《免费医学论文发表-剖析巨细胞病毒 CC 趋化因子:趋化因子活性和 gHgL趋化因子依赖性细胞趋化因子是 CMV 感染的独立参与者》期刊简介
免费医学论文发表-剖析巨细胞病毒 CC 趋化因子:趋化因子活性和 gHgL趋化因子依赖性细胞趋化因子是 CMV 感染的独立参与者
抽象
与所有疱疹病毒一样,巨细胞病毒 (CMV) 编码许多免疫调节蛋白,包括趋化因子。人巨细胞病毒 (HCMV) CC 趋化因子 pUL128 在感染周期中具有双重作用。一方面,它形成五聚体受体结合复合物gHgLpUL(128,130,131A),这对HCMV的广泛细胞趋性至关重要。另一方面,它是一种活性趋化因子,可吸引白细胞并塑造其活化。迄今为止研究的所有动物巨细胞病毒都具有功能同源的 CC 趋化因子。在小鼠巨细胞病毒 (MCMV) 中,CC 趋化因子由 m131/m129 阅读框编码。MCMV CC 趋化因子称为 MCK2,形成三聚体 gHgLMCK2 进入复合物。在这里,我们产生了MCK2突变病毒,这些病毒要么不能形成gHgLMCK2复合物,要么缺乏趋化因子功能,要么缺乏这两种功能。通过使用这些病毒,我们可以证明 gHgLMCK2 依赖性进入和 MCK2 趋化因子活性是 MCK2 在体外和体内的独立功能。gHgLMCK2 复合物促进巨噬细胞和树突状细胞等白细胞的趋向性,并确保 MCMV 感染小鼠唾液腺中的高滴度,而与 MCK2 的趋化因子活性无关。相反,MCMV 感染小鼠中早期抗病毒 T 细胞反应的降低依赖于 MCK2 是一种活性趋化因子,并且不需要形成 gHgLMCK2 复合物。感染小鼠脾脏中高水平的CCL2和IFN-γ和MCMV毒力取决于gHgLMCK2复合物的形成和MCK2趋化因子活性。因此,MCK2 作为趋化因子和 gHgL 进入复合物的一部分的独立和协调功能塑造了抗病毒免疫和病毒传播。
作者摘要
对疱疹病毒免疫调节蛋白的研究极大地有助于理解感染期间引发的抗病毒免疫反应,并确定疱疹病毒感染期间的干预靶点。巨细胞病毒的CC趋化因子已被证明可以塑造病毒细胞嗜性和抗病毒免疫反应,然而,它们的作用方式尚未真正了解。在这里,我们使用 MCMV 趋化因子 MCK2 的明确突变体来示例性地剖析 CMV CC 趋化因子在病毒传播和抗病毒先天性和适应性免疫反应中的作用。我们可以证明 MCK2 的趋化因子活性和进入功能是小鼠 MCMV 感染的独立参与者。由于巨细胞病毒被讨论为潜在的疫苗载体,可以被编程为引发特异性 CD8+ T 细胞反应并对抗特定病原体,因此了解免疫调节蛋白对载体诱导的免疫反应的贡献非常重要。具体来说,在恒河猴感染恒河猴 CMV (RhCMV) 时,病毒 CC 趋化因子已被证明可以极大地塑造对疫苗抗原的免疫反应。我们对 CMV CC 趋化因子的双重作用的详细分析可能进一步有助于确定 CMV 疫苗载体是否应表达完整的病毒 CC 趋化因子。
数字
Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3
引文: Eletreby M, Thiessen L, Prager A, Brizic I, Materljan J, Kubic L, et al. (2023) 剖析巨细胞病毒 CC 趋化因子:趋化因子活性和 gHgL趋化因子依赖性细胞趋向性是 CMV 感染的独立参与者。PLoS 病理学 19(12): e1011793 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011793
编辑 器: Wolfram Brune,德国莱布尼茨病毒学研究所 (LIV)
收到: 2023年7月25日;接受: 2023年11月1日;发表: 12月 8, 2023
版权所有: ? 2023 Eletreby et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章,该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制,前提是注明原作者和来源。
数据可用性: 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金: BA得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft(AD 131/4-1)和Wilhelm Sanderstiftung(2018.105(1+2))的资助。ME得到了德意志学术交流中心(DAAD)通过德国埃及研究长期奖学金的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺: 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染虽然在免疫功能正常的人群中通常无症状,但在免疫功能低下的患者中可诱发危及生命的疾病,并且是发育中的胎儿宫内感染后出生缺陷的主要原因[1]。与所有疱疹病毒一样,HCMV高度适应其宿主,并使用多种包膜蛋白来决定病毒包膜与细胞膜的附着、受体识别和融合[2]。此外,它还表达许多免疫调节基因,包括趋化因子[3]。HCMV CC 趋化因子样 UL128 编码蛋白已被证明在感染中起双重作用。作为一种病毒趋化因子,pUL128可塑造单核细胞活化[4,5]。作为五聚体gHgLpUL(128,130,131A)进入复合物的重要组成部分,pUL128有助于HCMV的广泛病毒细胞嗜性,并促进多种细胞类型的感染,包括单核细胞和树突状细胞[2,6\u20128]。除了另一种三聚体gHgLgO进入复合物外,五聚体复合物还塑造了HCMV的细胞趋向性,并提供了一种引导HCMV通过感染宿主的方法[9,10]。虽然对细胞培养中HCMV感染的研究有助于理解单核细胞感染或单核细胞活化,但体外模型不能完全概括体内HCMV感染和活化过程中单核细胞感染和活化的作用。这只能在动物模型中解决。pUL128的功能同源物已鉴定出多种动物巨细胞病毒,包括小鼠巨细胞病毒(murine CMV, MCMV)和大鼠巨细胞病毒(rat CMV, RCMV)[11–13]。