免费医学论文发表-细胞诱导的P损伤。恶性疟原虫感染的红细胞需要配体特异性识别，并释放寄生虫液泡，在免疫 IgG 存在下被单核细胞吞噬

抽象

自然杀伤 （NK） 细胞裂解病毒感染的细胞，并通过将裂解效应分子极化递送至靶细胞中来转化细胞。我们已经证明，NK细胞通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）裂解恶性疟原虫感染的红细胞（iRBC）。在长期暴露于疟疾传播的人群中，高频率的适应性NK细胞和内在ADCC活性升高与寄生虫血症减少和对疾病的抵抗力有关。NK细胞如何与iRBC结合以及NK细胞裂解iRBC的结果尚未得到研究。我们在诱导型红细胞前体中应用基因消融和 iRBC 抗体阻断实验，以证明 CD58 和 ICAM-4 作为配体分别通过 CD2 和整合素 αMβ2 粘附 NK 细胞的核心作用。粘附取决于 IgG 对 iRBC 的调理作用。NK介导的ADCC对iRBC的活体成像和定量流式细胞术显示，iRBC质膜损伤先于P损伤。寄生液泡 （PV） 内的恶性疟原虫。PV 被识别并用 P 进行跟踪。表达用 GFP 标记的 PV 膜相关蛋白 EXP2 的恶性疟原虫菌株。在NK介导的ADCC之后，PV要么在iRBC幽灵中被发现，要么完整地释放，没有红细胞质膜。ADCC培养物的电子显微镜图像显示，通过细胞分选从iRBC裂解物中分离出紧密的NK-iRBC突触和大小与GFP PV相似的游离囊泡。结合 PV 的疟疾暴露个体血浆中 IgG 滴度比结合 iRBC 的 IgG 高两个数量级。这种免疫 IgG 刺激原代单核细胞对 PV 的有效吞噬作用。NK介导的对iRBC的选择性损伤，导致PV的释放，以及随后单核细胞对PV的吞噬作用，可能结合在一起，有效杀伤和去除红细胞内P。恶性寄生虫。这种机制可以减轻血液P期的炎症和疟疾症状。恶性疟原虫感染。+

作者摘要

寄生虫恶性疟原虫是疟疾的主要因素，每年造成60多万人死亡，主要是幼儿。为了控制疾病，了解暴露于疟疾的人群的临床免疫力如何发展至关重要。在反复暴露于疟疾期间获得的抗体足以预防疾病。保护机制之一是自然杀伤 （NK） 细胞（一种白细胞）对寄生虫感染的红细胞 （RBC） 的抗体依赖性杀伤。在这里，我们展示了NK细胞如何检测并结合寄生虫感染的红细胞并破坏红细胞质膜。我们鉴定了两种独立的NK细胞受体，它们仅促进与感染红细胞的稳定相互作用，并鉴定了这些受体在红细胞上识别的两种蛋白质。通过活体成像捕获NK细胞与感染红细胞之间的相互作用，这表明NK介导的对感染红细胞膜的选择性损伤之后是含有寄生虫的囊泡（“寄生液泡”或PV）的释放。PV 很容易被来自疟疾暴露个体的抗体检测到，并刺激单核细胞通过吞噬作用吞噬 PV。这项研究深入了解了NK细胞活性如何有助于减少寄生虫负荷并促进疟疾流行地区人群的疟疾抵抗力。

数字

Fig 7Fig 8图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8图1图2图3

引文： Sekar P， Rajagopalan S， Shabani E， Kanjee U， Schureck MA， Arora G， et al. （2023） NK 细胞诱导的 P 损伤。恶性疟原虫感染的红细胞需要配体特异性识别，并释放寄生虫液泡，在免疫 IgG 存在下被单核细胞吞噬。PLoS 病理学 19（11）： e1011585 中。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011585

编辑 器： James G. Beeson，澳大利亚伯内特研究所

收到： 2023年7月28日;接受： 2023年10月24日;发表： 11月 8， 2023

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数据可用性： 所有相关数据都在论文和支持信息文件中。

资金： 美国国立卫生研究院 （NIH） 国家过敏和传染病研究所的研究得到了校内研究部资助AI001238（SAD 和 EOL）的支持。哈佛大学陈曾熙公共卫生学院的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）拨款5R01HL139337-04和5R01AI140751-05的支持，其中包括工资（MTD）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。

介绍

疟疾仍然是一种毁灭性的疾病，严重和致命的病例主要发生在幼儿身上。恶性疟原虫（P.f.） 是导致疟疾死亡最多的寄生虫，由以人类血液为食的蚊子传播。可用于治疗和保护暴露于疟疾传播的人的药物和疫苗要么不够有效，要么负担不起，无法消除这种疾病。在疟疾流行地区，大多数患者在疟疾流行地区反复暴露于疟疾传播，人体免疫系统赋予其临床免疫力（即无症状感染）[1]。了解这种免疫力如何发展并通过限制 P 提供保护。F.诱导炎症，同时保持对寄生虫复制的控制可以转化为更好的治疗方法和疫苗。

来自临床免疫个体的IgG足以预防疟疾[2]。IgG 对血液阶段的不同靶点具有特异性，例如 P。裂殖子镰刀菌和受感染的红细胞可以通过中和阻断红细胞侵袭、激活补体系统杀死裂殖子、结合Fcγ受体激活髓样细胞和中性粒细胞的吞噬作用以及FcγRIIIA（CD16）触发NK细胞介导的抗体（ab）依赖性细胞毒性（ADCC）来提供保护[3\u20127]。除了阻止或禁用 P.F.在血液阶段，保护的另一个要求是控制炎症。当炎症得不到控制时，就会发生严重的疟疾病例，这可能导致脑型疟疾。P的调节。F.诱导的炎症可能有助于预防疟疾症状[8–11]。事实上，在外周血单个核细胞中观察到的表观遗传变化表明，感染个体的髓系细胞中发生的表观遗传变化与保护作用的相关性最强[12]。

NK细胞毒性的常规靶点是肿瘤细胞、病毒感染细胞和活化的T细胞，它们通过多种配体-受体相互作用被识别[13,14]。为了弥补抗原特异性受体的不足，NK细胞具有共激活受体库，可检测不同的配体并发挥协同对的作用[15]。Fc受体CD16是个例外，它通过IgG的Fc片段的多价结合而发出ADCC信号[16]。NK细胞对靶细胞的裂解是一个多步骤的过程，从最初的接触开始，发展到强粘附和免疫突触的形成[17]。整合素αLβ2（CD11a/CD18，LFA-1）是NK细胞的主要粘附受体。NK共激活受体的由内而外的信号[18]进一步增强了粘附性[19]。αLβ2与其配体ICAM-1的结合足以诱导信号，促进NK细胞向靶细胞的粘附和极化[20]。细胞核移动到细胞后部，而中心体和相关的裂解颗粒则与靶细胞一起向突触移动[17]。该信号不会引起脱颗粒。脱颗粒是由成对的共激活受体或CD16触发的，与极化无关[21]。当诱导粘附/极化和脱颗粒的信号通路时，极化脱颗粒将裂解效应分子（如穿孔素、颗粒酶和颗粒溶菌素）递送至靶细胞中[22]。在有核靶细胞中，这些分子通过核凝聚和线粒体去极化诱导细胞凋亡。由于红细胞缺乏细胞核和线粒体，目前尚不清楚NK细胞如何裂解它们。

NK细胞的天然细胞毒性独立于IgG触发，并通过多种信号通路发生，具体取决于靶细胞上与配体结合的共激活受体的组合[21,23]。例如，NKG2D（KLRK1，CD314）与应激诱导的配体结合，与CD48（SLAMF2）结合的2B4（CD244，SLAMF4）协同作用。CD58 （LFA-3） 在红细胞上表达，是人类受体 CD2 的配体。CD2信号转导与基于免疫受体酪氨酸的激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif， ITAM）介导的信号协同作用，例如CD16触发的信号[21,24,25]。

我们已经报道，NK细胞选择性地裂解IgG包被的iRBC，而不会引起未感染红细胞的旁观者裂解，并在体外抑制寄生虫生长和传递到新鲜红细胞中[6]。为了直接比较iRBC与未感染RBC与NK细胞的相互作用，我们使用了多克隆抗RBC兔IgG。对离体NK细胞的研究表明，暴露于疟疾的个体具有高比例的适应性NK细胞，适应性NK细胞的ADCC活性增强与寄生虫血症减少和对疟疾的抵抗力有关[26,27]。适应性NK细胞的一个亚群，其特征是CD56（NCAM1）缺失，抑制性受体LAG3（CD223）和LILRB1（CD85j）表达较高，与随后一年寄生虫血症减少和预防疟疾症状相关[27]。

本研究的目的是确定NK细胞如何介导iRBC的抗体依赖性裂解，并进一步研究NK细胞介导的裂解后iRBC和寄生虫的命运。NK细胞识别感染红细胞上的哪些分子，激活了什么样的反应？红细胞内P的命运是什么？f. 寄生虫 当 iRBC 受到 NK 细胞攻击时？在这里，我们确定了两种独立的受体-配体相互作用，它们有助于稳定的NK-iRBC粘附，并报告说，iRBC质膜的初始损伤之后是幽灵iRBC释放寄生液泡（PV）。此外，在存在来自对疟疾有抵抗力的个体的人类 IgG 的情况下，这些 PV 通过吞噬作用被单核细胞清除。

结果

NK细胞优先粘附在P上。f.感染的红细胞，并通过ADCC选择性裂解它们

由于与靶细胞的紧密粘附是NK细胞穿孔素和颗粒酶依赖性裂解的先决条件，因此我们研究了原代人NK细胞与P之间的偶联物形成。f.感染的红细胞（iRBC）。与未感染或iRBC孵育20分钟或40分钟后，对NK细胞[28]进行双色流式细胞术粘附测定。在没有多克隆抗红细胞兔IgG的情况下，它与未感染的和iRBC的结合同样好（S1图），并通过与FcγRIIIA（CD16）的结合激活NK细胞，未感染或iRBC的粘附很少（图1A）。NK细胞与有核靶细胞的粘附通常与CD16信号无关[16]，主要由整合素αLβ2介导。相比之下，NK细胞仅在存在抗红细胞IgG的情况下粘附在iRBC上（图1A），这表明来自CD16的信号提供了强粘附所需的由内而外的信号。值得注意的是，即使在存在抗红细胞IgG的情况下，NK细胞也能区分未感染和iRBC（图1A）。在多个实验中观察到对 IgG 与 iRBC 粘附的依赖性（图 1B），在 IgG 存在下，未感染和 iRBC 的偶联物形成也存在明显差异（图 1C）。NK细胞与iRBC的强粘附与通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）有效裂解iRBC一致[6]。

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图 1. P上的配体。六.-NK细胞识别所需的感染红细胞。

(A）NK细胞与未感染的红细胞（未感染的红细胞）或P之间的结合物形成。f.感染的红细胞（iRBC），在抗红细胞IgG不存在（开放符号）或存在（填充符号）的情况下。NK 细胞用 Cell Tracker Green 标记，RBC 用 eFluor 670 标记。在指定的时间之后，通过流式细胞术通过对双阳性 NK-RBC 偶联物进行门控来评估偶联物。（B） 在存在或不存在抗红细胞 IgG 的情况下，NK 细胞和红细胞（未感染的红细胞和 iRBC）之间在 40 分钟时以 1：1 的比例形成相对偶联物。每种颜色代表一个捐赠者。为了比较来自三个不同供体的NK细胞的独立实验，在IgG存在下与iRBC的偶联物设置为1。（C） 在抗红细胞 IgG 存在下，NK 细胞和红细胞（未感染的红细胞：开放圆圈;iRBC：填充圆圈）之间的结合物形成。图中显示了来自不同供体的NK细胞的七个独立实验。均值的标准误差：**** p < 0.0001 通过单因素方差分析，然后进行 Tukey 的多重比较检验。（D） P孵育后释放的血红蛋白（Hb）。六.-iRBC 与 NK 细胞在抗 RBC IgG 和针对指示的 NK 粘附受体的阻断抗体存在下以 E：T 比为 2 放置 1 小时。对照是在没有封闭抗体的情况下释放的Hb，通过ELISA测定法测量释放的Hb。展示了一个具有代表性的实验。（E） 阻断 Abs 对 NK 粘附受体的影响，在与 NK 细胞孵育期间，iRBC 释放的 Hb 的影响如 （D） 所述，在 5 个与不同人类献血者的独立实验中。（F） 相同阻断抗体对红系 EJ-Cas9 细胞释放的 Hb 的影响，在 （D） 中进行的测定中，并在 5 个独立实验中对来自不同人类供体的 NK 细胞进行了测试。（G） EJ 细胞在抗红细胞 IgG 存在下与 NK 细胞孵育期间释放的 Hb。对照组为单独转染Cas9的EJ细胞，与CRISPR-Cas9独立敲除ICAM4和CD58基因的EJ细胞进行比较。展示了一个具有代表性的实验。（H） 对来自不同供体的 NK 细胞进行五次独立实验，如 （G） 所示，使用 EJ-Cas9 细胞、EJ-ICAM4-KO 和 EJ-CD58-KO 细胞进行。为了比较单独的实验，将 EJ-Cas9 细胞在 IgG 存在下释放的 Hb 设置为 1。（I） 在五个独立实验中，针对 NK 粘附受体的阻断抗体对 EJ-ICAM4-KO 细胞释放的 Hb 的影响，如 （H） 中，使用来自不同供体的 NK 细胞。（J） 在与（I）相同的测定中，相同的阻断抗体对EJ-CD58-KO细胞释放的Hb的影响，以及来自5个不同人类供体的NK细胞：P值（双尾）* p < 0.05，**** p < 0.0001，通过一个假设值为 1 的样本 t 检验。

