免费医学论文发表-促进脑区域特异性干扰素信号传导和限制蜱传黄病毒感染
抽象
中枢神经系统 （CNS） 中的先天免疫信号传导表现出许多显着的特化，这些特化因细胞类型和 CNS 区域而异。在神经侵袭性黄病毒感染的情况下，神经元利用免疫激酶受体相互作用激酶 3 （RIPK3） 来促进抗病毒转录程序，这与该酶促进坏死性凋亡细胞死亡的传统功能无关。然而，虽然最近的工作已经确定了神经元 RIPK3 信号在控制蚊媒黄病毒感染（包括西尼罗河病毒和寨卡病毒）中的作用，但尚未探索蜱传黄病毒感染期间 RIPK3 信号传导在中枢神经系统中的功能。在这里，我们使用Langat病毒（LGTV）脑炎模型来表明，RIPK3信号在小脑神经元中是控制LGTV复制和限制疾病发病机制所必需的。这种效应不需要坏死性凋亡刽子手分子混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL），这一发现与先前在蚊媒黄病毒感染模型中的观察结果相似。然而，控制 LGTV 感染需要对 RIPK3 具有独特的区域特异性依赖性，以促进小脑中关键抗病毒干扰素刺激基因 （ISG） 的表达。这种 RIPK3 介导的 ISG 表达增强与小脑颗粒细胞神经元中 LGTV 复制的强大细胞内在限制有关。这些发现进一步阐明了 RIPK3 信号转导在协调病毒感染神经免疫反应中的复杂作用，并为中枢神经系统中区域特异性先天免疫信号转导的机制提供了新的见解。
作者摘要
神经和免疫系统之间的相互作用经过精心编排，以保护大脑和脊髓免受免疫介导的损伤，同时仍保持对感染的保护性防御。这些特殊的神经免疫相互作用已被证明在大脑区域之间有显着差异，先天性抗病毒信号在小脑中特别强烈，尽管其原因知之甚少。在这里，我们展示了程序性细胞死亡信号的特殊适应，它独特地保护小脑免受蜱传黄病毒感染。这些发现为促进小脑独特强大的抗病毒免疫的分子机制提供了重要的新见解。它们还为蜱传脑炎的发病机制提供了新的线索，蜱传脑炎是一种全球高度关注的人畜共患病。
数字
Fig 7Fig 8Fig 9图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 9图1图2图3
引文： Lindman M， Angel JP， Estevez I， Chang NP， Chou T-W， McCourt M， et al. （2023） RIPK3 促进脑区域特异性干扰素信号传导和限制蜱传黄病毒感染。PLoS 病理学 19（11）： e1011813 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813
编辑 器： Stanley Perlman，美国爱荷华大学
收到： 2023年5月23日;接受： 2023年11月9日;发表： 十一月27 2023
版权所有： ? 2023 Lindman et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金： 这项工作得到了 R01 NS120895（BPD）的支持。JPA 和 IE 得到了 NIH 促进多样性补充（R01 NS120895-S1 和 NS120895-S2）的支持。IE还得到了HHMI吉列姆高级研究奖学金的支持。NPC 得到了 F31 NS124242的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者声明他们没有竞争利益。
介绍
黄病毒是一类正义RNA病毒，包括几种与人类神经侵袭性感染相关的著名病原体，包括西尼罗河病毒（West Nile virus， WNV）、寨卡病毒（Zika virus， ZIKV）和日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis virus）[1]。虽然几乎所有主要的黄病毒都是通过蚊子媒介传播的，但也有少量但数量可观的黄病毒通过蜱传播，包括蜱传脑炎病毒（TBEV）及其近亲，它们共同构成了一个TBEV血清复合体。蜱传脑炎对公共卫生构成重大且日益严重的威胁，特别是在欧洲和北亚，TBEV是蜱传人畜共患疾病最普遍[2-4]。值得注意的是，一些TBEV毒株在人类中导致的死亡率高达40%[5]，这凸显了迫切需要更好地了解蜱传黄病毒感染的发病机制。
要有效控制中枢神经系统（central nervous system， CNS）中的黄病毒感染，需要神经细胞（尤其是神经元）中强大的先天免疫信号传导，神经元是大多数黄病毒脑炎病例中的主要感染细胞类型[6–9]。有效的I型干扰素（type I interferon， IFN）信号转导对于神经元中病毒复制的先天控制尤为重要[10\u2012122]。值得注意的是，神经细胞类型和大脑区域之间 I 型 IFN 信号传导的差异与对黄病毒感染的易感性差异有关。例如，既往报道表明，与前脑相比，后脑区域I.型IFN信号转导增强，是前脑区域对WNV感染易感性增强的潜在决定因素[12,13]。然而，促进IFN介导的后脑病毒感染差异控制的独特信号传导机制尚未得到广泛表征。
黄病毒感染期间神经元 IFN 信号转导的潜在调节因子是受体相互作用蛋白激酶-3 （RIPK3）。RIPK3是一种传统上与坏死性凋亡相关的酶，坏死性凋亡是溶解性程序性细胞死亡的一种形式[14]。坏死性凋亡是通过混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）的RIPK3依赖性激活而发生的，MLKL形成诱导细胞裂解的寡聚孔复合物[15]。然而，最近的许多研究已经确定了RIPK3信号转导在炎症协调中的复杂作用，包括调节独立于坏死性凋亡的炎症转录反应[16\u2012224]。我们和其他人已经证明，神经元中的RIPK3信号转导对于控制嗜神经病毒感染尤为重要，因为神经元RIPK3促进了强大的抗菌转录程序，包括许多IFN刺激基因（ISG），该基因限制了病毒感染，而不会诱导神经元坏死性凋亡[16,17].最近的其他研究已经确定了RIPK3在I型IFN信号转导的调控中意想不到的作用，其机制包括调节模式识别受体信号转导和PKR介导的Ifnb mRNA稳定[18,19]。
在这项研究中，我们研究了 RIPK3 在控制蜱传黄病毒感染中的作用。为此，我们使用了Langat病毒（LGTV），这是TBEV血清复合物的自然减毒成员，可以在BSL2遏制下进行研究。LGTV感染在啮齿动物中具有神经侵袭性，可导致轻度临床疾病[25,26]。Ripk3小鼠在皮下LGTV感染后表现出增强的神经系统疾病，而Mlkl小鼠与同窝对照组没有区别，表明RIPK3在限制LGTV发病机制方面具有坏死性凋亡非依赖性功能。值得注意的是，Ripk3小鼠在小脑中表现出病毒负荷增加，同时在小脑中表达炎症趋化因子和ISGs的表达减少，但大脑皮层则没有。对培养的原代皮质细胞和小脑细胞类型的体外分析表明，RIPK3 的药理抑制导致小脑颗粒细胞神经元中 LGTV 复制增强，但在皮质神经元或来自任一大脑区域的星形胶质细胞和小胶质细胞中不增加。转录谱分析表明，RIPK3 信号转导是小脑颗粒细胞神经元中 ISG 表达完全诱导所必需的，这表明 RIPK3 在协调中枢神经系统内的先天抗病毒免疫方面具有以前未知的区域特异性功能。-/--/--/-
结果
RIPK3 独立于 MLKL 和外周免疫控制 LGTV 发病机制
为了评估 RIPK3 在控制 LGTV 发病机制中的作用，我们皮下感染 Ripk3 小鼠，以及杂合子同窝对照，用 3x10-/-4马来西亚LGTV菌株TP21的斑块形成单位（pfu）。我们注意到，Ripk3动物没有表现出单倍体功能不全，在该途径的研究中通常用作同窝对照[27\u2012229]。对照组动物在LGTV感染后的死亡率有限（图1A），与既往报道一致[25,26]。然而，缺乏Ripk3表达的小鼠表现出显着加速和增强的死亡率（图1A）。此外，在感染后 14 天 （dpi） 时，更高比例的 Ripk3 小鼠表现出神经系统疾病的临床症状，包括麻痹或完全后肢瘫痪（图 1B），并且这种差异持续到至少 21 dpi。这些数据表明，Ripk3对于限制LGTV感染期间的神经发病机制至关重要。+/--/-
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图 1. RIPK3 限制 LGTV 发病机制，与外周免疫无关。
（A-B）皮下接种 3x10 后 Ripk3 小鼠和同窝对照组的生存分析 （A） 和疾病临床体征 （B） 的表现-/-4PFU LGTV TP21.数据来自两个实验。（C） Ripk3 和同窝对照小鼠皮下感染 LGTV TP21。在感染后的指定日子里，通过qRT-PCR测量脾脏病毒负荷。根据已知病毒滴度的标准曲线对数据进行归一化，以生成斑块形成单位 （PFU） 当量。感染后每天的数据是从 2-3 个实验中汇总而来的。LOD，检测限。（D-P）Ripk3 和同窝对照小鼠用 LGTV TP21 皮下感染 8 天，然后收获脾细胞并通过流式细胞术分析白细胞。（D） 代表性流式细胞术图显示脾脏中 CD3+ 白细胞中的 CD8+ 和 CD4+ T 细胞。数字表示每个门中的细胞相对于绘制的细胞总数的百分比。（东至下）CD3+ 白细胞中 CD8+ T 细胞 （E） 和 CD4+ T 细胞 （F） 的数量。（G-H）CD8+ T 细胞 （G） 和 CD4+ T 细胞 （H） 中 CD44+ 细胞的百分比。（I-N）脾脏白细胞总白细胞中CD19+ B细胞（I）、CD11b+ NK1.1+自然杀伤细胞（J）、CD11c+ MHC-II+树突状细胞（K）、CD45高CD11b+F4/80+巨噬细胞（L）、CD11b+Ly6G+中性粒细胞（M）和CD45高CD11b+Ly6C+单核细胞（N）的数量。（O-P）CD11c+ MHC-II+ 树突状细胞 （O） 和 CD11b+ F4/80+ 巨噬细胞 （P） 中 CD80+ 细胞的百分比。ns，不显著。**p < 0.01，***p < 0.001。-/--/-
