免费医学论文发表-9抑制性 ART 期间的瞬时 CD4 T 细胞耗竭减少了人源化小鼠的 HIV 储存库+

抽象

HIV感染者需要终身治疗，因为目前的抗逆转录病毒疗法（ART）并不能根除HIV感染。潜伏感染的细胞与未感染的细胞基本上无法区分，并且不能通过目前可用的方法耗尽。这项研究评估了抗体介导的瞬时 CD4 T 细胞耗竭作为减少潜伏 HIV 储存库的策略。抗CD4抗体有效地耗尽了人源化小鼠外周血和组织中的CD4 T细胞。然后，我们证明，在抗CD4抗体治疗过程中，HIV感染的ART抑制动物的抗体介导的CD4 T细胞耗竭导致外周血细胞中细胞相关病毒RNA和DNA水平的显着降低。在停止抗体治疗 26 天后，除肺外，所有分析组织中均观察到 CD4 T 细胞的恢复。CD4 T 细胞回收后，在抗 CD4 抗体处理的动物组织中检测到细胞相关病毒 RNA 和 DNA 水平显着降低。此外，与对照组相比，在抗CD4抗体治疗的动物中观察到完整HIV前病毒DNA水平降低8.5倍，潜伏感染细胞数量减少3.1倍。然而，与对照组相比，在CD4 T细胞恢复后，抗CD4抗体治疗的动物中停止ART时，病毒反弹没有延迟。我们的结果表明，在抑制性 ART 期间，短暂的 CD4 T 细胞耗竭（一种可能具有可接受安全性的长期临床干预措施）可以减少人源化小鼠中 HIV 储存库的大小。+++++++

作者摘要

目前的长期抗逆转录病毒疗法并不能根除潜伏感染HIV的细胞。潜伏HIV感染的细胞基本上无法与未感染的细胞区分开来，并且不能轻易被目前可用的策略靶向。CD4 T细胞是特征最明确和最大的HIV病毒库。抗 CD4 抗体介导的 CD4 T 细胞耗竭已被证明在人类中是可逆的且耐受性良好。在这项研究中，我们评估了用抗 CD4 抗体瞬时耗竭人 CD4 T 细胞对 HIV 感染的 ART 抑制人源化小鼠 HIV 储存库大小的影响。人源化小鼠外周血和组织中的CD4 T细胞被有效耗尽。重要的是，与未处理的对照组相比，在CD4 T细胞回收后，抗CD4抗体治疗的动物的HIV储存库大小显着减小。+++++

数字

Fig 4Fig 5图1图2图3Fig 4Fig 5图1图2图3

引文： Ling L， De C， Spagnuolo RA， Begum N， Falcinelli SD， Archin NM， et al. （2023） 抑制性 ART 期间的瞬时 CD4 T 细胞耗竭减少了人源化小鼠的 HIV 储存库。PLoS 病理学 19（12）： e1011824 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011824+

编辑 器： Daniel C. Douek，美国疫苗研究中心

收到： 2023年9月21日;接受： 2023年11月14日;发表： 12月 6， 2023

版权所有： ? 2023 Ling et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有数据均在手稿和/或支持信息文件中。

资金： 这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款UM1-AI-164567（D，M.M.），P30AI050410（D，M.M.），F30 AI145588（SDF）的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。

介绍

目前的抗逆转录病毒疗法（ART）可以有效地将HIV复制抑制到无法检测到的水平。然而，抗逆转录病毒疗法只能抑制新一轮的病毒复制。它不能根除由感染细胞组成的HIV病毒库，这些细胞中不同比例的细胞具有复制能力，完整的病毒基因组，目前的方法不容易靶向特异性耗竭[1,2]。停用抗逆转录病毒治疗不可避免地会导致病毒血症在几周或几个月内反弹，需要终生治疗。

诱导病毒库抗原表达并伴随免疫增强已成为耗尽病毒库的主要策略[3\u20128]。虽然在临床试验中，几种病毒再激活策略已被证明具有良好的耐受性，并导致病毒转录增加，但没有一种策略被证明能有效减少病毒库的大小[3–8]。

虽然进一步的研究可能会提高病毒抗原诱导和清除方法的功效，但储存库耗尽的潜在替代策略是直接靶向宿主 CD4 T 细胞。与正在开发的抗 HIV 广泛中和抗体 （bNAb） 和其他 HIV 靶向免疫疗法不同，抗 CD4 抗体介导的 CD4 T 细胞耗竭不需要诱导病毒抗原表达。抗CD4抗体治疗已在临床试验中用于治疗各种人类疾病;其中CD4 T细胞的耗竭是可逆的，耐受性良好，通常没有免疫抑制的临床证据[9–12]。+++

抗CD4抗体介导的CD4 T细胞耗竭用于研究CD4 T细胞在SIV感染和发病机制中的作用[13\u201216]。CD4 T细胞耗竭通过改变病毒嗜性增强巨噬细胞和小胶质细胞中SIV的感染[15]。CD4 T细胞有助于未经治疗的SIV感染恒河猴病毒血症高峰后下降[16]。抗体介导的CD4 T细胞耗竭诱导抗逆转录病毒抑制、SIV感染的猕猴体内稳态CD4 T细胞增殖，但未检测到病毒再激活[14]。++++++

本文的结果表明，通过被动输注抗人CD4抗体，人源化小鼠的外周血和组织中的人CD4 T细胞被有效耗尽。重要的是，CD4 T细胞的水平在停止抗体治疗后大幅恢复。与对照组相比，在CD4 T细胞重建后，在抗CD4抗体处理的动物中检测到的细胞相关病毒RNA和DNA水平显着降低。值得注意的是，在CD4 T细胞重新填充后，相对于对照组，抗CD4抗体组中可能具有复制能力的完整前病毒基因组的频率较低。此外，还注意到携带复制能力病毒的潜伏感染细胞数量减少了~5倍。综上所述，目前的研究提供了直接的体内证据，证明一种有效方法可以大大减少HIV病毒库。++++

