免费医学论文发表-寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶的双重功能
抽象
寨卡病毒 （ZIKV） 丝氨酸蛋白酶是病毒多蛋白加工和复制不可或缺的物质，由膜锚定的 NS2B 多肽和 NS3 多肽 （NS3pro） 的 N 端结构域组成。NS3 多肽 （NS3hel） 的 C 末端结构域是解旋酶活性所必需的，并且包含一个 ATP 结合位点。我们发现 ZIKV NS2B-NS3pro 将单链 RNA 与 K 结合d~0.3μM，表明具有新功能。我们测试了NS2B-NS3pro的各种结构修饰，并观察到在最近发现的“超开放”构象中稳定的构建体不会结合RNA。同样，使用底物抑制剂在“封闭”（蛋白水解活性）构象中稳定NS2B-NS3pro消除了RNA结合。我们假设当 ZIKV NS2B-NS3pro 采用“开放”构象时发生 RNA 结合，我们使用在开放构象中结晶的高度同源登革热 NS2B-NS3pro 对其进行建模。我们鉴定了两种带正电的叉状结构，仅存在于NS3pro的开放构象中。这些分叉在黄病毒科中是保守的，并且可以与NS3hel上带正电荷的树林对齐，为离开解旋酶的负RNA链提供连续的结合表面。我们提出了一个紧密交织的NS2B-NS3解旋酶-蛋白酶机制的“反向尺蠖”模型，该模型表明NS2B-NS3pro在开放和超开放构象之间循环以结合和释放RNA，从而实现长程NS3hel的持续合成能力。向封闭构象的转变，可能是由底物诱导的，使NS2B-NS3pro的经典蛋白酶活性成为可能。
作者摘要
寨卡病毒（ZIKV）丝氨酸蛋白酶是病毒复制所必需的，由蛋白和解旋酶亚基组成。我们发现ZIKV蛋白酶亚基结合RNA，表明具有新的功能。我们测试了ZIKV蛋白酶的各种结构修饰和构象，并观察到三种可能的构象中只有一种，即“开放”蛋白水解无活性构象，结合RNA。我们鉴定出仅存在于许多黄病毒（包括寨卡病毒和登革热）的开放构象中的特定三维结构，这表明我们的发现可能对几种黄病毒具有广泛的意义。我们提出了一种新的解旋酶-蛋白酶机制的“反向尺蠖”模型，该模型是病毒传播的关键，也是靶向黄病毒的可能新方法。
数字
Fig 10Fig 11Fig 12Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 9Fig 10Fig 11Fig 12Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Shiryaev SA、Cieplak P、Cheltsov A、Liddington RC、Terskikh AV （2023） 寨卡病毒 NS2B-NS3 蛋白酶的双重功能。PLoS 病理学 19（11）： e1011795 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795
编辑 器： Sonja M. Best，美国国家过敏和传染病研究所
收到： 2023年9月5日;接受： 2023年11月2日;发表： 十一月27 2023
版权所有： ? 2023 Shiryaev et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据均在手稿及其支持信息文件中。
资金： 美国国家神经疾病和中风研究所 （NINDS）：R01 NS105969 A.V.T. A.V.T. 和 S.A.S. 从 NINDS 获得薪水。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
寨卡病毒 （ZIKV） 是黄病毒科的成员，该家族包括西尼罗河病毒 （WNV）、登革热病毒（DENV 血清型 1-4）、日本脑炎病毒、丙型肝炎病毒 （HCV） 和蜱传脑炎病毒）以及许多其他人类病原体。与其他反复暴发的黄病毒一样，寨卡病毒被认为是全球健康的主要威胁[1,2]。孕妇感染寨卡病毒可导致胎儿小头畸形[3-5]，成人感染与自身免疫性神经退行性疾病吉兰-巴利综合征有关[6-8]。遗憾的是，迄今为止，美国尚无获批的药物或疫苗用于治疗或预防ZIKV感染[9–11]。
ZIKV是一种正义的单链RNA病毒，与其他黄病毒相似。它的基因组为 ~11 kb，编码一个 3423 个氨基酸的多蛋白前体，由 3 个结构蛋白和 7 个非结构蛋白组成。一旦插入宿主内质网 （ER） 膜，病毒多蛋白就会在非结构蛋白之间的胞质溶胶暴露连接处和衣壳蛋白 C 内被病毒蛋白酶切割。
ZIKV NS3 蛋白是一种 ~615 aa 多功能蛋白，具有内肽酶、RNA 解旋酶、RNA 三磷酸酶和 NTP 酶活性 [12]。NS3 （NS3pro） 的 N 端 170-aa 结构域与膜锚定的 NS2B 的胞质 48-aa 区域相互作用，形成一种称为 NS2B-NS3pro 的高活性丝氨酸蛋白酶（S1B 图）[13]。病毒繁殖对NS2B-NS3pro的关键依赖性使该多肽成为有前途的抗病毒药物靶点。然而，由于病毒NS2B-NS3pro的活性中心与具有关键细胞功能的多种细胞丝氨酸蛋白酶之间存在高度结构同源性，因此竞争性抑制剂的开发具有挑战性[14]。变构抗NS2B-NS3pro抑制剂的开发可以克服这一障碍[14,15]。
最近，我们用共价连接的NS2B辅因子确定了ZIKV NS3pro的晶体结构，分辨率为2.5 ?和3 ?。这些结构表明，NS2B-NS3pro采用“超开放”构象（PDB ID：5TFN、5TFO、6UM3和7M1V），这与先前报道的ZIKV NS2B-NS3pro（PDB ID：5LC0,16）的蛋白水解活性“封闭”构象截然不同。虽然ZIKV蛋白酶在“开放”构象中的晶体结构尚未报道，但开放构象中DENV和WNV NS2B-NS3pro的结构（PDB ID：2FOM和2GGV）表明，ZIKV蛋白酶开放构象可以使用密切相关的DENV和WNV进行建模。
HCV 的 NS3-NS4A 蛋白酶结构域与 ZIKV NS2B-NS3pro 远距离同源;然而，两者在HCV蛋白酶结构域的单一构象、不同的底物特异性和前者活性位点的正电荷方面有所不同[17]。几项独立研究表明，HCV NS3的蛋白酶结构域与RNA结合，并且全长HCV NS3蛋白比单独使用解旋酶结构域具有更好的dsRNA持续合成能力[18\u20\u201220]。然而，ZIKV NS2B-NS3pro的等电点（pI）低于HCV蛋白酶，这意味着它可能无法结合RNA。然而，与单独的NS3解旋酶结构域相比，同源WNV和DENV2病毒的全长NS3（NS3pro+NS3hel）也显示出明显更好的持续合成能力[21,22]。
在这里，我们首次证明了ZIKV NS2B-NS3pro蛋白以生理学上有意义的亲和力结合RNA。对不同构象状态的进一步研究表明，RNA与ZIKV NS2B-NS3pro的开放构象结合。我们证明了RNA结合干扰了NS2B-NS3pro的蛋白水解活性[23]，并确定了阻止RNA与NS2B-NS3pro结合的小分子抑制剂。分子建模确定了能够容纳RNA的保守叉状结构。NS2B-NS3pro-NS3hel 的建模揭示了蛋白酶和解旋酶之间带正电的连续界面。基于我们的研究结果，我们提出了一种新的“反向尺蠖”机制，即通过ZIKV NS2B-NS3机制偶联RNA和多肽加工，这可能是所有黄病毒的共同特征。
结果
ZIKV和JEV之间的超开放构象是保守的