研究最广泛的同源物是在MCMV中发现的MCK2蛋白,该蛋白由MCMV开放阅读框(open reading frame, ORF)m131和m129结合的剪接事件引起[11,14]。与HCMV的pUL128一样,MCK2的氨基酸序列显示出CC(?)-趋化因子的半胱氨酸模式特征,并表现出趋化因子的功能特征,即体外PEC中钙信号传导的诱导、髓系祖细胞的募集和体内炎症的诱导[14\u201217]].与HCMV类似,MCMV病毒粒子也含有两种替代的gHgL进入复合物,即gHgLgO和gHgLMCK2。后者是HCMV gHgLpUL(128,130,131A)五聚体复合物的功能同源物,决定了MCMV在体外和体内对巨噬细胞的嗜性[18\u201222]。感染缺乏MCK2的MCMV小鼠表现出多效性表型,其显著特征是唾液腺感染减少[14,15,21,23]。此外,还观察到抗病毒CD8 T细胞反应增强,与肺和脾脏滴度一过性增加有关[24,25],同时感染脾脏中IFN-α、IFN-γ和CCL2水平降低[24]。MCK2趋化因子活性或gHgLMCK2复合物如何导致观察到的唾液腺感染和抗病毒防御差异尚不清楚。此外,也不知道趋化因子是通过促进 gHgLMCK2 依赖性进入的相同受体还是通过不同的受体发挥其活性。+
在这里,我们首次证明了 gHgLMCK2 依赖性细胞嗜性和 MCK2 趋化因子活性是 MCK2 的独立功能。我们构建了MCMV突变体,这些突变体要么缺乏形成gHgLMCK2复合物的能力,要么表达活性趋化因子,反之亦然。通过使用这些突变体,我们可以证明单核细胞和唾液腺滴度的感染依赖于 gHgLMCK2 复合物。相比之下,早期抗病毒CD8 T细胞反应的降低受MCK2趋化因子活性的控制。如果 MCK2 功能中的任何一个丧失,则不可能有效诱导干扰素和 CCL2 等细胞因子,并且 MCMV 毒力似乎也受趋化因子和 gHgLMCK2 复合物的影响。+
结果
MCMV MCK2突变体,用于区分MCK2的趋化因子活性和gHgLMCK2依赖性病毒进入
为了研究MCMV的MCK2蛋白在体内的作用,既往研究中主要使用了缺乏完整MCK2蛋白的MCMV突变体[14,16,18,21,23–26]。为了确定 MCK2 的趋化因子活性和 gHgLMCK2 复合物促进的进入是否是 MCK2 的独立功能,我们克隆了趋化因子阴性但复合物阳性、趋化因子阳性但复合物阴性或趋化因子阴性和复合物阴性的 MCMV 突变体。所有MCK2突变均被引入BAC克隆的MCMV史密斯菌株(pSM3fr-MCK2fl,此处称为wt MCMV)的基因组背景中[23](图1A)。MCK2 C1突变体携带点突变,导致半胱氨酸27到甘氨酸27交换,因此不能形成 CC 趋化因子的 C1-C3 二硫键特征。因此,C1 MCK2 不应不再是活性趋化因子,但仍可能与 gHgL 形成复合物。129stop突变体携带终止盒,该终止盒中断129 ORF [18],导致MCK2蛋白截短。该突变与在BAC克隆的MCMV史密斯菌株中发现的MCK2突变相同[23,27]。131stop突变体携带终止突变,中断131 ORF [18],因此不表达MCK2蛋白。在蛋白质印迹(WB)分析中,C1 MCMV显示出多条带的典型MCK2 WB模式,这是wt MCK2蛋白的特征[11,18](图1B)。129stop MCMV 表达截短的 MCK2 蛋白,131stop MCMV 不表达 MCK2 蛋白(图 1B)。Wt 和 C1 MCK2 被整合到病毒粒子中(图 1C,左图),wt 和 C1 MCK2 都形成了先前描述的 gHgLMCK2 复合物(图 1C,右图)[18]。有趣的是,MCK2与半胱氨酸C27和C28分别交换为精氨酸和甘氨酸(C1C2突变)[15],在WB中显示出不同的模式(图1D,左图),并且没有掺入病毒粒子中(图1D,右图)。这表明破坏 MCK2 中的两个二硫键导致突变蛋白无法形成包膜 gHgLMCK2 复合物。当我们研究原代成纤维细胞培养物的生长时,我们观察到一组MCK2突变体。与 wt 或 C1 MCMV 相比,不能形成 gHgLMCK2 复合物的突变体 129stop、131stop 和 C1C2 显示出上清液病毒滴度升高(图 1E)。病毒之间的差异太小,无法达到统计学意义,但gHgLMCK2阳性和阴性病毒的分组是惊人的。对于HCMV,有报道称,与五聚体阴性HCMV感染相比,gHgLpUL(128,130,131A)复合物会阻碍感染细胞释放新产生的病毒,导致细胞培养物中上清液病毒的滴度较低[28,29]。我们的数据表明,对于表达或缺乏 gHgLMCK2 复合物的 MCMV 也是如此。我们的观察结果是 MCMV gHgLMCK2 复合物和 HCMV gHgLp(UL128,130,131A) 复合物之间功能同源性的另一个迹象。
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图 1. MCMV MCK2突变体。
(A) MCMV MCK2 蛋白和 MCMV MCK2 突变体 C1、129stop 和 131stop 的示意图。(B) MEF 细胞以 1 的感染倍数 (m.o.i.) 感染 wt MCMV 和不同的 MCK2 突变体感染。48 小时后制备总细胞裂解物,并通过 WB 分析。(C)浓缩的病毒制剂在还原(左图)或非还原(右图)条件下裂解,并通过WB分析。(D) MEF 细胞被 wt、C1C2 或 C1 MCMV 感染,m.o.i. 为 1。48 小时后制备总细胞裂解物,并通过 WB 分析(左图)。裂解 wt、C1C2 或 C1 MCMV 的浓缩病毒制剂,并通过 WB 进行分析(右图)。(E) MEF 细胞中 wt、C1、C1C2、129stop 或 131stop MCMV 的多步生长曲线。细胞以 0.o.i. 的 m.o.i. 感染,每 24 小时收获一次上清液并滴定。显示的是三个独立实验(p.i.,感染后)的平均值 +/- SD。观察到的差异无统计学意义(2因素方差分析与土耳其的多重比较检验)(B)、(C)和(D)所有WB均用MCK2特异性抗体染色。作为可比感染或可比数量的病毒粒子的量度,对 WB 进行额外染色以检测糖蛋白 B (gB) 的表达。标记蛋白的分子量如左图所示。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011793.g001
