《免费医学论文发表-通过数字病理学和机器学习对仓鼠中 SARS-CoV-2 变体的毒力进行表型分析》期刊简介
免费医学论文发表-通过数字病理学和机器学习对仓鼠中 SARS-CoV-2 变体的毒力进行表型分析
抽象
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 在整个冠状病毒病 19 （COVID-19） 大流行期间持续发展，产生了具有不同生物学特性的多种关注变体 （VOC）。随着大流行的进展，必须近乎实时地测试任何新出现的变异株导致严重疾病的可能性。与之前的 VOC （如 Delta）相比，BA.1 （Omicron） 被证明是减弱的，但新出现的变体可能会重新获得毒性表型。仓鼠已被证明是 SARS-CoV-2 发病机制的一个非常好的模型。在这里，我们旨在开发强大的定量管道，以评估 SARS-CoV-2 变体在仓鼠中的毒力。我们使用了各种方法，包括RNAseq、RNA原位杂交、免疫组化和数字病理学，包括软件辅助的全切片成像和机器学习增强的下游自动分析，以开发以无偏倚的方式评估和量化病毒诱导的肺部病变的方法。最初，我们使用 Delta 和 Omicron 来开发我们的实验管道。然后，我们评估了最近的奥密克戎亚谱系的毒力，包括BA.5、XBB、BQ.1.18、BA.2、BA.2.75和EG.5.1。我们发现，在实验感染的仓鼠中，肺泡上皮增生和巨噬细胞浸润的准确定量代表了评估病毒诱导的肺部病理程度以及病毒毒力的有力标志物。此外，利用这些管道，我们可以揭示一些奥密克戎亚谱系（例如BA.2.75和EG.5.1）与原始BA.1相比如何重新获得毒力。最后，为了最大限度地发挥我们研究中报告的数字病理学管道的效用，我们开发了一个在线存储库，其中包含具有代表性的全器官组织病理学切片，可以在可变放大倍率 （https://covid-atlas.cvr.gla.ac.uk） 下可视化。总体而言，该管道可以为快速评估新出现的变异株及其导致严重疾病的可能性提供公正和宝贵的数据。
作者摘要
在整个 COVID-19 大流行期间，新的 SARS-CoV-2 变体定期出现。在大流行的这个阶段，“成功”的变体所具有的关键特征是它们能够逃避现有SARS-CoV-2疫苗或感染所赋予的免疫力。然而，目前尚不清楚新变异株是否会保持奥密克戎所表现出的相对较低的毒力，或者获得奥密克戎前变异株的毒性更强的表型。
在这项研究中，我们开发了软件辅助图像分析方法来定量评估实验感染 SARS-CoV-2 的仓鼠肺部病变的程度。仓鼠是评估 SARS-CoV-2 毒力的绝佳动物模型。根据之前的实验，我们推断SARS-CoV-2变体的毒力将与它们在仓鼠中引起的肺部病变成正比。我们开发了无偏倚的方法，旨在对整个肺切片进行成像，并量化浸润器官的免疫细胞，以及响应病毒损伤的肺细胞增殖水平。使用这些方法，我们表明，正如预期的那样，奥密克戎的毒性低于德尔塔变体。XBB和BQ.1.18等其他变异株的毒力与奥密克戎所显示的毒力相当。然而，最近出现的变种BA.2.75和EG.5.1比奥密克戎更具毒性，但不是德尔塔。我们的方法可以对新出现的变异株引起严重疾病的能力进行定量评估。
数字
Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3
引文： Meehan GR、Herder V、Allan J、Huang X、Kerr K、Mendonca DC 等人（2023 年）通过数字病理学和机器学习对仓鼠中 SARS-CoV-2 变体的毒力进行表型分析。PLoS 病理学 19（11）： e1011589 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589
编辑 器： Christiane E. Wobus，密歇根大学，美国，美国
收到： 2023年7月31日;接受： 2023年10月30日;发表： 11月 7， 2023
版权所有： ? 2023 Meehan et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 本项目期间生成的原始FASTQ文件已提交至欧洲核苷酸档案库（ENA），项目登录号为PRJEB55782。Elighten 存储库 （https://doi.org/10.5525/gla.researchdata.1513） 中提供了支持本研究中提供的图表的原始数据，以及实施检测 HALO 中肺泡上皮增殖所需的机器学习辅助数字病理学管道所需的训练文件。
资金： 资金由Wellcome Trust（206369 / Z / 17 / Z到MP），UKRI UK-G2P财团（MR / W005611 / 1到MP，AHP和WSB），由LifeArc（COVID-19赠款给MP和AHP）和MRC（MC MC_UU_00034 / 5到QG和DWW，MC_UU_00034 / 9到MP和AHP）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
随着冠状病毒病-19（COVID-19）大流行在过去三年中的进展，导致该疾病的病毒严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）继续进化，产生了许多变异株，其中一些被世界卫生组织（WHO）定义为“需要关注的变异株”（VOC）[1,2].这些VOC包含突变，特别是但不仅限于编码S基因的刺突突变，与祖病毒相比，这可能具有选择性优势，例如通过增加其传播性和/或免疫逃逸性[1]。迄今为止，世界卫生组织已经认可了五种需要关注的物质：B.1.1.7（阿尔法）;B.1.351（测试版）;P.1 （伽玛）;B.1.617.2（Delta）和B.1.1.529（Omicron;以下称为BA.1，以区别于其他亚谱系）[1,3–5]。 自2021年11月最初的BA.1出现以来[5]，出现了不同的亚谱系。BA.1出现后不久，BA.2成为主要变异株，随后是BA.2的多种后代，包括BA.5和BA.2.75，它们在一些地理区域占主导地位[1,6]。 虽然BA.5和BA.2.75都从BA.2中分化出来，但这两个奥密克戎亚谱系在系统发育上是分开的，这表明BA.5和BA.2.75是独立出现的。BQ.1.18是BA.5的一个亚谱系[7]，而XBB变体是BJ.1（BA.2.10衍生物）和BM.1.1.1（BA.2.75的后代）之间的重组，后者于2022年9月在印度首次被发现，并于2022年底显著传播[8]。EG.5.1 是 XBB.1.9.2 的后代谱系，但携带两个额外的刺突突变 F456L（定义 EG.5 谱系）和 Q52H。它于 2023 年 3 月初首次被发现，随后于 2023 年 8 月 9 日与 EG.5 及其亚谱系一起被世卫组织指定为关注变异株 （VOI）。截至2023年10月2日，EG.5.1已在全球范围内被发现，患病率迅速上升至50%左右[9]。
一般而言，全球传播的每种新变异株往往比之前的主要变异株更具传播性[1]。随着人群免疫力的提高，由于疫苗接种或持续暴露于病毒，COVID-19可能会采取地方性模式，可能伴有季节性高峰，由逃避人群中已有免疫力的变异株引发[10]。
“实时”了解任何新变异株的疫苗逃逸程度对于确定疫苗接种政策至关重要。为此，体外血清中和试验已被证明是预测 SARS-CoV-2 变体疫苗逃逸的有用替代方法。病毒毒力是任何需要早期评估的新变异株的另一个关键表型特征。重症和住院的风险各不相同，与 Beta 和 BA.1 相比，Alpha、Gamma 和 Delta VOC 的重症监护病房 （ICU） 入院风险更高。因此，人群中已有免疫力的增强与Omicron的内在减弱特征相结合，导致COVID-19相关重症发病率和死亡率总体下降[11–14]。
然而，就病毒毒力而言，预测新变种的轨迹更为困难。尽管 BA.1 已被证明是减弱的，并且假设其传播潜力得以维持，但没有普遍的进化压力可以将这种表型性状保留在新出现的亚谱系或新的 VOC 中。
我们和其他人已经表明，观察到的BA.1变异株毒力的降低与体外病毒进入途径的变化有关，重要的是与实验感染仓鼠的毒力降低有关[15\u201218]。在整个大流行期间，小动物模型已被广泛用于评估野生型SARS-CoV-2和新出现的VOC的毒力[8,15,17–27]。这些研究为疾病发病机制、病毒传播以及不同抗病毒化合物或疫苗的疗效提供了宝贵的数据[20,28–33]。 重要的是，仓鼠已被证明天生易感染SARS-CoV-2，并能够将病毒传播给人类[34]。在仓鼠中，BA.1无法感染肺上皮细胞（与原始的B.1病毒、Delta和其他变体不同）[15,17]。 此外，在实验感染的仓鼠中，与人群中显示的B.1相比，Delta变体的毒力也有所增加[24,35]。
因此，尽管没有动物模型可以完全概括人类疾病，但仓鼠是剖析 SARS-CoV-2 发病机制和确定新出现变异株的毒力程度的绝佳模型。为此，许多使用实验感染仓鼠的研究都集中在测量体内病毒复制、识别病毒感染细胞以及通过测量体重减轻和通过定性评分评估各种组织病理学标准来检查致病潜力[8,18–21 ].在这里，我们开发了无偏见和自动化的“数字病理学”方法来评估 SARS-CoV-2 的毒力。数字病理学是一个广义的术语，指的是将病理切片和相关元数据数字化的各种系统，包括其存储、审查、分析和启用基础设施[36]。对整个扫描组织切片的计算分析提供了量化感染器官广泛代表性区域的细胞或组织学特征的机会。我们将这些管道应用于最近进化的变体（BA.5、BQ.1.18、BXX、BA.2和BA.2.75）[1,6–8]，并表明与亲本BA.1相比，其中一些获得了更强的毒力表型。该管道有助于快速评估新出现的变异株，并且随着大流行进入下一阶段，应该被证明是无价的。此外，我们创建了一个在线存储库，与科学界分享这项研究的高分辨率数字化全器官扫描载玻片，为 COVID-19 实验模型的组织病理学显微照片提供了更广泛的背景。
结果
宿主对 SARS-CoV-2 感染的转录反应
为了评估 SARS-CoV-2 感染期间复杂的宿主反应，我们首先用 Delta （B.1.617.2） 或 BA.1 变体实验感染了金色叙利亚仓鼠。这些变异与人类和实验模型中与SARS-CoV-2感染临床结果相关的表型相反。因此，Delta和BA.1可以为开发评估病毒毒力的定量管道提供基线。正如预期的那样，在感染后 2 到 6 天 （dpi） 之间，Delta 感染的动物比 BA.1 和模拟感染的仓鼠减轻了更多的体重，并且福利评分更高（S1A 图），证实了两种变体的预期表型。我们以 2 或 6 dpi 的速度剔除动物，并收集上呼吸道和下呼吸道的组织以及外周血，用于下游分析。