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NK细胞上的主要粘附受体整合素αLβ2与细胞间粘附分子（ICAM）-1、-2和-3结合，这些分子均未在人红细胞上表达。ICAM-4，也称为Landsteiner-Wiener（LW）血型抗原，是ICAM家族的一个分支成员，在红系细胞中选择性表达，是红细胞岛形成所必需的[29]。相互矛盾的研究报道了ICAM-4与整合素αMβ2（CD11b/CD18，Mac-1）[30]或整合素α4β1（CD49d/CD29，VLA-4）[31]的结合。红细胞还表达 CD58 （LFA-3），它是人 T 细胞和 NK 细胞上 CD2 的主要配体。为了确定 iRBC 和 NK 细胞之间可能发生哪些配体-受体相互作用，我们使用了一组已知可阻断受体与其配体结合的单克隆抗体 （mAb）。在 iRBC 的 NK 依赖性裂解功能测定中测试了整合素亚基 αL （CD11a）、αM （CD11b）、β2 （CD18） 和 α4 （CD49d） 以及 CD2 的单克隆抗体。我们测量了在与NK细胞孵育期间，在存在抗RBC IgG且存在或不存在阻断抗体的情况下从iRBC释放的血红蛋白（Hb）（图1D）。CD11a和CD49d Abs对Hb释放没有影响，而CD11b、CD18和CD2抗体抑制Hb释放（图1D和1E），这与一项显示ICAM-4与αMβ2结合的研究一致[30]。Abs 与 CD2 和 CD11b 或 CD2 和 CD18 的组合导致 Hb 释放的更大抑制。这些结果表明，在ADCC测定中，CD2和整合素αMβ2，而不是整合素αLβ2或α4有助于NK细胞对iRBC的裂解。

红细胞上的 ICAM-4 和 CD58 是 NK 细胞识别所必需的

为了获得ICAM-4和CD58在NK细胞裂解iRBC中的作用的更直接证据，我们转向了遗传学方法。诱导型红细胞前体（例如分化为去核红细胞的EJ细胞）中的基因消融一直是鉴定P介导红细胞侵袭的分子的有力工具。裂殖子镰刀菌[32\u201233]。首先，我们评估了分化的EJ细胞是否可以用作模型，通过对NK细胞进行ADCC测定来研究NK-RBC相互作用。由于在抗红细胞IgG存在下观察到NK细胞对EJ细胞的强烈裂解，与iRBC相当，因此我们进行了与iRBC相同的抗体阻断实验（图1E）。通过Hb释放测量的EJ细胞裂解被CD2抗体抑制，但没有其他抗体抑制（图1F）。因此，与iRBC相比，分化EJ细胞的裂解对αMβ2的阻断不敏感，对CD2的阻断更敏感（图1E和1F）。

接下来，我们测试了 ICAM4 和 CD58 被 CRISPR-Cas9 单独敲除的 EJ 细胞（S1 图）。ICAM4-KO 和 CD58-KO 细胞以及亲本 Cas9 转染细胞在抗红细胞 IgG 存在下与 NK 细胞一起孵育。Hb释放试验显示NK细胞裂解这两种KO细胞系的能力降低（图1G）。在多个实验中，ICAM4-KO细胞的裂解率约为70%，CD58-KO的裂解率为亲本EJ-Cas9细胞的50%（图1H）。这与NK受体对两种配体的识别以及Abs对CD11b和CD18的不完全阻断一致。为了进一步研究 ICAM-4 和 CD58 在 NK 细胞识别 EJ 细胞中的作用并验证抗体的特异性，我们进行了抗体阻断实验。正如预期的那样，CD2 抗体抑制了 ICAM4-KO 细胞的裂解，但 CD11b 或 CD18 抗体不抑制 ICAM4-KO 细胞的裂解（图 1I）。相反，CD2 抗体对 CD58-KO EJ 细胞的裂解没有影响（图 1J），提供了 CD2 抗体特异性的证据。此外，NK细胞与CD58-KO EJ细胞之间CD2-CD58相互作用的缺失揭示了ICAM-4的贡献，因为Abs确实对αM和β2发生了抑制，但对αL或α4整合素亚基没有抑制（图1J）。该实验还证实了整合素αMβ2抗体的特异性，因为它们在缺乏ICAM-4配体的情况下不会引起抑制（图1I）。当相对于 EJ-Cas9 细胞进行测量时，ICAM4-KO EJ 细胞在 Ab 到 CD2 存在下的残留裂解率下降到 32%，在 Abs 存在下 CD58-KO EJ 细胞对 αMβ2 的残留裂解率下降到 EJ-Cas9 细胞裂解率的 42%。残留裂解可能是由于 Abs 的抑制不完全或红细胞上存在有助于 NK 细胞识别的其他配体。EJ 细胞中 ICAM-4 和 CD58 的基因消融已经确定了这两种配体在 NK 细胞识别红细胞以及两者的抗体阻断实验中的作用。f.感染的红细胞和EJ细胞与CD2对CD58的识别和整合素αMβ2对ICAM-4的识别明显一致。

对 P 的损害。NK细胞介导的ADCC期间的恶性疟原虫在红细胞质膜完整性丧失后发生

已有报道称，人NK细胞通过ADCC高效、选择性地裂解iRBC[6]。作为 iRBC 和红细胞内 P 的命运。f.寄生虫在NK介导的裂解中尚不清楚，我们开发了定量测定法来检查iRBC和寄生虫的完整性。将 eFluor 670 染色的 iRBC 设门为糖蛋白 A+ LFA-1 阴性细胞（图 2A 和 S2A）。鬼笔环肽AF405（图2B）检测到其质膜损伤，其进入渗透性iRBC并结合F-肌动蛋白[34]。iRBC 用膜染料 PKH26 预染色（图 2B）。用碘化丙啶 （PI） 监测寄生虫的完整性，PI 对失去核膜完整性的细胞中的 DNA 进行染色。将富含滋养体的红细胞与新鲜分离的原代人NK细胞孵育后，检测到鬼笔环肽AF405 + iRBC（图2B和S2）。PKH26+ 鬼笔环肽阴性是完整的 iRBC，鬼笔环肽的外周染色鉴定出鬼 iRBC，它看起来是半透明的，但在 DIC 图像中是色素（图 2B）。在没有NK细胞的情况下，只有少数iRBC对鬼笔环肽具有渗透性（图2C，2D和S2）。鬼笔环肽渗透性iRBC的比例随着时间和IgG浓度的增加而增加（图2C和2D）。一小部分 iRBC 成为 PI+（图 2C 和 2E）。几乎所有的PI+ iRBC也是鬼笔环肽渗透性的（图2C），这意味着iRBC质膜完整性的丧失对寄生虫的损害。多个实验的定量分析表明，43.5%±5.4%（P <0.0001）的iRBC是鬼笔环肽渗透性的，13.5%±1.6%（P = 0.0443）是PI+（图2F），相当于31%的鬼笔环肽+部分。

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图 2. 对 P 的连续损坏。f.感染的红细胞和NK依赖性ADCC期间的寄生虫。

(A） 鉴定原代 NK 细胞和 3D7 P 的门控策略。f.-iRBC 以 3：1 的比例混合。iRBC 用 eFluor 670 预先标记。与 NK 细胞孵育后，将 iRBC 用 Ab to glycophorin A （CD235a PE-Cy7） 染色，NK 细胞用 Ab 染色至 integrin LFA-1 （FITC）。（B） 用膜染料 PKH26（黄色）和伯胺染料 eFluor 670（红色）染色并与 NK 细胞在 F-肌动蛋白结合鬼笔环肽-AF405（蓝色）存在下孵育 3 小时的 iRBC 的免疫荧光图像。DIC 图像显示了完整的 iRBC（左）和半透明的重影 iRBC（右）。可见两个未染色的NK细胞（顶部和底部）。（C） NK 细胞和 iRBC 以 3：1 的比例在抗红细胞 IgG 存在下孵育长达 3 小时，如图所示。用鬼笔环肽 AF405 检测受损的 iRBC，用碘化丙啶 （PI） 的 DNA 结合鉴定受损的寄生虫。结果代表了七个实验。（D） 鬼笔环肽染色检测到对 iRBC 的时间、抗体和 NK 依赖性损伤。左图显示了无抗体（-）、单独抗体（IgG）或单独NK细胞（NK）孵育的对照iRBC。（E） NK依赖性寄生虫损伤通过PI染色确定。左侧面板中的控件如 （D） 中所述。（F） 来自不同供体的 NK 细胞进行的 7 次独立实验的数据，如 D 和 E 所示，显示为 iRBC 成为鬼笔环肽-AF405+ 的比例，以及检测到为鬼笔环肽和 PI 双阳性事件的红细胞内寄生虫损伤的比例（较暗的阴影）。将样品在存在 （+） 或不存在 （-） NK 细胞和 2 μg/ml 抗红细胞 IgG 的情况下孵育 3 小时。均值的标准误差：* p < 0.05，**** p < 0.0001，通过单因素方差分析，然后进行 Tukey 的多重比较检验。（G） 在 1 μg/ml IgG 存在下与 NK 细胞孵育后，用 iRBC 进行颗粒酶 B 报告基因测定。在分析之前，NK-iRBC偶联物被添加5mM EDTA破坏。使用流式细胞仪上的前向散射参数 （FSC >600） 对残留偶联物进行设门。将 eFluor 670 标记的 iRBC 与原代 NK 细胞在存在或不存在 IgG 的情况下在 37°C 下混合 1 小时。 然后向细胞中加入颗粒酶B底物，并通过流式细胞术定量eFluor670+颗粒酶B+ iRBC。填充符号代表来自三个单独供体的NK细胞的独立实验。开放符号表示在没有 IgG 的情况下孵育的样品。

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颗粒酶报告基因测定法用于检测 NK-iRBC 接触是否导致颗粒酶极化递送至 iRBC 靶标。为了消除可能从NK细胞发出的颗粒酶活性的检测，在添加颗粒酶报告基因之前，将NK-iRBC偶联物与EDTA解离。在 IgG 存在下与 NK 细胞孵育 1 小时后，在 iRBC 中检测到颗粒酶 B 活性，并且信号以较高的 NK 与 iRBC 比率增加（图 2G）。这种报告基因检测的一个好处是它忽略了iRBC的自发裂解。事实上，在没有NK细胞或抗RBC IgG的情况下，背景信号可以忽略不计（图2G）。该实验提供了强有力的证据，证明 iRBC 在偶联物形成时通过裂解效应分子的极化释放被 NK 细胞裂解。

迄今为止描述的实验提供了NK细胞在ADCC期间对iRBC和细胞内寄生虫造成的损害的定量信息。然而，他们没有区分单一的、连续的途径（寄生虫损伤之前的iRBC损伤）或两种途径，一种单独导致iRBC损伤，另一种导致iRBC和寄生虫同时损伤。进行实时成像实验以检查单个细胞随时间的变化。原代NK细胞和iRBC分别用eFluor 450和eFluor 670染色，并以3个iRBC与1个NK细胞的比例共同孵育。在孵育过程中存在 PI 和抗红细胞 IgG，并在温控室中以每分钟一帧的速度采集图像 5 小时。来自电影（S1 Movie）的单帧显示一个运动的NK细胞遇到iRBC并形成一个紧密的突触，8分钟后出现PI信号（图3A）。在这种情况下，无法确定幽灵细胞的形成，因为NK细胞在3分钟时覆盖了iRBC。

