免费医学论文发表-通过市政污水处理去除肠道病毒，以达到饮用水再利用的要求
抽象
城市废水的一级和二级处理有助于在高级净化的上游去除病毒，从而生产出饮用水再利用。在这项研究中，通过可培养和分子方法在24个月内测量了来自两个市政污水处理厂的原始废水进水和二次出水中的病毒发生率，这两个污水处理厂共同为先进的水净化设施提供了循环水源。使用基于协方差的秩对统计方法，确定了在两个设施中并行运行的四个废水处理过程（两个活性污泥过程、滴流过滤器过程和滴流过滤器/固体接触器过程）的病毒日志去除值。滴滤过程对可培养肠道病毒的去除率最低，中位去除率为 1.0 log10（或 90% 去除）和 5第百分位对数去除率为0.73（或82%），而对其中一个活性污泥过程观察到的最大去除率（中位数对数去除率为2.4或99.6%，5第百分位数为 2.1 或 99.2%）。对于涓流过滤器，男性特异性 （MS） 和体细胞 （SOM） 大肠杆菌的中位对数去除率分别为 1.8（98.6% 去除率）和 0.5 （70%），活性污泥为 2.9 （99.9%） 和 2.0 （99%）。因此，大肠杆菌的去除与可培养的肠道病毒的去除非常相似。可培养肠道病毒5第向州监管机构提出了从滴滤过滤处理过程中去除百分位数 （0.7） 的信用，以抵免与使用净化再生水增强地下水相关的国家病毒去除要求。获得二级废水处理的病原体去除信用额度将允许提高信用额度的利润率（安全系数），超过所需的最低要求;在这种情况下，还可以通过减少获得足够信用所需的地下旅行时间，增加更靠近饮用水生产井的可行未来地下水补给站点的数量。
数字
Table 1Fig 4Fig 1Fig 2Fig 3Table 1Fig 4Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Polanco JA、Safarik J、Dadakis JS、Johnson C、Plumlee MH （2023） 通过市政废水处理去除肠道病毒以达到饮用水再利用的要求。PLOS水2（9）： e0000052 中。 https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052
编辑 器： 西尔维娅·蒙泰罗（Silvia Monteiro），葡萄牙里斯本高等技术学院
收到： 2022年7月15日;接受： 2023年4月30日;发表： 9月 27， 2023
版权所有： ? 2023 Polanco et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 支持信息文件中的所有数据。
资金： 资助本研究的赠款和协议编号：1） 大都会水区（未来供应行动资助计划），协议编号：189638。获得该奖项的作者：JD、MHP、CJ、JS、JP 2）水研究基金会订户优先研究计划（2018），项目资助协议编号：5041（项目5041）。获得该奖项的作者：JD、MHP、CJ、JS、JP 作者没有从商业公司获得这项工作的资助。提交人没有从商业公司获得任何其他资金的报酬。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者宣称不存在任何利益冲突。
介绍
随着干旱地区的不断发展，提供可靠且有弹性的饮用水源以满足需求至关重要。有计划的饮用水再利用通过实施有意识的再生水再利用作为饮用水源来应对这一挑战。“间接”饮用水再利用（IPR）是指使用经过处理的再生水来增加储存在环境中的现有饮用水源，即地下水含水层或地表水库[1,2]。 这种做法代表了一种工程化的、可持续的水安全解决方案。
2014 年，加利福尼亚州水资源控制委员会 （SWRCB） 饮用水部 （DDW） 最终确定了通过地下水补给进行知识产权的法规。这些法规规定，知识产权项目必须满足病毒、贾第鞭毛虫和隐孢子虫的高对数减少值（LRV）分别为12、10和10（“12/10/10规则”）[3]。该州的知识产权项目，如奥兰治县水区（OCWD）地下水补给系统（GWRS）必须证明，在源头原始废水（即未经处理的废水处理厂[WWTP]）和饮用水源（即循环水含水层补给位置的下坡处的饮用水井产生的地下水）之间，满足了病毒（12个对数或99.9999999999%）和原生动物（10个对数）的要求[3–5].日志删除积分可以分配给发生在这两个点之间的不同单元处理过程，并相加以满足要求 [6]。
可用的数据集数量有限，可以定量描述初级和二级废水处理的病毒去除程度。最近在加利福尼亚州圣地亚哥附近的废水处理设施进行的两项研究评估了肠道病毒、贾第鞭毛虫和隐孢子虫的去除效果[7,8]。 圣地亚哥市的病原体监测研究[7]对其北城再生水厂实施了一项长期抽样计划，以表征病毒去除的特征，并且是加利福尼亚州第一项获得病毒原木去除学分的研究。这两项研究都证明了病毒日志的去除，其中Pecson等[7]提出了5第百分位数为0.7的对数去除值，Bartolo等[8]（针对不同的设施）提出了用于活性污泥废水处理的肠道病毒的中位数为2.8的对数去除值。尽管人们普遍认为在废水处理过程中会发生病毒去除，但除非进行适当的特定部位研究并批准建立保守的病毒对数去除值，否则不会被识别（记入）去除[9]。获得特定地点的微生物数据并辨别量化病毒去除的适当统计方法是本文报告的研究重点。
本研究的目的是使用可培养和分子方法以及其他微生物指标测量常规废水处理过程中的病毒发生和去除，并选择和执行适当的统计方法，以使用病毒数据保守地计算病毒的总去除量（对数去除值）以获得饮用水再利用处理的潜在监管信用。这是通过监测一个运营着两个城市污水处理厂的废水收集机构在原始废水进水和二次废水中的24个采样事件中的微生物目标来实现的。一家工厂目前作为先进水净化设施的循环水源，另一家工厂将在不久的将来开始供应[6]。虽然最初的目标是在一年内完成 24 项活动（涵盖所有季节），但由于 SARS-CoV-2 大流行，采样时间延长了两年。根据独立专家委员会的建议，比较了两种不同的数据分析统计方法[10,11]，包括基于蒙特卡罗模拟的方法和基于秩对的协方差方法。使用每种不同的方法分析微生物浓度数据，以生成概率分布并计算病毒日志去除值。在抽样期间，对工厂收集的常规污水处理厂运行性能数据进行了分析，以确定代表正常性能和条件的运行范围。
像这里研究的饮用水再利用项目一样，受到高度监管和审查。在废水处理、高级净化和包括土壤含水层处理 （SAT） 在内的任何处理阶段为现有处理提供额外的 LRV 信用额度，可以增加信心，并为饮用水再利用项目提供额外的余量（安全系数），以可靠地满足严格的监管要求（即 12/10/10 规则）。对于GWRS等一些项目，它还可以减少获得足够信用所需的地下旅行时间，从而增加靠近饮用水投射井的可行补给点的数量。
方法
OC San 和 OCWD 设施说明
奥兰治县卫生区 （OC San） 是一家资源回收机构，负责收集、处理、处置和回收加利福尼亚州奥兰治县中部和北部约 260 万人产生的废水。OC San 经营着两家处理厂，分别是位于喷泉谷的 OC San 1 号填海厂 （P1） 和位于亨廷顿海滩的 2 号处理厂 （P2）。OCWD 运营着一个与 OC San P1 位于同一地点的先进净水设施 （AWPF），目前基本上接收所有 OC San P1 废水作为源水，通过饮用水再利用的深度处理或非饮用水再利用的三级处理进行再利用。OCWD 目前尚未回收 P2 二次污水，但大部分将在 2023 年 GWRS 最终扩建 （GWRSFE） 的 AWPF 扩建完成后回收。
GWRS是OC San和OCWD的联合项目，是一个知识产权项目，旨在从OC San收到的二级处理废水进行高级净化，每天从废水中产生1亿加仑（MGD）的高纯度水，否则这些废水将被排放到海洋中。GWRSFE完成后，将生产130 MGD。GWRS的主要组成部分包括AWPF，泵站以及将净化后的循环水输送到OCWD的补给池和注入井的管道。OCWD AWPF处理系统由微滤（MF）或超滤（UF）组成，然后是反渗透（RO）和紫外线高级氧化过程（UV/AOP），最后是脱碳和石灰稳定。经过深度处理后，这种高度纯净水的一部分被注入附近的海水入侵屏障，其余的水沿着 13 英里长的管道泵送，输送到其他 OCWD 注入井，最后输送到扩散盆地（渗滤池）进行地下水补充。AWPF 和相关的地下水补给基础设施由 OCWD 运营，以补充和增加该地区的主要饮用水供应——储存在奥兰治县地下水盆地的地下水。
关于病毒清除学分，AWPF 目前从 RO 处理中获得 2 个对数去除学分，从 UV/AOP 中获得 6 个对数去除学分（8 个对数总学分）。由于病毒的尺寸相对于较大的MF孔径较小，因此在RO之前通过MF去除病毒不予考虑，也不对氯化（在MF之前添加氯以形成氯胺以控制膜生物污染）给予信用。在AWPF进行处理后，根据纯净水渗透或注入地点与饮用水井生产地点之间的旅行时间，GWRS每一个月在地下清除一次对数病毒。DDW之所以授予这一荣誉，是因为人们普遍期望在SAT期间去除病毒（保守地基于Yates等人，1985[12,13]），但应该注意的是，在正常操作期间，纯化成品水中发生任何此类病原体的可能性都极小[14]。因此，目前对于GWRS来说，需要4个月的地下保留时间才能满足12个对数的肠道病毒去除要求[3,12]。每个治疗步骤的病毒学分（包括 SAT）的基本原理不在本摘要的范围之内，但通常在加利福尼亚州（以及其他具有类似饮用水再利用监管框架的州）根据特定地点的研究、建模和/或该州的既定指南的组合授予。