为了了解宿主对 SARS-CoV-2 感染的总体反应并确定病毒毒力的潜在标志物，我们对受感染和模拟感染仓鼠的肺部和血液进行了批量 RNAseq。主成分分析（PAC）表明，在肺和血液中，Delta和BA.1感染组在2 dpi时存在明显的聚类，但在6 dpi时，BA.1和模拟感染动物的分离不太明显（S1B图）。与模拟感染样本相比，在肺部和外周血中，Delta 和 BA.1 诱导了显着的差异基因表达（图 1A）。正如预期的那样，两种变体都诱导了与抗病毒机制、免疫系统激活、细胞因子和趋化因子反应以及干扰素信号传导相关的多种细胞反应通路，这通过基因本体 （GO） 分析显而易见（图 1B 和 1C）。两种变体之间的直接GO分析发现，仅在delta感染的动物中，第6天的通路数量有限，上调。这些通路包括与重塑和脂蛋白调节相关的通路，表明这两种变异引起的疾病结果差异可能归因于肺部组织修复通路的病变和激活。对~200个干扰素刺激基因的比较显示，感染动物的肺部和血液中I.型IFN反应普遍激活（如GO分析和先前发表的研究表明）[37\u201239]。与BA.1感染的仓鼠相比，Delta感染的动物在肺部和血液中都显示出更强的干扰素刺激基因（ISG）上调（图1D和1E）。总体而言，这些分析表明，I 型 IFN 反应、免疫系统激活和组织修复的标志物可能有助于表征 SARS-CoV-2 变体诱导的病理程度。
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图 1. SARS-CoV-2感染仓鼠肺部和血液的转录组反应。
（A） 火山图表示在每个时间点感染指定变异的仓鼠的肺部或血液中显着上调（红色箭头）或下调（蓝色箭头）基因的数量（与模拟感染的对照组相比）。（B-C）通路分析突出显示感染仓鼠在感染后 2 天和 6 天 （dpi） 时肺 （B） 和血液 （C） 中差异表达基因的丰富本体。每个通路旁边都标明了所涉及的基因数量。（D-E）散点图表示干扰素刺激基因 （ISG） 在指定时间点实验感染 Delta 或 BA.1 变体的仓鼠肺 （D） 和血液 （E） 中的相对表达。与Delta（FDR<0.05）相比，在BA.1中表达相对更高的ISG以红色显示。与 BA.1 （FDR<0.05） 相比，在 Delta 中表达相对更高的 ISG 以蓝色显示。数据来源于在两个独立实验中感染的 n = 8 只仓鼠（每组 4 只雌性和 4 只雄性）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.g001
组织中 SARS-CoV-2 复制的成像和定量
接下来，我们描述了 SARS-CoV-2 感染在感染组织中的传播。在这项研究中，为了检测病毒和细胞标志物，我们旨在开发使用软件辅助的全切片成像和下游自动分析的无偏倚定量方法，包括通过机器学习方法增强的方法（以下称为广义的数字病理学）[40]。本研究中介绍的数字病理学管道的开发已由董事会认证的兽医病理学家 （VH） 进行评估。此外，标准组织病理学评分和数字病理学流程之间的并排比较由另外三名获得委员会认证的兽医病理学家（FH、AC、CA）进行。此外，为了尽可能全面地分享本研究中显示的组织病理学特征，我们开发了一个在线存储库（“CVR 虚拟显微镜”;https://covid-atlas.cvr.gla.ac.uk）用户可以在可变放大倍率下完整地访问整个器官扫描的图像，就像他们在显微镜下观察载玻片一样。
首先，我们通过免疫组织化学 （IHC） 比较了感染仓鼠肺部 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白的检测水平，该蛋白在 2 dpi 时与原位杂交的刺突 RNA 进行了比较。两种方法得到的染色模式基本相同（S2图）。使用IHC对模拟感染样本的背景染色更高，因此我们在研究的其余部分使用RNA原位杂交。接下来，我们评估了 Delta 和 BA.1 在整个呼吸道上的病毒复制。正如预期的那样，从以 2 dpi 剔除的动物身上收集的组织显示呼吸道内同时存在 Delta 和 BA.1 感染的细胞（图 2A 和 2B）。相反，我们发现几乎没有证据表明动物在6 dpi时被剔除的病毒感染细胞。在 2 dpi 时，我们发现 Delta 和 BA.1 感染动物的鼻子、喉部和气管中的感染细胞数量没有显着差异。在我们的样本中，鼻子代表仓鼠鼻腔周围小软骨组织的内粘膜。然而，与BA.1感染的仓鼠相比，Delta感染动物的鼻甲和肺部都显示出明显更多的感染细胞。重要的是，SARS-CoV-2 在肺实质中的显着传播仅在感染 Delta 的仓鼠中明显。Delta感染细支气管和肺泡中的上皮细胞，形成感染组织的大病灶。相反，BA.1仅感染细支气管中的细胞，最多在一些动物的肺实质中形成小的感染病灶（图2A和2B）。正如预期的那样，每组动物之间在感染细胞数量方面存在差异。这种变异性在气管中尤为明显，8 只 Delta 感染动物中有 2 只显示出感染细胞的数量是该组其余动物数量的 10 倍以上。除了上述两个异常值外，其余感染 Delta 和 BA.1 的仓鼠的气管显示出相似数量的感染细胞。
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图 2. Delta 和 BA.1 在实验感染仓鼠呼吸道器官中的分布。
金色叙利亚仓鼠鼻内感染了 Delta 或 BA.1 （3.75x106每只动物的基因组拷贝数相当）（或模拟感染）。对照动物单独接受培养基。在感染后 2 天或 6 天 （dpi） 扑杀动物，收集鼻子、鼻甲、喉、气管和肺进行数字病理学分析 （A）。通过原位杂交 （B） 评估组织中是否存在刺突 RNA 或通过免疫组化 （C） 评估 MX1 的表达。对于信号定量，使用Aperio VERSA 8明场，荧光和FISH数字病理扫描仪（Leica Biosystems）以200倍明场放大倍率扫描载玻片。使用 QuPath（版本 0.3.2 或更高版本）勾勒出要分析的组织。在分析之前，对检测阳性染色像素百分比的算法进行了单独调整。采用双因素方差分析进行统计分析，*<0.05、**<0.01、***<0.001、****<0.0001。数据来自两个独立的实验（总共n = 8;每个实验n = 4）。黑色：未感染;红色：德尔塔感染;蓝色：感染BA.1（雄性动物，三角形;雌性动物，圆圈）。蓝色比例尺：100μm;绿色比例尺：1 毫米。使用 biorender.com 制作的图形。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.g002
鉴于RNAseq获得的数据，其中干扰素反应是感染仓鼠中关键的差异激活途径，我们还评估了MX1的表达，作为代表性的核心ISG[41]。与在 6 dpi 时观察到的水平相比，鼻子和肺部的 MX1 表达在 2 dpi 时通常较低。喉部在2 dpi时表现出高MX1表达，但在6 dpi时表达很少，而鼻甲和气管在两个时间点显示出相似的水平（图2C）。批量RNAseq数据表明，与BA.1相比，Delta变体在受感染仓鼠肺部引起的I型IFN反应更为强烈（图1B-1E）。因此，我们旨在使用以 2 dpi 收集的连续肺切片的原位 RNA 杂交在空间上解析受感染仓鼠的 ISG 表达。我们使用了五个切片，中间切片探测了刺突，而在其他切片中，我们使用RNA探针对以下ISG：RSAD2、IFIT1、MX1和OAS1（图3）。ISG阳性像素的百分比与感染仓鼠肺部刺突阳性像素的百分比直接相关。在 Delta 和 BA.1 感染的肺部中，病毒和 ISG 阳性区域明显重叠。因此，RNAseq在受感染动物的肺和血液中观察到的更稳健的I型IFN反应与2 dpi时肺部Delta的较高复制水平相关。
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图 3. 干扰素刺激基因在实验感染仓鼠肺部的表达。
（A） 从实验感染 Delta 或 BA.1 并在感染后 2 天 （2 dpi） 扑杀的仓鼠中获得的连续肺切片的原位 hybridisation。使用的探针包括SARS-CoV-2刺突、RSAD2、IFIT1、MX1和OAS1的探针。（B）如图2所示对信号进行量化，并使用单因素方差分析进行统计分析，*<0.05，**<0.01，***<0.001，****<0.0001。数据代表两个独立的实验，总共使用 n = 6 只仓鼠（每组 3 只雌性和 3 只雄性）。黑色：未感染;红色：SARS-CoV-2 （Delta） 感染;蓝色：SARS-CoV-2 （BA.1） 感染（雄性动物，三角形;雌性动物，圆圈）。比例尺：3 毫米。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.g003
感染 Delta 和 BA.1 的仓鼠之间的差异也存在于较早的时间点。对以 1 dpi 收集的鼻甲、气管和肺的组织（S3A 图）的分析显示，Delta 感染动物的刺突 RNA 水平（S3B 图）升高。MX1 表达在 Delta 感染的动物中显示出更高水平的表达趋势，但差异无统计学意义（S3C 图）。同样，洗鼻、咽拭子和全肺RT-qPCR表明，Delta感染仓鼠的基因组RNA水平较高，但只有后者的差异具有统计学意义（S3D图）。
通过数字病理学量化肺部病变的范围
我们在上面表明，在 6 dpi 时，在实验感染的仓鼠的临床症状高峰期，大部分 SARS-CoV-2 已被宿主清除（图 2A）。我们的RNAseq分析表明，除了I型IFN反应的标志物外，导致免疫细胞活化和组织修复的途径在Delta和BA.1感染的仓鼠之间也存在差异性上调（图1B和1C）。受感染仓鼠（尤其是感染了 Delta 的仓鼠）肺部的组织病理学病变的特征是肺泡和间质中的巨噬细胞浸润，呈多灶性到聚结性分布，尤其是在 6 dpi 时（图 4、5A 和 5D）。免疫细胞浸润还含有中性粒细胞/嗜异性粒细胞以及淋巴细胞和浆细胞（S4图）。在 2 dpi 时，Delta 感染的仓鼠表现出血管炎和支气管上皮细胞脱落。相反，在 2 dpi 时，BA.1 感染动物的血管和支气管病变最小。正如其他研究[30,42,43]所示，我们发现明显的肺泡上皮增生形成密集的蜿蜒和玫瑰花结状结构，取代了肺泡间隙，特别是在Delta感染的仓鼠中（图4和S4）。从支气管周围开始的 2 型肺细胞（或其他肺祖细胞）的细胞浸润和增殖涉及肺部的大面积区域（尤其是在 Delta 感染的仓鼠中）（S4 图）。有时，多核细胞（解释为合胞体）（S5图）与通常严重增生的支气管上皮或肺实质有关（图4）。