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图 3. 与NK细胞一起孵育的iRBC的活体成像。

(A、B）在 2 μg/ml 抗红细胞 IgG 存在下，eFluor 450 染色的原代 NK 细胞（蓝色）与 eFluor 670 染色的 iRBC（红色）以 3：1 的比例孵育。PI是在图像记录开始时添加的。每个面板中的数字表示相对于第一个 NK-iRBC 触点（设置为分钟 0）的时间（以分钟为单位）。效应NK细胞在第一帧中用星号标记，iRBC靶标用T标记。PI阳性寄生虫的首次出现用黄色箭头标记。（A） 显示了跨越 11 分钟的六个时间范围，（B） 显示了跨越 159 分钟的八个时间范围。比例尺代表 10 μM。

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第二个例子（图3B）显示了一个较慢的事件，其步骤界限明确：NK细胞在与iRBC相遇后保持静止近一个小时，然后建立承诺的突触（55分钟）并被激活（S2电影）。25 分钟后，iRBC 靶标变成了幽灵，正如 eFluor 670 丢失所检测到的那样，18 分钟后变成了 PI+（图 3B）。NK细胞大多附着在受损的iRBC上（图3B和S3）。下一个例子是连环杀手NK细胞，它破坏了三个独立的P。f. 第一次接触 iRBC 后 16 分钟，以及接触另外两个 iRBC 后 18 分钟和 36 分钟不同 iRBC 中的寄生虫（S3 图，S3 电影）。 NK细胞最初是通过与含有PI阴性寄生虫的幽灵细胞接触而被激活的。幽灵 iRBC 中的 PV 在与 NK 细胞接触 3 分钟后变为 PI+（S3 图）。我们的研究结果清楚地支持了 NK 依赖性损伤 iRBC 先于 P 损伤的顺序通路模型。f.在寄生液泡内。长时间（例如S3图，S3电影中的>67分钟）容纳PI阴性PV的游离幽灵iRBC（即不与NK细胞接触）很常见，这表明NK细胞加速了对P的损伤。 f. 在幽灵 iRBC 内部。

P.的发布。f. NK细胞介导的ADCC从iRBC中提取寄生液泡

为了获得更高分辨率的NK-iRBC突触图像，并更详细地检查ADCC期间NK细胞造成的损伤，使用与iRBC一起孵育3小时的NK细胞的固定样品在2μg/ ml抗RBC IgG存在下进行透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。通过透射电镜，看似完整的 iRBC 显示 PV 中的晚期寄生虫，包括质膜上的特征性旋钮和消化液泡中的血裂素晶体（图 4A）。第二张透射电镜图像显示了一个质膜塌陷的iRBC重影，其表面保留了旋钮（图4A）。PV 的完整性似乎受到了损害。相比之下，即使在 IgG 存在的情况下，未感染的红细胞也不会与 NK 细胞相互作用（S4 图）。在较低放大倍率下拍摄的一个例子显示，单个受损的 iRBC 参与两个突触，两侧都有极化良好的 NK 细胞（S4 图）。其中一个NK细胞也参与第二个突触，iRBC明显受损。

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图 4. iRBC 和 NK 细胞共培养的电子显微镜图像。

(A） NK 细胞和 iRBC 在 2 μg/ml 抗 RBC IgG 存在下以 5：1 的比例重温 3 小时。将样品固定并准备用于透射电镜分析。第一张图显示了一个明显完整的晚期滋养体，具有边界清晰的 iRBC 质膜和寄生液泡膜 （PVM）。第二个面板显示了一个包含 PV 的 iRBC 鬼细胞。iRBC质膜的特征性旋钮在完整膜和幽灵膜（箭头）上可见。比例尺为 2 μm。（B） 如（A）所述，在共孵后通过SEM成像的NK-iRBC偶联物。NK-iRBC 偶联物对 iRBC 膜的表观损伤增加的示例从左到右显示。在第一个面板中，与NK细胞接触的iRBC仍然是僵硬和多节的，表明它相对完整。相反，与NK细胞广泛接触的圆形光滑iRBC（中）表明细胞骨架结构丢失，圆形且明显穿孔的iRBC膜（右）表明它是幽灵iRBC（右）。每个panel包括第二个NK细胞，不参与与iRBC的接触。比例尺为 5 μm。（C） 在没有 IgG 的情况下共孵育后 NK 细胞和 iRBC 的低倍 SEM 图像（左图）显示 NK 细胞和 iRBC 看起来基本完整。在存在 IgG 的情况下共培养后拍摄的类似框架（右图）更具异质性，包括比 NK 细胞或 iRBC（白色箭头）小的囊泡。这种囊泡的直径，包括任何至少1.5μm宽的囊泡，平均直径为2.23μm（SD 0.46μm，n = 12）。比例尺为 50 μm。（D） NK细胞介导的iRBC裂解后，从两个独立实验中看到的液泡样颗粒样品。第 2 帧和第 6 帧包括典型的幽灵 iRBC。比例尺为 5 μm。

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选择三张SEM图像作为NK-iRBC突触的例子，这些突触有越来越多的iRBC损伤证据（图4B）。在第一种情况下，iRBC仍然是刚性的，并且在质膜上带有特征性旋钮，尽管已经与NK细胞的突触结合了大表面积。在下一张图像中，突触似乎更紧，iRBC失去了刚性。第三张图像显示iRBC膜上有更大的损伤和可见的穿孔，表明它可能是一个幽灵（图4B）。NK-iRBC突触的其他例子如S4图所示

与iRBC共培养的NK细胞的低倍SEM图像的比较提供了信息（图4C）。在没有抗红细胞IgG的情况下，NK细胞和iRBC均匀分布，除了偶尔接触（图4C，左图和图S4）。相比之下，NK介导的ADCC后成像的培养物看起来非常不同（图4C，右图和S4图）。受损的 iRBC 数量丰富，一些 NK 细胞已经崩溃。值得注意的是，可见1.5 μm至3.1 μm的较小囊泡（图4C，右图和图4D）。在没有抗红细胞IgG的情况下，在共培养的iRBC-NK中未检测到这种囊泡（图4C，左）。这些囊泡的放大图像显示其表面比幽灵iRBC更光滑，表明它们是游离PV（图4D和S4）。iRBC释放的囊泡的平均直径为2.23μm（n = 12，SD 0.46μm）。我们得出的结论是，在NK介导的ADCC期间对iRBC造成的损伤会导致幽灵细胞的形成，并且有些细胞可能已经足以使PV逃逸。

确认在NK细胞和iRBC共培养过程中释放的颗粒是包裹发育中的P的真正PV。f. 寄生虫，为了在实时成像过程中跟踪它们的命运，我们生成了 3D7 P。f.在C末端用GFP标记的编码EXP2基因替换野生型EXP2基因的菌株。输出的蛋白质-2 （EXP-2） 是 PV 膜中蛋白质转位子的成孔亚基。EXP2 C末端位于液泡内[35]。EXP2-GFP的表达确实在完整的iRBC和幽灵细胞中都显示出具有绿色膜的PV（图5A和5B）。完整的 iRBC 是 eFluor 670 明亮且鬼笔环肽阴性，而鬼细胞是 eFluor 670 暗淡鬼笔环肽+，在 DIC 图像中明显半透明。每个示例显示在单个图像中（图 5B）。进行实时成像以检查 NK 细胞介导的 iRBC 裂解过程中 PV 的命运。EXP2-GFP+ iRBC 与原代 NK 细胞在抗 RBC IgG 和鬼笔环肽存在下孵育。来自跨越 12 分钟的电影的帧显示 2 个 NK 细胞接近 3 个 iRBC（图 5C，S4 电影）。第一次 NK-iRBC 接触（时间 0）在 7 分钟后产生鬼笔环肽 + iRBC。下一次 NK-iRBC 接触（t = 2 分钟）导致 4 分钟后出现鬼笔环肽 + iRBC，2 分钟后鬼笔环肽 + 幽灵内可见 GFP+ PV（图 5C）。第一次 NK-iRBC 接触（7 分钟后变成鬼笔环肽+）在 9 分钟后释放游离的 GFP+ PV（图 5C）。在第二个示例中，两个NK细胞接触并分别覆盖一个iRBC（图5D）。12 分钟后，第一次接触导致鬼笔环肽+ iRBC 内的 GFP+ PV。在第二次 NK-iRBC 接触 （t = 7min） 后 12 分钟，第三个 NK 细胞接触仍与第二个 NK 细胞接触的 iRBC （t = 19 min）。3 分钟后，iRBC 变成鬼笔环肽+，一分钟后出现游离的 GFP+ PV（图 5D）。我们得出结论，在ADCC期间，NK细胞与iRBC的单独接触会导致iRBC膜损伤，如鬼笔环肽所确定的那样，并且PV要么保留在鬼细胞内，要么从鬼细胞中释放出来。

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图 5. 在与NK细胞孵育期间，iRBC释放寄生液泡。

(A） 识别 iRBC 内部或外部 PV 的策略图。3D7 页f.表达用GFP标记的PfEXP2用于跟踪PV。EXP2-GFP+ iRBC 用膜染料 PKH26 和 eFluor 670 染色。（B） EXP2-GFP+ iRBC 在与 NK 细胞孵育之前预染色的免疫荧光图像，如 （A） 所示。右边的细胞是一个幽灵，如鬼笔环肽 AF405 染色和 DIC 图像所示。比例尺为5μm。（C） 10 帧，时长 12 分钟。将未染色的 NK 细胞和双染色的 EXP2-GFP+ iRBC 与 2 μg/ml 抗 RBC IgG 一起孵育。在每一帧中，两个效应NK细胞用星号标记，在第一帧中，三个iRBC靶标被标记为T1、T2和T3。底部NK细胞与T1的第一次接触被设置为时间0。2分钟后，顶部的NK细胞联系了T2。在第一次 NK-iRBC 接触后 4 分钟检测到第一个鬼笔环肽+ iRBC（黄色箭头）。T1 在接触后 7 分钟变成鬼笔环肽+（黄色箭头）。由于细胞重叠，不可能明确地跟踪靶标 T2 和 T3 各自的命运。8 分钟后，鬼笔环肽 + 幽灵 iRBC 内可见的第一个 GFP+ PV 出现。9 分钟后，检测到第二个 GFP+ PV（黄色箭头），这显然是在 iRBC 之外。（D） 10 帧，跨越 23 分钟，从实验中执行，如 （C） 所示。第一个 NK-iRBC （T1） 接触在时间 0 可见，如图像顶部所示（1 分钟后拍摄）。NK 细胞在 4 分钟时覆盖 iRBC。第二个效应NK细胞从底部向T2移动，并在7分钟时覆盖它。12 分钟后检测到幽灵内部的第一个可见 GFP+ PV（黄色箭头）。19 分钟时，第三个效应 NK 细胞（底部的星号）接触另一个仍然完整的 iRBC，3 分钟后成为鬼笔环肽+（黄色箭头）。一分钟后出现了一个自由的GFP+ PV（黄色箭头）。无法明确跟踪 3 个效应 NK 细胞和 3 个 iRBC 的各自位置。（C 和 D）为清楚起见，从图像中删除了黄色PKH26信号。右上角的数字表示以分钟为单位的时间。比例尺为 10 μm。

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为了量化NK介导的ADCC期间游离PV的释放，将用PKH26和eFluor 670染色的iRBC与PKH67染色的NK细胞孵育1小时，并通过流式细胞术进行分析。门控 PKH67+ NK 细胞后，PV 被鉴定为 PKH26 阴性 eFluor 670+ 事件（图 6A 和 S5）。随着NK与iRBC比率的升高和IgG浓度的增加，PKH26阴性的eFluor 670+事件的比例增加（图6A和6B）。这些结果表明，在成像实验中观察到的游离PV并不少见，并且iRBC释放的PV取决于NK细胞和ADCC。在TEM图像上捕获，在NK介导的ADCC期间释放的PV具有圆形和光滑的膜（图6C），与SEM图像一致（图4D和S4）。因此，NK细胞裂解iRBC在结构上留下了足够的GFP + PV，可以通过定量流式测定和活体或固定样品的成像实验进行检测。

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图 6. 定量分析与NK细胞孵育期间iRBC释放的PV。