结果

抗 CD4 抗体耗竭 CD4 T 细胞+

首先，设计了一项实验来评估人源化小鼠中抗 CD4 抗体介导的 CD4 T 细胞全身耗竭（图 1A）。为此，我们使用了一种抗体，该抗体已在先前使用非人灵长类的体内实验中广泛使用，并且与人CD4发生交叉反应[13\u201215]。在第 0、3、6 和 9 天通过静脉注射给小鼠抗 CD4 抗体。在抗体给药前和给药后第 3、7 和 12 天测量血液中人 CD4 T 细胞的水平。在尸检时测量组织中人CD4 T细胞的水平。与耗竭前时间点相比，外周血CD4 T细胞的平均频率在首次给药后第3天、第7天和第12天分别下降了75.5%、98.0%和98.9%（图1B）。在抗体处理动物的所有分析组织中，还观察到CD4 T细胞的百分比和绝对数量都强烈消耗（图1C和1D）。与未治疗的对照组相比，抗CD4抗体治疗的动物中CD4 T细胞的平均频率在骨髓中降低了82.5%（p = 0.0238），在肝脏中降低了99.3%（p = 0.0275），在肺中降低了90.8%（p = 0.0238），在淋巴结中降低了90.8%（p = 0.0571），在脾脏中降低了97.8%（p = 0.0256），在人胸腺类器官中降低了66.2%（p = 0.0238），当同一组内的所有单个组织（p<0.0001）一起分析时，降低了90.9%（图1C）。同样，CD4耗竭动物中CD4 T细胞的平均绝对数在骨髓中下降了96.5%（p = 0.0238），在肝脏中下降了99.8%（p = 0.0238），在肺中下降了98.9%（p = 0.0238），在淋巴结中减少了96.2%（p = 0.1143），在脾脏中下降了99.3%（p = 0.0238），在人胸腺类器官中下降了74.9%（p = 0.0952），当同组内的所有单个组织（p<0.0001）一起分析时，下降了91.0%。 分别与对照组相比（图1D）。+++++++

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图 1. 人CD4 T细胞在用抗CD4抗体处理的动物中强烈耗尽。+

（A）人源化小鼠抗CD4抗体治疗的实验设计。（B）通过流式细胞术分析纵向监测外周血中人CD4 T细胞的频率。通过尸检时的流式细胞术分析确定人源化小鼠组织中人CD4 T细胞的频率（C）和绝对数（D）。通过尸检时流式细胞术测定抗 CD4 抗体处理和对照动物的幼稚 （E、CD27CD45RA）、中枢记忆 （F、CD27CD45RA） 和效应记忆 （G， CD27CD45RA） CD4 T 细胞的频率。BM， 骨髓;LIV，肝脏;LNG，肺;LN，淋巴结;SPL、脾脏、ORG、人胸腺类器官。组合：将所有动物的所有单个组织绘制在一起。A 和 B 中的蓝色箭头表示抗 CD4 抗体治疗组 4 次抗 CD4 抗体给药 （6 mg/kg） 的时间。抗CD4抗体处理的动物（n = 6）显示为红色;对照动物（n = 3）以黑色显示。数据以SEM±平均值表示。 使用非配对双侧Mann-Whitney U检验进行统计分析。当P < 0.05时考虑统计学意义。+++++---+

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011824.g001

中央记忆CD4 T细胞是一种重要的病毒储存库，据报道，与幼稚或效应记忆CD4 T细胞相比，它对抗CD4抗体介导的耗竭具有更强的抵抗力[13,17–19]。在最后一次抗CD4抗体治疗后3天分析人源化小鼠组织（CD27CD45RA幼稚，CD27CD45RA中枢记忆和CD27CD45RA效应记忆）中剩余CD4 T细胞的表型。尽管CD4 T细胞耗竭广泛，但抗CD4抗体治疗小鼠和对照小鼠之间每个亚群的比例没有显著差异（幼稚，图1E，P = 0.1151;中央记忆，图1F，P = 0.8078;效应记忆，图1G，p = 0.5469），表明抗体处理的所有亚群都很好地耗尽了。总的来说，这些结果表明，在人源化小鼠中，抗CD4抗体治疗可以有效地消耗CD4 T细胞。++++++---++

外周血CD4 T细胞在接受抗CD4抗体的ART抑制，HIV感染的人源化小鼠中有效耗尽，并在停止抗体治疗后迅速恢复+

为了评估抗CD4抗体治疗对ART抑制，HIV感染的人源化小鼠的影响，分别在第-71天静脉内感染HIV和在第-39天接受抗逆转录病毒治疗（图2A）。在第 0、3、6 和 10 天给予抗 CD4 抗体。在最后一剂抗 CD4 抗体后，动物在抑制性 ART 上再维持 26 天，以使 CD4 T 细胞水平恢复。+

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图 2. 外周血CD4 T细胞在接受抗CD4抗体的ART抑制，HIV感染的人源化小鼠中有效耗尽，并在停止抗体治疗后迅速恢复。+

（A）人源化小鼠HIV感染及抗CD4抗体治疗的实验设计。采用流式细胞术纵向监测外周血中人CD45造血细胞（B）、CD3 T细胞（C）、CD19 B细胞（D）、CD3CD19髓样细胞（E）、CD4 T细胞（F）和CD8 T细胞（G）的频率。蓝色箭头表示抗 CD4 抗体治疗组 4 次抗 CD4 抗体给药 （6 mg/kg） 的时间。抗CD4抗体处理的动物（n = 6）显示为红色;对照动物（A中的n = 7;B-G中的n = 4）以黑色显示。数据以SEM±平均值表示。 使用非配对双侧Mann-Whitney U检验进行统计分析。当P < 0.05时考虑统计学意义。+++--++

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011824.g002

在抗CD4抗体治疗开始后，纵向监测小鼠外周血中人类细胞亚群的频率。在第 3 天时，与对照组相比，在治疗小鼠中观察到人 CD45 细胞和 CD3 T 细胞水平显着降低（CD45 细胞，p = 0.0381;CD3 T细胞，p = 0.0191），而在第10、17、23、30和36天没有观察到显着差异（图2B和2C）。相比之下，在第3天（p = 0.0191），但在第10、17、23、30和36天时，抗CD4抗体处理的动物中CD19人B细胞的频率显着更高（图2D）。+++++

