免费医学论文发表-化学感觉样组氨酸激酶在体外的趋化性中是可有可无的，但通过调节 RpoS 的稳定性来调节伯氏疏螺旋体的毒力
抽象
作为一种地方性病原体，莱姆病细菌伯氏疏螺旋体具有多个趋化性蛋白拷贝，包括两种趋化性组氨酸激酶 （CHK）、CheA1和 CheA2.我们之前的研究表明，CheA2是趋化性所需的真正 CHK;然而，CheA的作用1仍然神秘。本报告首先比较了区分CheA的结构特征1和 CheA2然后提供证据证明CheA1是一种控制 B 毒力的非典型 CHK。通过调节 RpoS 的稳定性来调节 RpoS，RpoS 是螺旋体的关键转录调节因子。首先，使用绿色荧光蛋白 （GFP） 标签的显微分析显示 CheA1具有独特而动态的细胞定位。其次，功能丧失研究表明，CheA1尽管与其他细菌的对应物具有高度的序列和结构相似性，但在体外不需要趋化性。第三，使用针头接种的小鼠感染研究表明，CheA的缺失突变体1 (车1mut）能够在免疫缺陷小鼠中建立全身感染，但在免疫功能正常的小鼠中却无法建立全身感染，尽管突变体可以在接种部位存活长达28天。蜱虫和小鼠感染研究进一步表明，CheA1对于蜱虫定植和获取是可有可无的，但对蜱虫传播至关重要。最后，结合免疫印迹、蛋白质周转、诱变和 RNA-seq 分析的机制研究表明，CheA 的耗竭1影响 RpoS 稳定性，导致几种 RpoS 调节的毒力因子（即 OspC、BBK32 和 DbpA）的表达降低，这可能是由于 clpX 和 lon 蛋白酶表达失调所致。对感染小鼠皮肤组织的批量RNA-seq分析进一步表明，cheA1mut不能引起小鼠 TNF-α、IL-10、IL-1β 和 CCL2 的表达，这是莱姆病发展的四种重要细胞因子和 B。Burgdorferi 轮回。综上所述，这些结果揭示了CheA的独特作用和调控机制1调节毒力因子表达，并为理解 B 的调控网络增添新的见解。布格多夫里。
作者摘要
莱姆病是一种由伯氏疏螺旋体引起的传染病，通过受感染的黑腿蜱叮咬传播给人类。它是北美和欧洲最常报告的蜱传疾病。伯氏疏螺旋体是一种高度侵袭性的细菌，可以游动并深入组织，引起多种疾病，包括关节炎、脑膜炎和游走性肌肉骨骼疼痛。这种侵入性是由螺旋体感知和响应周围环境的能力驱动的，这种能力由信号转导以及位于细胞两端的复杂感觉蛋白阵列引发。B的基因组。Burgdorferi编码趋化性相关基因的多个拷贝，其中许多基因的功能仍然未知。在本报告中，我们重点破译了一种趋化性组氨酸激酶CheA的作用1.我们的研究结果揭示了CheA的新监管贡献1B的感染生命周期和发病机制。布格多夫里。
数字
Table 5图1图2图3Fig 4Table 1Fig 5Table 2Fig 6Table 3Fig 7Fig 8Table 4Fig 9Fig 10Fig 11Table 5图1图2图3
引文： Sze CW， Zhang K， Lynch MJ， Iyer R， Crane BR， Schwartz I， et al. （2023） 化学感觉样组氨酸激酶在体外趋化性中是可有可无的，但通过调节 RpoS 的稳定性来调节伯氏疏螺旋体的毒力。PLoS 病理学 19（11）： e1011752 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752
编辑：D. Scott Samuels，蒙大拿大学，美国
收到： 2023年8月10日;接受： 2023年10月14日;发表： 十一月27 2023
版权所有： ? 2023 Sze et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 作者确认，研究结果所依据的所有数据都是完全可用的，没有限制。所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。
资金： 该项目得到了以下 NIH 赠款的支持：AI078958 到 CL;AI148844 B.R.C 和 C.L;R35122535 到 B.R.C;并AI045801 到 I.S.资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。没有作者从资助者那里获得薪水。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
趋化性使运动细菌能够感知周围环境，并相应地引导其游泳行为，以促进其生存以及定植和入侵宿主的能力[1]。细菌趋化性信号通路依赖于包含趋化性组氨酸激酶 CheA 和反应调节因子 CheY 的双组分系统 （TCS）。在大肠杆菌中，组氨酸激酶CheA是趋化性信号通路的关键组成部分[1–4]。当膜结合的甲基接受趋化蛋白 （MCP） 结合配体（即引诱剂）时，趋化性启动，导致通过接头蛋白 CheW 激活从 MCP 到组氨酸激酶 CheA 的信号转导。然后，通过自磷酸化激活的CheA将其磷酸基团转移到趋化性反应调节剂CheY，CheY又与鞭毛运动开关蛋白结合以调节鞭毛运动旋转，使细胞能够游向或远离环境。
莱姆病（Lyme disease， LD），又称莱姆疏螺旋体病（Lyme borreliosis），是美国和欧洲最常报告的蜱传疾病，美国每年新发病例超过476,000例[5]。LD是由伯氏疏螺旋体（也称为伯氏疏螺旋体）引起的，该细菌通过受感染的硬蜱叮咬传播给人类。从叮咬部位播散后，高度运动的螺旋体可以侵入身体的其他组织和远端部位。早期LD可以用抗生素有效治疗。然而，未被识别的LD可能产生使人衰弱的长期影响，如关节炎、脑膜炎和游走性肌肉骨骼疼痛，这些影响可能在感染数月甚至数年后出现[6,7]。
B的基因组。burgdorferi编码两个cheA（cheA1和 cheA2）、三个 cheY （cheY1、车2和 cheY3）和三个 cheW （cheW1、咀嚼2和 cheW3) [8,9]。这些基因中的大多数位于两个基因簇中：cheA2-嚼3-cheX-cheY3和 cheW2-bb0566-cheA1-cheB2-bb0569-cheY2 [第9-11页]。目前的证据表明，cheA中的所有趋化性基因2趋化性需要簇[11–13]。相比之下，咀嚼中的基因2已研究的簇（bb0569除外，其编码非典型MCP[14]）不参与体外趋化性。例如，cheW2和 cheY2突变体的体外表型与野生型相似，在趋化功能上没有明显的缺陷[11,13,15,16]。我们之前的研究表明，CheA2对 B 的趋化性至关重要。burgdorferi，例如cheA2突变体未能逆转，不断向一个方向奔跑，并且对引诱剂无趋化作用[11]。此外，体内研究表明，CheA2对 B 来说是必不可少的。伯氏疏螺旋在哺乳动物宿主中建立感染，并完成其地方性动物病生命周期[17]。
CheA的作用1目前仍不得而知。切阿1包含组氨酸激酶的所有特征结构域，类似于CheA2但结合CheY反应调节因子所需的P2结构域并不像其他已知的CheA那样保守[11]。Xu 等人以及我们小组最近的一项体内研究表明，cheY2和 cheW2对于B的趋化性和运动性是可有可无的。在体外，但对脊椎动物宿主内的生产性感染至关重要[15,18]。为了理解咀嚼器的功能2操纵子，特别是 CheA1，在B的趋化性和致病性中。burgdorferi， a cheA1突变体在致病性B31 A3-68?bbe02背景中产生[19]，并使用不同的体外和体内方法对其表型进行了非常详细的表征。分析了该突变体完成地方性动物感染周期的能力，并探讨了其对RpoS介导的调控的贡献。
结果
B的结构比较。布格多里切阿1和 CheA2
调查为什么 CheA1在体外对于趋化性是可有可无的，而 CheA2是必需的[11]，我们生成了两种CheA蛋白（BbCheA1和 BbCheA2），并将它们与Thermotoga maritima（Tm）的CheA的求解结构进行了比较[21,22]（图1A）。这些模型对每个单体中的所有结构域都显示出高置信度（pLDDT评分>80），仅对构成P1-P2和P2-P3接头的残基<50分。TmCheA 的结构域组成与 BbCheA 相似1和 BbCheA2有一些显着的差异（图 1B）。BbCheA公司1与 TmCheA 相比，具有类似的结构域排列，唯一的主要区别是扩展的 P2-P3 连接子（73 个残基长，而 TmCheA 的残基为 42 个残基）。相比之下，BbCheA2 differs from BbCheA1 and TmCheA in several distinct ways. First, BbCheA2 has two P2 domains (CheY binding domains, referred to here as P2α and P2β) compared to a single P2 domain in TmCheA and BbCheA1. Superimposition of the P2α and P2β domains reveals a high degree of structural similarity despite a mere 26% identity (Fig 1C). Sequence alignment suggests that both P2 domains bind to CheY, which could potentially act to increase the local phospho-CheY concentration within the chemosensory arrays of B. burgdorferi (S1A Fig), as has been shown for the P2 domain of the canonical E. coli CheA [23]. The second major difference between BbCheA1 and BbCheA2 is that BbCheA2 has an extended P3 domain (Fig 1B). CheA homodimerizes via P3-P3’ interactions, wherein two adjacent P3 domains come together to form a four-helix bundle [21]. In BbCheA2, the 122 residues in P3 domain is significantly longer than the ~53 residues domain found in TmCheA and BbCheA1 due to inserts between residues Ile446-Leu515 (Fig 1A and 1B).
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图 1. B的结构比较。布格多里切阿1和 CheA2.