除了ZIKV NS2B-NS3pro（PDB ID 7M1V）的结构外，2015年还发现了另一种直系同源黄病毒，日本脑炎病毒（JEV）NS2B-NS3pro（PDB ID 4R8T）的晶体结构[24]。然而，没有对PDB ID 4R8T晶体结构进行结构或功能分析，这可能是研究界缺乏关注的原因。在ZIKV NS2B-NS3pro（PDB ID 7M1V）与JEV NS2B-NS3pro（PDB ID 7M1V）晶体结构的超开放确认中，我们计算了ZIKV NS2B-NS3蛋白酶结构的叠加（S2图）。我们观察到这两种结构之间关键的NS3pro C端环路组织几乎相同（RMSD 0.6A）。
ZIKV NS2B-NS3pro开放构象的建模
我们利用在开放构象中结晶的结构 DENV 和 WNV NS2B-NS3pro（PDB ID：2FOM 和 2GGV）在 FFAS [25]、MODELLER [26] 和 RoseTTAFold [27] 包的帮助下对 ZIKV NS2B-NS3pro 进行建模。通过模拟NS2B的C端部分从封闭构象中NS2B-NS3pro的疏水裂隙中抽出，获得了更多的见解[23]。与开放构象相比，超开放构象诱导NS2B与NS3pro的进一步解离以及NS3pro C末端残基的重新折叠，这极大地影响了NS3pro的整体折叠。鉴于这些结构变化的明显连续性，我们提出NS2B-NS3pro可以在闭合、开放和超开放构象之间动态切换（图1和S3）。
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图 1. ZIKV NS2B-NS3pro的构象景观。
（A） ZIKV NS2B-NS3pro闭、开和超开构象之间的过渡平衡。蛋白酶活性中心基于肽的底物（RKADI，绿球棒模型）是根据 WNV NS2B-NS3pro + 抑肽酶 （PDB ID： 2IJO） 的相关结构建模的。RLLG 环面向 ER 膜的表面。（B） 沿水平轴向上旋转 90 度后与 B 中的构象相同。活动站点现在面向查看者。NS2B 以绿色卡通结构显示。带正电的侧链为蓝色，带负电的残基为红色。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.g001
ZIKV NS2B-NS3pro多肽结合RNA
为了研究 RNA 和单链 （ss） DNA 与 ZIKV NS2B-NS3pro 多肽的结合，我们采用了经典的荧光偏振 （FP） 测定法。将荧光素酰胺（FAM）标记的RNA或ssDNA与NS2B-NS3pro混合，并使用FP的增加来检测结合[28]。野生型蛋白水解感受态NS2B-NS3pro多肽可以采用封闭、开放或超开放构象，对RNA表现出很强的亲和力。直接结合试验和竞争试验产生了相似的结果，均表明平衡解离常数（Kd）为~0.34μM（图2A和2B）。NS2B-NS3pro与FAM标记的ssDNA孵育后，FP信号也有所增加（图2C）。然而，直接结合和竞争测定均产生 KdssDNA的值为~2.0μM，比RNA低~10倍（图2C和2D）。未标记的RNA和ssDNA与具有相似动力学的FAM标记探针有效竞争（图2B和2D），证实了结合的特异性。
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图 2. ZIKV NS2B-NS3pro 结合 ssRNA 和 ssDNA。
（A） 荧光素酰胺 （FAM） 标记的 ssRNA （20 poly-rU） 与指定量的 NS2B-NS3pro 结合，（B） FAM 标记的 ssRNA （20 poly-rU） 与 1 μM NS2B-NS3pro 结合，存在指定量的未标记 ssRNA （20 poly-rU）。（C，D）至于A，B，除了用FAM标记的ssDNA（20poly-dT）进行实验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.g002
为了更详细地研究RNA与ZIKV NS2B-NS3pro多肽的结合，我们生成了一组额外的构建体，旨在探测一些关键的结构和构象要求（S4图）。首先，我们测试了带负电荷的 12-aa 连接区域 （171EEETPVECFEPS182） 将 NS3pro 结构域与 NS3 解旋酶结构域连接起来。NS2B-NS3-long构建体（包含NS3的182个N端残基）在超开放构象（PDB ID 5TFN）中结晶。鉴于接头的非结构化性质（天然存在于 NS3 多肽中），NS2B-NS3-long 构建体应该能够采用所有构象。令人惊讶的是，NS2B-NS3-long与RNA或ssDNA一起孵育并没有增加FP信号，表明缺乏RNA或ssDNA结合（图3A）。这一观察结果可能表明，12-aa带负电荷的接头区域调节RNA与NS2B-NS3pro的结合，可能与带负电荷的RNA竞争。该连接子的确切作用尚不完全清楚，该连接子在全长 NS3 的两个末端都绑定。
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图 3. ZIKV NS2B-NS3pro 的结构和功能改变排除了 ssRNA 结合。
（A） NS2B-NS3pro 的修饰（详见 S1 图），阻止 FAM 标记的 ssRNA （20 poly-rU） 有效结合。（B） 抑肽酶 （~0.15 μM） 和 WRPK3（共价抑制剂）抑制 NS2B-NS3pro 催化活性可阻断 ssRNA 结合。将每种条件与蛋白酶 NS2B-NS3pro、*** p<0.0005、双尾不配对 t 检验与 Welch 校正进行比较。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.g003
接下来，我们测试了几种旨在稳定超开放构象的突变体结构。截短的 NS2B-NS3-short 构建体缺乏氨基酸 161–170，因此无法假设封闭或开放构象 （PDB 5LC0， 23）。FP 检测未能检测到与此类 NS2B-NS3 短突变体结合的 RNA 或 ssDNA（它不是一种构建体而不是突变体吗？（图 3A），表明 NS3pro 需要 aa 161–170 来支持 RNA 结合，并表明超开放构象对 RNA 结合是难治性的。
接下来，我们测试了 NS2B-NS3pro-Mut5 和 Mut7 构建体，它们被设计为通过引入 NS3 序列中的两个半胱氨酸之间的二硫键在超开放构象中稳定。我们解析了 Mut5 和 Mut7 的结构，并确认两个突变体都采用超开放构象 （PDB ID 6UM3， 7M1V）。我们证明这些突变体都不能结合RNA（图3A），这表明超开放构象对RNA结合是难治性的。
综上所述，这些实验表明，虽然只有野生型NS2B-NS3pro多肽能有效结合RNA，而迄今为止测试的所有结构修饰，特别是那些将NS2B-NS3pro锁定在超开放构象中的修饰，则废除了RNA结合。此外，蛋白酶-解旋酶连接区（具有 5 个负电荷）似乎可能通过与 RNA 竞争来阻碍 RNA 与野生型构建体的结合。
NS2B-NS3pro 底物模拟抑制剂与 RNA 结合竞争
一些研究小组已经证明，锁定在NS2B-NS3pro活性中心的蛋白酶活性抑制剂（拟肽剂或小分子化合物）会刺激蛋白酶向封闭构象转化[16,23,29–31]。这种现象在几种黄病毒科的蛋白酶中已有充分的文献记载，包括WNV（PDB ID 2IJO，2YOL）[23,29]、DENV-2（PDB ID 3U1J）[30]和ZIKV（PDB ID 5YOF，5LCO）[16,31]。为了确定 RNA 是否可以在封闭的蛋白水解活性状态下与 ZIKV NS2B-NS3pro 结合，我们使用两种底物模拟抑制剂在 NS2B-NS3pro 中诱导这种构象;抑肽酶（一种70-aa丝氨酸蛋白酶抑制剂）和WRPK3（一种合成肽抑制剂，与NS2B-NS3pro活性中心共价结合）[32]。
