感染后第7天的24小时蠕虫卵释放增加（图1D）。此外，在第 7 天和第 8 天，STAT6 KO 宿主内适应成虫的总数相对于 WT 对照增加（图 1E 和 1F）。这意味着 STAT6 KO 适应钩虫在 STAT6 KO 宿主中的存活率和繁殖力增加。
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图 1. STAT6 驱动的抗扰度会降低 N。Brasiliensis在宿主内的繁殖输出和存活。
一个。实验进化设计，N。巴西人（最初从大鼠宿主棕色中分离出来）通过WT（黑色或灰色）或STAT6 KO（红色）小鼠宿主感染了几代（n），以产生适应的队列。该图中的数据来自第 11 次（D，24 小时内的单个雌性卵输出）、第 15 次（E，肠道成虫）、第 16 次（B，C-每克粪便卵，EPG，输出）或第 21 次（F，肠道成虫）感染生成 WT N。brasiliensis 和第 10、14、15 或 20 代 STAT6 KO N。巴西人。湾。每株系的 EPG 在其传代宿主基因型内评估第 5-9 天。三.按宿主基因型划分的第 5-9 天 EPG 曲线下面积 （AUC）。D. 50 成年女性 N.从每个品系的巴西人中分离出其传代宿主的肠道，并评估 24 小时离体卵释放。图中显示了每种条件下 50 条成虫释放 0、<20、20-50 或 >50 个卵的比例。请注意，N.与WT相比，来自STAT6 KO的巴西雌性都产生了一定程度的卵子，并且每个卵子产生一个以上的卵子明显更多。 E.在传代宿主（第15代或第14代）感染后第7天从小肠中分离出的每个宿主的成虫数量。六.在传代宿主（第 21 代或第 20 代）感染后第 8 天，每个宿主从小肠中分离出的成虫数量。这些是两次重复实验的结果，每次重复实验有3-5只小鼠/基因型。除非另有说明，否则数据是单个值（圆圈），通过t检验（C，E，F）或卡方检验（D）表示平均值±SEM（条形），* p < 0.05，**p < 0.01。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.g001
与WT适应的寄生虫相比，成年期STAT6 KO适应的钩虫具有更高的大小，ATP和血红蛋白含量
IL-4Rα依赖性STAT6信号转导是杯状细胞分泌RELM-β所必需的，这会干扰胃肠道线虫的摄食能力和健康[31]。进行实验以了解 STAT6 KO 适应蠕虫是否出现异常的形态或生化特征。图 2A 中的数据显示，与 WT 适应的雌性相比，STAT6 KO 适应的雌性在质量上看起来更红，更大。在感染后第 7 天对单独分离的成年雌性进行测量显示，缺乏 STAT6 的环境也导致蠕虫明显更长（图 2B）。然后测量蠕虫匀浆中的血红蛋白水平，以评估红色和增加的大小是否与更大的摄食能力相对应。STAT6 KO适应蠕虫的钩虫血红蛋白水平显著高于WT对照组（图2C）。当测量值调整为平均蠕虫长度时，这种差异消失了（图2D），表明营养摄入量与体型成正比。STAT6 KO适应蠕虫的营养摄入增加表明它们也会增加可用能量。因此，我们测量了蠕虫匀浆中的 ATP（每次测量 10 条蠕虫），发现在感染后第 7 天，相对于 WT 对照，STAT6 KO 适应和衍生的蠕虫中的 ATP 浓度显着增加（图 2E）。蠕虫ATP也与大小成正比，因为在归一化蠕虫长度后，幅度增加同样减少（图2F）。总的来说，这些结果表明，STAT6驱动的免疫反应阻碍了钩虫的大小和摄食能力。
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图 2. 在没有 STAT6 驱动的免疫反应的情况下，巴西奈瑟菌表现出更大的大小、血红蛋白和 ATP 含量。
A.感染后第7天从传代宿主来源的成年雌性WT或STAT6 KO适应蠕虫（第23代和第22代）的10倍放大图像（比例尺= 200μm，箭头表示蠕虫边缘）。B-F 中的数据来自感染后第 8 天从第 21 代 （WT） 或第 20 代 （STAT6 KO） 分离的成虫。湾。来自传代宿主的WT或STAT6 KO适应蠕虫的雌性蠕虫长度。C-D.血红蛋白浓度或来自传代宿主的蠕虫的蠕虫长度归一化浓度。E-F。ATP浓度或蠕虫长度归一化浓度，来源于传代宿主的蠕虫。除非另有说明，否则数据是单个值（圆圈），通过t检验表示平均值±SEM（条形），* p < 0.05 ** p < 0.01，*** p < 0.001。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.g002
WT 和 STAT6 KO 适应蠕虫在其传代宿主中具有不同的基因表达谱
基于N的急剧增加。当蠕虫寄生在 STAT6 KO 宿主中时，我们假设这些寄生虫也可能在这种免疫缺陷环境中改变它们的转录谱。这种改变可以立即发生，也可以需要几代人传代。为了确定蠕虫在单代暴露于 STAT6 KO 宿主后是否表现出转录反应的改变，我们对来自亲本（WT 大鼠适应）N 的后代进行了单蠕虫 mRNA-seq。在第 2 天从肺部 （L4） 以及第 5 天（D5 成年雌性）和第 7 天（D7 成年雌性）分离出 WT 或 STAT6 KO 小鼠的巴西感染（图 3A）。我们还对来自G15（WT）和G14（STAT6 KO）传代宿主的两个适应系进行了单蠕虫mRNA-seq，在感染后第7天分离成年雌性（图3B）。在 G1 感染中，首先使用 PCA 和分层聚类通过生命周期阶段和宿主基因型区分个体（图 3C 和 3E）。来自 STAT6 KO 宿主的第 5 天 （D5） 和第 7 天 （D7） 成年雌性独立于 WT 宿主中的等效阶段聚集，通过 PCA 图，这对于 L4 阶段并不明显（图 3C）。分层聚类还表明，第7天的成虫也可以按宿主基因型进行区分（图3E）。同样，在适应的蠕虫系中，WT （G15） 或 STAT6 KO （G14） 组各自产生不同的转录谱，如 PCA 和分层聚类所示（图 3D 和 3F）。为了分析所有RNA-seq数据，我们为N生成了一个改进的基因组组装和蛋白质编码基因集。巴西的完整性（蛋白质组BUSCO评分为97.5%）高于先前发表的研究（蛋白质组BUSCO评分为75.1%）[41]。
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图 3.