(A） B的AlphaFold模型。布格多里切阿1（BbCheA公司1） 和 CheA2（BbCheA公司2）亚基与Thermotoga maritima CheA（TmCheA）的比较。蛋白质结构根据其pLDDT评分进行着色[20]。（B） BbCheA的域名组织1、BbCheA2和 TmCheA。BbCheA2 的第一个 P2 结构域（此处称为 P2α） 从 Glu153 延伸到 Lys265，并连接到第二个 P2 结构域 （P2β） 通过 18 个残基长 P2α-P2型β连接。小二β由残基 Glu283 至 Val387 组成，并通过 32 个残基长 P2 连接到二聚化结构域 （P3）β-P3 连接器。总体而言，P1-P2α和 P2β-P3 连接子由大约 50 个残基组成，类似于 TmCheA 的 43 个残基长 P2-P3 连接子。（c） BbCheA P2 的叠加α（RMSD：0.48 ?，青色，C150-V267）和 P2β（灰色，F279-V387）。（D） TmCheA（tan）、BbCheA的磷酸化转移结构域（P1）、CheY结合结构域（P2）、二聚化结构域（P3）、激酶结构域（P4）和调控结构域（P5）的叠加1（粉红色）和 BbCheA2（绿色）。每个对齐的 RMSD 显示在每个面板的下部区域。所有结构叠加和图形均在PyMol中生成[105]。
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更深入地了解 CheA 领域架构的整体差异1和 CheA2，我们叠加了来自 BbCheA 的结构域 P1-P51（粉红色）和 BbCheA2（绿色）与TmCheA的类似结构域（棕褐色，图1D）。总体而言，所有三种蛋白质 （RMSD < 1） 的 P1、P4 和 P5 结构域非常相似，而相似的 P2 和 P3 结构域在三种 CheA 中差异很大（RMSD 范围为 0.71–10.2 ?）。对于P2结构域叠加，畴核心是相似的，大多数结构偏差分别来自连接β链的环，以及连接到P1-P2和P2-P3连接子的N端和C端。BbCheA 的推定 CheY 结合位点分析1P2 和 BbCheA2P2（α 和 β）显示，P2 结构域的结构在该区域通常非常保守，支持表明 CheY：P2 结合界面残基中保守的序列比对数据（S1A–S1B 图）。来自 TmCheA、BbCheA 的 P3 结构域的叠加1和 BbCheA2AlphaFold 模型揭示了 BbCheA 的程度2P3结构域与TmCheA和BbCheA结构域不同1，其 P3 结构域与 0.7 ? 的 RMSD 对齐。与 TmCheA P3、BbCheA 相比2P3 的 RMSD 为 3.7 ?，长约 43 ?。扩展的P3结构域对于维持同源二聚体内CheA亚基之间和/或CheA与阵列中的化学感觉受体之间的正常蛋白-蛋白相互作用可能很重要[21,24]。
为了更好地理解 BbCheAs 预测的 P2 和 P3 差异，我们对螺旋体门内离散的 CheA 序列组进行了多序列比对分析。我们首先检查了螺旋体物种中仅包含一个CheA基因的所有CheA序列，假设该单个CheA将与趋化性信号传导有关。在此类别中，我们仅检查了密螺旋体目的成员。这些CheA序列的多个序列比对表明它们具有单个P2结构域和扩展的P3结构域（S2图）。这些结果表明，虽然额外的 P2 结构域可能在其他螺旋体物种的趋化性中起作用，也可能不起作用，但扩展的 P3 结构域是与螺旋体趋化性相关的 CheA 的保守结构基序。接下来，我们研究了所有CheA1和 CheA2来自疏螺旋体科物种的序列。来自这些序列的多重比对数据表明，在具有两种不同CheA亚型的物种中，所有CheA1蛋白质编码单个 P2 结构域，并具有类似于 BbCheA 的短 P3 结构域1和 TmCheA（S3 图）和所有 CheA2蛋白质编码第二个 P2 结构域和一个扩展的 P3 结构域（S3 图）。这些数据表明，虽然扩展的 P3 结构域似乎对不同螺旋体物种中与趋化性相关的 CheA 蛋白很重要，但添加第二个 P2 结构域可能是疏螺旋体属和疏螺旋体属的特异性修饰。
cheA的分离1突变体及其补补菌株
研究CheA的作用1在B的感染周期中。burgdorferi，我们试图使cheA失活1在致病力强的B31 A3-68 Δbbe02菌株中[25]。pGA的1Kan是先前构建的载体[11]，被线性化并电转化成野生型感受态细胞。首先进行了先前描述的PCR分析，以筛选具有所需靶向诱变的克隆[11]。一个克隆（称为 cheA1mut）被选中进行进一步分析。对于互补，质粒CheA1/pBBE22（图2A）被电转化成cheA1mut感受态细胞。CheA的存在1使用抗 CheA 的免疫印迹证实了抗生素耐药菌落中的 /pBBE221抗体和抗 DnaK 抗体作为对照。如图2B所示，在野生型和cheA中检测到约80 kDa的条带1com菌株，但在cheA中不存在1mut，表明同源基因产物在突变体中被消除，并在补补菌株中恢复（图2B）。伯氏疏螺旋体B31菌株含有21个直链和环状质粒[26]，其中一些对其感染性至关重要，但在体外培养过程中容易丢失[27]。为了检查我们分离菌株的质粒谱，使用先前开发的PCR方法确定获得的阳性克隆是否含有与其亲本菌株相同的质粒[28]。我们的结果表明，cheA1mut (S4B图）其同基因互补菌株（S4C图）含有与野生型菌株相同的质粒图谱（S4A图）。生长分析表明，cheA缺失1不影响突变体在23°C、34°C或37°C下的适应性（图2C–2E），表明CheA的耗竭1对 B 没有影响。Burgdorferi在体外生长。
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图 2. cheA的表征1突变体 （cheA1mut） 及其同基因互补菌株 （cheA1com）。
（A） 删除cheA1对 B 没有影响。Burgdorferi 增长。CheA的建设1/pBBE22 用于 cheA 的互补1mut.bb0566-cheA1使用引物对 P 对片段进行 PCR 扩增1/P2并克隆到pBBE22 [17,99]中，pBBE22是B的穿梭载体。burgdorferi，产生CheA1/pBBE22 中。（B） WT、cheA 的免疫印迹分析1mut和 cheA1com株。相同数量的 WT、cheA1mut和 cheA1com用SDS-PAGE分析全细胞裂解物，然后用CheA探测1和DnaK抗体，如先前报道[11,97]。WT、cheA的生长分析1mut和 cheA1com在常规实验室条件 （C） （34°C/pH7.6）、（D） 蜱样条件 （23°C/pH7.6） 和 （E） 宿主条件 （37°C/pH6.8） 下。进行生长曲线分析以确定 CheA1影响细胞生长。104或 105将细胞/ml 细菌接种到 10 ml BSK-II 培养基中，并在 34°C/pH7.6、23°C/pH7.6 或 37°C/pH6.8 下培养。每 1-4 天计数一次细胞数，直到细胞进入固定期。用至少两个独立样品重复细胞计数一式三份，结果表示为SEM±平均值。
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CheA的细胞定位1在时间和空间上受调控
如前所述，B.Burgdorferi 编码趋化性基因的多个拷贝。据推测，B.伯氏疏螺旋体可能具有两种趋化性通路，在感染周期内在不同宿主中起作用[8,11,13,18,29]，即CheA2嚼3和 CheY3形成在哺乳动物宿主中执行趋化性的途径，而 CheA1嚼2和 CheY2形成一个在蜱向量中被激活的独特途径。与这一推测一致，我们之前的研究表明，cheA的失活2减弱螺旋体在小鼠中建立感染的能力，但在蜱虫中则不受损[17]。为了破译CheA的功能1在B的流行周期中。burgdorferi，一种GFP报告基因构建体（S5A图）被创建并用于补充cheA1mut.报告菌株在实验室条件下以及体外模拟蜱环境的条件下培养，并在显微镜下观察。令人惊讶的是，我们注意到 CheA1-GFP在刻度相条件下培养时定位于一个细胞极，但在高温下出现弥散（图3A）。扩散模式不是由于GFP融合蛋白在高温下降解为全长CheA1-检测到GFP融合蛋白，没有过度降解（S5C图）。在仅携带空GFP载体的菌株（图3A）或表达CheA的菌株中未观察到这种模式2-GFP融合蛋白（S5C-S5D图）。该结果表明，极性定位模式是CheA独有的1 (图3A）。此外，CheA的国产化1似乎与细胞分裂有关。在早期测井阶段，CheA1-GFP信号定位于一个细胞极。当细胞进入对数中期时，CheA的信号1-GFP分布到中间细胞以及两个细胞极（图3B，第7天开始）。当细胞进入晚期对数到固定相时，CheA1-GFP信号沿细胞体分布在特定的点状体上，如图3B第13-17天的白色箭头所示（图3B）。当细胞在高温下培养时，CheA的极性定位1-GFP消失（S6图）。在高温下，在早期生长阶段，CheA1-GFP信号沿细胞体分散，只有当细胞进入固定相时，单极定位才会再次出现，就像在23°C下培养的细胞一样（S6B图），表明CheA的定位1在空间和时间上受到调节。与CheA相比1-GFP，GFP和CheA的定位2-GFP在所有培养条件和生长阶段都沿细胞均匀分布（S6A和S6C图）。总而言之，这些结果强烈表明CheA的定位1在B的整个生长过程中是动态的。burgdorferi 和那个 CheA1在地方性动物周期的蜱期，功能可能更突出。此外，pH值（细胞密度增加并进入固定相时呈酸性[30]）或温度可能对CheA的定位和功能产生影响1.