为了确认 C1 突变体趋化因子活性的丧失,我们将 wt 和 C1 MCK2 表达为无标签的可溶性重组蛋白,将 wt、C1 和 129stop MCK2 表达为可溶性重组人 IgG-Fc 融合蛋白。129stop MCK2 只能使用 IgG 标签进行定量,因为抗 MCK2 抗体 MCK2.04 对 129stop MCK2 的亲和力降低。使用人 IgG-Fc 特异性 ELISA 通过 MCK2 特异性定量 WB 和 IgG-Fc 融合蛋白调节未标记重组蛋白的量。通过ELISA测定的可比蛋白质量还通过WB目视确认(图2A)。抗 MCK2 抗体可识别 m131 ORF 中迄今为止未表征的表位,但未能检测到 C1 MCK2。这样,我们也可以通过 WB 来区分 wt 和 C1 MCK2(图 2B)。在跨孔迁移试验中,我们可以验证重组 wt MCK2 蛋白诱导 J774 和 ANA-1 巨噬细胞的迁移,而重组 C1 MCK2 失去了这种趋化因子活性图 2C 和 S1A)。之前已经表明,仅包含m131 ORF的合成MCK2是一种活性趋化因子,可以在小鼠腹膜巨噬细胞中诱导钙信号传导[16]。同样,我们可以在这里证明,截短的重组 129stop MCK2 缺乏约 70% 的 m129 ORF,但表达完整的 m131 ORF,是一种活性趋化因子,可以诱导 J774 巨噬细胞的迁移(图 2C)。
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图 2. C1 MCK2 是一种无活性的趋化因子。
(A) HEK293 细胞用表达人 IgG-Fc 融合蛋白 wt、C1 和 129stop MCK2 的 pFuse 载体转染。转染后 24 小时,收获转染细胞的上清液,用 EtOH 沉淀蛋白质,并使用人 IgG 特异性抗体通过 WB 检测。使用来自空转染细胞的上清液作为对照。(B) WB 还使用 MCK2 特异性抗体(抗 MCK2131).(A)和(B)MCK2-Fc融合蛋白的特异性条带用箭头表示。标记蛋白的分子量如左图所示。(C) 使用来自转染表达指定 MCK2 融合蛋白的 pFuse 载体的 HEK293 细胞的上清液对 J774 细胞进行 Transwell 迁移测定。使用 Fc 特异性 ELISA 调节 Fc 融合蛋白量。迁移表示为用空 pFuse 克隆载体转染的 HEK293 细胞表达的人 IgG-Fc 迁移的百分比。符号表示独立实验。所示为独立实验的平均值 +/- SD (n = 3–9)。使用单因素方差分析检验确定 P 值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011793.g002
MCK2趋化因子活性对gHgLMCK2依赖性进入宿主细胞并不重要
缺乏gHgLgO复合物的MCMV感染MCMV宿主细胞严格依赖于替代性gHgLMCK2复合物[18,20]。因此,缺乏这两种复合物的MCMV突变体既不能产生传染性病毒,也不能在体内或细胞培养物中传播[18,20]。为了确定导致 MCK2 趋化因子活性丧失的 C1 突变是否也会影响 gHgLMCK2 进入功能,我们构建了一个携带 gO (m74) 缺失和 MCK2 C1 突变的 MCMV 突变体。如果进入功能受到影响,则 Δm74/C1 突变体不应在细胞培养物中生长。通过比较 wt、Δm74 和 Δm74/C1 MCMV 的生长,我们发现 Δm74/C1 双突变体在成纤维细胞培养物中表现出与 Δm74 MCMV 相同的生长模式(S1B 图)。这表明 C1 突变不影响宿主细胞的 gHgLMCK2 依赖性感染。
我们和其他人先前已经表明,MCMV的MCK2突变体感染巨噬细胞在体外和体内均受损[18,19,21,22]。与wt MCMV感染相比,129stop和131stop MCMV均无法形成gHgLMCK2复合物,对巨噬细胞的感染能力降低[18]。为了更详细地研究 MCK2 在巨噬细胞感染中的作用,我们用 wt、C1、129stop 和 131stop MCMV 感染 ANA-1 和 J774 巨噬细胞,并通过细胞内细胞荧光染色 (ICS) 确定 MCMV 即刻早期 (IE) 1 蛋白的感染细胞数量。此外,我们还研究了D2SC/1树突状细胞的感染,因为在细胞培养物中,缺乏五聚体复合物的HCMV对巨噬细胞和树突状细胞的嗜性均严重受损[6,7]。用蔗糖缓冲纯化的病毒感染细胞,以确保释放到病毒生产细胞上清液中的因子不影响单核细胞对病毒感染的易感性。如前所述,129stop和131stop突变体对ANA-1和J774巨噬细胞的感染受损(图3A、3B、S2A和S2B)[18]。 此外,正如五聚体阴性HCMV感染树突状细胞所描述的那样,树突状细胞的感染也依赖于gHgLMCK2(图3C和S2C)。
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图 3. MCMV 的巨噬细胞和树突状细胞嗜性依赖于 gHgLMCK2 复合物。
(A) ANA-1 细胞、(B) J774 细胞和 (C) D2SC/1 细胞以相等的感染剂量/ml 感染(由 TCID 确定50在 MEF 上测定)的 wt、C1、129stop 或 131stop MCMV。24 小时后,通过 IE1 阳性细胞的 ICS 染色确定感染细胞的百分比。gHgLMCK2 复合阴性 MCMV 以红色突出显示。所示为独立实验的平均值 +/- SD (n = 3–4)。用于评估差异显著性的 P 值(单因素方差分析检验)适用于最感兴趣的组比较。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011793.g003