OC San 采样位置
共监测了 OC San P1 和 P2 的六 （6） 个采样点。OC San P1 和 P2 处理过程的简化流程图可在 S1 图中找到。OC San P1的采样位置为原始废水进水（原始进水）、滴滤器（TF）二次出水、活性污泥1（AS1）二次出水和活性污泥2（AS2）二次出水。P1 的原始废水是在初级酒吧筛选之后收集的，但在初级澄清和化学添加之前。第一台 P1 处理系统将主要废水输送到 TF 工艺，然后进行二级澄清。对二次澄清后TF工艺处理的流出物进行取样。P1 初级流出物也通过两个平行的活性污泥 （AS） 处理系统输送，分别命名为 AS1 和 AS2。二次澄清后，从每个AS工艺中抽取二次流出物样品。两种 AS 列车均以硝化-部分反硝化 （NDN） 模式运行，AS1 和 AS2 工艺之间的主要区别在于 AS1 不接收混合液回流，而较新的 AS2 设施接收混合液回流。
OC San P2 采样位置仅限于原始进水和滴流过滤器/固体接触器 （TF/SC） 二次出水（即二次澄清后），因为 GWRSFE 将在 2023 年向 GWRS 供应该工厂的 P2 TF/SC 二次出水，并与 P1 供应的二次出水混合。OC San P2 处理来自 OC San 服务区西部和沿海地区的废水以及圣安娜区域拦截器 （SARI） 干线（盐水管线）、来自 P1 和 P2 的生物固体浓缩和脱水的浓缩液流以及其他侧流。在本研究中，P2 的原始进水是在初步筛选后、化学添加、初级澄清和浓缩回流之前收集的。
工厂性能和运行参数
在本研究中，工作范围值（ORV）被确定并定义为描述在本研究微生物采样期间观察到的污水处理厂典型和正常处理过程操作的参数值。开发这些 ORV 的目的是，未来在 WWTP 中为 12 个日志要求而授予的任何病毒清除学分都取决于满足 ORV 的设施，基于 30 天的平均性能，与研究建议的基线下限或上限 ORV 进行比较。
对于向OCWD AWPF进水供应的每个二级处理工艺，即P1 TF、AS1、AS2和P2 TF/SC的关键工厂运行参数（即AS1、AS2和TF/SC的平均细胞停留时间（MCRT）以及TF的总生物需氧量[BOD-T]），得出ORV。超过指定的ORV表示偏离正常治疗效果。换言之，超标将表明污水处理厂在正常操作范围之外运行，并且不会在该时间段内授予病毒日志信用。这种偏差可能与意外事件有关，但也可能是由于计划的活动，例如处理系统的操作维护或OC San操作员的流量调整。有关为本研究计算的 ORV 和值的详细信息，（参见 S7 文本和 S3 表）。
微生物靶标和样品分析
对原始进水样品和二次流出物样品进行肠道病毒、雄性特异性 （MS） 大肠脂、体细胞 （SOM） 大肠菌群以及总大肠菌群和粪便大肠菌群的分析。为了分析肠道病毒样本，使用EPA方法1615中所述的基于培养的分子检测方法对样本进行拆分和分析[15]。对于MS和SOM大肠菌计数，将2升抓取样品收集在无菌聚丙烯Nalgene瓶中，并使用EPA方法1602进行处理，并进行双琼脂层修饰[16]。对于总大肠菌群和粪便大肠菌群分析，将 100 mL 抓取样品收集在无菌 IDEXX 瓶中，并分别根据标准方法 9222B 和 9222D 进行计数 [17]。Polanco等[6]提供了用于样品分析的方法的详细信息，包括对EPA 1615病毒分子检测方法的微小修改。
样品采集
进水的原始样品。
将进水进料样品收集在两个 1 升无菌高压灭菌的高密度聚乙烯瓶中。在样品采集前，将样品水龙头冲洗 2-3 分钟。注意确保样品瓶和样品龙头之间没有物理接触。样品被放在冰上进行装运和加工。在PEG浓缩后分离样品进行培养和分子测定[18]。
二次出水。
通过一次性死端聚砜中空纤维超滤器（Innovaprep 的 Rexeed-25 S 超滤器套件）过滤 25 升来收集二次流出物样品。根据制造商的说明在现场进行过滤。所有管路、接头和瓶盖均在受控实验室环境中进行消毒和高压灭菌。采用无菌技术，在中空纤维过滤器前方安装压力表和蠕动泵，以泵送和监测进水压力。使用安装在渗透管上的流量计监测过滤体积（渗透液）。过滤后，小心地将超滤器卸下，重新盖上盖子，用 10% 的漂白剂溶液擦拭并保存在冰上。
使用由加压的 0.075% 吐温 20 磷酸盐缓冲溶液组成的大容量洗脱罐从每个超滤器中提取二级流出浓缩物。超滤洗脱液通过无菌的0.22 μm孔过滤器过滤，并分成一系列子样品，用于基于培养的肠道病毒分析和DNA提取（分子检测）[18]。有关超滤程序的详细信息，请参见 S2 文本。
采样频率
在研究过程中，共完成了 24 个抽样事件。从六个采样地点中的每一个地点收集样本，时间跨度为一到三天，构成一个采样事件。平均而言，由于与大流行相关的采样推迟，每月安排两次采样活动，总共持续了 24 个月。还在每个地点以交错的时间表收集所有微生物靶标的重复样品。除了收集一次的 P2 原始进水重复样本外，在研究期间，所有地点总共收集了两个重复样本。每月从所有六个地点收集一次用于大肠脂肪评估的抓取样本，同时收集肠道病毒样本，因此该研究期间共报告了 12 次大肠脂肪采样事件。所有样品均立即发货和处理，以符合样品保持时间标准和质量保证。
没有尝试根据平均系统水力停留时间（即拉格朗日采样）对出水和进水样品进行时间收集，因为这通常很困难且不可靠，并且因为确定原木移除的预期数据分析方法不需要它。本研究采用的两种数据分析方法都是根据对观察到的进水和出水浓度分布的统计评估来计算病毒的去除。考虑到使用利用完整采样分布的统计分析可能被认为优于同一天的进水-出水配对[19]。
质量管理
为了确定病毒回收效率，将基质刺突回收 （MSR） 样品与肠道病毒和大肠杆菌样品的子集同时收集。在总共 24 个样本中，每个原始进水采样位置共收集了 9 个原始进水 MSR 样本。对于每个二级污水采样位置，收集了五个 MSR 样品，给定四个二级污水采样位置，在研究过程中总共产生了 20 个二级污水 MSR 样品。将已知浓度的男性特异性 （MS） 大肠杆菌 （ATCC 15597-B1）、体细胞 （SOM） 大肠杆菌 （ATCC 13706-B1） 和脊髓灰质炎病毒 （ATCC VR1562） 直接加标到原始进水样品中，并在洗脱前加入超滤装置中，以确定和评估方法回收率。对于ddPCR回收率，将肠道病毒和诺如病毒GII的装甲RNA靶标加入到原始进水样品中以已知浓度加入超滤装置中。有关如何处理 MSR 样品的更多信息，请参阅（参见 S3 和 S4 文本）。
中位数和 5 的测定第百分位病毒清除
根据过去加州研究的先例，DDW 将第 5 个百分位的 LRV 视为首选的统计学保守去除值，作为特定治疗过程授予病原体信用的基础，而不是 50第百分位数或平均值[3,8]。 计算 5第使用百分位数 LRV，并使用 OC San P1 和 P2 中每个二级处理过程的肠道病毒和大肠菌微生物浓度数据进行比较。
这两种方法包括基于协方差的秩对方法和基于蒙特卡罗模拟的方法。尽管 OCWD GWRS 接收来自 OC San P1 处理过程（到 2023 年也包括 OC San P2 处理过程）的二次流出物的混合物，但通过分别计算 5第来自 OC San P1 和 P2 的每个不同二级污水处理过程的百分位数 LRV，而不是最终混合污水。换言之，在对进水和出水分布进行了一些潜在的数据合并方法之后，决定不尝试将观察到的单独植物数据集结合起来以确定一个“整体”5第百分位数 LRV 作为表示 AWPF 之前的多个废水处理过程的手段。人们认识到，相反，更简单地说，来自废水处理的病毒LRV信用可以保守地建议基于观察到的最低个体处理过程肠道病毒LRV。换句话说，最低的 5第在所研究的四种废水处理工艺中，百分位 LRV 被提议作为饮用水再利用 12 对数病毒要求的信用值。
协方差法
对于[20]所述的基于协方差的秩配对方法，假设来自污水处理厂的进水和出水数据是相关的（相关）。该方法使用样本均值的估计值，然后计算出样本协方差的标准差，这些协方差来自两个相关的随机正态分布，即原始进水病毒浓度分布和流出病毒浓度分布。使用Microsoft Excel软件分析微生物浓度数据。对于进水和出水分布，首先对每个样本结果（即病毒浓度）进行对数转换，平均 LRV（μLRV系列）的计算公式如方程1所示：
(1)
在哪里μINF的是进水分布和μ的平均对数值伊芙是污水分布的平均对数值。
为了确定协方差，对数转换的进水和出水数据按从小到大的顺序进行排序。这些来自进水分布的排名值与来自污水分布的排名值（即排名配对）配对，以计算排名配对样本协方差。要确定两个分布是否协变，每个分布的条目数必须相同，即进水样本数必须等于流出物样本数。然后使用方程 2 使用方程 1 中计算的平均 LRV 项、z 分数统计量和样本协方差的标准差来估计 LRV 概率分布：
(2)
在哪里μLRV系列是在方程 1 中计算的平均 LRV，Z 表示给定概率（例如 5）的 z 分数或标准分数第百分位数和σ变量-Δ是进水和出水分布之间样品协方差的标准差。