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图 4. SARS-CoV-2 实验感染仓鼠的肺部组织病理学。
实验性感染 Delta 或 BA.1 的仓鼠苏木精和伊红染色的肺切片的低（左）和高（右）放大倍数 （3.75x106每只动物的基因组等效拷贝数）或模拟感染对照。在感染后 2 天 （dpi），Delta 导致支气管内和周围巨噬细胞浸润水平更高，而与模拟治疗的仓鼠相比，BA.1 仅引起轻度浸润（白色箭头）。同一天，德尔塔感染的动物表现出中度血管炎（插图，右图）和支气管上皮细胞中度脱落（星号）。BA.1感染动物的血管和支气管病理学在2 dpi时最小。在6 dpi时，Delta感染动物的肺部显示巨噬细胞，淋巴细胞，浆细胞和中性粒细胞/嗜异性粒细胞的严重浸润，以及覆盖肺叶大面积的严重肺泡上皮增生（黑色箭头;另见S4图）。在某些情况下，感染BA.1的动物表现出相同的病变，包括2型肺细胞增生（星号），但仅覆盖有限量的肺叶（黑色箭头）。（空比例尺：2 mm;填充比例尺：100 μm）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.g004
因此，我们接下来的目标是通过首先评估和比较 6 dpi 时浸润 Delta 和 BA.1 感染仓鼠肺部的免疫细胞来成像和量化病毒诱导的肺部病理学程度。我们专门评估了 T 细胞 （CD3） 和巨噬细胞 （IBA1），发现与感染 BA.1 的仓鼠相比，Delta 感染仓鼠中这些细胞的数量显着增加（图 5A 和 5B）。通过组织病理学，这两种细胞类型都代表了Delta感染仓鼠肺部的大多数免疫细胞浸润（图5A和5B）。++
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图 5. Delta 或 BA.1 实验感染仓鼠的组织组织病理学定量。
实验性感染 Delta 或 BA.1 的仓鼠整个肺部部分的图像 （3.75x106每只动物的基因组等效拷贝）（或模拟感染对照），并在感染后 2 天或 6 天 （DPI） 进行扑杀。通过免疫组化评估CD3（A）、IBA1（B）和TTF1（C-D）的表达。在感染后 2 天或 6 天 （dpi） 扑杀动物，并收集肺部进行组织学分析。（空调）显示了每个标记物的代表性显微照片和相关定量。（D）模拟感染的动物仅在支气管上皮和散布在整个肺实质的单个细胞中显示出TTF1的阳性信号。（E） Delta 感染仓鼠的肺部显示 TTF-1 阳性细胞严重增殖（箭头）。插图显示了位于中央的支气管（星号）周围的 2 型肺细胞增生的较高放大倍数。（F） 使用训练用于检测肺泡上皮增生的 HALO 软件算法进行分析后，图像与 E 中的图像相同。该软件以绿色显示负区域，以黄色显示正区域;只有增殖的肺泡上皮细胞被识别为阳性区域，而TTF1 2型肺细胞和支气管上皮细胞被软件排除。使用 QuPath（版本 0.3.2 或更高版本）量化实验感染动物中的 CD3 和 IBA1 阳性细胞，而 HALO 用于量化肺泡上皮增生。采用双因素方差分析进行统计分析，*<0.05、**<0.01、***<0.001、****<0.0001。数据来自使用8只仓鼠（在两个独立实验中感染的4只雌性和4只雄性）的两项独立实验。黑色：未感染;红色：德尔塔感染;蓝色：BA.1感染者（男性，三角形;女性：圆形）。蓝色比例尺：1 mm;绿色比例尺：400μm。++
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.g005
接下来，我们开发了一种量化肺泡上皮增生的方法。我们使用了甲状腺转录因子（TTF1）[44,45]，这是呼吸道上皮细胞中表面活性蛋白表达所需的关键因子。正如预期的那样，我们发现TTF1阳性细胞包括增生性肺泡上皮细胞，但也包括肺部的正常/孤立的2型肺细胞和末端细支气管中的上皮细胞。为了仅量化肺实质中的增生区域，我们使用了软件辅助成像检测。使用监督机器学习方法，我们“训练”了 HALO 软件 （Indica Labs） 来检测代表增殖的 2 型肺细胞的 TTF1 阳性核区域簇，同时忽略末端支气管中分离的 2 型肺细胞或 TTF1 细胞。在培训期间，我们确保软件排除了增生性支气管上皮（S6图）。我们在任何仓鼠组中都没有发现 2 dpi 的增生性病变，而在第 6 天，我们发现与感染 BA.1 的仓鼠相比，Delta 感染的仓鼠中增生型 2 型肺细胞明显更多（后者的值在大多数动物中仅略高于背景;图 5C 和 5D）。+
评估奥密克戎亚谱系的毒力
迄今为止开发的管道使我们能够提供一种自动、无偏见和定量的方法来评估仓鼠中 SARS-CoV-2 的毒力程度。因此，我们接下来使用这种方法来评估最近出现的奥密克戎亚谱系的毒力。
我们首先研究了BA.5，因为其他研究虽然使用了嵌合BA.2/BA.5病毒，但表明与BA.1相比，该变异株的毒力更高[23]。与感染BA.1的仓鼠相比，从感染BA.5的仓鼠身上收集的肺部显示出（i）巨噬细胞浸润（IBA-1细胞）、（ii）表达MX-1的细胞和（iii）肺泡上皮增生值增加的一致趋势。然而，差异缺乏统计学意义（图6A）。BA.5感染的动物在6 dpi时体重也略有下降，而感染Delta或BA.1的动物显示出预期的表型（BA.1感染动物的体重略有增加，Delta的体重从2 dpi开始减轻;图 6B）。+
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图 6. 实验感染仓鼠中奥密克戎亚谱系毒力的量化。
（A） 感染后 6 天 （dpi） 从实验感染 Delta、BA.1、BA.5（病毒载量相当于 3.75x106每只仓鼠的基因组拷贝）或模拟感染。通过原位杂交评估TTF1增生上皮细胞和浸润巨噬细胞（IBA1）的表达。相反，通过免疫组化评估MX1的表达。数据量化如图5所示。（B）每天记录这些动物之间的体重差异。（C） 模拟感染或感染BA.1、XBB、BQ.1.18或BA.2.75的动物的每日记录体重变化。（D） 分析肺全扫描切片是否存在 IBA1 细胞或 （E） 增生性肺泡上皮细胞，如 A. （F） 模拟感染仓鼠或感染 BA.1、BA.2 或 BA.2.75 的动物的每日体重变化。（G） 表达 IBA1 或 （H） 增生性 TTF-1 细胞的细胞定量。BA2.75 或 EG.5.1 感染仓鼠肺部体重减轻 （I）、巨噬细胞浸润 （J）、肺泡上皮增生 （K） 和 T 细胞浸润 （L） 的比较。使用单因素方差分析和Tukey的多重比较检验进行统计分析。使用双向方差分析进行权重比较。数据显示为平均值 +/- 标准差。显著性用 *<0.05、**<0.01、***<0.001、****<0.0001 表示。* 表示 Delta 和 mock 之间的比较，或 BQ.1.18 和 mock，或 BA.2.75 和 mock 之间的比较;# 表示 BA.1 和 delta 之间的比较，或 mock 和 BA.2.75 之间的比较;$ 表示 Delta 和 BA.5 之间的比较，或 mock 和 XBB 之间的比较;+ 表示未感染和 BA.5 之间的比较;& 表示 BA.5 和 BA.1 之间的比较。n = 6（每组 3 名女性和 3 名男性）。**€ 表示 mock 和 EG.5.1 之间的差异，*€€ 表示 mock 和 BA2.75 以及 mock 和 EG.5.1 之间的差异。黑色：未感染;红色：德尔塔感染;蓝色：BA.1感染;绿色倒三角形：SARS-CoV-2 （BA.5） 感染;橙色倒三角形：SARS-CoV-2 （XBB） 感染;紫色方块：SARS-CoV-2 （BQ.1.18） 感染;粉红色方块：SARS-CoV-2 （BA.2） 感染;绿色钻石：SARS-CoV-2 （BA.2.75） 感染。雄性：三角形，雌性：圆形。比例尺：500μm。使用 biorender.com 制作的图形。++++
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.g006
鉴于数字病理学管道能够显示 BA.5 可能的中间毒力表型，我们继续评估其他 Omicron 亚谱系的毒力，例如 BQ.1.18、XBB 和 BA.2.75（图 6C-6E）。没有一个变异导致受感染仓鼠的体重大幅减轻（图6C）。感染BA.2.75的仓鼠在dpi 2和5之间表现出适度的体重减轻，但与感染BA.1的动物不同，感染BA.2.75和BQ.1.18的仓鼠都没有显示体重增加直到5dpi（图6C）。
我们发现，与感染原始BA.1的仓鼠相比，感染其他变异株的仓鼠肺部浸润的巨噬细胞有所增加（图6D）。BA.2.75 显示肺部 IBA 细胞水平最高，尽管差异仅在 BA.1 和 XBB 中具有统计学意义，而与 BQ.1.18 没有差异。与感染BA.1的动物的肺相比，感染BA.2.75的动物的肺也显示出肺泡上皮增生的显着增加（图6E）。总体而言，数据表明，与BA.1相比，奥密克戎亚谱系，尤其是BA.5和BA.2.75的毒力有所增加。我们还将 BA.2.75 与其前身 BA.2 进行了比较，以确定 BA.2.75 中是否存在进一步的进化适应，有利于更具毒性的表型。BA.2.75 和 BA.2 之间的体重减轻、巨噬细胞数量和肺泡上皮增殖没有观察到显着差异（图 6F–6H）。然而，感染BA.2.75或感染BA.2的动物体重增加不如模拟或BA.1感染的动物稳定。然而，我们看到，与BA.2相比，BA.2.75感染的仓鼠肺部浸润巨噬细胞水平有所增加，尽管差异没有统计学意义（图6G）。所有变异都诱导了有限水平的肺泡上皮增生（图6H），这与这些病毒侵入肺实质的能力有限一致。最后，为了可视化和比较本研究中使用的所有不同变体，我们使用在 BA.1 感染的仓鼠中获得的值作为不同实验之间的参考单位对数据进行归一化（S7 图）。正如预期的那样，S7图中显示的图表显示了变体之间的毒力梯度。XBB 诱导的肺部病变很少或没有，类似于 BA.1。BA.5、BA.2 和 BQ.1.18 的毒性比 BA.1 强，而 BA.2.75 的毒性明显高于 BA.1，但不如 Delta 强。因此，使用标准参考病毒可以对不同实验（和不同实验室）中使用的变体进行比较。+