在之前的一项研究中，未接受过ART感染的SIV感染猕猴中CD4 T细胞的耗竭使巨噬细胞和小胶质细胞扩增，并增加了病毒复制[15]。相比之下，最近的一项研究表明，在接受抗CD4抗体治疗的ART抑制SIV感染猕猴中，单核细胞没有耗尽或扩增[13]。因此，髓系细胞的扩增很可能是由活跃的SIV复制驱动的。在抗CD4抗体治疗开始后，纵向监测人源化小鼠外周血中人单核细胞（鉴定为hCD45hCD3hCD19hCD4）的频率。如图2E所示，在抗CD4抗体治疗过程中，除了抗CD4抗体治疗后的第17天外，在外周血中，抗CD4抗体治疗小鼠和对照小鼠之间的人单核细胞水平没有显着差异（p = 0.0191）。++--+

在ART抑制的HIV感染动物中，在首次接受抗CD4抗体治疗后，还纵向测量了外周血中的人CD4和CD8 T细胞水平。在抗体治疗过程中，外周血中超过95%的CD4 T细胞被耗尽（图2F）。到抗体治疗开始后第 36 天，外周血中的 CD4 T 细胞反弹至耗竭前水平的 59.0%。与对照组相比，抗CD4抗体治疗动物外周血CD4 T细胞的平均频率在治疗开始后第3天（p = 0.0095）、第10天（p = 0.0139）、第17天（0.0128）、第23天（p = 0.0095）、第30天（p = 0.0238）和第36天（p = 0.0238）降低了97.0%、99.3%、99.4%、92.6%、45.8%和37.4%（图2F）。相反，CD4 耗竭动物中外周血 CD8 T 细胞的百分比在首次给予抗 CD4 抗体后迅速增加，在最后一次给予抗体后迅速下降（图 2G）。与对照组相比，抗CD4抗体治疗组CD8 T细胞的平均频率分别增加了361.5%、403.7%、350.9%、295.7%、154.7%和110.3%，分别为第3天（p = 0.0095）、第10天（p = 0.0095）、第17天（p = 0.0095）、第23天（p = 0.0139）、第30天（p = 0.0238）和第36天（p = 0.0238）（图2G）。+++++++

研究显示，CD8耗竭可促进CD4 T细胞活化和增殖[20,21]。为了检查 CD4 T 细胞耗竭对 HIV 感染和 ART 抑制背景下 T 细胞活化的影响，我们接下来测量了抗体治疗期间和之后的 T 细胞活化 （CD38/HLA-DR） 水平。在整个实验过程中，抗CD4抗体治疗的动物和对照动物在活化的CD4 T细胞水平上没有发现显着差异（S1A图）。同样，抗CD4抗体治疗的动物和对照动物在所有时间点的活化CD8 T细胞水平上没有观察到显着差异，除了抗体治疗开始后的第17天（p = 0.0191）（S1B图）。++++++

在之前的一项CD4耗竭研究中，中央记忆CD4 T细胞的恢复速度快于幼稚的CD4 T细胞，但所有亚群在抗体治疗终止后8-9个月恢复到耗竭前的水平[13]。在目前的研究中，与对照组相比，在抗 CD4 抗体治疗开始后第 30 天，在接受治疗的动物中观察到更高水平的中央记忆 （p = 0.0238） 和效应记忆 CD4 T 细胞 （p = 0.0275），但幼稚 CD4 T 细胞的水平较低（p = 0.0238）（S2 图）。然而，在尸检时一周后，幼稚、中枢记忆和效应记忆细胞的水平没有发现显着差异（S2图）。总之，这些结果证明了抗体治疗终止后人CD4 T细胞的有效回收。+++++

抗 CD4 抗体给药可降低外周血中细胞相关病毒 RNA 和 DNA 水平

HIV暴露后对血浆病毒载量进行纵向监测。用抗CD4抗体治疗ART抑制的HIV感染小鼠不会导致血浆病毒血症的诱导（图3A）。这与先前发表的CD8耗竭抗体结果形成鲜明对比[20,22]。还纵向监测抗 CD4 抗体治疗开始后的细胞相关病毒 RNA 水平。与未治疗的对照组相比，在首次抗体治疗后，用抗CD4耗竭抗体3（p = 0.0057）、10（p = 0.0057）、17（p = 0.0057）、23（p = 0.0258）和30（p = 0.0162）治疗的动物的细胞相关病毒RNA水平显着降低（图3B）。与对照组相比，第36天时，抗CD4抗体治疗动物的平均细胞相关病毒RNA水平降低了3.4倍，尽管差异没有统计学意义（图3B;p = 0.1167）。

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图 3. 抗 CD4 抗体给药可降低外周血中细胞相关病毒 RNA 和 DNA 水平。

（A） HIV-1 感染后，使用 qRT-PCR 测定法对纵向血浆样品中的血浆病毒载量（HIV-RNA 拷贝/ml）进行定量。（B） 通过qPCR纵向定量PBMC中细胞相关病毒RNA的水平。（C） 通过qPCR纵向定量PBMCs中细胞相关病毒DNA的水平。PBMC：外周血单核细胞。A 中的阴影灰色区域表示正在进行的 ART 管理。图A中的虚线表示检测限（693拷贝/ml）。B 和 C 中具有无法检测值的样本设置为每 10 个拷贝5hCD45 细胞。蓝色箭头表示抗 CD4 抗体治疗组 4 次抗 CD4 抗体给药 （6 mg/kg） 的时间。抗CD4抗体处理的动物（n = 6）显示为红色;对照动物（A中的n = 7;B和C中的n = 4）以黑色显示。数据以SEM±平均值表示。 使用非配对双侧Mann-Whitney U检验进行统计分析。当P < 0.05时考虑统计学意义。+