(A） 流式细胞术分析以检测 PKH26 阴性 eFluor+ 颗粒（即游离 PV），在指定的 IgG 浓度和 NK 细胞与 iRBC 比率下与 NK 细胞孵育一小时后。（B） PKH26阴性eFluor+颗粒随着IgG浓度和NK与iRBC比值的增加而增加。误差线表示来自四个独立实验的平均值的标准误差。（C） 游离PV（右上）和NK细胞的TEM图像，取自类似于（A）和（B）中的实验。比例尺为5μm。（D） PV在较低的图像中以较高的放大倍率显示，比例尺表示2μm。

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疟疾暴露个体血浆中的IgG与游离寄生液泡结合

我们开发了一种分离和纯化PV的方案，以供进一步研究。用 0.0125% 皂苷短暂处理用 PKH26 和 eFluor 670 染色的 EXP2-GFP iRBC 以温和地透化质膜。在PBS中洗涤后，iRBC质膜通过针头被机械力进一步破坏（图7A和S6）。通过流式细胞术对样品进行 eFluor 670+ PKH26 阴性颗粒的分选（图 7A 和 S6）。共聚焦显微镜在DIC图像中显示预期的带有GFP +膜和色素沉着外观的小囊泡（图7A）。纯化PV的SEM图像（图7B）显示圆形，与iRBC与NK细胞孵育后释放的囊泡大小范围相同（图4D和S4）。

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图 7. 暴露于疟疾的成人血浆中的 IgG 结合 PV。

(A） 通过轻度皂苷处理和机械破坏 iRBC 膜从 iRBC 中分离的完整 EXP2-GFP+ iRBC（上图）和 PV 的免疫荧光图像，然后对 PKH26 阴性 eFluor+ 颗粒进行流式细胞术分选（底部）。比例尺为 5 μm。（B） PV的SEM图像，如（A）所示。它们的直径分别为 3.19 μm（顶部）和 2.56 μm（底部）。比例尺为3μm。（C） 未感染的红细胞、iRBC 和 PV 的图谱，如图所示，用抗红细胞 IgG（上图）、来自美国健康供体的 IgG（美国，中图）和来自马里暴露于疟疾的成年人的 IgG（马里，下图）染色。如图所示，人 IgG 样品在 3000 倍范围内滴定。每个panel的底部两行显示仅使用二抗（2°）或无IgG（–）进行染色。（D） 未感染的红细胞（未感染的红细胞）、iRBC 和 PV 的平均荧光强度 （MFI），如 （C） 用 US IgG（开放圆圈）和 Mali IgG（实心圆圈）染色。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011585.g007

然后，我们检查了暴露于季节性 P 的成人血浆中分离的 PV 与抗体的反应性，包括多克隆抗 RBC IgG 和 Abs。F.感染。抗红细胞 IgG 对未感染的红细胞和 iRBC 染色效果相同（S1 图），与 PV 的结合非常低（图 7C 和 S6）。可以得出两个结论：首先，PV制剂没有被来自iRBC质膜的颗粒或囊泡污染，其次，PV膜在抗原上与RBC膜不同。接下来，我们测试了来自马里队列的疟疾暴露成人血浆中IgG的结合（称为Mali IgG）。0.8 mg/mL 的 Mali IgG 与 iRBC 结合，但不与未感染的红细胞结合（图 7C 和 7D）。与 iRBC 的结合率很低但很重要，因为来自美国健康供体的 IgG 没有结合。相比之下，Mali IgG 与 PV 结合的 MFI 比对照 US IgG 的 MFI 高两个数量级（图 7C 和 7D）。IgG均未与未感染的红细胞结合（图7C和7D）。因此，暴露于疟疾的成年人具有针对裂解的 iRBC 释放的 PV 的抗体的高滴度。

Mali IgG 诱导单核细胞清除 PV

与游离 PV 结合的 IgG 可能具有通过吞噬作用刺激单核细胞清除的益处。为了测试这一点，将纯化的 eFluor 670+ PV 与原代单核细胞一起孵育 1 小时，并通过流式细胞术分析是否存在 eFluor+ 单核细胞（图 8A）。在存在 Mali IgG 的情况下，eFluor+ 单核细胞的比例是存在 US IgG 或无抗体时的 3 倍。为了排除在单核细胞门中检测到的 eFluor 670 信号是由于与 PV 的细胞外结合而不是吞噬作用的可能性，我们使用了在酸性 pH 值下发出荧光的 pHrodo 染料。因此，单核细胞中的阳性信号不仅表明吞噬作用，而且表明PV传递到酸性吞噬体中。双染色的 iRBC 进一步用 pHrodo 染色，然后在存在或不存在不同抗体的情况下与单核细胞一起孵育。在与eFluor+ PV相同的条件下，在Mali IgG存在下与PV一起孵育后检测到的pHrodo+单核细胞比例是存在US IgG或无抗体时的5倍（图8A和S7）。pHrodo 测量的 PV 吞噬作用选择性更高，主要是由于在没有 Mali IgG 的情况下获得的较低值。我们得出结论，我们的测定法是测量单核细胞对PV的真正吞噬作用。

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图 8. 在暴露于疟疾的成人的 IgG 存在下，原代单核细胞对 PV 的吞噬作用。

(A） 如图 7 所示，从 iRBC 中分离的 eFluor 670+（左图）和 pHrodo+（右图）PV 与原代单核细胞一起在不存在或存在 80 μg/ml US IgG 和 80 μg/ml Mali IgG 的情况下孵育 1 小时。通过流式细胞术定量 eFluor 670+ 或 pHrodo+ 单核细胞的比例来确定吞噬作用。误差线表示平均值的标准误差。使用来自不同供体的单核细胞进行四个独立实验，用不同的颜色鉴定，并使用独立的PV制剂。（B） 使用如图 7 所述从 iRBC （PV） 中分离的 PV 或在 iRBC 与 NK 细胞 （NK-PV） 以 6：1 的 NK 与 iRBC 比例孵育 3 小时后分离的 PV 进行实验。由于NK介导的iRBC裂解后释放和分离的PV数量有限，在6个实验中的2个实验中进行了无抗体对照，在6个实验中的3个实验中进行了US IgG对照。在所有实验中都进行了US与Mali IgG的关键比较。误差线表示来自六个独立实验的平均值的标准误差。（C） 用 eFluor 450（蓝色）染色并与 PKH26 阴性 eFluor 670+ PV（红色）在 80 μg/ml Mali IgG 存在下以 1：1 的比例共同孵育的原代单核细胞的活体成像。每张图片右上角的数字表示时间（以分钟为单位）。在图像采集开始时添加 PI 以排除受损的单核细胞和 PV。在时间 0 时，在接下来的 13 分钟内被吞噬的 7 个 PV 按照随后被单核细胞吞噬的顺序向左编号（黄色）。例如，时间 0 的 PV1 在一分钟后被吞噬，标记为 1'。随后的吞噬事件被标记为 2'、3' 至 7'。吞噬后PV的eFluor 670信号迅速减弱，但PV2除外，10分钟后仍然可见。PV2 可能代表在完全内吞作用之前保留在吞噬杯中的 PV。* p < 0.05， ** p < 0.01 Sidak 多重比较检验。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011585.g008

为了排除在从 iRBC 中分离 PV 期间引入的一些伪影对 PV 吞噬作用的贡献，我们测试了在 NK 细胞介导的 ADCC 期间从 iRBC 释放并通过流式细胞术分选分离的 PV 吞噬作用。六个独立实验，每个实验都使用从不同疟疾初治自体供体获得的原代单核细胞和NK细胞，以及新鲜的富含滋养体的iRBC培养物，结果表明，与NK细胞共培养的iRBC释放的PV的吞噬作用与从皂苷处理的iRBC制备的PV一样好（图8B）。最后，为了直接观察 PV 吞噬作用，我们对在 Mali IgG 存在下用 eFluor+ PV 孵育的单核细胞进行了实时成像。成像显示单核细胞对PV的快速内化（图8C），从而验证了我们在定量流式细胞术测定中的测量结果。

讨论

人NK细胞，特别是适应性NK细胞[36]和CD56阴性NK细胞的活性与疟疾耐药性有关[26,27]。它们如何提供保护仍然是一个悬而未决的问题。为了解决这个问题，我们研究了原代NK细胞与感染P的红细胞之间的相互作用。恶性疟原虫 （iRBC）。我们发现两者之间的稳定粘附取决于两对受体-配体相互作用，NK 细胞对 iRBC 造成的损伤需要通过与 iRBC 结合的 IgG 激活 FcR CD16。这些要求类似于NK细胞裂解肿瘤细胞或病毒感染细胞所涉及的步骤，但所涉及的受体除外。对iRBC有反应的NK细胞被IgG激活，而不是肿瘤细胞配体或应激信号的组合，这些配体或应激信号与先天性NK受体共啮合[15]，这足以触发CD16并诱导脱颗粒以释放裂解效应分子[16]。NK细胞与肿瘤细胞的粘附是由整合素αLβ2介导的，而NK细胞使用整合素αMβ2和受体CD2分别与iRBC上的ICAM-4和CD58相互作用。使用携带基因 ICAM4 和 CD58 特异性缺失的分化红细胞获得了这两种受体-配体相互作用在 NK 细胞和 iRBC 之间粘附的明确证据。ICAM-4和ICAM-1之间的根本区别在于ICAM-4中不存在谷氨酸（ICAM-1中的Glu34），而谷氨酸对于ICAM-1通过与Mg2+的配位与αLβ2强结合至关重要[37]。较弱的 ICAM-4-αMβ2 相互作用可能是 NK 细胞与 iRBC 的粘附需要通过与 iRBC 结合的 IgG 共同参与 CD16 来由内而外的信号传导。

我们发现，尽管存在调理作用IgG，但未感染的红细胞没有与NK细胞形成结合物（图1A-1C）。一个可能的原因是红细胞的高变形性，这是它们通过脾脏所必需的[38]。页。F.侵入可变形的红细胞，使其宿主膜僵化，以粘附在血管上进行隔离[39,40]。这种iRBC的刚性可能也有助于与免疫系统效应细胞的粘附[41]。CD2是CD58的受体，除了在粘附中发挥作用外，还是CD16在NK细胞和T细胞受体上信号转导的放大器[24,25,42]。适应性NK细胞中CD2表达上调[36]。因此，NK细胞上的CD2可能不仅有助于粘附，还有助于ADCC对受感染红细胞的反应。

我们使用了几种测定法来确定iRBC和P的完整性。f.在与IgG和NK细胞孵育后的寄生液泡中。成像和定量流式细胞术作为补充方法，以显示 NK 细胞在 IgG 存在下与 iRBC 接触后被激活，如运动性增加和与其他 iRBC 的频繁接触所见。与γδ2 T细胞不同，γδ2 T细胞通过与iRBC上的butyrophilin结合来检测和吞噬iRBC[43]，我们没有观察到NK细胞对调理作用iRBC的吞噬作用。NK细胞对P的连续杀伤。f.观察到iRBC内的PV。这一特性将使NK细胞在肺、脾和骨髓等器官微血管系统的iRBC隔离位点非常有效[44]。

NK 细胞依赖性 ADCC 不会破坏 iRBC 和 PV，但会透化和破坏 iRBC 质膜。iRBC 损伤的两个可靠读数是血红蛋白的释放和 iRBC 中 F-肌动蛋白对鬼笔环肽的可及性。PV膜在结构上保持完整，即使对于那些在与NK细胞孵育后从幽灵iRBC中释放的PV也是如此。然而，寄生虫发生了损害，如DNA与碘化丙啶的可及性所示。此外，在NK介导的ADCC中，在iRBC中检测到活性颗粒酶B，就像GzmB递送至肿瘤靶细胞一样。颗粒酶裂解P。f.红细胞内血液阶段的蛋白质，如γδ2 T细胞所示[45]。iRBC的通透性需要颗粒溶血素而不是穿孔素，因为在疟原虫发育的晚期，iRBC质膜中的胆固醇消耗[43,45,46]。

疟疾是一种炎症性疾病，抑制宿主先天免疫应答有助于预防疟疾症状[47]。富含 AT 的 P.f. DNA激活由STING和IRF3/IRF7介导的DNA感应通路[48]。裂殖子流出时破裂的 iRBC 释放的血红素与 P 相关。f. DNA并激活TLR9和NLRP3炎症小体[49,50]。血红素诱导的反应导致树突状细胞功能障碍，从而损害抗疟疾免疫力[51]。因此，虽然髓样细胞的早期先天促炎反应控制寄生虫复制并促进寄生虫清除，但水平升高与严重疟疾有关。髓系细胞反应的抑制对疾病耐受性至关重要的迹象表明，有证据表明 P.F.诱导骨髓细胞向调节状态的表观遗传重编程[9]，这是一种与疟疾耐药性相关的表型[12]。