在修订该手稿期间，EG.5.1在世界范围内的传播大大增加[9]。我们将EG.5.1与BA.2.75的毒力进行了比较，因为与其他Omicron样病毒相比，后者在仓鼠中的毒力相对较高。我们发现EG.5.1的毒力明显高于BA.1，但与BA.2.75相当（图6I–6L）。
为了进行比较，三名委员会认证的病理学家还对感染BA.1、XBB、BQ.1.18和BA.2.75的仓鼠的肺部同时进行了肺部病理学的半定量评分[39]。与我们的数字病理学管道相比，总体数据显示了类似的趋势（S8 图）。
讨论
COVID-19 大流行已进入一个阶段，其特征是免疫逃逸变体的周期性出现，其毒力可能与前辈不同。因此，评估任何新出现的变异株的毒力将是需要近乎实时监测的关键特征之一。在整个大流行期间，动物模型已被用于揭示SARS-CoV-2发病机制的许多方面[43]。到目前为止，SARS-CoV-2变异株（如Delta和BA.1）在人类和实验感染的仓鼠中的毒力之间存在极好的相关性[7,18–21,26,27,42,46,47]。
在许多研究中，通过评估体重减轻、肺功能的各种特征和组织病理学病变来确定实验性感染仓鼠中SARS-CoV-2变异株的毒力[8,15,17,18,23–27,48]。总的来说，这些参数已被证明是变异株毒力的良好代表。对于德尔塔和奥密克戎等变异株来说尤其如此，它们在毒力方面表现出明显不同的表型。然而，当变异株之间毒力的内在差异不大时，例如BA.2和BA.5与BA.1相比，研究之间可能会出现一些相对差异[23,26]。
感染动物的组织病理学特征，如肺泡损伤和呼吸道炎症性病变，是病毒复制（和宿主免疫反应）的结果，因此直接反映了病毒的毒力。在各种研究中，肺部病理学的特征通常是由训练有素的病理学家对毛细支气管炎、出血、肺泡损伤等病变进行定性评分（S9 图）。定性组织病理学评分可能因人而异，因此很难在不同实验室之间明确比较这些类型的数据。在机器学习辅助下实施数字病理学管道不仅通过消除观察者之间和观察者内部的差异来提高客观性，而且还提高了数据分析的速度[49]。此外，以半定量方式评估病变，选项数量有限（即 评分为 0、1、2、3）可能会掩盖个体之间的变异性，而本研究中使用的更定量的方法可以更好地理解这些变异性。在这项研究中，我们旨在开发一个定量无偏倚方法的框架，通过量化实验感染仓鼠的肺部病理学程度来对 SARS-CoV-2 变体的相对毒力进行表型分析。与先前的研究一致[39,50–52]，我们的转录组学分析表明，SARS-CoV-2感染会诱导肺部免疫细胞浸润和免疫激活。事实上，在这里我们发现 ISG 的表达以及 T 细胞和巨噬细胞的浸润在高毒力变异 Delta 诱导的病变中很常见，但在 BA.1 感染的仓鼠中几乎不高于背景。
此外，我们的RNAseq数据表明，组织重塑是区分Delta和BA.1感染仓鼠转录谱的另一个关键参数。毒性 SARS-CoV-2 变异株可诱导肺泡损伤，伴有 1 型和 2 型肺细胞坏死。肺泡上皮增生随后可修复肺损伤，肺泡上皮增生是SARS-CoV-2在实验性感染仓鼠中诱导的病变的一个关键特征[30,42,43]，在某些情况下，在因COVID-19死亡的人类患者的尸检样本中也发现了肺损伤[53–55]。肺呼吸道上皮修复是由于轻度损伤后2型肺细胞增殖[56]，或重度损伤后其他肺祖细胞增殖伴1型肺细胞大量丢失[57–59]。
总体而言，我们发现浸润的巨噬细胞和增殖的上皮细胞构成了感染毒性 SARS-CoV-2 变体的仓鼠肺实质受影响区域的大部分细胞。在另一项基于第一波COVID-19死亡患者肺部组织病理学的研究中，我们一致观察到上皮增生和巨噬细胞浸润[60]。因此，这两个特征代表了非常好的标志物，它们本身可以对病毒诱导的肺部病变进行无偏倚的定量，进而提供病毒毒力。此外，使用整个肺切片还可以通过提供炎症反应的空间概览来减少偏倚。例如，我们对ISG反应的空间分布以及它如何与炎症病变中病毒的存在直接相关的研究被证明特别有见地（图3）。组织切片的全扫描成像和下游分析，包括基于人工智能方法的分析（“数字病理学”），已广泛用于诊断病理学和其他领域，包括癌症研究和传染病[49,61,62]。 最近出现了用于诊断人类肺部病理学的基于人工智能的管道[63]。在这些方法中，该软件经过训练，可以区分不同的疾病，如肺结核和肺癌以及纤维化疾病。
在我们的研究中，通过对整个扫描的肺切片进行免疫组化以鉴定IBA1细胞（作为巨噬细胞的方便标记物），我们能够量化实验感染仓鼠肺实质中浸润的巨噬细胞。以这种方式，可以无偏倚地获得肺实质中浸润巨噬细胞的相对数量。由于该标志物在增殖和非增殖的 2 型肺细胞以及支气管上皮细胞中均有表达，因此通过简单地量化 TTF1 细胞来测量肺泡上皮增生的相同方法最初并没有提供令人满意的结果。然而，监督机器学习方法使我们能够训练用于检测TTF1细胞簇（增生性2型肺细胞）的软件，并排除孤立的2型肺细胞（代表肺部的正常2型细胞）或细支气管上皮中的TTF1细胞。我们的方法不仅使我们能够清楚地区分由毒力 Delta 和减毒的 BA.1 诱导的肺部病变，而且还显示出其他 Omicron 亚谱系的毒力增加。++++
本研究中使用的管道使我们能够证明，与BA.1相比，BA.5、BA.2.75和EG.5.1的毒力表型有所增加，正如最近的其他研究所表明的那样[6,23,27]。 我们发现XBB和BA.1之间的毒力没有差异，这也与最近的另一项研究一致[8]。有趣的是，我们发现与 BA.1 相比，BA.2 倾向于诱导更多数量的巨噬细胞浸润和 2 型肺细胞增生，尽管差异没有达到统计学意义。其他已发表的研究发现，BA.1和BA.2的毒力没有显著差异[8,48]，而之前的一项研究使用BA.1或BA.2刺突的重组病毒[64]。
我们建议，本研究中描述的方法可用于量化变体之间毒力的适度差异，尽管可能需要调整动物组大小以解决特定的实验问题。事实上，大多数关注仓鼠 SARS-CoV-2 毒力的研究都使用 4 到 6 只动物（通常只有雄性）的实验组，但这些可能不足以揭示变异之间毒力和固有个体变异性相对适度的差异（还考虑到分数设置的值在 0 到 3 或 4 之间）。可以说，在仓鼠中观察到的变异毒力的适度差异在人类患者中的生物学意义可能有限。事实上，这类研究的一个局限性是，幼稚仓鼠中变异株的内在毒力很难与它们在人类“现实世界”中的毒力进行比较（预先存在的免疫力来自疫苗接种或以前的感染）。然而，新出现的变异株的内在毒力仍然是需要监测的关键表型，以确定是否需要对公共卫生措施进行调整。例如，出现毒力增加的变异株可能需要与现有疫苗接种政策不同的疫苗接种政策。
我们在所有实验中使用相同数量的雄性和雌性仓鼠。正如预期的那样，我们在不同实验中和不同实验之间观察到个体仓鼠之间由相同变异引起的病变程度存在一些与性别无关的变异性。标准参考病毒可用于多个实验，评估不同的变体，以使实验之间的数据标准化（S7图）。这种方法还可以对不同实验室之间的数据进行有意义的比较。
总之，本研究中开发的数字病理学管道为定量评估实验感染仓鼠中 SARS-CoV-2 变体的毒力提供了一个框架。鉴定具有明确致病性的病毒标准品并共享用于量化肺部病变的方案，可以全面比较不同实验室之间的体内数据。我们还开发了一个在线存储库，以便更有效地与研究界共享来自扫描的整个器官组织切片的组织病理学图像。我们认为，如果读者能够更好地欣赏手稿主体中包含的组织病理学显微照片，这些照片由类似于我们的虚拟显微镜中包含的整个扫描载玻片的图像补充。由于空间限制，标准手稿图中包含的显微照片仅以单倍或双倍放大倍率显示单个感兴趣区域。虚拟显微镜允许读者以多种放大倍率查看给定切片的所有区域，从而提供全面的数据空间背景。
材料与方法
道德声明
根据英国内政部法规（项目许可证PP0271643），根据1986年《动物（科学程序）法》，并经格拉斯哥大学伦理委员会批准，在特定的无病原体条件下饲养动物。所有动物研究均遵守ARRIVE指南。
细胞和病毒
Calu-3细胞（ATCC HTB-55）是人肺腺癌上皮细胞。使用表达人类Ace2受体的非洲绿猴肾细胞（Vero E6）[65]来传播病毒。所有细胞系均保持在 37°C 和 5% CO 下2在补充有 10% 胎牛血清 （FBS） （ThermoFisher） 的 DMEM （ThermoFisher） 中，除了 Calu-3 细胞，其中 RPMI-1640 培养基 （ThermoFisher） 补充了 20% FBS。BA.5病毒分离株是从Greg Towers（英国伦敦大学学院）获得的P2通道，在最初获得Alex Sigal（AHRI，南非）的P1通道后获得的。本研究中使用的其他变异株包括Delta变异株（B.1.617.2，GISAID登录号EPI_ISL_1731019）、BA.1、BA.2、BA.2.75、BQ.1.18和XBB，均从CVR或伦敦帝国理工学院获得的临床样本中分离出来。从病毒转运培养基中收集的临床鼻咽拭子样本中分离出病毒。然后将样品重悬于补充有 100 单位 mL-1 青霉素-链霉素、10 ug mL-1 庆大霉素和 2.5 ug mL-1 两性霉素 B 的无血清 DMEM 中，最终体积为 1.5 mL。然后接种Calu-3细胞，并在37C，5%CO 2下孵育过夜。第二天，在进一步孵育之前，用新鲜的完全培养基替换细胞培养基。通过RT-qPCR监测感染细胞的CPE体征和上清液中病毒后代的存在。所有工作储备液均在VeroE6细胞中繁殖。
动物
雄性和雌性金色叙利亚仓鼠（HsdHan：AURA）由Envigo饲养和饲养;Wyton，英国）。动物按照要求被运送到格拉斯哥大学的兽医研究设施（VRF），并在转移到3级收容（CL3）套件之前适应环境。将动物饲养在单独通风的笼子（IVC）中，以12小时的光/暗循环进行，并随意提供食物和水。8-12周龄的雄性和雌性仓鼠都用于实验。
实验性感染
动物被随机分配到治疗组，然而，由于这项工作的性质，盲法是不可能的。在整个实验过程中，动物在CL3套件的I类微生物安全柜（MSC）内处理。仓鼠用含有 5% 异氟醚的氧气 （1.5 L/min） 麻醉，并在鼻内给药 50 μl 含有 3.75x10 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）6基因组拷贝（相当于大约 1x104PFU）的SARS-CoV-2。我们选择使用基因组拷贝进行感染研究，以控制BA.1变异株在感染性和斑块形成方面的差异[16]。对照动物仅接受DMEM。每天记录动物体重和体温，每天两次监测动物的临床疾病迹象，包括毛发勃起、驼背、呼吸异常和同伴互动减少。动物根据体重减轻以及这些迹象的存在和严重程度接受疾病评分。在实验结束时，通过增加一氧化碳浓度来扑杀动物2.