gHgLMCK2阴性突变体129stop和131stop感染的减少程度是细胞系特异性的(图3)。与 ANA-1 和 D2SC/1 细胞相比,J774 感染也显示 C1 MCMV 感染的细胞数量减少。然而,与129stop和131stop MCMV相比,这种减少明显不明显(图3B)。因此,所有三种细胞系的感染显然依赖于病毒粒子 gHgLMCK2 复合物。我们没有观察到缺乏MCK2趋化因子活性的C1突变体的感染性普遍降低。
唾液腺的 MCMV 感染由 gHgLMCK2 复合物促进
在比较wt MCMV或表达MCK2突变体的小鼠感染时,一些出版物描述了不同器官的病毒载量差异[14,15,23–25]。研究结果不一致,取决于感染途径、病毒株、接种物和分析的时间点。有一个值得注意的例外:从第7天到第14天,唾液腺中MCK2突变体的滴度总是降低[14,15,23–25,30–32]。目前尚不清楚这是由于白细胞扩散感染的募集受损,还是由于这些白细胞没有 gHgLMCK2 依赖性感染,或者是由于控制唾液腺感染的抗病毒免疫反应的调节。因此,我们用 wt MCMV 和 MCK2 突变病毒感染 BALB/c 小鼠,并测定感染后第 14 天 (p.i.) 唾液腺中的病毒载量。gHgLMCK2 复合物阴性 129stop 和 131stop 突变体显示唾液腺中病毒滴度降低 2 个对数,而 C1 突变体显示出与 wt MCMV 相同的病毒滴度(图 4A)。这表明宿主细胞的 gHgLMCK2 依赖性感染,而不是宿主细胞的 MCK2 依赖性募集,促进唾液腺中的高病毒滴度。有趣的是,通过感染中心测定(图4B)和定量PCR(图4C)定量的外周血白细胞(PBL)(第4天p.i.)感染,在wt MCMV或MCK2突变体感染之间没有显示出显着差异。
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图 4. gHgLMCK2 复合物促进唾液腺感染。
(A) BALB/c 小鼠腹腔内感染 2 x 105指定病毒的 PFU。在感染后第 14 天 (p.i.) 通过器官匀浆斑块测定法测定唾液腺中的 MCMV 滴度。符号表示个体小鼠器官中的滴度,并标记了中值。DL, 检出限。显示了用于评估差异显着性的 P 值(单因素方差分析检验(左图)、未配对学生 T 检验(右图))。(B)和(C)BALB/c小鼠被(A)所述感染。(B) PBL 每年收获 4 天,并在 MEF 上进行感染中心测定。符号表示个体小鼠感染PBL的百分比,并标记了中值。(C)从PBL中提取DNA,用于通过PCR定量细胞和病毒基因组。符号表示每 10 个病毒基因组数6标记中值的个体小鼠的细胞。(B)和(C)分析组之间未观察到显着差异(Kruskal-Wallis检验与Dunn的多重比较)。(A) 至 (C) gHgLMCK2 复合阴性突变体以红色突出显示。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011793.g004
MCK2 趋化因子活性塑造早期 CD8 T 细胞反应+
之前已经表明,MCK2抑制脾脏中早期CD8 T细胞反应[24,25]。对感染 MCK2 阳性或阴性 MCMV 的小鼠脾脏中 IE1 特异性 CD8 T 细胞反应的比较显示,在第 4 天 p.i. 时,MCK2 阴性 MCMV 的特异性 T 细胞数量更高。在第6天,不再观察到MCK2依赖性抑制IE1特异性T细胞[24]。为了证实这些数据,我们用 wt 或 131stop MCMV 感染 BALB/c 小鼠,并测定脾脏 4 天和 7 天 pi 中 IE1 特异性激活的 CD8 T 细胞的百分比。我们发现在第 4 天 p.i. 中,131stop MCMV 的活化 IE1 特异性 CD8+ T 细胞百分比显着更高。在第 7 天,wt MCMV 感染显示出比 131stop MCMV 更高的活化 T 细胞百分比(S3A 图),表明 MCK2 依赖性抑制早期 T 细胞反应是短暂的。由于尚不清楚这种早期抑制是由MCK2趋化因子吸引抑制T细胞反应的免疫调节细胞[25]还是由gHgLMCK2依赖性感染和随后的T细胞活化细胞(如巨噬细胞和树突状细胞)的重编程[33,34],我们比较了WT和所有三种MCMV突变体在第4天p.i.的IE1特异性CD8 T细胞反应。131stop 感染的小鼠显示出 IE1 特异性 CD8 T 细胞百分比显着增加(图 5A)。C1感染的小鼠也显示出IE1特异性CD8 T细胞数量增加的趋势,而129stop突变体显示出更受抑制的T细胞反应的趋势(图5A)。这导致 C1 和 129stop MCMV 感染之间 IE1 特异性 CD8 T 细胞百分比存在显着差异。wt MCK2 主要与 gHgL 络合,截短的 129stop MCK2 不与 gHgL 络合,都是活性趋化因子。我们发现两者都抑制了早期IE1特异性CD8 T细胞反应。不表达活性 MCK2 趋化因子的 131stop 和 C1 MCMV 已经失去了抑制 T 细胞反应的能力。在确定脾脏和肺的器官滴度时,我们发现活化的 IE-1 特异性 CD8 T 细胞的差异主要反映在 129stop MCMV 感染中的病毒清除率降低(图 5B)。与 wt MCK2 相比,129stop MCMV 的这种表型可能是由于截短的 MCK2 的释放效率更高,或者是活性趋化因子与感染和功能转化免疫调节细胞(如巨噬细胞和树突状细胞)同时缺乏的结合。+++++++++
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图 5. MCK2 趋化因子塑造早期抗病毒 CD8+ T 细胞反应和器官清除。
