免费医学论文发表-苯硝唑治疗导致克氏锥虫的DNA损伤，以及小鼠中罕见的广泛分散的非复制性无鞭毛体的持续存在

抽象

苯硝唑是用于治疗克氏锥虫感染的一线药物，克氏锥虫是恰加斯病的病原体。然而，由于未知的原因，治疗失败很常见。当我们使用高度灵敏的体内和离体生物发光成像检查小鼠苯硝唑治疗中幸存下来的寄生虫时，我们发现复发不是由于寄生虫在特定器官或组织中的持续存在，这些器官或组织优先保护它们免受药物活性的影响。存活的寄生虫分布广泛，位于宿主细胞中，其中绝大多数仅包含一两个无鞭毛体。因此，感染复发不是由少数完整的大巢引起的。相反，持久性要么是共处寄生虫被杀死的细胞内群体的幸存者，要么是单个/低水平感染细胞中的无鞭毛体存在于它们对苯硝唑不敏感的状态。为了更好地评估寄生虫持久性的性质，我们将受感染的哺乳动物细胞单层暴露于苯硝唑方案中，该方案将细胞内无鞭毛体种群减少到治疗前水平的 <1%。在仍然感染的宿主细胞中，与体内的情况一样，绝大多数仅包含一两个存活的细胞内无鞭毛体。基于胸苷类似物EdU的未掺入的分析显示，这些幸存的寄生虫处于短暂的非复制状态。此外，苯硝唑治疗导致广泛的寄生虫DNA损伤。当使用EdU标记评估非治愈性治疗后在小鼠中存活的少量寄生虫时，这表明这些持久性寄生虫最初也是非复制的。一种可能的解释可能是触发 T。克鲁兹苯硝唑代谢物活性的DNA损伤反应途径导致寄生虫试图修复DNA时退出细胞周期，并且与不增殖相关的代谢变化起到降低药物敏感性的作用。或者，一小部分寄生虫种群可能在治疗前预先存在于这种非复制状态。

作者摘要

克氏锥虫是恰加斯病的病原体，恰加斯病是美洲最重要的寄生虫感染。由于无法确定的原因，一线药物苯硝唑往往无法实现无菌治愈。在这里，我们使用高灵敏度成像技术研究了苯硝唑对T的影响。克鲁兹感染的小鼠。在非治愈性治疗后，我们发现持久性并不局限于优先保护寄生虫免受药物活性的特定器官或组织。相反，存活的寄生虫分布广泛，尽管整体组织水平极低。这些持久性细胞位于宿主细胞中，宿主细胞通常只包含一个或两个非复制的细胞内无鞭毛体。然而，这些寄生虫在治疗停止后的几天内重新开始DNA复制并开始增殖。因此，处于非复制状态似乎可以防止药物介导的锥虫杀虫活性。苯硝唑治疗导致寄生虫DNA的广泛损伤。因此，一种可能性是这会触发 T。克鲁兹DNA 损伤反应通路，导致寄生虫尝试 DNA 修复时退出细胞周期。或者，持久性可能来源于在治疗前以非复制状态预先存在的小型寄生虫亚群。

数字

Fig 7图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7图1图2图3

引文： Jayawardhana S， Ward AI， Francisco AF， Lewis MD， Taylor MC， Kelly JM， et al. （2023） 苯硝唑治疗导致克氏锥虫的 DNA 损伤和小鼠中罕见的广泛分散的非复制性无鞭毛体的持续存在。PLoS 病理学 19（11）： e1011627 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011627

编辑 器： Luisa M. Figueiredo，Instituto de Medicina Molecular，葡萄牙

收到： 2023年8月22日;接受： 2023年10月30日;发表： 十一月13 2023

版权所有： ? 2023 Jayawardhana et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。

资金： 这项工作得到了英国医学研究委员会（MRC）向JMK和MDL提供MR / T015969 / 1和向MDL提供MR / R021430 / 1的资助，以及被忽视疾病药物倡议（DNDi）的资助。DNDi获得了以下机构的财政支持：英国国际发展部（DFID）;德国联邦教育与研究部（BMBF）通过德国复兴信贷银行;以及无国界医生组织（MSF）国际。AIW 获得了 MRC LID （DTP） 助学金 （MR/N013638/1）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。

介绍

恰加斯病由昆虫传播的原生动物寄生虫克氏锥虫引起，是整个美洲的一个主要公共卫生问题，有600-700万人感染[1,2]。此外，目前在世界范围内的移民人群中发现了许多病例，特别是在欧洲[3]。克氏锥虫是一种专性细胞内寄生虫，具有广泛的宿主细胞范围。在疾病的急性期，即人类感染后 2-8 周，寄生虫在血液和组织中广泛传播，感染表现为短暂的、通常轻微的发热状况。在儿童中，急性期可能更严重，有时导致心肌炎或脑膜脑炎，5% 的确诊病例导致致命后果。急性期通常由CD8 IFN-? T细胞介导的适应性免疫反应控制[4]，然后感染进展到无症状的慢性阶段，此时寄生虫负荷极低且局灶性受限。然而，30-40%的慢性感染者最终会发展到有症状的阶段，尽管这可能需要几十年的时间。大多数患者会发生心肌病，或较少见的消化道巨综合征，或两者兼而有之[5,6]。感染 T.克鲁兹是整个流行地区心脏病的主要原因。++