样本协方差的标准差 （σ变量-Δ）使用下面的方程3计算，这需要求解进水分布的方差、出水分布的方差以及进水和出水分布之间的协方差。对于每个相应的对数转换分布，可以分别使用 Microsoft Excel 的方差和协方差公式计算这些参数。
(3)
其中 var（Inf） 是进水分布的方差，var（Eff） 是出水分布的方差，cov（Inf，Eff） 是进水和出水分布之间的协方差相关性。
第 5 个百分位数 LRV 是使用方程 2 中的第 5 个百分位数 z 分数或 z = （-） 1.645 获得的。使用方程 2 生成每个处理过程和微生物靶标的 LRV 概率图。
蒙特卡罗模拟
用于计算 5 的第二种统计方法第百分位LRVs是蒙特卡罗模拟方法[8]。蒙特卡罗模拟方法涉及对原始进水和二次出水微生物浓度数据的对数正态分布进行统计分析，以生成给定微生物目标的对数去除值的概率分布模型。由于蒙特卡罗模拟从两个独立的对数正态变量估计统计参数，因此蒙特卡罗模拟的任何结果都代表了由LRV计算的正态性定义的解析解的近似值[21]。有关此方法的详细信息，请参阅 S8 文本。本研究对蒙特卡洛方法的一个关键修改是在确定 5第可以提议用于监管信贷的百分位 LRV。这种修改是基于认识到在废水处理过程中不可能进行阴性去除（人类肠道病毒形成）而进行的。因此，本文所述方法被称为“修正的”蒙特卡罗方法。修改将在后面的讨论中进一步讨论，以及（见S8文本）[6]。
数据分析和概率分布
微生物浓度数据在R中使用ggplot2软件绘制，微生物概率分布图和LRV图（即分位数图）使用文献中描述的传统参数绘制[8,22,23]。 对于每个采样点，使用最佳拟合线对浓度值的分布进行建模。使用 Dixon 的 Q 检验和 Grubbs 统计异常值检验对每个分布的异常值进行测试。最后，使用 Contchart 软件测试所有分布的对数正态适应度。最后，获得百分位排名数据，包括 5第百分位值，则使用 Microsoft Excel 百分位数公式。在应用该公式之前，将对数去除值转换为去除百分比，这是准确计算百分位数所必需的[24]。如上所述，为了绘制通过协方差分析方法计算的 LRV 分布，将第 5 个百分位数、中位数和第 95 个百分位数值绘制在概率图上。对于蒙特卡罗模拟方法，使用所有模拟 （n = 10,000） LRV 绘制了 LRV 分布的概率图。
结果
微生物浓度数据
图1总结了可培养的肠道病毒、肠道病毒和诺如病毒GII靶标、MS大肠杆菌、SOM大肠杆菌以及总大肠菌群和粪便大肠菌群的微生物浓度数据（图1）。可培养肠道病毒、MS大肠杆菌和SOM大肠杆菌浓度均高于检出限，完全符合方法病毒接受标准。可培养肠道病毒、MS大肠杆菌和SOM大肠杆菌的浓度数据通过病毒回收进行校正，如S4文本[6]所述。相比之下，肠道病毒和诺如病毒GII分子浓度数据被报告为许多二级污水样品的未检出（见S1表），并且经常观察到进水和二级污水样品的回收率较差。由于分子方法的病毒回收率较差（回收率超出验收标准）、MSR实验中的非检测值和统计异常值，天然肠道病毒和诺如病毒GII浓度未通过回收率进行校正。最后，由于这些数据在整个研究中作为标准的微生物指示剂对照，因此没有调整大肠菌群数据的回收率。所有微生物浓度的详细统计属性可在 S2 表中找到。
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图 1. 可培养肠道病毒、肠道病毒 （ddPCR） 和诺如病毒 GII （ddPCR） 的浓度。
对可培养的肠道病毒数据 （A） 进行病毒回收校正，并通过 EPA 1615 可培养感染性测定获得，并报告为每升最可能的数量 （MPN/L）。图中还显示了通过液滴数字聚合酶链反应 （ddPCR） 获得的肠道病毒和诺如病毒 GII （B） 的基因拷贝检测。通过 EPA 1602 获得的男性特异性和体细胞大肠杆菌数据 （C） 也通过病毒回收进行校正，并报告为每升斑块形成单位数 （PFU/L）。分别使用标准方法 9222B 和 9222D 枚举粪便和总大肠菌群数据 （D），并以每毫升菌落数报告。原始进水浓度以灰色显示，二级出水浓度以深绿色 （P1 TF）、深蓝色 （P1 AS1）、浅蓝色 （P1 AS2） 和浅绿色 （P2 TF/SC） 显示。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.g001
在 P1 原始进水 （5.5x101至 4.5x104MPN/L）通常大于P2（5.4.101至 1.6x104MPN/L），如P1（1.3x103MPN/L） 比 P2 （7.5x102MPN/L），但无显著差异（S2表）。在1.3x10时，可培养肠道病毒的P1 TF流出物几何平均浓度大于其他流出物2MPN/L，与 4.9、1.3x10 相比1和 3.7x101P1 AS1、P1 AS2 和 P2 TF/SC 流出物的 MPN/L（S2 表）。最重要的是，通过可培养的感染性测定获得的数据表明，在所有监测的治疗设施中，培养的肠道病毒都被显着去除。当按采样日期按时间顺序绘制时，尽管每个处理过程的去除量存在一些变化，但在整个采样日期中都观察到肠道病毒去除（见S2图）。
未经校正的分子浓度数据显示，P1（1.8x104至 1.8x106GC/L）和P2（1.0x104至 2.7x106GC/L）。同样，诺如病毒GII浓度在P1（4.7x104至 3.8x106） 和 P2 （3.4x104至 3.8x106).对于P1和P2，原始进水诺如病毒GII几何平均浓度均高于肠道病毒。在二级出水浓度方面，肠道病毒和诺如病毒GII几何平均浓度在P1 TF出水中最高，其次是P2 TF/SC出水，P1 AS1和P1 AS2出水（S2表）。所有次级流出部位均显示出病毒遗传物质的去除，其中（与可培养的肠道病毒一样）P1 TF的去除率最低。
P1 和 P2 之间原始进水的 MS 和 SOM 大肠脂浓度相似，与 SOM 大肠脂相比，观察到的 MS 大肠脂浓度范围更广（S2 表）。虽然二次出水的MS和SOM共脂浓度因工艺而异，但所有工艺也都显示出MS和SOM共脂的去除。P1 的 AS1 和 AS2 处理过程显示出最低的共脂几何平均浓度（最高去除率），而 P1 TF 流出物的平均浓度最高（S2 表）。
最后，P1和P2之间原始进水的粪便大肠菌群浓度范围也相似，总大肠菌群浓度范围也相似（S2表）。两种植物原始进水的总大肠菌群几何平均浓度均大于粪便大肠菌群。在 P1 和 P2 进行二次处理后，总大肠菌群和粪便大肠菌群的浓度降低。P1 TF出水的总大肠菌群和粪便大肠菌群在所有次级出水部位的几何平均浓度最高（去除率最低），其次是P2 TF/SC出水、P1 AS2出水和P1 AS1出水。
病毒恢复和数据更正
P1 和 P2 原始进水的平均可培养肠道病毒回收率分别为 99% 和 103%（S1 表）。二次流出物样品的平均可培养肠道病毒回收率因处理工艺而异（TF为49%，AS1为64.5%，AS2为59.6%，TF/SC为66%），但基本相似。通过对每株植物的MS大肠杆菌、SOM大肠杆菌和脊髓灰质炎病毒的可培养回收率的平均值（P1和P2分别为99%和103%）来校正原始进水中天然可培养的肠道病毒浓度，这与Pecson等人的方法相似[25]。各个方法的回收率在S1表中列出。对于二次出水，将来自相同三个目标的回收数据合并，以计算单个平均回收值，然后用于校正天然浓度。换言之，所有P1二级出水处理过程的平均回收率用于校正所有P1二级出水数据（58%）。P2二次出水数据分别按平均回收率（66%）进行校正。最后，仅使用MS大肠杆菌和SOM大肠杆菌的平均可培养回收率来校正大肠杆菌浓度数据。总体而言，这些二次流出病毒回收结果明显低于平均原始进水回收率，因此需要对数据集应用更大的校正因子。由于原始进水病毒回收率接近 ~100%，而二次出水回收率接近 ~60%，因此校正观察到的回收率具有降低计算去除率 （LRV） 的保守影响。
值得注意的是，从分子测定（ddPCR）获得的肠道病毒和诺如病毒GII靶标的回收率值不一致。诺如病毒GII的回收率变化很大，从频繁的0%回收率到原始进水的回收率高达180%和二次出水的回收率高达20%不等。在P1原始进水中也观察到有限数量的极高异常值（>6,000%）（S1表）。虽然肠道病毒回收的异常值较少，但回收值非常低的情况也经常发生。回收率高的原因尚不清楚，但可能与使用ddPCR分析与装甲RNA靶标的潜在不相容性有关，装甲RNA靶标传统上用作使用qPCR的EPA 1615方法中的抑制对照（S5文本）。因此，这些测量的回收率无法校正天然分子浓度数据。因此，未校正的天然ddPCR数据用于日志删除估计。
病毒日志删除
图 2 使用对数尺度 y 轴显示了从 P1 和 P2 获得的可培养肠道病毒浓度数据的原始进水和次级出水概率图。分子靶标和大肠杆菌靶标的概率图可在支持信息中找到。所有分布最好使用指数最佳拟合线进行建模，表明所有数据都是对数正态分布的。原始进水可培养肠道病毒浓度数据（绘制为黑色圆圈）的分布始终高于在P1和P2的所有百分位数收集的二级出水浓度数据。原始进水分布和每个相应的二次流出物分布之间的差异代表肠道病毒的去除。通过秩对协方差方法和蒙特卡罗模拟方法获得的LRV分布如图3所示。
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图 2.