(A) 和 (B) BALB/c 小鼠腹腔内感染 2 x 105指定病毒的 PFU。收获 4 天和 6 天的 p.i.、脾脏和肺。(A) p.i. 4 天,用 ICS 测定的 MCMV 和 IFN-γ阳性 CD8 T 细胞的 IE1 特异性肽刺激脾细胞。符号表示单个小鼠的IFN-γ阳性CD8 T细胞的百分比。列表示均值 +/- SD。 用于评估差异显著性的 P 值(Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 多重比较)用于最感兴趣的组比较。在第 4 天和第 6 天通过斑块测定法测定脾脏和肺中的病毒滴度 (B)。符号表示标有中值的个体小鼠。P 值(未配对的 Student-T 测试)表示第 4 天和第 6 天之间的成对比较以测试清除率。对于在第 4 天和第 6 天之间表现出显着差异的每种病毒,描绘了倍数变化。通过比较每只小鼠第 6 天的滴度和第 4 天的平均滴度(Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 的多重比较)来确定显着性。(A) 和 (B) MCMV 表达无 MCK2 趋化因子或有缺陷的 MCMv 以绿色突出显示。DL, 检出限。++
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011793.g005
MCK2 趋化因子和 gHgLMCK2 复合物均形成脾脏中的干扰素和趋化因子水平,并有助于 MCMV 毒力
研究表明,MCK2 调节病毒诱导的脾脏细胞因子产生。与wt MCMV感染相比,MCK2阴性MCMV感染的IFN-α、IFN-γ和促炎细胞因子CCL2水平降低[24]。基于这些研究,我们用 wt MCMV 和 MCK2 突变体感染 BALB/c 小鼠,并比较脾脏 4 天和 6 天 p.i. 的 IFN-γ(图 6A)和 CCL2(图 6B)水平。正如Wikstrom等[24]所描述的,与感染wt MCMV的小鼠相比,131stop突变体的IFN-γ和CCL2水平降低。有趣的是,C1 和 129 个终止突变体的水平也降低,这表明 IFN 和 CCL2 的诱导是由 MCK2 趋化因子和 gHgLMCK2 复合物塑造的,没有明显的趋化因子或 gHgLMCK2 复合物在调节 IFN-γ 或 CCL2 中占主导地位的趋势。
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图 6. MCK2 趋化因子和 gHgLMCK2 复合物均调节脾脏中趋化因子和细胞因子的产生并促进 MCMV 毒力。
BALB/c 小鼠腹腔内感染 2 x 105指定病毒的 PFU。通过ELISA测定均质脾脏中4 d的p.i.、IFN-γ(A)和CCL2(B)水平。符号表示个体小鼠脾脏中的细胞因子/趋化因子水平。列表示平均值 +/- SEM。 P值(Kruskal-Wallis检验与Dunn多重比较)显示显著差异。(C) 在 5 天 p.i. 中,每 24 小时称一次小鼠的体重,体重描述为第 0 天体重的百分比。显示的是每组 8 至 14 只小鼠的平均值 +/- SD。P 值(带有土耳其多重比较检验的 2 微方差分析)显示了显着不同的体重增加过程。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011793.g006
BALB / c小鼠用2 x 10 ip感染5细胞培养衍生的 wt MCMV 的 PFU 通常没有显示严重的疾病迹象。在感染后的前5天内,我们经常观察到体重轻微减轻或体重没有增加。当我们比较感染 MCMV 的 wt MCMV 或 MCK2 突变体的小鼠的体重时,我们观察到 131stop 突变体的体重发展与 wt、C1 和 129stop MCMV 的体重发展显着不同(图 6C)。感染 wt、C1 或 129 stop MCMV 的小鼠在感染后的前五天内没有体重增加,而 131stop MCMV 随着时间的推移明显显示出体重增加。这与MCK2阴性MCMV感染小鼠的脾脏和肝脏病变减少的报道一致[14,24],以及缺乏MCK2功能同源物GP129的GPCMV感染豚鼠体重减轻[35]。因此,MCK2 趋化因子和 gHgLMCK2 复合物似乎都有助于 MCMV 的发病机制。
讨论
CMV CC 趋化因子是许多巨细胞病毒免疫调节蛋白中的一个例子。它们在感染周期中具有双重作用,既是单核细胞激活趋化因子[4,5,12,15–17,36,37],又是gHgL趋化因子进入复合物的组成部分[8,18,38]。它们已被证明可以塑造抗病毒免疫应答[24\u2012226],但作为gHgL复合物的一部分,它们也是抗病毒中和抗体应答的重要靶标[39\u2012411]。
在感染情况下研究疱疹病毒蛋白的一种方法是使用敲除病毒。细胞培养中CC趋化因子阴性CMV感染的主要表型是细胞嗜性受限[2,6,18,19,42]。CC趋化因子阴性病毒的体内研究主要使用MCMV[23\u2012225],但也使用RhCMV [43,44]和GPCMV [38]。有趣的是,尽管敲除CC趋化因子在体外细胞嗜性方面存在显著差异,但体内器官滴度的差异主要影响唾液腺中的病毒滴度以及不同器官中巨噬细胞和单核细胞感染的程度[18,19,21,45]。此外,MCMV的MCK2敲除突变体显示出抗病毒免疫应答的多效性变化[24\u201226]。大多数研究将 wt MCMV 与缺乏完整 MCK2 的突变 MCMV 进行了比较。因此,尚不清楚抗病毒免疫应答的特定变化是由于MCK2趋化因子活性的丧失,吸引和塑造炎症和免疫调节细胞,还是由于单核细胞的gHgLMCK2依赖性感染减少,这可能导致感染细胞的重编程[33,34].目前还不清楚是否可以剖析MCK2功能,以了解它们对抗病毒免疫反应的MCK2依赖性调节的贡献。
为了解决这些问题,主要的先决条件是设计特异性失去趋化因子活性 (C1 MCMV)、gHgLMCK2 依赖性进入活性 (129 stop MCMV) 或两者兼而有之 (131stop MCMV) 的 MCK2 突变体,并在体外和体内研究它们的表型。131stop 突变体不表达 MCK2。129stop突变体在m129 ORF中携带终止盒,感染巨噬细胞的能力受损[18]。MCMV细胞培养传代产生的类似突变体在体内也显示出巨噬细胞趋向性受损[18,19,45]。在这里,我们发现 m129stop 突变体在感染细胞中表达截短的 MCK2 蛋白,该蛋白未整合到 gHgLMCK2 复合物中,但具有 wt 样趋化因子活性。为了设计表达无活性趋化因子但仍能够形成功能性 gHgLMCK2 进入复合物的 MCK2 突变体,需要对蛋白质和 gHgLMCK2 复合物的形成进行详细的体外分析,以确保定义 cc 趋化因子结构的 4 种半胱氨酸中的一种或多种的突变仅消除趋化因子活性,而不消除 gHgLMCK2 复合物的形成。消除 C1-C3 二硫键的 C1 突变体满足这些标准。C1 MCK2 是一种无活性的趋化因子,但仍形成病毒粒子 gHgLMCK2 复合物,并在细胞培养中显示出类似 wt 的生长特性。