页。f.在血液阶段取决于红细胞，入侵的裂殖子开始从环到滋养体的发育周期，再到裂殖体，直到红细胞和PV膜破裂以释放新鲜的裂殖体。寄生虫根据自己的目的重塑红细胞，修饰质膜脂质组成，并插入自己的离子通道和变异抗原，这些离子通道和变异抗原用于吸收营养并作为配体介导隔离。因此，P需要iRBC膜的结构完整性。F. 发展。然而，PV内受损寄生虫的命运仍然很重要，因为寄生虫DNA和消化液泡成分的释放会通过TLR9和I型干扰素诱导炎症，并使髓系细胞失效[47,49,51]。

我们发现，不含 iRBC 质膜的分离 PV 与生活在马里的暴露于疟疾的成年人血浆中的 IgG 发生强烈反应，其中大多数人已获得对疟疾的临床免疫力。因此，从 iRBC 释放后暴露在 PV 膜上的抗原必须诱导 Ab 反应。在裂殖子侵袭期间，PV由红细胞质膜内陷形成[52]，这一过程包括蛋白质和脂质的选择性分选[53,54]。例如，尽管气孔素常见于红细胞耐洗涤剂膜结构域中，但其被排除在PV之外，而芦苇素则被排除在外[55]。同样，磷脂酰丝氨酸（PS）也包括在内，而磷脂酰肌醇[4,5]二磷酸（PIP2）则不包括在内[53]。CD58 是裂殖子入侵期间包含在 PV 膜中的蛋白质之一。但请注意，PVM 的内小叶代表红细胞质膜朝外的位置。因此，CD58的CD2结合结构域预计位于PV内部[55]。虽然 PVM 上人 IgG 的配体尚不清楚，但任何通常不暴露于循环血液的配体都可能诱导抗体反应，其中包括在 P 期间内化的人蛋白胞质结构域。f. 入侵和 P.f. 跨越 PVM 的蛋白质，例如 EXP2。iRBC 释放的 PV 显然具有免疫原性，因为来自疟疾暴露个体的 PV 结合 IgG 的滴度远高于与 iRBC 结合的 IgG。这种 IgG 诱导单核细胞对 PV 的有效吞噬作用。因此，在进一步损伤和释放寄生虫物质之前清除 PV 可能有助于控制与 P 相关的炎症。F.感染。

暴露于疟疾的人群中NK细胞ADCC活性与寄生虫血症减少有关[26,27]。适应性NK细胞具有更高的内在ADCC反应[25,26,36]。值得注意的是，在疟疾的背景下，由CD16触发的适应性NK细胞上调脱颗粒，但不上调IFN-γ分泌[10,26]，可能是为了抑制炎症。疟疾期间发生的I.型干扰素反应[47,48]可能通过抑制NK细胞产生干扰素γ来控制炎症[56]。一项关于生活在疟疾低传播地区个体的外周血单核细胞的研究发现，疟疾发作期间的NK细胞上调了细胞毒性效应因子（GNLY、FCGR3A、GZMB），同时也上调了抑制标志物，如共抑制受体HAVCR2（Tim-3）、LAG3（CD223）和几个TNFRSF成员[10]。

总之，我们发现NK细胞识别P。f.感染红细胞并通过CD2-CD58和αMβ2-ICAM-4相互作用粘附在它们上。这种粘附事件之后是 iRBC 质膜的损伤和寄生液泡的释放。这些 PV 显示出与来自流行地区的疟疾暴露个体的 IgG 的强大结合，这标志着单核细胞通过吞噬作用清除的 PV。这些发现为早期观察提供了见解，即NK细胞频率和功能与寄生虫血症降低和对疟疾的抵抗力相关[26,27]，并揭示了NK介导的ADCC与单核细胞合作从血液中清除寄生虫。

材料与方法

道德声明

根据美国国立卫生研究院机构审查委员会批准的方案 （99-CC-0168），从美国国立卫生研究院输血医学部获得来自美国健康成年人的外周血样本，并征得书面知情同意书。马里队列研究得到了马里巴马科科学、技术和技术大学医学、药学和牙科学院伦理委员会和美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所机构审查委员会的批准。在纳入本研究之前，已收到参与者的书面知情同意书。

人类抗体来源

从马里坎比拉（Kambila）农村一项多年疟疾研究中的成人中采集血浆样本[57]，首先采集在含柠檬酸盐的细胞制备管中的静脉血（Becton Dickinson）。样本被运送到45公里外的巴马科疟疾研究和培训中心，在那里分离外周血单核细胞（PBMC）和血浆。将血浆在 80°C 下以 1 mL 等分试样冷冻。 样品被运往美国进行干冰分析。来自美国个体的对照血清购自 Valley Biomedical。

抗体富集

通过标准亲和色谱从血浆或血清中纯化IgG。简而言之，将每个样品在柱平衡洗涤缓冲液（20 mM NaPO 4，pH 7.0）中以 1：2 的比例稀释。将 IgG 级分分离在置于色谱柱 （Bio-Rad， 732–1010） 中的蛋白 G 琼脂糖 （GE Healthcare 17-0618-02） 上，用 100 mM 甘氨酸（pH 值为 2.7）洗脱，并立即用 1 M Tris pH 值 8.0 中和至 pH 7.4。将 IgG 浓缩并用 PBS 在 Amicon Ultra-15 离心过滤装置（截止 3 kDa MW）中透析。

NK细胞分离

在知情同意的情况下，根据 NIH IRB 批准的协议，在 NIH 血库中抽取来自美国健康献血者的人类血液样本用于研究目的。首先使用淋巴细胞分离培养基（MP Biomedical）分离PBMC，用PBS洗涤两次，然后用2%FBS和1mM EDTA重悬于PBS中。使用NK细胞分离试剂盒（STEMCELL Technologies）通过去除非NK细胞从PBMC中分离NK细胞。制造商的协议修改如下。PBMC于2×10重新悬浮8加入细胞/mL 和 50 μL/mL 的混合物。还添加了浓度为 2.5 μL/mL 的抗 CD3 生物素 （STEMCELL Technologies），以提高 NK 细胞纯度。静息NK细胞重悬于Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM;Invitrogen）补充 10% 人血清 （Valley Biomedical），并在分离后 1 至 4 天内使用。实验中仅使用流式细胞术测定的CD14-、CD3-、CD56+细胞含量大于95%的NK细胞制剂。

单核细胞分离

使用无 CD16 耗竭的人单核细胞富集试剂盒 （STEMCELL Technologies） 通过去除非单核细胞来分离单核细胞。PBMC在5×10重新悬浮7加入细胞/mL 和 50 μL/mL 的非单核细胞混合物。富集细胞在 5×10 时重悬7含有 2% FBS 和 1 mM EDTA 的 PBS 中的细胞/mL，并使用 100 μL/mL 的 CD56 阳性选择混合物 （STEMCELL Technologies） 去除残留的自然杀伤细胞。单核细胞 （5×106/vial）冷冻保存在10%DMSO的FBS中。仅使用具有>95%CD14+和<5%CD56+细胞的单核细胞制剂（通过流式细胞术测定）进行实验。

磷的培养和纯化。恶性

3D7 和 3D7-EXP2-GFP 菌株在 37°C 下 5% O 下培养2， 5% 一氧化碳2， 90% 氮2在 37°C 下，使用 O+ 人红细胞 （Interstate Blood Bank， Inc.） 进行 <5% 的血细胞比容。在RPMI 1640中用谷氨酰胺、25 mM HEPES、0.5% Albumax、0.26% 碳酸氢钠、10 μg/mL 庆大霉素和 50 mg/L 次黄嘌呤培养寄生虫。使用甲醇固定、Giemsa 染色的薄血涂片通过光学显微镜监测寄生虫的发展。如前所述，使用5%山梨糖醇同步寄生虫[6]。常规使用 Zeptogel 沉降法富集寄生虫 iRBC 以用于旋钮。对于实验，如前所述[6,58]，在早期滋养体阶段用Percoll-山梨糖醇梯度离心富集感染的红细胞，洗涤并重悬于完全培养基中。

EJ细胞的维持和分化

如前所述，EJ细胞得到维持和分化[58]。简言之，将 EJ 细胞培养在含有补充有 4 mM L-谷氨酰胺 （Sigma-Aldrich）、330 μg/mL 铁饱和人全转铁蛋白 （BBI 溶液）、10 μg/mL 重组人胰岛素 （Sigma-Aldrich）、2 IU/mL 肝素钠盐 （Affymetrix） 和 0.5% Pen/Strep （Life Technologies） 的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基 （IMDM， Sigma-Aldrich） 的 pIMDM 培养基中培养。维持培养基由补充有 5% 溶剂/洗涤剂病毒灭活血浆（八等离子体;Octapharma）、3 IU/mL 促红细胞生成素 （EPO;罗氏）、50 ng/mL 干细胞因子 （SCF;R&D 系统）、1 μg/mL 多西环素 （Sigma-Aldrich） 和 1 mM 地塞米松 （Sigma-Aldrich）。EJ细胞的浓度维持在5×104?7.5×105细胞/mL，每 3 天拆分一次。为了诱导分化，EJ细胞在2×10时接种5细胞/mL，并在补充有 5% 八胞浆、3 IU/mL EPO、10 ng/mL SCF 和 0.5 mg/mL 多西环素的 pIMDM 中培养 3 天。在第 3 天，细胞在 2×10 接种6含有 5% 八等体和 3 IU/mL EPO 的 pIMDM 培养基中 MS-5 基质细胞上的细胞/mL。细胞在分化的剩余时间内保持在该培养基中。在第 5 天，细胞在 5×10 重新接种6新鲜 MS-5 基质上的细胞/mL。在分化第 8 天收获细胞，并在 40% Percoll-PBS 梯度上分层。含有终末分化细胞的沉淀在使用前洗涤三次。

EJ 细胞 KO 生成和验证

如前所述，CRISPR/Cas9介导的EJ细胞系遗传扰动是通过改编先前发表的方案产生的[58]。LentiCas9-Blast 质粒 （Addgene 质粒 #52962） 首先通过慢病毒转导在 EJ 细胞中表达。使用 psPAX2 （Addgene 质粒 # 12260） 和 VSV-G （Addgene 质粒 # 12259） 包装质粒在 HEK 293T 中生产慢病毒。在 4 μg/mL 聚凝胺存在下，用 1 mL LentiCas9-Blast 慢病毒以 1000×g 的速率以 1000 g 转导 100 万个 EJ 细胞。然后将转导的细胞选入 10 μg/mL 杀稻瘟菌素上，持续 2-4 周。接下来，使用LentiGuide-Puro质粒[59]表达单向导RNA（CD58 sgRNA;5'-GAGCATTACAACAGCCATCG-3' 和 ICAM4 sgRNA：5'-CCGGGAACACCTGCGTCACG-3'） LentiGuide-Puro （Addgene 质粒 # 52963） 是张峰的礼物。慢病毒的生成和转导如上所述进行。在 2 μg/mL 嘌呤霉素中选择 ~2 周后，通过限制稀释克隆表达转基因的细胞，并通过 PCR 扩增筛选克隆的插入缺失。（CD58引物：F 5'-GCTCAAGGAGTTTGTCTGCTCATC-3'和R 5'-TGCTTGGGATACAGGTTGTC-3';ICAM4 引物：F 5'-GCCTACAGTGAGGGACAGG-3' 和 R 5'-ATCACGGGCTGCCAGAAG-3'）随后通过 Sanger 测序。使用 CRISPR 编辑推断工具（ICE、Synthego）以及流式细胞术通过 ICAM4 和 CD58 染色来估计编辑。

偶联物测定

该测定改编自[28]。静息 NK 细胞在 37°C 下用 1 μg/mL Cell Tracker Green CMFDA （Invitrogen） 标记 30 分钟，洗涤并在 1.5×10 下重悬6/毫升。红细胞或 EJ 细胞在 37°C 下用 eFluor 670（分子探针）标记 10 分钟并洗涤。然后将标记的红细胞或 EJ 细胞与 2 μg/mL 的抗红细胞兔 IgG（抗体 209–4139，Thermo Fisher）在 PBS 中孵育 30 分钟，在 PBS 中洗涤并在 4.5×10 下重悬6/毫升。NK 细胞 （0.1 mL） 和 RBC 或 EJ （0.1 mL） 在 4°C 下以 1：3 的效应子与靶标 （E：T） 细胞比例混合，以 20 g 短暂旋转 3 分钟，并在 37°C 水浴中孵育 0、20 或 40 分钟。通过使用 0.5% 多聚甲醛溶液涡旋和固定细胞来阻止偶联物的形成（电子显微镜科学） 通过流式细胞术（FACScan，Becton Dickinson）测定偶联物的形成，并表示为转变为两种颜色偶联物的 NK 细胞的分数。