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011824.g003

还对经抗CD4抗体处理的对照小鼠和未经处理的对照小鼠之间外周血hCD45细胞中细胞相关小瓶DNA水平进行了纵向分析。与未处理的对照组相比，抗CD4抗体治疗的动物在首次给予抗体后3天（p = 0.0089）、10（p = 0.0057）、17（p = 0.0057）、23（p = 0.0057）、30（p = 0.0258）和36（p = 0.0476）中，细胞相关病毒DNA水平显着降低（图3C）。总的来说，这些数据表明，CD4 T细胞的耗竭导致外周血中细胞相关病毒RNA水平和DNA水平显着降低。++

CD4 T 细胞耗竭会降低 CD4 T 细胞中 HIV RNA 和 DNA 的水平++

为了确定抗体介导的CD4 T细胞耗竭对CD4 T细胞重新填充后ART抑制的HIV感染的人源化小鼠组织中细胞相关病毒RNA和DNA水平的影响，从每只小鼠的骨髓、肝脏、肺、脾脏、淋巴结和人胸腺类器官中分离的混合单核细胞（MNCs）中富集人CD4 T细胞。首先，评估CD4 T细胞耗竭对纯化CD4 T细胞中细胞相关病毒RNA的影响。与对照动物相比，在从抗CD4抗体处理的动物中分离的CD4 T细胞中检测到的细胞相关病毒RNA水平显着降低（图4A;P = 0.0022）。接下来，我们研究了CD4 T细胞耗竭对细胞相关病毒DNA水平的影响。与对照动物相比，在从抗CD4抗体处理的动物中分离的CD4 T细胞中检测到的细胞相关病毒DNA水平显着降低（图4B;P = 0.0152）。++++++++

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图 4. CD4 T 细胞耗竭导致完整 HIV 前病毒和潜伏感染细胞的水平降低。+

通过qPCR定量从混合MNC中分离的纯化CD4 T细胞中细胞相关病毒RNA（A）和DNA（B）水平的拷贝。（C） 通过定量病毒生长测定 （QVOA） 测量从混合 MNC 中分离出的每百万个纯化的 CD4 T 细胞中完整病毒的拷贝数。（D） 通过完整前病毒 DNA 测定 （IPDA） 测量从混合 MNC 中分离的纯化 CD4 T 细胞中完整病毒、5'缺陷病毒和 3'缺陷病毒的频率。MNC：单核细胞;完整的，完整的病毒;5' def，5' 缺陷病毒;3' def，3' 缺陷病毒。抗CD4抗体处理的动物（n = 6）显示为红色;对照动物（n = 6）以黑色显示。X 轴中的 T 和 C 分别表示测试和控制。数据以SEM±平均值表示。 使用非配对双侧Mann-Whitney U检验进行统计分析。当P < 0.05时考虑统计学意义。+++

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011824.g004

CD4 T 细胞耗竭导致完整 HIV 前病毒和潜伏感染细胞水平降低+

为了确定观察到的细胞相关病毒RNA和DNA的下降是否反映在完整的HIV前病毒水平或潜伏感染细胞的数量上，我们进行了定量病毒生长测定（QVOA）和完整前病毒DNA测定（IPDA）。与对照组相比，抗CD4抗体治疗的动物每百万CD4 T细胞中潜伏感染的细胞数平均减少3.1倍（p = 0411）（图4C）。一只动物似乎对治疗没有反应。当对治疗有反应的5只动物与对照组进行比较时，潜伏感染的CD4 T细胞数量减少了11.5倍（图4C）。重要的是，与对照小鼠相比，抗CD4抗体治疗的小鼠中IPDA测量的完整前病毒的平均频率降低了8.5倍，并且这种差异具有统计学意义（P = 0.0022）（图4D）。与对照小鼠相比，抗CD4抗体处理的小鼠中3'缺陷前病毒的频率也显着降低（图4D;p = 0.0087）。在抗CD4抗体处理的小鼠和对照小鼠之间，5'缺陷前病毒的频率没有观察到显着差异（图4D;p = 0.3095）。总的来说，这些结果表明，抗体介导的CD4 T细胞耗竭导致HIV-1储库大小减小。+++

抗逆转录病毒抑制、HIV 感染小鼠抗体治疗终止后 CD4 T 细胞水平的全身恢复+

在尸检时比较抗 CD4 抗体处理动物和对照动物之间的全身人 CD3 T 细胞水平。抗CD4抗体治疗组和对照组之间，除肝脏外，所有测试组织中人CD3 T细胞的频率没有显着差异（p = 0.0381）（S3A图）。同样，抗CD4抗体治疗的动物和对照动物之间除肺外的所有组织中CD3 T细胞的绝对数量没有观察到显着差异（p = 0.0381）（图5A）。总体而言，试验组和对照组之间CD3 T细胞的频率或绝对数量没有显著差异（图S3A和5A）。++++

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图 5. 在 ART 抑制的 HIV 感染小鼠中抗体治疗终止后 CD4 T 细胞水平的全身恢复。+

通过尸检时流式细胞术测定抗CD4抗体处理和对照动物组织中人CD3 T细胞（A）、CD4 T细胞（B）和CD8 T细胞（C）的绝对数量。BM， 骨髓;LIV，肝脏;LNG，肺;LN，淋巴结;SPL、脾脏、ORG、人胸腺类器官。组合：将所有动物的所有单个组织绘制在一起。抗CD4抗体处理的动物（n = 6）显示为红色;对照动物（n = 4）以黑色显示。数据以SEM±平均值表示。 使用非配对双侧Mann-Whitney U检验进行统计分析。当P < 0.05时考虑统计学意义。+++

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011824.g005

还比较了重组后抗CD4抗体处理和对照小鼠组织中的CD4 T细胞水平。有趣的是，尽管与对照组小鼠相比，抗CD4抗体治疗的骨髓（p = 0.0139），肝脏（p = 0.0191），肺（p = 0.0247），淋巴结（p = 0.0159）和脾脏（p = 0.0191）中人CD4 T细胞的频率显着降低，但仅在肺（p = 0.0095）中观察到CD4 T细胞绝对数量的统计学显着差异（图S3B和5B）。+++