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图 3. 切阿1在蜱样条件下栽培时具有独特的极性定位。
（A） CheA的体外定位1.本地化 CheA1，一个CheA1-GFP 报告基因构建体（S3 图）用于补充 cheA1mut.获得的细胞在 23°C/pH 7.6 的未喂养蜱 （UF） 条件下或 34°C/pH 7.6 的常规实验室培养条件下培养。监测细胞是否存在GFP信号，并使用蔡司Axiostar Plus显微镜在早期对数期以×200放大倍率拍摄图像。比例尺表示 10 μm。A cheA1mut携带GFP报告基因构建体作为对照，以确认在CheA中看到的极性定位1-GFP补补菌株是由于CheA1而不是来自 GFP 蛋白的伪影。（B） CheA的时程图像1-在UF条件下培养的GFP菌株。105细胞/毫升 CheA1-将GFP菌株接种到10ml新鲜BSK-II中，并在UF条件下培养。每 2 天拍摄一次图像以监测 CheA 的定位1-GFP信号。当细胞进入晚期对数期至早期静止期时，观察到越来越多的离散明亮点状物沿细胞体均匀分布，这与标记子细胞分裂位点的新肽聚糖形成区域相吻合[106]。
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切阿1对 B 没有影响。体外伯氏疏螺旋泳行为和趋化性
伯氏疏螺旋体有3种不同的游泳模式：跑步、弯曲和反向[11,12]。我们之前的工作表明，cheA 的删除1对B的游泳行为没有影响。体外伯氏疏螺旋[11]。然而，所有这些研究都是使用高传代无毒B31A菌株进行的。为了测试在毒力菌株背景下是否是这种情况，野生型cheA的游泳行为1mut和 cheA1com如前所述，使用计算机辅助细胞追踪器分析细胞[11]。与WT、cheA类似1mut显示了三种游泳模式——被反向/弯曲中断的跑步，平均游泳速度为 12.5 ± 0.5 μm/sec，而 WT 和 cheA 的平均游泳速度为 13.7 ± 0.3 和 12.9 ± 0.3 μm/秒1com，分别（图 4A）。此外，使用N-乙酰基-D-氨基葡萄糖（NAG）作为化学引诱剂的毛细管测定[31]（图4B）和游泳板分析（图4C-4D）未显示WT、cheA之间的显着差异1mut和 cheA1com，进一步支持CheA1对 B 来说是可有可无的。体外的 Burgdorferi 运动和趋化性。
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图 4. 切阿1在体外对螺旋体运动和趋化性是可有可无的。
（A）细菌跟踪分析。WT、cheA 的游泳速度1mut和 cheA1com如前所述，使用基于计算机的运动跟踪系统进行测量[11]。跟踪了至少 25 个细胞并测量了游泳速度。（B）毛细管趋化性测定。根据先前的报道，该实验使用100 mM N-乙酰基-D-氨基葡萄糖（NAG）作为引诱剂进行[31]。结果表示为进入含有引诱剂的毛细管的细胞数量相对于进入不含引诱剂的对照管的数量（仅缓冲液）的数倍增加。结果表示为五个试管±SEM的平均值。增加 2 倍被认为是积极响应的阈值。（C）和（D）游泳板测定。如前所述，在含有1：10稀释的BSK-II培养基的0.35%琼脂糖上进行测定[100]。包括flgE突变体，一种先前构建的非运动突变体[103]，以确定接种物的大小。数据以十二块板的环的平均直径（以毫米为单位）表示± SEM。所有测定至少重复两次，独立重复，此处显示了代表性数据。*差异有统计学意义（P < 0.05）。
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车1mut未能通过针头接种在免疫功能正常的小鼠中建立全身感染
确定 CheA1对 B 的毒力至关重要。布格多里BALB/c 小鼠皮内感染 1 x 105WT、cheA 的细胞1mut和 cheA1com菌株（每株3-7只小鼠）。在感染后三周收获来自耳朵、皮肤、心脏和关节的组织，并转移到 BSK-II 培养基中进行重新分离。从所有感染动物中成功回收野生型菌株（7/7），而cheA1com从5只感染小鼠（5/5）的部分组织中成功回收，表明部分互补。有趣的是，cheA1mut仅从接种部位的皮肤中回收，而不是从远端器官中回收（表1）。为了排除突变体中自发突变的可能性，产生了一种新的缺失结构来取代整个cheA1用卡那霉素 （kan） 盒（S4D 图）框内的基因重复小鼠感染研究。新构建的突变体（cheA1IFD公司）能够在接种部位存活，但未能在免疫功能正常的小鼠中建立全身感染（表1），类似于cheA1mut.综上所述，这些结果表明CheA1对 B 来说不是必需的。Burgdorferi 在皮肤上定植，但需要从初始接种部位播散和/或在小鼠中建立全身感染。
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表 1. cheA1mut 不能在免疫功能正常的小鼠中引起全身感染。一个
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车1mut可在接种部位持续存在和增殖
突变体皮内感染未能引起全身感染，但突变体可以从初始接种部位重新分离出来，表明突变体能够在注射部位存活并持续存在并逃避宿主免疫系统。为了确定突变体可以在接种位点持续多长时间，1 x 105WT 或 cheA 细胞1mut将BALB/c小鼠皮下注射，并标记接种位点，在不同时间点进行细菌再分离，如材料和方法所示。qRT-PCR分析表明，突变体不仅能够持续存在，而且能够在接种位点复制，其程度与WT相同，如flaB转录拷贝增加长达28天所示（图5）。
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图 5. 车A1mut能够在接种部位持续存在。
确定 CheA1是 B 所必需的。在接种部位的 burgdorferi 持久性，进行了时间点感染研究。18只免疫功能正常的小鼠皮下感染105WT 或 cheA1mut并在指定的时间点处死小鼠。如前所述，使用qRT-PCR从接种部位回收皮肤组织以评估疏螺旋体负荷[17]。数据以超过 10 个的平均 flaB 转录拷贝数表示5小鼠β肌动蛋白±每组小鼠的SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.g005
车1mut血行播散有缺陷
我们推断，突变体未能引起全身感染可能是由于以下三种可能性：1）突变体未能从注射部位播散;2）突变体从注射部位成功播散到血流中，但由于组织趋向性缺陷而未能扩散到远端器官;或3）突变体成功播散到血液中，但被宿主免疫系统清除。为了测试这些可能性，使用严重联合免疫缺陷（SCIDs）小鼠重复上述动物研究。根据表2中的组织再分离结果，WT和cheA1com从所有收获的组织中成功回收。相比之下，cheA1mut突变体能够在50%的注射SCID小鼠中播散并引起全身感染。与使用免疫功能正常小鼠获得的结果一致，cheA1mut与其他组织相比，能够更好地在皮肤中定植和持久（表2）。qRT-PCR分析表明，在50%的全身感染SCID小鼠中，野生型cheA之间的组织螺旋体负荷差异无统计学意义1mut和 cheA1com耳朵和心脏组织除外（图6）。这一结果强烈表明，在没有适应性免疫反应的情况下，cheA1mut可从注射部位播散并引起全身感染，尽管程度有所减弱。在免疫功能正常的小鼠中，cheA1mut最有可能未能逃避宿主的适应性免疫反应，并在动物能够在远端器官定植和建立感染之前从动物身上清除。此外，血培养显示 6 只小鼠中有 3 只对 cheA 呈阳性1mut当皮下注射到SCID小鼠中时（表2），进一步证实突变体能够从接种部位播散并通过血液全身传播。综上所述，小鼠感染研究表明，在没有CheA的情况下1，B。伯氏疏螺旋在先天性和适应性免疫逃避以及组织定植方面均减弱。
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表 2. 车1mut在SCID小鼠的远端器官定植中仍减弱。b
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图 6. 车1mut在引起免疫缺陷小鼠全身感染方面减弱。
确定 CheA1是 B 所必需的。使用严重联合免疫缺陷 （SCIDs） 小鼠重复进行 burgdorferi 免疫逃避、针头感染研究。在这项研究中，105的 WT， cheA1mut和 cheA1com将菌株皮下接种到SCID小鼠中，并在感染后3周处死。采集注射部位周围和远端的皮肤组织以及耳、关节、心脏和脾脏的组织，使用qRT-PCR评估疏螺旋体负荷，如上所述[17]。数据以超过 10 个的平均 flaB 转录拷贝数表示5小鼠β肌动蛋白±SEM.*，差异有统计学意义（P < 0.05）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.g006
车1mut在定植和适应性免疫逃避中减弱
上述研究表明，该突变体的传染性降低，但仍能够扩散到血液中，在SCID小鼠中引起全身感染，但在免疫功能正常的小鼠中则不然。在存在适应性免疫的情况下，存活的少量突变细胞可能无法播散并引起全身感染。为了排除这种可能性，一个 10 倍以上的数字 （1 x 106通过尾静脉注射将螺旋体的细胞）直接引入BALB/c小鼠的血液中，以确定高剂量的细菌是否可以克服播散和定植屏障。作为对照，非运动、非传染性 flaBmut纳入菌株[32]。1 x 106的 WT， cheA1mut或者 flaBmut将100μlPBS中的细胞注射到BALB / c小鼠的尾静脉中。注射后两周收获组织以检查播散情况。所有注射WT菌株的小鼠都表现出播散性感染（3/3），而flaBmut正如预期的那样，对照组是无传染性的（0/3）。对于注射了cheA的小鼠1mut从感染的小鼠中只有五分之一的皮肤中成功回收了活螺旋体，这表明即使在直接引入血液的高接种量下，突变体在组织定植中也会减弱（表3）。此外，从任何注射cheA的小鼠的血液中均未发现突变细胞1mut.这一结果清楚地表明，CheA1对 B 的生存至关重要。血液中的Burgdorferi。与活培养回收率一致，从感染 WT 菌株的小鼠中检测到高水平的 flaB 转录本，而 cheA1mut-受感染的小鼠每 10 个 flaB 转录本拷贝少于一个5小鼠β-肌动蛋白转录本的总体（很可能是由于残留的 B.最初被引入血液中的伯氏疏螺旋（图7A））。这些发现进一步证实了CheA的关键作用1在 B 中。伯氏疏螺旋免疫逃避和组织定植。