N. brasiliensis 在 STAT6 KO 宿主内的转录谱发生了改变。 答：试验设计。父母 N.巴西（棕色）用于感染WT（黑色）或STAT6 KO（红色）小鼠G1。从感染后第 2 天 （L4） 从肺部分离的单个蠕虫或感染后第 5 天（D5 成人）或第 7 天（D7 成人）从小肠分离的雌性蠕虫（6 条蠕虫/阶段和宿主基因型）对 mRNA 进行测序。湾。在感染后第 7 天从传代宿主（10 条成年雌性蠕虫/宿主基因型）中分离出 WT（黑色）或 STAT6 KO（红色）适应蠕虫（分别为 15 代和第 14 代）。三.主成分分析 （PCA） 按生命周期阶段和宿主基因型绘制 G1 单个蠕虫的主成分 （PC） 1 和 PC2。每个点代表一个蠕虫复制。D.PC1 和 PC2 的 PCA 图，用于 G15/14 个体成年雌性蠕虫基因表达，每种情况的椭圆为 95% 正态概率。从分析中删除了三个异常点（两个来自 STAT6 KO 条件，一个来自 WT）。E-F。分别对 G1 和 G15/14 的基因表达数据进行分层聚类。G-I。差异基因表达的火山图来自源自 G1 N 的蠕虫。在L4，D5或D7成年雌性阶段的WT或STAT6 KO小鼠的巴西感染。J.G15/14成年雌性WT或STAT6 KO小鼠适配N的差异基因表达结果火山图。来自通道宿主的巴西人;Log2FC > 2 或 < -2 表示显着性，调整后的 p < 0.05。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.g003
根据聚类模式，16,464 个蛋白质编码基因中只有 14 个在 G1 的 WT 和 STAT6 KO 宿主之间在 L4 阶段差异表达（图 3G）。到 G1 感染后第 5 天，在来自肠道的 D5 雌性蠕虫中鉴定出略多 （106） 个差异表达基因（图 3H）。在 WT 和 STAT6 KO 宿主之间观察到肺部（感染后 24 或 48 小时）或第 5 天成虫的 L4 期寄生虫负荷没有差异（S1 图）。在第 7 天成年雌性蠕虫中，差异表达的基因 （2,909） 要多得多，其中 97% 的基因 （2,815） 在 STAT6 KO 条件下下调（图 3I）。有趣的是，与 G15/14 宿主适应蠕虫相比，将亲本原种蠕虫引入 STAT6 KO 小鼠 （G1） 导致差异下调基因的数量是 12.7 倍（G1 中下调的基因为 2,815 个，而 G14 STAT6 KO 中下调的基因为 222 个;图 3I 和 3J）。令人惊讶的是，在显著上调或下调的基因（log2FoldChange > 2 或 < - 2 和 padj < 0.05）中，共享基因的数量是有限的，并且与偶然预期的重叠无法区分（S2A 图）。此外，虽然大多数基因在 G1 或 G15 适应蠕虫（1,004 个基因）的 STAT6 KO 条件下表现出一致的表达，但两个数据集之间有很大一部分不一致（330 个基因;S2B图）。这表明钩虫对小鼠 STAT6 驱动的免疫的转录反应在没有先前世代暴露于此类宿主的情况下更动态地改变。此外，钩虫在缺乏 STAT6 驱动的免疫反应的宿主中具有不同的转录谱，这早在感染后第 5 天就很明显，到第 7 天显示出对 STAT6 KO 宿主基因表达的整体抑制的偏向。
成虫期钩虫在没有 STAT6 驱动的免疫力的情况下表达不同的基因家族
为了进一步探索在WT与STAT6 KO宿主来源的蠕虫中差异表达的基因的功能作用，我们使用多个基因集术语数据库进行了基因集富集分析（GSEA）[42,43]，包括基因本体（GO）、生物学功能、细胞区室和分子功能术语、InterPro蛋白域名和eggNOG描述术语[44\u201246]].在 G1 感染（图 4A 和 S1 原始数据）和适应 （G15/14） 队列（图 4B 和 S2 原始数据）的 STAT6 KO 条件下（FDR 调整的 p 值< 0.05）中，许多感兴趣的基因集被鉴定为正富集或负富集。在G1或适应队列感染中，最突出的上调基因集是与胚胎发生和细胞分裂相关的基因集。来自STAT6 KO感染的G1蠕虫和G15/14适应蠕虫均富集表达GO项，包括细胞周期（GO：0007049）、基因沉默（GO：0016458）、减数分裂细胞周期（GO：0051312）和染色体（GO：0005694）;所有这些生物学注释都与线虫的胚胎发生有关[47]。这些基因集的富集与我们的数据一致，表明 N.当适应并衍生自 STAT6 KO 宿主时，brasiliensis 变得更有生育能力（图 4B）。
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图 4.
宿主 STAT6 免疫影响 N。巴西普通家族的基因表达。A-B.在基因集富集分析 （GSEA） 中鉴定的 WT- 或 STAT6 KO 衍生的成年第 7 天雌性蠕虫的选定上调和下调基因家族术语，来自 （A） 亲本 N 感染。brasiliensis stock，G1，或 （B） WT（第 15 代）或 STAT6 KO（第 14 代）适应 N。Brasiliensis种群。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.g004
STAT6 KO下调的基因集很有趣，因为我们假设其中许多基因集代表了对抗或逃避2型免疫反应的功能。在STAT6 KO环境中生长的蠕虫中，推测与免疫逃避相关的基因的表达可能受到抑制，有利于增加胚胎发生。事实上，在G1-（图4A和S1原始数据）或G15适应的N中，不同的功能基因集被下调。巴西蠕虫（图 4B 和 S2 原始数据）来源于 STAT6 KO 宿主相对于 WT 对照。许多在 G1 或适应 N 中功能相似。巴西人感染。最引人注目的是表明特定行为反应和肽酶产物下调的途径。FMRFamide 相关肽样 [IPR002544] 或神经肽信号转导 （GO：0007218） 在单代和适应的 N 中均强烈下调。来自STAT6 KO宿主的brasiliensis（图4，S3B和S3C）。这两个基因集都由编码FMRFamide样肽（FLPs）的基因组成，这些肽在线虫中高度保守，在自由生活线虫和寄生线虫中均表现出动态表达[48]，并已被证明可以控制觅食、寻找配偶的行为和避免有害刺激[49,50]。这些基因的下调与宿主内定向移动的需求减少一致，宿主缺乏导致蠕虫从黏膜组织中脱落的哭泣和扫荡反应[31,32,51,52]。在 WT 条件下富集的其他基因集家族表明对应激的反应增加，例如 G1 感染中的细胞色素 p450 和 G15/14 感染中的 HSP20 样伴侣。最后，在 G15/14 感染的 WT 条件下富集最多的基因类别包括编码蛋白酶的基因类别（木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶、阿斯塔辛、金属肽酶、天冬氨酸肽酶结构域超家族）、SCP/TAPS 蛋白和转甲状腺素蛋白样蛋白（图 4A 和 4B）。在寄生线虫的ESP中反复观察到蛋白酶、SCP/TAPS和转甲状腺素蛋白样蛋白，这些ESP通常被怀疑，或者在特定情况下已知会调节宿主免疫应答或参与宿主组织的迁移[2,39,40,53–55].当我们直接分析这些ESP样基因的相对表达时，我们发现它们在感染适应（G14）蠕虫的STAT6 KO条件下显着下调（图5A和5B）。然而，令我们惊讶的是，在亲本种群感染中，我们发现这些基因在D7成虫阶段略有上调，而在D5成虫阶段则呈最小趋势（图5C-5F）。此外，我们从WT或STAT6 KO适应蠕虫的成虫培养物中分离出上清液，这些蠕虫可能含有排泄/分泌产物（ESP和其他非蛋白质分子），并测试了它们从钩虫感染的WT小鼠的肠系膜淋巴结中引发细胞因子反应的能力。我们发现 STAT6 KO 适应蠕虫来源的上清液导致 IL-4 的产生减少，但不导致 IL-10 的产生减少（S5 图）。这表明 STAT6 KO 适应蠕虫产生的排泄/分泌产物免疫原性较低，可能具有降低的抗原多样性。
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图 5.