接下来，比较抗CD4抗体处理的小鼠和对照组组织中的人CD8 T细胞水平。与对照组小鼠相比，抗CD4抗体治疗小鼠的骨髓（p = 0.0139），肝脏（p = 0.0191），肺（p = 0.0247），淋巴结（p = 0.0159）和脾脏（p = 0.0191）中CD8 T细胞的百分比显着更高（S3C图）。然而，在抗CD4抗体处理的小鼠和对照小鼠之间，除肺外，分析的所有单个组织中的CD8 T细胞的绝对数量没有显着差异（p = 0.0381）（图5C）。总之，这些结果表明，即使在抗体治疗中断后第26天CD4 T细胞的总体水平显着恢复，CD4 T细胞区室并未完全恢复到对照动物中观察到的相同水平。+++++

还比较了尸检时抗CD4抗体处理和对照小鼠组织中的T细胞活化水平。在所分析的任何单个组织中，CD4或CD8 T细胞活化水平均未观察到显着差异（S4图）。++

接下来，我们测量了组织中不同CD4 T细胞亚群的比例。与对照组相比，在抗CD4抗体治疗的动物的骨髓中观察到幼稚（p = 0.0191）CD4 T细胞的水平显着降低，而中枢记忆（p = 0.0191）和效应记忆（p = 0.0191）CD4 T细胞的水平较高（S5图）。同样，在抗CD4抗体处理的小鼠的肺中也观察到较低水平的幼稚CD4 T细胞和较高水平的中央记忆CD4 T细胞（S5图）。总体而言，在抗CD4抗体处理的动物中观察到幼稚CD4 T细胞水平显着降低（p = 0.0002），中央记忆CD4 T细胞水平显着升高（p = 0.0002）（S5图）。+++++++

CD4 T 细胞耗竭不会延迟 ATI 后病毒反弹+

在另一项实验中，我们测试了抗 CD4 抗体治疗后观察到的潜伏感染细胞和完整前病毒的减少是否会反映在分析 ART 中断后病毒反弹的延迟中（S6A 图）。在整个抗 CD4 抗体治疗过程中，外周血中 CD4 T 细胞的强烈消耗（S6B 和 S6C 图）。与耗竭前水平相比，抗CD4抗体处理动物外周血CD4 T细胞的平均频率在首次抗体给药后第2、9、17、23天分别降低了96.8%、99.3%、99.3%、99.5%。外周血CD4 T细胞的频率在最后一次给药后16天开始反弹，并恢复到ART中断前耗竭前水平的59.9%。然而，在ART中断后，在抗CD4抗体治疗的动物中没有观察到病毒反弹的延迟（S6D图）。+++

讨论

CD4 T细胞是特征最明确和最大的HIV病毒库。目前尚无特异性细胞标志物能够可靠地区分潜伏感染细胞和未感染细胞[1,2]。尽管HIV潜伏期逆转剂在临床试验中能够诱导RNA的表达，但尚无一种药物被证明能成功减少病毒库[3\u20128]。广泛中和抗体 （bNAb）、双特异性抗体和毒素标记抗体有可能杀死 HIV-1 感染的细胞，但它们的作用高度依赖于 HIV 的再激活。需要不基于靶向表达HIV抗原的HIV感染细胞的替代品。重要的是，潜伏感染的CD4 T细胞具有高度异质性，使其难以消除。临床上已有概念验证，即被动给药抗体以消耗多个疾病区域的特定细胞类型[22–24]。具体而言，抗胸腺细胞球蛋白耗竭T细胞在治疗移植物抗宿主病、移植预处理、移植排斥反应和多种自身免疫性疾病方面有着悠久的历史[25–27]。值得注意的是，muromonab（抗CD3）是第一个获得FDA批准的单克隆抗体，历史上被用于抗肾移植排斥反应。然而，泛T细胞耗竭治疗也会耗竭CD8 T细胞，这些T细胞在控制HIV和许多其他感染方面起着关键作用。此外，泛T细胞耗竭疗法与细胞因子释放综合征和其他毒性有关[28]。相比之下，CD4-T 细胞耗竭抗体具有保留 CD8 T 细胞的显着优势。+++

在先前的临床研究中，CD4靶向抗体被评估为治疗各种人类疾病的潜在药物[9\u2012122]。抗CD4抗体治疗显示出临床和实验室参数的改善。重要的是，只报告了偶尔和轻微的副作用。既往使用NHP进行的研究也表明，抗CD4抗体介导的CD4 T细胞耗竭是可逆的，耐受性良好[13,14]。+

在先前的非人灵长类动物研究中，抗CD4抗体已被证明会耗尽CD4 T细胞[13\u201216]。在目前的研究中，无论HIV状态如何，都给予抗CD4抗体以靶向所有人类CD4 T细胞。CD4 T 细胞被外周血和组织中的抗 CD4 抗体有效耗尽。具体来说，我们发现幼稚、中央记忆和效应记忆人 CD4 T 细胞在分析的所有组织中成比例地耗尽。++++

与之前的一项非人灵长类动物研究一致，抗CD4抗体治疗并未扩增ART抑制的HIV感染的人源化小鼠外周血中的单核细胞[13]。另一项研究显示，在SIV感染前给予抗CD4抗体[15]。单核细胞和小胶质细胞在SIV感染后被激活和扩增，而不是在抗CD4抗体给药期间或ART启动后[15]。因此，髓系细胞的扩增很可能是由活跃的SIV复制驱动的。此外，嗜 T 型 HIV-1JR-CSF（JR-脑脊液）目前研究中使用的药物不会在巨噬细胞中复制[29]。值得注意的是，在首次给予抗体后第17天，与对照组相比，在抗体治疗的动物中观察到的单核细胞水平显着降低。这可能是由于单核细胞的部分耗竭，单核细胞在其表面表达低水平的CD4分子。

CD4 T 细胞耗竭不会诱导人源化小鼠或血浆病毒斑点的 T 细胞活化。相反，抗体介导的CD8细胞耗竭诱导CD4 T细胞活化，驱动CD4 T细胞的短暂增殖，并在恒河猴中诱导HIV潜伏期[20\u201222]。++++