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.g001
为了更好地了解这种表型，我们首先评估了早期控制全身感染是否需要RIPK3。受感染小鼠的脾脏表现出低水平的LGTV RNA，不受Ripk3表达的影响（图1C）。为了测试 Ripk3 小鼠是否表现出任何外周免疫反应缺陷，我们在 8 dpi 下对感染动物脾脏中的主要免疫细胞亚群进行了流式细胞术分析。与同窝对照组相比，Ripk3动物在所有脾细胞中表现出相似的CD4和CD8 T细胞频率（图1D）和总数（图1E和1F），以及相似的CD44表达率（一种关键的T细胞活化标志物）在两个亚群中（图1G和1H）。B细胞（图1I）和自然杀伤（NK）细胞（图1J）的数量在基因型之间也相似。在髓系隔室中，我们观察到基因型之间相似数量的CD11c MHCII树突状细胞（图1K），以及表达F4/80（图1L）、Ly6G（图1M）和Ly6C（图1N）的髓系亚群的相似数量。CD11c MHCII 和 F4/80 抗原呈递细胞亚群在基因型之间也表现出相似的共刺激信号 CD80 表达速率（图 1O 和 1P）。这些数据表明，Ripk3小鼠对皮下LGTV激发反应具有正常的外周免疫应答，这与我们之前对WNV和ZIKV的观察相似[16,17]。因此，在缺乏Ripk3的小鼠中观察到的发病机制增加不太可能由外周病毒学控制失败引起。-/--/-+++++-/-
RIPK3 信号转导可能限制 LGTV 发病机制的一个潜在机制是通过诱导感染细胞中的坏死性凋亡。因此，我们测试了坏死性凋亡刽子手分子 MLKL 的丢失是否会影响皮下 LGTV 感染后的病程。值得注意的是，与同窝对照组相比，Mlkl小鼠在存活率或临床疾病体征的发展方面没有差异（图2A和2B）。我们同样看到，Mlkl 在 8dpi 时没有表现出脾脏病毒负荷的改变（图 2C）。流式细胞术分析还显示，在这个时间点，脾脏中所有主要免疫细胞亚群的数量和频率基本相同（图2C-2P）。多步生长曲线分析还表明，RIPK3 和 MLKL 均不影响原代白细胞培养物（包括骨髓来源的巨噬细胞和树突状细胞）中观察到的低水平 LGTV 复制（S1A 和 S1B 图）。这些数据表明，在LGTV感染的情况下，MLKL和坏死性凋亡不是外周病毒学控制或整体疾病发病机制的主要贡献者，因此RIPK3通过另一种机制在该模型中发挥其保护作用。-/--/-
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图 2. MLKL 信号转导不影响 Langat 病毒的发病机制。
（A-B）皮下接种 3X10 后 Mlkl 小鼠和同窝对照组的生存分析 （A） 和疾病临床症状 （B） 的表现-/-4PFU LGTV TP21.数据来自两个实验。（C） Mlkl 和同窝对照小鼠皮下感染 LGTV TP21。在感染后的指定日子里，通过qRT-PCR测量脾脏病毒负荷。根据已知病毒滴度的标准曲线对数据进行归一化，以生成斑块形成单位 （PFU） 当量。感染后每天的数据是从 2-3 个实验中汇总而来的。LOD，检测限。（D-P）在收获脾细胞并通过流式细胞术分析白细胞之前，用 LGTV TP21 皮下感染 Mlkl 和同窝对照小鼠 8 天。（D） 代表性流式细胞术图显示脾脏中 CD3+ 白细胞中的 CD8+ 和 CD4+ T 细胞。数字表示每个门中的细胞相对于绘制的细胞总数的百分比。（东至下）CD3+ 白细胞中 CD8+ T 细胞 （E） 和 CD4+ T 细胞 （F） 的数量。（G-H）CD8+ T 细胞 （G） 和 CD4+ T 细胞 （H） 中 CD44+ 细胞的百分比。（I-N）脾脏白细胞总白细胞中CD19+ B细胞（I）、CD11b+ NK1.1+自然杀伤细胞（J）、CD11c+ MHC-II+树突状细胞（K）、CD45高CD11b+F4/80+巨噬细胞（L）、CD11b+Ly6G+中性粒细胞（M）和CD45高CD11b+Ly6C+单核细胞（N）的数量。（O-P）CD11c+ MHC-II+ 树突状细胞 （O） 和 CD11b+ F4/80+ 巨噬细胞 （P） 中 CD80+ 细胞的百分比。ns，不显著。-/--/-
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.g002
RIPK3 是 LGTV 感染的 CNS 内在限制所必需的
由于我们没有观察到 Ripk3 小鼠外周病毒学控制的差异，我们接下来质疑 RIPK3 是否以 CNS 固有方式限制 LGTV 感染。为了评估这一点，我们接下来使用颅内感染途径来评估 RIPK3 信号转导对 LGTV 发病机制的局部影响。与同窝对照组相比，Ripk3小鼠在颅内感染后表现出加速和增加的死亡率（图3A）。Ripk3缺陷小鼠在死亡前也表现出恶化的临床疾病，感染后更早和更显着的体重减轻证明了这一点（图3B）。相比之下，Mlkl小鼠在颅内感染后的总死亡率（图3C）和体重减轻（图3D）方面与同窝对照组没有区别。这些数据进一步支持了RIPK3通过CNS内在机制限制LGTV神经发病机制的观点，与坏死性凋亡无关。-/--/--/-
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图 3. RIPK3 而非 MLKL 限制颅内感染后 Langat 病毒的发病机制。
Ripk3 （A-B） 和 Mlkl （C-D） 小鼠及其各自的同窝对照组在颅内接种 50 PFU LGTV TP21 后的存活率和体重分析。数据来自两个（A-B）或三个（C-D）实验。ns，不显著。**p < 0.01，***p < 0.001。-/--/-
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.g003
RIPK3 在 LGTV 感染后以区域特异性方式促进神经元趋化因子表达
我们和其他人先前表明，神经元 RIPK3 信号转导是关键炎症趋化因子表达所必需的，这些趋化因子通过协调白细胞募集到受感染的中枢神经系统中来限制 WNV 发病机制。因此，我们质疑 RIPK3 是否也在 LGTV 感染期间促进中枢神经系统中趋化因子的表达。令人惊讶的是，皮下LGTV感染后Ripk3小鼠大脑皮层的转录分析显示，与同窝对照组相比，主要趋化因子的表达没有差异（图4A）。然而，我们确实观察到来自Ripk3动物的小脑组织中趋化因子反应显着减弱（图4B）。我们通过 ELISA 证实了 CXCL10 在 Ripk3 小鼠小脑中的差异表达，但未在大脑皮层中通过蛋白质水平（S2A 和 S2B 图）进行差异表达。为了了解哪些细胞类型导致了趋化因子表达的这种区域特异性缺陷，我们接下来培养了特异性来源于大脑皮层或小脑并感染LGTV的原代神经元和星形胶质细胞，有或没有RIPK3小分子抑制剂（GSK 872）。与我们的体内研究结果一致，阻断大脑皮质神经元中的RIPK3不会影响LGTV感染后的趋化因子表达（图4C）。相反，当 RIPK3 被 GSK 872 抑制时，感染的小脑颗粒细胞神经元培养物表现出趋化因子表达显着降低（图 4D 和 S2C）。值得注意的是，我们没有观察到RIPK3在来自任一区域的星形胶质细胞中趋化因子表达的依赖性（图4E和4F）。这些数据表明，在神经侵袭性LGTV感染期间，RIPK3在小脑神经元中具有意想不到的区域特异性转录功能。-/--/--/-
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图 4. RIPK3 在 LGTV 脑炎期间促进小脑趋化因子的表达。
（A-B）用 LGTV TP21 皮下感染 Ripk3 和同窝对照小鼠。在 8dpi 时，收集大脑皮质 （A） 和小脑组织 （B） 并通过 qRT-PCR 测定趋化因子转录物。（C-F）Ccl2 和 Cxcl10 在原代皮质神经元 （C）、小脑颗粒细胞神经元 （D）、皮质星形胶质细胞 （E） 和小脑星形胶质细胞 （F） 的野生型 （C57BL/6J） 培养物中表达，在用 GSK 872 或载体预处理 2 小时后，用 0.5 （C-D） 或 0.01 （E-F） MOI LGTV TP21 感染 24 小时，通过 qRT-PCR 测量。ns，不显著。*p<0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。-/-
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.g004
免疫细胞募集到LGTV感染的中枢神经系统不需要RIPK3