硝基杂环化合物苯硝唑是治疗T的一线药物。克鲁兹感染[7,8]。尽管它已经使用了近50年，但治疗失败很常见[9–11]。涉及几个因素，包括药物毒性和长给药期（60-90 天）对患者依从性的影响，以及 T 的多样性。克鲁兹属，在谱系内和谱系之间表现出显著的药物敏感性自然变异[12,13]。此外，自发寄生虫休眠[14]、应激诱导的细胞周期停滞[15]和慢性期增殖率降低[16]都被认为是保护寄生虫免受药物治疗的潜在机制。苯硝唑是一种前体药物，必须在寄生虫体内被线粒体硝基还原酶TcNTR-1激活[7,12,17]。尽管确切的作用方式仍有待解决，但目前的证据支持一种机制，即高度诱变的苯硝唑代谢物（包括乙二醛）对基因组DNA造成广泛损伤[18\u201220]。此外，还可能与其他抗T抗药物产生交叉耐药性。克鲁兹药物硝呋替莫司，也需要TcNTR-1介导的激活[17,21]。

近期临床试验显示，20%-50%的患者苯硝唑治疗失败[10]。由于寄生虫负荷极低、慢性感染的局灶性以及由此导致的难以确定治愈/不治愈，调查其原因变得复杂。例如，目前尚不清楚 T.克鲁兹能够持续存在于苯硝唑难以接近的特定组织或器官中，或者如果休眠或代谢静止的寄生虫子群能够在杀死大多数寄生虫种群的药物暴露中存活下来。为了更好地研究治疗失败，我们利用了一种转基因寄生虫细胞系，该细胞系表达一种既具有生物发光又具有荧光作用的报告基因融合蛋白[22]。这种蛋白质的红移生物发光成分允许在小鼠感染期间以极高的灵敏度解析寄生虫的组织特异性位置[23]，然后荧光成分使寄生虫能够在单个感染细胞的水平上可视化[24,25]。这使我们能够定位和表征在急性恰加斯病小鼠模型中非治愈性苯硝唑治疗后持续存在的寄生虫。我们的结果表明，在治疗中存活下来的寄生虫处于非复制状态。

结果

在体外苯硝唑治疗中存活的克氏锥虫持久性处于瞬时非复制状态

为了在体外产生持久性，我们采用了MacLean等人描述的“洗脱”方案。[26]，使用感染T的MA104细胞。克鲁兹CL Luc：：mNeon 克隆 [22]（材料和方法）。治疗期为 8 天，苯硝唑浓度为 20 μM（10x 无鞭毛体 EC50）被评估为该寄生虫菌株：宿主细胞类型组合的最佳选择（图1）。在这些条件下，所有寄生虫在治疗开始后4天内停止复制（基于胸苷类似物EdU的掺入）（图1A和1B），无鞭毛体种群下降到治疗前水平的<1%。此外，到第5天及以后，大多数感染细胞仅含有一种细胞内无鞭毛体（图1C）。当苯硝唑被移除时，鞭毛锥鞭毛体最终确实发育并经历流出，表明至少一些存活的寄生虫的长期活力，即使在暴露于200μM8天后也是如此（图1D）。

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图 1. 评估苯硝唑治疗条件以优化 T 的产生。克鲁兹坚持者。

（a） MA104细胞感染T。克鲁兹CL Luc：：mNeon [22] 在含有玻璃盖玻片的 24 孔板中孵育 3 天，然后用苯硝唑以一定浓度 （5–30 μM） 处理 8 天（材料和方法）。每天，将选定的培养物暴露于 10 μM EdU 中 6 小时，固定在盖玻片上，显影并通过荧光显微镜扫描。数据以含有至少一种 EdU+ve 无鞭毛体的感染宿主细胞百分比表示。（b） 上部图像;药物暴露前的受感染细胞，在 6 小时暴露期间处于 S 期的寄生虫以红色显示（EdU 掺入）。DAPI染色（蓝色）可识别宿主细胞核和无鞭毛体，可通过其独特的盘状动质体基因组（橙色箭头）进行识别。下图;暴露于 10 μM 苯硝唑 8 天后的感染细胞。箭头突出显示的两个无鞭毛体在 EdU 暴露的 6 小时内没有进行 DNA 复制。相邻的红色染色宿主细胞核作为 EdU 标记的阳性对照。白色比例尺 = 10 μm。（c） 用 20 μM 苯硝唑处理 24 孔板（如上）中感染的细胞单层。在指示的日期，固定盖玻片并记录随机选择的感染细胞的无鞭毛体含量。到第 5 天，所有成像的感染细胞都含有一个无鞭毛体。平均细胞内负荷用红线表示。（d） 24 孔板中受感染的单层以指示的浓度用苯硝唑处理 8 天。洗涤后，将培养物在 MEM 中维持 32 天，并监测细胞外分化锥鞭毛体的出现。该测定期（总共~50天）是单层MA104细胞可达到的极限。

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我们使用受感染的 MA104 细胞的活分选进一步检查了寄生虫持久性。如上所述，用20μM苯硝唑处理高度感染细胞的培养物（图1B，例如）8天，然后分离细胞以产生悬浮液（图2A和2B，材料和方法）。将悬浮液的等分试样与碘化丙啶一起孵育，并使用 Aria BD 细胞分选仪进行分离，以确定群体中宿主细胞活力的水平。细胞死亡水平最低（图2B和2C）。当根据寄生虫表达的绿色荧光的存在与否分离宿主细胞时，发现绝大多数（>99%）为荧光阴性。唯一检测到的荧光阳性细胞处于最低门控状态，每个细胞仅包含 1、2 或偶尔 3 个寄生虫（图 2D 和 2E）。随后对这些感染细胞的接种证实了它们的活力（图2F），培养7-14天后可检测到锥形腺增产体出口。总的来说，这些实验表明，在苯硝唑治疗中存活的持久性寄生虫必须来自受感染的宿主细胞，尽管暴露于同等的药物压力，但其他同居寄生虫已被消除，或者单个/低水平感染细胞中存在无鞭毛体的内在特征，可以赋予对苯硝唑的保护。