在抗 CD4 抗体治疗过程中，CD4 T 细胞耗竭导致外周血人 CD45 细胞中细胞相关病毒 RNA 和 DNA 显着减少。与我们的结果类似，在猕猴中接受抗CD4抗体治疗后，在PBMC中检测到较低水平的细胞相关SIV DNA[14]。此外，与对照动物相比，在CD4 T细胞恢复后，抗CD4抗体治疗动物的组织中检测到的细胞相关病毒RNA和DNA水平显着降低，这可能是因为用新重组的CD4 T细胞替换了HIV感染的细胞通过连续ART保护免受HIV感染。++++

与对照组相比，抗CD4抗体处理的人源化小鼠组织中完整前病毒DNA的水平降低了8.5倍。此外，在大多数被检查的动物中，我们观察到组织中潜伏感染的细胞数量减少了11.5倍。与我们的结果一致，最近一项针对 ART 抑制、SIV 感染的 NHP 的研究也报告说，在 CD4 T 细胞耗竭后，外周血中潜伏感染的细胞数量减少了 0.5 log。然而，这种减少没有统计学意义[14]。+

5'-缺陷前病毒缺乏统计学意义的缺失不太可能用优先去除 3'-缺陷和/或完整前病毒来解释，因为在抑制性 ART 的背景下，抗 CD4 抗体应该与前病毒完整性无关。IPDA 中的 2 个扩增子共同排除有缺陷的前病毒，是根据人类的近全长前病毒序列设计的，这些前病毒序列经过多年的持久 ART，主要在慢性感染期间开始治疗。鉴于人类与小鼠治疗持续时间的差异，很难知道IPDA扩增子在人源化小鼠样本中排除缺陷前病毒的程度，因为前病毒缺失/超突变情况可能与长期ART治疗的慢性HIV感染期间的人类不同（尽管如果不测序和比较，很难确定）。另一个考虑因素是，由于个体间前病毒景观的变异性，IPDA引物/探针对完整前病毒的预测价值似乎在不同的人类供体中有所不同[30]，因此在个体人源化小鼠之间也可能有所不同。此外，这项研究的小样本量可能会放大个体小鼠之间的微小差异。所有这些都可能导致 5' 缺陷前病毒的减少。

在恒河猴中，抗CD4抗体介导的CD4 T细胞耗竭后，CD8 T细胞出现反向扩增[13]。与之前的研究一致，在目前的研究中也观察到CD8 T细胞的扩增，可能是由于CD4 T细胞的不完全恢复。人源化小鼠的抗HIV-1特异性CD8 T细胞反应在特异性、动力学和免疫优势方面与人类相似[31]。HIV感染后的抗HIV特异性CD8 T细胞反应已被证明在控制人源化小鼠的病毒复制方面很重要[31]。最近，在CD8耗竭后，ART抑制的人源化小鼠中观察到中等水平的病毒再激活[22]。因此，在当前研究中观察到的HIV参数降低，细胞毒性CD8 T细胞对积极表达HIV抗原的HIV储库细胞的反应增加也可能导致观察到的HIV参数降低。虽然在尸检时观察到抗CD4抗体治疗的动物CD4 T细胞的频率显着降低，但CD4 T细胞的绝对数量没有差异，这可能部分是由于CD8 T细胞的扩增。++++++++++

在抗CD4抗体治疗的动物的外周血中，中央记忆和效应记忆CD4细胞的恢复速度比幼稚CD4 T细胞快，但最终都恢复到与对照动物相似的水平。这一现象与先前在非人灵长类动物中的观察结果一致[13]。在尸检时，在抗CD4抗体处理的动物中发现记忆CD4 T细胞的百分比较高，而幼稚CD4 T细胞的百分比较低。需要进一步的研究来确定这种差异是否会随着时间的推移而消失，如果没有，其功能相关性是什么。目前研究中相对较少的CD4 T细胞数量阻碍了对CD4 T细胞不同亚群对HIV储存库的贡献的研究。++++++

在HIV/AIDS研究中使用人源化小鼠存在一些局限性。小鼠重建的人体免疫系统部分概括了人体免疫系统。抗HIV IgG抗体的有限生成可能低估了抗抗体的影响，这是抗体介导的临床干预的一个问题。此外，与人类和非人灵长类相比，人源化小鼠外周血或组织中的细胞数量相对较少，因此无法对特定细胞亚群的HIV库进行全面分析。

尽管治疗动物中存在的完整前病毒数量显着减少，并且含有具有复制能力的HIV的潜伏感染细胞减少，但在ART中断后，病毒反弹没有明显的延迟。这与之前在非人灵长类动物中的研究结果一致，在非人灵长类动物中，CD4 T细胞的耗竭并没有延迟病毒反弹[13]。因此，尽管有这些非常有希望的结果，但仍需要进一步改进、更长时间的治疗或使用联合疗法来延缓 ATI 后的病毒反弹。总之，我们的研究结果提供了直接的体内证据，证明CD4 T细胞的瞬时耗竭是有效减少HIV储存库大小的可行方法，该储存库与细胞的HIV感染状态无关。++

材料与方法

道德声明

所有动物实验均根据北卡罗来纳大学教堂山分校机构使用和护理委员会批准的协议进行，并符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南。

人源化小鼠的生成

如前所述生成人源化小鼠[22,32–38]。简而言之，将一小块人胎儿肝组织（1-2 mm）夹在亚致死（200 rad）NOD.Cg-Prkdc 左肾囊下的两块自体胸腺组织（Advanced Bioscience Resources）之间SCID的IL2RGtm1Wjl/SzJ （NSG;杰克逊实验室）小鼠。组织植入后，用自体肝源性人CD34造血干细胞静脉内（通过尾静脉注射）移植小鼠。如前所述，通过流式细胞术纵向监测外周血中人造血细胞的BLT小鼠重建[22,32–38]。+

人源化小鼠的HIV-1感染

HIV-1的库存JR-CSF（JR-脑脊液）按照先前报道的制备和滴定[34,37,38]。简而言之，通过瞬时转染HEK293T细胞产生含病毒的上清液，并在 TZM-bl 指示细胞上滴定（美国国家过敏和传染病研究所艾滋病部艾滋病研究和参考试剂计划）。人源化小鼠静脉内（通过尾静脉）暴露于3×104HIV的组织培养感染单位（TCIU）JR-CSF（JR-脑脊液）.