血红蛋白释放测定

静息NK细胞于5×10重悬于CTS OpTmizer培养基（GIBCO Invitrogen）中6将细胞/mL 和 0.1 mL 接种在 96 孔圆形底板中。将NK细胞表面受体抗体以终浓度10 μg/mL添加到细胞中。将 EJ Cas9 对照细胞或 EJ KO 细胞分层在 Percoll 梯度上并离心以确保细胞分化，并在 2.5×10 下重悬6/毫升。然后将EJ细胞与抗红细胞兔IgG（1μg/mL）在PBS中孵育30分钟，洗涤并向NK细胞中加入0.1mL。在 37°C 下 1 小时后，根据制造商的说明，在血红蛋白释放测定中以 1：1600（人血红蛋白 ELISA 试剂盒，Abcam）的稀释度测试共培养物的上清液。在该测定中使用了以下针对人CD分子的阻断抗体：CD2，克隆TS1/8（BioLegend，#309236）;CD11a，克隆 TS1/221（Invitrogen，#MA11A10）;CD11b，克隆 M1/70 （BioLegend， #101284）;CD18，克隆 TS1/18 （BioLegend， #302116）;CD49d，克隆 HP2/1 （Bio-Rad #MCA697）。

颗粒酶测定

用 eFluor 670 标记 3D7 感染的红细胞靶标，并用抗红细胞兔 IgG 包被 30 分钟。靶细胞 （0.1×106）在37°C下以5和2.5的E/T比在96孔V底板中与静息NK细胞混合1小时。 然后将细胞与 5mM EDTA（在 4°C 下孵育 30 分钟）以破坏 NK-iRBC 偶联物。在流式细胞术过程中，使用前向散射门去除任何残留的偶联物。加入颗粒酶B底物（GranToxiLux试剂盒，OncoImmunin Inc.）（室温下5分钟），并用FACScan流式细胞仪（BD BioSciences）采集细胞。计算双阳性 eFluor+ 和颗粒酶 B+ 靶细胞的百分比。

电子显微镜（EM）

未感染的红细胞和富集的 iRBC （2×105） 单独使用或与静息 NK 细胞混合 （1×106）加入 96 孔板的孔中，在抗体（1.6 mg/mL 的 US IgG、1.6 mg/mL 的 Mali IgG 或 2 μg/mL 的抗红细胞兔抗体）存在的情况下，并在 37°C 下孵育 3 小时。用0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）洗涤细胞，以2500rpm离心5分钟，除去上清液。再次用0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）洗涤细胞，并重悬于20μlPBS中。将 2-3 滴细胞滴在聚赖氨酸涂层硅芯片的闪亮面（用于扫描 EM）和聚赖氨酸涂层塑料盖玻片（用于透射 EM）上。让细胞沉降 5 分钟。然后将含有细胞的芯片和盖玻片浸入固定液（3% PFA 和 2% 戊二醛）中，并在 4°C 下储存直至进一步处理成像。

对于透射电子显微镜 （TEM）：将样品固定在用 2% 多聚甲醛和 2.5% 戊二醛在 0.1 M 磷酸盐缓冲液 （PB） 中制成的 Karnovsky 固定剂中。所有后续步骤均在Pelco Biowave Pro实验室微波（MW）（Ted Pella Inc.，Redding，CA）中使用2分钟开，2分钟关和2分钟开机周期进行。将样品固定在 170 瓦的 MW 中，然后用 0.1 M PB 冲洗。在用 0.1 M PB 中的 8% 亚铁氰化钾还原的 1% 四氧化锇中固定后，用 PB 冲洗细胞并用 1% 醋酸铀酰整块染色。用水冲洗样品后，根据制造商的说明用水溶性Durcupan树脂渗透。将样品硬化48小时，并使用徕卡UC6超薄切片机（徕卡显微系统，Wetzlar，德国）收集超薄切片。这些切片在 Hitachi 7800 显微镜（Hitachi High-Tech in America， Schaumburg， IL）中使用 AMT XR-81 相机（Advanced Microscopy Techniques， Inc.， Woburn， MA）在 80 kV 下成像。

对于扫描电子显微镜（SEM）：将硅芯片上的细胞固定在Karnovsky固定剂中，并用TEM方法中提到的还原四氧化锇进行后固定。在水中洗涤样品后，将细胞在乙醇中脱水，并使用Baltech临界点干燥机干燥。使用银漆将芯片安装到SEM存根上。使用Quorum Q300T溅射镀膜机（Quorum Tech，UK）对电池进行溅射镀膜，镀膜8nm铱（Ir）。使用日立SU 8000显微镜（Hitachi High-Tech in America，Schaumburg，IL）拍摄SEM图像随后用1%OsO 4进行后固定，微波照射（Pelco 3451微波处理器，在15英寸下以250 W的2分钟开启，2分钟关闭，2分钟开启的周期。（Hg 真空;泰德·佩拉）。将样品在分级乙醇系列中在真空下脱水1分钟。然后，在Bal-Tec cpd 030干燥机（Balzer，Bal-Tec AG，Balzers，列支敦士登）中将样品干燥至临界点。然后在IBS离子束溅射中用75 A°的铱涂覆细胞（South Bay Technology，Inc.，San Clemente，CA.）样品在日立SU-8000 SEM（Hitachi，Pleasantown，CA）上成像。

寄生液泡 （PV） 的鉴定

用PBS洗涤富含滋养体的iRBC和静息NK细胞。在室温下用 1.5 μM PKH26 膜染料对 iRBC 染色 3 分钟，然后用 RPMI 和 10% FBS 洗涤细胞一次，用 PBS 洗涤一次细胞。然后用细胞增殖染料 eFluor 670 （2.5 μM） 在 37°C 下对 iRBC 染色 5 分钟。 然后用含有血清的培养基洗涤细胞两次。在室温下用 2 μM PKH67 膜染料对静息的 NK 细胞染色 5 分钟，然后用含有血清的培养基洗涤细胞两次。染色 iRBC （2×105） 单独使用或与染色的静息 NK 细胞混合 （1×106）加入到96孔板中，在抗红细胞兔抗体（2μg/ mL）存在下孵育1小时。然后通过流式细胞术（X-20，BD Biosciences）洗涤和分析细胞，然后使用FlowJo（FlowJo，LLC）进行数据分析。PKH67-PKH26-eFluor+ 细胞被认为是寄生液泡。

EXP2-GFP 3D7的生成

如前所述，使用双载体Cas9基因组编辑系统用单体GFP标记EXP2位点的C端[60]。为了创建 sgRNA，将源自 EXP2 最后一个外显子的引导序列 （5'-gttgaagaagaagatgccag-3'） 克隆到 pL6 载体的 BtgZ1 位点。为了生成同源臂，对 EXP2 核苷酸 959–1337 进行 PCR 扩增以创建 5'-同源臂，并将终止密码子之后的 515 个核苷酸进行 PCR 扩增以创建 3'-同源臂。编码 EXP2 核苷酸 1,338 至 1,400 的 DNA 发生突变以保留编码的氨基酸，但破坏 sgRNA 结合（盾牌突变）。在5'和3'-同源臂之间克隆凝血酶切割位点、单体GFP、3xFLAG标签、八组氨酸序列和终止密码子。将 5'-同源臂、密码子优化的 EXP2-凝血酶-GFP-3xFLAG-八组氨酸、终止密码子和 3'-同源臂克隆到 pL6 Not1 和 AflII 限制性位点，以创建 pL6-EXP2-GFP。

用 pUF1-Cas9 和 pL6-EXP2-GFP 洗涤未感染的红细胞并电穿孔。将转染的未感染红细胞与富含滋养体的 3D7 iRBC 混合，并在 RPMI 1640 中用 2 mM L-谷氨酰胺、25 mM HEPES、0.5% Albumax、0.26% 碳酸氢钠、10 μg/mL 庆大霉素和 50 μg/mL 次黄嘌呤在 RPMI 1640 中培养两天。2 天后，使用 2 mL 新鲜的 50% 未感染红细胞和含有 1.5 μM DSM1 （MR4） 和 2 nM WR99210（均来自 Jacobus Pharmaceuticals）的培养基进行选择。3-4 周后，通过有限稀释克隆分离 3D7-EXP2-GFP iRBC。通过蛋白质印迹、PCR 和成像证实了 EXP2-GFP 的存在。

iRBC 的鬼笔环肽和 PI 染色

用 PBS 洗涤富含滋养体的 3D7 iRBC，并在 37°C 下用 2.5 μM eFluor 670 在 PBS 中染色 5 分钟。 然后用 10% FBS 在 RPMI 1640 中洗涤细胞两次。富集的 eFluor 670 染色的 3D7 iRBC （2×105） 单独使用或与静息 NK 细胞混合 （1×106）加入96孔板中，在抗体（抗红细胞兔抗体浓度为2μg/mL或4μg/mL）存在的情况下，并在37°C下孵育1-3小时。洗涤细胞，并在冰上用 Pe-Cy7、CD235a 和 FITC-LFA-1 染色 15 分钟。洗涤细胞，并在室温下用 165 nM AF405-鬼笔环肽染色 10 分钟，然后用 1.25 μg/mL PI 染色 5 分钟。在LSRFortessa X20细胞分析仪（BD Biosciences）上进行流式细胞术，并使用FlowJo（FlowJo，LLC）分析数据。对于免疫荧光分析，将细胞转移到 8 孔室中，并在 LSM 780 共聚焦激光显微镜（德国卡尔蔡司）上收集图像。同样，用 1.5 μM PKH26 膜染料染色富集的 3D7-EXP2-GFP iRBC，然后用 2.5 μM eFluor 670 染色。将富集的 PKH26 和 eFluor 670 染色的 EXP2-GFP 3D7 iRBC 单独或与静息 NK 细胞混合加入 96 孔板中，在抗体（抗红细胞兔抗体 2 μg/mL）存在下，并在 37°C 下孵育 3 小时。然后在LSM 780共聚焦激光显微镜上收集图像。图像是使用 Zen 软件（卡尔蔡司）获取的。

光伏隔离

iRBC 分别用 1.5 μM PKH26（或 PKH67 或 CellVue Claret）膜染料染色，然后分别用 2.5 μM eFluor 670（或 5 μM eFluor 450）染色。首先通过非离子洗涤剂化学破碎（0.0125%皂苷3分钟）透化染色的iRBC，在PBS中洗涤一次，然后进行机械破碎（31G针头）。对于NK细胞介导的iRBC裂解后释放的PV，用5μM的eFluor 450对静息NK细胞进行染色，然后用含有血清的培养基洗涤两次。将染色的 iRBC 与 eFluor 450 染色的静息 NK 细胞混合加入 6 孔板中，在 4 μg/mL 兔抗 RBC 抗体存在下孵育 1 小时。将细胞（手动破碎后以及NK细胞介导的裂解后）重悬于0.5%Albumax中，并在细胞分选前立即通过35μm过滤器（Corning）过滤。使用BD FACSAria TM Fusion对液泡进行分选，并使用BD FACSDiva TM软件（BD Biosciences）进行设门。样品的鞘压为 70 psi，喷嘴为 70 μm，最大事件率为每秒 10,000 次。收集膜染料阴性的eFluor+细胞（PV），洗涤并用于实验。

抗体染色

将富集的 iRBC、未感染的红细胞和皂苷裂解后的分离 PV 在不同浓度的抗体（US IgG、Mali IgG 或抗 RBC IgG）存在下孵育。用 BV421 二抗检测与细胞的结合抗体。洗涤样品，重悬于PBS中，并在FACS LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）上进行分析。使用FlowJo软件（FlowJo，LLC）进行数据分析。