在体外分析巨噬细胞和树突状细胞的感染时,我们可以确认无法形成 gHgLMCK2 复合物的 MCK2 突变体表现出感染巨噬细胞的能力受损,并且新的是,这与感染树突状细胞的能力受损密切相关。值得注意的是,C1突变体表现出J774细胞特异性感染能力的降低,但比gHgLMCK2阴性的129stop和131stop突变体所显示的明显损伤要弱得多。这可能反映出 C1 MCMV 的 gHgLMCK2 复合物表现出轻微的结构变化,这可能会损害 gHgLMCK2 与其受体的相互作用,但只有在细胞类型高度依赖 gHgLMCK2 驱动的进入(如 J774 细胞)时才会变得明显。巨噬细胞和树突状细胞感染受损也见于五聚体阴性HCMV[4,6]。据报道,树突状细胞可促进MCMV在感染小鼠体内的播散[46,47]。此外,CD11c阳性髓系细胞已被描述为将MCMV转移到唾液腺腺泡细胞[31]。gHgLMCK2 阴性 MCMV 感染这些单核细胞的能力降低可能是唾液腺滴度降低的一种解释。我们的研究结果指出,129stop 和 131stop MCMV 感染时唾液腺滴度降低,但 C1 MCMV 感染时没有。因此,树突状细胞定植唾液腺的gHgLMCK2依赖性趋向性确实可能有助于唾液腺的有效感染。我们之前已经证明,第14日时唾液腺滴度的MCK2依赖性差异取决于感染途径,当小鼠静脉感染时,这种差异会消失[20,23]。这加强了组织驻留迁移细胞类型促进向唾液腺扩散的发现[46],当小鼠被静脉感染时,可以绕过这一途径。
唾液腺滴度显著降低是 gHgLMCK2 阴性 MCMV 感染的可靠表型。相比之下,在脾脏、肝脏、肺和血液中观察到MCK2阴性MCMV感染后滴度降低的观察结果并不一致、轻微,且取决于感染途径、感染剂量以及所用的小鼠或病毒株[14,24,25,31,32,45]。很有可能,器官滴度的 MCK2 依赖性差异只能在详细的时间过程中清楚地揭示出来,并且会因每个实验环境而异。PBL感染可能也是如此。通过使用成纤维细胞的体外再激活试验或通过测定PBL中的病毒DNA载量来分析PBL,我们观察到在腹腔内感染4天后Balb/c小鼠中MCMV的wt和MCK2突变体感染之间没有差异,而Saederup等[15]发现使用相同的感染途径,MCK2阴性MCMV的感染PBL数量减少。
器官滴度不仅由将感染传播到特定器官的细胞塑造,还由局部免疫反应塑造。对于MCK2敲除突变体,脾脏早期IE1特异性CD8 T细胞反应升高[24,25],这表明MCK2可以抑制早期抗病毒T细胞反应,并可能促进病毒在器官中的复制。在我们的手中,131stop 和 C1 突变体的感染显示出增强的早期抗 IE CD8 T 细胞反应,这表明 CD8 T 细胞反应被活性 MCK2 趋化因子抑制。这支持了Daley-Bauer等[25]的假设,他们假设MCK2吸引炎性单核细胞,然后抑制CD8 T细胞活化。有趣的是,129stop 突变体对 CD8 T 细胞反应的抑制比 wt MCMV 更强。解释这一发现的一个假设可能是,未与 gHgL 络合的 MCK2 趋化因子更具活性。另一种假设可能是,活性趋化因子的存在和 129stop 突变体感染单核细胞的能力平行降低可能导致更明显的炎症性单核细胞反应。+++++
与表达CC趋化因子的RhCMV疫苗载体相比,靶向SIV且缺乏RhCMV CC趋化因子的RhCMV疫苗载体在免疫小鼠中引起非常规CD8 T细胞反应[44,48]。非常规的CD8 T细胞反应导致SIV感染的早期控制[49]。这些发现引发了对用于疫苗接种的定制CMV载体的深入研究[48]。在这里,我们研究了靶向 MCMV IE1 蛋白的早期 CD8+ T 细胞反应的定量差异。我们没有解决当MCK2突变时抗病毒CD8 T细胞反应是否也发生定性变化的问题。然而,用表达MCK2突变的MCMV疫苗载体对小鼠进行免疫接种将是解决CMV CC趋化因子在疫苗接种中的作用的有趣模型。+++
Wikstrom等[24]显示,感染MCK2阴性MCMV的小鼠脾脏中IFNs和炎性趋化因子CCL2水平降低。我们观察到所有 MCK2 突变体的 IFN-γ 和 CCL2 水平均降低。这表明,为了在感染后产生高水平的细胞因子/趋化因子,需要活性趋化因子和有效感染与 wt MCMV 相同的靶细胞的能力。所有突变体的细胞因子/趋化因子水平的降低都相当。
研究显示,当小鼠感染相同数量的感染性颗粒时,MCK2和GPCMV的功能同源物GP129的缺失会导致病毒的毒性降低[14,24,35]。这也可以解释为什么唾液腺来源的MCMV原液(均质MCK2阳性)[23]与组织培养衍生的病毒原液相比,表现出更强的毒力。MCMV感染后体重减轻是病毒毒力的症状之一。在这里,我们发现与wt,C1或129stop MCMV感染的小鼠相比,无论感染如何,只有131stop MCMV感染的小鼠体重增加。这表明 MCK2 依赖性毒力是由 MCK2 的两种功能决定的。
在细胞培养物中繁殖MCMV存在选择MCK2失活突变的风险[23]。因此,当使用细胞培养衍生病毒时,应控制ORF m131和m129序列,以避免抗病毒免疫反应的不受控制的调节。一个突出的例子是使用源自 BAC pSM3fr [27] 重建的 MCMV 的研究,该 MCMV 在 ORF m129 中携带固定突变,对应于我们的 129stop 突变体。因此,由pSM3fr衍生病毒引起的抗病毒免疫反应将类似于129stop突变体引起的反应,而不是由wt MCMV引起的反应。