抗逆转录病毒治疗和抗 CD4 抗体给药

如前所述，使用含有以下3种药物的辐照Teklad食物对人源化小鼠进行ART治疗：恩曲他滨（FTC;1,500mg/kg）、富马酸替诺福韦二吡呋酯（TDF;1,560mg/kg）和雷替拉韦（RAL;600mg/kg）（研究饮食）[22,34,37,38]。

对于抗CD4抗体给药，每只动物静脉内注射四剂恒河猴化耗竭抗CD4抗体（CD4R1，NIH非人灵长类动物试剂资源），剂量为6mg/kg。将抗体在生理盐水中稀释，每 3 至 4 天静脉注射（通过尾静脉）。

单核细胞分离

如前所述，从组织中分离出单核细胞（mononuclear cells， MNCs）[35,38–40]。简而言之，通过用3ml注射器柱塞将组织通过70μm尼龙细胞过滤器，获得来自脾脏，淋巴结和人胸腺类器官的单核细胞。骨头用研钵和研杵粉碎，然后通过细胞过滤器。将肺和肝组织切成小块，并用胶原酶/DNase消化，然后通过细胞过滤器过滤组织。通过Percoll梯度离心进一步纯化细胞。用ACK裂解缓冲液裂解组织红细胞。

人CD4 T细胞纯化+

从骨髓、肝脏、肺、脾脏、淋巴结中分离的所有单核细胞和从每只动物的人胸腺类器官中分离的 2000 万个单核细胞合并在一起，然后进行 CD4 T 细胞选择。来自每个混合样品的 CD4 T 细胞被抗人 CD4 微珠（Miltenyi Biotec 试剂盒 130-045-101）阳性富集。在选择前后进行流式细胞术分析，以评估分选样品的纯度。++

血浆病毒载量、细胞相关 HIV-1 RNA 和 DNA

使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒从血浆样品中提取RNA。使用Qiagen QIAamp viral RNA Mini Kit提取血液和组织RNA样品。纵向监测血浆HIV病毒载量，灵敏度为每毫升693拷贝。如前所述，使用TaqMan RNA to-CT一步法试剂盒在ABI 7500快速实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems）上进行一步法逆转录酶qPCR对病毒RNA进行定量[22,34,38]。正向和反向引物以及TaqMan探针的序列分别为：5′-CATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGA-3′、5′-TGCTTGATGTCCCCCCACT-3′和5′-FAM-CCACCACCACAAGATTTAAACACCAT-GCTAA-Q-3′。

使用Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit分离DNA样本。如前所述，通过qPCR分析对外周血和组织中细胞相关病毒DNA的拷贝进行定量[32,38,39]。通过同时扩增人γ珠蛋白DNA来确定人类细胞数量。检测人γ珠蛋白的正向、反向引物和探针序列分别为5'-CGCTTCTGGAACGTCTGAGATT-3'、5'-CCTTGTCCTCCTCTGTGAAATGA-3'和5'-FAM-TCAATAAGCTCCTAGTCCAGAC-Q-3'。

流式细胞术分析

通过9色流式细胞术panel分析人源化小鼠的人类免疫细胞，包括CD45-V500（HI30，BD Biosciences）、CD3-APC-R700（UCHT1，BD Biosciences）、CD4-APC-H7（RPA-T4，BD Biosciences）、CD8-FITC（SK1，BD Biosciences）、CD19-PE-Cy7（SJ25C1，BD Biosciences）、CD27-PE（M-T271，BD Biosciences）、CD38-APC（HB7，BD Biosciences）、CD45RA-Pacific Blue（F8-11-13，Bio-Rad）、HLA-DR-PerCP（L243，BD Biosciences）。小鼠IgG1k-APC（MOPC-21，BD Biosciences），小鼠IgG1k-Pacific Blue（MOPC-21，BD Biosciences），小鼠IgG1k-PE（MOPC-21，BD Biosciences）和小鼠IgG2ak-PerCP（X39，BD Biosciences）作为同型对照。抗体孵育后，用1×BD FACS裂解液（BD Bio-sciences）裂解血样。然后洗涤样品并用PFA固定。在BD LSRFortessa仪器上收集数据，并使用BD FACSDiva（6.1.3版）和FlowJo（10.6.2版）软件进行分析。

流式细胞术设门策略如下：hCD45hCD3和hCD45CD19分别用于人T细胞和B细胞门控;人CD38和HLA-DR共表达为活化的T细胞;根据 CD27 和 CD45RA 的表达对 T 细胞亚群进行门控（幼稚：CD27CD45RA，中枢记忆：CD27CD45RA，效应记忆：CD27CD45RA）;CD3CD19CD4用于门控人单核细胞（S7图）。+++++++-----+

完整的前病毒DNA检测

如上所述，对分离的总CD4 T细胞进行IPDA[41]。中位数为 4.2（第一季度 3.2，第三季度 7.8）x 10+5测定每个样品的 CD4 T 细胞当量。DNA剪切指数中位数为0.47（Q1 0.41，Q3 0.49）。前病毒频率小于 5 x 10+6CD4 T 细胞被左删失。使用无模板、HIV 血清阴性人类供体 CD4 T 细胞 DNA 和 HIV 扩增子 gblock（集成 DNA 技术）对照设置阳性前病毒扩增的数字 PCR 阈值。++

定量病毒生长测定

如前所述进行 QVOA。简而言之，据报道，人CD4 T细胞是从单核细胞中纯化的[21]。将 CD4 T 细胞接种在限制稀释液中，并用由 2ug/ml PHA（Remel，Fisher Scientific）、60U Il-2 和来自未感染的人类供体的辐照 PBMC 组成的混合物刺激 24 小时。将血清阴性人类供体的 PBMC 产生的 CD8 耗竭的 PHA 原始细胞添加到培养物中以扩增再活化的病毒。使用最大似然法估计含有复制能力HIV的CD4 T细胞的频率[21]。+++