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图 2. 细胞内T的分离。体外苯硝唑处理后通过活细胞分选的克鲁兹持久性。

（a） 实验大纲。MA104 细胞培养物感染 T。克鲁兹CL Luc：：mNeon 寄生虫。72 小时后，用 20 μM 苯硝唑处理它们，再处理 8 天。然后生成细胞悬液，通过活细胞分选进行分析（材料和方法）。（b） 细胞悬液的活荧光图像，显示 DNA（Hoechst 染色，蓝色）、非活细胞（碘化丙啶 （PI） 染色，红色）和寄生虫感染细胞（绿色荧光）。在合并的图像（右下角）中，白色箭头表示 T。克鲁兹感染了MA104细胞。黄色比例尺 = 50 μm。（c） 在 PI 染色后，使用 Aria BD 细胞分选仪分离感染的细胞悬液。小比例的非活细胞可以基于获得的PI荧光进行分离。（d）根据寄生虫持久性生物的绿色荧光，将活宿主细胞分分为感染（红色圆圈内）和非感染亚群。0， 背景荧光;G， 最低绿色荧光门控。（e） 分选后感染细胞亚群悬浮液的图像。指示每个细胞中的寄生虫数量（1或2）。（f） 接种后 18 小时分选感染细胞（材料和方法）。DNA，（蓝色）;无鞭毛体，（绿色）。比例尺 = 25 μM。

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为了评估暴露 8 天后持续存在的细胞内无鞭毛体的复制状态，我们监测了 EdU 掺入寄生虫 DNA 的过程（图 3）。在处理后的选定时间点，将细胞单层暴露于 EdU 6 小时，从 24 孔板中取出盖玻片，进行处理（材料和方法），然后进行详尽扫描以定位存活的寄生虫（绿色荧光）。绝大多数剩余的感染细胞仅含有 1 或 2 个无鞭毛体（图 3A）。然后进一步评估寄生虫，以识别在 6 小时 EdU 暴露期间处于 S 期的寄生虫（由红色荧光指示）。在未经处理的感染细胞的情况下，在这些条件下，30-50%的细胞内无鞭毛体是EdU+ve，表明DNA复制（图1A和3C）。相比之下，在停止药物治疗后 9 天内检测到的 607 例细胞内无鞭毛体中，99.5% 为 EdU-ve（图 3D 和 3E）。然而，到第11天，一些存活的寄生虫重新进入细胞周期，细胞内数量增加和EdU阳性证明了这一点（图3A和3E）。因此，T.在体外苯硝唑治疗后持续存在的克鲁兹无鞭毛体处于非复制状态，但保留增殖能力。

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图 3. 评估苯硝唑治疗后持续寄生虫在体外的复制状态。

MA104细胞感染T。克鲁兹如图所示，CL Luc：：mNeon 在 24 孔板中，生长 3 天后，用 20 μM 苯硝唑处理 8 天。当去除苯硝唑时，将细胞维持在完整的MEM中，并通过荧光显微镜监测。为了鉴定进行DNA复制的寄生虫，将培养物暴露于10μM EdU中6小时，并使用蔡司LSM880共聚焦显微镜（材料和方法）处理盖玻片进行分析。（a） 药物清除后立即和治疗后第 11 天感染细胞中的无鞭毛体数量。EdU+ve 寄生虫的数量以红色显示。（b） 独立实验的时间表，在停止治疗后定期评估 EdU+ve 无鞭毛体的数量。（c） 治疗前的寄生虫巢穴，其中~50%的无鞭毛体在EdU暴露期间处于S期（红色）。DAPI染色（蓝色）可识别宿主细胞核（大）和寄生虫动质体DNA（小而强烈的蓝色圆盘）。（d） 洗涤后 6 天，无鞭毛体（绿色）处于非复制状态。S 期的 MA104 细胞通过核 EdU 染色（红色）鉴定。（e）显示寄生虫重新进入细胞周期（第11天）并进行异步DNA复制的图像[24]。白色比例尺 = 10 μm。

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苯硝唑的生物活化由寄生虫特异性硝基还原酶TcNTR-1启动，导致产生具有诱变特性的反应性代谢物[7,12,17–20]。这种可能的结果是诱导 T 中的 DNA 损伤反应系统。克鲁兹，导致细胞周期退出并进入非增殖状态[27\u201230]。为了研究苯硝唑对寄生虫基因组DNA结构完整性的影响，我们使用了TUNOL（末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记）测定（图4），这是一种最初用于监测凋亡细胞死亡的程序[31]。在 T.克鲁兹，该技术可用于识别线粒体DNA（kDNA）复制的寄生虫[22,24]。kDNA S 期早期的寄生虫在 kDNA 盘两侧的对足位点表现出 TUNEL 阳性，表明存在两个复制工厂（见插图图 4B）。在循环的后期，整个圆盘被标记。然而，在正常生长条件下，T.使用这种技术，克鲁兹核DNA没有显示出可检测的阳性信号。从游离3'-羟基的TUNEL标记推断，24小时苯硝唑处理（200μM）导致寄生虫DNA的广泛片段化，而相邻哺乳动物细胞的细胞核仍未标记（图4B）。在这些条件下，治疗期延长8倍不足以完全消除感染培养物中的寄生虫（图1D）。作为对照，与诱导细胞凋亡和坏死性凋亡的氢过氧化物TBHP一起孵育[32]，导致寄生虫和宿主细胞的DNA损伤，其标记谱与固定后DNase处理产生的标记谱相似（图4B）。因此，苯硝唑治疗导致的 DNA 损伤是寄生虫特异性的，反映了 TcNTR-1 对药物的选择性代谢减少。