G14 STAT6 KO 适配 N.Brasiliensis 下调与 ESP 相关的基因类别。A-B.编码 WT 或 STAT6 KO 代 15/14 适应女性 N 的 ESP 相关基因类别的转录本的热图和 GSEA 富集图。巴西人来源于感染后第 7 天的传代宿主。C-F.编码 G1 N 成人期 ESP 相关基因类别的转录本的热图或 GSEA 富集图。WT或STAT6 KO小鼠的巴西感染，感染后第5天雌性蠕虫的（C-D）或感染后第7天的雌性蠕虫（E-F）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.g005
STAT6 KO 适应蠕虫从 WT 宿主引发更强的炎症免疫反应
鉴于与ESP相关的基因类别在STAT6 KO适应蠕虫中下调，可能对应于免疫调节蛋白的分泌减少，我们假设WT宿主可能对STAT6 KO适应蠕虫具有更强大的免疫力。为了测试这一点，我们用 STAT6 KO 或 WT 适应的蠕虫感染 WT 小鼠，并测定肠道引流肠系膜淋巴结的细胞含量以评估适应性免疫反应或腹膜灌洗液以评估局部诱导的先天反应通过流式细胞术（图 6A 和 S4）。用PMA刺激淋巴结分离的细胞，并通过流式细胞术测定细胞因子表达。对肠系膜淋巴结 （MLN） 细胞进行门控以识别淋巴样细胞，如辅助性 T 细胞、γδ T 细胞和 CD8 细胞毒性 T 细胞（图 6B 和 S4）。引人注目的是，我们发现感染STAT6 KO适应蠕虫的WT小鼠的免疫细胞比例和数量发生了巨大变化。在STAT6 KO感染条件下，MLN细胞总数显着增加（图6C），表明引发的免疫反应更强。这种反应的特征是肠系膜淋巴结内IL-13+和IL-33受体ST2+阳性Th2细胞的比例和数量增加（图6D-6G）。此外，STAT6 KO适应的蠕虫诱导IL-17+ γδT和IFNγ+ CD8+ T细胞的百分比和数量显着增加（图6H-6K）。因此，当用抗CD3 / CD28刺激时，从这些动物中分离的MLN比WT适应的蠕虫分泌更多的IFN-γ（S5图）。
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图 6.
STAT6 KO 适配 N.brasiliensis 引起更强的炎症性 WT 宿主免疫反应。肠系膜淋巴结数据（A-K） A.实验设计;WT 或 STAT6 KO（分别为 25 代或第 24 代）适应蠕虫感染 WT 小鼠，并在感染后第 8 天对肠系膜淋巴结的细胞进行流式细胞术。湾。门控策略。三.肠系膜淋巴结细胞总数。D-E.IL-13+ Th2 细胞的百分比和总细胞数。F-G.ST2+ Th2 细胞的百分比和总细胞数。H-I.IL-17+ γδT 细胞的百分比和总细胞数。J-K.肠系膜淋巴结中 IFNγ+ CD8+ T 细胞的百分比和总细胞数。来自腹膜腔 （L-T） 的数据。L.检测髓系细胞群的门控策略;由框框勾勒出的单元格类型。M-N。FcεR 阳性细胞的亲本群体百分比或总细胞数。O-P。亲本群体的百分比或巨噬细胞的总细胞数。Q-R。表达巨噬细胞的 Arg-1 的百分比或总细胞数。S-T.嗜酸性粒细胞或中性粒细胞的亲本群体百分比。每个点是一个重复鼠标，误差线是 SEM。 * p < 0.05 ** p < 0.01， *** p < 0.001， t检验。数据代表了 3 个独立实验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.g006
为了评估可能由细胞因子产生引起的局部髓系效应细胞，我们观察了腹膜腔的灌洗液（图6L）。我们发现 STAT6 KO N 中 FcεR 阳性细胞增加。巴西感染状况，表明可能与IgE抗体结合的细胞更多（图6M和6N）。我们还发现，在 STAT6 KO 适应的 N 中，总巨噬细胞和 2 型相关巨噬细胞群的代表性过高。巴西感染状况，后者表达精氨酸酶 1 （Arg1），一种已知的 M2 巨噬细胞标志物群体（图 6O–6R）。然而，我们没有看到粒细胞（如中性粒细胞和嗜酸性粒细胞）的增加（图6S和6T）。使用qPCR分析小肠组织杯状细胞（S6B-S6D图）或簇状细胞（S6E图）上皮细胞谱系标志物的长度（S6图）和mRNA转录水平的变化，未观察到差异。这表明 STAT6 KO 适应蠕虫引起的蠕虫保护效应反应具有一定的特异性。解决寄生虫负荷增加是否是导致对 STAT6 KO 适应的 N 的炎症反应增加的原因。巴西感染，我们运行了多个线性回归模型，将细胞数量与第 8 天的成年寄生虫负荷、AUC 或第 8 天的卵/克粪便进行比较。我们观察到组织收获时寄生虫负荷的任何测量值与免疫反应水平之间没有相关性，而先前的宿主选择基因型显着预测了免疫反应水平（S3原始数据）。此外，我们没有发现WT或STAT6 KO适应蠕虫之间成虫负荷或卵脱落的显着差异（S7图），这意味着免疫反应的增加与寄生虫负荷无关。然而，奇怪的是，在八次实验过程中，我们发现用STAT6 KO适应蠕虫感染WT小鼠导致宿主死亡率显着增加（S8图）。接下来，我们测试了单代先前暴露于 STAT6 KO 宿主是否足以诱导 N 免疫原性增加。通过比较感染亲本 N 的 WT 小鼠的髓系和淋巴细胞来巴西。在WT或STAT6 KO小鼠中传代的brasiliensis。我们发现，在 STAT6 KO 和 WT 条件下，肠系膜淋巴结在表达细胞因子 IL-13、IL-17 或 IFNγ 或 ST2 受体的细胞群的数量和比例上没有差异（S9B–S9J 图）。此外，先前测量的任何PEC髓系细胞群均未增加（S9K-S9P图），而寄生虫负荷相似（S9Q-S9S图），这表明需要不止一代先前的STAT6 KO宿主选择才能增加钩虫免疫原性。总的来说，这表明与WT适应的蠕虫相比，多代STAT6 KO适应的蠕虫已经失去了抑制宿主炎症反应的能力。这种炎症并不偏向于Th2免疫反应。
WT 和 STAT6 KO 适应钩虫在 WT 宿主中受到攻击时具有相当的生殖适应度测量
鉴于 STAT6 KO 适应的钩虫似乎会引起更强的宿主反应，我们假设如果将这种反应重新引入野生型宿主，将对蠕虫的整体适应性产生负面影响。先前的研究发现，虽然 N.巴西线虫是大鼠的天然线虫，经过短短6代的选择后，它可以适应在小鼠宿主中更好地生存[56\u201257]。我们推断，对 STAT6 KO 免疫缺陷宿主的适应 6 至 24 代对于它们在 WT 宿主中的生存是不适应的。为了测试这一点，我们使用与图6A类似的感染策略，在WT小鼠中挑战我们的适应系，并测量蠕虫存活率，繁殖力和转录谱（图7A）。与预期相反，我们发现 STAT6 KO 适应蠕虫在感染后第 5-8 天具有类似于 WT 适应蠕虫的脱卵模式，这在体外得到证实（图 7B-7D）。我们也没有发现存活率降低的证据，在第9天有类似的成年寄生虫负担（图7E）。这些结果在第 6 代至第 24 代之间进行了多次总结（S10 图）。我们测试了 STAT6 KO 适应蠕虫中其他表型是否减弱，发现蠕虫长度、血红蛋白或 ATP 水平没有差异（图 7F-7H）。数据表明，尽管 WT 宿主免疫反应增加，但 STAT6 KO 适应不会对适应的 N 的存活率或生育能力造成任何重大不利影响。感染 WT 宿主后的巴西人。氮的长度、ATP 和血红蛋白水平增加。在 STAT6 KO 宿主中观察到的巴西人即使暴露于完整的免疫环境中也不会持续存在。这表明 N.Brasiliensis 可能会经历快速的转录变化以适应新的宿主环境。
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图 7.