咽拭子
将动物束缚，将拭子（MWE）插入口腔，并在每个扁桃体上旋转五次。然后将拭子置于含有 2% FBS （ThermoFisher） 的 2 ml DMEM （ThermoFisher） 中 1 分钟。对于RNA RT-qPCR，将250μl培养基加入750μlTRIzol LS（ThermoFisher）中。对于活病毒检测，将培养基在 -80°C 下冷冻。
RNA提取
按照制造商的说明，使用 RNAdvance 血液试剂盒 （Beckman Coulter Life Sciences） 从培养上清液中提取病毒 RNA。将大小约为 20 mg 的组织样品收集在含有 2.8 mm 金属珠 （Stretton Scientific） 和 1 ml TRIzol 试剂 （ThermoFisher Scientific） 的均质管中。在TRIzol LS试剂（ThermoFisher Scientific）中以1：4的比例收集血液。使用 Precellys Evolution 均质器（Bertin Instruments）匀浆组织样品（6500 rpm，4x 30s 循环，30 秒断裂，室温），并将匀浆与 200 μl 氯仿 （Merck—1L） 混合。将每个样品充分混合，并在 4°C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟。 除去水相并与230μl100%乙醇（默克）混合。然后将样品加入RNeasy Mini Kits（Qiagen）的色谱柱中，并按照制造商的说明进行处理。在色谱柱上，按照制造商的说明对所有样品进行DNase酶解（Qiagen）15 min。
RT-qPCR检测
以RNA为模板，使用Luna Universal Probe一步法RT-qPCR试剂盒（New England Biolabs，E3006E）通过双链逆转录酶（RT）定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测和定量病毒基因组。使用以下一组引物和探针靶向 ORF1ab 基因来检测 SARS-CoV-2 特异性 RNA：SARS-CoV-2_Orf1ab_Forward 5'GACATAGAAGTTACTGGCGATAG3'、SARS-CoV-2_Orf1ab_Reverse 5'TTAATATGACGCGCACTACAG3' 和 SARS-CoV-2_Orf1ab_Probe 5' HEX-ACCCCGTGACCTTGGTGCTTGT-BHQ-1 3'。使用以下引物 hACTB-F 5′CTCCCAGCACCATGAAGATC3′、hACTB-R 5′GCTGGAAGGTGGACAGTG3′ 和 hACTB-Probe 5′ Cy5-TGTGGATCGGTGGCTCCATCCTG-BHQ-3 3′ 将仓鼠 β-肌动蛋白用作参考基因。使用 ΔΔCt 方法进行归一化，并通过从标准曲线中插值调整后的 ORF1ab Ct 值来计算 SARS-CoV-2 基因组拷贝。所有运行均在 ABI7500 Fast 仪器上进行，并使用 7500 软件 v2.3（Applied Biosystems，Life Technologies）分析结果。
组织学、免疫组化和原位杂交
切割3μm厚的福尔马林固定（8%）和石蜡包埋（FFPE）组织（肺，气管，喉和EDTA脱钙的鼻甲酸盐）切片并安装在载玻片上。我们确保在包埋过程之前，肺始终以相同的方向放置在盒中。每只动物的整个器官水平切片也在同一水平上切割。载玻片用苏木精和伊红 （HE） 染色。使用了以下抗体：抗 SARS CoV-2 核衣壳 （Novus Biologicals）、抗 CD3 （Agilent DAKO）、抗 Pax5 （Agilent DAKO）、抗 TTF-1 （Leica）、抗 E-cadherin （Agilent DAKO）、抗 IBA1 （Fujifilm） 和抗 MX1 （Cell Signaling）。作为阴性对照，一抗被同型血清取代。为了可视化，在自动染色机（Autostainer Link 48，Agilent Technologies）中分别使用EnVision+/HRP，小鼠，HRP试剂盒（Agilent DAKO）或EnVision+/HRP，Rabbit，HRP试剂盒（Agilent DAKO）。对于所有免疫组化实验，均使用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）作为显色剂。根据制造商的说明（Advanced Cell Diagnostics，RNAScope），使用RNAScope在靶液中炖煮和蛋白酶K处理来检测RNA。使用了以下探针：SARS-CoV-2 刺突（产品代码：848561）、DapB（产品代码：310043）、泛素（产品代码：310041）以及 cricetine MX1（产品代码：1153131）、IFIT1（产品代码：1153111）、OAS1（产品代码：1153101）、RSAD2（产品代码：1153121）。
数字病理学：标准信号定量
对于图像分析，使用Aperio VERSA 8明场，荧光和FISH数字病理扫描仪（Leica Biosystems）以200倍明场放大倍率扫描载玻片[66]。
为了量化组织（鼻子、鼻甲、喉、气管和肺）中固红（原位杂交，ISH）和二氨基联苯胺（DAB）-棕色（免疫组化，IHC）的阳性信号，我们根据使用 QuPath 软件（版本 0.3.2 或更高版本）检测到的信号优化了图像分析管道。第一步是上传并设置适当的图像类型[ISH的明场（其他）;IHC 的明场 （H-DAB） ]，然后使用“魔杖”和“画笔”工具手动勾勒出感兴趣的区域。对 SARS CoV-2 刺突 RNA （ISH）、IBA1 （IHC）、MX1 （IHC） 以及包括 IFIT1、MX1、RSAD2 和 OAS1 （ISH） 在内的各种 ISG 进行染色，我们利用了 QuPAth 中的像素分类器功能。选择这种特异性（像素分类器）进行分析，因为在这些染色中，病毒（刺突RNA）信号非常丰富，多个阳性细胞聚集在一起或成片。相反，对于ISG，正信号以标点模式分散分布。具体而言，对于每个像素检测（%），图像类型按上述方式设置。为了创建阈值器，“分辨率”设置为 1.09 μm/像素或更高。对于“通道”，我们使用“红色”（ISH）或“DAB”（IHC）;“预过滤器”始终是“高斯”，而“平滑西格玛”和“阈值”已针对每组实验进行了调整，以优化正确的检测（基于每批载玻片及其各自的染色强度和背景）。“高于阈值”选项始终设置为“正数”，而“低于阈值”始终设置为“负数”。要分析的“区域”设置为“任何注释 ROI”。读数是注释区域中正像素占总像素的百分比。
“阳性细胞”检测功能已用于检测细胞膜相关的 CD3 阳性细胞。“请求的像素大小”的设置调整为 0.5 μm 或更小，“细胞核参数”包括 8 μm 的“背景半径”。“中值过滤半径”设置为0.8 μm或更小，“Sigma”设置为1.5 μm或更小，而“最小”和“最大”区域调整为10-30 μm2和 400 μm2分别。“强度参数”包括 0.1 或 0.2 的“阈值”和 2 的“最大背景强度”。“细胞参数”包括 5 μm 的“细胞扩增”。读数是注释区域中每个细胞检测到的阳性细胞的百分比。
数字病理学：肺泡上皮增生的量化
我们使用 HALO （Indica Labs） 软件中的算法“AI”来检测肺内与肺泡上皮增生相对应的 TTF1 核簇，同时忽略单个 TTF1 正常 2 型肺细胞，以及阳性染色的正常或增生性支气管上皮。因此，读数是肺中具有莲座状形状的阳性 TTF1 染色区域的百分比。首先，该软件经过训练，可以检测出感兴趣的积极区域。使用经过训练的算法检测肺泡上皮增生的文件在 Enlighten 存储库 （https://doi.org/10.5525/gla.researchdata.1513） 中共享，用户可以将其导入任何 HALO 软件（HALO 版本 3.4.2986.230）。文件“.classifier”可以由文本编辑器读取，并包含元数据（分辨率、类名等）。“.params”和“.trainer”文件特定于深度学习框架 mxnet。.params 文件 MXNet 用于存储模型权重的特定文件格式。.trainer 文件是 MXNet 为优化器提供的特定文件格式。这会跟踪训练信息，例如迭代、学习率和优化器状态。包含这三个文件的 zip 文件可以直接加载到 HALO 中。++
HALO 算法（Densenet AI V2 插件）经过 3 组独立实验的训练。每组动物作为单独的批次处理，并作为独立实验分3个不同的时间进行感染、处理、染色和扫描。使用相同的机器学习算法在多个实验中以相同的方式处理样本。我们在 3 个不同的实验中选择了至少 30-40 张载玻片，其中包含 delta 和 omicron 感染的肺部样本，以训练软件并优化其性能。首先，在每张幻灯片上选择感兴趣区域 （ROI）。使用 DenseNet AI 插件分类器，为阳性组织（TTF-1 阳性和增殖的 2 型肺细胞）和阴性组织（孤立的 2 型肺细胞，以及正常或增生性支气管上皮）定义类别。在高放大倍率下绘制每个类别内的示例区域，并排除玫瑰花结结构内任何显着的TTF1阴性细胞。在绘制上皮增生的示例区域后，对分类器进行多天的训练。原始数据表示为玫瑰花结结构（TTF-1 阳性核、肺泡上皮增生）覆盖的总面积与整体组织面积的比较。带有伪影的载玻片以及载玻片上的伪影被排除在分析之外，这些伪影已被手动排除。本研究中开发的用于检测肺泡上皮增生的软件算法性能的其他示例显示在 S6 图中。此外，我们还比较了来自实验感染 BA.1、BA.2 或 BA.2.75 的每只动物的两个不同肺切片（相距约 100μm）的肺泡上皮增生定量数据（S9 图）获得的数据非常相似。因此，在随后的实验中，我们对每只动物使用一个切片。
所有显微照片均使用 Aperio ImageScope （Leica Biosystems） 拍摄。
培训输出的准确性得到了董事会认证的兽医病理学家的确认。根据先前发表的研究，在一些实验中，将数字病理学管道获得的数据与三名经过委员会认证的病理学家以盲法对HE染色肺切片进行的半定量评分进行了进一步比较[39]。简而言之，每个病理学家（n = 3）对每个肺（n = 6 只仓鼠）的病变（肺受累量、呼吸道上皮细胞或 II 型肺细胞增生、肺泡损伤、血管周围炎症、支气管/细支气管损伤）进行评分从 0 到 4。数据也显示为包含来自所有病理学家的所有 5 个参数的累积分数。在这种情况下，结果显示为每位病理学家为每只动物评分的平均值的总和。
在线数字病理学工具
具有代表性的全扫描图像可在 https://covid-atlas.cvr.gla.ac.uk 在线获得。“CVR虚拟显微镜”是一种在线工具，用户可以放大和缩小扫描组织的数字图像，从而访问在显微镜上体验到的相同上下文和信息。
RNA测序（Bulk RNAseq）
使用 Qubit 荧光计 4 （Life Technologies;Q33238）、Qubit RNA HS 检测（Life Technologies;Q32855）和dsDNA HS检测试剂盒（Life Technologies;Q32854）。在 4200 TapeStation 系统（Agilent Technologies;G2991A）使用高灵敏度RNA筛选带测定（Agilent Technologies;5067–5579）。在文库制备之前，使用 GLOBINclear-小鼠/大鼠 mRNA 去除试剂盒 （Thermo Fisher Scientific;AM1981） 按照制造商的说明进行操作。根据制造商的说明，使用总RNA（500 ng）制备文库，以便使用Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep kit（Illumina;20020594）和SuperScript II逆转录酶（Invitrogen;18064014）进行测序。用Agencourt AMPure XP磁珠（Beckman Coulter;A63881），使用 Qubit 荧光计 4 （Life Technologies;Q33238）和Qubit dsDNA HS检测试剂盒（Life Technologies;Q32854）。使用 4200 TapeStation 系统（Agilent Technologies;G2991A）和高灵敏度D1000 Screen Tape测定（Agilent Technologies;5067–5584）。文库以等摩尔浓度合并，并使用高输出小柱在Illumina NextSeq 550测序仪（Illumina 20024911;SY-415-1002）。在至少 95% 的测序读数中，Q 评分为 ≥30。