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图 4. T的碎片化。克鲁兹苯硝唑治疗后的DNA。

（a） 实验大纲。MA104细胞感染T。克鲁兹CL Luc：：mNeon 在 24 孔板中。用苯硝唑 （BZ） （200 μM） 处理 24 小时，或用叔丁基过氧化氢 （TBHP） （50 μM） 处理 3 天。固定后，作为对照组，用DNase处理未处理的细胞。然后进行TUNEL测定，并使用尼康Ti-2 E倒置显微镜（材料和方法）对细胞进行成像。（b） 显示每次处理后感染细胞的代表性图像。寄生虫（绿色荧光）、DNA（蓝色、DAPI）、TUNEL（红色）。放大的插图（左）突出显示了复制动质体 DNA （kDNA）。未经处理的图像中的白色箭头显示了高度感染细胞的位置，其中所有寄生虫都已分化为TUNEL阴性非复制锥鞭毛体。白色比例尺 = 10 μm。

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克氏锥虫治疗后的组织特异性存活率

小鼠在急性期感染的高峰前期（第9天）和高峰期（第14天）使用生物发光：荧光T。克鲁兹报告菌株CL-Luc：：Neon[22]每天治疗一次，持续5天，剂量为25mg/kg，我们之前已经证明这种治疗方案是无治愈性的[33]。这导致在治疗期结束时全身寄生虫负荷下降了 97-99%，正如体内生物发光成像所推断的那样（图 5A）。然后使用离体成像来检查器官和组织。在未经治疗的小鼠中，感染广泛传播，所有器官和组织都具有高度的生物发光（图5B和5C）。药物治疗导致寄生虫载量和感染部位数量大幅减少，但未观察到寄生虫完全清除。重要的是，从剩余的生物发光病灶的模式中没有迹象表明任何特定的组织或器官已经充当了优先保护寄生虫免受药物活性影响的位置（图5C）。这与苯硝唑在T中的药代动力学一致。克鲁兹感染的小鼠，药物在器官和组织中具有广泛的生物分布[34]。

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图 5. 通过生物发光成像监测非治愈性苯硝唑治疗的组织特异性影响。

（a） T的代表性体内图像。克鲁兹在每天用25mg / kg苯硝唑口服治疗5天后感染BALB / c小鼠（材料和方法）。在感染后 9 天（高峰期）或 14 天（高峰期）（dpi）开始治疗。表示全身生物发光下降的百分比（每个队列中的n = 6）。（b） 用于离体成像的组织、器官和胴体的排列示意图。（c）未经处理和处理的受感染小鼠的离体图像。离体和活体成像的热图均采用log10刻度，指示从低（蓝色）到高（红色）的生物发光强度，并显示最小和最大辐射值。（d） 使用蔡司LSM880共聚焦激光扫描显微镜在感染急性期荧光检测未经治疗和治疗的小鼠膀胱和心肌中的寄生虫。DNA（红色，DAPI）;寄生虫（绿色荧光;黄色，如果在红色背景上）。白色比例尺 = 20 μm。下图显示单个无鞭毛体感染的扩展视图。

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切除含有生物发光病灶的组织样本，并通过共聚焦激光扫描显微镜（材料和方法）进行检查。在急性期的前高峰期和高峰期，从感染的未处理小鼠获得的所有组织样本中均可检测到mNeonGreen荧光，并且可以在单细胞分辨率下确定寄生虫位置[25]（图5D）。在受感染的宿主细胞中，然后使用连续的z-stacking精确测定寄生虫数量（图6A）。检查的组织包括心脏、脂肪组织、膀胱、脾脏、腹膜、肺、肝脏、结肠、直肠、盲肠、胃和骨骼肌。在未治疗的小鼠中，细胞内无鞭毛体数量差异很大。绝大多数受感染细胞的寄生虫负荷少于50个，尽管偶尔可以检测到含有多达150个寄生虫的大“巢”（占受感染细胞的1.5%）（图6B）。来自苯硝唑处理的小鼠的组织和器官在治疗停止后的第二天进行类似处理。受感染的细胞数量要少得多，并且更难定位。在一系列组织类型中，大多数感染细胞（>75%）仅含有一个无鞭毛体（图6B）。因此，隐含的是，药物治疗后的复发不是由少数完整的大巢的存活引起的。与体外情况一样，最简洁的解释是，持久性是来自细胞内种群的幸存者，其中其他寄生虫已被杀死。或者，单个/低水平感染细胞中的无鞭毛体可能以它们不太易受苯硝唑锥虫杀虫活性影响的状态存在。以较高剂量（100 mg/kg，5 天）或更长时间（30 mg/kg，10 天）治疗也会导致复发（S1 图）。然而，在用这些方案停止治疗后，立即检测少量存活的组织驻留寄生虫在技术上更具挑战性。

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图 6. 在苯硝唑处理的小鼠中，大多数仍然感染的细胞只含有一种寄生虫。

在感染高峰前（9 dpi）和高峰（14 dpi）阶段的BALB / c小鼠每天用25mg / kg苯硝唑处理一次，持续5天（如图5所示）。制备来自一系列组织的连续切片（10μm），并通过z-stacking在3维中进行检查，以确定每个感染细胞中无鞭毛体的精确数量（材料和方法）（另见S1视频）。（a） 来自未经处理的小鼠的心脏组织切片的 0.7 μm 系列图像说明性。无鞭毛体（绿色）;DNA（蓝色，DAPI）。寄生虫数量可以通过计数独特的强烈染色的动质体（线粒体）DNA 来精确确定，这些 DNA 与连续切片中的绿色荧光共定位。白色比例尺 = 5 μm。（b）通过对从治疗（橙色条）和未处理（蓝色条）小鼠的一系列组织获得的多个切片进行详尽筛选来确定每个感染细胞的寄生虫数量。