吞噬作用测定

用 1.5 μM PKH26（或 CellVue Claret）膜染料对 iRBC 进行染色，然后用 2.5 μM eFluor 670（或 5 μM eFluor 450）染色。流式分选后分离膜染料阴性 eFluor+ 细胞的 PV。隔离光伏 （1.5×105）在存在或不存在抗体（兔抗红细胞抗体 100 μg/mL、US IgG 80 μg/mL 或 Mali IgG 80 μg/mL）的情况下，将已接种有单核细胞的 24 孔板 （2×105）并在37°C下孵育1小时。对于某些供体，在用 CellVue Claret 膜染料和 eFluor 450 对 iRBC 进行染色后，用 4 μg/mL pHrodo （Thermo Fisher， P36011） 进一步对细胞进行染色。对 pHrodo 染色的 iRBC 进行细胞分选，并收集膜染料阴性 eFluor+ 细胞的 PV。然后将这些PV与存在或不存在抗体的单核细胞一起孵育。洗涤单核细胞，用LIVE-DEAD染色剂染色，然后在LSRFortessa X20细胞分析仪（BD Biosciences）上对它们进行流式细胞术，并用FlowJo（FlowJo，LLC）分析数据。

延时成像

对于NK细胞介导的裂解，NK细胞和iRBC用PBS洗涤两次，然后用不同的染料标记。在 37°C 下用 2.5 μM eFluor 670 在 PBS 中对 iRBC 染色 5 分钟。 NK 细胞在 37°C 的 PBS 中用 5 μM eFluor 450 染色 8 分钟。 然后洗涤细胞两次，并在不含酚红的情况下重悬于含有 0.5% Albumax-II 的 RPMI 1640 中。将细胞加入 8 孔 Lab-Tek I 腔室盖玻片 （Nunc） 中，静置 10 分钟，向孔中加入 1.25 μg/mL PI。同样，用 1.5 μM PKH26 膜染料对 iRBC 进行染色，洗涤，然后用 2.5 μM eFluor 670 染色。为了成像，在没有酚红的情况下，将细胞重悬于含有 0.5% Albumax-II 的 RPMI 1640 中。将细胞加入 8 孔 Lab-Tek I 腔盖玻璃 （Nunc） 中并沉降 10 分钟，向孔中加入 165 nM AF405-鬼笔环肽。

对于单核细胞实验，用 1.5 μM PKH67 膜染料染色 iRBC，洗涤，然后用 2.5 μM eFluor 670 染色。PV如上所述分离。在实验当天，解冻、洗涤单核细胞并用 5 μM eFluor 450 染色。将染色的单核细胞滴入 8 孔 Lab-Tek I 腔室盖玻片上，并在 37°C 下沉降 2 小时。 用PBS洗涤腔室一次，然后加入PV并沉降10分钟，向孔中加入1.25μg/ mL PI。使用蔡司LSM 780共聚焦显微镜进行成像，同时在加湿室中保持37°C，5%CO 2的孵育条件。以 60 秒的间隔采集图像，持续 5 小时。延时图像堆栈被导入到Imaris软件中。

统计分析

使用的统计检验在图例中指定。使用GraphPad Prism 9.0版（http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 计算统计检验)

支持信息

EJ 细胞和红细胞的流式细胞术图谱。

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一个兔防-红细胞EJ Cas9 控制 EJ ICAM4 KO EJ CD58 KO控制 IgGICAM4的CD58型B

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S1 图。 EJ 细胞和红细胞的流式细胞术图谱。

(A） 在未感染和 3D7 感染的红细胞中使用兔抗红细胞多克隆抗体对细胞表面染色进行流式细胞术分析。（B） ICAM4 和 CD58 的 Cas9 对照、ICAM4 KO 和 CD58 KO EJ 细胞的细胞表面染色的流式细胞术图谱，显示 ICAM4 和 CD58 在各自的敲除细胞中丢失。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011585.s001

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S2 图。 门控以识别 iRBC 和在没有 NK 细胞的情况下对 iRBC 损伤的对照。

(A） 对 eFluor 670+ 糖蛋白 A （CD235a）+ iRBC 和 LFA-1+ NK 细胞进行门控，以确定鬼笔环肽-AF405 对 iRBC 的损伤和对 PI 寄生虫的损伤。（B） 与 （A） 中相同的分析，即在没有 NK 细胞的情况下与抗 RBC IgG 孵育 3 小时的 iRBC。（C）如图2C所示的代表性实验，在NK细胞不存在的情况下进行。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011585.s002

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S3 图。 P的连环杀人。f.在iRBC中由单个NK细胞组成。

实验装置与图3所示相同。将 eFluor 450 染色的原代 NK 细胞（蓝色）与 eFluor 670 染色的 iRBC（红色）以 1：3 的比例在 2 μg/ml 抗红细胞 IgG 存在下孵育。PI是在图像记录开始时添加的。这 12 个时间范围跨越 52 分钟。每个面板左上角的数字表示相对于第一个 NK-iRBC 触点的时间（以分钟为单位），该触点设置为分钟 0。在时间 0 时，NK 细胞（标有星号）接触了幽灵 iRBC（在第一个面板中标记为 G，-7 分钟）。该幽灵 iRBC 包括一个 PI 阴性 PV，并且与一个完整的 iRBC 靶标（标记为 T）相邻。2分钟后（t = 2）通过增强的运动性和质膜延伸检测到与iRBC幽灵接触的NK细胞的激活。3 分钟后观察到 PV 损坏（黄色箭头）。一分钟后（t = 4 min），NK细胞覆盖iRBC靶标并开始移开。幽灵 iRBC 膜被 NK 细胞拖走，留下游离的 PI+ PV （t = 9）。运动的NK细胞接触其他几个iRBC（从t = 9开始）。PI+ PV 出现在 t = 20、27 和 45 处（黄色箭头）。请注意，在幽灵 iRBC（右下）中存在 PV，该 PV 保持 PI 阴性至少 52 分钟。

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S4 图。 NK 细胞、未感染红细胞、iRBC、幽灵 iRBC 和 PV 的电子显微镜图像。

(A） NK 细胞和三个未感染红细胞的 TEM 图像，它们在 2 μg/ml 抗红细胞抗体存在下共同孵育 3 小时。比例尺为5μm。（B） 在与 2 μg/ml 抗 RBC 抗体孵育期间，三个 NK 细胞与两个 iRBC 接触的 TEM 图像。同一 iRBC 两侧的两个 NK 细胞（左下和右下）被极化，如位于细胞后部的细胞核所示，远离具有 iRBC 靶标的免疫突触。左下角NK细胞与2个iRBC形成突触。顶部的NK细胞显然不那么极化，可能已经从幽灵iRBC中分离出来。比例尺为5μm。（C） 在没有抗红细胞抗体的情况下共同孵育的 NK 细胞和 iRBC 的 SEM 图像。比例尺为5μm。（D） 与 2 μg/ml 抗 RBC 抗体孵育后与 iRBC 接触的 NK 细胞的 SEM 图像。第一张图片（上图）中的 iRBC 似乎保留了一些刚性。在下图中，iRBC刚度的丧失表明NK细胞已经发生损伤。比例尺为 5 μm。（E） 中心PV的SEM图像，周围有四个NK细胞和三个iRBC重影（箭头），取自NK细胞和iRBC在2μg/ml抗RBC抗体存在下共孵后获得的样品。比例尺为5μm。

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S5 图。 门控用于将 iRBC 与 NK 细胞分离并识别游离 PV。

用 eFluor 670 和膜染料 PKH26 对 EXP2-GFP+ iRBC 进行染色。NK细胞用PKH67染色。首先通过前向和侧向散射将 iRBC 门控远离 NK 细胞，然后对 eFluor670+ PKH67 阴性细胞进行门控，然后对由游离 PV 组成的 PKH26 阴性 eFluor670+ 细胞群进行门控。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011585.s005

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S6 图。 制备从 iRBC 中提取的 PV 并用抗 RBC IgG 染色。

(A） 用膜染料 PKH26 和 eFluor 670 染色感染的 3D7 PfEXP2-GFP 感染的红细胞，并用 0.0125% 皂苷处理 3 分钟，然后通过 31 号针头洗涤和机械破坏 iRBC 质膜。（B） 通过流式细胞术对样品进行 PKH26 阴性 eFluor 670+ 颗粒的分选。（C） 未感染红细胞（未感染红细胞）、iRBC 和用不同浓度的抗红细胞 IgG 染色的 PV 的平均荧光强度 （MFI）。第一组点表示仅用二次抗体染色的样品（仅秒）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011585.s006

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S7 图。 eFluor 450+ 和 pHrodo+ 单核细胞的设门策略。

先前用 PV 孵育的单核细胞用活死染色剂染色，并对活单核细胞进行门控，并进一步对 eFluor 450+ 或 pHrodo+ 单核细胞进行门控。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011585.s007

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S1 电影。 图 3A 的视频。

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S2 电影。 图 3B 的视频。

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S3 电影。 S3 Fig. 的视频。

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S4 电影。 图 5C 的视频。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011585.s011

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S5 电影。 图 5D 的视频。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011585.s012

（移动）

S1 数据。 支持手稿中所示数字图表的主要数据。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011585.s013

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确认

美国国立卫生研究院 （NIH） 国家过敏和传染病研究所 （NIAID） 的研究得到了 NIAID 校内研究部的支持。我们感谢 L. Krymskaya 的细胞和液泡分选（细胞分选和分析核心，免疫遗传学实验室），J. Brzostowski 的成像帮助（Twinbrook 成像设施，免疫遗传学实验室），D. Dorward 和 E. Fischer 的电子显微镜（显微镜部门，落基山实验室，NIAID）。DSM1 （MRA-1161） 通过 MR4 获得，作为 NIAID 的 BEI 资源库的一部分。WR99210是雅各布斯制药公司（Jacobus Pharmaceuticals）的慷慨礼物。

引用

1.Tran TM、Li S、Doumbo S、Doumtabe D、Huang CY、Dia S 等。一项针对马里儿童和成人的密集纵向队列研究显示，没有证据表明对恶性疟原虫感染具有获得性免疫力。2013 年临床感染病;57(1):40–7.PMID：23487390

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2.Cohen S、Mc GI、Carrington S. 丙种球蛋白和对人类疟疾的获得性免疫。自然界。1961;192:733–7.PMID：13880318

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

3.Bournazos S， Gupta A， Ravetch 合资企业。IgG Fc 受体在抗体依赖性增强中的作用。Nat Rev 免疫学。2020;20(10):633–43.PMID：32782358

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

4.Teo A， Feng G， Brown GV， Beeson JG， Rogerson SJ.功能性抗体和预防血液期疟疾。趋势 Parasitol。2016;32(11):887–98.PMID：27546781

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

5.Boyle MJ、Reiling L、Feng G、Langer C、Osier FH、Aspeling-Jones H 等人。人类抗体固定补体以抑制恶性疟原虫侵袭红细胞，并与预防疟疾有关。免疫。2015;42(3):580–90.PMID：25786180

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

6.Arora G， Hart GT， Manzella-Lapeira J， Doritchamou JY， Narum DL， Thomas LM， et al. NK 细胞通过抗体依赖性细胞毒性抑制红细胞中恶性疟原虫的生长。生命。2018;7.PMID：29943728

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

7.Garcia-Senosiain A、Kana IH、Singh S、Das MK、Dziegiel MH、Hertegonne S 等。中性粒细胞在恶性疟原虫血期裂殖子的调速吞噬作用中占主导地位，可预防发热性疟疾。2021年;4(1):984.PMID：34413459

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

8.葡萄牙 S、Moebius J、Skinner J、Doumbo S、Doumtabe D、Kone Y 等。疟疾诱导的儿童炎症的暴露依赖性控制。PLoS 病理学。2014;10（4）：e1004079.PMID：24743880

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

9.Guha R、Mathioudaki A、Doumbo S、Doumtabe D、Skinner J、Arora G 等人。恶性疟原虫疟疾推动人类单核细胞的表观遗传重编程向调节表型发展。PLoS 病理学。2021;17（4）：e1009430.PMID：33822828

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

10.Dooley NL、Chabikwa TG、Pava Z、Loughland JR、Hamelink J、Berry K 等。疟疾在多个免疫细胞亚群中驱动独特的调节反应。生物Rxiv。2022:2022.11.16.516822.

查看文章Google 学术搜索

21 分钟Lautenbach MJ、Yman V、Silva CS、Kadri N、Broumou I、Chan S 等。系统分析显示，亲细胞抗体在塑造对疟疾的先天耐受性方面的作用。2022 年细胞代表;39(3):110709.PMID：35443186

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

12.Nideffer J， Ty M， Donato M， John R， Kajubi R， Ji X， et al. 通过反复疟原虫感染获得的疾病耐受性涉及先天免疫细胞的表观遗传重编程。生物Rxiv。2023:2023.04.19.537546.