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表 3. 车1mut在播散和免疫逃避方面存在缺陷。c
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.t003
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图 7. 车1mut在播散和血清耐药方面存在缺陷。
（A） 确定高剂量接种是否可以恢复 cheA1mut免疫逃避和定植屏障，106的 WT， cheA1mut和不运动的 flaBmut [32] 通过尾静脉将菌株注射到野生型小鼠中，并在感染后两周处死。采集皮肤、耳朵、关节、心脏和脾脏的组织，使用qRT-PCR评估疏螺旋体负荷[17]。数据以超过 10 个的平均 flaB 转录拷贝数表示5小鼠β肌动蛋白±SEM。 （B）血清杀菌活性。106WT、cheA 细胞1mut和 cheA1com与 20% 正常人血清 （NHS） 或热灭活血清 （hiNHS） 孵育 2 小时。NHS处理的细胞中活细胞的百分比在归一化到各自的hiNHS处理组后确定。此处显示的数据是SEM±三个独立重复的平均值。 *，差异有统计学意义（P < 0.05）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.g007
车1mut更易受血清杀菌活性的影响
伯氏疏螺旋体能够抵抗血清的杀菌活性[33,34]，因为它会产生多种毒力因子，保护螺旋体免受补体介导的杀伤，如BBK32、OspC和CRASP蛋白[参见最近的综述[35\u201238]]。cheA的减弱感染性1mut在SCID小鼠和尾静脉感染模型中，CheA1对 B 的免疫逃避很重要。布格多夫里。确定是否删除 CheA1使螺旋体对血清杀菌活性、WT、cheA 敏感1mut和 cheA1com用正常人血清 （NHS） 或热灭活 NHS （hiNHS） 处理，处理后活细胞的百分比与输入细胞进行归一化。我们的数据显示，cheA1mut更易受到血清杀伤的影响，存活率为~25%，而WT和cheA的存活率为~60%1com在NHS中（图7B）。这一观察结果与SCID小鼠研究一致，其中只有50%的cheA1mut能够在感染小鼠的血液中存活，并且补制菌株将存活率完全恢复到WT水平（表2）。突变体在血液中的存活率降低可能归因于其对血清杀菌活性的易感性。
切阿1不是肩胛硬蜱定植所必需的
作为 cheA1mut在野生型小鼠中未能引起播散性感染，我们使用基于显微注射的感染程序人工感染蜱虫[39]。对于这项研究，幼稚的我。肩胛若虫显微注射等量的WT、cheA1mut或 cheA1com株。感染后，允许蜱虫在幼稚的C3H小鼠（5个蜱/小鼠和每个菌株3只小鼠）上进食。如前所述，通过qRT-PCR测量充血蜱的螺旋体负荷[17,40,41]。如图8所示，cheA的细菌负荷1mut在喂食蜱中与WT和cheA无显著差异1com (图8A）。该结果表明 CheA1对于 B，不是必需的。蜱向量中的伯氏疏螺旋定植和存活。
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图 8. 切阿1对于 B，不是必需的。伯氏疏螺旋体在蜱中获得和存活，但对传播是必需的。
（A）进食后显微注射若虫蜱中螺旋体负荷的检测。从全饲喂的蜱中提取RNA样品（补充后，5至7天）并进行qRT-PCR分析。如前所述，通过flaB转录本的拷贝数与蜱β-肌动蛋白转录本的拷贝数进行比较来测量蜱的细菌负荷[17]。数据表示为每种菌株（WT、cheA）的flaB转录物±SEM的相对水平的平均值1mut和 cheA1com).（B）检测通过蜱叮咬感染的小鼠的螺旋体负荷。在蜱喂养后第14天，处死小鼠，从皮肤、心脏、关节和膀胱中采集组织进行qRT-PCR分析，如前所述[17,107]。在用cheA喂养的小鼠组织中未检测到微量的flaB转录本1mut感染蜱虫，而每 3 只小鼠中就有 1 只被 cheA 喂养1com在皮肤和心脏组织显示出积极的结果。*，差异有统计学意义（P < 0.05）。（C） 检测以感染小鼠为食的幼稚若虫蜱中的螺旋体负荷。C3H小鼠人工感染WT或cheA1mut通过针头接种菌株。幼稚的若虫蜱被限制在注射部位，并允许喂食至补充。72 小时后，收集喂养的若虫，并通过 qPCR 单独检测 flaB 的存在。实验重复两次，数据以每个喂食若虫的平均flaB拷贝数表示，来自两个数据集±SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.g008
车1mut不能通过蜱虫叮咬传播给小鼠
cheA的传染性1mut首先通过针头接种对小鼠进行评估。然而，这种方法不同于哺乳动物通过蜱虫叮咬感染的自然途径。作为 cheA1mut仍然能够在蜱虫中建立感染（图8A），我们检查了当被感染的蜱虫喂食时，突变体是否可以传播给小鼠。幼稚的C3H小鼠组被允许被人工感染的蜱寄生，如材料和方法中详述的那样。蜱喂食7天后，处死小鼠，收集皮肤、耳朵、心脏、膀胱和血液标本，进行qRT-PCR分析以确定病原体水平。与通过针头接种获得的结果一致（表1），只有来自WT-和cheA喂养的小鼠的组织标本1com-通过qRT-PCR分析，感染的蜱虫的flaB转录本呈阳性（表4）。仅从一只用cheA喂养的小鼠的皮肤和心脏中检测到flaB转录本1com-感染的蜱虫，与针刺接种小鼠观察到的结果一致，其中仅与cheA实现部分互补1com (表1）。在用cheA喂养的小鼠的标本中未检测到flaB转录本1mut-感染的蜱虫（表4），表明该突变体即使可以在蜱虫载体上定植，也无法传播给小鼠。总的来说，这些结果表明CheA1对于B的传播至关重要。通过蜱叮咬对小鼠进行 burgdorferi。
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表 4. 车1mut蜱虫传播有缺陷。d
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.t004
车1mut可由受感染小鼠的幼稚蜱获得
蜱传播实验表明，cheA1mut能够通过人工感染在蜱虫中存活，但未能传播给幼稚的哺乳动物宿主（图8A和表4）。测试CheA的可能作用1在采集阶段，小鼠感染WT或cheA1mut通过针头接种。注射后两周，通过从注射部位培养皮肤活检确认感染。若虫被放置并限制在注射部位，并允许喂食 72 小时。然后收集补料蜱进行qPCR，以确定螺旋体的采集效率。如图8B所示，flaB基因在寄生突变感染小鼠的若虫中成功检测到，其拷贝数与以WT感染小鼠为食的若虫中检测到的拷贝数相当（图8C）。应该注意的是，在大多数cheA1mut-感染的蜱虫，相对于野生型感染的若虫，获得大大减弱，12 个若虫中有 3 个未检测到 flaB 基因。该结果表明 CheA1对于蜱虫从小鼠身上获取螺旋体并不是绝对必需的，但可能在此过程中发挥一定作用。
切阿1影响 RpoS-调节子的表达和 RpoS 稳定性
伯氏疏螺旋体编码几种对哺乳动物宿主宿主组织结合/相互作用和免疫逃避至关重要的蛋白，例如OspC、BBK32和DbpB/A[42\u201245]。cheA的减毒表型1mut在小鼠感染研究中观察到的可能是毒力相关蛋白表达改变的结果。为了测试这种可能性，B.在高温和降低pH值（37°C/pH 6.8）下培养伯氏疏螺旋细胞，以模拟宿主环境。WT、cheA 的总蛋白谱1mut和 cheA1com在SDS-PAGE（图9A）和一些B上进行了分析。通过免疫印迹分析测量伯氏疏螺旋毒力决定簇，并与上样对照 DnaK 水平进行比较。CheA中RpoS蛋白水平显著降低1mut与 WT 和 cheA 相比的突变体1com菌株（图9B）。与这一发现一致，几种 RpoS 调节蛋白（即 BBK32、OspC 和 DbpA）的水平在突变体中也显着降低，并在补补菌株中恢复。相比之下，P66（一种非RpoS调节蛋白）的水平[46]不受cheA缺失的影响1，建议CheA1特异性影响 RpoS 和 RpoS-调节子表达（图 9B）。qRT-PCR分析显示，突变体中rpoS的转录水平略有降低，但不显著，而ospC和dbpA的转录水平分别显著降低65%和75%（图9C）。相比之下，在RpoD调节基因ospA转录本的突变体中没有观察到显著变化[47]。总之，删除cheA1导致 RpoS 和 RpoS 调节的毒力因子的表达降低，这反过来可以解释 cheA 观察到的感染性减弱1mut.CheA的耗竭1影响 RpoS 转录后，因为在 cheA 中未检测到 rpoS 转录本显着减少1mut (图 9C）。确定 CheA 如何1影响 RpoS 蛋白表达，使用 WT 和在模拟宿主环境的条件下培养的突变细胞进行蛋白周转测定以诱导 RpoS 表达。与野生型相比，在没有CheA的情况下，RpoS周转率增加1.野生型培养物的固定期RpoS水平相对稳定，而CheA的RpoS周转率超过50%1mut早在蛋白质合成停止后一小时（图9D）。CheA的互补1成功恢复了 RpoS 的稳定性（S7 图）。因此，在cheA中观察到的RpoS蛋白水平降低1mut是由于在没有CheA的情况下蛋白质稳定性降低1.