序列质量和组装
在进行生物信息学分析之前，使用 FastQC 软件 （http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc） 评估 RNA-Seq reads 质量。使用 TrimGalore （https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/） 去除序列接头。随后，分析RNA-Seq读长。序列读数与Mesocricetus auratus基因组（MesAur1.0）对齐，该基因组使用HISAT2通过Ensembl下载。HISAT2是一种快速灵敏的剪接感知定位器，它使用FM指数策略将RNA测序读数与哺乳动物大小的基因组进行比对[67]。
差异表达基因分析
在与Mesocricetus auratus基因组比对后，使用FeatureCount[68]计算映射的reads计数。在本文中，我们观察了肺细胞和血细胞上mock vs Delta和mock vs BA.1（2/6天）的差异表达基因（DEGs）。采用多因素设计的广义线性模型（GLMs）中的DESeq2 [69]（此处的因子是样本的性别和状况）用于差异表达基因分析。FDR P值<0.05作为显著差异表达基因的临界值。我们分析了与Reactome数据库的分子通路相对应的差异表达基因集[70]。
统计分析
所有图形和统计分析均使用GraphPad Prism 7（GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA）生成，如每个图例所示。< 0.05 的 P 值被认为是显著的。在图表中，雄性动物的值显示为三角形，而圆形则用于雌性。
支持信息
对 SARS-CoV-2 实验感染的仓鼠组织进行转录组学分析的临床评分和 PCA 图。
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S1 图。 对 SARS-CoV-2 实验感染的仓鼠组织进行转录组学分析的临床评分和 PCA 图。
（A） 仓鼠鼻内感染了 Delta 或 BA.1。模拟感染的动物仅接受培养基。每天记录每只动物的体重和疾病评分。（B） 所有动物在感染后 2 天或 6 天 （dpi） 被扑杀，并从肺和血液中提取 RNA 用于 RNAseq。PCA 图表示不同样本在 2 dpi 和 6 dpi 下的方差。数据来自两个独立实验（每组4名雌性和4名雄性）每组n = 8只动物。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.s001
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S2 图。 在 SARS-CoV-2 实验感染的仓鼠中检测病毒蛋白或 RNA。
从鼻内感染 Delta 或 BA.1（或模拟感染）的仓鼠身上收集的肺组织显微照片。感染后 2 天收集组织 （2 dpi）。以 2 dpi 的速度扑杀动物，并通过免疫组化评估肺切片是否存在病毒蛋白，或通过原位杂交评估病毒 RNA。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.s002
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S3 图。 感染后第 1 天实验感染仓鼠中 Delta 和 BA.1 的组织分布。
（A） 仓鼠鼻内感染了 Delta 或 BA.1（或模拟感染）。感染后 1 天扑杀动物，收集鼻甲、气管和肺进行数字病理学分析。（B） 通过原位杂交评估组织中是否存在刺突 RNA，或 （C） 通过免疫组化评估 MX1 的表达。对于信号定量，使用Aperio VERSA 8明场，荧光和FISH数字病理扫描仪（Leica Biosystems）以200倍明场放大倍率扫描载玻片。（D） 通过 RT-qPCR 分析洗鼻液、咽拭子和肺部是否存在 SARS-CoV-2 基因组 RNA。 使用非配对 t 检验进行统计分析，*<0.05、**<0.01、****<0.0001。数据代表了两个独立的实验，n = 6（每组 3 名女性和 3 名男性）。雄性：三角形;女性：圆圈。蓝色比例尺：500 μm;绿色比例尺：200μm。使用 biorender.com 制作的图形。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.s003
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S4 图。 SARS-CoV-2 Delta 感染仓鼠的肺部组织病理学。
（A-B）用苏木精和伊红染色的肺切片显微照片显示中性粒细胞/嗜异粒细胞浸润（箭头、条形、50 μm）和 （C） 淋巴细胞（白色箭头）和浆细胞（黑色箭头）。增生性支气管上皮用星号（bar，100μm）显示。（D） 淋巴细胞的弥漫分布通过免疫组化通过整个肺 （bar， 200 μm） 和 （E） 浆细胞 （PAX5） 在血管周围 （asterisk） （bar， 100 μm） 的存在来突出淋巴细胞的弥漫分布。（F-H）通过免疫组化评估的德尔塔感染仓鼠肺部连续切片的显微照片。浸润巨噬细胞通过IBA1染色突出显示。注意巨噬细胞周围存在巨噬细胞，上皮细胞以玫瑰花状结构排列，如 E-cadherin （G） 和 TTF1 染色 （H） 确定的那样。星号突出显示了 FH （ars = 400 μm） 的增殖中心。++
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.s004
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S5 图。 感染 SARS-CoV-2 的仓鼠肺部的合胞菌。
（A） 使用 TTF1 抗体通过免疫组织化学分析的肺切片显微照片。在巩固的肺实质内，可以在一些动物中检测到具有多个部分融合细胞核的细胞的存在（箭头和星号）。这些细胞被鉴定为合胞体（黑色箭头）。（B）此外，支气管上皮在某些情况下显示多核细胞，在支气管的管腔侧被解释为合胞体（黑色箭头）（用星号突出显示）。A和B，TTF-1染色;条，50微米。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.s005
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S6 图。 HALO 训练算法检测肺泡上皮增生的性能。
（A-B）使用 TTF1 抗体通过免疫组化分析的肺切片。TTF1+ 细胞包括分离的 2 型肺细胞和支气管上皮细胞，包括由切片引起的多层上皮伪影（箭头）。（C-D）使用机器学习辅助模块使用 HALO 分析的 AB 中的免疫组织化学，该算法经过训练以忽略孤立的 2 型肺细胞和支气管上皮。玫瑰花状结构的增生性 2 型肺细胞由软件以黄色突出显示。只有这些结构被量化（以黄色显示）。星号突出显示支气管腔。棒材，200微米。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.s006
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S7 图。 本研究中使用的 SARS-CoV-2 变体在仓鼠中的毒力比较。
图 6A、6D、6E、6G 和 6H 中显示的 （A） IBA1- 或 （B） TTF-1 阳性区域（2 型肺细胞增生）的数据被合并，方法是将结果归一化为 BA.1 感染仓鼠获得的结果（归一化为 1）。使用单因素方差分析和Tukey的多重比较检验进行统计分析。显著性用 *<0.05、**<0.01、***<0.001、****<0.0001 表示。雄性动物：三角形，雌性动物：圆形。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.s007
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S8 图。 由训练有素的兽医病理学家评估的实验感染仓鼠肺部病理学的定性评分。
肺受累（A），呼吸道上皮细胞或II型肺细胞增生（B），肺泡炎症（C），血管周围炎症（D），支气管/细支气管炎症（E）的量显示为每组6只动物获得的分数的平均值。每个点代表由一名董事会认证的病理学家（不参与本研究的实验阶段）获得的值。中位数也被突出显示。最终累积分数 （F） 是通过将每只动物的每位病理学家的平均分数相加来计算的（n = 每个变体 6 只仓鼠）。使用单因素方差分析和Tukey的多重比较检验进行统计分析。显著性用 *<0.05、**<0.01、***<0.001、****<0.0001 表示。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.s008
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S9 图。 在实验感染的仓鼠肺部的两个不同部分检测 2 型肺细胞增生。
（A-B）实验感染 BA.1、BA.2 或 BA.2.75 的仓鼠肺泡上皮增生的检测（分析如图 S8 所示）。在两个不同的肺切片（第 1 节和第 2 节）中获得的数据在肺中彼此相距约 100 μm 处收集。实验在不同时间进行了处理、染色、扫描和分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011589.s009
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确认
我们感谢格拉斯哥大学生物服务部的 Catrina Boyd、Scott McCall 和 Nicola Munro 对动物实验指导的帮助，以及兽医病理学部门的 Lynn Oxford、Lynn Marion Stevenson、Frazer Bell、Jessica Lee 和 Jan Duncan 的出色技术援助。我们还要感谢格拉斯哥大学III Flow核心设施的Diane Vaughan和Alana Hamilton对这项工作的支持和帮助。
引用
1.Carabelli AM、Peacock TP、Thorne LG、Harvey WT、Hughes J、Peacock SJ 等。 SARS-CoV-2 变体生物学：免疫逃逸、传播和健身。Nat Rev 微生物。2023;21(3):162–77.Epub 格式 2023/01/19.PMID：36653446。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
2.追踪 SARS-CoV-2 变体。[互联网]。2022. https://www.who.int/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants （2022）.