总之,我们的研究首次证明 MCK2 趋化因子和 gHgLMCK2 复合物具有不同的功能,可以独立或协同作用。这为理解 MCK2 在 MCMV 感染中的作用奠定了全新的基础。此外,对缺乏趋化因子或携带特定突变体的实验室菌株的巨细胞病毒免疫反应的研究现在可以回顾性地重新评估。对于未来的研究,例如CMV疫苗载体的设计,必须考虑到,正如RhCMV载体所显示的那样[48],CC趋化因子与特定病毒株或载体骨架的其他免疫调节基因之间的相互作用可能进一步塑造CC趋化因子依赖性免疫调节。
材料与方法
道德声明
根据德国联邦法律 §8 Abs. 1 TierSchG(动物保护法),动物研究方案已获得 Regierung von Oberbayern 伦理委员会的批准,许可号为 55.2-1-54-2532-78-2015。
小鼠和感染
BALB / c小鼠(由法国Janvier-Labs培育)在德国慕尼黑LMU的Max von Pettenkofer研究所的动物设施中保持在SPF条件下。在150μlPBS中腹腔内感染6-8周龄的雌性BALB / c小鼠,用组织培养物(NIH3T3)衍生的wt MCMV或MCMV突变体感染。通过MEF细胞上的噬菌斑测定滴定体内感染的病毒储备液。所有小鼠均被CO处死2吸入或颈椎脱位。
细胞、病毒和细胞培养研究
将BALB/c小鼠原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、NIH3T3细胞(ATCC:CRL-1658)和细胞系J774A.1(ATCC:TIB-67)维持在补充有10%胎牛血清(FCS)的DMEM培养基中。将小鼠巨噬细胞系ANA-1(CVCL_0142)维持在补充有10%FCS的RPMI培养基中。树突状细胞系D2SC/1(CVCL_U653)维持在补充有5%FCS和50μM β-巯基乙醇的IMDM培养基中。
BAC (pSM3fr-MCK-2fl) 衍生的 MCMV 被用作 wt MCMV [23]。pSM3fr-MCK-2fl衍生的MCK2突变病毒129 stop、131stop和delta m74 [18]之前已有报道。如前所述,通过蔗糖梯度超速离心从感染的NIH3T3细胞的上清液中制备病毒储备液[50]。使用 MEF 培养物通过 TCID50 测定法测定病毒滴度。为了监测巨噬细胞或树突状细胞的病毒感染,进行了细胞内细胞荧光染色 (ICS)。简而言之,用 0.5 mM Na-EDTA 分离细胞,用 1% 多聚甲醛固定 10 分钟,然后使用抗 IE1 抗体(Croma101,由克罗地亚里耶卡大学的 Stipan Jonjic 提供)和 Fluor488 偶联的山羊抗小鼠抗体(Cell Signaling Technology)在含有 0.3% 皂苷和 1% BSA 的 PBS 中染色。用含有0.03%皂苷的PBS洗涤细胞。染色后,将细胞重悬于1%多聚甲醛中,并使用CellQuest软件(BD Biosciences)在FACSCalibur上进行分析。
BAC诱变
如前所述,进行无标记BAC诱变以将突变引入BAC克隆的MCMV基因组[51]。将 C1 点突变、C1C2 双突变和 131stop 突变引入 pSM3fr-MCK-2fl BAC 的 m131 ORF 中。C1突变也被引入Δm74突变体的m131 ORF中[18]。对于克隆 C1 突变,引物 C1-for (5'-ACCGCGTACAGCGGGAGAGGGTGCAGCTGCGGCCGCGCGCAAC C TGGCTCGCGGAGGTCCGCGAAGGATGACGACGATAAGTAGGG-3') 和 C1-rev (5'-CGTGTTGGTCGTGTCTACCGTCGCGGACCTCCGCGAGCCA GGTTGCGCGCGGCCGCGCCTGCACCAACCAATTAACCAATTGATGATTAG-3') 和克隆 C1C2 双突变体,引物 C1C2-for (5'- ACCGCGTACAGCGGGAGAGGGTGCAGCTGCGGCGCGC CACCTGGCTCGCGGAGGTCCGCGAAGGATGACGACGATAAGTAGGG-3')和C1C2-rev(5'-CGTGTTGGTCGTGTCTACCGTCGCGGACCTCCGCGAGCCA GGT G GCGCGCGGCCGCAGCTGCACCAACCAATTAACCAATTCTGATTAG-3')。为了克隆 131stop 突变,使用了引物 m131stopdirect-for (5'-GACACGACCAACACGACGCAACAGACGAGGC AGCACGAGGAGCGTTCCTATTAAGGATGACGACGATAAGTAGAGTAGGG-3') 和 m131stopdirect-rev (5'-TGTTTTTGCTTAACGTTTCACTGATTCACAATAAAA TCTCATCTGAAATGTAATAGGAACGCTCCTCGTGTGCTGCCAACCAATTAACCAATTCTGATTAG-3')。突变碱基以粗体标记。引入的突变通过测序进行控制。使用 Superfect 转染试剂 (Qiagen) 将纯化的 BAC DNA 转染到 MEF 中,从而复溶重组 MCMV。
蛋白质印迹分析
将超速离心浓缩的细胞或上清液病毒在还原样品缓冲液(0.5 M Tris-HCl(pH 6.8)、6% SDS、10% α-硫代甘油)中裂解,经 SDS-PAGE 处理并转移到硝酸纤维素膜上。用小鼠单克隆抗体MCK2.04 [52]或MCK2.07检测MCMV MCK2,后者可识别MCK2的m131 ORF中的表位。这两种抗体都是针对克罗地亚里耶卡大学蛋白质组学中心的重组 MCK2 蛋白产生的。使用小鼠单克隆抗体5F12 [20](由德国埃尔朗根-纽伦堡大学的Michael Mach提供)检测MCMV gB。采用过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠或抗人抗体(Sigma-Aldrich)进行检测。
质粒和转染
对于重组未标记 MCK2 蛋白的表达,使用 pCR3 载体 (Invitrogen)。对于重组 MCK2 人 IgG1Fc 融合蛋白的表达,使用 pFuse-hIgG1-Fc2 表达载体 (Invivogen)。从cDNA中克隆了pSM3fr-MCK2fl或129stop突变体的完整m131/129 ORF,用于表达wt MCK2和MCK2129停止蛋白质。为了引入 C1 突变,使用 Quikchange II 诱变试剂盒 (Agilent Technologies) 对表达 wt MCK2 的载体进行定点诱变。