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图 9. CheA的耗竭1对 RpoS、BBK32、OspC 和 DbpA 的水平产生负面影响。
伯氏疏螺旋体菌株（WT、cheA1mut和 cheA1com）在 37°C/pH 6.8 下培养以模拟哺乳动物宿主条件，并在固定期收获 （～108cells/ml）用于（A，B）免疫印迹分析和（C）qRT-PCR分析。（A） 通过无染色 SDS-PAGE 分析相似量的全细胞裂解物。凝胶图像显示WT的总蛋白，cheA1mut和 cheA1com在SDS-PAGE上分析。（B） WT、cheA 的免疫印迹分析1mut和 cheA1com使用针对 CheA 的特异性抗体的样品2、谢1 [11]、p66 [101]、BBK32 [102]、RpoS、OspC和DbpA [86]。如前所述，DnaK被用作内部对照[97]。（C） 检测 WT、cheA 中 rpoS、ospC、dbpA 和 ospA 转录水平 1mut和 cheA1com使用qRT-PCR。将 dnaK 转录本用作内部对照。实验至少重复两次，独立重复。来自两次重复的数据表示为相对于WT的平均倍数变化±SEM.*，差异显著（P < 0.05）。（D） WT和cheA中的RpoS蛋白周转率1mut.检测RpoS蛋白在固定相WT B31 A3-68和B31 A3-68 cheA中的稳定性1mut使用大观霉素停止蛋白质合成后。在指定的时间点收获样品，并使用针对 RpoS 和 DnaK 的抗体（作为上样对照）进行探测。实验至少重复三次，具有独立的生物学重复。此处显示了具有代表性的图像。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.g009
CheA的耗竭1导致蛋白酶表达失调
蛋白质的稳态和稳定性由一组蛋白酶控制，这些蛋白酶负责调节给定蛋白质靶标的降解[48,49]。B的基因组。伯氏疏螺旋编码多种蛋白酶，包括Lon-1 [50]、Lon-2 [51]、HtrA [52–55]、CtpA [56]和Clp [9]。研究显示，Lon-1蛋白酶在转录水平上对RpoS表达产生负向影响[50]，而Lon-2蛋白酶在转录后水平上对RpoS表达产生正向调节[51]。在其他细菌中，例如 E.大肠杆菌，RpoS的蛋白稳定性受ClpXP蛋白酶的控制[57\u201259]。由于 RpoS 蛋白的稳定性在 cheA 中受到影响1mut，在突变体中检查了这些已知蛋白酶的表达。来自两个独立生物学重复的qRT-PCR数据一致表明，clpX、lon-1和lon-2的转录本在cheA中显著减少1mut与WT相比，WT在补补菌株中成功恢复（图10A）。初步RNA-seq分析还显示，cheA中clpX、lon-1和lon-2的表达显著下调1mut (S8 图）。我们的数据表明，CheA的耗竭1导致 B 表达失调。伯氏疏螺旋蛋白酶，如clpX和lon，随后对RpoS的表达和蛋白质稳定性产生负面影响。与此一致，clpX 的缺失显着损害了 RpoS 以及各种 RpoS 调节蛋白的表达（图 10B），而 lon-1 的缺失导致高水平的 RpoS 表达，如 Thompson 等人所示。[50]，进一步支持ClpX和Lon蛋白酶对RpoS表达的调节作用。
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图 10. CheA的耗竭1导致蛋白酶表达失调。
（A） 检测 WT、cheA 中 clpX、lon-1 和 lon-2 转录水平1mut和 cheA1com使用qRT-PCR。将 dnaK 转录本用作内部对照。用两个独立的重复重复实验。数据表示为相对于WT±SEM的平均倍数变化*，差异有统计学意义（P < 0.05）。（B） WT、clpX的免疫印迹分析mut和 lon-1mut使用针对 P66 [101]、BBK32 [102]、RpoS、OspC 和 DbpA [86] 的特异性抗体的样品。如前所述，DnaK被用作内部对照[97]。实验重复两次，独立重复。Lon-1突变体（lon-1mut）由欧阳实验室作为阳性对照提供，以显示如前所述的RpoS上调[50]。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.g010
车1mut不能引起小鼠 IL-10、TNF-α、CCL2 和 IL-1β 表达
cheA的减毒表型1mut在建立全身感染时，即使在免疫缺陷小鼠中也涉及先天性和适应性免疫逃避的缺陷。IL-10是莱姆病感染期间先天免疫应答的关键介质[60]。及时诱导 IL-10 表达对疾病进展至关重要，因为它抑制了宿主的炎症反应，有利于 B 的存活。早期感染期间的 burgdorferi。剖析 cheA 背后的原因1mut未能在小鼠中建立全身感染，使用受感染的小鼠皮肤组织进行RNA-seq分析。简而言之，100μl1 x 107WT 或 cheA1mut在三个不同的位置针头接种到 BALB/c 小鼠的背侧。在注射后 72 小时 （p.i.） 从接种部位收获皮肤组织，用于 RNA 提取和 RNA-seq 分析。富集KEGG通路的散点图显示，假与WT和假与MT（cheA1mut）在72小时p.i.时感染样品（图11A）。在WT感染的样本中，观察到许多免疫系统相关基因的显著变化，例如参与白细胞、粒细胞和中性粒细胞迁移的基因。这些基因在突变感染样本中没有变化。据报道，IL-10、IL-1β、TNF-α和CCL2等几种重要细胞因子和趋化因子的转录水平在WT感染组织中上调，但在MT感染组织中上调（图11B），qRT-PCR证实了这一点（图11C）。与RNA-seq分析一致，qRT-PCR显示cheA中il-10、il-1β和ccl-2的转录水平显著降低1mut-与被WT感染的小鼠皮肤组织相比，感染的小鼠皮肤组织（图11C）。从RNA-seq分析中获得的数据表明，cheA的不能力1mut确定全身感染的部分原因是其未能及时引起关键宿主细胞因子和趋化因子的表达以帮助传播和定植。
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图 11. WT感染的BALB/c小鼠皮肤组织的RNA-seq分析车1mut.
（A） 假手术与感染样品在72小时p.i.下差异表达基因的富集KEGG通路散点图。垂直坐标表示通路名称，水平坐标表示富因子。点的大小和颜色分别表示通路中差异基因的数量和不同Q值的范围。（B） MT （cheA 之间差异表达基因 （DEG） 的火山图1mut） 与 72 小时 p.i. 的 WT 样品每个点代表一个基因，其位置由 log2 倍数变化（x 轴）和 -log10（p 值）（y 轴）决定。具有显着上调（红色）或下调（绿色）的基因突出显示，而非显着基因显示为灰色。（C） 检测 WT 和 cheA 中 il-10、tnf、il-1β 和 ccl-2 转录水平 1mut使用qRT-PCR感染小鼠皮肤组织。β-肌动蛋白转录本用作内部对照。数据表示为相对于WT±SEM的平均倍数变化*，差异有统计学意义（P < 0.05）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.g011
讨论
伯氏疏螺旋体生活在一个复杂的地方性动物生命周期中，在节肢动物媒介和哺乳动物宿主之间交替。因此，蜱虫和宿主特异性转录组的高度协调表达对于确保螺旋体在自然界中的存活和持久性是必不可少的。Hk2-Rrp2-RpoN-RpoS和HK1-Rrp1信号通路是两种双组分系统（TCS）的主要原因，这些广泛的转录调整（参见综述[69–71]）。在地方性周期阶段特异性差异表达基因中，除了多种关键的表面脂蛋白外，还发现许多趋化性相关基因在B时具有不同的表达谱。burgdorferi 在不同的宿主之间交替，这强烈表明 B.蜱虫和哺乳动物的伯氏疏螺旋趋化机制不同[72]。B的基因组。burgdorferi 编码趋化性相关基因的直系同源物，其中许多基因以多个拷贝形式存在，例如两种趋化性组氨酸激酶 （cheA1、车2）和三种趋化性反应调节剂（cheY1、车2、车3) [其中一些基因在趋化性中没有已知的功能，因为诱变研究显示体外对趋化性没有明显的贡献。例如，缺乏CheA的突变体1表现出正常的趋化性反应，而CheA的丧失2在体外导致非趋化性表型[11,17]。因此，了解这些趋化性相关蛋白质在 B 的自然地方性循环中是如何协调的。Burgdorferi对于充分理解每种蛋白质在体内趋化性反应调节中的重要性至关重要。
有趣的是，尽管 CheA1在体外不需要趋化性，它具有结构域排列和局部结构域结构，与趋化性CheA更类似于TmCheA2.AlphaFold 模型显示 CheA1具有单个 P2 结构域，而 CheA2有两个 P2 结构域（α 和 β，图 1A–1B）。序列比对、结构叠加和先前的生化数据表明，这些结构域都与 CheY 样蛋白结合 [13]（S1A–S1B 图），尽管不同的 P2 结构域是否对一种 CheY 亚型具有特异性，而不是另一种 CheY 亚型（即 CheY1-3）目前未知。除了 P2 结构域外，CheA 之间的另一个主要区别1和 CheA2是 P3 结构域的长度（图 1D）。切阿1具有与 TmCheA 长度非常相似的 P3 结构域，而在 CheA 中2P3 超过 68 个残基，比 CheA 长 43 ?1和 TmCheA。以前，已经认识到 B.伯氏疏螺旋体和密螺旋体具有扩展的P3结构域结构[21,24]。据推测，这些扩展的 P3 结构域可能会稳定 CheA2通过增加两个CheA亚基的结合界面表面积来增加同型二聚体。另一种可能性是，较长的P3-P3'四螺旋束是一种适应，可以更好地与螺旋体的化学感觉阵列结合，由于膜曲率高，螺旋体具有不同的结构[21,24]。虽然为什么疏螺旋体科CheA背后的确切分子机制2第二个 P2 结构域和扩展 P3 结构域的编码尚未确定，但有趣的是，这两个特征在整个疏螺旋体科中是保守的（S3 图）。