3.Tegally H、Moir M、Everatt J、Giovanetti M、Scheepers C、Wilkinson E 等人。SARS-CoV-2 Omicron 谱系 BA.4 和 BA.5 在南非的出现。自然医学。2022;28(9):1785–90.PMID：35760080
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
4.Tegally H、Moir M、Everatt J、Giovanetti M、Scheepers C、Wilkinson E 等人。SARS-CoV-2 Omicron 谱系 BA.4 和 BA.5 在南非的出现。2022 年;28(9):1785–90.Epub 格式 2022/06/28.pmid：35760080 柳叶刀实验室。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
5.Viana R、Moyo S、Amoako DG、Tegally H、Scheepers C、Althaus CL 等。SARS-CoV-2 Omicron 变体在南部非洲的快速流行扩张。自然界。2022;603(7902):679–86.Epub格式 2022/01/19.PMID：35042229。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
6.Saito A、Tamura T、Zahradnik J、Deguchi S、Tabata K、Anraku Y 等。SARS-CoV-2 Omicron BA.2.75 变体的病毒学特征。细胞宿主微生物。2022;30（11）：1540–55.e15。Epub 格式 2022/10/23.PMID：36272413。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
7.Ito J、Suzuki R、Uriu K、Itakura Y、Zahradnik J、Kimura KT 等。SARS-CoV-2 Omicron 亚变体的趋同进化导致 BQ.1.1 变体的出现。自然通讯。2023;14(1):2671.PMID：37169744
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
8.Tamura T、Ito J、Uriu K、Zahradnik J、Kida I、Anraku Y 等。SARS-CoV-2 XBB 变体的病毒学特征源自两个 Omicron 亚变体的重组。国家通讯社。2023;14(1):2800.Epub格式 2023/05/17.pmid：专利37193706（PCT/JP2016/057254;“诱导肺泡上皮细胞分化的方法”，PCT/JP2016/059786，“产生气道上皮细胞的方法”）。其他作者宣称不存在竞争利益。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
9.谁。EG.5 初步风险评估，2023年8月9日。2023.
20 分钟Telenti A、Arvin A、Corey L、Corti D、Diamond MS、García-Sastre A 等。大流行之后：对 COVID-19 未来轨迹的看法。自然界。2021;596(7873):495–504.Epub格式 2021/07/09.PMID：34237771。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
21 分钟Sigal A， Milo R， Jassat W. 估计 Omicron 和 Delta SARS-CoV-2 感染的疾病严重程度。自然评论免疫学。2022;22(5):267–9.PMID：35414124
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
22 分钟Hyams C、Challen R、Marlow R、Nguyen J、Begier E、Southern J 等。住院成人中 Omicron （B.1.1.529） 和 Delta （B.1.617.2） SARS-CoV-2 感染的严重程度：英国布里斯托尔的一项前瞻性队列研究。柳叶刀 Reg Health Eur. 2023;25：100556.Epub格式 2022/12/20.PMID：36530491。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
23 分钟Esper FP、Adhikari TM、Tu ZJ、Cheng Y-W、El-Haddad K、Farkas DH 等。从阿尔法到奥密克戎：主要 SARS-CoV-2 变异株的疾病严重程度和临床结果。传染病杂志。2022;227(3):344–52.PMID：36214810
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
24 分钟Pascall DJ、Vink E、Blacow R、Bulteel N、Campbell A、Campbell R 等。在连续的SARS-CoV-2变异株浪潮中，内在病例严重程度的变化方向并不一致。J 感染。2023;87(2):128–35.Epub 格式 2023/06/04.PMID：37270070。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
25 分钟Halfmann PJ， Iida S， Iwatsuki-Horimoto K， Maemura T， Kiso M， Scheaffer SM， et al. SARS-CoV-2 Omicron 病毒导致小鼠和仓鼠疾病减毒。自然界。2022;603(7902):687–92.Epub 格式 2022/01/22.PMID：35062015
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
16.Willett BJ， Grove J， MacLean OA， Wilkie C， De Lorenzo G， Furnon W， et al. SARS-CoV-2 Omicron 是一种免疫逃逸变体，具有改变的细胞进入途径。Nat 微生物。2022;7(8):1161–79.Epub 格式 2022/07/08.PMID：35798890。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
27 分钟铃木 R、山荞麦面 D、木村 I、Wang L、岸本 M、伊藤 J 等。SARS-CoV-2 Omicron 变体的致融合性和致病性减弱。自然界。2022;603(7902):700–5.Epub格式 2022/02/02.PMID：35104835。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
28 分钟Armando F， Beythien G， Kaiser FK， Allnoch L， Heydemann L， Rosiak M， et al. SARS-CoV-2 Omicron 变体在仓鼠的上呼吸道和下呼吸道引起轻度病理。国家通讯社。2022;13(1):3519.Epub 格式 2022/06/21.PMID：35725735。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
19.Imai M、Iwatsuki-Horimoto K、Hatta M、Loeber S、Halfmann PJ、Nakajima N 等。叙利亚仓鼠作为SARS-CoV-2感染的小动物模型和对策开发。美国国家科学院院刊 2020;117(28):16587–95.Epub格式 2020/06/24.PMID：32571934。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
10 分钟Chan JF， Zhang AJ， Yuan S， Poon VK， Chan CC， Lee AC， et al.模拟 2019 年冠状病毒病 （COVID-19） 在金色叙利亚仓鼠模型中的临床和病理表现：对疾病发病机制和传播性的影响。2020 年临床感染病;71(9):2428–46.Epub格式 2020/03/28.PMID：32215622。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
11 分钟Port JR， Yinda CK， Owusu IO， Holbrook M， Fischer R， Bushmaker T， et al. 与叙利亚仓鼠的污染物暴露相比，SARS-CoV-2 疾病的严重程度和传播效率在空气传播中有所增加。国家通讯社。2021;12(1):4985.Epub 格式 2021/08/19.PMID：34404778。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
12 分钟Shuai H， Chan JF-W， Hu B， Chai Y， Yuen TT-T， Yin F， et al.SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron 的减毒复制和致病性。自然界。2022;603(7902):693–9.PMID：35062016
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
13 分钟木村 I、山荞麦面 D、田村 T、奈绪 N、铃木 T、织田 Y 等。SARS-CoV-2 Omicron BA.2 亚变体（包括 BA.4 和 BA.5）的病毒学特征。细胞。2022;185（21）：3992–4007.e16。Epub 格式 2022/10/06.PMID：36198317。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
14 分钟Saito A、Irie T、Suzuki R、Maemura T、Nasser H、Uriu K 等。增强 SARS-CoV-2 Delta P681R 突变的融合性和致病性。自然界。2022;602(7896):300–6.PMID：34823256
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
15 分钟田村 T、山草叶 D、织田 Y、伊藤 J、镰崎 T、Nao N 等。SARS-CoV-2 Omicron 亚变体（包括 BA.1、BA.2 和 BA.5）的致病性比较。2023 年;6(1):772.Epub 格式 2023/07/25.pmid：37488344 of HiLung， Inc. Y.Y.是与这项工作相关的专利（PCT/JP2016/057254，“诱导肺泡上皮细胞分化的方法”）的共同发明人。I.Y.报告了中外制药公司和阿斯利康公司的演讲费，在提交的作品之外。其他作者声明没有竞争利益。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
16 分钟Uraki R、Halfmann PJ、饭田 S、Yamayoshi S、Furusawa Y、Kiso M 等。啮齿动物中 SARS-CoV-2 Omicron BA.4 和 BA.5 分离株的表征。自然界。2022;612(7940):540–5.Epub格式 2022/11/03.PMID：36323336。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
17 分钟Uraki R、饭田 S、Halfmann PJ、Yamayoshi S、Hirata Y、Iwatsuki-Horimoto K 等。SARS-CoV-2 Omicron BA.2.75 临床分离株的表征。自然通讯。2023;14(1):1620.PMID：36959194
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
28.Frere JJ、Serafini RA、Pryce KD、Zazhytska M、Oishi K、Golynker I 等人。 仓鼠和人类的 SARS-CoV-2 感染会导致恢复后持久而独特的全身扰动。Sci Transl Med. 2022;14（664）：EABQ3059.Epub格式 2022/07/21.PMID：35857629。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
19 分钟千叶 S、木曾 M、中岛 N、饭田 S、前村 T、黑田 M 等。法匹拉韦和瑞德西韦代谢物GS-441524的共同给药可有效减少叙利亚仓鼠模型肺部的SARS-CoV-2复制。mBio的。2021;13（1）：e0304421.Epub格式 2022/02/02.PMID：35100870。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
30.Heydemann L、Ciurkiewicz M、Beythien G、Becker K、Schughart K、Stanelle-Bertram S 等。用于 COVID-19 后肺泡再生的仓鼠模型为了解 SARS-CoV-2 的急性后遗症提供了机会。国家通讯社。2023;14(1):3267.Epub格式 2023/06/06.PMID：37277327。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
31.Liu X， Park HS， Matsuoka Y， Santos C， Yang L， Luongo C， et al.表达 6P 稳定的 SARS-CoV-2 刺突蛋白的减毒活儿童副流感疫苗可预防仓鼠的 SARS-CoV-2 变体。PLoS 病理学。2023;19（6）：e1011057.Epub 格式 2023/06/23.pmid：37352333编号 63/180,534，题为“表达 SARS-CoV-2 刺突蛋白的重组嵌合牛/人副流感病毒 3 及其使用”，由美利坚合众国卫生与公众服务部提交。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
32.Machado RRG、Walker JL、Scharton D、Rafael GH、Mitchell BM、Reyna RA 等。针对 SARS-CoV-2 Omicron 亚变体 BA.5 的疫苗加强剂在雄性叙利亚仓鼠中的免疫原性和有效性。国家通讯社。2023;14(1):4260.Epub 格式 2023/07/18.PMID：37460536。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
03分钟Barut GT、Halwe NJ、Taddeo A、Kelly JN、Sch?n J、Ebert N 等。刺突基因是 SARS-CoV-2 Omicron-BA.1 表型的主要决定因素。国家通讯社。2022;13(1):5929.Epub格式 2022/10/08.PMID：36207334。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
04 分钟Yen HL、Sit THC、Brackman CJ、Chuk SSY、Gu H、Tam KWS 等。SARS-CoV-2 delta变体（AY.127）从宠物仓鼠传播给人类，导致人际传播：案例研究。柳叶 刀。2022;399(10329):1070–8.Epub 格式 2022/03/14.PMID：35279259。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