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在体内苯硝唑治疗中存活的寄生虫处于非复制状态

如上所述，感染急性期的BALB / c小鼠用非治愈性苯硝唑给药方案（5天，25mg / kg）治疗。然后，我们的策略是将EdU掺入寄生虫DNA中作为报告基因[16,24]，以确定细胞内无鞭毛体持久性蛋白的复制状态（材料和方法）。然而，在感染的这一点（第20天），许多检测到的寄生虫在治疗和未治疗的小鼠中都显示出不规则和弥漫的形态（S2A图，例如）。在未经治疗的小鼠中，这与感染心脏组织内增殖宿主细胞的积累增加（心肌细胞通常终末分化）和白细胞浸润的显着增加有关（S2B图）。我们从中推断，观察到的寄生虫损伤是由适应性免疫反应介导的。为了避免这种混杂因素，这会使EdU掺入数据的解释复杂化，因此我们转换了小鼠模型，并使用了CB17 SCID小鼠，这是一种缺乏功能性淋巴细胞的免疫缺陷菌株[35]。这解决了这个问题，然后在心脏切片中观察到很少的增殖细胞（见图7C，其中一个例子）。在分析时间点，可以很容易地检测到未经治疗的小鼠中受感染的心脏细胞，其中绝大多数含有1至50个形态完整的寄生虫。在接受调查的无鞭毛体中，45% （845/1863） 被发现正在经历 DNA 复制，正如从 EdU 掺入推断的那样（图 7A、7B 以及 S3 和 S1 视频）。应该注意的是，体内的EdU标记提供了在短暂暴露期间处于S期的寄生虫百分比的“快照”。在小鼠中，EdU的消除半衰期为25分钟[36]。DNA的EdU标记只发生在这个短暂的暴露期间，非常稳定，需要几轮细胞分裂才能稀释出来[16,24]。 既往报道错误地推断，单次注射EdU后仍未标记的寄生虫是非增殖的[14]。在苯硝唑处理的CB17 SCID小鼠中，感染的心脏细胞要罕见得多，在对组织切片进行详尽搜索后，总共检测到23个感染细胞。其中大多数仅含有单个无鞭毛体（74%，17/23），并且没有发现宿主细胞含有超过3种寄生虫（S3图）。苯硝唑治疗后在心脏组织中检测到的 30 种持续寄生虫中没有一个处于复制状态，这是通过缺乏将 EdU 掺入基因组和/或动质体 DNA 来判断的（图 7A 和 7C 以及 S2 和 S3 视频）。

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图 7. 苯硝唑治疗后在小鼠心脏组织中持续存在的寄生虫处于非复制状态。

CB17 SCID小鼠感染T。克鲁兹和感染后 10 天，每天用 25 mg/kg 苯硝唑治疗一次，持续 5 天。然后按照前面所述（材料和方法）进行 EdU 标签。对小鼠实施安乐死（16 dpi），并使用尼康Ti-2 E倒置显微镜制备和成像心脏切片（每组9只小鼠，每只小鼠随机选择3个切片）（a）每个受感染的心脏细胞（巢）的感染负荷，指示EdU + ve / -ve寄生虫的数量（另见S3图）。（b） 显示来自未经处理的小鼠的受感染心肌细胞的图像，该小鼠同时含有复制性和非复制性无鞭毛体。插图显示了由三维共聚焦激光扫描显微镜（z-堆叠）得出的单个串行横截面的示例，该横截面用于确定感染细胞中无鞭毛体的精确数量（白色箭头表示强烈染色的动质体DNA）（有关该感染细胞的3D图像，请参见S1视频）。DNA（蓝色，DAPI）;EdU+ve 无鞭毛体（红色）;寄生虫（绿色荧光）。白色比例尺 = 10 μm。（c）来自苯硝唑处理的小鼠的受感染心肌细胞的图像。检测到的无鞭毛体均不是 EdU+ve。紫色箭头表示在EdU暴露期间处于S期的两个宿主细胞（上图）。白色比例尺 = 20 μM。插图（右）显示了DAPI染色的宿主细胞核和单个感染性无鞭毛体（绿色）的放大图像。苯硝唑治疗后持续存在的寄生虫的完整 3 维图像显示在 S2 和 S3 视频中。

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讨论

苯硝唑仍然是用于治疗 T 的一线药物。克鲁兹感染，尽管有多篇治疗失败的报道[9–11]。这些非治愈性结局的根本原因尚未解决。天然 T 中苯硝唑敏感性水平存在很大差异。克鲁兹种群[37]。然而，这与TcNTR-1的多态性无关，TcNTR-1是编码硝基还原酶的基因，可启动药物的还原激活[12]。此外，一个TcNTR-1等位基因的失活仅导致耐药性增加2-4倍[17]，这一水平不足以解释自然群体中广谱苯硝唑耐受性（~20倍）。两个TcNTR-1等位基因的功能破坏使耐药性增加~10倍，但这与感染性降低有关，这将阻止这些高度耐药的寄生虫在宿主种群中建立[12,17]。因此，必须涉及其他机制[21]。

在这项研究中，我们证明在苯硝唑治疗中存活的寄生虫并不优先局限于实验小鼠的特定器官或组织（图5C）。这表明，药物分布的可变性不太可能成为复发的主要因素，至少在这种情况下是这样。这与苯硝唑药代动力学的研究一致[34]。作为另一种解释，有人提出细胞内无鞭毛体的复制状态可能会影响药物敏感性，并且这可能在寄生虫持久性中发挥作用。这是根据对寄生虫明显休眠形式的描述[14,38,39]、应激诱导的静止[15]以及对慢性感染的适应而降低的增殖率[16]。在这里，我们发现在体外苯硝唑治疗中存活的少数无鞭毛体处于非复制状态（图3）。这些持久性保持活力（图2C），并且在群体水平上，即使在暴露于200μM苯硝唑（~100x EC50) (图1D）。在治疗停止后9-11天内，非复制性寄生虫重新进入细胞周期并开始增殖（图3）。