运动性和趋化性对 B 的发病机制有显著影响。伯氏疏螺旋体（burgdorferi）作为运动性或趋化性丧失导致非感染性螺旋体，无法定植蜱媒介和/或哺乳动物宿主[17,73,74]。我们小组之前的一项研究表明，趋化性信号传导由CheA介导2组氨酸激酶是螺旋体从蜱传播到哺乳动物以及在脊椎动物宿主中建立感染所必需的，但对它在蜱虫中的存活不是必需的[17]。基于趋化性基因簇的组织[75]以及cheA基因的诱变研究1 [11,14-16]和cheA2 [12,13,17,73]操纵子，我们假设B。伯氏疏螺旋体在其感染周期中可能在不同环境中利用不同的化学感觉机制，即 CheA2在哺乳动物宿主的传递/持久性期间调节趋化性，而 CheA1构成第二趋化性通路，以指导蜱向量中的趋化反应，并相应地介导 B。伯氏疏螺旋从受感染的蜱虫传播给哺乳动物。与我们的假设一致，Iyer 等人最近的一项研究。显示CheA1和CheY2在传播蜱虫中被高度诱导，这表明这两种蛋白质可能形成功能性趋化性通路，当受感染的蜱虫吸血时，该通路被激活，从而为休眠的螺旋体迁移和传播到新宿主做准备[72]。最后，Caimano等人最近的一项研究。进一步证实了CheA的作用1在传输过程中，cheA 的水平1在喂食的蜱虫和哺乳动物中，RpoS高度诱导[76]。
当前研究中一个有趣的观察结果显示，CheA1在成长过程中具有动态定位。重要的是，CheA的强烈单极定位1当在模拟未饲喂的蜱虫环境与高温条件下培养时，表明 CheA1与脊椎动物宿主相比，可能在节肢动物载体中发挥更突出的作用（图 3 和 S6）。切阿1可战略性地放置在靠近化学感受器阵列的细胞极附近[16]，随时准备检测血粉中的刺激，以便启动从蜱中肠向唾液腺的迁移以进行传播[77,78]。为了回答这个问题，cheA的体内可视化1mut蜱血粉后的细胞对于揭示突变体无法通过蜱虫叮咬传播（表4）是否是由于从血淋巴迁移到蜱唾液腺失败所必需的。此外，CheA 的点状定位增加1-GFP作为细胞从早期对数期过渡到晚期对数期，与ParB定位具有惊人的相似之处。ParB 是一种染色体分离蛋白，已被证明可以将染色体 （SMC） 复合物的结构维持募集到 B 中复制的起点。Burgdorferi[79]。测试CheA的本地化是否会很有趣1与 DNA 分配 Par 蛋白相关，也许是为了确保 CheA 的平等分离1细胞分裂过程中子细胞之间的蛋白质。
鉴于 cheW2操纵子受RpoS和BosR的正向调控[18,76]，cheA的失败1mut传播过程中的部分原因可能是血粉期间从蜱肠道到唾液腺的迁移缺陷，类似于喂养蜱中rpoS突变体的表型[80]。最重要的是，CheA 的可能关联1Par 蛋白意味着已建立的 CheA 池1需要在子细胞之间平均分布。在高温培养的细胞中也观察到这种独特的分配，但仅在固定期晚期（S6B图）。一旦将这些晚期固定期细胞重新接种到新鲜的BSK-II培养基中，CheA1定位恢复到第 1 天看到的弥散模式。这种蛋白质定位对 CheA 具有特异性1因为我们没有用 CheA 观察到这一点2 (S5D和S6C图）。对 CheA 的需求1进行空间和时间定位是目前未知的。鉴于蜱鼠感染研究指出了CheA的作用1在蜱传播和血行传播期间，监测CheA的定位将是有趣的1在喂食蜱虫和哺乳动物中，以确定 CheA1改变其在不同细胞环境中的定位，以及这种定位是否有助于其功能。
在通过蜱叮咬或针头接种进行初始沉积后，B。伯氏疏螺旋体需要先确定局部感染，然后再播散到外周器官。因此，血行播散是早期感染的关键致病事件[81]。一旦进入血流，螺旋体必须通过血管外渗进行迁移，以扩散和定植于远端器官[82,83]。一些发现阐明了CheA的传播事件1最有可能参与其中。一、cheA1突变体在针头接种后能够在免疫功能正常和缺陷小鼠的注射部位存活，表明CheA1不是皮肤组织存活所必需的。针头接种到SCID小鼠中允许cheA的部分传播1突变于血液中，随后定植于注射部位远端的皮肤区域（即耳朵）以及其他器官，但在免疫功能正常的小鼠中未能做到这一点。该结果表明 CheA1是螺旋体在血液中存活所必需的，最有可能是通过帮助细菌进行免疫逃避。与此一致，免疫印迹分析显示 CheA 缺失1对几种必需表面毒力因子的表达产生负面影响，例如 OspC 和 BBK32（图 9B）。OspC 已被证明与宿主免疫成分相互作用，例如补体成分 4b （C4b），并有助于 B 的存活。血液中的伯氏疏螺旋[42]。这可以解释在SCID小鼠中的发现，其中只有50%的小鼠有全身感染，因为补体系统在免疫缺陷小鼠和cheA中保持完整1mut与野生型相比，在血液中的保护作用不如野生型（表2和图6）。血清杀菌试验证实了这一点，因为 CheA 缺失1使螺旋体更容易被血清杀伤（图7B）。伯氏疏螺旋体尾静脉感染进一步支持了这一观点，因为该突变体在14天内从野生型小鼠的血液中清除，并且在血行播散中严重减弱。尾静脉注射大剂量螺旋体不能挽救cheA的存活和全身播散缺陷1突变体表明，除了先天性和适应性免疫逃避减弱外，突变体可能由于表面蛋白表达失调而存在组织定植缺陷或外渗能力减弱（图9），例如BBK32[84]，这导致宿主免疫系统清除血液中的螺旋体。cheA的能力1mut需要通过活体成像检查从脉管系统迁移，以确定 cheA 的能力是否降低1mut从小鼠的血液中定植和播散部分是由于外渗缺陷以及免疫逃避受损。硬蜱的人工感染显示野生型和突变型之间的存活率没有显着差异（图8A）。此外，cheA1突变体可以从受感染小鼠的皮肤中获得，提示CheA1对于获取是可有可无的。此外，cheA1mut未能通过受感染的蜱虫叮咬传播，提示CheA1是蜱传播所必需的，与观察到的 cheA 增加一致1传播过程中的转录本[72]。免疫印迹和qRT-PCR分析（图9）表明，CheA耗尽后小鼠的感染性减弱1可能是由于 RpoS 和 RpoS-调节子表达失调所致，这对 B 至关重要。哺乳动物宿主的伯氏疏螺旋存活率、免疫逃逸和持久性[42,43,45,69,78,85,86]。蛋白质周转试验显示，在没有CheA的情况下，RpoS的稳定性显著降低1 (图 9D）这可能是由于蛋白酶表达失调所致（图10）。
在其他细菌中，例如 E.大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，除了σ70管家Sigma因子，采用多种替代Sigma因子根据生长条件的变化（如应激反应、饥饿以及运动期和无柄期之间的过渡）有效调控基因表达[87\u201288]。每种σ的活性都由抗σ蛋白的结合控制，因此可以在需要时释放适当的σ与RNA聚合酶（RNA polymerase， RNAP）相互作用[89\u201291]。B的基因组。Burgdorferi 编码两个替代 sigma 因子，σ54（RpoN） 和 σ38（RpoS）[9]. 西格玛因子伴侣转换是如何发生在 B 中的。Burgdorferi 仍然不清楚，因为尚未发现反西格玛因素。使用体外培养样品进行的初步RNA-seq分析显示，cheA中许多RpoS抑制基因（如bb_d18和bb_a68）显著上调[76,92][76,92]1mut突变体（S7图）。如图10A所示，cheA的bb_d18水平显著升高1mut与使用 qRT-PCR 验证时的 WT 相比。值得注意的是，bb_d18的表达在互补菌株cheA中仍然升高1com，这也许可以解释为什么在cheA中只实现了部分互补1com (表1）。RpoS 抑制基因的不合时宜表达可能稀释了可用于转录核心基因（如 clpX 和 lon 蛋白酶）的 RNAP-RpoD 复合物库，导致 CheA 的全局失调1突变转录组（S8图）。此外，BBD18被称为RpoS的负调节因子[93\u201295]，该基因的上调可以进一步抑制突变体中RpoS调节子的表达（图9）。总而言之，数据强烈表明 CheA1影响B的致病性和转录组。burgdorferi 通过潜在地通过 ClpX 和 Lon 蛋白酶影响 RpoS 的稳定性。
如上所述，CheA1可能有助于蜱内的趋化性。它也有可能在宿主传播中发挥作用。我们没有在cheA中检测到任何趋化性缺陷1mut 体外（图4）;然而，CheA的意义1趋化性可能只能在体内观察到，因为实验室培养很少能准确代表 B 自然感染周期的任何方面。伯格多里[96]。我们之前已经证明过 CheW2有助于B的完全致病性。burgdorferi 作为 CheW 的消耗2导致螺旋体的传播和定植减弱[18]。鉴于 CheW2优先与CheA互动1 [16]， 谢1嚼2和 CheY2在载体传播和宿主传播阶段可能构成主动趋化性途径，以指导 B 的趋化反应和迁移。布格多夫里。值得注意的是，cheA 的表型1mut与在感染性化学中观察到的不同2和 cheW2突变体;徐， 等.显示 cheY2两周后，突变体从接种部位清除，但未引起全身感染[15]。相比之下，cheA1mut在初始注射部位持续存在，并且能够复制，如我们的时程研究所示（图5）。至于咀嚼2，即使删除了 CheW2导致免疫功能正常小鼠的感染性减弱，其感染性在SCID小鼠中不受影响，这与cheA的体内表型有显著差异1mut [然而，所有三个突变体在体外都表现出野生型趋化性行为，这引发了CheA是否1-嚼2-车友2在体内特定情况下是趋化性所必需的。车1和 cheY2蜱载体中的突变体存活率与野生型无显著差异（图8A），强调CheA1和CheY2 [15] 不是 B 的持久性和存活所必需的。节肢动物载体中的Burgdorferi。cheA怎么样1mut能够在皮肤组织中持续存在并扩散，但不能扩散到远端器官？鉴于 B.伯氏疏螺旋体可通过直接组织播散[81]，一旦cheA1mut在注射部位建立局部感染，它能够在皮肤组织内扩散到远端皮肤区域（例如耳朵），并通过非血行扩散避免宿主免疫系统清除。
为了在哺乳动物宿主中定殖和生存，B.伯氏疏螺旋体已经进化到改变其表面抗原表达，以实现不同的组织趋向性以及对宿主免疫反应的反应[45]。WT 与 cheA 引起的宿主免疫反应的差异1mut (图 11）与小鼠感染结果一致。缺乏螺旋体传播所需的关键炎症介质可能会抑制 cheA 的进展1mut感染和播散结果，导致观察到的传染性减弱（表1、2和3）。抗炎细胞因子IL-10在B的进展中起关键作用。伯氏疏螺旋感染[60–62]。cheA的失败1mut在小鼠中及时表达IL-10可能导致其在免疫功能正常和缺乏小鼠中的传播和定植失败（表1和表2）。尽管如此，突变体能够在没有IL-10细胞因子效应保护的情况下在接种位点持续存在（图5），这意味着可能需要额外的细菌和宿主因子。cheA 后缺乏激活的宿主免疫反应1mut感染（图11B）可能使螺旋体逃避免疫监视并在接种部位持续存在。
综上所述，本研究揭示了CheA1是一种非经典的趋化性组氨酸激酶，在 B 中具有新的作用。伯氏疏螺旋感染和毒力因子表达的控制。作为一种组氨酸激酶，CheA1不直接影响基因表达，但必须通过反应调节蛋白起作用才能激活给定的信号通路。确定 CheA 的同源反应调节因子1是理解CheA如何的下一个重要步骤1通过 RpoS 蛋白表达和稳定性以及 CheA 的更大作用影响全局转录组变化1在 B 中播放。体内的伯氏疏螺旋发病机制。
材料与方法
道德声明