将 ZIKV NS2B-NS3pro 与抑肽酶或 WRPK3 一起孵育，并在 RNA FP 测定中测试凝胶过滤纯化的复合物。我们观察到没有RNA与任何一种复合物结合（图3B）。由于ZIKV蛋白酶闭合构象中的活性位点带负电荷（图1A），因此RNA与抑肽酶或WRPK3的相同位点直接结合似乎不太可能。我们假设底物模拟抑制剂通过诱导和维持与 RNA 结合不相容的 NS2B-NS3pro 的封闭构象来消除 RNA 结合。从下面的建模结果中，这种解释获得了进一步的可信度。
RNA结合抑制ZIKV NS2B-NS3pro的蛋白水解活性
迄今为止描述的实验表明，RNA 在封闭或超开放构象中不与 NS2B-NS3pro 构建体结合。通过推论，这表明当 NS2B-NS3pro 适应开放蛋白水解无活性构象时，会发生 RNA 结合。然后，我们研究了RNA的结合是否会干扰NS2B-NS3pro的蛋白水解活性。事实上，使用荧光底物切割测定，我们发现 RNA 或 ssDNA 的结合抑制了 ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶与 IC 的蛋白水解活性50RNA的值为26.28 ± 1.12 μM，ssDNA的值为64.75 ± 1.08 μM（图4）。观察到的蛋白水解活性抑制可能是由于RNA诱导的NS2B-NS3pro稳定，NS2B-NS3pro采用开放的蛋白水解无活性构象[23,33]。
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图 4. ssRNA 抑制 NS2B-NS3pro 的蛋白水解活性。
ssRNA（20-rA，左图）和ssDNA（20-dA，右图）抑制ZIKV NS2B-NS3pro蛋白水解活性。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.g004
NS2B-NS3蛋白酶的变构抑制剂干扰RNA结合
NS2B-NS3pro的开放构象是通过NS2B辅因子的重排（与NS3pro的部分解离）实现的，导致蛋白水解活性丧失[23,33]。NS2B 解离揭示了 NS3pro 中的疏水性裂隙，该裂隙呈现出一种新的可成药位点，该位点在不同的黄病毒之间相对保守。此前，我们鉴定了具有亚微摩尔或低微摩尔 IC 的 ZIKV、WNV 和 DENV2 NS2B-NS3pro 变构抑制剂50体外值[13,14]。这些变构抑制剂被设计为与远离蛋白水解活性位点的NS2B-NS3pro区域结合[14,34,35]。尽管对几种黄病毒蛋白酶有有效的抑制作用，但我们发现这些抑制剂对具有相似底物特异性的宿主丝氨酸蛋白酶（弗林蛋白酶和其他前蛋白转化酶）没有可检测到的影响[13]。
在这里，我们研究了几种 ZIKV、WNV 和 DENV2 NS2B-NS3pro 抑制剂对 RNA 与 ZIKV NS2B-NS3pro 结合的影响。我们发现，其中一些化合物也是与ZIKV NS2B-NS3pro结合的RNA结合的有效抑制剂（图5A）[13]。例如，NSC86314 是一种有效的 RNA 结合抑制剂，也是 ZIKV、WNV 和 DENV 蛋白酶的亚微摩尔抑制剂 [13]（图 5A 和 5B），以及基于细胞的 IC 检测中 WNV 和 DENV2 复制子的有效抑制剂50值为<50μM [13,34,35]。有关详细信息，请参阅材料和方法。
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图 5. ZIKV NS2B-NS3pro的变构抑制剂干扰RNA结合。
（A） ZIKV NS2B-NS3pro 的小变构抑制剂阻断 ssRNA 结合。使用 FAM 标记的 ssRNA （20 poly-rU） 进行荧光偏振 （%）。将每种条件与单独的蛋白酶进行比较，* p<0.05，** p<0.05，*** p<0.0005，**** p<0.0005 双尾不配对 t 检验与 Welch 校正。所有抑制剂均在10μM下测定。（B） IC50 抑制上述相应抑制剂对 ZIKV、WNV 和 DENV2 NS2B-NS3pro 蛋白水解的抑制作用（在 A 中）。（C） ZIKV NS2B-NS3-Mut7蛋白酶与NSC86314抑制剂（PDB 7M1V）的晶体结构。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.g005
我们将NSC86314与 Mut7 ZIKV NS2B-NS3pro 构建体共结晶，该构建体旨在加强超开放构象并最大限度地减少与先前构建体 Mut5 （PDB ID 6UM3） 观察到的蛋白质二聚化。对Mut7晶体结构进行了解析和细化，分辨率为1.8 ? （PDB ID 7M1V）。该结构表明，NSC83614与NS3pro的C末端附近的疏水口袋结合（图5C），并吸出NSC83614稳定超开放构象，从而阻止向开放构象的转变。然而，由于 Mut7 的剩余二聚化，NSC86314的一部分无法进入额外的预测结合口袋。然而，这种晶体结构证实了靶向ZIKV NS2B-NS3pro超开放构象中可用的新口袋的可行性。
我们对NCI化疗药物库进行了虚拟配体筛选（VLS），以找到与NSC86314具有相似支架结构的化合物。NSC114428，其中一种化合物能够在低μM范围内阻断ZIKV蛋白酶的蛋白水解活性和RNA结合（图5A和5B）。
接下来，我们对黄病毒复制抑制剂进行了比较分析，这些抑制剂具有对 ZIKV、WNV 和 DENV 蛋白酶的活性，以及它们抑制 RNA 与 ZIKV NS2B-NS3pro 结合的能力。最有效的 ZIKV 和 DENV2 蛋白酶活性抑制剂往往也是最有效的 RNA 结合抑制剂。然而，在抑制WNV蛋白酶活性方面没有观察到这种关联，这表明抑制黄病毒蛋白水解活性与RNA结合之间的关系可能很复杂（图5A和5B）。
综上所述，这些结果为一类新型变构抑制剂提供了原理验证，该抑制剂专门针对ZIKV NS2B-NS3pro开放和超开放构象中新发现的可成药口袋。我们的结果表明，这种变构抑制剂除了阻断蛋白酶活性外，还可以干扰NS2B-NS3pro的RNA结合活性。
模拟 RNA 与 ZIKV NS2B-NS3 的结合
我们的生化发现提供了NS2-NS3pro结合RNA的证据，这提出了NS2-NS3pro与NS3hel合作解开双链RNA的诱人可能性。为了深入了解这种可能性，我们利用结构建模进行了以下步骤：a）建立RNA-NS2B-NS3pro复合物的模型;b） 探索 NS2B-NS3pro 和 NS3hel 结构域的相对位置和构象;c） 构建与NS2B-NS3复合物结合的RNA模型;e） 提出了双链 RNA 解旋的框架，包括 NS2B-NS3pro 构象的动态变化。