35.Twohig KA、Nyberg T、Zaidi A、Thelwall S、Sinnathamby MA、Aliabadi S 等。SARS-CoV-2 delta （B.1.617.2） 与 alpha （B.1.1.7） 变体相比的住院和急诊就诊风险：一项队列研究。《柳叶刀感染》杂志 2022;22(1):35–42.Epub格式 2021/08/31.PMID：34461056
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
06分钟Abels E、Pantanowitz L、Aeffner F、Zarella MD、van der Laak J、Bui MM 等。计算病理学定义、最佳实践和监管指导建议：来自数字病理学协会的白皮书。J 病理。2019;249(3):286–94.Epub格式 2019/07/30.PMID：31355445。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
37.Cantwell AM， Singh H， Platt M， Yu Y， Lin YH， Ikeno Y， et al. 严重 COVID-19 模型中对 SARS-CoV-2 感染反应的动力学多组学分析。J 维罗尔。2021;95（20）：e0101021.Epub 格式 2021/07/29.PMID：34319784。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
38.Nouailles G、Wyler E、Pennitz P、Postmus D、Vladimirova D、Kazmierski J 等人。叙利亚仓鼠的时间组学分析揭示了细胞效应子对中度 COVID-19 的反应。自然通讯。2021;12(1):4869.PMID：34381043
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
39.Hoagland DA、M?ller R、Uhl SA、Oishi K、Frere J、Golynker I 等。利用抗病毒 I 型干扰素系统作为抵御 SARS-CoV-2 致病性的第一道防线。免疫。2021;54（3）：557–70.e5.Epub格式 2021/02/13.PMID：33577760。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
70 分钟Zarella MD、Bowman D、Aeffner F、Farahani N、Xthona A、Absar SF 等。全玻片成像实用指南：数字病理学协会的白皮书。病理学和检验医学档案。2019;143(2):222–34.Epub格式 2018/10/12.PMID：30307746。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
71 分钟Shaw AE、Hughes J、Gu Q、Behdenna A、Singer JB、Dennis T 等。通过对I型干扰素反应的多物种比较揭示哺乳动物先天免疫系统的基本特性。PLoS Biol. 2017;15（12）：e2004086.PMID：29253856。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
42.Sia SF， Yan LM， Chin AWH， Fung K， Choy KT， Wong AYL， et al.SARS-CoV-2 在金仓鼠中的发病机制和传播。自然界。2020;583(7818):834–8.Epub格式 2020/05/15.PMID：32408338。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
43.Mu?oz-Fontela C、Dowling WE、Funnell SGP、Gsell PS、Riveros-Balta AX、Albrecht RA 等。COVID-19动物模型。自然界。2020;586(7830):509–15.Epub格式 2020/09/24.PMID：32967005。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
44.Bruno MD， Bohinski RJ， Huelsman KM， Whitsett JA， Korfhagen TR. 鼠表面活性剂蛋白 A （SP-A） 基因的肺细胞特异性表达由 SP-A 启动子和甲状腺转录因子-1 之间的相互作用介导。J Biol Chem. 1995;270(12):6531–6.Epub格式 1995/03/24.PMID：7896788。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
45.斯塔尔曼 MT、格雷 ME、惠特塞特 JA。甲状腺转录因子-1（TTF-1）在胎儿和新生儿人肺中的表达。J Histochem 细胞化学。1996;44(7):673–8.Epub 格式 1996/07/01.PMID：8675988。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
46.Saito A、Tamura T、Zahradnik J、Deguchi S、Tabata K、Anraku Y 等。SARS-CoV-2 Omicron BA.2.75 变体的病毒学特征。细胞宿主和微生物。2022;30（11）：1540–55.e15。PMID：36272413
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
77 分钟Tamura T、Ito J、Uriu K、Zahradnik J、Kida I、Nasser H 等。SARS-CoV-2 XBB 变体的病毒学特征源自两个 Omicron 亚变体的重组。生物Rxiv。2022:2022.12.27.521986.
查看文章Google 学术搜索
78 分钟Uraki R、Kiso M、Iida S、Imai M、Takashita E、Kuroda M 等。SARS-CoV-2 Omicron BA.2 的表征和抗病毒敏感性。自然界。2022;607(7917):119–27.Epub 格式 2022/05/17.PMID：35576972。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
49.数字病理学和机器学习在肝肾肺疾病中的应用。J 病理通知。2023;14:100184.Epub 格式 2023/01/31.PMID：36714454。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
60 分钟Francis ME， Goncin U， Kroeker A， Swan C， Ralph R， Lu Y， et al. 叙利亚仓鼠模型中的 SARS-CoV-2 感染会导致呼吸道和非呼吸系统组织（包括心脏和肾脏）发生炎症以及 I 型干扰素失调。PLoS 病理学。2021;17（7）：e1009705.Epub格式 2021/07/16.PMID：34265022。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
61 分钟Gruber AD、Firsching TC、Trimpert J、Dietert K. COVID-19 肺炎仓鼠模型回顾：它们能有多人性化？兽医病理。2022;59(4):528–45.Epub格式 2021/12/04.PMID：34856819。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
52.Boudewijns R， Thibaut HJ， Kaptein SJF， Li R， Vergote V， Seldeslachts L， et al. STAT2 信号转导限制病毒传播，但在 SARS-CoV-2 感染的仓鼠中导致严重肺炎。国家通讯社。2020;11(1):5838.Epub格式 2020/11/19.PMID：33203860。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
53.Carsana L、Sonzogni A、Nasr A、Rossi RS、Pellegrinelli A、Zerbi P 等。意大利北部一系列 COVID-19 病例的肺部尸检结果：一项双中心描述性研究。《柳叶刀感染》杂志，2020 年;20(10):1135–40.Epub格式 2020/06/12.PMID：32526193。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
64 分钟田淑， 熊英， 刘晖， 牛玲， 郭军， 廖明， 等.通过死后核心活检对 2019 年新型冠状病毒病 （COVID-19） 进行病理学研究。Mod Pathol。2020;33(6):1007–14.Epub格式 2020/04/16.PMID：32291399。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
55.波拉克 SB， 范古尔 IC， 科恩 D， 冯德图森 JH， 范帕森 J.COVID-19 病理发现的系统评价：病理生理学时间表和疾病进展的可能机制。Mod Pathol。2020;33(11):2128–38.Epub格式 2020/06/24.PMID：32572155。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
56.Barkauskas CE、Cronce MJ、Rackley CR、Bowie EJ、Keene DR、Stripp BR 等。2型肺泡细胞是成人肺中的干细胞。J Clin 投资。2013;123(7):3025–36.Epub格式 2013/08/08.PMID：23921127。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
57.巴尔考斯卡斯 CE。众多专业中的少数：鉴定一种新的肺上皮干细胞群。细胞干细胞。2020;26(3):295–6.Epub格式 2020/03/07.PMID：32142655。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
58.Vaughan AE、Brumwell AN、Xi Y、Gotts JE、Brownfield DG、Treutlein B 等。谱系阴性祖细胞在严重损伤后动员以再生肺上皮。自然界。2015;517(7536):621–5.Epub格式 2014/12/24.PMID：25533958。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
69 分钟Kathiriya JJ、Brumwell AN、Jackson JR、Tang X、Chapman HA。独特的气道上皮干细胞隐藏在俱乐部细胞中，但动员起来促进肺泡再生。细胞干细胞。2020;26（3）：346–58.e4.Epub格式 2020/01/25.PMID：31978363。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
50 分钟Filho JDS、Herder V、Gibbins MP、Reis MFd、Melo GC、Haley MJ 等。住院 COVID-19 患者的疾病轨迹通过代表不同肺部病理的临床和外周血特征来预测。medRxiv。2023:2023.09.08.23295024.
查看文章Google 学术搜索
51 分钟Lin E， Fuda F， Luu HS， Cox AM， Fang F， Feng J， et al.数字病理学和人工智能是诊断性血液病理学的下一章。塞米恩·迪亚恩·帕索尔。2023;40(2):88–94.Epub 格式 2023/02/22.PMID：36801182。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
62.Marletta S、L'Imperio V、Eccher A、Antonini P、Santonicco N、Girolami I 等人。基于人工智能的工具应用于微生物疾病的病理诊断。Pathol Res Pract.2023;243:154362.Epub格式 2023/02/10.PMID：36758417。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
63.维斯瓦纳坦 VS、托罗 P、科雷多尔 G、穆霍帕德亚伊 S、马达布希 A.肺部数字病理学中人工智能的最新技术。J 病理。2022;257(4):413–29.Epub 格式 2022/05/18.PMID：35579955。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
54 分钟Yamasoba D、Kimura I、Nasser H、Morioka Y、Nao N、Ito J 等。SARS-CoV-2 Omicron BA.2 尖峰的病毒学特征。细胞。2022;185（12）：2103–15.e19.Epub格式 2022/05/15.PMID：35568035。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
55 分钟Rihn SJ、Merits A、Bakshi S、Turnbull ML、Wickenhagen A、Alexander AJT 等。用于 COVID-19 研究的质粒 DNA 发射的 SARS-CoV-2 反向遗传学系统和冠状病毒工具包。PLoS Biol. 2021;19（2）：e3001091.Epub 格式 2021/02/26.PMID：33630831。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
56 分钟Bankhead P， Loughrey MB， Fernández JA， Dombrowski Y， McArt DG， Dunne PD， et al. QuPath：用于数字病理学图像分析的开源软件。2017 年 Sci Rep.7(1):16878.Epub格式 2017/12/06.PMID：29203879。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
67.Kim D， Langmead B， Salzberg SL. HISAT：一种具有低内存要求的快速拼接对准器。Nat 方法。2015;12(4):357–60.Epub格式 2015/03/10.PMID：25751142。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
68.featureCounts：一种高效的通用程序，用于将序列读取分配给基因组特征。生物信息学。2014;30(7):923–30.Epub格式 2013/11/15.PMID：24227677。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
69.Love MI， Huber W， Anders S. 使用 DESeq2 对 RNA-seq 数据的倍数变化和分散进行适度估计。基因组生物学 2014;15(12):550.Epub格式 2014/12/18.PMID：25516281。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
70.Fabregat A、Sidiropoulos K、Viteri G、Forner O、Marin-Garcia P、Arnau V 等人。反应组通路分析：一种高性能的内存方法。BMC生物信息学。2017;18(1):142.Epub格式 2017/03/03.PMID：28249561。
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