所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物饲养和护理的指南进行，并在机构动物护理和使用委员会[IACUC批准号：#AD10001779]审查和批准后，按照弗吉尼亚联邦大学的机构规定进行。
细菌菌株和生长条件
传染性克隆 A3-68 和 A3-68?bbe02（野生型），是 B 的两种衍生菌株。本研究使用了严格意义上的伯氏疏螺旋B31-A3[25]。它们是 P. Rosa（落基山实验室，NIAID，NIH）的善意礼物。如前所述[97]，细胞在Barbour-Stoenner-Kelly（BSK-II）培养基中生长，并根据需要在适当的抗生素中进行选择性压力：链霉素（50μg/ml）、卡那霉素（300μg/ml）和/或庆大霉素（40μg/ml）。确定CheA的表达1, 105将固定相野生型细胞接种到 10 ml 新鲜的 BSK-II 培养基中，然后在 23°C/pH 7.6（未补料的蜱，UF）或 34°C/pH 7.6（常规实验室培养条件）下培养。检查 RpoS 和 RpoS-调节子的表达，105将固定相野生型、突变体和补补菌株接种到10 ml新鲜BSK-II培养基中，然后在37°C/pH 6.8和5% CO下培养2以模拟主机条件。在~10进入固定相时收获细胞进行免疫印迹分析8细胞/毫升。
切阿1、谢2以及 TmCheA AlphaFold 模型的生成和分析
构建 CheA1、谢2和 TmCheA 模型、TmCheA （AAA96387.1）、CheA 的蛋白质序列1（AAC66935.1） 和 CheA2（AAC67024.1）从NCBI数据库中检索并提交使用AlphaFold2进行自动化模型构建[20]。所有参数都保留为模型构建的默认值。
CheA的建设1/pBBE22 用于 cheA 的互补1突变体
pGA的1kan，一种先前构建的载体，在 cheA 中具有 393 bp 的内部缺失1基因（核苷酸1,016–1,409）[11]，用于灭活cheA1在 B31 A3-68 和 A3-68?bbe02 菌株中通过等位基因交换诱变。本报告中进行的所有实验均使用在 A3-68?bbe02 背景中产生的突变体完成，但 RpoS 蛋白周转分析除外，其中 cheA1突变体是在 B31 A3-68 背景下产生的，因为 A3-68?bbe02 携带链霉素抗性盒。补充 cheA1突变体， CheA1/pBBE22（图2A），使用引物对P通过PCR连接构建1/P2扩增bb0566-cheA1区域，并在BamHI限制性位点克隆到pBBE22G载体中[17,98,99]。本研究中使用的所有引物均列于表5中。
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表 5. 本研究中使用的寡核苷酸引物。e
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CheA的建设1用于框内删除 cheA 的 IFD1
创建替代 cheA1突变体，使用PCR连接方法制备框内缺失构建体，以框内替换cheA的整个开放阅读框（orf）1用卡那霉素（KAN）盒。使用P PCR扩增缺失构建体的左臂和右臂27/P28和P29/P30，并用P 31/P32 (表5）。然后用P27/P30并与 pJET1.2/钝克隆载体 （Thermo Scientific， Waltham， MA） 连接，产生 CheA1IFD（S4B图）。
CheA 的本地化1和 CheA2在 B 中。布格多里
对于CheA的本地化1和 CheA2、车1-gfp/pBSV2G（S3A图）和cheA2-gfp/pBSV2G（S3B图）构建体用于补充cheA1mut和先前构建的cheA2突变株[11]。由flgB启动子驱动的gfp对照质粒被纳入定位研究的对照[100]。确定 CheA 的本地化1和 CheA2，将表达GFP构建体的细胞接种到10ml新鲜BSK-II培养基中，然后在23°C/pH 7.6或34°C/pH 7.6下培养。每 48 小时观察一次细胞，持续长达 2 周。如前所述，使用蔡司Axiostar plus显微镜拍摄图像，并使用Axiovision软件（德国蔡司）进行处理[100]。
SDS-PAGE和免疫印迹
10 至 20 μg B。在 10% 或 12% Stain-Free SDS-PAGE 凝胶上分离 burgdorferi 全细胞裂解物，并转移到 PVDF 膜上（Bio-Rad Laboratories， Hercules， CA）。首先使用 ChemiDoc MP 成像系统（Bio-Rad Laboratories）激活和成像 Stain-Free SDS-PAGE，然后进行膜转移以可视化凝胶上的总蛋白质。用抗 B 的抗体探测免疫印迹。布格多里切阿1、谢2 [11]、p66 [101]、BBK32 [102]、RpoS、OspC和DbpA [86]。如前所述，DnaK被用作内部对照[97]。使用辣根过氧化物酶二抗和ECL鲁米诺测定或荧光标记的二抗开发膜。使用 ChemiDoc MP 成像系统对信号进行成像，并使用 Image Lab 软件 （Bio-Rad Laboratories） 进行量化。
细菌运动跟踪分析、游泳板和基于毛细管的趋化性测定
B的游泳速度。如前所述，使用基于计算机的运动跟踪系统测量Burgdorferi细胞[31]。游泳板测定与既往报道的相同[11,32,103]。游泳圈的直径以毫米为单位记录。野生型A3-68 Δbbe02作为阳性对照。使用非运动菌株flgE突变体[103]作为阴性对照来监测初始接种量。如先前报道，在毛细管试验中，N-乙酰基-D-氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine （NAG）被用作引诱剂[31]。使用Petroff-Hausser计数室计数毛细管中积聚的螺旋体细胞进行计数。确定三次重复的平均值，并将数据表示为每组不含引诱剂的缓冲液对照的平均相对增加。与缓冲液对照相比，螺旋体数量增加两倍或更多被认为是显著的。
定量逆转录PCR（qRT-PCR）
按所述制备用于qRT-PCR分析的蜱和小鼠组织样本[17,97]。简而言之，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）从蜱虫或小鼠组织中分离总RNA，并使用Turbo DNase（Ambion，Austin，TX）去除污染的基因组DNA。根据制造商的说明，使用 SuperScript IV VILO 预混液 （Invitrogen） 重新纯化经 DNase 处理的 RNA 并转化为 cDNA。然后使用Fast SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems，Foster City，CA）进行定量PCR。如前所述，感染小鼠和蜱虫体内的螺旋体负荷表示为相对于小鼠拷贝数的flaB转录水平或蜱β-肌动蛋白转录水平[17]。表5总结了qRT-PCR中使用的引物。数据表示为两个重复相对于WT±SEM的平均倍数变化。采用方差分析（P值<0.05）评价不同实验组间差异的显著性。
蛋白质周转测定
为了确定RpoS蛋白的稳定性，如前所述[104]使用野生型A3-68和cheA进行蛋白质周转1突变体在相同的背景中构建。该突变体被证实具有与cheA相同的抗原谱1mut [103,104]。简述 105细胞/ml 的 B。将 burgdorferi 细胞接种到 50 ml pH 6.8 的 BSK-II 培养基中，并在 37°C 至对数期中期 （5x106细胞/mL）或固定相（108细胞/毫升）。向培养物中加入100μg/ml大观霉素以阻止蛋白质合成。在蛋白停滞后 0、1、2、3、4、6、8 和 24 小时收获 5 ml 细胞进行 SDS-PAGE，然后进行针对 RpoS 和 DnaK 的免疫印迹。
小鼠感染研究
6-8周龄的BALB/c或BALB/c SCID小鼠（Jackson Laboratory，Bar Harbor，MN）用于针头感染研究。动物研究如前所述[17,97]。简而言之，小鼠单次皮下注射105感染后 3 周处死螺旋体。对于时间点接种位点研究，小鼠同样感染了WT或cheA1mut初始接种位点在感染后96 h、14 d、21 d和28 d标记收获。如上所述对皮肤标本进行qRT-PCR分析。
对于尾静脉感染，106将重悬于100μlPBS中的螺旋体注射到BALB / c小鼠的尾静脉中。非运动性非感染性flaB突变体被列为阴性对照[32]。小鼠在感染后两周处死。从耳朵，皮肤，关节和心脏收集组织并将其放入含有5μg/ ml利福平的1ml BSK-II培养基中。将样品在 34°C 下孵育长达 1 个月，并在显微镜下监测螺旋体的存在。同样收集组织进行qRT-PCR分析，以评估螺旋体负荷。对于批量RNA-seq分析，107将100μlBSK-II中的螺旋体注射到BALB / c小鼠的三个不同位置的背侧。对于假对照，则注射等体积的BSK-II培养基。小鼠在注射后72小时处死。如上所述，从注射部位收获皮肤组织用于RNA提取。
血清杀菌试验
血清杀菌试验如前所述[43]。正常人血清购自BioIVT（纽约州韦斯特伯里）。（简言之，野生型A3-68?bbe02，cheA1mut和 cheA1com在 34°C/pH 7.6 下生长至对数中期。106将 80 μl BSK-II 培养基中的细胞接种到 96 孔板中，然后加入 20 μl 正常人血清 （NHS） 或热灭活 NHS （hiNHS），以获得 100 μl 中血清的终浓度为 20%。将细胞在 34°C 下孵育 2 小时。在暗视野显微镜下，使用基于固定、细胞裂解和细胞膜完整性丧失的Petroff-Hausser计数室对孵育后活细胞的百分比进行计数。实验至少重复三次。数据以相对于输入像元的活细胞百分比表示。
蜱鼠传播研究
蜱鼠传播研究如前所述[17,41]。简言之，如前所述，幼稚肩胛硬蜱若虫（俄克拉荷马州立大学，斯蒂尔沃特）通过显微注射人工感染[39]。注射后两天，允许受感染的若虫寄生在幼稚的C3H小鼠（5个蜱/小鼠，每只B3只小鼠）上。Burgdorferi 菌株）5 至 7 天，并使其脱落。收集充血的蜱虫并进行qRT-PCR分析以确定螺旋体负荷。在蜱喂食后第14天，处死小鼠，从皮肤、心脏、关节、膀胱和血液中采集组织，通过qRT-PCR分析定量螺旋体负荷，以确定如前所述的传播率[41]。喂食蜱虫中的螺旋体负荷以flaB / 10的对数副本形式呈现3勾选 β-肌动蛋白拷贝，而传输数据显示为每 10 个 flaB 拷贝6小鼠β肌动蛋白。
蜱采集研究