这些持久性寄生虫是来自预先存在的非复制性亚群，还是它们进入这种状态是对药物活性的某些方面的反应？在苯硝唑的情况下，寄生虫DNA损伤是一种已知的作用方式[19,20,40–42]。TcNTR-1引发还原性药物代谢，产生反应性代谢物，最终分解产生乙二醛[18,43]。这些反应性分子可以促进DNA交联、诱变和染色体断裂的形成。此外，氧化应激的增加导致氧化核苷酸的形成，例如8-氧代鸟嘌呤。作为这种作用方式的进一步证据，我们在这里表明，苯硝唑治疗导致产生广泛的寄生虫特异性DNA断裂，可通过TUNEL测定检测到（图4）。其结果将是诱导DNA损伤反应通路[44]，退出细胞周期，并在损伤部位募集和组装DNA修复酶。如果病变修复成功，随后将重新进入细胞周期并继续增殖。在 T.与其他真核生物一样，克氏菌的亚致死性DNA损伤会导致DNA修复机制的核募集和细胞周期停滞[30,45]。因此，在 T 中触发此响应。通过苯硝唑治疗的Cruzi可能具有诱导瞬时非复制状态的作用，该状态可保护至少一些寄生虫免受进一步的药物介导的损伤。这并不排除自发休眠[14]或其他形式的应激诱导的静止[15]等机制，这些机制可以并行起作用，或者在具有不同作用方式的药物的情况下，在持久性中起关键作用。

当评估苯硝唑对小鼠感染的影响时，与体外情况一样，少数在治疗中幸存下来的寄生虫主要局限于仅含有一个或两个无鞭毛体的宿主细胞。在广泛的组织类型中都是这种情况（图6和图7），表明这些稀少的残留寄生虫可能是复发的来源。为了评估持续性无鞭毛体的复制状态，我们重点关注心脏组织。在恰加斯病的急性（心肌炎）和慢性（心肌病）阶段，心脏是病理学的主要部位。体内实验的结果与体外研究的结果非常相似。在未经治疗的小鼠中，最大巢大小通常高达50个无鞭毛体，其中40-50%的寄生虫种群处于S期（图7A和7B）。相比之下，在处理后，巢的大小大大减小（通常为1-2个寄生虫），并且所有检测到的寄生虫都是非复制的（图7A和7C以及S2和S3视频）。

值得注意的是，一些寄生虫暴露于连续浓度为 100xEC 的苯硝唑50在体外存活8天后能够存活和增殖（图1D）。在体内，单剂量（25mg / kg）后的药物暴露量远低于此值，并且血浆浓度降至EC以下50给药后12小时内的值[33]。然而，正如我们在这里所展示的，在这种给药方案下对实验小鼠进行5天的治疗足以杀死绝大多数寄生虫（图5），罕见的非复制性无鞭毛体是唯一的幸存者。目前尚不清楚非增殖表型的哪些特征具有保护作用。一种可能性是苯硝唑的摄取可能会减少，从而减少药物暴露的程度。另外，非增殖状态可能与TcNTR-1活性下调有关，TcNTR-1活性是负责苯硝唑寄生虫特异性生物活化的代谢过程[7,12,17]。这将导致负责锥虫杀虫活性的反应性代谢物的产生减少，包括DNA损伤[19,20,40–42]。

通过改变给药方案来增强苯硝唑疗效的尝试产生了不同的结果。在小鼠模型中，250mg/kg的延长间歇治疗（4个月，每周2次）的疗效最佳[46]。相比之下，对于人类，无论治疗时间长短（一日1次，持续2周或8周），使用标准剂量的治愈率（~80%）保持不变[47]。克服持续性寄生虫问题的苯硝唑治疗方案可能是可能的，但延长治疗方案可能会带来不可接受的毒性，同时对患者的依从性产生影响。联合治疗可能是缩短治疗时间和减少苯硝唑剂量的途径之一，但与麦角甾醇生物合成抑制剂联合治疗的临床试验显示，其益处甚微[11,47]。新型抗T。单独或联合给药的克鲁兹药物将需要消除持久性的能力。最近的报道表明，氰基三唑可以通过与拓扑异构酶II.的选择性不可逆结合来治愈实验性感染[48]，强调必需酶的共价抑制可能是实现寄生虫消除的途径之一。

材料与方法

道德声明

动物工作是在英国内政部项目许可证（PPL 70/8207 和 PPL P9AEE04E4）下进行的，并得到了伦敦卫生和热带医学学院动物福利和伦理审查委员会的批准。程序是根据英国《1986年动物（科学程序）法》进行的。

体外寄生虫培养

如前所述，生成并培养组成型表达生物发光：荧光融合蛋白（克隆CL-Luc：：Neon）的克氏锥虫（CL Brener菌株）[22]。通过将表鞭毛体转移到 Graces-IH 培养基中产生次环锥鞭毛体，并在 4-7 天后收获。用间环锥鞭毛体感染MA104细胞（非洲绿猴肾上皮细胞系）后产生组织培养锥鞭毛体（TCT）[16]。