STAT6 KO 适配 N.当在WT小鼠中受到攻击时，巴西人不会表现出适应性减弱。一个。试验设计。在感染后第 7 天从 WT 宿主中分离出 WT（黑色）或 STAT6 KO（红色）适应的蠕虫，用于 RNA 测序或指示寄生虫学或形态学测量的时间点。使用单个雌性蠕虫进行mRNA测序。湾。第 13 代 WT 小鼠适应 N 的感染后天数每克粪便 （EPG） 卵的平均数和 SEM。brasiliensis （WT G13） 和第 12 代 STAT6 KO 小鼠适应 N。WT小鼠的brasiliensis（STAT6 G12）感染;每个条件重复 4 次。三.B的AUC由宿主适应类型划分。D.在液体培养基中离体孵育 25 小时后从单个成虫中释放的卵，在第 8 天从 WT 宿主中回收（G25/24 适应系）。E.来自适应性N感染的成虫。巴西在感染后第 9 天从 WT 宿主的肠道中恢复。六.每个适应的 N 的蜗杆长度。WT 暴露后的巴西 （G25/24）。G.感染后第 8 天通过传代条件（G15/14 适应系）测定 WT-小鼠感染的蠕虫血红蛋白浓度。H.感染后第 8 天来自 WT 来源的成虫的蠕虫-ATP 浓度，适应 （G24/25） N。巴西人。对于 C-H，绘制的数据包括单个值（圆圈）、平均值（条形）、SEM（误差条）、ns p 值> t 检验的 0.05。数据代表了8个（图7B和7C）或2个（图6D-6H）独立实验。I-K。感染后第 7 天个体 WT 或 STAT6 KO （G9/7） 适应 N 的 RNA-seq 数据。巴西人源自 WT 宿主感染。我。主成分 （PC） 1 和 PC2 的主成分分析 （PCA） 图，用于单个蠕虫基因表达，椭圆围绕每个宿主适应条件的 95% 正常概率。J.基因表达数据的分层聚类。K.差异基因表达结果的火山图;Log2FC > 2 或 < -2 表示显著性，调整后的 p 值< 0.05。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.g007
为了测试这一点，我们对每个队列（第 9 代用于先前的 WT 适应，或第 7 代用于先前的 STAT6 KO 适应）在 WT 宿主中感染后的单个成年雌性蠕虫的转录本进行了测序。我们发现，当它们遇到 WT 宿主环境时，先前的 STAT6 KO 或 WT 适应不会导致 PCA 或整个转录组表达的分层聚类（图 7I 和 7J），并且只有 7 个差异表达的基因（图 7K）。有趣的是，在差异表达的基因中，有三个含有信号肽基序（S4原始数据），表明它们可能被释放到宿主环境中。下调最深的基因编码一种 astacin 蛋白;astacins在成虫期蠕虫的ES中高度表达[58]，这增加了WT和STAT6 KO适应蠕虫之间这些少数转录差异可能影响宿主的可能性。然而，基因集富集分析显示，总体而言，ESP相关基因的表达在STAT6 KO适应蠕虫中没有改变（S11图）。为了更好地可视化条件之间的差异，根据PC1和PC2的95%内百分位范围之外，并且对热图中的行z分数分布有很大影响，从分析中排除了三个异常值样本（S12图）。排除它们不会影响我们的总体结论。这些数据表明，尽管 STAT6 KO 适应的 N 的转录组和适应性表型发生了巨大变化。在其传代宿主中，在7-9代内，这种蠕虫在重新暴露于这种免疫功能正常的环境时恢复到可能适合WT宿主的转录状态。
讨论
本研究调查了缺乏 STAT6 依赖性免疫反应的宿主环境是否会对钩虫寄生虫的适应性产生负面影响，一旦它们被重新引入具有完整免疫环境的宿主。我们的研究结果表明，尽管STAT6免疫力对钩虫施加压力以适应性地抑制其免疫原性，但钩虫可以迅速恢复以前在免疫功能正常宿主中单代时间内丢失的大多数生物学特征。已知蠕虫物种会发生宿主适应，但宿主免疫的特定分支是否负责尚未得到解决。这项工作表明，STAT6驱动的免疫反应的丧失增加了钩虫的大小和繁殖量，并显着改变了这些寄生虫的转录谱，最早在感染后第5天。然而，奇怪的是，在观察到ESP相关基因的表达减少之前，需要对STAT6 KO环境进行多代适应，这表明钩虫在反复暴露于免疫缺陷宿主时会继续发生变化。有趣的是，我们的数据显示，钩虫基因表达在STAT6 KO宿主中初始停留时会动态降低，但多代暴露导致与宿主免疫调节更相关的基因下调。因此，用 STAT6 KO 适应的蠕虫攻击免疫功能正常的宿主会引起比正常人更大的炎症反应（图 8）。即便如此，当将 STAT6 KO 适应的蠕虫重新引入免疫功能正常的宿主中进行单代时，会迅速恢复其大部分 WT 宿主转录谱。在缺乏 STAT6 的情况下增加的大小和繁殖力等表型性状在存在 2 型免疫的情况下会迅速逆转（图 8）。总而言之，这些数据突出了钩虫对其宿主的多功能适应性，除了已知的基因组位点突变外，这可能是寄生线虫产生耐药性的另一种机制[59\u201262]。
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图 8.