检查cheA的能力1mut通过喂食蜱虫获得，1 x 104WT 或 cheA1mut皮下注射到两只幼稚的C3H小鼠中。感染后两周，从注射部位进行皮肤活检，通过培养确认存在活螺旋体。2-3 天真的 I.将肩胛若虫置于接种部位的感染小鼠上，并让其进食至补给。72 小时后，收集喂养的若虫并通过 qPCR 单独检测 flaB 的存在。蜱采集实验重复两次，两个数据集的平均值表示为每个喂食若虫的flaB拷贝。
clpX框内缺失突变体的构建
使用与CheA相同的PCR连接方法制备clpX的框内缺失构建体1IFD。clpX 的 orf 被 kan 盒式磁带取代。使用P PCR扩增缺失构建体的左臂和右臂23/P24和P25/P26，分别用P扩增Kan盒31/P32 (表5）。然后用P39/P42并与 pJET1.2/钝克隆载体 （Thermo Scientific） 连接并用于转化成野生型 A3-68 菌株。
小鼠RNA-seq分析
如前所述，使用TRIzol试剂从小鼠皮肤组织中提取总RNA，并用DNase处理以去除污染的基因组DNA。RNA样品被送往CD Genomics（CD Genomics，Shirley，NY）进行RNA-seq分析。简而言之，使用Illumina Ribo-Zero Plus rRNA Depletion Kit去除rRNA去除。使用 NEBNext Ultra II RNA （non-directional） Kit 进行文库制备。使用NovaSeq 6000平台生成长度为~150 nt的双端读长。使用Fastp进行质量控制，过滤低质量读数。读段与宿主参考基因组 （GRCm39） 比对。然后根据比对结果进行定量，然后用 DESeq2 进行差异表达基因分析。成对比较之间的显著差异表达基因 （DEG） 被鉴定为阈值 |log2FC|> 0.5，p < 0.01。所有重要的DEGs都用eggNOG、COG、Pfam、Swiss-Port和KEGG数据库进行了注释。在 R 中使用 ClusterProfiler 进行 GO 富集分析和 KEGG 通路分析。
统计分析
对于游泳板、运动跟踪、毛细管测定以及小鼠和蜱虫感染研究，结果表示为平均值±平均值标准误差 （SEM）。采用未配对Student t检验或方差分析（P值<0.05）评估不同实验组间差异的显著性。对于血清杀菌试验，使用多重 t 检验（P 值 < 0.05）确定统计学意义，然后使用 Holm-Bonferroni 方法校正多重比较。数据被描述为SEM±所有重复的平均值。
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BbCheA P2 结构域的序列和结构比对1和 BbCheA2.
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S1 图。 BbCheA P2 结构域的序列和结构比对1和 BbCheA2.
（A） BbCheA的序列比对2小二α和 P2β域与 TmCheA P2 域的比较。CheY：P2结构域结合位点界面处的保守残基用黑框表示。（B） BbCheA的结构叠加1P2（粉红色）和 BbCheA2小二α具有TmCheA P2：CheY复合物（tan，PDB：1U0S）的（绿色）结构域[5]。使用Clustal Omega [6]生成多序列比对分析（MSA），并在PyMol [7]中制备数字。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.s001
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S2 图。 包含单个 CheA 亚型的密螺旋体属的多序列比对分析 （MSA）。
（A） 密螺旋体属CheA P2结构域序列的MSA。BbCheA公司1和 BbCheA2包括序列进行比较。BbCheA的位置2小二α标有黑框。（B） 密螺旋体属CheA P3结构域序列的MSA。BbCheA公司1和 BbCheA2包括序列进行比较。BbCheA的位置2P3 域标有黑框。使用Annotree收集的序列[1]，使用Clustal Omega [6]生成的MSA文件。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.s002
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S3 图。 疏螺旋体属和疏螺旋体属的多序列比对分析（MSA）切阿1和 CheA2序列。
（A） 疏螺旋体（B_）和疏螺旋体（Ba_）属的MSA。切阿1和 CheA2P2 结构域序列。BbCheA P2的位置α标有黑框。（B） 疏螺旋体（B_）和疏螺旋体（Ba_）属的MSA。切阿1和 CheA2P3 结构域序列。BbCheA的位置2用黑匣子扩展 P3 域序列标记。使用Annotree收集的序列[1]，使用Clustal Omega [6]生成的MSA文件。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.s003
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S4 图。 通过PCR检测cheA1com菌株中的质粒含量并构建CheA1用于框内删除 cheA 的 IFD1基因。
PCR检测WT（A）和cheA的质粒谱1mut （B） 和 cheA1com （C）.使用的引物在前面已经描述过[8]。（D） CheA的构造图1IFD。构建框内缺失突变体，引物对P27/P28和P29/P30用于扩增cheA的上下游侧翼区域1.引物对 P31/P32用于扩增无启动子卡那霉素盒 （KAN）。车1通过PCR融合技术将框内替换为具有引物对P的kan27/P30.将所得PCR融合扩增子克隆到pJet1.2载体中，形成CheA1IFD。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.s004
（TIFF格式）
S5 图。 cheA的构造1-gfp/pBSV2G 和 cheA2-gfp/pBSV2G 和 CheA GFP 融合蛋白的表达。
（A） cheA1-gfp/pBSV2G的构建。上游侧翼区域（PcheW2，417 bp） 的 cheW2基因PCR扩增并融合到cheA1使用工程限制位点，如图所示。融合的 PcheW2-车1然后将片段融合到指定限制性位点处含有 5 x Gly 接头的 gfp 基因，并克隆到 B 的穿梭载体 pBSV2G 中。burgdorferi [3]，产生cheA1-gfp/pBSV2G。（B） cheA的建设2-gfp/pBSV6G。类似地，flgB启动子[4]被PCR扩增并融合到cheA2在克隆到 pBSV2G 之前，基因随后在指定的限制性位点用 5 x Gly 接头融合到 gfp。获得的构建体用于补充先前构建的cheA2突变株[9]。（C） GFP 融合蛋白的免疫印迹分析。细胞裂解物来自B。表达GFP、CheA的伯氏疏螺旋菌株1-GFP 或 CheA2-在UF条件（23°C/pH 7.6）或常规实验室培养条件（34°C/pH 7.6）下培养的GFP在SDS-PAGE上进行分析，并用抗GFP或DnaK的抗体（作为上样对照）进行探测。在两种培养条件下均未观察到GFP融合蛋白的过度降解。（D） 切阿2-GFP 没有像 CheA 那样的极性定位1-GFP。携带CheA的伯氏疏螺旋体菌株2-GFP构建体在UF蜱条件下培养。切阿2-GFP呈弥漫性，未观察到特异性细胞定位。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.s005
（TIFF格式）
S6 图。 切阿1-GFP定位在空间和时间上受到调控。
105细胞/ml 的 B。表达 （A） GFP、（B） CheA 的 burgdorferi 菌株1-GFP 或 （C） CheA2-将GFP接种到10 ml新鲜BSK-II培养基中，并在34°C/pH 7.6下培养。使用蔡司Axiostar Plus显微镜以×200倍放大倍率每两天拍摄一次图像。比例尺表示 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.s006
（TIFF格式）
S7 图。 CheA的互补1恢复 cheA 中 RpoS 蛋白的稳定性1com.
检测RpoS蛋白在B31 A3-68 cheA固定相中的稳定性1com在蛋白质合成时用大观霉素阻滞。在指定的时间点收获样品，并使用针对 RpoS 和 DnaK 的抗体（作为上样对照）进行探测。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.s007
（TIFF格式）
S8 图。 WT 和 WT 之间差异表达基因 （DEG） 的火山图车1mut.
WT与突变体之间共计1391 DEG图。cheA 中 3 个下调蛋白酶基因（bb0613、bb0612 和 bb0253）和 6 个上调的 RpoS 抑制基因（bb_a38、bb_a68、bb_d18、bb_i16、bb_i39、bb_j09）1mut在火山图中突出显示。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.s008
（TIFF格式）
S1 表。 本研究中使用的寡核苷酸引物。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.s009
（PDF格式）
S2 表。 伯氏疏螺旋体RNA-seq分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.s010
（XLSX）
S3 表。 小鼠RNA-seq分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011752.s011
（XLSX）
确认
特别感谢 Utpal Pal 博士对蜱显微注射研究的帮助。我们感谢纽约市立大学亨特学院的 Eamen Ho 和 Weigang Qiu 对 RNA-Seq 数据的可视化。我们还要感谢 Patricia Rosa 博士提供 B。布格多里A3-68 和 A3-68?bbe02 菌株，Jennifer Coburn 博士提供 P66 抗体，Melissa Caimano 博士提供 OspC 和 DbpA 抗体，Janakiram Seshu 博士提供 BBK32 抗体，Zhiming Ouyang 博士提供 lon-1 突变体。
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