接下来，我们质疑Ripk3小鼠小脑中趋化因子表达的降低是否会导致抗病毒白细胞无法募集到该大脑区域。因此，我们对皮下LGTV感染后来自大脑皮层或小脑的白细胞进行了流式细胞术分析。值得注意的是，在6或8 dpi下，与同窝对照组相比，我们没有发现Ripk3小鼠任一大脑区域淋巴细胞募集发生变化的证据（图5A）。这种差异的缺乏延伸到所有主要的CD45-/--/-你好浸润白细胞亚群，包括CD4和CD8 T细胞（图5B和5C）、NK细胞（图5D）、CD11c MHCII树突状细胞（图5E）和表达F4/80（图5F）、Ly6G（图5G）和Ly6C（图5H）的髓系亚群。我们同样没有观察到CD45数量的差异++++瞧小胶质细胞（图5I），表明两个区域的基因型之间的小胶质细胞增殖没有重大差异。这些数据表明，尽管小脑中主要白细胞趋化物的表达存在显着差异，但免疫细胞募集的差异并不能解释在LGTV感染期间在Ripk3小鼠中观察到的发病机制增加。-/-
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图 5. 在 LGTV 脑炎期间，白细胞募集到 CNS 独立于 RIPK3 信号转导而发生。
（A-I）用 LGTV TP21 皮下感染 Ripk3 和同窝对照小鼠。在感染后指定天数 （dpi） 收获大脑皮质和小脑组织并分离白细胞进行流式细胞术分析。（A） 代表性流式细胞术图显示脑中 CD3+ 白细胞中的 CD8+ 和 CD4+ T 细胞。数字表示每个门中的细胞相对于绘制的细胞总数的百分比。（B-I）CD8+ T 细胞 （B）、CD4+ T 细胞 （C）、CD11b+ NK1.1+ 自然杀伤细胞 （D）、CD11c+ MHC-II+ 树突状细胞 （E）、CD45 的数量-/-高CD11b+ F4/80+ 巨噬细胞 （F）、CD11b+ Ly6G+ 中性粒细胞 （G）、CD45高CD11b+ Ly6C+ 单核细胞 （H） 和 CD45.2瞧CD11b+ 小胶质细胞 （I） 在总脑白细胞中。没有比较具有统计学意义。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.g005
RIPK3 促进小脑神经元中 LGTV 复制的细胞内在限制
鉴于这些观察结果，我们接下来质疑 Ripk3 小鼠是否由于 LGTV 复制的先天免疫限制受损而无法控制 LGTV 感染。皮下LGTV感染后Ripk3小鼠大脑中病毒负荷的评估显示，Ripk3小鼠在8dpi和12 dpi下都表现出显着升高的CNS病毒滴度，特别是在小脑中（图6A）。相比之下，Mlkl在两个大脑区域的病毒载量上都没有表现出这种差异（图6B）。病毒载量的差异似乎与血脑屏障完整性的缺陷无关，因为 Ripk3 小鼠和同窝对照组在感染后表现出相似水平的荧光素钠外渗到中枢神经系统中（图 6C）。因此，我们质疑 RIPK3 是否需要在易感的 CNS 细胞类型中对病毒复制进行细胞内在限制。虽然LGTV在体内优先感染神经元[25]，但我们仍然测试了一组原代CNS细胞类型，以评估RIPK3是否也可能影响LGTV趋向性。原代中枢神经系统细胞的多步生长曲线分析显示，RIPK3的药理学抑制对源自大脑皮层的神经元中的LGTV复制没有影响（图6D）。相反，抑制RIPK3显著增强了原代小脑颗粒细胞神经元培养物中的LGTV复制（图6E）。这种效应是神经元独有的，因为GSK 872治疗对来自任一大脑区域的原代星形胶质细胞的LGTV复制没有影响（图6F-6G）。在原代小胶质细胞培养物中，斑块测定无法检测到LGTV复制;然而，我们没有观察到来自任一大脑区域的原代小胶质细胞中LGTV RNA的Ripk3依赖性差异（S3A和S3B图）。总之，这些数据表明，在Ripk3小鼠中观察到的增强发病机制是由于无法控制小脑神经元感染的特定失败，导致整体CNS病毒负荷增加。-/--/--/--/--/--/-
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图 6. RIPK3 限制了小脑颗粒细胞神经元中的 LGTV 复制。
（A-B）Ripk3 （A） 或 Mlkl （B） 小鼠和同窝对照者皮下感染 LGTV TP21。在感染后 8 或 12 天 （dpi），通过斑块测定法测定大脑皮质和小脑组织中的病毒载量。数据汇总自 2-3 个独立实验。（C） Ripk3 和同窝对照小鼠皮下感染 LGTV TP21。通过检测来自大脑皮层或小脑的组织匀浆中的荧光素钠积累，在 8 dpi 下测量 BBB 通透性。数据代表归一化为血清荧光素钠浓度的个体脑荧光值。然后将单个小鼠值归一化为未感染对照的平均值。（D-G）皮质神经元 （D）、小脑颗粒细胞神经元 （E）、皮质星形胶质细胞 （F） 和小脑星形胶质细胞 （G） 感染 0.01 MOI LGTV TP21 后的多步生长曲线分析。n = 3（小脑颗粒细胞神经元）或 4（星形胶质细胞和皮质神经元）用于生长曲线实验。ns，不显著。*p<0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。-/--/--/-
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.g006
RIPK3 在 LGTV 感染期间增强小脑神经元中的 I 型 IFN 信号传导
我们之前观察到来自Ripk3小鼠的小脑神经元中趋化因子表达减少，这表明这些细胞可能在先天免疫信号传导方面表现出更广泛的缺陷，导致对LGTV复制的控制不佳。先前的研究表明，与皮质神经元相比，小脑颗粒细胞神经元表现出增强的I型IFN信号转导[12]。因此，我们接下来质疑IFN信号传导是否在缺乏RIPK3表达的小鼠的小脑中受到干扰。皮下LGTV感染后脑组织中的转录分析显示，Ripk3小鼠的小脑确实表现出许多已知对控制黄病毒复制至关重要的ISG的表达减弱[30–35]，包括Ifit1、Isg15、Mx1、Mx2、Oas1b和Rsad2，而在大脑皮层中没有观察到这种表型（图7A和7B）).原代细胞培养物中的类似分析证实，当通过 GSK 872 处理阻断 RIPK3 信号传导时，小脑颗粒细胞神经元（而不是源自大脑皮层的神经元）表现出 ISG 表达减弱（图 7C 和 7D）。相比之下，我们观察到 RIPK3 阻断对来自任一大脑区域的星形胶质细胞中 ISG 表达的影响很小或没有影响（图 7E 和 7F）。令人惊讶的是，我们确实观察到 Ripk3 表达的缺乏降低了原代小胶质细胞中 ISG 的表达，尽管这种表型发生在大脑皮质和小脑小胶质细胞培养物中（S3B 和 S3C 图），这表明小胶质细胞 ISG 表达的变化不是大脑病毒学控制区域差异的来源。区域神经元类型之间ISG表达的差异不是由细胞死亡率的差异驱动的，因为RIPK3的药物阻断不会影响LGTV感染后任何一种神经元类型的活力（S4图）。总之，这些数据表明，RIPK3信号转导是小脑神经元中I型IFN反应的稳健诱导所必需的，这是LGTV复制的细胞内在限制所必需的。-/--/-
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图 7. RIPK3 促进小脑颗粒细胞神经元中 ISG 的表达。
（A-B）用 LGTV TP21 皮下感染 Ripk3 和同窝对照小鼠。通过qRT-PCR在大脑皮质（A）和小脑（B）组织中以8dpi评估指示基因的转录表达。（C-D）使用 GSK 872 或载体预处理 2 小时后，用 0.5 （C-D） 或 0.01 （E-F） MOI LGTV TP21 感染 24 小时后，原代皮质神经元 （C）、小脑颗粒细胞神经元 （D）、皮质星形胶质细胞 （E） 和小脑星形胶质细胞 （F） 的野生型 （C57BL/6J） 培养物中 ISG 的转录表达，通过 qRT-PCR 测量。ns，不显著。*p<0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。-/-
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.g007
为了更好地了解 RIPK3 信号转导在增强 ISG 表达中的作用，我们接下来询问了 RIPK3 是否在 IFN 受体信号转导的下游起作用。为了评估这一点，我们在用 GSK 872 或载体对照预处理后，用外源性 IFNβ 处理神经元培养物 1 小时。正如预期的那样，IFNβ 处理导致多个 ISG 的稳健诱导（图 8A 和 S5A）。然而，RIPK3 的药物阻断不影响 IFNβ 治疗诱导的小脑颗粒细胞神经元（图 8A）或大脑皮质神经元（S5A 图）中的 ISG 表达，这表明 RIPK3 可能不会直接作用于 I 型 IFN 受体 （IFNAR） 下游以调节基因表达和/或单独使用 I 型 IFN 不足以诱导 RIPK3 激活。接下来，我们测试了另一种假设，即 RIPK3 通过直接影响 IFN 配体和受体的表达来调节 LGTV 感染期间的 IFN 信号传导。令人惊讶的是，转录分析显示，RIPK3 的药理学阻断不影响感染后小脑颗粒细胞神经元中 I 型 IFN 配体 Ifna 和 Ifnb 的表达（图 8B）。相比之下，GSK 872治疗显著减弱了感染诱导的IFN受体亚基的上调，包括I型IFN受体亚基Ifnar1和Ifnar2，以及II型IFN受体亚基Ifngr1和Infgr2。重要的是，我们没有在大脑皮质神经元培养物中观察到IFN受体表达的这种RIPK3依赖性（S5B图），这表明RIPK3在小脑颗粒细胞神经元中具有独特的功能，以增强LGTV感染期间的I型IFN信号传导。