苯硝唑处理的克氏锥虫感染细胞的分选

T25 组织培养瓶接种 106MA104 细胞，孵育 6 小时以允许附着，然后以 10：1 的 MOI 感染 TCT（寄生虫：宿主细胞）。18 小时后，通过彻底洗涤 （×3） 去除外部寄生虫，加入新鲜补充的 Minimum Essential Medium Eagle（MEM，Sigma-Aldrich），并将苯硝唑 （Epichem Ltd.） 制成终浓度为 20 μM。将培养板在 37°C 下孵育，在第 4 天更新新鲜培养基/苯硝唑。8 天后，洗涤培养物 （x2），并通过在 TrypLE express （Thermo Fisher） 中孵育单层细胞来分离细胞。为了对活细胞核进行染色，在分离前将单层细胞与 Hoechst 3342 （200 ng/ml） 一起孵育 90 分钟。为了区分有活力/无活力的细胞，将细胞悬液与碘化丙啶 （PI） （1 μg/ml） 一起孵育 30 分钟。染色和分级后，使用 Aria BD 细胞分选仪在 CL3 条件下对细胞悬液进行分选，激光设置适用于染色/荧光感染的细胞。

TUNEL 检测

感染 T 的哺乳动物细胞培养物。如上所述，在 24 孔板的盖玻片上生长 cruzi。在特定时间点，单层用4%多聚甲醛的PBS溶液固定，风干，在PBS中洗涤（x1），在0.1%TritonX-100 / PBS中透化5分钟，并用PBS洗涤（x3）。然后将 20 μl TUNEL 反应混合物（原位细胞死亡检测试剂盒，TMR-red，罗氏）加入到每个盖玻片中，并将反应物在 37°C 下在黑暗中孵育 1 小时。 将盖玻片在PBS中洗涤（x3），用带有DAPI（Vector Laboratories，Inc.）的VECTASHIELD安装在载玻片上，然后使用蔡司LSM880共聚焦或倒置尼康Ti-2 E倒置显微镜进行检查。

使用 EdU 进行体外标记

作为 DNA 复制的标志物，用 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷 （EdU） 标记感染细胞。在停止苯硝唑处理后的不同时间点，将含有10μM EdU（Sigma-Aldrich）的新鲜培养基加入选定的孔中[16]，并将培养物再孵育6小时。然后洗涤单层膜（x2），并在PBS中稀释的4%多聚甲醛中孵育45分钟。最后，取出盖玻片并在PBS（x2）中洗涤。使用 Click-iT PlusEdU AlexaFluor 555 成像试剂盒 （Invitrogen） 确定 EdU 掺入的程度，然后用 PBS （x2） 洗涤，然后将盖玻片安装在带有 DAPI 的 VECTASHIELD 中。使用蔡司LSM880共聚焦显微镜对细胞进行三维成像。

小鼠感染

CB17 SCID小鼠和BALB/c小鼠购自Charles River（英国）。动物在特定无病原体的条件下保持在单独通风的笼子中，有12小时的光/暗循环，并可以随意获取食物和水。雌性CB17 SCID小鼠，9周龄，感染1x103通过腹腔注射，在 Dulbecco 最低必需培养基 （DMEM） 中加入 0.2 ml 10% 胎牛血清和 4.5 克/升葡萄糖的 TCT。BALB/c雌性小鼠，年龄7-8周，通过腹腔注射1x10感染3BTs来源于CB17 SCID小鼠血液。在实验终点，小鼠在终末麻醉下通过放血被扑杀。

对于药物治疗，制备苯硝唑，以2.5或10mg/ml的浓度在5%二甲基亚砜（v/v）/95%HPMC悬浮载体（0.5%（w/v）羟丙基甲基纤维素，0.5%（v/v）苯甲醇，0.4%（v/v）吐温80的Milli-Q水中）给药。小鼠按照图例中概述的方案进行治疗，通过口服强饲法给药[33]。未处理的对照小鼠给予0.2ml 5%二甲基亚砜（v / v）/ 95%HPMC悬浮载体。

生物发光成像

腹腔注射150mg/kg d-荧光素，然后在d-荧光素给药后5-10分钟用2.5% （v/v）气态异氟烷麻醉[49,50]。然后将它们放入 IVIS Lumina II Spectrum 系统 （PerkinElmer） 中，并使用 Living Image v4.7.3 获取腹侧和背侧图像。暴露时间在 30 秒到 5 分钟之间变化，具体取决于信号强度，并且通过单个鼻锥始终保持麻醉。对于离体成像，向小鼠注射d-荧光素，并如上所述实施安乐死，然后通过心脏灌注10ml 0.3mg / ml d-荧光素的PBS溶液。取出器官和组织并以标准化排列转移到培养皿中，浸泡在PBS中的0.3mg / ml d-荧光素中，并使用最大检测设置（5分钟曝光，大分箱）成像。检查剩余的动物部位和胴体是否有残留的生物发光病灶，也使用最大检测设置。使用未感染的小鼠确定活体成像的检测阈值。

组织学程序

为了确保在感染小鼠的组织样本中保留荧光，我们采用了先前描述的方法[51]。通过离体成像鉴定的生物发光病灶从组织中切除，并在组织学盒中在 4°C 下在预冷的 95% 乙醇中固定 20-24 小时。样品脱水（用 100% 乙醇洗涤 4x15 分钟）、澄清（用二甲苯洗涤 2x12 分钟）并包埋在石蜡中。用切片机切割组织切片（3-10μM）。对于共聚焦成像，将载玻片在加热垫上熔化 30 分钟，用二甲苯换两次（每次 12 分钟）、三次换液（每次 12 分钟）的 Tris 缓冲盐水（pH 7.6 （TBS）进一步脱蜡，用 0.1% Triton X-100 + 0.1% 柠檬酸钠透化，然后使用带有 DAPI 的 VECTASHIELD 进行封片，然后在 4°C 下避光储存直至需要。对于免疫染色，将载玻片封闭并用 1：250 稀释的大鼠抗小鼠 CD45 一抗（Tonbo Biosciences;克隆 30-F11，货号 #70-0451-U100）染色，并与 1：500 二抗 Alexa Fluor 647 驴抗大鼠抗体（Invitrogen Thermo Fisher Scientific，货号 #A-21209）联合使用。