仔细检查三种NS2B-NS3pro构象，发现在开放构象中存在不同的2个带正电的叉状结构（以下简称叉状结构）（图6）。奇怪的是，这些结构在封闭和超开放构象中被阻塞或变形（图6），使它们成为RNA结合的主要候选者。事实上，这些分叉是不同的，但让人想起在噬菌体Enc34（PDB ID：5ODL）[36]和噬菌体T7（PDB ID：1JE5,37）的gp2.5蛋白中观察到的结构。 然后，我们通过使用Amber18 [38]和ff14SB力场[39]最小化的能量，模拟了由NS3pro区域结合的RNA的可能方向。这种建模提供了良好的体积拟合，并揭示了两个叉子容易容纳的单条RNA链的合理位置（图6）。请注意，这种局部结构（代表合理的 RNA 结合裂隙和带正电荷的叉子）要么在封闭构象中被 NS2B 阻断，要么在超开放构象中缺失/毁容。我们的模型还表明，双链RNA不能结合NS3pro的开放构象（S5图）。这是因为 dsRNA 无法在 NS3pro 中提供负 RNA 骨架和带正电荷的侧链氨基酸之间的连续相互作用。
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图 6. ZIKV NS2B-NS3pro 的开放构象特别适合结合 RNA。
ZIKV NS2B-NS3 的闭合（PDB ID：5LC0）、开放（基于 WNV PDB ID：2GGV 的模型）和超开放（PDB ID：7M1V）构象。开放构象显示 RNA 插入由带正电荷的氨基酸（标记为蓝色）组成的叉状结构中。一个叉子靠近 3' 端，另一个叉子位于 RNA 链的中间。这些结构的方向使 NS3pro 的 RLLG 环路朝下。对于封闭构象，蛋白酶活性中心基于肽基底物（RKADI，绿球和棒模型）是根据 WNV NS2B-NS3pro + 抑肽酶 （PDB ID： 2IJO） 的相关结构建模的。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.g006
RNA-解旋酶相互作用建模
接下来，我们模拟了与ZIKV NS3hel的RNA相互作用。我们使用与短RNA片段AGAUC结合的ZIKV NS3hel的结构（PDB ID：5GJB [40]）通过扩展短片段和结构优化来模拟RNA的长链。我们使用与单链DNA结合的细菌解旋酶（PDB ID：2P6R [41]）以5GJB结构为模板构建ZIKV解旋酶-RNA复合物的初始构型（图7A）。该模型包含RNA的双螺旋部分，在分裂和展开之前，朝向前导链的5'端，以及向3'端延伸的单链RNA。然后使用Amber18[38]和ff14SB力场[39]使该结构的能量最小化。
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图 7. 通过ZIKV NS3hel模拟RNA的定向性。
（A） 面板代表 ZIKV NS3hel 的结构，具有模型构建和 AMBER 力场最小化的 RNA 片段。在分子的左侧有未加工的dsRNA，而在右侧有一条ssRNA的前导链，在分裂和分离另一条链后。带正电荷的残基（NS3hel 的右侧-蓝色）促进了 ssRNA 的运动。（B） 图显示了 ZIKV NS3hel 的晶体结构 （PDB id： 5GJB） 与 ssRNA 的短片段（橙色）和 ZIKV RNA 结的暂定位置 （PDB id： 5TPY）。该模型解释了为什么RNA从3'端向5'端进行处理。如果通过拉动其 5' 端（右侧结）来解开结要困难得多，因为与其他核苷酸的相互作用更强，然后通过拉动其 3' 端（左侧结）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.g007
NS3-pro-NS3-hel结构建模
为了探索 NS3pro 和 NS3hel 结构域之间连接子的灵活性，我们模拟了这些结构域可能的相互取向，重点关注开放构象中的 NS2B-NS3pro 和使用三种可用晶体结构模板构建的 NS3hel。由于ZIKV NS2B-NS3（即NS2B-NS3pro-NS3hel复合物，蛋白酶和解旋酶在一起）的结构不可用，我们探索了从同源MVE（PDB ID：2WV9[42]）和DENV4（PDB ID：2WZQ，2WHX [21]）黄病毒中获得的三种晶体结构，代表了NS3pro和NS3hel结构域的不同相互取向。这些可用的结构证明了连接两个域的接头具有足够的灵活性。我们通过ZIKV NS3hel（PDB ID：5GJB）的结构对齐和NS2B-NS3pro的结构在封闭（PDB ID：5lC0）、开放（我们自己的模型，基于WNV的NS2B-NS3-pro的2GGV结构作为模板）和超开放（PDB ID：7M1V）构象，构建了ZIKV NS3pro-NS3hel。建模结果说明了 NS3hel 相对于 NS2B-NS3pro 可用的广泛运动范围（图 8A 和 8C）。NS3pro 和 NS3hel 的相互取向将 NS3pro 的叉子与 NS3hel 中带正电的贴片对齐以促进 RNA 结合，可以通过旋转调整三个模型中的任何一个来实现，这些模型仅涉及 NS3pro 和 NS3hel 之间柔性接头的运动（图 8D）。因此，NS2B-NS3pro 的开放构象中带正电荷的 NS3pro 叉子和 NS3hel 贴片的并置被选为 NS2B-NS3 复合物的暂定 RNA 结合构型，用于进一步建模。
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图 8. 模拟ZIKV NS3pro-NS3hel相互取向。
NS2B-NS3pro 的开放构象模型和使用三种不同晶体结构模板构建的 NS3hel 模型证明了 NS3pro 和 NS3hel 之间连接子的灵活性。（A） 来自MEV病毒的2WV9结构模板（PDB ID：2WV9）;（B） 来自DENV4的2WHX结构结构模板（PDB ID：2WHX）;（C） 来自 DENV4 的 2WZQ 结构模板（PDB ID：2WZQ）。（D） 将NS3hel结构域中带正电的残基斑块与NS2B-NS3pro开放构象中的带正电荷的叉子并列的同源构建模型。NS2B 的 N 端和 C 端螺旋（分别为灰色和天蓝色）定向插入由虚线表示的 ER 膜中。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.g008
RNA与NS2B-NS3构象结合的比较分析
并列模型（图 8D）提供了一个吸引人的例证，说明 RNA 如何沿着 NS3hel 上带正电的小树林和 NS3pro 上的叉子结合。我们使用该模型通过对 Amber18[38] 和 ff14SB 力场 [39] 进行几个能量最小化步骤来拟合扩展的 RNA 链，从而得到 RNA-NS2B-NS3pro-NS3hel 模型，其中 NS2B-NS3pro 处于开放构象中（图 9B）。为了提供更真实的复合物视图，我们将NS2B的N端和C端螺旋定向插入到ER膜中，该膜使用膜片段（PDB id：2MLR [43]）建模为缩放。NS2B 的完整模型是使用 RoseTTAFold 程序构建的。（图 9）。
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图 9. RNA-NS2B-NS3pro-NS3hel复合物的模型。
将NS2B的N端和C端螺旋（分别为灰色和绿色）插入ER膜（灰色网格）中，使用膜片段（PDB ID：2MLR）建模为缩放。NS2B-NS3pro 在 （A） 闭合 （PDB ID： 5LC0）、（B） 开放（基于 WNV PDB ID： 2GGV 的模型）和 （C） 超开放 （PDB ID： 7M1V） 构象中相对于 NS3hel 的方向相似。NS2B-NS3pro的蛋白酶活性位点在封闭构象中的位置用黄色星号标记。B 中的 RNA 链被建模为跨越 NS3hel 的带正电的表面，在 NS2B-NS3pro 的开放构象中与带正电的叉子相邻。A 和 C 中显示了仅与 NS3hel 结构域相关的较短 RNA 链，反映了 NS2B-NS3pro 的封闭和超开放构象中缺乏明显的 RNA 结合结构。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.g009