从OC San P1（左）和P2（右）采集的原始进水和次级出水样品中获得的可培养肠道病毒浓度的概率分布。每个点表示一个抽样事件，实线表示最佳拟合回归。决定系数（R2value） 也被显示出来。从 P1 和 P2 获得的原始进水和继发出水可培养肠道病毒数据呈对数正态分布。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.g002
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图 3. 通过OC San P1和P2的二次处理从可培养的肠道病毒数据中获得的协方差和改良蒙特卡罗LRV分布。
5第, 50第和 95第使用秩对协方差方法获得的百分位 LRV 如图所示（左）。使用修正蒙特卡罗方法获得的所有计算的LRV如图所示（右）。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.g003
使用协方差方法（图3，左图），P1 TF和P2 TF/SC下可培养肠道病毒的LRV中位数分别为1.0和1.3（或90%和95%）。P1 AS1 和 P1 AS2 的中位 LRV 分别为 2.4 和 2.0（或 99.6 和 99.0%）。使用改进的蒙特卡洛方法，P1 TF和P2 TF/SC下可培养肠道病毒的中位LRV与协方差方法相似，分别为1.2和1.4，P1 AS1和P1 AS2的中位LRV分别为2.4和2.0。
虽然发现不同处理过程中两种计算方法的中位数 LRV 相似，但 5第协方差方法的百分位数 LRV 更大，例如，0.73 （82%），而 P1 TF 测量的可培养肠道病毒的改良蒙特卡洛方法为 0.18 （33%）。使用协方差方法，5第P2 TF/SC、P1 AS1和P1 AS2可培养肠道病毒的百分位LRV分别为1.1（92%）、2.1（99.2%）和1.5（97%）。与改进的蒙特卡罗方法相比，P2 TF/SC、P1 AS1 和 P1 AS2 5第百分位LRV分别为0.3（45%）、1.0（91%）和0.7（82%）。这与修正的蒙特卡罗方法的LRV分布的更大陡峭度一致。表1还报告了使用两种计算方法计算的每个微生物靶标的LRV。
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表 1. 使用基于协方差的方法和改进的蒙特卡罗方法为每个微生物目标计算的对数去除值的统计属性。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.t001
改良蒙特卡洛的第 5 个百分位 LRV 较低是由于相对较高的流出物浓度值与不相关的低进水值随机配对（参见 S8 文本）。由于本研究在24个采样事件中观察到某些处理过程和微生物目标的浓度范围重叠（图2），有时修改后的蒙特卡罗模拟会随机配对非常相似的原始进水和二次出水浓度值，这些情况在分布中产生最低的LRV，从而驱动低5第百分位值。
反之，较高的 5第协方差法观察到的百分位数LRV与进水和出水浓度值的等级配对关系（依赖性）有关[20]。协方差方法通过简单的排序将进水和出水浓度数据配对来生成其 LRV 概率分布。为了检验数据集的相关性，使用线性趋势线对每个原始进水分布和每个各自的二次出水分布进行建模，以计算 Pearson 相关性 （R2） 决定系数（参见支持信息）。该测试表明，在原始进水中观察到的值分布与每个不同的二次出水过程中观察到的值分布有关（S4表）。
将所有二级污水处理工艺中每个微生物靶标的LRV制成表格（表1）。对于从可培养的肠道病毒和所有其他微生物靶标获得的 LRV，P1 TF 和 P2 TF/SC 过程表现出比使用协方差方法的 P1 AS1 和 AS2 更低的中位数和第 5 个百分位数 LRV。此外，对于任何给定的微生物靶标，P1 AS1 和 AS2 都显示出相似的 LRV。总体而言，P1 TF 过程通常具有最低的第 5 个百分位数 LRV。这一结果也适用于使用改进的蒙特卡洛方法计算的LRV，但P1 TF / SC的MS大肠分离除外，其去除率略高于P2 TF / SC（表1）。总体而言，与其他三种流出物相比，P1 TF流出物在所有目标中都表现出更高的微生物目标浓度（表1），这与计算的较低LRV和每个过程预期的一般处理程度一致。
对于大多数处理过程，从分子数据集 （ddPCR） 计算的 LRV 与使用可培养肠道病毒数据集获得的 LRV 相似，无论计算方法如何，尽管每种测定的方法学方法存在固有差异。这在图 4 中显而易见，该图显示了沿条形图计算出的 LRV，比较了每个二级处理过程的微生物靶标（和相关方法）。在分子数据集中观察到的最低中位数LRV为P1 TF（肠道病毒和诺如病毒GII分别为1.6和0.9）和P2 TF/SC（肠道病毒和诺如病毒GII分别为1.8和1.1）。P1、AS1（2.1和2.0）和AS2（2.2和1.7）的肠道病毒和诺如病毒GII的LRV较高。这种趋势与为基于培养的测定计算的LRV相似（图4）。无论采用何种计算方法，除5第P1 AS2 的百分位 LRV，略高（图 4）。相反，中位数和 5第肠道病毒ddPCR的百分位LRV通常略高于5第百分位可培养肠道病毒 LRV，P1 AS1 除外。
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图 4. 通过协方差分析方法生成的可培养肠道病毒、肠道病毒 （ddPCR） 和诺如病毒 GII （ddPCR）、MS 大肠脂和 SOM 大肠杆菌的对数去除值 （LRV） 摘要。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.g004
最后，应该注意的是，虽然微生物靶标之间的LRV存在显着差异（表1和图4），但在考虑去除百分比的结果时，差异在+/- 0.4之间（例如，1.0对0.7）的LRV并不大，其中1.0和0.7 LRV分别对应90%和80%。在比较较大的 LRV 时尤其如此，例如 2.0 和 1.5 LRV，它们对应于 99% 和 97% 的去除率。因此，本研究中不同微生物靶标或处理过程之间去除的明显差异并不总是显着的，在解释时应考虑这一点。因此，在本研究中，不同微生物靶标或处理过程之间去除的明显差异可能并不显着。
讨论
保守病毒LRV的选择
为了评估废水处理过程中的病毒日志去除情况，在为期 2 年的时间里监测了各种微生物靶标，包括肠道病毒、MS 大肠杆菌和 SOM 大肠杆菌，包括 24 个采样事件。使用可培养和分子方法对四种二级处理过程中的微生物浓度数据进行计数，并使用两种数学方法计算病毒日志去除率，包括基于秩对协方差的方法和改进的蒙特卡罗模拟方法。对于所有微生物靶标，使用每种方法获得的中位LRVs非常相似，这表明尽管两种方法之间存在分析差异，但可以使用两种方法评估每个处理过程的病毒去除（表1）。然而，与观察到的中值相比，5第与协方差方法相比，蒙特卡罗 LRV 结果通常较低，每种方法的百分位 LRV 都不同。鉴于加利福尼亚州使用 5 的监管先例，这一点很有意思第用于处理单元过程计入的百分位数 LRV。
微生物去除率最低的处理过程推动了最保守的病毒去除估计值的选择（5第百分位数 LRV），用于选择潜在的监管信用价值。这里报告的LRV显示，P1 TF和P2 TF/SC处理过程始终比两个AS过程更有效地去除所有病毒靶标。事实上，这种去除效率的降低凸显了蒙特卡罗方法在估计这两个过程的低端百分位数的LRV时的局限性。对于这些性能较低的处理过程，在低百分位排名中计算出的非常低的 LRV 被认为是蒙特卡洛的进水-出水值随机配对的数学伪影（参见支持信息中的蒙特卡罗方法），因此是该方法的潜在弱点。在 P1 TF 和 P2 TF/SC 性能的情况下，在原始进水分布和次级出水分布之间观察到的浓度值重叠说明了这一点。结果，5第使用蒙特卡洛方法估计的百分位LRV被确定不能代表在所有四种处理过程中观察到的实际低端病毒日志去除（表1）。换言之，蒙特卡罗模拟方法（有或没有删失以去除过低端的LRV，例如在低百分位数处观察到的负值）可能过于保守，不能反映病毒去除的真正低端工厂性能。需要更多的工作来证实这一观察结果，并继续开发一种更好的统计和/或抽样方法。
相比之下，协方差方法通常具有更高的 5第与改进的蒙特卡洛相比，微生物目标的百分位 LRV，并强调了每种计算方法之间的潜在差异。与秩对协方差分析方法的主要区别在于原始进水和次级出水分布的相关关系，而蒙特卡罗方法则假设每个分布都是相互独立和不同的。鉴于观察到的秩对协方差方法缺乏任何负 LRV 配对，因此无需对 LRV 结果进行审查（参见支持信息）。因此，对于本研究和潜在监管信用的提议，协方差方法被认为更适合于量化所述分布之间的差异（病毒减少）并确定 5第百分位 LRV。未来的工作可能会确定一种更有意义的方法来确定本研究中使用的简单秩配对之外的协方差。基于协方差方法，保守的第 5 个百分位 LRV 为 0.73（去除率为 82%），是本研究中监测的四个废水处理过程向加州 DDW 提出病毒日志去除信用的基础;在本报告编写之时，DDW的审查正在进行中。肠道病毒 （ddPCR）、诺如病毒 GII （ddPCR） 以及 MS 和 SOM 大肠杆菌未被用作拟议信贷的基础，因为加利福尼亚州先前有先例将可培养的肠道病毒用于其他废水处理厂评估。
微生物方法检测性能
虽然通过分子方法（例如qPCR、ddPCR）进行微生物检测有希望，但目前尚不清楚与去除可培养的肠道病毒靶标相比，在治疗过程中去除基因拷贝数是否足以评估性能，因为本研究中观察到的两种方法之间的浓度缺乏相关性（Polanco等人，2022年报告的分析）[6].这可能与以下事实有关：使用分子测定法进行病毒评估可以包括活病毒和非活病毒，尽管在本研究中，缺乏相关性也可能与ddPCR靶标的回收率不一致有关。虽然可以在可培养测定和分子测定之间进行相关分析，但这些测定之间的根本差异（即生物活性检测与遗传物质检测）表明，这些检测不能使用简单的相关分析进行比较，需要额外的研究。