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图 8. RIPK3 促进小脑颗粒细胞神经元中 IFN 受体和 IFN 依赖性炎症基因的表达。
A-B） 在用 GSK 872 或载体预处理 2 小时，然后用 10ng/ml IFNβ （A） 处理 1 小时或用 0.5 MOI LGTV TP21 感染 24 小时的情况下，小脑颗粒细胞神经元野生型 （C57BL/6J） 培养物中指示基因的转录表达 （B）。C） 用抗 IFNAR1 中和抗体或同型对照 +/- 与 GSK 872 或载体共处理 45 分钟的野生型小脑颗粒细胞神经元中指示基因的表达，然后用 0.5 MOI LGTV TP21 感染 24 小时。ns，不显著。*p<0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.g008
为了进一步研究 RIPK3 在小脑神经元中 IFN 介导的基因表达中的作用，我们接下来进行了实验，其中我们使用针对 IFNAR1 的中和抗体在有或没有同时阻断 I 型 IFN 信号传导的情况下阻断 RIPK3 活性。我们推断，这种范式将使我们能够评估 RIPK3 对 LGTV 感染后 IFNAR 依赖性和 IFNAR 非依赖性基因表达的差异影响。也许不足为奇的是，我们观察到大多数 ISG 的表达完全依赖于 IFNAR1 信号转导，因此在缺乏完整的 I 型 IFN 信号转导的情况下，很难区分 RIPK3 的特定作用（S5C 图）。因此，我们鉴定了几种替代性炎症基因，其表达完全（Cxcl1）或部分（Ccl2和Il6）独立于感染后的IFNAR1信号传导。值得注意的是，RIPK3 的药物阻断仅影响这些基因诱导表达的 IFNAR1 去烯酸部分，而对 IFNAR1 非依赖性部分没有影响，如在 αIFNAR1 处理的培养物中缺乏效果所示（图 8C）。总之，这些数据进一步支持了我们对LGTV感染期间小脑颗粒细胞神经元中I型IFN和RIPK3信号传导之间的协同信号传导的观察。
为了在体内证实这些观察结果，我们接下来在皮下 LGTV 攻击后 8 天对小鼠小脑中的 IFNAR1 进行免疫组织化学染色。与同窝对照组相比，我们观察到 Ripk3 小鼠在小脑颗粒细胞层内表达 MAP2 的神经元上 IFNAR1 的共定位信号显着减弱（图 9A 和 9B），证实 RIPK3 在蛋白质水平上促进这些细胞中的干扰素受体表达。为了进一步确认 RIPK3 是否促进这些细胞中的 ISG 表达，我们在颅内 LGTV 感染后体外急性分离小脑颗粒细胞神经元（图 9C）。分离的细胞表达了高水平的谷氨酸受体基因 Gria4 和 Grid2，但神经胶质细胞相关基因 Gfap 和 Aif1 的水平较低或检测不到，这证实了我们的分离株对神经元的高度富集（S6 图）。基因表达分析显示，与对照组相比，Ripk3小鼠小脑神经元中的ISG诱导显着减少（图9D），这与我们之前使用原代培养物的发现一致。这些数据进一步支持了我们的发现，即在LGTV感染期间，RIPK3是小脑神经元中干扰素信号传导的强烈诱导所必需的。-/--/-
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图 9. RIPK3 在体内促进小脑神经元中的 IFN 信号传导。
A-B） 以 8 dpi（皮下）对小鼠小脑中表达 MAP2 的神经元上 IFNAR1 表达的 IHC 分析的代表性图像 （A） 和定量 （B）。IFNAR1 和 MAP2 之间的共定位信号转导以黄色显示。痕迹勾勒出小脑的颗粒细胞层。比例尺 = 100um。量化表示归一化为每个图像中颗粒细胞层总大小的共定位信号的强度。C） 描述成人小脑颗粒细胞神经元 （GCN） 离体分离的实验示意图。使用 BioRender 制作的图像。D） 在 4 dpi（颅内）下从指定基因型的小鼠中提取的分离 GCN 中指示基因的转录表达。ns，不显著。*p<0.05，****p < 0.0001。一些人物元素是用BioRender制作的。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.g009
讨论
我们的研究结果确定了RIPK3在协调大脑区域特异性先天免疫方面以前未知的功能。神经免疫信号转导区域差异的研究是一个不断发展的领域，越来越多的证据表明，驻留神经细胞在中枢神经系统的不同解剖区域对病毒感染和细胞因子刺激表现出不同的反应[36\u201239]。特别是小脑中的神经元和星形胶质细胞，已被证明对I型IFN的刺激表现出更高的反应性，并且与其他大脑区域相比，病原体传感器分子的基础水平更高，这表明先天抗病毒防御在该组织中具有关键的进化重要性[12,13].I型IFN信号转导的这种区域差异似乎至少在一定程度上是与前脑的易感区域（如大脑皮层和海马体）相比，小脑对黄病毒感染的易感性相对较低的基础。我们的研究结果还强调了IFN信号转导在小脑颗粒细胞神经元中的特殊重要性，小脑颗粒细胞神经元占小脑神经元的99%以上，占整个大脑神经元的50%以上[12,40]。然而，决定在小脑中观察到的增强先天免疫信号的分子机制仍然知之甚少。我们的研究表明，在LGTV感染期间，RIPK3信号转导是小脑神经元中ISG表达的稳健诱导所必需的，尽管需要正在进行的工作来了解介导这种效应的特定信号转导相互作用。
既往研究描述了RIPK3和I.型IFN信号转导之间高度复杂的相互作用，这种相互作用因细胞类型和疾病模型而异[17\u20121241]。比较清楚的是，I.型IFN信号转导能够通过多种机制激活RIPK3，导致坏死性凋亡和/或坏死性凋亡非依赖性转录激活[41–44]。然而，RIPK3 如何在 I 型 IFN 信号转导的上游（或协同作用）影响 ISG 的表达尚不清楚。我们和其他人已经证明，当RIPK3信号被消融时，ISG表达在各种情况下显著降低[17,18]，包括在这项研究中LGTV感染期间的小脑颗粒细胞神经元中。这种效应的一种可能解释是RIPK3介导的NF-κB激活，NF-κB是一种与RIPK信号转导密切相关的转录因子，已知在增强I型IFN信号转导和ISG表达方面起着重要作用[22,45–47]。我们和其他人之前还表明，ZIKV感染后皮质神经元中的RIPK3激活导致干扰素调节因子1（IRF1）激活，这是在这种情况下表达至少一个RIPK3诱导基因子集所必需的，尽管这种影响可能是间接的，因为IRF1不是已知的RIPK3底物[17].需要更多的工作来充分表征 RIPK3 和 CNS 中 I 型 IFN 信号传导之间相互作用中调用的调节机制。
我们的研究还进一步扩展了我们对中枢神经系统中 RIPK3 信号转导的坏死性凋亡非依赖性功能的理解。许多研究现在已经确定了RIPK3通过其独立于其在坏死性凋亡中的典型作用的机制促进宿主防御的重要性[16\u2012221]。然而，这些不依赖坏死性凋亡的功能似乎因疾病状态而异，包括中枢神经系统感染伴不同的神经侵袭性黄病毒[48,49]。我们和其他人先前表明，RIPK3在限制西尼罗河河病毒脑炎方面的主要作用是诱导趋化因子表达和抗病毒白细胞募集到感染的中枢神经系统中[16]。值得注意的是，虽然我们确实观察到 RIPK3 介导的趋化因子在 LGTV 感染期间在小脑中的表达，但这种趋化因子表达对于中枢神经系统免疫细胞募集显然是可有可无的。这些发现强调了 RIPK3 似乎调节神经炎症的上下文依赖性。值得注意的是，RIPK3依赖性神经元转录程序包括促炎介质和抗炎介质[17,49]。在我们目前的研究中，IFN信号转导的中心地位也是值得注意的，因为我们和其他人之前已经证明，I型IFN在黄病毒脑炎期间抑制白细胞浸润到CNS中[13]。因此，LGTV感染的Ripk3小鼠中IFN信号传导的减少可以抵消中枢神经系统免疫细胞募集整体调节中白细胞化学引诱剂表达的减少。-/-
与我们之前使用WNV脑炎模型的研究结果不同[16]，抗病毒效应基因（包括ISG）的RIPK3依赖性转录激活是神经元中LGTV复制的细胞内在限制所必需的，这种表型与ZIKV的研究结果更相似[17]，尽管我们没有观察到ZIKV感染期间这种反应的区域特异性的证据。与这些观察结果相反，Bian及其同事在JEV脑炎模型中观察到了截然不同的表型，其中RIPK3和MLKL似乎都加剧了而不是限制了疾病的发病机制[50,51]。RIPK3似乎也抑制而不是促进JEV感染神经元中的ISG表达。目前，决定RIPK3信号转导在这一系列密切相关的病毒中以及不同的中枢神经系统区域和细胞类型中如此不同结果的因素是神秘的。然而，我们推测，在不同区域神经元群体中形成差异先天免疫信号传导的进化压力，例如小脑颗粒细胞神经元中增强的模式识别受体信号转导[12]，也可能推动了Ripk3的收敛、上下文特异性功能特化，Ripk3是一种在哺乳动物属中表现出高进化率和强正选择的基因[52].然而，需要进一步的工作来充分定义控制这些特化的分子机制，以及评估中枢神经系统中 RIPK3 功能的区域差异是否在物种之间是保守的。