统计分析

所有数据均使用GraphPad Prism（8.02版）进行绘图和分析。数据以SEM±平均值表示。 当 p < 0.05 时考虑统计学意义。没有使用统计方法来预先确定样本量。研究者在评估结局时没有对组分配或结局不知情。为了评估抗CD4抗体组和对照组之间观察到的差异的统计学意义，我们使用了未配对的双侧Mann-Whitney U-检验。

支持信息

抗 CD4 抗体治疗不会诱导血液中的 T 细胞活化。

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S1 图。 抗 CD4 抗体治疗不会诱导血液中的 T 细胞活化。

通过流式细胞术纵向测定外周血中活化 （CD38HLA-DR） CD4 （A） 和 CD8 （B） T 细胞的频率。A 和 B 中的蓝色箭头表示 4 次抗 CD4 抗体给药的时间，用于抗 CD4 抗体治疗的动物。抗CD4抗体处理的动物（n = 6）显示为红色;对照动物（n = 4）以黑色显示。数据以SEM±平均值表示。 使用非配对双侧Mann-Whitney U检验进行统计分析。当P < 0.05时考虑统计学意义。++++

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011824.s001

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S2 图。 抗体治疗终止后，记忆CD4 T细胞在血液中的重新填充速度比幼稚CD4 T细胞快。++

通过流式细胞术纵向测定外周血中幼稚（A，CD27CD45RA），中枢记忆（B，CD27CD45RA）和效应记忆（C，CD27CD45RA）CD4 T细胞的频率。A 中的蓝色箭头表示抗 CD4 抗体治疗组 4 次抗 CD4 抗体给药的时间。抗CD4抗体处理的动物（n = 6）显示为红色;对照动物（n = 4）以黑色显示。数据以SEM±平均值表示。 使用非配对双侧Mann-Whitney U检验进行统计分析。当P < 0.05时考虑统计学意义。+++---+

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011824.s002

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S3 图。 与CD4 T细胞恢复后的对照组相比，在接受抗CD4抗体治疗的ART抑制，HIV感染的动物中观察到CD4 T细胞的百分比显着降低。++

通过尸检时流式细胞术测定抗CD4抗体处理和对照动物组织中人CD3 T细胞（A）、CD4 T细胞（B）和CD8 T细胞（C）的频率。BM， 骨髓;LIV，肝脏;LNG，肺;LN，淋巴结;SPL、脾脏、ORG、人胸腺类器官。组合：将所有动物的所有单个组织绘制在一起。抗CD4抗体处理的动物（n = 6）显示为红色;对照动物（n = 4）以黑色显示。数据以SEM±平均值表示。 使用非配对双侧Mann-Whitney U检验进行统计分析。当P < 0.05时考虑统计学意义。+++

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011824.s003

（TIF）

S4 图。 抗 CD4 抗体治疗不会在 CD4 T 细胞重建后诱导 ART 抑制、HIV 感染的人源化小鼠组织中的 T 细胞活化。+

通过尸检时流式细胞术测定活化 （CD38HLA-DR） CD4 （A） 和 CD8 （B） T 细胞的频率。BM， 骨髓;LIV，肝脏;LNG，肺;LN，淋巴结;SPL、脾脏、ORG、人胸腺类器官。组合：将所有动物的所有单个组织绘制在一起。抗CD4抗体处理的动物（n = 6）显示为红色;对照动物（n = 4）以黑色显示。数据以SEM±平均值表示。 使用非配对双侧Mann-Whitney U检验进行统计分析。当P < 0.05时考虑统计学意义。++++

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011824.s004

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S5 图。 重建后，在抗CD4抗体处理的动物中检测到更高水平的中央记忆CD4 T细胞。+

通过尸检时流式细胞术测定抗CD4抗体处理和对照动物的幼稚（A，CD27CD45RA），中央记忆（B，CD27CD45RA）和效应记忆（C，CD27CD45RA）CD4 T细胞的频率。BM， 骨髓;LIV，肝脏;LNG，肺;LN，淋巴结;SPL、脾脏、ORG、人胸腺类器官。组合：将所有动物的所有单个组织绘制在一起。抗CD4抗体处理的动物（n = 6）显示为红色;对照动物（n = 4）以黑色显示。数据以SEM±平均值表示。 使用非配对双侧Mann-Whitney U检验进行统计分析。当P < 0.05时考虑统计学意义。+++---+

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011824.s005

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S6 图。 抗 CD4 抗体治疗不会延迟 ART 中断后的病毒反弹。

（A）人源化小鼠HIV感染及抗CD4抗体治疗的实验设计。（B）通过流式细胞术分析纵向监测外周血中CD4 T细胞的频率。（C） 显示抗 CD4 抗体处理（顶部）和对照（底部）小鼠中 CD4 T 细胞比例的流图。（D） HIV-1 感染后使用 qRT-PCR 测定法定量纵向血浆样品中的血浆病毒载量（HIV-RNA 拷贝/毫升）。蓝色箭头表示抗 CD4 抗体治疗组 5 次抗 CD4 抗体给药 （6 mg/kg） 的时间。抗CD4抗体处理的动物（n = 5）显示为红色;对照动物（n = 1）以黑色显示。++

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011824.s006

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S7 图。 流式细胞术的设门策略。

所示为用于分析（A）人免疫细胞亚群（hCD45CD3：T细胞，hCD45CD19：B细胞）的门控策略;（B）、T细胞活化（CD38HLA-DR）;（C）、T细胞亚群（幼稚：CD27CD45RA，中枢记忆：CD27CD45RA，效应记忆：CD27CD45RA）;（D），单核细胞（hCD3hCD19hCD4）。FSC：前向散射。SSC：侧散射。+++++++++-----+

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011824.s007

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S1 数据。 包含用于生成图1B-1G、2B-2G、3-5、S1-S5、S6B和S6D的数值数据的Excel文件。

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确认

作者感谢加西亚实验室的现任和前任成员提供技术援助，并感谢北卡罗来纳大学比较医学系技术人员的技术支持。

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