对ZIKV NS2B-NS3pro的闭合（图9A）和超开（图9C）构象进行了类似的排列建模。只有在开放构象中，NS3pro中带正电荷的氨基酸的两个叉状斑块才为RNA链提供了合理的结合。在封闭构象中，RNA结合体积被带负电荷的NS2B辅因子占据，阻碍RNA结合（图9A）。在超开放构象中，RNA结合区扭曲，不容易观察到带正电荷的叉子的适当排列（图9C）。
黄病毒中RNA结合叉的氨基酸序列的保守性
我们认为，如果 ZIKV NS2B-NS3pro 开放构象中存在的叉状结构对 RNA 结合具有重要功能意义，那么它们的氨基酸序列将在黄病毒中保守。事实上，来自 11 种黄病毒的 NS3pro 比对揭示了叉 1-3 的近乎完美的氨基酸同一性/电荷守恒，而 4 叉的氨基酸同一性/电荷守恒度较小第叉子（图 10A）。请注意，虽然不带正电，但天冬酰胺（N）和谷氨酰胺（Q）侧链是极性的，已知很容易形成氢键[44]，从而可能稳定单条RNA链。在ZIKV RNA-NS2B-NS3pro模型（图10B）中清晰可见的电荷分布在WNV RNA-NS2B-NS3pro模型中显得不那么明显（图10C），部分原因是WNV NS2B-NS3pro结构中的侧链（PDB ID：2GGV）中分离不良。
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图 10. 带正电荷的叉子在黄病毒中是保守的。
（A） 来自11种黄病毒的NS3蛋白序列比对。（B） ZIKV NS2B-NS3pro 与结合 RNA 的开放构象模型。（C） WNV NS2B-NS3pro 与结合的 RNA 具有开放构象 （PDB id： 2GGV） 的结构。红色数字（A 到 C）表示 RNA 结合叉的相应保守氨基酸/结构位置。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.g010
“反向尺蠖”模型
基于我们的生化、结构和建模数据，我们提出了一种紧密交织的 ZIKV NS2B-NS3 解旋酶-蛋白酶机制的新模型（图 11）。根据该模型，NS3hel表面上带正电的凹槽容纳螺纹单链RNA，并将其“移交”给NS2B-NS3pro。NS2B-NS3pro 的开放构象提供了两个带正电/极性的叉子，在 NS3hel 上与带正电的凹槽相邻;这些叉结合由 NS3hel 串联的单链 RNA（图 11B）。在ATP的驱动下，NS3hel继续移动并解开双链RNA，与NS3hel相比，双链RNA是一个大得多的分子，并且与几种大的病毒蛋白（例如RNA依赖性RNA聚合酶NS5）相关。由于 NS2B-NS3pro 通过 NS2B 的 N 端和 C 端膜相关结构域永久拴在内质网膜上，并与单链 RNA 结合，因此 NS3hel 持续合成能力导致 NS3pro 和 NS3hel 结构域之间的连接子伸长（图 11C）。在某个时刻，链接器被拉长到最大，NS3hel 对 NS3pro 施加“拉扯”，因为 NS3pro 被束缚并且 NS3hel 正在移动。该力导致NS2B-NS3pro构象变为超开放，并释放结合的RNA链（图11D）。NS2B-NS3pro结构域松弛，然后返回到与NS3hel相邻的开放构象，进入RNA结合的新循环。这种 RNA 结合和释放的动态循环使解旋酶沿着 ~11 kb 的 dsRNA 黄病毒基因组具有无限的持续合成能力。蛋白酶活性需要NS2B-NS3独特的封闭构象，这很可能是由底物（例如从ER膜延伸的肽环）的存在诱导的（图11A）。请注意，反向尺蠖模型可以很容易地扩展到所有黄病毒，因为该家族中NS2B-NS3复合物的序列和结构保守程度非常高。
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图 11. ZIKV RNA-NS2B-NS3pro-NS3hel复合物解旋酶-蛋白酶结构-活性循环的“反向尺蠖”模型。
（A） NS2B-NS3pro 处于封闭构象（可能由底物诱导），无法结合 RNA。黄色星形表示面向内质网膜的蛋白酶活性中心;（B） NS2B-NS3pro 处于开放构象（蛋白水解无活性），通过 2 个带正电荷的叉状结构结合 RNA;（C） NS2B-NS3pro 与结合的 RNA 切换为开放构象，NS3pro 和 NS3hel 结构域之间的连接子最大拉长;（D）NS2B-NS3pro处于超开放构象，无法结合RNA;解离的RNA链以灰色表示。粉红色的圆形箭头表示NS2B-NS3pro构象变化的周期，NS3hel涉及dsRNA解旋。（E）反向尺蠖模型的图谱，显示了NS2B-NS3pro的解旋酶和蛋白酶活性。绿色的“ATP”箭头表示 NS3hel 运动的方向，由 ATP 驱动解开 dsRNA。GKRSS 表示 ZIKV Ns2B-NS3pro 在 Arg （R） 和 Ser （S） 之间裂解的 ZIKV 多肽片段。所有模型均基于晶体结构和能量最小化进行缩放（有关详细信息，请参阅文本）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.g011
靶向 ZIKV NS2B-NS3 功能的新方法
我们推测，NS2B-NS3pro 和 NS3hel 的特定空间排列使 RNA 能够通过 NS3pro 和 NS3hel 中的带正电荷的元件同时与两个结构域结合，这可能是病毒复制周期中的一个重要元素。我们的模型表明，靶向与小分子（例如桥接两个结构域的双结合分子）的这种特异性比对可能是一种很有前途的治疗策略。这种小分子可以装入位于NS3pro和NS3hel之间界面的空腔中。因此，我们使用 POVME3.0 软件评估了 ZIKV NS2B-NS3pro 和 NS3hel 界面上这些空腔的大小和位置 [45]。体积测量范围为 150–680 A3适用于 NS3hel 和 300–650 A3对于 NS3pro，因此组合体积为 500–1300 A3可用于容纳双结合分子（图 12）。相比之下，ATP分子的体积为~650 A3.因此，这种空腔的单个体积和组合体积都可以容纳小分子，这些小分子可以被设计成干扰NS2B-NS3pro和NS3hel的这种特定排列。
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图 12. NS3pro 和 NS3hel 接口处空腔的体积和位置。
在最佳排列的 NS3pro 和 NS3hel 界面处的空腔位置，以容纳单链 RNA（同图 8D）。彩色网格区域标记了空腔的位置。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.g012
可能的警告和解释