材料与方法
道德声明
所有涉及动物护理和使用的程序均由罗格斯大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准并按照协议编号 201900016 进行。
鼠标线
Ripk3 [53] 和 Mlkl [54] 小鼠品系在罗格斯大学尼尔森生物实验室的无特定病原体条件下培育和饲养。Ripk3小鼠由基因泰克公司慷慨提供野生型C57BL / 6J小鼠，要么通过商业（杰克逊实验室）获得，要么在内部繁殖。用于皮下感染的小鼠为5周龄;用于颅内感染的小鼠为8-15周龄。-/--/--/-
病毒和滴度测定
在整个研究过程中使用了 Langat 病毒株 TP21。创始人股票来自世界新兴病毒和虫媒病毒参考中心（WRCEVA）。使用 Vero E6 细胞（ATCC，#CRL-1586）生成实验室储备液，并在 -80°C 下冷冻直至需要。通过对 Vero E6 细胞的噬菌斑测定法测定病毒滴度。将细胞保存在补充有 10% 热灭活 FBS （Gemini Biosciences #100–106）、1% 青霉素–链霉素-谷氨酰胺 （Gemini Biosciences #400–110）、1% 两性霉素 B （Gemini Biosciences #400–104）、1% 非必需氨基酸 （Cytiva， #SH30238.01） 和 1% HEPES （Cytiva， #SH30237.01） 的 DMEM （Corning #10-013-CV） 中。斑块检测培养基由 1X EMEM （Lonza # 12-684F） 组成，其中补充了 2% 热灭活 FBS （Gemini Biosciences #100–106）、1% 青霉素-链霉素-谷氨酰胺 （Gemini Biosciences， #400–110）、1% 两性霉素 B （Gemini Biosciences #400–104）、1% 非必需氨基酸 （Cytiva， #SH30238.01） 和 1% HEPES （Cytiva， SH30237.01）、0.75% 碳酸氢钠 （VWR， #BDH9280） 和 0.5% 甲基纤维素 （VWR， #K390）。通过使用 10% 中性缓冲福尔马林 （VWR， #89370） 和 0.25% 结晶紫 （VWR， #0528） 去除覆盖培养基并染色/固定，以 5dpi 进行斑块测定。通过将 100uL 连续稀释的样品在 37°C 下连续稀释 1 小时添加到每孔含有 200,000 个 Vero E6 细胞的 12 孔板中进行斑块测定。将培养板与噬菌斑测定培养基在 37°C 和 5% CO2 下进一步孵育 5 天。从孔中取出培养基，并用含有结晶紫的固定剂代替约 20-30 分钟。板在H中反复洗涤2O，并在计数可见斑块之前晾干。
小鼠感染和组织采集
所有手术均使用异氟醚麻醉。小鼠皮下注射（50uL）3x104PFU 或使用胰岛素注射器颅内注射 （10uL） 50 PFU 的 LGTV-TP21 （BD Medical， #BD-329461）。在感染后的适当时间，小鼠用 30 mL 冷无菌 1X 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 进行心脏灌注。使用直径为 1.0 mm 的氧化锆/二氧化硅珠 （Biospec Products， #11079110z） 在无菌 PBS 中称重并匀浆提取的组织进行噬菌斑测定，或使用 TRI 试剂 （Zymo， #R2050-1） 进行基因表达分析。在 Omni Beadrupter Elite 中以 4 m/s 的速度进行 2 个 20 秒的连续循环均质化。
原代细胞感染
从 P1-P2 幼崽中收获皮质和小脑星形胶质细胞和小胶质细胞，并在 E13.5-E15.5 处收获皮质神经元。按照制造商的说明使用神经解离试剂盒 （T） 解离组织 （Miltenyi， #130-093-231）。在纤连蛋白包被的细胞培养瓶中，在补充有 10% FBS 的 AM-a 培养基 （ScienCell， #1831） 中扩增星形胶质细胞，并在实验前接种到涂有 20 μg/mL 聚-L-赖氨酸 （Sigma-Aldrich， #9155） 的平板中。对于小胶质细胞培养物，将混合胶质细胞在补充有 10% FBS、1% PSF 和 20 ng/mL 重组小鼠 M-CSF 的 DMEM 中在纤连蛋白包被的细胞培养瓶中生长 （Peprotech， #315–02）。每 2-3 天更换一次培养基，持续约 1 周，然后在 37C 下以 500rpm 摇动烧瓶 3-4 小时。收集上清液中的小胶质细胞，并将其接种到PLL包被的细胞培养处理板中，用于后续实验。将神经元接种到PLL包被的细胞培养处理板中，并在Neurobasal Plus + B-27补充培养基（Thermo-Fisher Scientific，#A3582901）中生长，然后用于7-9天的体外实验（DIV）。将来自 C57BL/6 小鼠 （ScienCell， # M1530-57） 的小鼠小脑颗粒细胞接种到涂有 10 ug/mL 聚-D-赖氨酸 （ThermoFisher， #A3890401） 的细胞培养处理板中，该板含有预热的神经元培养基 （ScienCell， #1521），按照制造商的建议，用于实验 6 DIV。
从安乐死小鼠的骨髓中分离出巨噬细胞和树突状细胞。使用无菌针头和注射器分离股骨并推出骨髓，注射器中装有补充有 10% FBS、1% 青霉素-链霉素-谷氨酰胺、1% HEPES、1% Glutamax （ThermoFisher， #35050061） 的 RPMI。将骨髓接种到非细胞培养处理的 10cm 培养皿中，放入含有 20ng/mL 重组 M-CSF （Peprotech， #315–02） 或 20ng/mL 重组 GM-CSF （Peprotech， #315–03） 和 20ng/mL IL-4 （Peprotech， #214–14） 的 8mL 补充 RPMI 培养基中，分别分化为巨噬细胞或树突状细胞。四天后，用含有适当细胞因子的额外培养基喂养细胞，并在 6–7 DIV 下用于实验，在实验前将细胞接种到细胞培养处理的培养皿中。对于病毒复制测定，所有培养物均用 LGTV TP21 感染，MOI 为 0.01。对于qRT-PCR实验，皮质和小脑神经元培养物的MOI为0.5，而星形胶质细胞培养物的MOI为0.01。在感染或后续治疗之前，将 RIPK3 的药物抑制剂 GSK 872 以 100nM 的浓度加入培养物中 2 小时。在收获细胞裂解物之前，将干扰素-β以 10ng/mL 的浓度加入神经元培养物中 1 小时。在Langat病毒感染前45分钟，将IFNAR-1单克隆抗体（MAR1-5A3，Leinco Technologies）或同型对照（GIR-208，Leinco Technologies）以5μg/mL的浓度添加到培养物中。
离体小脑颗粒细胞神经元分离
如前所述，使用Percoll梯度分离成人小脑颗粒细胞神经元[55]，并稍作修改。使用成人脑解离试剂盒（Miltenyi，#130-107-677）解离成人小脑。在 60% 和 35% 等渗 Percoll （Cytiva， #17-0891-02） 的阶梯梯度下分层细胞，并以 2370g 离心 20 分钟。仔细收集由颗粒细胞组成的中间部分，并立即裂解急性分离的细胞进行RNA提取，不进行培养。
实时荧光定量PCR
根据制造商说明（Zymo，#R2051），使用 Zymo Direct-zol RNA Miniprep 试剂盒从收获的组织中提取总 RNA。如前所述，从培养细胞中提取总RNA、合成cDNA和随后的qRT-PCR[22,56]。分析基因的周期阈值 （CT） 值归一化为管家基因 18 S （CT目标? CT扫描280= ΔCT）。将原代细胞培养实验的数据进一步归一化为基线对照值（ΔCT实验的? ΔCT控制= ΔΔCT （DDCT））。本研究中使用的引物列表可在 S1 表中找到。
流式细胞术