图形摘要。由于 STAT6 免疫反应，WT 宿主环境中适应的钩虫（左上框）阻碍了生存和繁殖力。作为反应，蠕虫产生排泄和分泌产物 （E/S），这可能会抑制 STAT6 驱动的免疫力。适应缺乏 STAT6 免疫力的宿主的蠕虫（左下框）更大，产卵更多，并且 E/S 产量减少。当适应蠕虫的后代感染WT宿主（右框）时，它们会恢复到相似的大小，卵脱落和E/S的产生。然而，来自 STAT6 KO 适应蠕虫的后代在 WT 宿主中引发了更强的免疫反应。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.g008
肠道中的成虫位于免疫介导的排出和抑制摄食活动的微环境中，这与肺部环境中的L4不同，L4受到幼虫的杀伤和诱捕。STAT6驱动的关键肺免疫应答包括M2巨噬细胞捕获幼虫，而肠道效应应答主要取决于上皮细胞效应分子[29,63]。因此，根据不同的生命周期阶段，宿主选择压力存在明显差异。通过这项研究和其他研究，很明显，对抗免疫宿主免疫反应的寄生虫内在因素在肺和肠道阶段之间有很大不同[58]。先前的研究结果和我们的数据表明，STAT6和IL-4R驱动的免疫会影响肠道驻留的成虫阶段的寄生虫，但不会影响驻留于肺部的幼虫阶段蠕虫（S1图）[30]。我们的RNA-seq数据进一步支持了这一假设，表明来自STAT6 KO或WT宿主的L4期幼虫在转录上是无法区分的。这与 STAT6 依赖性反应对肺寄生虫的最小影响一致。此外，幼虫在肺部微环境中停留的时间很短，表明寄生虫没有足够的时间来感知和适应性地反应WT和STAT6缺陷宿主之间免疫肺免疫反应的潜在差异。与幼虫通过肺部的短暂迁移不同，成熟的钩虫物种在肠道中停留数天，在此期间，死亡的成虫进行有性繁殖并产卵。成虫可能比幼虫阶段分泌更多的免疫调节化合物，因为前者在一个器官系统中的停留时间更长，并且具有更大的已知ESP库[58]。先前对另一种蠕虫物种 S. 的研究。Ratti发现，与在感染早期选择的后代相比，从感染晚期蠕虫中选择的后代在免疫宿主的“敌对”环境中存活的时间更长[15]。这项研究的广泛意义是，蠕虫的生存性状不断受到免疫施加的宿主选择压力;然而，它不排除影响免疫反应的其他因素（例如，微生物群、代谢状态、营养状况）。我们目前采用遗传定义的宿主免疫环境的工作显示了它如何影响寄生虫形态、生理学、繁殖力和转录调控。
STAT6是蠕虫感染期间建立和维持2型免疫优势所必需的典型转录因子之一[28,64,65]。STAT6激活发生在1型或2型IL-4受体的下游，这些受体分别与IL-4或IL-4/IL-13结合[66]。大量研究表明，宿主中这种信号通路的缺失会导致胃肠道钩虫负荷增加[27,30]。2 型免疫对胃肠道中成虫钩虫生殖健康的影响可能是由于杯状和簇状细胞扩增，它们都依赖于 STAT6 驱动的免疫。胃肠道中的杯状细胞分泌粘蛋白，这被认为有助于将蠕虫从其摄食生态位中驱逐出去。此外，杯状细胞衍生因子（如RELMβ）被认为通过直接结合蠕虫来抑制摄食行为[31]。在转录上，WT宿主中的蠕虫表达更多的热休克蛋白，这表明应激反应[67]和神经肽，这表明逃避潜在的有害免疫因子[50]。我们的表型和转录组学研究结果支持这样一种观点，即 STAT6 驱动的免疫不仅将蠕虫从其生态位中驱逐出去，而且还会降低单个成年雌性蠕虫的大小、摄食能力和繁殖力。在2型免疫应答期间，激活胃肠道ILC2的化学感觉簇状细胞也以STAT6或IL-4R依赖性方式高度扩增[68\u201270]。这些特化的上皮细胞负责感知蠕虫的存在，可能是通过检测蠕虫产生的代谢物[71]。我们的研究发现，在 STAT6 KO 环境中进行选择后，钩虫减少了在 ESP 中观察到的基因家族的转录，同时引发了 WT 宿主更强的免疫反应。有趣的是，这种增加的WT宿主免疫反应并没有表现出簇状细胞或杯状细胞的增加，蠕虫的适应性也没有明显受到影响。鉴于对钩虫的保护性免疫取决于簇状细胞的扩增和驱动ILC2保护性反应的活性[69]，STAT6 KO适应钩虫中ESP相关基因类别的表达减少可能是簇状细胞反应减少的结果。正在进行的实验试图通过质谱法进一步表征WT与STAT6 KO适应蠕虫的ESP差异，并解决这些不同的ESP谱是否改变了免疫原性。
2型免疫的一个特点是尽量减少1型炎症反应的产生，如果不加以控制，对宿主有害[16,72]。有证据表明，组织损伤和钩虫排泄/分泌产物都需要引起适当的2型免疫应答[73]，而单独排泄/分泌产物可以促进抗炎和免疫抑制反应[54,55]。抑制炎症的机制多种多样，包括促进Treg增殖[74]、直接抑制中性粒细胞[75]和巨噬细胞[76]、在进食过程中拮抗宿主凝集素[77]以及通过miRNA沉默[54]。我们的研究结果与抑制2型免疫的感知和/或扩增的能力改变一致，或者可能抑制M2巨噬细胞的分化。我们的数据表明，前几代的免疫状态可以决定钩虫从宿主那里引发的炎症反应。此外，我们的研究结果表明，钩虫以某种方式主动感知宿主的免疫反应，并以前几代暴露于宿主免疫的方式调整ESP相关基因表达。
有趣的是，我们的WT-宿主攻击数据与先前的研究不一致，这些研究发现其他寄生蠕虫在免疫选择后变得更健康[15,78]。这些发现令人费解，因为人们会期望更强的免疫反应至少会削弱寄生虫的存活率，如果不是繁殖力的话。事实上，我们发现 STAT6 KO 适应蠕虫感染会增加宿主死亡率（S8 图）。鉴于过度的免疫活动会伤害宿主，如果宿主死亡，这会对寄生虫的适应性产生负面影响，我们的结果与选择具有宿主保护作用的免疫抑制性状一致。
我们的基因表达数据显示，WT 和 STAT6 KO 适应蠕虫在其传代宿主内存在显着差异，当第 7 代 STAT6 KO 蠕虫原液重新引入 WT 宿主环境时，这种差异在很大程度上消失了。重新引入后，我们发现 STAT6 KO 适应的蠕虫与 WT 在全球范围内无法区分，先前被抑制的途径恢复了。我们还发现，亲本（WT大鼠维持）N.brasiliensis 在暴露于 STAT6 KO 宿主（G1 感染）后显着改变了其转录谱。这表明大多数观察到的转录差异是短暂的和宿主环境特异性的。然而，要得出结论，这种特定的转录谱适合免疫缺陷与足够的环境，需要进一步的实验，例如检查暴露于具有增强的 STAT6 驱动免疫的宿主的蠕虫的基因同一性和表达幅度，就像在继发感染攻击中一样。这一发现与STAT6 KO适应蠕虫在25代选择后引发更强的WT宿主免疫反应的观察结果有些不协调，因为人们可能会期望WT宿主内的基因表达谱发生更戏剧性的变化。然而，相关的转录差异可能仅在第 7 代之后出现或发生在早期发育阶段;或者，观察到的增强宿主免疫反应可能是由于 STAT6 KO 适应蠕虫中只有少数基因的表达改变，而不是广泛的基因家族。事实上，我们发现STAT6 KO适应蠕虫中Astacin-metallopeptidase蛋白的表达大幅降低，这可能表明这种分泌丰富的蛋白质具有新的免疫抑制功能[79]。