其他研究表明，在第5个百分位数和平均LRV上，遗传物质的去除率高于可培养的肠道病毒[8,26]。这可能与本研究使用ddPCR代替qPCR以及ddPCR结果缺乏回收率校正有关（参见S3文本）。很明显，需要进一步的工作来建立这些检测之间的关系，以了解靶向分子分析如何为病毒活力和定量提供信息。
本研究之所以选择铠装RNA，是因为其在EPA 1615方法中长期用于质量控制目的，但并未特别用于确定回收率[18,27]。 诺如病毒GII的恢复结果表现出重大的不一致，其中包括大值异常值，因此有必要决定不更正本地数据集。此外，诺如病毒GII和肠道病毒的分子回收率数据通常为阴性（即加标样品的靶标低于配对的天然样品）或接近零（见S1表）。因此，在最低接受率为 5% 的情况下，使用这些恢复数据来校正本机结果是不可接受的。需要更多的研究来进一步了解铠装RNA的检测如何受到样品-基质干扰的影响，以便为病毒靶标的回收提供信息。
处理性能和取样方法
活性污泥处理的LRV高于TF或TF/SC。事实上，无论使用何种统计方法计算LRV（等级对协方差或蒙特卡洛），所有处理过程在微生物去除方面的排名都相似（表1），即AS>TF/SC>TF。这是一个值得注意的观察结果，可以为未来类似研究的取样方法和/或LRV计算方法的选择提供信息，因为它表明保守的计算方法（即保守的意思是较低的LRVs以获得监管信用），即蒙特卡洛分析，可以接受评估活性污泥过程的性能，这取决于正在寻求多少额外的信用。
在这项研究中，对于具有最低 LRV （OC San P1 TF） 的工艺观察到的协方差方法第 5 个百分位数 LRV 为 0.73（去除率为 82%），最终被提议作为 OCWD GWRS 饮用水再利用处理设施的信用值。这是因为 P1 TF 代表了一种保守的选择，它避免了将四种污水的 LRV 数据集组合在一起的需要，这些污水混合在一起作为 GWRS 的入口，以获得单个 LRV 信用值。然而，鉴于观察到的 AS1 和 AS2 的第 5 个百分位 LRV 要高得多，严格依赖 P1 TF 过程会显着降低废水处理的总体信用价值，这基本上低估了 GWRS 废水处理工艺的信用。
未来旨在评估用于废水处理（即二级或三级处理废水）的肠道病毒原木去除的研究可以从本研究中使用的策略中受益，以进一步开发和执行有效的微生物监测研究，以进行原木去除学分。虽然本研究最终使用基于协方差的方法来计算废水处理的拟议 LRV 信用额度（目前正在由监管机构审查），但未来的研究应寻求进一步开发和推进适当的统计和/或抽样技术，以确定保守的（例如，5第百分位数）LRV，基于在整个废水处理过程中真正的病毒去除可能很重要的知识（例如，本研究发现活性污泥工艺的中位去除率为 2.0+ LRV 或 99%+，基于滴滤器的工艺的中位去除率为 1.0 至 1.3 LRV 或 90% 至 95%）。方法必须考虑到可培养肠道病毒等靶标的浓度数据将具有很大可变性，这可以通过研究抽样设计来解决（例如，停留时间配对采样;每个样本采集的MSR）或考虑使用更稳定的病毒指示剂（如MS和SOM大肠杆菌）代替可培养的肠道病毒，或开发更合适的统计方法。在这项研究和其他研究中，大肠杆菌浓度数据已被证明在进水和废水流出物样品中都更加稳定，这表明当使用基于培养的测定时，MS和SOM大肠杆菌可以成为病毒去除的可靠指标。
解决样品变异性问题
鉴于重复样品的良好性能，观察到的 OC San P1 和 P2 进水和流出物中可培养肠道病毒发生的变异性可能是真实的，而不是分析方法性能问题的结果。然而，改进的研究设计可以包括每个抽样事件的重复或一式三份，这样用于表示该事件的平均值可以抑制任何分析变异性，从而为保守的计算提供更准确的测量（例如，5第百分位数）LRV。如果重复/一式三份非常一致，随着研究的继续，它们可以逐渐减少。
与根据同一事件配对的进水/出水浓度值计算 LRV 相比（这使得对同一水地进行采样的可疑假设），蒙特卡罗方法从根本上不需要停留时间配对样本，因为它假设进水和出水分布之间没有关系，并且从不同采样天数的所有结果的每个分布中随机选择样本对。如本研究所示，当目标成分（在本例中为可培养的肠道病毒）在不同日期的进水量变化很大时，蒙特卡洛 LRV 分布将非常陡峭，LRV 分布的低端（即低/保守百分位数）非常低，基于不相关的高流出物样品与低进水样品的随机配对，LRV 分布的低端（即低/保守百分位数）。要求参加 5第百分位 LRV，建议的信用价值将受这些情况驱动，并且非常低。
5第出于监管信用目的的百分位数假设 5第百分位数估计值是处理过程的真实低端性能。然而，根据这项研究，对于通常去除较少病毒颗粒的处理过程来说，这可能并不总是正确的，因为在这种情况下，进水和流出物的分布可能会重叠。发生这种情况时，非常低的 5第由于蒙特卡罗模拟的 LRV 计算中进水/出水配对无意义，分布中的百分位数 LRV 不太可能，因此不能代表处理去除的真实范围（即，这些值非常低）。然而，这种保守的方法对于具有高病毒去除率的处理过程可能是可以接受的，例如这里研究的活性污泥过程，其中至少 ~1.0 病毒对数信用为 5第百分位数是可以达到的。然而，正如本研究所观察到的那样，对于非 NDN 流程来说，这似乎是有问题的，因为拟议的信用价值可能接近于零。因此，基于协方差的方法在这里受到青睐，因为它是一种根本不同的统计方法，不会随机配对进水-出水浓度。
液压停留时间和复合取样
收集在时间上与过程的平均水力停留时间适当交错的样品，以允许从当天停留时间配对的进水/流出样品计算 LRV 可能会导致更准确（并且可能更高）的原木去除估计。然而，由于污水处理厂的水力停留时间很长，因此在实践中很难正确执行，因此很难准确估计。此外，来自侧流的回流可能会影响最终的浓缩结果，从而使从进水到出水的同一水包取样的尝试变得复杂。另一个相关的并发症是，进水样品可能使用简单的抓取样品（瞬时时间点），而流出样品可能需要现场超滤（多小时复合），具体取决于微生物目标。
为了应对这些挑战，未来的工作可以考虑将重点放在废水处理厂的单个单元工艺上，与最终的二级或三级废水相比，除了或代替从原始进水中去除病毒的取样之外，因为单个单元工艺将具有较短的停留时间，可能会减少一些不确定性，也许还会减少进水的可变性。可以优化取样方法，使进水和出水既是抓取物，又是复合物。此外，预研究可以表征与停留时间相关的时间尺度上病毒浓度的变化，以支持研究设计（例如，如果估计的停留时间是一定的小时数，并且在该时间范围内缺乏显着的微生物目标浓度变化，则没有必要按停留时间错开进水/流出样品的收集）。需要开发一种适当的统计方法，从停留时间配对的进水/出水样本中计算LRV，例如基于简单的进水/出水配对（使用最低或5第百分位数观察到的 LRV 作为建议的信用值）或基于协方差的方法，根据每个收集的样本集进行配对。
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OC San 简化了流程图。
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S1 图。 OC San 简化了流程图。
简化的流程图，说明二级处理系统和研究采样位置。（A） OC San Reclamation Plant No. 1 的两条平行二级处理装置。TF、AS1 和 AS2 之后的工厂二级澄清池具有工程差异，如图所示。（B） OC San 2 号处理厂的滴流过滤器/固体接触器 （TF/SC） 二级处理装置。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s001
（提夫）
S2 图。 使用改良的培养感染性测定法 （EPA 1615） 观察原始进水和二次流出物的肠道病毒浓度。
上面显示的数据已针对病毒恢复进行了更正，包括来自 OC San P1（左面板）和 OC San P2（右面板）的数据。抽样的差距对应于全球大流行导致的研究中断。原始废水进水数据点显示为黑点，而次要出水数据显示为深绿色 （P1 TF）、深蓝色 （P1 AS1）、浅蓝色 （P1 AS2） 和浅绿色 （P2 TF/SC）。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s002
（提夫）
S3 图。 肠道病毒和诺如病毒GII（ddPCR）的浓度。
使用液滴数字聚合酶链式反应 （ddPCR） 对 OC San 1 号工厂（左图）和 OC San 2 号工厂（右图）的原废水和二次废水进行肠道病毒（上行）和诺如病毒 GII（下行）的基因拷贝检测。采样的差距对应于由于 SARS-CoV-2 大流行导致的研究中断。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s003
（提夫）
S4 图。 在 OC San P1 和 P2 采集的原始进水和二次出水样品的液滴数字 PCR （ddPCR） 分析中肠道病毒和诺如病毒 GII 浓度的概率分布。
每个点表示一个采样事件，虚线表示最佳拟合回归。决定系数（R2value） 也被显示出来。从 OC San P1 和 P2 获得的原始进水和二次出水分子测定数据呈对数正态分布。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s004
（提夫）
S5 图。 记录 OC San P1 和 P2 的原始进水和次级出水相关图。
将每个 P1 二级处理工艺（P1 TF、AS1、AS2）的分级浓度值 （n = 24） 与 P1 的分级原始进水浓度值进行比较（左图）。同样，将排名的 P2 TF/SC 二级出水浓度值 （n = 24） 与 P2 的排名原始进水浓度值（右图）进行比较。线性模型表示每个分布之间的相关性，从中确定的相关系数 （R2） 进行计算。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s005
（提夫）
S1 表。 所有病毒目标的回收百分比摘要。