从新鲜灌注的小鼠中解剖小鼠大脑的小脑和大脑皮层，并将其放入含有1X PBS的试管中。将脑组织与含有 0.05% I 型胶原酶 （Sigma-Aldrich， #C0130）、10ug/mL DNase I （Sigma-Aldrich， #D4527） 和 10mM HEPES （Cytiva， #SH30237.01） 的 10mL 缓冲液在室温下恒定旋转的 1X Hanks 平衡盐溶液 （VWR， #02-1231-0500） 中孵育 1 小时。将脑组织转移到 50mL 锥形管上的 70um 过滤器中，并使用 3-5mL 注射器的柱塞通过过滤器捣碎。在 8 mL 37% 等渗 Percoll （Percoll： Cytiva， #17-0891-02;RPMI 1640：Corning，#10-040-CV，补充 5% FBS），以 1200xg 离心 30 分钟，缓慢休息。弃去髓鞘层和上清液。将白细胞在室温下在 1X RBC 裂解缓冲液（Tonbo Biosciences，#TNB-4300-L100）中孵育 10 分钟。将细胞离心并重悬于由 1X PBS、2% 叠氮化钠和 5% FBS 组成的 FACS 缓冲液中。将样品转移到 U 型底 96 孔板中。在 4°C 下用 2% 正常小鼠血清和 1% FcX Block （BioLegend， #101320） 在 FACS 缓冲液中封闭白细胞 30 分钟，然后用 CD3e（Biolegend，克隆 17A2）、CD44（Biolegend，克隆 IM7）、CD19（Biolegend，克隆 6D5）、CD8a（Biolegend，克隆 53–6.7）、CD4（Biolegend，克隆 RM4-5）、CD45.2（Biolegend，克隆 104）、 MHC-II（Biolegend，克隆 M5/114.15.2）、NK1.1（Biolegend，克隆 PK136）、CD11c（Biolegend，克隆 N418）、F4/80（Biolegend，克隆 BM8）、CD11b（Biolegend，克隆 M1/70）、Ly6G（Biolegend，克隆 1A8）、Ly6C（Biolegend，克隆 HK1.4）、CD80（Biolegend，克隆 16-10A1）和 Zombie NIR（Biolegend，#423105）。将白细胞在4C下染色30分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤并用1%PFA的PBS溶液固定（ThermoFisher，#J19943-K2）。使用Cytek北极光流式细胞仪（Cytek，Fremont，California）和FlowJo软件（Treestar）进行数据收集和分析。使用流式细胞仪对每个样品进行计数的标准微珠浓度对数据进行归一化（ThermoFisher，#C36950）。将脾脏压碎在两个载玻片之间，通过70um细胞过滤器过滤，并用FACS缓冲液洗涤。分离的脾细胞与 1X RBC 裂解缓冲液一起孵育，就像在封闭和染色之前从大脑中分离的白细胞一样。
免疫组化
用冰冷的 PBS 灌注小鼠，然后用 30mL 冷的 4% PFA 在 PBS 中灌注 （Electron Microscopy Sciences， #15714）。将大脑置于 4% PFA 中，在 4°C 下放置 24 小时，然后在 4°C 下置于含有 0.1% 叠氮化钠的 PBS 中。 使用压缩切片机（Precisionary，#VF-510-0Z）在50um处切片，切片储存在含有0.1%叠氮化钠的PBS中，温度为4°C。 将切片在由 10% 山羊血清 （Gibco， #16210） 和 0.4% Triton X-100 组成的封闭溶液中，在室温下恒定旋转孵育 3 小时。切片用一抗（小鼠抗 IFNAR-1：5 ug/mL，Leinco，#I-400;鸡抗 MAP2：1：1000，Invitrogen，#PA1-16751）染色，在封闭溶液中在 4°C 下稀释 2 天。 切片在室温下用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，然后用二抗（山羊抗鸡 IgY 偶联的 Alexa Fluor 594：8 ug/mL，Invitrogen，#A32759;山羊抗小鼠 IgG 偶联的 Alexa Fluor 488：8 ug/mL，Invitrogen，#A32723）在室温下用 10% 山羊血清的 PBS 溶液稀释孵育 1 小时。洗涤切片 3 次，然后在室温下与 DAPI（10 ug/mL，Biotium，#40043）孵育 10 分钟。然后使用ProLong金刚石抗淬灭封片剂（Invitrogen，#P36961）将切片安装到载玻片上。在使用Airyscan荧光共聚焦显微镜（Carl Zeiss LSM 800）获取图像之前，让载玻片干燥。
血脑屏障通透性的体内评估
血脑屏障通透性的体内评估如上所述[57]。小鼠腹膜内注射溶解在无菌1X PBS中的100uL 100mg/mL荧光素钠盐（Sigma，#F6377）。45分钟后，采集血液，然后进行心脏灌注。如上所述，在1X PBS中解剖和匀浆组织。将来自匀浆组织的血清和上清液在 4°C 下与 2% 三氯乙酸溶液（Sigma，#T0699）以 1：1 的稀释度孵育过夜。在 4°C 下以 2,823xg 离心 10 分钟，沉淀的蛋白质沉淀。 用硼酸盐缓冲液（pH 11 （Sigma， #1094621000）稀释上清液以达到中性pH值。使用 SpectraMax iD3 酶标仪（Molecular Devices，San Jose，CA）测量光学透明黑壁 96 孔板 （Corning， #3904） 中样品在 538nm 处的荧光素发射。将组织荧光值与个体小鼠的血浆值进行标准化。
统计分析
使用适当的参数检验分析正态分布的数据：双向方差分析（ANOVA）和Sidak校正进行多重比较，对数秩（Mantel-Cox）检验进行生存比较，两者均使用GraphPad Prism Software v8（GraphPad软件，San Diego，CA）。使用 Excel v2211 （Microsoft） 进行用于比较临床疾病体征的卡方检验。P < 0.05被认为具有统计学意义。
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RIPK3 和 MLKL 都不是限制骨髓来源的巨噬细胞和树突状细胞中 LGTV 复制所必需的。
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S1 图。 RIPK3 和 MLKL 都不是限制骨髓来源的巨噬细胞和树突状细胞中 LGTV 复制所必需的。
（A-B）从 C57BL/6J （WT）、Ripk3 或 Mlkl 小鼠的骨髓培养的原代巨噬细胞 （BMDM） （A） 和树突状细胞 （BMDC） （B） 中感染 0.01 MOI LGTV TP21 后的多步生长曲线分析。（n = 4）没有比较具有统计学意义。-/--/-
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.s001
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S2 图。 RIPK3 促进小脑和培养的 GCN 中 CXCL10 的蛋白表达。
A-B） ELISA 分析皮层 （A） 或小脑 （B） 匀浆中 CXCL10 丰度，这些匀浆来自指定基因型的小鼠，浓度为 8 dpi（脚垫）。C） 24 hpi 下 GCN 培养上清液中的 CXCL10 ELISA 分析。ns，不显著。第<0.0001页。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.s002
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S3 图。 RIPK3 在培养的小胶质细胞中促进独立于 CNS 区域的 ISG 表达。
A-C） 感染 0.1 MOI LGTV TP21 （B） 24 小时后，在大脑皮质 （B） 或小脑 （C） 小胶质细胞培养物中 LGTV （A） 或指示基因 （B-C） 的转录表达。ns，不显著。*p<0.05，**p < 0.01。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.s003
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S4 图。 RIPK3 不影响 LGTV 感染神经元的细胞死亡。
A-B） 在脑皮质神经元或小脑颗粒细胞神经元 （GCN） 的野生型 （C57BL/6J） 培养物中进行细胞滴度 Glo 活力测定，在用 GSK 872 或载体预处理 2 小时的情况下，然后用 0.5 MOI LGTV TP21 感染 24 小时。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.s004
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S5 图。 RIPK3 不影响皮质神经元中 IFN 介导的对 LGTV 的反应。
A-B） 在用 GSK 872 或载体预处理 2 小时，然后用 10ng/ml IFNβ （A） 处理 1 小时或用 0.5 MOI LGTV TP21 感染 24 小时的情况下，脑皮质神经元野生型 （C57BL/6J） 培养物中指示基因的转录表达 （B）。C） 用抗 IFNAR1 中和抗体或同型对照 +/- 与 GSK 872 或载体共处理 45 分钟的野生型大脑皮质神经元中指示基因的表达，然后用 0.5 MOI LGTV TP21 感染 24 小时。ns，不显著。*p<0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.s005
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S6 图。 分离的成人小脑颗粒细胞神经元高度富集神经元基因，而不是神经胶质基因。
来自成年 WT （C57BL/6J） 小鼠的分离 GCN 中指示基因的转录表达。从从 3 种不同动物中分离出的 GCN 池得出的值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.s006