在凝血酶介导的标签去除之前，通过 His 标签纯化 RNA 结合 ZIKV NS2B-NS3pro 构建体。原则上，其他 E.大肠杆菌蛋白可能在影响RNA结合的亲和层析中被共纯化。例如，热稳定的 E.大肠杆菌已知Hfq蛋白含有一段His残基，这些残基可以在Ni亲和层析过程中共纯化，从而产生假阳性的RNA结合活性[46]。然而，我们的纯化方案涉及凝血酶裂解 His 标签以释放 ZIKV NS2B-NS3pro，并且凝血酶位点在 E 中不存在。大肠杆菌 Hfq。此外，Hfq 是一种 11 kDa 的蛋白质，具有 IC50RNA 结合值在低纳摩尔范围内，这与我们使用 IC 与 NS2B-NS3pro 与 RNA 结合的结果不一致50亚微摩尔范围内的值。至关重要的是，抑肽酶、WRPK3 和几种 NS2B-NS3 变构抑制剂消除了与 NS2B-NS3pro 的 RNA 结合，排除了 Hfq 的参与。 需要额外的实验来正式证明 ZIKV NS2B-NS3pro 的开放构象与 RNA 结合。一种确定的方法是结晶 RNA-NS2B-NS3pro 复合物;这些努力正在进行中。
讨论
在所有黄病毒中，NS2B-NS3pro 的蛋白水解活性和 NS3hel 的解旋酶活性都限制在单个 NS3 多肽内。广泛的结构和功能研究最终证明，黄病毒NS3多肽的蛋白酶和解旋酶结构域的酶活性具有很强的相互依赖性[18,19,47,48]。多项研究指出，黄病毒NS3pro结构域对NS3解旋酶的正常功能起着关键作用[18\u201220]。HCV NS3蛋白的蛋白酶结构域在NS3hel的步进效率中起着重要作用，它使偶联构建体NS3-NS4A的效率在每次ATP水解事件中高达93%，而单个NS3解旋酶构建体为20%[18]。研究显示，全长HCV NS3蛋白酶-解旋酶构建体中NS3pro结构域的存在可显著增强RNA与NS3解旋酶的结合[19]。DENV2 NS3pro结构域的缺失导致DENV2 NS3解旋酶定向运动失灵，并出现两种相反的活动，其特征是RNA解旋和RNA退火过程之间的ATP依赖性稳态[20]。DENV4病毒全长NS3蛋白的ATP亲和力比分离的解旋酶结构域高10倍[49]。此外，对于DENV2病毒NS3解旋酶-蛋白酶构建体，RNA解旋活性比仅代表解旋酶结构域的NS3hel构建体高出约30倍[50]。此外，与仅包含NS3hel结构域的构建体相比，Kunjin virus（KUNV）全长NS3蛋白的RNA解旋率更高[51]。尽管有强有力的证据表明 NS3pro 对解旋酶功能很重要，但 NS2B-NS3pro 参与 NS3 解旋酶活性的机制仍然不明确。
我们发现 RNA 仅结合 ZIKV NS2B-NS3pro 的开放构象，使我们能够为 ZIKV 和黄病毒的紧密交织的 NS2B-NS3 解旋酶机制制定一种新的“反向尺蠖”模型。至关重要的是，我们的模型在许多黄病毒报道的NS2B-NS3pro的封闭、开放和超开放构象之间提供了以前未被重视的机制联系。该模型的关键要素是捕获和释放循环，其中 NS2B-NS3pro 在开放构象中结合 RNA，并在超开放构象中释放 RNA。虽然让人想起PcrA DNA解旋酶的“尺蠖”机制[52]，但“反向尺蠖”模型有几个主要区别。首先，在PcrA DNA解旋酶的情况下，ATP水解驱动结构域1A和2A的ssDNA亲和力交替，从而通过捕获和释放循环直接促进DNA链易位[52]。在ZIKV NS2B-NS3 RNA解旋酶的情况下，捕获和释放循环由与ATP水解的直接结果分离的构象开关驱动。其次，NS3pro 通过 NS2B 锚定在内质网膜中，同时通过柔性接头与 NS3hel 连接，与 PcrA 的紧密对立的 A1 和 A2 ssDNA 结合位点相比，有效地使这 2 个 RNA 结合位点更加独立。第三，ZIKV蛋白酶-解旋酶的主要区别在于，NS2B-NS3pro仅在适应封闭构象时才发挥蛋白酶的作用。NS2B-NS3pro-NS3hel 活动的整个谱系自然地唤起了逆转尺蠖的形象（图 11E）。
在我们的模型中，单链RNA的结合是由两个带正电荷的叉状结构介导的，这种结构仅存在于NS2B-NS3的开放构象中。这种分叉的氨基酸序列和3D排列在黄病毒中高度保守，表明所提出的机制具有普遍性。NS3pro的缺失导致黄病毒解旋酶活性大幅降低[21,22,53]，这可能是因为NS3hel在ATP水解时缺乏RNA穿线的方向性，类似于双描述RNA解旋酶的方向性[54\u201257]。在这种情况下，NS3hel 的向后运动被与单链 RNA 结合的 NS3Pro 阻断，从而加强了 NS3hel 对双链 RNA 的方向性。需要进一步的结构工作（例如 RNA-NS2B-NS3pro-NS3hel 复合物的结晶）将需要阐明单链 RNA 如何精确地结合不同黄病毒中 NS3pro 内的此类结构。
2015年发现了日本脑炎病毒（JEV）NS2B-NS3pro（PDB ID 4R8T）的晶体结构[24]。然而，没有报道这种晶体结构的结构或功能分析，这可能解释了研究界缺乏关注的原因。请注意，同一性超过35%的多肽很可能具有相似的折叠[58]。鉴于整个家族中黄病毒蛋白酶的同一性超过50%[23,59]，我们认为JEV和ZIKV NS2B-NS3pro的超开放构象是黄病毒科家族的共同特征。
以前，两种ZIKV NS2B-NS3pro构建体eZiPro [60]和bZiPro [61]在封闭构象中结晶。事实上，在这两种情况下，ZIKV NS2B-NS3pro的活性中心都被短肽片段占据，可能诱导这种封闭构象。我们将 eZiPro （PDB ID 5GJ4） 与 bZiPro （PDB ID 5GPI） 叠加在一起，以更好地证明两种结构中的活性中心被源自 NS2B C 末端的四肽 TGKR （T127-G128-K129-R130） 或源自相邻 NS3 分子 （bZiPro） 的四肽 KKGE （K14-K15-G16-E17） 占据（S5 图).据我们所知，在活性中心没有肽/抑制剂的封闭构象中没有黄病毒NS2B-NS3蛋白酶的晶体结构。我们将其视为一种迹象，即当活性中心存在底物时，总是会诱导闭合构象。奇怪的是，15N R2来自NS2B残基65-85的NMR信号仅在bZiPro中缺失，但在加入AcKR时会重新出现[61]。这与没有 AcKR 的情况下，bZiPro 以开放构象的形式存在，其中 NS2B 的大部分 C 端部分与 NS3Pro 解离并保持非结构化，从而导致缺乏 NMR 信号。
称为复制工厂 （RF） 的内质网膜的细胞器样改变与 ZIKV / 黄病毒感染有关。使用电子断层扫描重建了RF的详细结构[62\u201267]。复制工厂由几个子结构组成，包括囊泡包（VP）和病毒袋（新组装的病毒粒子），它们在形态上是不同的[62\u201267]。根据该模型，NS2B-NS3复合物主要在VP内作为解旋酶发挥作用，而在VP外主要作为蛋白酶发挥作用，因为指示翻译区域的核糖体簇在VP结构附近但在VP结构之外可见[68]。ZIKV的射频动力学与NS2B-NS3功能循环的反向尺蠖模型兼容。然而，完整的~11kB病毒RNA如何从VP中转运并装载到核糖体上仍然是个谜。