我们研究的一些局限性如下。初始 （G1） 与适应 （G9/7， 15/14） 的 RNA 测序在不同机构内进行;因此，动物设施、寄生虫种群和测序批次效应等因素可能会影响观察到的差异。其次，我们适应的队列不是通过实验重复完成的。此外，每一代传代的蠕虫数量在1,000-1,500个传染性幼虫之间，分布在2-3个宿主上;因此，我们归因于免疫选择压力的差异可能是由于瓶颈或其他随机效应而产生的。最后，虽然已经确定 N.在WT大鼠中维持的巴西虫增加了STAT6 KO宿主的负担，我们只在它们暴露于STAT6 KO环境多代后测试了额外的寄生虫测量值（如大小，ATP含量和血红蛋白含量）;因此，我们不知道这些特征在选择过程中出现的时间有多早，尽管我们已经提供了以所执行的方式进行研究的基本原理。
我们的研究结果进一步证实了哺乳动物钩虫的独特适应性，并可能支持基于蠕虫适应的人类钩虫负担随年龄增长的机制。在鉴定神经肽信号传导、蛋白酶、SCP/TAPS 蛋白和转甲状腺素蛋白样蛋白等宿主免疫改变通路时，本研究深入了解了响应宿主免疫丧失的最动态调节机制。未来的研究将探讨钩虫在具有增强的 STAT6 驱动免疫的宿主中的传代（即通过外源性 IL-4 处理宿主）是否进一步增加高于 WT 宿主的 ESP 表达。鉴定这些ESPs可以为针对成虫阶段蠕虫的药物或疫苗提供重要的靶点，并为进一步研究寄生线虫的适应机制奠定基础。
材料与方法
道德声明
所有涉及动物的程序均已获得宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准（协议 805911），并符合美国兽医协会 （AVMA） 指南。小鼠在加州大学河滨分校的类似屏障设施中饲养。所有涉及动物的程序均已获得加州大学河滨分校 IACUC 的批准（协议 20210017），并符合 AVMA 指南。
小鼠品系
用于N传代的小鼠品系。brasiliensis 和 N. 的测量。宾夕法尼亚大学保留了巴西寄生虫学特征。B6.129S2（C）-Stat6tm1格鲁/J小鼠 （STAT6 KO） 和野生型 C57BL/6J 小鼠 （WT） 是从我们殖民地培育的杰克逊实验室获得的，并饲养在不含其他病原体的屏障设施中。雌性大鼠是从Wistar购买的，并被安置在同一设施的一个单独的房间里。来自与上述相同的Jackson实验室菌株的小鼠用于单代（G1）感染的WT或STAT6 KO小鼠的测序。
巴西奈瑟菌（N. brasiliensis）系列传代和维护
使用野生型Wistar大鼠中维持的巴西奈瑟菌通过皮下注射500只传染性幼虫期蠕虫（iL3）、3只WT或3只STAT6 KO小鼠进行感染，以产生第一代和后续代传代小鼠。WT 传代蠕虫比 STAT6 KO 传代蠕虫早一代启动。从感染后第 6 天至第 7 天过夜收集的受感染 WT 或 STAT6 KO 小鼠的粪便进行蠕虫培养，为任一组制作单培养板。如前所述，用木炭和泥炭藓的混合物制成培养物[18]。随后将 2-3 周龄蠕虫培养板的 iL3 传代到 2-5 个宿主中，并且雄性和雌性之间的传代宿主性别交替进行。传代宿主在感染时为 5-10 周龄。G1蠕虫在UCR的传代是在从Taconic购买的雌性Sprague-Dawley大鼠中，遵循与上述相同的方法。
成虫阶段蠕虫检测
如前所述[8]，将小肠从十二指肠解剖到回肠，纵向切割，并将组织放在改良的Baerman装置上，在PBS烧杯上衬有两层纱布，并在37°C下孵育2-3小时，从单个宿主小肠中分离出成虫期蠕虫。 将沉淀在烧杯底部的蠕虫转移到培养皿中，并通过移液管在解剖显微镜下单独转移以进行评估。蠕虫性别是通过区分形态特征在视觉上确定的[18]：尾巴呈扇形、体型较小的个体为成熟雄性，而体型较大、色素沉着较深、尾巴呈尖钩状的个体为成熟雌性。通过将每次测量的 10 个成年期男性或女性分离到 1.5 mL Eppendorf 管中，用去离子水洗涤蠕虫一次，用 PBS 洗涤 3 次，留下 50 μL 体积来测量蠕虫血红蛋白含量。用塑料研钵匀浆蠕虫，并根据制造商的建议立即使用比色血红蛋白测定试剂盒（Sigma-Aldrich，MAK115）评估血红蛋白浓度。如前所述测量蠕虫ATP含量[63]，每次测量使用10条蠕虫（活的或通过煮沸10分钟热杀灭）。
成像时，分离活成虫，在PBS中洗涤3X，重悬于25mM叠氮化钠PBS中，并用琼脂糖垫固定在载玻片上，如前所述[80]。在徕卡DM6000B宽视场显微镜上使用徕卡DMC-2900彩色相机以10倍放大倍率对蠕虫进行成像。对于不适合单个图像场的蠕虫，使用图像平铺和拼接功能来捕获蠕虫的全长。图像以Z轴堆栈的形式采集，并使用徕卡LAS X软件中的扩展景深功能进行处理。为了测量蠕虫长度，将图像导出为带有比例尺的tiff图像，用于在MetaMorph图像分析软件中创建适当的像素到微米转换校准。长度是通过使用 MetaMorph 中的校准线工具跟踪蠕虫并使用一系列连接的短直线段近似曲线来测量的。
从成虫阶段的蠕虫中分离出的排泄物和分泌产物如下。在感染后第 7 天选择 25 或 24 代后，从 WT 或 STAT6 KO 宿主的小肠中分离蠕虫 将 500-1000 条混合性蠕虫分离到 PBS 中，在无菌 PBS 5X 中洗涤，然后在无血清 RPMI 中与青霉素-链霉素 （1 mg/mL） 和庆大霉素 （0.5 mg/mL） 以及 10% 真菌素在 37°C 下孵育 30 分钟， 然后用蠕虫培养基（含 1% 葡萄糖的 RPMI、青霉素-链霉素 （100 μg/mL）、庆大霉素 （50 μg/mL） 和 1% 真菌酮）洗涤 3 次。蠕虫在 37°C 下孵育，25 小时后丢弃并更换一半的上清液，3 天后收集培养基上清液。使用 BCA 测定法定量蛋白质，并使用 10 μg/mL 刺激细胞。
N. 的 mRNA 测序。巴西人
对于 WT- 或 STAT6-KO 适配 N。巴西人（来自WT攻击感染的G9/7或来自传代宿主的G15/14），RNA分离和测序在宾夕法尼亚大学病理生物学设施系进行，如下所示。针对每种情况，从单个宿主中分离出成虫阶段的蠕虫，并用无菌 PBS 洗涤 5 次。通过移液管将单个蠕虫转移到无菌管中并快速冷冻。然后解冻分离物并用研杵匀浆。采用三唑苯酚-氯仿法提取RNA。使用高灵敏度 RNA TapeStation （Agilent， 5067–5579） 分析 RNA 完整性，包括 RIN 值为 7 或更高的样品进行测序。RNA浓度通过量子比特（Invitrogen，Q32852）测定。使用 mRNA SMART-seq HT 试剂盒（Takara，634437）从每个样品 1 ng RNA 制备文库。使用Nextseq 550 （Illumina）对文库进行测序，WT攻击RNA-seq为单读长75个循环（图7），或NextSeq 2000 （Illumina），单读长100个循环，用于传代内宿主RNA-seq（图3和图4）。每个样本至少获得 2000 万个原始读数。
对于WT或STAT6 KO小鼠的单代（G1）感染，在加州大学河滨分校从每种条件下的3个宿主中收获寄生虫。如前所述，分离出单个肺期L4蠕虫[81]。通过解剖宿主的整个小肠并将其放入装有PBS的培养皿中，分离出单个D5和D7成虫阶段的雌性蠕虫。在37度下孵育约两个小时后，从肠道组织中手动挑选成虫，评估性别，并放入PBS中。