共聚焦和宽视场荧光显微镜

对于成像，我们使用了蔡司LSM880共聚焦激光扫描显微镜和Zen black软件。通过三维成像（z-stacking）准确测定细胞内寄生虫数量，并采用适当的扫描缩放设置[25]。还使用尼康Ti-2 E倒置显微镜对安装的载玻片进行成像，并使用Zen blue软件处理图像进行分析。使用Plan Apo 60x油浸物镜（NA = 1.42，Ph2，尼康）和ORCA Flash 4.0 CMOS相机（滨松）对样品进行成像。对于每个标本，使用绿色荧光通道检测寄生虫。在感兴趣的区域，沿组织长度拍摄了 30 至 50 张图像的 z 堆栈，轴向间距为 0.3 μm，以解释寄生虫在单个细胞内的 3D 位置。使用NIS Advanced Research软件包采集和处理3D视频投影。

使用 EdU 进行体内标记

为了鉴定进行DNA复制的宿主细胞和寄生虫，小鼠在PBS中腹腔注射2次EdU（12.5mg / kg，间隔6小时），如结果部分所述。然后将小鼠放置过夜，通过终末麻醉实施安乐死，并按上述方式固定和切片组织。使用 Click-iT Plus EdU AlexaFluor 555 成像试剂盒对掺入的 EdU 进行标记，如培养的单层所述。

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T 急性期 BALB/c 小鼠的体内成像。非治愈性苯硝唑治疗后的克鲁兹感染。

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S1 图。 T 急性期 BALB/c 小鼠的体内成像。非治愈性苯硝唑治疗后的克鲁兹感染。

（a） 用 30 mg/kg 苯硝唑口服治疗的小鼠的背部图像，每天一次，持续 10 天（材料和方法）。（b） 用 100 mg/kg 苯硝唑口服治疗的小鼠的腹侧图像，每天一次，持续 5 天。在这两种情况下，治疗都是在感染后 14 天 （dpi） 开始的（用红色箭头表示）。热图采用log10刻度，指示从低（蓝色）到高（红色）的生物发光强度，并显示最小和最大辐射值。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011627.s001

（TIF）

S2 图。 白细胞浸润到克氏锥虫感染后 20 天 BALB/c 小鼠的心脏组织中。

6-8周龄雌性BALB/c小鼠感染T。克鲁兹CL Luc：：mNeon（材料和方法）。19 dpi，小鼠间隔6小时给予两次EdU ip接种（12.5mg / kg）。然后将它们放置过夜，实施安乐死，并通过荧光显微镜制备和成像组织切片（材料和方法）。（a） 使用蔡司LSM880共聚焦激光扫描显微镜成像的心脏组织中的细胞内寄生虫。注意不规则和弥漫的寄生虫形态。DNA（蓝色，DAPI）;EdU+ve 宿主细胞的细胞核（绿松石色）;寄生虫（绿色荧光）。白色比例尺 = 5 μm。（b） 未感染和 T 的心脏组织切片。克鲁兹感染的小鼠显示CD45 +细胞浸润（红色），使用尼康Ti-2 E倒置显微镜成像。图中显示了一个直径为200μm的黄色圆圈，以供参考。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011627.s002

（TIF）

S3 图。 细胞内T的复制状态。来自苯硝唑处理和未处理的CB17 SCID小鼠心脏切片中的克鲁兹寄生虫。

小鼠感染T。克鲁兹和 10 天后用 5 次每日剂量的苯硝唑 （25 mg/kg） 治疗或不治疗。然后用EdU（两剂12.5mg / kg，间隔6小时）（材料和方法）接种小鼠，第二天剔除，并从每只小鼠（n = 9，每组）中随机选择3个心脏切片，详尽地搜索含有荧光标记寄生虫的感染细胞。使用尼康Ti-2 E倒置显微镜获取图像。显示了每组中 EdU+ve 寄生虫的数量。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011627.s003

（TIF）

S1 视频。 T 的三维成像。克鲁兹在非苯硝唑处理的CB17 SCID小鼠的组织切片中感染了心肌细胞。

有关详细信息，请参见 S3 图例。DNA（蓝色，DAPI）;寄生虫（绿色荧光）;EdU+ve 无鞭毛体 DNA（红色）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011627.s004

（MP4格式）

S2 视频。 对苯硝唑处理的 CB17 SCID 小鼠的组织切片中含有单个无鞭毛体持久性的受感染心肌细胞进行 3 维成像。

有关详细信息，请参见 S3 图例。DNA（蓝色，DAPI）;寄生虫（绿色荧光）。还评估了该组织切片是否将 EdU 掺入 DNA（红色），但未检测到寄生虫或宿主细胞 EdU 阳性。在上图中，受感染宿主细胞的尺寸用黄色虚线表示。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011627.s005

（MP4格式）

S3 视频。 对苯硝唑处理的 CB17 SCID 小鼠的组织切片中含有两种无鞭毛体持久性的受感染心肌细胞进行 3 维成像。

有关详细信息，请参见 S3 图例。DNA（蓝色，DAPI）;寄生虫（绿色荧光）。还评估了该组织切片是否将 EdU 掺入 DNA（红色），但未检测到寄生虫或宿主细胞 EdU 阳性。受感染的细胞中存在两个无鞭毛体，它们的kDNA可见为一个离散的蓝色圆盘。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011627.s006

（MP4格式）

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