以粗体显示的平均回收率百分比用于校正每个相应的天然数据集，例如，120% 回收率用于校正所有非性 P1 原始进水样品的 SOM 大肠菌。通过取SOM、MS和脊髓灰质炎病毒回收率的平均值，获得用于校正天然可培养肠道病毒数据集的平均回收率百分比，这些回收率显示为脊髓灰质炎病毒的粗体平均值。平均回收率值未用于校正天然分子（肠道病毒和诺如病毒GII）数据集。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s006
（XLSX）
S2 表。 微生物目标浓度。
显示了在研究期间获得的每个监测微生物靶标的微生物浓度范围、中位数和几何平均值。肠道病毒（培养）、MS 大肠母和 SOM 大肠母已通过病毒回收得到纠正。肠道病毒、诺如病毒GII值未通过病毒恢复进行校正（S4文本）。未调整总大肠菌群和粪便大肠菌群数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s007
（XLSX）
S3 表。 采样期间的 OC San P1 和 P2 工作范围值 （ORV） 和工厂性能。
AS = 活性污泥，TF = 滴流过滤器，SC = 固体接触器，MCRT = 平均细胞停留时间，BOD-T = 总生物需氧量。所有二级处理过程的 MCRT 由 OC San 每天使用以下公式计算。OCWD 建议使用 MCRT 的 OC San 计算值来评估与 LRV 信用值相关的 ORV。BOD-T （P1 TF） 由 OC San 测量为每日复合物。平均细胞停留时间 （MCRT） 计算：P1 活性污泥工艺 MCRT = （反应器体积 x MLSS） ÷ [（WAS 流量 x WAS MLSS） + （出水流量 x 出水 TSS）];其中 MLSS = 混合液悬浮固体，WAS = 废物活性污泥，TSS = 总悬浮固体。P2 滴滤固体接触器 MCRT = [（反应器体积 x MLVSS） + （反应器体积 RSS VSS）] ÷ [（废液流量 x RSS VSS） + （出水流量 x 出水 VSS）];其中 MLVSS = 混合液挥发性悬浮物，RSS VSS = 原始污水污泥挥发性悬浮物，VSS = 挥发性悬浮物。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s008
（XLSX）
S4 表。 OC San P1 和 P2 原始进水和次级出水相关性的概率值（p 值）。
图中显示了 P1 和 P2 的原始进水和二次出水浓度分布的相关性。这些相关性证明了进水和出水的排序日志浓度值是如何相关的。使用线性趋势线对每个二次出水过程的相关性进行建模，以计算 Pearson 的相关决定系数 （R2).R2值测量两个分布之间的变异量，范围介于 -1 和 1 之间，其中 0 表示无相关性，1 或 -1 表示完全相关性。如表1所示，S5图中显示的每个相关性都具有统计学意义，概率值（p值）小于0.1%（p<0.001）。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s009
（XLSX）
S1 文本。 OC San 采样位置描述。
共监测了 OC San P1 和 P2 的六 （6） 个采样点。OC San P1 的采样位置为原始废水进水、滴滤器 （TF） 二次出水、活性污泥 1 （AS1） 二次出水和活性污泥 2 （AS2） 二次出水，而 OC San P2 的采样位置包括原始废水进水和滴滤器/固体接触器 （TF/SC） 二次出水。P2 处的取样仅限于表征 TF/SC 过程，而不是其他平行处理过程。进入OC San P1的原始废水经过初步筛选和化学添加的一级澄清处理，然后被转移到两个并行运行的二级处理系统之一（滴滤工艺或活性污泥工艺）。P1 的原始废水是在初级酒吧筛选之后收集的，但在初级澄清和化学添加之前。本研究对P1的三个平行处理过程产生的二次出水进行了采样。第一台 P1 处理系统将主要废水输送通过滴滤器 （TF） 工艺，然后进行二次澄清。对TF工艺处理过的废水进行取样。P1 初级流出物也通过活性污泥 （AS） 处理系统的两个平行系统输送，分别命名为 AS1 和 AS2。在二次澄清后，从每个AS工艺中抽取的二次流出物样品进行采样。两列AS列车均以硝化-部分反硝化（NDN）模式运行。AS1 和 AS2 工艺之间的主要区别在于，AS1 不接收混合酒回流，而较新的 AS2 设施接收混合酒。由于上述两个过程之间的操作差异，来自 P1 的 AS1 和 AS2 流出物流的微生物浓度值得关注。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s010
（文件）
S2 文本。 过滤程序和超滤洗脱。
为了使用超滤器收集二次流出物样品，所有管道、配件和瓶盖在使用前都在受控的实验室环境中进行消毒和高压灭菌。灭菌设备在现场拆开包装。所有超滤模块均在每个采样位置使用相同的程序制备，如下所示：容纳中空纤维的超滤池的蓝色端用于标记进料口（接收 OC San 采样水的末端），而过滤池的红端设置为渗透/截留液端口（排水口）。由于一些二级废水站点（P1 AS1 和 P1 AS2）的访问受到限制，因此在过滤前使用 50 升大瓶收集 25 升大瓶。在这种情况下，大瓶龙头作为收集后立即过滤的二级出水龙头。对于其余站点（P1 TF 和 P2 TF/SC），直接从与超滤器管组件兼容的采样阀对二次流出物进行采样。在这种情况下，样品抽头在样品采集前吹扫了 3 分钟。为了监测现场过滤情况，在中空纤维过滤器之前的进料管组件上安装了压力表和蠕动泵，以泵送和监测进水压力。为了完成组装，在渗透管上安装了一个下游流量计，以监测采样的水量。过滤 25 升（以每分钟 1 升的速度）后，关闭蠕动泵，并从样品取样口中取出入口管线。通过确保将所有夹夹放置在打开位置并在入口管上插入无菌 2 μm 筒式过滤器来去除管道组件内的任何剩余水，以避免进气口的气溶胶污染。打开蠕动泵约 1 分钟后，剩余的空隙水从管道组件中清除。在拆卸之前，样品时间、日期和地点都写在样品标签上。然后立即小心地将超滤细胞取出、重新盖上盖子、擦拭并保存在冰上。为了提取过滤器的内容物，使用由制造商提供的加压 0.075% 吐温 20 PBS 组成的大容量洗脱罐洗脱每个超滤器。使用灭菌的罐适配器接头，在超滤池截留端口（排水口）打开，滤液端口（渗透端口）关闭的情况下，通过罐的手动减压洗脱样品。从过滤器中洗脱出大约 100–120 mL 体积的溶液，并立即通过无菌 0.45 μm 过滤器以去除大碎片和细菌细胞。密歇根州立大学水质与环境微生物学实验室将每个样品（包括未加工的进水浓缩物）分成一系列子样品，以保护样品免受多次冻融循环的影响。对于样品分析，一个子样本用于基于培养的肠道病毒分析，一个子样本用于基于分子的病毒分析，最后一个子样本用于存档。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s011
（文件）
S3 文本。 对 EPA 1615 方法 （ddPCR） 的修改。
对于分子检测，使用 EPA 1615 标准方法中描述的方法和材料对肠道病毒和诺如病毒 GII 靶标进行计数，并根据 BioRad QX200 微滴式数字 PCR （ddPCR） 进行了修改。使用的引物和探针序列与EPA方法1615相同，除了用黑洞淬灭剂1（BHQ1）替换探针荧光淬灭基团3?TAMRA和用5?HEX替换诺如病毒GII探针5?FAM以允许在ddPCR平台上进行双链分析。使用一步法RT-ddPCR Advanced Kit for Probes （BioRad） PCR试剂盒进行扩增。肠道病毒和诺如病毒GII靶标的热循环条件优化和编程如下：42°C下60分钟，95°C下10分钟，95°C下循环40次，持续30秒，57°C下循环1分钟。扩增循环后，在 98°C 孵育 10 分钟，然后进行 4°C 保持循环。对于每个病毒靶标，在PCR后对荧光阳性或荧光阴性液滴进行计数，以使用泊松统计计算每升（GC/L）体积的基因复制者数。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s012
（文件）
S4 文本。 基质加标回收程序。
通过测定方法回收率校正可培养肠道病毒、MS大肠杆菌和SOM大肠杆菌天然浓度。在洗脱之前，将已知浓度的MS大肠杆菌（F特异性大肠杆菌，ATCC#15597-B1）、体细胞大肠杆菌（ATCC#13706-B1）和脊髓灰质炎病毒（ATCC VR1562）以已知浓度直接加标到原始进水抓取样品和超滤装置中，进行回收率测量。该程序是针对 P1 和 P2 废水样品执行的，这些样品专门用于在研究过程中测定采样事件子集的基质加标回收率。通过计算从基质刺突样品中回收的病毒百分比来估计方法回收率： % 回收率 = 100 x（在加标样品中观察到 # – 在天然样品中观察到 #） ÷ # 添加了加标病毒 其中，“添加的刺突病毒”表示给定病毒靶标的初始加标浓度，“观察到的#”对应于肠道病毒或大肠杆菌的“每升斑块形成单位数（PFU/L）”或“每升最可能数（MPN/L）”， 分别。为了校正天然可培养肠道病毒浓度数据，使用了MS大肠杆菌、SOM大肠杆菌和脊髓灰质炎病毒的平均可培养回收率。将所有三个目标的恢复数据合并在一起，以计算单个平均恢复值，然后使用该值来校正本机结果。仅使用MS大肠杆菌和SOM大肠杆菌的平均可培养回收率校正大肠杆菌浓度数据。由于基质差异（原废水和二次出水基质），分别使用各自对应的基质加标样品组计算P1原进水、P2进水、P1二次出水和P2二次出水的回收率校正。对于 P1 二级出水，根据相似的回收率范围，对所有三种 P1 二级处理工艺（即 P1 AS1、AS2、TF）的回收率测量值进行合并和平均。对于分子测定 （ddPCR），通过将铠装 RNA（由已知浓度的病毒靶标基因片段组成）加标到上述可培养肠道病毒和大肠杆菌的样品中，从基质刺突样品中测量病毒回收率，该 RNA 在 EPA 1615 方法中用作抑制对照。本研究中测得的负回收率实例被转换为零回收率。广泛回收性能的原因尚不清楚，但可能与使用ddPCR分析与装甲RNA靶标（传统上在使用qPCR的EPA 1615方法中用作抑制对照）的潜在不相容性有关。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s013