将 HEK293 细胞瞬时转染在 10 cm 培养皿中,其中含有 24 μg 质粒 DNA 与聚乙烯亚胺混合。转染后3小时,将培养基交换至DMEM(0.2%BSA,25mM Hepes),转染后24小时,收获上清液并以等分试样冷冻。使用单克隆抗人生物素化捕获抗体(克隆 HP-6017;Sigma)和小鼠抗人Fc特异性过氧化物酶标记的二抗(Calbiochem)。
跨孔迁移测定
J774细胞用IL-4(20ng/ml;Biolegend)24小时,使用Versene(Life Technologies)收获,并重悬于DMEM(0.2%BSA,25mM Hepes)中。200μl(5×106细胞/ml)加入到Millicell细胞培养插入物(5.0μmPET,24孔)的顶部。重组人 IgGFc-MCK2 融合蛋白由 HEK293 细胞表达。将转染细胞的上清液在DMEM(0.2%BSA,25mM Hepes)中稀释至浓度为10μg/ ml Fc蛋白,并加入底部孔中。以载体pFuse-hIgG1-Fc2表达的人IgG-Fc作为背景对照。迁移运行4小时,然后从插入物顶部取出细胞,细胞粘附在底部,用钙黄绿素-AM(Biolegend)标记,然后使用胰蛋白酶释放。使用用钙黄绿素-AM标记的J774细胞的标准曲线确定迁移细胞的数量。
宿主组织中病毒基因组、传染性病毒和细胞因子的定量
在离心增强感染性的条件下,通过MEF上的斑块测定从感染器官的匀浆中测定体内感染性。进行感染中心测定以确定血液中受感染的白细胞数量。简而言之,从非凝固血液中制备外周血白细胞 (PBL) 4 天,计数,添加到 12 孔板中的亚汇合 MEF 单层中,并用羧甲基纤维素覆盖。三天后,对牌匾的数量进行了清点。为了定量PBL中的病毒DNA,使用DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)提取DNA。然后,通过MCMV M55(编码gB)对病毒基因组进行定量,MCMV M55通过pthrp特异性qPCR将特异性qPCR归一化为细胞数量[50]。使用商业 ELISA 测定器官匀浆中的脾细胞因子水平:小鼠 IFN-γ ELISA (Biolegend) 和小鼠 MCP1 (CCL2) ELISA (Biolegend)。
T细胞刺激试验
从脾脏制备单细胞悬液。1 x 106将细胞在圆底 96 孔板中与 1 μg/ml H-2Ld IE 肽 YPHFMPTNL 或作为阴性对照的加扰肽 NFYPTLPHM 共培养 1 小时。之后,以5μg/ ml的浓度加入Brefeldin A(Biolegend),并继续共培养5小时。对细胞进行 CD8 染色(FITC 抗小鼠 CD8a,克隆 53–6.7;Biolegend),固定在 1% 多聚甲醛中,用 0.1% 皂苷 (Sigma-Aldrich) 透化,染色用于胞浆内 IFN-γ(PE 抗小鼠 IFN-γ,克隆 XMG1.2;Biolegend),在FACSCalibur上进行分析,并使用FlowJo软件(BD Biosciences)进行描述。
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C1 MCK2 的表征。
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S1 图。 C1 MCK2 的表征。
(A) 使用转染表达 wt 或 C1 MCK2 的 pCR3 载体或空 pCR3 载体作为对照的 HEK293 细胞的上清液,对 J774 和 ANA-1 细胞进行 Transwell 迁移测定。wt 和 C1 MCK2 蛋白量通过定量 WB 进行调节。通过计算穿过跨孔膜的细胞数量来确定迁移。所示为在5次重复中完成的一项代表性实验的平均值+/- SD。(B) MEF 细胞中 wt、ΔgO 或 ΔgO/C1 MCMV 的多步生长曲线。细胞以 0.o.i. 的 m.o.i. 感染,每 24 小时收获一次上清液,并通过测定 TCID 进行滴定50/毫升。显示的是三个独立实验(p.i.,感染后)的平均值 +/- SD。P 值(带有土耳其多重比较检验的 2 微方差分析)显示了显着不同的生长曲线。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011793.s001
(TIF)
S2 图。
(A) ANA-1 细胞、(B) J774 细胞和 (C) D2SC/1 细胞感染的流式细胞术。图3所示是分析的感染的代表性斑点印迹。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011793.s002
(TIF)
S3 图。 第 4 天和第 7 天 PI 的 IE1 特异性 CD8 T 细胞反应+
(A) BALB/c 小鼠腹腔内感染 2 x 105wt 的 PFU 和 131stop MCMV。4 天和 7 天,用 ICS 测定的 MCMV 和 IFN-γ阳性 CD8 T 细胞的 IE1 特异性肽刺激脾细胞。符号表示单个小鼠的IFN-γ阳性CD8 T细胞的百分比。列表示第 4 天和第 7 天感染的成对比较的 P 值(未配对的学生 T 检验)。显示未感染小鼠的IFN-γ阳性IE1特异性CD8 T细胞进行比较。(B) 第 7 天 p.i. 分析的代表性小鼠脾细胞的流式细胞术+++
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011793.s003
(TIF)
确认
我们要感谢托马斯·戴勒(Thomas Deiler)为开始这项研究铺平了道路,并感谢海科·阿德勒(Heiko Adler)批判性地阅读了手稿。
引用
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