查看文章Google 学术搜索

13.Long EO， Kim HS， Liu D， Peterson ME， Rajagopalan S. 控制自然杀伤细胞反应：激活和抑制信号的整合。Annu Rev Immunol.2013;31:227–58.PMID：23516982

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

24 分钟Cerwenka A， Lanier LL. 感染、炎症和癌症中的自然杀伤细胞记忆。Nat Rev 免疫学。2016;16(2):112–23.PMID：26806484

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

15.Bryceson YT、March ME、Ljunggren HG、Long EO。静息人类自然杀伤细胞的激活、共激活和共刺激。免疫学修订版，2006 年;214:73–91.PMID：17100877

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

26 分钟Bryceson YT、March ME、Barber DF、Ljunggren HG、Long EO。静息NK细胞中不同受体控制的溶细胞颗粒极化和脱颗粒。J Exp Med. 2005年;202(7):1001–12.PMID：16203869

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

27 分钟Mace EM、Dongre P、Hsu HT、Sinha P、James AM、Mann SS 等。获取NK细胞毒性的细胞生物学步骤和检查点。免疫细胞生物学 2014;92(3):245–55.PMID：24445602

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

18.Springer TA， Dustin ML. 整合素由内而外的信号传导和免疫突触。Curr Opin 细胞生物学 2012 年;24(1):107–15.PMID：22129583

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

29 分钟理发师 DF，长 EO。CD58 或 CD48 与细胞间粘附分子 1 在靶细胞上的共表达增强了静息 NK 细胞的粘附。免疫学杂志。2003;170(1):294–9.PMID：12496412

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

10 分钟Zhang M， March ME， Lane WS， Long EO.β2整合素刺激的信号转导网络促进细胞毒性细胞中裂解颗粒的极化。SCI信号。2014;7（346）：RA96.

查看文章Google 学术搜索

11 分钟Bryceson YT、March ME、Ljunggren HG、Long EO。静息NK细胞受体之间的协同作用，以激活天然细胞毒性和细胞因子分泌。血。2006;107(1):159–66.PMID：16150947

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

12 分钟Liu X， Lieberman J. Knocking 'em Dead： Pore-forming Proteins in Immune Defense（《敲死他们：免疫防御中的成孔蛋白》）。Annu Rev Immunol.2020;38:455–85.PMID：32004099

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

13 分钟庄旭， 龙 EO.CD28 homolog 是一种强的自然杀伤细胞激活剂，用于裂解 B7H7（+） 肿瘤细胞。癌症免疫研究 2019;7(6):939–51.PMID：31018957

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

14 分钟Grier JT、Forbes LR、Monaco-Shawver L、Oshinsky J、Atkinson TP、Moody C 等。人类免疫缺陷引起的突变定义了自发性NK细胞毒性中的CD16。J Clin 投资。2012;122(10):3769–80.PMID：23006327

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

15 分钟Liu LL， Landskron J， Ask EH， Enqvist M， Sohlberg E， Traherne JA， et al. CD2 共刺激在 NKG2C 缺陷人类中揭示的适应性自然杀伤细胞反应中的关键作用。2016 年细胞代表;15(5):1088–99.PMID：27117418

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

16 分钟Hart GT、Tran TM、Theorell J、Schlums H、Arora G、Rajagopalan S 等。暴露于恶性疟原虫的人群中的适应性NK细胞与预防疟疾有关。J Exp Med. 2019年;216(6):1280–90.PMID：30979790

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

17 分钟Ty M、Sun S、Callaway PC、Rek J、Press KD、van der Ploeg K 等。疟疾驱动的适应性样功能性CD56阴性NK细胞扩增与疟疾的临床免疫相关。Sci Transl Med. 2023;15（680）：eadd9012.PMID：36696483

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

18 分钟Burshtyn DN， Shin J， Stebbins C， Long EO.与靶细胞的粘附被杀伤细胞抑制受体破坏。Curr Biol. 2000年;10(13):777–80.PMID：10898979

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

19 分钟Lee G、Lo A、Short SA、Mankelow TJ、Spring F、Parsons SF 等。靶向基因缺失表明细胞粘附分子 ICAM-4 对成红细胞岛的形成至关重要。血。2006;108(6):2064–71.PMID：16690966

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

30.Hermand P、Huet M、Callebaut I、Gane P、Ihanus E、Gahmberg CG 等。白细胞 β2 整合素（LFA-1、Mac-1）在人 ICAM-4/LW 血型蛋白上的结合位点。生物化学杂志 2000;275(34):26002–10.PMID：10846180

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

31.Spring FA、Parsons SF、Ortlepp S、Olsson ML、Sessions R、Brady RL 等。细胞间粘附分子-4 通过新的整合素结合机制结合 α（4）β（1） 和 α（V）-家族整合素。血。2001;98(2):458–66.PMID：11435317

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

32.Egan ES， Jiang RH， Moechtar MA， Barteneva NS， Weekes MP， Nobre LV， et al. 疟疾.前向遗传学筛查发现红细胞 CD55 是恶性疟原虫侵袭所必需的。科学。2015;348(6235):711–4.PMID：25954012

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

33.Kanjee U， Gruring C， Chaand M， Lin KM， Egan E， Manzo J， et al. CRISPR/Cas9 敲除揭示了恶性疟原虫侵袭的菌株-超越性红细胞决定簇之间的遗传相互作用。美国国家科学院院刊 2017;114（44）：E9356–E65。PMID：29078358

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

34.格鲁沙科娃 S、汉弗莱 G、莱基娜 E、巴拉班 A、米勒 J、齐默尔伯格 J.在正常和镰状红细胞中成像的疟疾寄生虫出口计划的新阶段。Curr Biol. 2010年;20(12):1117–21.PMID：20537541

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

35.Ho CM、Beck JR、Lai M、Cui Y、Goldberg DE、Egea PF 等。疟疾寄生虫易位子结构及其效应输出机制.自然界。2018;561(7721):70–5.PMID：30150771

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

36.Schlums H、Cichocki F、Tesi B、Theorell J、Beziat V、Holmes TD 等。巨细胞病毒感染通过改变信号传导和效应功能驱动NK细胞的适应性表观遗传多样化。免疫。2015;42(3):443–56.PMID：25786176

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

37.Shimaoka M， Xiao T， Liu JH， Yang Y， Dong Y， Jun CD， 等.α L I 结构域的结构及其与 ICAM-1 的复合物揭示了整合素调节的变形途径。细胞。2003;112(1):99–111.PMID：12526797

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

38.谢尔比 JP、怀特 J、加内桑 K、拉索德 PK、邱 DT。恶性疟原虫感染的红细胞单细胞毛细血管阻塞的微流控模型。美国国家科学院院刊，2003年;100(25):14618–22.PMID：14638939

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

39.希尔林豪斯 S、达桑娜 AK、贡珀 G、费多索夫 DA。红细胞变形性对疟疾寄生虫入侵时排列的重要性。生物物理学杂志 2019;117(7):1202–14.PMID：31540708

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

40.Maier AG、Rug M、O'Neill MT、Brown M、Chakravorty S、Szestak T 等。恶性疟原虫感染的人红细胞的毒力和刚性所需的输出蛋白质。细胞。2008;134(1):48–61.PMID：18614010

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

71 分钟Kechagia JZ， Ivaska J， Roca-Cusachs P. 整合素作为微环境的生物力学传感器。《自然》杂志评论了分子细胞生物学。2019;20(8):457–73.

查看文章Google 学术搜索

42.Demetriou P、Abu-Shah E、Valvo S、McCuaig S、Mayya V、Kvalvaag A 等人。免疫突触外缘的富含 CD2 的动态隔室可增强和整合信号。Nat 免疫。2020;21(10):1232–43.PMID：32929275

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

73 分钟Junqueira C， Polidoro RB， Castro G， Absalon S， Liang Z， Sen Santara S， et al. gammadelta T 细胞通过直接杀伤和吞噬作用抑制恶性疟原虫血液阶段感染。Nat 免疫。2021;22(3):347–57.

查看文章Google 学术搜索

74 分钟弗兰克-法亚德 B、福纳格 J、布拉克斯 A、汗 SM、詹斯 CJ。人类疟疾寄生虫的隔离和组织积累：我们能从疟疾的啮齿动物模型中学到什么吗？PLoS 病理学。2010;6（9）：e1001032.PMID：20941396

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

45.Hernandez-Castaneda MA， Happ K， Cattalani F， Wallimann A， Blanchard M， Fellay I， et al. gammadelta T 细胞在晚期血液阶段以颗粒酶和颗粒溶菌素依赖性机制杀死恶性疟原虫。免疫学杂志。2020;204(7):1798–809.

查看文章Google 学术搜索

46.Junqueira C、Barbosa CRR、Costa PAC、Teixeira-Carvalho A、Castro G、Sen Santara S 等。细胞毒性CD8（+）T细胞识别并杀死间日疟原虫感染的网织红细胞。2018 年;24(9):1330–6.PMID：30038217

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

77 分钟Gazzinelli RT、Kalantari P、Fitzgerald KA、Golenbock DT。疟疾寄生虫的先天感应。Nat Rev 免疫学。2014;14(11):744–57.PMID：25324127

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

48.Sharma S、DeOliveira RB、Kalantari P、Parroche P、Goutagny N、Jiang Z 等。恶性疟原虫基因组中富含 AT 的茎环 DNA 基序的先天免疫识别。免疫。2011;35(2):194–207.PMID：21820332

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

49.Kalantari P、DeOliveira RB、Chan J、Corbett Y、Rathinam V、Stutz A 等。疟疾期间疟原虫来源的血红素和 DNA 对 NLRP3 和 AIM2 炎症小体的双重参与。2014 年细胞代表;6(1):196–210.PMID：24388751

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

60 分钟Parroche P、Lauw FN、Goutagny N、Latz E、Monks BG、Visintin A 等。疟疾血细胞素具有免疫惰性，但通过将疟疾 DNA 呈递给 Toll 样受体 9 从根本上增强先天反应。美国国家科学院院刊，2007年;104(6):1919–24.PMID：17261807

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

61 分钟Pack AD、Schwartzhoff PV、Zacharias ZR、Fernandez-Ruiz D、Heath WR、Gurung P 等。血霉素介导的炎症小体激活限制了长期抗疟疾免疫力。2021 年细胞代表;36(8):109586.PMID：34433049

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

52.Dvorak JA， Miller LH， Whitehouse WC， Shiroishi T. 疟疾裂殖质侵袭红细胞。科学。1975;187(4178):748–50.PMID：803712

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

53.Murphy SC、Fernandez-Pol S、Chung PH、Prasanna Murthy SN、Milne SB、Salomao M 等。人类疟疾寄生虫恶性疟原虫感染期间红细胞筏脂质的细胞质重塑。血。2007;110(6):2132–9.PMID：17526861

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

54.Haldar K、Murphy SC、Milner DA、Taylor TE。疟疾：红细胞感染的机制和严重疾病的病理相关性。安努牧师帕索尔。2007;2:217–49.PMID：18039099

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

55.Murphy SC、Samuel BU、Harrison T、Speicher KD、Speicher DW、Reid ME 等。红细胞洗涤剂抗性膜蛋白：它们在疟疾感染期间的表征和选择性摄取。血。2004;103(5):1920–8.PMID：14592818

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

56.Lee AJ， Mian F， Poznanski SM， Stackaruk M， Chan T， Chew MV， et al. NK细胞上的I型干扰素受体负向调节干扰素-γ的产生。免疫学前沿。2019;10:1261.

查看文章Google 学术搜索

67 分钟Crompton PD、Traore B、Kayentao K、Doumbo S、Ongoiba A、Diakite SA 等。镰状细胞性状与疟疾的延迟发作有关：对疟疾临床研究中事件发生时间分析的影响。J Infect Dis. 2008年;198(9):1265–75.PMID：18752444

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

68 分钟Scully EJ、Shabani E、Rangel GW、Gruring C、Kanjee U、Clark MA 等。从外周血中生成永生化的红系祖细胞系：用于疟原虫侵袭功能分析的模型系统。Am J Hematol。2019;94(9):963–74.PMID：31148215

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

69 分钟Sanjana NE， Shalem O， Zhang F. 用于 CRISPR 筛选的改进载体和全基因组文库。Nat 方法。2014;11(8):783–4.PMID：25075903

查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索

60.Ghorbal M， Gorman M， Macpherson CR， Martins RM， Scherf A， Lopez-Rubio JJ. 使用 CRISPR-Cas9 系统对人类疟疾寄生虫恶性疟原虫进行基因组编辑。国家生物技术。2014;32(8):819–21.PMID：24880488

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