在最近的一项研究中，Xu 等人，2019 [53] 提出 ZIKV NS3 是一种经典的 RNA 解旋酶，但观察到重组 NS3 多肽的持续合成能力非常有限，其能够解开不超过 18 bp 的 RNA 双链体。奇怪的是，添加NS5聚合酶可以提高速度，但不会改变NS3的持续合成能力（最大18 bp RNA双链体）[53]，这表明NS3固有的局限性。Xu 等人 2019 年研究中使用的重组 NS3 多肽包括 NS3pro 和 NS3hel;事实上，单独使用重组NS3hel没有显示出任何解旋酶活性。然而，单个NS3多肽缺乏NS2B。请注意，NS2B 始终通过三链 β-桶（NS2B 的 aa 49-58）与 NS3pro 紧密结合，该桶在所有 NS3pro 构象中保持完整。NS2B 的 N 端和 C 端都锚定在内质网膜中，因此，将整个 NS2B-NS3pro-NS3hel 复合物拴在内质网膜上。在没有NS2B辅因子的情况下，NS3pro仍然可以采用能够结合RNA的开放样构象。然而，如果没有 NS2B 辅因子将 NS3pro 牢固地锚定在 ER 膜上，在 12 aa 接头的最大伸长率下，NS3hel 将无法在 NS3pro 上“拉扯”。因此，缺少向迫使RNA解离的超开放构象的转换。因此，Xu 等人，2019 年的结果与我们的反向尺蠖模型一致，该模型还预测，添加膜锚定形式的 NS2B 辅因子 NS2B-NS3 复合物将表现出解离整个 ZIKV dsRNA 的 ~11kb 所需的无限持续合成能力。最后，NS2、NS3、NS4 和 NS5 多肽的组分很可能作为一个协调复合物协同工作，其中 NS2、NS4A 和 NS4B 蛋白的各种亚基可以提供整个复合物与内质网膜的复杂锚定。事实上，最近有人提出了这样的复合体[69]。
NS3pro和NS3hel结构域之间的12个aa连接子被证明对结构和功能相似的DENV2 NS2B-NS3pro中的蛋白酶和解旋酶活性至关重要[21]。影响其灵活性和长度的接头突变对ATP酶和解旋酶活性至关重要，并导致病毒基因组RNA合成显著减少[21]。由于沿序列扩散的 5 个谷氨酸残基 （171EEETPVECFEPS182).在晶体结构中，ZIKV蛋白酶-解旋酶连接子是无序的（PDB ID 5TFN、5TFO、5T1V和6UM3）。然而，在WNV和DENV2蛋白酶的封闭和开放结构中，连接子与蛋白酶结构域的保守区域相关[23]。我们提出，这种带负电荷的柔性肽与 RNA 竞争与 NS2B-NS3pro 结合，从而为观察到的包含 12 个 aa 接头的 NS2B-NS3pro-long 构建体缺乏 RNA 结合提供了解释。
最后，反向尺蠖模型假设 NS3hel 将螺纹 RNA 链“移交”给 NS2B-NS3pro。当NS3hel带正电的凹槽与NS2B-NS3pro开放构象中带正电的叉状结构相邻时，该过程最有效。由紧密相对的 ZIKV NS3pro 和 NS3hel 结构域形成的空腔体积与设计在一侧或两侧结合的小分子的可能性一致，从而干扰了这种排列。我们认为，NS3pro 和 NS3hel 结构域的这种精确定位对于 NS3 解旋酶最有效的 RNA 加工至关重要。我们提出的想法是，用二价小分子靶向这里提出的NS3pro和NS3hel结构域的特定比对界面，可以有效地桥接NS3pro和NS3hel，冻结这种瞬时构象，这可能是一种通用且高度特异性的方法，针对ZIKV和黄病毒的复制。
材料与方法
试剂
除非另有说明，否则常规实验室试剂均购自Millipore Sigma（密苏里州圣路易斯）。辣根过氧化物酶偶联的驴抗小鼠 IgG 和 TMB/M 底物来自 Jackson ImmunoResearch Laboratories（宾夕法尼亚州西格罗夫），用于 ECL 的 SuperSignal West Dura 延长持续时间底物来自 ThermoFisher（加利福尼亚州卡尔斯巴德）和 SurModics IVD（明尼苏达州伊甸草原），寡核苷酸由 Integrated DNA Technologies（加利福尼亚州圣地亚哥）合成。
ZIKV NS2B-NS3pro构建体的克隆、表达和纯化
合成 ZIKV 构建体的 DNA 序列并对其进行密码子优化，以便在 E 中进行高效转录。大肠杆菌。这些构建体被设计为单链双组分产物，缺乏NS2B辅因子的疏水性跨膜结构域。为了实现这一点，NS2B 的细胞质部分（残基 48-94）通过 9 残基接头 （GGGGSGGGG） 连接到 NS3pro 结构域。为了阻断构建体的蛋白水解活性，在指示的情况下，催化Ser135被 Ala 取代，得到无活性的 Ser135Ala 构造体。
ZIKV NS2B-NS3pro重组构建体与N端His标签用于转化感受态E。大肠杆菌BL21 （DE3） 密码子 Plus 细胞 （Stratagene）。转化细胞在 30°C 下在含有羧苄青霉素 （0.1 mg/ml） 的 LB 肉汤中生长。在 18°C 下用 0.6 mM IPTG 诱导蛋白质产生 16 小时。 通过在 4°C 下以 5000 g 离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于 pH 8.0（含有 150 mM NaCl （TBS） 的 20 mM Tris-HCl 缓冲液中，并在冰上超声处理（间隔 30 秒脉冲 8 次 30 秒）。然后将样品在 4°C 下以 40,000 g 离心 30 分钟，并使用与含有 1 M NaCl 的 TBS 平衡的 Ni-NTA 琼脂糖从上清液部分纯化构建体。用补充有35 mM咪唑的相同缓冲液洗涤除去杂质，并用标准TBS平衡色谱柱。将磁珠与凝血酶 （Sigma Aldrich） 共同孵育以切割 His 标签并释放 NS2B-NS3pro。将含有重组蛋白的馏分合并，并通过凝胶过滤在S200 26/60色谱柱（GE Healthcare）上纯化，并与标准TBS平衡。 使用10 kDa截留浓缩器（Millipore，Billerica，MA）将含有ZIKV NS2B-NS3pro的馏分浓缩至约10 mg/ml，然后以小等分试样快速冷冻并储存在–80°C下。 通过SDS-PAGE（12%NuPAGE-MOPS，Invitrogen）检查材料的纯度，然后进行考马斯染色。
我们生成了一系列结构（Mut3、Mut5 和 Mut6），迫使 ZIKV NS2B-NS3pro 采用“超开放”构象，使用野生型结构作为模板。在 Mut3 构建体中，原始序列中的所有三个 Cys 残基都被 Ser 残基（Cys80Ser、Cys143Ser 和 Cys178Ser）取代。在仅具有“超开放”构象 （Mut5） 的构建体中，将两个额外的 Cys 残基插入到 Mut3 构建体中（Ala88Cys 和 Lys157Cys）。为了获得具有“超开放”构象 （Mut6） 的催化失活突变体，在 Mut5 构建体中引入了额外的 Ser135Ala。出于结晶目的，我们还创建了一个 Mut7 构建体，其中包含 Mut5 序列中的 Leu30Thr 和 Leu31Ser 突变。Mut7 旨在最大限度地减少结晶过程中的 ZIKV 蛋白酶二聚化。
使用 BamH1 和 EcoR1 切割位点将 DNA 构建体克隆到 pGEX6P1 质粒中，导致 GST 标签在 NS2B 辅因子的 N 末端融合。用单个重组构建体转化大肠杆菌，诱导蛋白质产生，并如上所述破坏细胞。将含有 GST 标记的构建体的上清液部分上样到 Protino 谷胱甘肽琼脂糖 4B （Fisher Scientific） 珠子上，并用 TBS 洗涤除去杂质。为了从病毒蛋白酶上切割GST标签，将磁珠与3C蛋白酶（金斯瑞）共同孵育。然后，在S200 26/60色谱柱（GE Healthcare）上通过凝胶过滤对NS2B-NS3pro构建体进行额外纯化，该色谱柱与TBS平衡。 使用SDS-PAGE分析纯化构建体的纯度，然后进行考马斯染色。使用 10 kDa 截止浓缩器（Millipore、Billerica、MA）将纯化的蛋白酶浓缩至约 10 mg/ml，以小等分试样快速冷冻，并储存在 –80°C 下。 为了分离与抑肽酶或 WRPK3 复合物的 NS2B-NS3pro，将 NS2B-NS3pro 构建体与每种抑制剂以等摩尔比孵育，并通过在 S200 Superdex 柱上进行凝胶过滤纯化蛋白-抑制剂复合物。