（文件）
S5 文本。 使用分子方法测定基质尖峰回收率的变异性。
对于使用分子方法的回收率测量，需要更多的研究来有效地确定使用装甲RNA作为ddPCR的基质刺突靶标的样品回收率。本研究选择铠装 RNA 是基于其在 EPA 1615 方法中用于质量控制目的的悠久历史（尽管不像本研究那样用于确定回收率）。在这项研究中，诺如病毒ddPCR回收率结果表现出重大不一致，需要忽略回收率数据，而计算出的肠道病毒ddPCR回收率通常为阴性（即，加标样品的靶标值低于配对的天然样品）或接近于零。因此，鉴于回收率的最低接受标准为5%，使用这些回收率数据来校正研究的天然浓度数据被认为是不可接受的。因此，使用ddPCR获得的天然浓度数据未通过回收率进行校正。如果未来的任何研究考虑使用ddPCR来计数多个病毒靶标（即肠道病毒、诺如病毒GII、脊髓灰质炎病毒，如本研究所示），强烈建议进行稳健的预优化研究，以解决样品基质干扰、装甲RNA检测和病毒回收的任何潜在问题。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s014
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S6 文本。 工厂性能、运行参数和运行范围值 （ORV）。
本研究中将操作范围值（ORV）定义为描述典型和正常处理过程操作的参数值，如本研究期间在微生物监测期间观察到的那样。为OCWD AWPF提供进水的每个二级处理工艺，即P1 TF、AS1、AS2（当前）和P2 TF/SC（未来）得出ORV。超过指定的ORV表示偏离正常治疗性能。这种偏差可能与意外事件有关，但也可能是由于计划的活动，例如处理系统的操作维护或OC San操作员的流量调整。这些ORV被提议用于GWRS的或有LRV病毒信用，就像之前在加利福尼亚州用于饮用水再利用的废水处理的病原体信用计划一样。加州监管机构更喜欢这种方法，因此，只有在污水处理厂的日常表现正常且可接受的情况下（即在既定的 ORV 内），才能从一次性、过去批准的研究中观察到的任何病毒去除，该研究用作正在进行的 WWTP 病毒清除学分的基础。应该注意的是，ORV 与 OC San 国家污染物排放消除系统 （NPDES） 许可证中规定的任何基准、性能目标或废水限制没有直接关系。因此，不符合ORVs并不意味着二次出水质量差或不适合回收，而是表示出水不符合在微生物取样研究中观察到的与观察到的病毒去除值相关的正常条件，因此信用可能不适用。作为本研究的结果，OCWD 向 DDW 提出了本文描述的 ORV 框架，其中为 OCWD GWRS 服务的四个 OC San 污水中的每一个都具有 ORV，GWRS 的微滤进料 （MFF） 和微滤污水 （MFE） 形式的组合（混合）污水也是如此，所有这些都必须满足各自的 ORV 才能获得病毒 LRV 信用。为了确定每个 OC San 处理过程的推荐 ORV，在 LRV 研究采样期间收集了 P1 和 P2 的性能数据，作为常规工厂监测的一部分。为开发操作包络ORV而选择的参数在下面的S3表中进一步显示。通过计算 30 天平均值和四分位距来审查和分析性能数据。除了OC San处理过程中的ORV外，还选择了GWRS、AWPF、MFF和MFE监测位置，以代表正常的GWRS微滤进水和出水质量。使用来自 30 天平均数据的基线阈值方程计算每个选定参数的 ORV，如下所示：
（式S1）
（式S2）
其中：Q1 = 30 天运行平均数据集的第 25 个百分位，Q3 = 30 天运行平均数据集的第 75 个百分位，IQR = 四分位距，定义为 Q3 –Q1。基线阈值方法（即由四分位距定义）用于使用从大型数据集导出的统计模型来定义治疗过程基线条件的偏移。下限阈值定义为低于第 25 个百分位数的值为 IQR 的 1.5 倍，而上限阈值分别为高于第 75 个百分位数的 IQR 的 1.5 倍。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s015
（文件）
S7 文本。 性能监控和 ORV 结果。
收集来自 OC San P1 和 P2 的性能数据，以确定每个 OC San 处理工艺的推荐操作范围值 （ORV）。选择总生物需氧量（BOD-T）作为OC San P1 TF工艺的ORV。之所以提出 BOD-T 的基线上限阈值，是因为该采样位置的 BOD-T 高于正常值（30 天运行平均值为 > 26 mg/L）表明与肠道病毒采样期间记录的典型性能存在偏差。选择平均细胞停留时间 （MCRT） 的较低基线阈值，并提出作为 OC San P1 AS1、P1 AS2 和 P2 TF/SC 处理过程的 ORV。之所以选择较低的阈值，是因为这些过程中的 MCRT 低于正常值（P1 AS1 为 <3 天，P1 AS2 为 <4 天，P2 TF/SC 为 < 1 天）表明与典型性能有偏差。除了OC San处理工艺外，GWRS AWPF微滤进料（MFF）和微滤出水（MFE）监测位置的浊度参数。OCWD 提议将 MFF 和 MFE 的浊度参数纳入 ORV 框架，部分原因是 AWPF MF 处理过程对贾第鞭毛虫和隐孢子虫去除信用的现有限制。除此之外，OC San 污水必须符合指定的浊度要求，才能向 AWPF 提供混合的二次污水。将所述的 ORV 框架用于整个饮用水再利用项目，服务于 GWRS 的四个 OC San 污水中的每一个都具有 ORV，以及 MFF 和 MFE 形式的组合（混合）污水，必须满足各自的 ORV 才能获得病毒 LRV 信用。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s016
（文件）
S8 文本。 蒙特卡罗模拟。
对于蒙特卡罗方法，使用 MATLAB 软件（1984–2020 MathWorks， Inc.，版本 R2020a 9.8.0.1359463）计算每个微生物靶标的 LRV，该软件配备了统计和机器学习工具箱。使用简化的制表符分隔文件将微生物浓度数据导入MATLAB软件。导入后，使用最大似然估计函数为给定微生物目标的每个进水和出水数据集生成统计模型。简而言之，使用进水和出水微生物浓度来生成统计分布。从这些模拟的进水和出水分布中，从每个分布中选择一个独立的随机值，然后配对计算 LRV，如方程 S3 所示：
（式S3）
其中 C伊芙是从二次出水分布中获取的微生物靶标的浓度，C.raw是从原始废水分布中获取的微生物目标的浓度。该计算执行了 10,000 次，以生成 n = 10,000 个 LRV 的分布。然后将所有 LRV 从低到高排序，并在数据点总数 n 上分配一个等级 i。为每个值分配一个累积概率 p，如方程 S4 所示。
（式S4）
其中 p 是累积概率，i 是秩赋值，n 表示计算数据点的总数 （10,000）。本研究还修改了蒙特卡罗模拟方法，仅生成非负 LRV（n = 10,000+ 非负对数去除值）。之所以这样做，是因为标准的蒙特卡罗模拟方法在总共 10,000 个 LRV 中产生了相当多的负 LRV，从而减少了由 5第百分位 LRV。为了解决阴性 LRV，为总共 11,000 个样本计算了大约 1,000 个额外的 LRV。删除 n = 11,000 数据集中的负 LRV，使得剩余的正 LRV 数量至少为 n = 10,000。这种经过修改（删失）的蒙特卡罗方法用于确定特定过程的 LRV，从而对统计学确定的结果施加现实条件。执行改进的蒙特卡罗模拟，以解决使用标准蒙特卡罗方法时计算的 P1 TF 和 P2 TF/SC 分布的负 LRV。虽然这种情况只发生在一小部分时间，但这些负值被记录为百分位数分布低端的可能 LRV。计算出的负LRV被认为是蒙特卡洛进水-出水值随机配对的数学伪影，具体归因于在原始进水分布和OC San P1 TF出水分布之间观察到的浓度值的大重叠。修改（删失）的蒙特卡罗方法用于确定特定于过程的 LRV，对统计学确定的结果施加现实条件。使用改进的蒙特卡罗模拟生成的负 LRV 被删除，使得剩余的正 LRV 数量至少为 n = 10,000。在废水处理过程中，肠道病毒的LRV呈阴性，因为在一级或二级处理过程中由于缺乏宿主生物体而无法产生病毒，因此在物理上是不可能的。尽管试图通过审查数据以去除阴性 LRV 来解决这个问题，但这一估计并不代表在所有四个处理过程中观察到的实际低端病毒日志去除（表 1）。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s017
（文件）
S9 文本。 肠道病毒和诺如病毒GII靶标（分子靶标）的概率图。
观察到肠道病毒采样事件子集的未检测测量值，包括 P1 AS1 （n = 8）、P1 AS2 （n = 11） 和 P2 TF/SC （n = 5） 二次流出物。对于一个 P1 AS2 流出物样品，仅观察到一次诺如病毒 GII 的未检测测量。这些情况被替换为方法检测限，作为污水浓度的保守上限估计值，以完成LRVs的统计确定;使用统计技术估计低于检测限的值将导致分配给未检测结果的流出物浓度相对较低，而相应的LRVs较高。 肠道病毒和诺如病毒GII的S4图中显示了为每个处理过程生成的协方差和修正蒙特卡罗模拟LRV分布。无论使用何种统计方法，肠道病毒和诺如病毒 GII 效率最低的二级处理过程都是 OC San P1 TF，这与本研究中测量的其他靶点（可培养肠道病毒、SOM 大肠杆菌和大肠菌群）一致。在所有处理工艺中，OC San P1 的 AS 二级处理工艺表现出最高的基因拷贝去除率。与可培养的肠道病毒类似，肠道病毒和诺如病毒GII的第5个百分位协方差LRV都大于蒙特卡洛第5个百分位LRV。对于肠道病毒的协方差方法，P1 TF 和 P2 TF/SC 显示相同的第 5 个百分位数 LRV（四舍五入为 1.3 LRV），而改进的蒙特卡洛分析显示 P1 TF 为最低的第 5 个百分位数 LRV。应该注意的是，由于在肠道病毒分析的情况下，方法检测限代替了多个样品的未检测限，这可能会影响协方差分析方法中的相关变量，这可以解释较低百分位数（第 5 个百分位数）LRV 的收敛分布。