在5倍解剖显微镜下根据形态学特征确定蠕虫性别;雌性与雄性的区别在于外阴和卵子的存在以及没有交配滑囊。然后如前所述，从单个蠕虫中分离RNA[82]。使用Nextera DNA Flex文库制备试剂盒（Illumina，#20018704）制备mRNA文库，并在NovaSeq 6000上使用S1 50 bp双端读长进行测序，每个样本的深度为10-6000万个配对读长。
mRNA-seq分析
对于RNA-seq分析，我们使用了来自改进的N基因组组装的蛋白质编码基因集。巴西菌株MIMR（GenBank登录GCA_030553155.1）。用Raven组装纳米孔测序读数[83];重叠群用Nanopore读长和racon纠错[84]，然后用Illumina读长和POLCA[85]纠错;染色体用Omni-C读段和3d-DNA支架[86];用BRAKER2[87]和TSEBRA[88]预测蛋白质编码基因;用InterProScan[89]和EnTAP [90]注释蛋白质编码基因。该基因组的完整生物学分析将在其他地方发表。
使用Trimmomatic v. 0.39 [91]对原始测序读长进行修整，以去除低质量或包含适配器的序列，设置如下：LEADING：3 TRAILING：3 SLIDINGWINDOW：4：15 MINLEN：36。然后，将来自修剪读段的 K-mer 与源自 N 的编码 DNA 序列 （CDS） 对齐。使用Kallisto K-Mer假对齐仪对巴西新组装的参考基因组（PRJNA994163，GCA_030553155.1），G15/14和G9/7感染的设置如下：-b 100—单-l 100，G1感染的设置如下：-b 100[92]。使用tximport [93]将伪计数数据导入R，过滤以保留5个或更多样本的表达值大于0的基因，使用edgeR [94]进行归一化和缩放以获得百万计数（CPM）值，这些值用于使用prcomp函数进行的主成分分析，并在R中使用ggbiplot绘制[95]。使用DESeq2[96]和DESeqDataSetFromTximport函数从原始计数数据中鉴定差异表达基因。使用heatmap2 R包绘制基于CPM值的row-z分数的热图，并使用ggplot生成火山图。使用GSEA软件对CPM值进行基因集富集分析（GSEA）[42\u201243]。先前从成人 N 期鉴定的肽的基因同一性。使用BlastP搜索肽序列与预测的N进行鉴定，在培养物中分泌的brasiliensis[58]。巴西蛋白序列[97,98]。
宿主免疫分析
来自感染 WT 或 STAT6 KO 适应 N 的 WT 小鼠的细胞。从用 5-7 mL 无菌 PBS 洗涤的肠系膜淋巴结 （MLN） 或腹膜渗出物 （PEC） 液中分离出巴西人。对MLN进行机械破碎、过滤并生成细胞悬液。PEC 染色以使用 S1 表中列出的抗体评估髓系细胞群。用含有 Brefeldin A 的细胞活化混合物 （Biolegend， Cat#. 423304） 刺激 MLN 细胞 5–6 小时，然后使用 LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒进行活死染色，激发波长为 405 nm （ThermoFisher， Cat#.L34966），对淋巴细胞群进行表面染色，然后用 eBioscience Foxp3 / 转录因子染色缓冲液组 （ThermoFisher， Cat# 00-5523-00） 进行固定和透化。接下来，使用 S1 表中列出的抗体进行细胞内染色以产生细胞因子。髓样细胞在表面染色前未受到刺激。使用Symphony A3 Lite（BD Biosciences）采集样品，并使用Flowjo软件进行分析。6×106MLNs细胞也与CD3/CD28抗体孵育48小时，收集上清液进行ELISA（Invitrogen）检测细胞因子。
统计分析
除非另有说明，否则所有绘图和统计测试均在Graphpad Prism（v9）中运行。数据呈正态分布，因此使用参数统计检验，对两组以上进行事后检验。显著性设定为p < 0.05。
支持信息
WT与STAT6 KO小鼠感染WT大鼠的早期感染蠕虫负荷维持亲本N。巴西人。
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S1 图。 WT与STAT6 KO小鼠感染WT大鼠的早期感染蠕虫负荷维持亲本N。巴西人。
一个。试验设计。湾。感染后 24 小时、48 小时或 5 天后肺部寄生虫的数量。三.感染后 48 小时或 5 天后肠道中的寄生虫数量。每个点是一个重复鼠标，误差线是 SEM。 ns p 值> 0.05，通过 t 检验。数据代表 1 个独立实验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s001
（TIF）
S2 图。 适应性 （G15/14） 与 G1 成年雌性 N 中差异表达基因的比较。来自 STAT6 与 WT 主机的 brasiliensis。
一个。STAT6 KO 与 WT 宿主条件的显着向上 （Log2FoldChange > 2） 与向下 （Log2FoldChange < -2） 调控基因的维恩图（对于两者，调整后的 p < 0.05）。湾。在单代 N 中，所有 STAT6 KO 与 WT 宿主条件 Log2（FoldChange） 值的散点图，根据调整后的 p 值 0.05 <过滤。巴西感染，（G1）（y 轴）与适应 N。brasiliensis （G15/14） （x轴）。值表示每个象限中的基因数量。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s002
（TIF）
S3 图。
第 5 天雌性 WT 与感染亲本 N 后代的 STAT6 KO 宿主感兴趣的基因集的热图。brasiliensis （G1），B. G1 的第 7 天雌性，或 C. 第 7 天来自 WT 或 STAT6 KO 的雌性蠕虫感染了 G15 或 14 适应的 N。巴西人。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s003
（TIF）
S4 图。 流式细胞术的代表性设门图。
A.从腹膜细胞中检测淋巴细胞群的门控策略。B.用于检测肠系膜淋巴结骨髓细胞群的门控策略。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s004
（TIF）
S5 图。 从成年 STAT6 KO 适应蠕虫的排泄产物具有降低的免疫原性。