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S1 表。 qRT-PCR的引物序列。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011813.s007
（文件）
引用
1.舒尔茨 JS、斯帕克斯 H、贝克汉姆 JD。虫媒病毒中枢神经系统感染。Curr Opin Infect Dis. 2021;34(3):264–71.PMID：33899755
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
2.Ruzek D、Avsic Zupanc T、Borde J、Chrdle A、Eyer L、Karganova G 等。欧洲和俄罗斯蜱传脑炎的发病机制、临床特征、治疗和疫苗综述。抗病毒研究 2019;164:23–51.PMID：30710567
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
3.Riccardi N， Antonello RM， Luzzati R， Zajkowska J， Di Bella S， Giacobbe DR. 欧洲蜱传脑炎：流行病学、诊断、预防和治疗的简要更新。2019 年 Eur J 实习医学;62:1–6.PMID：30678880
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
4.Abdiyeva K、Turebekov N、Yegemberdiyeva R、Dmitrovskiy A、Yeraliyeva L、Shapiyeva Z 等。哈萨克斯坦和中亚TBEV的媒介、分子流行病学和系统发育。寄生向量。2020;13(1):504.PMID：33023633
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
5.Beaute J， Spiteri G， Warns-Petit E， Zeller H. 2012 年至 2016 年欧洲的蜱传脑炎。欧元监督。2018;23(45).PMID：30424829
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
6.Fares M、Cochet-Bernoin M、Gonzalez G、Montero-Menei CN、Blanchet O、Benchoua A 等。TBEV感染的病理学模型揭示了人类神经元和星形胶质细胞中与其对感染的易感性相关的不同先天免疫反应。J神经炎症。2020;17(1):76.PMID：32127025
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
7.Szretter KJ、Daffis S、Patel J、Suthar MS、Klein RS、Gale M Jr. 等。先天免疫衔接分子MyD88限制西尼罗河病毒在中枢神经系统神经元中的复制和扩散。J 维罗尔。2010;84(23):12125–38.PMID：20881045
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
8.Iwasaki Y， Zhao JX， Yamamoto T， Konno H. 日本脑炎病毒抗原的免疫组织化学证明。神经病理学杂志。1986;70(1):79–81.PMID：3014801
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
9.Klein RS、Lin E、Zhang B、Luster AD、Tollett J、Samuel MA 等。神经元 CXCL10 指导 CD8+ T 细胞募集和控制西尼罗河病毒脑炎。J 维罗尔。2005;79(17):11457–66.PMID：16103196
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
10.林德奎斯特 R、乌帕德亚伊 A、奥弗比 AK。蜱传黄病毒和I型干扰素反应。病毒。2018;10(7).PMID：29933625
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
11.Samuel MA， Diamond MS. α/β 干扰素通过限制细胞嗜性和增强神经元存活来防止致命的西尼罗河病毒感染。J 维罗尔。2005;79(21):13350–61.PMID：16227257
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
12.Cho H， Proll SC， Szretter KJ， Katze MG， Gale M Jr.， Diamond MS. 神经元亚型中的差异先天免疫反应程序决定了正链 RNA 病毒在大脑中感染的易感性。2013 年;19(4):458–64.
查看文章Google 学术搜索
13.丹尼尔斯 BP、Jujjavarapu H、杜兰特 DM、威廉姆斯 JL、格林 RR、怀特 JP 等。区域星形胶质细胞 IFN 信号转导限制了嗜神经病毒感染期间的发病机制。J Clin 投资。2017;127(3):843–56.PMID：28134626
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
14.摩根 MJ，金 YS。RIPK3 在坏死性凋亡、细胞信号传导和疾病中的作用。2022 年实验分子医学;54(10):1695–704.PMID：36224345
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
15.Samson AL， Zhang Y， Geoghegan ND， Gavin XJ， Davies KA， Mlodzianoski MJ， et al. MLKL 在质膜上的运输和积累控制坏死性凋亡的动力学和阈值。国家通讯社。2020;11(1):3151.PMID：32561730
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
16.Daniels BP， Snyder AG， Olsen TM， Orozco S， Oguin TH 3rd， Tait SWG， et al. RIPK3 通过细胞死亡非依赖性神经炎症限制病毒发病机制。细胞。2017;169（2）：301-13 E11。PMID：28366204
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
17.丹尼尔斯 BP、科夫曼 SB、史密斯 JR、诺里斯 GT、斯奈德 AG、科尔布 JP 等。核苷酸传感器 ZBP1 和激酶 RIPK3 诱导 IRG1 酶促进神经元中的抗病毒代谢状态。免疫。2019;50（1）：64–76 E4。PMID：30635240
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
18.Downey J， Pernet E， Coulombe F， Allard B， Meunier I， Jaworska J， et al. RIPK3 与 MAVS 相互作用以调节 I 型 IFN 介导的对甲型流感病毒感染的免疫力。PLoS 病理学。2017;13（4）：e1006326.PMID：28410401
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
29 分钟Saleh D， Najjar M， Zelic M， Shah S， Nogusa S， Polykratis A， et al. RIPK1 和 RIPK3 的激酶活性可以指导脂多糖诱导的 IFN-β 合成。免疫学杂志。2017;198(11):4435–47.
查看文章Google 学术搜索
20.Guo H， Koehler HS， Mocarski ES， Dix RD. RIPK3 和半胱天冬酶 8 合作限制单纯疱疹性脑炎。PLoS 病理学。2022;18（9）：e1010857.PMID：36121858
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
11 分钟Peng R， Wang CK， Wang-Kan X， Idorn M， Kjaer M， Zhou FY， 等.人 ZBP1 通过 RIPK3 和 RIPK1 诱导细胞死亡非依赖性炎症信号传导。EMBO 代表 2022;23（12）：e55839.PMID：36268590
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
22.Chou TW、Chang NP、Krishnagiri M、Patel AP、Lindman M、Angel JP 等。纤维状α-突触核蛋白通过RIP激酶信号传导和NF-κB诱导神经毒性星形胶质细胞活化。细胞死亡研究 2021;12(8):756.