荧光蛋白酶活性测定和离子色谱50测定
在含有 20% 甘油和 0.005% Brij 35 的 0.2 ml TBS 中，使用纯化的 ZIKV NS2B-NS3pro 多肽进行肽裂解活性测定，其中含有 20 μM 裂解肽焦谷氨酸 Pyr-Arg-Thr-Lys-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素 （Pyr-RTKR-AMC） 和 10 nM 酶。在λ处连续监测反应速度前任= 360 nm 和 λ他们= 465 nm 在 Tecan 荧光分光光度计（瑞士 M?nnedorf）上。确定 IC50将抑制性化合物 ZIKV NS2B-NS3pro 构建体 （20 nM） 的值在 20°C 下与不同浓度的化合物在含有 20% 甘油和 0.005% Brij 35 的 0.1 ml TBS 中预孵育 30 分钟。然后将Pyr-RTKR-AMC底物（20μM）加入0.1ml相同的缓冲液中。集成电路50通过确定获得对 Pyr-RTKR-AMC 的 NS2B-NS3pro 活性最大抑制的 50% 所需的化合物浓度来计算值。GraphPad Prism被用作拟合软件。所有测定均在 96 孔板中一式三份进行。如前所述，对WNV和DENV蛋白酶的催化试验相同[13,14,22,23]。
RNA/ssDNA与ZIKV NS2B-NS3蛋白酶结合的荧光偏振试验
使用在含有 1 mM MgCl 的 0.1 ml TBS 中进行的荧光偏振 （FP） 测定法评估纯化的重组 ZIKV NS2B-NS3pro 构建体与 RNA 或 ssDNA 之间的结合2在25°C下1小时。将 10 nM 6-羧基荧光素标记的 20 碱基 RNA（poly-rA 或 -rU）或 ssDNA（poly-dA 或 -dT）寡核苷酸样品与 50 nM 至 50 μM 纯化的 NS2B-NS3pro 构建体一起孵育。在布鲁克道尔顿荧光分光光度计（加利福尼亚州弗里蒙特）上监测偏振。Kd通过确定 3′-荧光素酰胺标记的 RNA/DNA 达到 50% 极化所需的构建体浓度来计算 RNA 和 ssDNA 结合的值。所有测定均在 96 孔板中一式三份进行。GraphPad Prism被用作拟合软件。
分子建模
这里介绍的所有结构建模都使用FFAS序列比对服务器在蛋白质数据库中查找结构模板[25]，并使用MODELLER程序创建同源模型[26]。为了建立完整蛋白质序列的结构模型，例如ZIKV NS2B辅因子蛋白，我们采用了RoseTTAFold程序，该程序使用深度学习方法进行快速结构预测[27]。使用 POVME3.0 程序计算 NS3pro 和 NS3hel 界面处空腔的体积和位置 [45]。
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ZIKV多蛋白组成和病毒和宿主细胞蛋白酶的加工。
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S1F免疫球蛋白.
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S1 图。 ZIKV多蛋白组成和病毒和宿主细胞蛋白酶的加工。
（A） 宿主蛋白酶和病毒蛋白酶在单个病毒蛋白之间连接处的切割位点的位置用箭头表示。（B） 黄病毒多蛋白中的NS2B-NS3pro切割序列。显示了衣壳蛋白 C 和 NS2A/NS2B、NS2B/NS3、NS3/NS4A、NS4A/NS4B 和 NS4B/NS5 边界处的切割位点。寨卡病毒，寨卡病毒（GenBank AMB37295）;西尼罗河病毒，西尼罗河病毒（GenBank P06935）;JEV，日本脑炎（GenBank P19110）;YFV，黄热病（GenBank P19901）;DENV1-4，登革热血清型 1-4（分别为 GenBank P33478、P29990、P27915 和 P09866）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.s001
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S2 图。 ZIKV NS2B-NS3pro （PDB ID 7M1V） 和 JEV NS2B-NS3pro （PDB ID 4R8T） 的重叠。
配色方案：粉色和蓝色 - 分别来自 ZIKV 的 NS3pro 和 NS2B。浅灰色和深灰色 — JEV 的 NS3pro 和 NS2B。红色标记 ZIKV 结构中的催化残基。请注意，所有结构分辨的元素完美重叠。NS2B的发散尾部（蓝色和深灰色）在两种结构中均未得到解决。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.s002
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S3 图。
（A） 本研究中使用的 NS2B-NS3pro 构建体。所有构建体均与 GST 蛋白或 HisTag 进行 N 端融合以进行纯化。NS2B 中心亲水部分以蓝色显示，NS3 蛋白酶以绿色显示。L = NS2B 和 NS3pro 之间的 GGGGSGGGG 链接子。（B） 纯化的野生型和 Mut7 NS2B-NS3pro 蛋白的蛋白质印迹分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.s003
（PDF格式）
S4 图。 eZiPro5 和 bZiPro6 晶体结构的叠加。
答：eZiPro（PDB ID GJ4）、NS3pro 和 NS2B 分别标有浅蓝色和深蓝色。肽片段 TGKR（与 eZiPro 结合）以绿色显示。B. bZiPro （PDB ID 5GPI）、NS3pro 和 NS2B 分别用洋红色和灰色标记。肽片段 KKGE（与 bZiPro 结合）以橙色显示。C.A和B的叠加，用红色标记的催化残留物。请注意，蛋白酶催化中心在两种晶体结构中都占据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.s004
（PDF格式）
S5 图。 eZiPro5 和 bZiPro6 晶体结构的叠加。
答：eZiPro（PDB ID GJ4）、NS3pro 和 NS2B 分别标有浅蓝色和深蓝色。肽片段 TGKR（与 eZiPro 结合）以绿色显示。B. bZiPro （PDB ID 5GPI）、NS3pro 和 NS2B 分别用洋红色和灰色标记。肽片段 KKGE（与 bZiPro 结合）以橙色显示。C.A和B的叠加，用红色标记的催化残留物。请注意，蛋白酶催化中心在两种晶体结构中都占据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011795.s005
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确认
我们感谢 Alexander Aleshin 博士的批判性讨论和建议，并感谢您提供对 PDB ID 7M1V 的早期访问。我们感谢 Alex Strongin 博士的宝贵建议和讨论，以及 Sumit Chanda 博士对 S.A.S. 的重要支持和有价值的讨论。
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