使用 WT 或 STAT6 KO 适应 （G24/23） 巴西奈瑟菌 3 天培养物的上清液刺激感染后第 8 天感染 WT 或 STAT6 KO 适应 （G25/24） 巴西奈瑟菌的 WT 小鼠收集的肠系膜淋巴结细胞。 A.上清液中IL-4的浓度。B.上清液中IL-10的浓度。P 值来自配对 t 检验。C.每个感染宿主（圆圈）的抗CD3 / 28刺激后测量的IFNγ浓度，带有SEM误差条。p 值< t 检验为 0.001。数据代表了 2 个独立实验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s005
（TIF）
S6 图。 感染 WT 或 STAT6 KO 适应的 N 后 WT 小鼠的肠道测量。巴西人。
A.肠的长度。B-E.RT-qPCR表达相对于GAPDH。圆圈是个体感染宿主，条形是平均值，ns p 值> t 检验为 0.05。数据代表 1 个独立实验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s006
（TIF）
S7 图。 与感染 WT 或 STAT6 KO 适应 N 的 WT 小鼠相关的寄生虫学。brasiliensis （G25/24） 图 6.
一个。感染后天数每克粪便的平均鸡蛋数，带有 SEM 误差线。湾。以 AC 绘制的数据曲线下的平均面积。 感染后第 8 天小肠中的成虫数量。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s007
（TIF）
S8 图。 WT 宿主存活率随着 STAT6 KO 适应的 N 而降低。巴西人感染。
一个。感染 WT 适应或 STAT6 KO 适应蠕虫的 WT 宿主感染后天数的平均宿主存活率曲线。来自 9 个独立实验的组合数据，每种条件 49 只小鼠，Mantel-Cox 检验 p 值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s008
（TIF）
S9 图。 巴西奈瑟菌暴露于上一代 STAT6 KO 宿主不会引起更强的炎症性 WT 宿主免疫反应。
肠系膜淋巴结数据（A-J） A.实验设计;亲本蠕虫感染WT或STAT6 KO小鼠，并由此产生的后代（G1适应）感染WT小鼠。在感染后第 8 天对肠系膜淋巴结的细胞进行流式细胞术。湾。肠系膜淋巴结细胞总数。C-D.IL-13+ Th2 细胞的百分比和总细胞数。E-F。ST2+ Th2 细胞的百分比和总细胞数。G-H.IL-17+ γδT 细胞的百分比和总细胞数。I-J.肠系膜淋巴结中 IFNγ+ CD8+ T 细胞的百分比和总细胞数。来自腹膜腔 （K-P） 的数据。K-L。亲本群体的百分比或巨噬细胞的总细胞数。M-N。表达巨噬细胞的 Arg-1 的百分比或总细胞数。O-P。嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的父母群体百分比。问。感染后每天每克粪便 （EPG） 的虫卵数的寄生虫负担。R.曲线下面积。S.感染后第 8 天来自宿主小肠的蠕虫数量。每个点是一个重复鼠标，误差线是 SEM。 * p < 0.05 ** p < 0.01， *** p < 0.001， t检验。数据代表 1 个独立实验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s009
（TIF）
S10 图。 使用 WT 或 STAT6 KO 适应蠕虫的所有 WT 挑战实验的总结。
空调。感染 STAT6 KO 或 WT 适应 N 的 WT 小鼠感染后几天每克粪便 （EPG） 的卵图。巴西人从初始接种数量中存活的成虫百分比如下所示。小鼠的适应代数和性别在上图的 STAT6 KO/WT 小鼠中表示为世代。收集的数据直到感染后第 9 天 （A）、第 8 天 （B） 或第 7 天 （C）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s010
（TIF）
S11 图例. WT小鼠感染后第7天，WT或STAT6 KO（G 9/7）适应了来自肠道的雌性蠕虫的基因表达数据的热图。
一个。编码成人阶段 ESP 相关基因类别的基因的热图和 GSEA 富集图。湾。染色体、基因沉默或FMRFamide样家族中基因表达的热图。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s011
（TIF）
S12 图。 WT小鼠感染后第7天，WT或STAT6 KO（G 9/7）适应来自肠道的雌性蠕虫的基因表达数据，包括异常值样本（用*表示）。
一个。PCA图。湾。分层聚类。三.差异基因表达结果的火山图;Log2FC > 2 或 < -2 表示显著性，调整后的 p 值< 0.05。D.编码成人阶段 ESP 相关基因类别的基因的热图和 GSEA 富集图。E.染色体、基因沉默或FMRFamide样家族中基因表达的热图。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s012
（TIF）
S1 表。 关键试剂的扩展列表。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s013
（文件）
S1 原始数据。 来自 WT 或 STAT6 KO 小鼠的 G1 天 7 成虫的完整 GSEA 结果。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s014
（XLSX）
S2 原始数据。 来自 WT 或 STAT6 KO 小鼠的 G15/14 适应第 7 天成虫的完整 GSEA 结果。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s015
（XLSX）
S3 原始数据。 感染 WT 或 STAT6 KO G15/14 适应 N 的 WT 小鼠宿主免疫细胞群与钩虫适应基因型和钩虫负荷的回归分析摘要。巴西人。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s016
（XLSX）
S4 原始数据。 来自 WT 或 STAT6 KO 小鼠的 G1 天 5 成虫的完整 GSEA 结果。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011797.s017
（XLSX）
确认
我们感谢 Boris Streipen 博士和 Dustin Brisson 博士对代际实验结果解释的意见，以及宾夕法尼亚兽医成像核心的 Gordon Ruthel 博士对 N 的成像和大小分析的指导。Brasiliensis 蠕虫品系。我们还要感谢 Daniel Beiting 博士和 Clara Malekshahi 使用他们的测序设备和 Linux 计算集群。
WEHI感谢维多利亚州政府运营基础设施支持和澳大利亚政府国家卫生和医学研究委员会独立研究所基础设施支持计划。
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