查看文章Google 学术搜索
23.Li S， Zhang Y， Guan Z， Ye M， Li H， You M， et al. SARS-CoV-2 Z-RNA 激活 ZBP1-RIPK3 通路以促进病毒诱导的炎症反应。细胞研究 2023.PMID：36650286
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
24.Najjar M， Saleh D， Zelic M， Nogusa S， Shah S， Tai A， et al. RIPK1 和 RIPK3 激酶通过 Toll 样受体 4 促进细胞死亡非依赖性炎症。免疫。2016;45(1):46–59.PMID：27396959
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
25.Baker DG、Woods TA、Butchi NB、Morgan TM、Taylor RT、Sunyakumthorn P 等。Toll样受体7抑制病毒在神经元中的复制，但不影响Langat病毒感染小鼠模型中的病毒发病机制。J Gen Virol。2013;94（第 2 部分）：336–47。PMID：23136362
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
26.Michlmayr D、Bardina SV、Rodriguez CA、Pletnev AG、Lim JK。Langat 病毒脑炎期间 Ccr5 的双重功能：中性粒细胞介导的中枢神经系统炎症减少和 T 细胞介导的病毒清除率增加。免疫学杂志。2016;196(11):4622–31.PMID：27183602
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
27.Hubbard NW、Ames JM、Maurano M、Chu LH、Somfleth KY、Gokhale NS 等人。 ADAR1 突变导致 ZBP1 依赖性免疫病理学。自然界。2022;607(7920):769–75.PMID：35859177
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
28.谢莹， 赵莹， 石玲， 李伟， 陈珂， 李明， 等.肠道上皮 TSC1/mTOR 控制肠道炎症和癌症中 RIPK3 依赖性坏死性凋亡。J Clin 投资。2020;130(4):2111–28.PMID：31961824
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
19 分钟Sai K， Parsons C， House JS， Kathariou S， Ninomiya-Tsuji J. 坏死性凋亡介质 RIPK3 和 MLKL 独立于宿主细胞杀伤抑制细胞内李斯特菌复制。细胞生物学杂志 2019;218(6):1994–2005.PMID：30975711
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
30.木村 T、加藤 H、笠山 H、赛加羚羊 H、奥山 M、冈本 T 等。Ifit1 通过与 5' 加帽的 2'-O 非甲基化 RNA 结合来抑制日本脑炎病毒复制。J 维罗尔。2013;87(18):9997–10003.PMID：23824812
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
31.Szretter KJ， Daniels BP， Cho H， Gainey MD， Yokoyama WM， Gale M Jr.， et al. 西尼罗河病毒对病毒 mRNA 帽的 2'-O 甲基化逃避了体内宿主限制的 ifit1 依赖性和非依赖性机制。PLoS 病理学。2012;8（5）：e1002698.PMID：22589727
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
32.ISG15 在体外促进细胞对登革热和西尼罗河病毒感染的抗病毒反应。Virol J. 2011;8：468。PMID：21992229
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
33.Singh PK， Singh S， Farr D， Kumar A. 干扰素刺激基因 15 （ISG15） 限制寨卡病毒在原代人角膜上皮细胞中的复制。Ocul 冲浪。2019;17(3):551–9.PMID：30905842
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
34.Bigham AW、Buckingham KJ、Husain S、Emond MJ、Bofferding KM、Gildersleeve H 等。西尼罗河病毒感染和疾病进展的宿主遗传危险因素。PLoS 一。2011;6（9）：e24745.PMID：21935451
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
35.Vonderstein K， Nilsson E， Hubel P， Nygard Skalman L， Upadhyay A， Pasto J， et al. Viperin 通过诱导非感染性衣壳颗粒的组装来靶向黄病毒毒力。J 维罗尔。2018;92(1).PMID：29046456
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
36.威廉姆斯 JL、Manivasagam S、史密斯 BC、Sim J、Vollmer LL、Daniels BP 等。星形胶质细胞-T 细胞串扰调节区域特异性神经炎症。神经胶质。2020;68(7):1361–74.PMID：31961459
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
37.西蒙斯 SB、利吉特 D、戈弗曼 JM。在实验性自身免疫性脑脊髓炎期间，脑部需要细胞因子调节的中性粒细胞募集，但不是脊髓炎症所必需的。免疫学杂志。2014;193(2):555–63.PMID：24913979
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
38.皮尔森ER，Goverman JM。GM-CSF 对实验性自身免疫性脑脊髓炎不是必需的，但会促进脑靶向疾病。JCI洞察。2017;2（7）：e92362.PMID：28405624
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
39.杜兰特 DM、丹尼尔斯 BP、帕西卡 T、多尔西 D、克莱因 RS。CCR5 限制了中枢神经系统西尼罗河病毒感染期间的皮质病毒载量。J神经炎症。2015;12:233.PMID：26667390
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
40.Rhee JK， Park H， Kim T， Yamamoto Y， Tanaka-Yamamoto K. 小脑颗粒细胞钙反应的投射依赖性异质性。摩尔脑。2021;14(1):63.PMID：33789707
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
41.McComb S、Cessford E、Alturki NA、Joseph J、Shutinoski B、Startek JB 等。通过 ISGF3 复合物的 I 型干扰素信号传导是巨噬细胞中持续 Rip3 激活和坏死性凋亡所必需的。美国国家科学院院刊，2014 年;111（31）：E3206-13。PMID：25049377
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
42.Brault M， Olsen TM， Martinez J， Stetson DB， Oberst A. 细胞内核酸感应通过协同 I 型 IFN 和 TNF 信号传导触发坏死性凋亡。免疫学杂志。2018;200(8):2748–56.PMID：29540580
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
43.Ingram JP， Thapa RJ， Fisher A， Tummers B， Zhang T， Yin C， et al. ZBP1/DAI 在没有 RIPK1 的情况下驱动 IFN 诱导的 RIPK3 介导的细胞死亡。免疫学杂志。2019;203(5):1348–55.PMID：31358656
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
44.Lee SA， Chang LC， Jung W， Bowman JW， Kim D， Chen W， et al. OASL 期凝聚诱导 RIPK3 淀粉样纤维化，促进病毒诱导的坏死性凋亡。Nat 细胞生物学 2023.PMID：36604592
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
45.Yatim N， Jusforgues-Saklani H， Orozco S， Schulz O， Barreira da Silva R， Reis e Sousa C， et al. 垂死细胞中的 RIPK1 和 NF-kappaB 信号转导决定了 CD8（+） T 细胞的交叉引发。科学。2015;350(6258):328–34.
查看文章Google 学术搜索
46.Snyder AG、Hubbard NW、Messmer MN、Kofman SB、Hagan CE、Orozco SL 等。坏死性凋亡途径成分 RIPK1 和 RIPK3 的瘤内激活增强了抗肿瘤免疫。科学免疫学。2019;4(36).PMID：31227597
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
47.Wegner KW、Saleh D、Degterev A. RIPK1 和 RIPK3 的复杂病理作用：超越坏死性凋亡。趋势药理学 2017;38(3):202–25.PMID：28126382
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
48.Angel JP， Daniels BP. 中枢神经系统病毒感染期间程序性细胞死亡信号传导的矛盾作用。Curr Opin 神经生物学。2022;77:102629.PMID：36162201
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
49.Daniels BP， Oberst A. 神经侵袭性病毒感染期间 RIP 激酶信号转导的结果。Curr Top 微生物免疫。2020. PMID：32253569
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
50.卞萍， 叶 C， 郑 X， 罗 C， 杨 J， 李明， 等. RIPK3 通过下调 IFI44L 促进神经元中的 JEV 复制。前微生物。2020;11:368.PMID：32265853
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
51.Bian P， Zheng X， Wei L， Ye C， Fan H， Cai Y， et al. MLKL介导的坏死性凋亡加速JEV诱导的小鼠神经炎症。前微生物。2017;8:303.PMID：28293227
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
52.帕尔默 SN、查皮迪 S、平克汉姆 C、汉克斯 DC。（宿主和病毒）MLKL的进化概况表明其活动是广泛反适应的战场。Mol Biol Evol.2021;38(12):5405–22.PMID：34436583
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
53.牛顿 K、孙 X、迪克西特 VM。激酶 RIP3 对于正常的 NF-κ B、B 细胞和 T 细胞受体、肿瘤坏死因子受体 1 以及 Toll 样受体 2 和 4 的信号传导是可有可无的。Mol Cell Biol. 2004 年;24(4):1464–9.PMID：14749364
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
54.Murphy JM、Czabotar PE、Hildebrand JM、Lucet IS、Zhang JG、Alvarez-Diaz S 等。假激酶 MLKL 通过分子转换机制介导坏死性凋亡。免疫。2013;39(3):443–53.PMID：24012422
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
55.Klein RS，Rubin JB，Gibson HD，DeHaan EN，Alvarez-Hernandez X，Segal RA等.SDF。 SDF-1 α诱导趋化性并增强声波刺猬诱导的小脑颗粒细胞增殖。发展。2001;128(11):1971–81.PMID：11493520
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
56.Kung PL、Chou TW、Lindman M、Chang NP、Estevez I、Buckley BD 等。寨卡病毒诱导的TNF-α信号转导失调，失调与精神疾病相关的神经基因的表达。J神经炎症。2022;19(1):100.
查看文章Google 学术搜索
57.丹尼尔斯 BP、霍尔曼 DW、克鲁兹-奥伦戈 L、Jujjavarapu H、杜兰特 DM、克莱因 RS。病毒病原体相关的分子模式通过竞争的先天细胞因子信号调节血脑屏障的完整性。mBio的。2014;5（5）：e01476–14。PMID：25161189
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索