https://doi.org/10.1371/journal.pwat.0000052.s018
（文件）
确认
我们要感谢南加州大都会水区（未来供应行动计划）和水研究基金会（WRF，订户优先研究计划），包括 WRF 项目咨询委员会对本研究的批判性审查。我们非常感谢我们的项目合作伙伴，包括奥兰治县卫生区运营和实验室服务团队的合作伙伴，他们协助样本收集和研究审查;以及密歇根州立大学的水质和环境微生物学实验室（Joan Rose教授）和北佛罗里达生物咨询服务（George Lukasik博士）处理样品。最后，作者要感谢参与小组讨论并为这项工作提供批判性审查和反馈的同事，包括 George Tchobanoglous、Rhodes Trussell 和 Joan Rose。
引用
1.美国环境保护署 （EPA）。饮用水再利用纲要，EPA/810/R-17/002。华盛顿特区，2017 年。可从： https://www.epa.gov/ground-water-and-drinking-water/2017-potable-reuse-compendium
查看文章Google 学术搜索
2.美国环境保护署 （EPA）。水再利用指南，EPA/600/R-12/618。华盛顿特区，2012 年。可从： https://www.epa.gov/sites/default/files/2019-08/documents/2012-guidelines-water-reuse.pdf
查看文章Google 学术搜索
3.与循环水相关的法规。加利福尼亚州水资源控制委员会，饮用水部 （DDW） 2018 [引用于 2023 年 2 月]。可从： https://www.waterboards.ca.gov/drinking_water/certlic/drinkingwater/documents/lawbook/RWregulations_20181001.pdf
查看文章Google 学术搜索
4.Gerrity D、Pecson B、Trussell RS、Trussell RR。饮用水回用处理列车遍布世界各地。J Wat Supply： Res Technol—Aqua.2013;62:321–38.https://doi.org/10.2166/aqua.2013.041。
查看文章Google 学术搜索
5.世界卫生组织 （WHO）。饮用水再利用：生产安全饮用水的指南。Water S，卫生与健康，编辑。瑞士日内瓦.2017.152 页码可从： https://apps.who.int/iris/handle/10665/258715
查看文章Google 学术搜索
6.波兰科 J、萨法里克 J、普卢姆利 MH。展示 OCWD 废水处理和反渗透饮用水再利用的病毒日志清除信用。最终报告。水研究基金会 （WRF） 和南加州大都会水区 （MWD），2022 年。WRF 5041。
查看文章Google 学术搜索
7.Pecson B、Dale C、Trussell S、Rose J、Ives R、Idica E 等人。一项为期一年的病原体监测研究的结果，以支持加利福尼亚州欧申赛德市的饮用水再利用。 WEFTEC 2017;水环境联合会会议记录：水环境联合会;2017 年，第 5130-41 页。
查看文章Google 学术搜索
8.Bartolo M， Chen E， Kolakovsky A， Bear S， Kenny J， Pecson B， et al. 北城再生水厂的病原体监测研究，最终报告。2017.
查看文章Google 学术搜索
9.怀特的氯化和替代消毒剂手册。博莱克威奇公司。第 5 版新泽西州霍博肯：John Wiley & Sons， Inc.;2010.
20 分钟国家水研究所（NWRI）。审查奥兰治县水区地下水补给系统。第17次会议小组报告。2021 年 1 月 6 日。出版物编号：NWRI-2020-18。可从： https://www.nwri-usa.org/
查看文章Google 学术搜索
21米国家水研究所（NWRI）。审查奥兰治县水区地下水补给系统。第18次会议小组报告。2021 年 11 月 10 日。可从： https://www.nwri-usa.org/
查看文章Google 学术搜索
12.耶茨 MV、Gerba CP、Kelley LM。病毒在地下水中的持久性。应用环境微生物。1985;49(4):778–81.PMID：4004211
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
23米耶茨 MV、Stetzenbach LD、Gerba CP、Sinclair NA。本地细菌对地下水中病毒存活的影响。环境科学与健康杂志A部分：环境科学与工程与毒理学。1990;25(1):81–100.
查看文章Google 学术搜索
24 分钟Betancourt WQ、Kitajima M、Wing AD、Regnery J、Drewes JE、Pepper IL 等。在三次全面作业中通过有管理的含水层补给来评估病毒清除情况。环境科学与健康杂志， Part A. 2014;49(14):1685–92.Epub格式 2014 年 10 月 16 日。PMID：25320855
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
25米美国环境保护署 （EPA）。方法 1615 通过培养和 RT-qPCR 测量水中肠道病毒和诺如病毒的发生，EPA/600/R-10/181。版本 1.3 ed. 俄亥俄州辛辛那提。2014. 可从： https://cfpub.epa.gov/si/si_public_file_download.cfm?p_download_id=522923
16.美国环境保护署 （EPA）。方法 1602：通过单琼脂层 （SAL） 程序测定水中的男性特异性 （F+） 和体细胞大肠杆菌。美国环保署 821-R-01-029。华盛顿特区，2001年。可从： https://www.epa.gov/sites/default/files/2015-12/documents/method_1602_2001.pdf
查看文章Google 学术搜索
17.美国公共卫生协会 （APHA）、美国水务协会和水环境联合会的标准方法委员会。9222膜过滤技术用于大肠菌群成员。在：水和废水检查的标准方法。Lipps WC、Baxter TE、Braun-Howland E，编辑：APHA 出版社;2006.
18.Ji P、Aw TG、Van Bonn W、Rose JB。评估用于检测水中病毒的便携式基于纳米孔的测序仪。J Virol方法。2020;278:113805.Epub 20191228。PMID：31891731。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
19.Trussell SR，编辑 通过欧申赛德市的圣路易斯雷伊污水处理厂监测病原体浓度。第11届国际水协会水再生与再利用国际会议论文集;2017年7月23日至27日;加利福尼亚州长滩：国际水协会 （IWA）。
20.Tchobanoglous G， Kenny J， Leverenz H. 用于优化废水处理和饮用水再利用应用的先进水处理性能的恒定流量的基本原理。2021 年水环境研究;93(8):1231–42.Epub 20210215。PMID：33547686;PubMed Central PMCID：PMC8451933。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
11米Schwartzmann A. 北城再生水厂的病原体监测研究——统计审查和分析报告。加州大学圣地亚哥分校，2018 年。
12 分钟Helsel DR、Hirsch RM、Ryberg KR、Archfield SA 和 Gilroy EJStatistical methods in water resources： U.S. Geological Survey Techniques and Methods。美国地质调查局2020.第117-43页。
查看文章Google 学术搜索
13 分钟Blom G. 统计估计和转换的 β 变量 [博士论文]。斯德哥尔摩：Almqvist & Wiksell：斯德哥尔摩学院。1958.
14 分钟施密特 PJ、安德森 WB、埃梅尔科 MB。描述水处理工艺性能：为什么平均对数减少可能是一个误导性的统计数据。水研究 2020;176：115702.Epub 20200309。PMID：32247998。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索
15 分钟Pecson B， Darby E， Di Giovanni G， Leddy M， Nelson K， Channah R， et al. 未经处理的废水中的病原体监测。最终报告。水研究基金会 （WRF）、加利福尼亚州水资源控制委员会和南加州大都会水区，2021 WRF 4989。
查看文章Google 学术搜索
16米国家水研究所（NWRI）。圣地亚哥纯净水专家顾问小组。小组委员会关于统计和病原体监测的报告。二月 112019.可从： https://www.nwri-usa.org/
17 分钟史蒂文森 J、海马斯 W、希尔亚德 D.使用Armored RNA作为RT-PCR的多用途内部对照。J Virol方法。2008;150(1–2):73–6.Epub 20080418。PMID：18395804;PubMed Central PMCID：PMC7119664。
查看文章PubMed/NCBI公司Google 学术搜索