免费医学论文发表-沃尔巴克氏体内共生体操纵生殖系干细胞的自我更新和分化，以增强其果蝇宿主的生育能力

抽象

α变形杆菌沃尔巴克氏菌（Wolbachia pipientis）感染全世界的节肢动物和线虫物种，使其成为宿主生物防治的关键靶标。沃尔巴克氏体驱动的宿主生殖操作，如细胞质不相容 （CI），被认为将这些细胞内细菌在宿主种群中高频传播。积极的（也许是互惠的）生殖操作也会增加感染频率，但尚不清楚。在这里，我们确定了沃尔巴克氏体影响生殖系干细胞（GSC）自我更新和分化的分子不同过程的分子和细胞机制。我们证明 wMel 感染挽救了缺乏翻译调节因子 mei-P26 的果蝇的生育能力，并且足以无限期地维持不育的纯合子 mei-P26 敲低储备。细胞学显示，wMel 通过恢复适当的 pMad、Bam、Sxl 和 Orb 表达来减轻 mei-P26 丢失的影响。在具有野生型生育力的俄勒冈州 R 文件中，wMel 感染提高了终生卵孵化率。通过对真核生物和细菌转录本的双RNAseq定量来探索这些表型，发现wMel感染在mRNA水平上挽救并抵消了mei-P26缺失诱导的许多基因表达变化。总体而言，我们发现 wMel 感染在 mRNA、蛋白质和表型水平上有益地增强了宿主的生育能力，这些机制可能促进共生关系的出现和宿主生殖操作的破坏。

数字

Table 1图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 9Table 1Fig 1Fig 2Fig 3

引文： Russell SL、Castillo JR、Sullivan WT （2023） 沃尔巴克氏体内共生体操纵生殖系干细胞的自我更新和分化，以增强其果蝇宿主的生育能力。PLoS 生物学 21（10）： E3002335 中。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335

学术编辑： Nancy A. Moran，德克萨斯大学奥斯汀分校，美国

收到： 2023年1月18日;接受： 2023年9月14日;发表： 10月 24， 2023

版权所有： ? 2023 Russell et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都包含在论文、支持信息文件、NCBI BioProject 编号 PRJNA1007602 或树妖：https://doi.org/10.7291/D1DT2C 上。

资金： 这项工作得到了加州大学圣克鲁斯分校校长博士后奖学金和NIH（R00GM135583 SLR;R35GM139595 至 WTS）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

缩写： BDSC， 布卢明顿果蝇库存中心;.BMP 骨形态发生蛋白;联邦调查局 膀胱母细胞;抄送， 囊细胞;词 细胞质不相容;CTCF， 校正了总细胞荧光;犯 错 雌激素相关受体;GSC， 生殖干细胞;NDJ， 不分离;OreR， 俄勒冈州 R;pHH3， 磷酸化组蛋白 H3;圆周率 碘化丙啶;RISC， RNA诱导的沉默复合物;核酸核酸（RNP）， 核糖核蛋白;UAM公司 转运放大;TomO， 卵子发生的毒性操纵剂;UTR， 未翻译的区域

介绍

内共生细菌已经进化出多种感染和操纵宿主种群的策略[1,2]，这些策略现在正被用于生物防治应用[3]。这些细菌中有许多存在于宿主细胞内，并引导雌性宿主发育以定植后代，从而通过垂直传播将其适应性与宿主的适应性联系起来[4]。具有生殖操纵能力的遗传性内共生体更进一步，通过改变宿主发育的方式迅速增加宿主种群中受感染的生殖雌性的频率。生殖操纵策略包括胞浆不相容（cytoplasmic incock， CI），其中受感染的精子需要通过受感染的卵子、雄性杀伤、女性化和孤雌生殖来挽救[5,6]。这些操作可以非常有效地将细菌共生体驱赶到宿主种群中，而不管宿主个体或种群的成本如何[7]。

尽管寄生生殖操作取得了成功，但自然选择偏向于提高受感染母亲生育能力的共生体，即使这些变异降低了最初导致感染的高频寄生机制的功效[8]。在节肢动物和 αproteobacterium Wolbachia pipientis 菌株之间的关联中，这种情况可能很常见。例如，在1980年代wRi的CI介导的横扫加利福尼亚之后，感染沃尔巴克氏体wRi菌株的果蝇种群的繁殖力在20年内从-20%波动到+10%[9]。这种从适应度成本到收益的转变与CI强度在同一时间段的减弱相吻合[10]。其他沃尔巴克氏体菌株的生育能力增强机制可能在其原生宿主中达到高感染频率，但目前没有寄生虫生殖操纵的证据[11]。重要的是，这些适应性益处也可能在人群感染的早期阶段发挥作用，此时受感染宿主的频率太低，CI无效[12]。

目前，沃尔巴克氏体的wMel菌株及其编码的CI机制已成功用于生物控制非天然宿主[3]。在埃及伊蚊中，CI导致未感染母亲所生后代的死亡率接近100%[13]。然而，在其原生宿主果蝇黑腹果蝇中，wMel表现出的CI很少超过50%，并且对父亲年龄[14–16]以及祖母年龄极为敏感，因为滴度随年龄增加而增加[17,18]。尽管其天然宿主的CI较弱，但在全世界人群中发现wMel的感染频率为中至高[19,20]。其他数据表明，这些频率可能由一些增加宿主适应性的新兴有益功能来解释[21\u201225]。这些有益功能的分子基础可能与 D 中 CI 疗效的丧失有关。黑腹果蝇。鉴于 wMel 在非原生宿主中的使用依赖于强大而高效的 CI，我们必须了解其最终可能破坏 CI 功能的有益功能的基础。

宿主生殖系干细胞 （GSC） 维持和分化途径是沃尔巴克氏体介导的生殖操作的强大靶点。沃尔巴克氏体菌株对宿主生殖组织具有很强的亲和力[26,27]，可将其定位在正确的位置，以操纵和提高宿主的生育能力。在与布鲁吉亚丝虫线虫[28]和阿索巴拉黄蜂[29]形成专性关联的菌株中，沃尔巴克氏体在种系中是防止过早分化和成功卵子发生的必要条件（见[30]）。在兼性 w Mel-D 中。黑腹肌协会，WMel菌株可以部分挽救雌性果蝇中基本种系维持和分化基因性致死（SXL）和弹珠袋（BAM）的部分功能等位基因丧失[31–33]。已知wMel编码其自身因子，即卵子发生毒性操纵因子（toxic manipululator of oogenesis， TomO），通过去抑制和过表达翻译阻遏蛋白Nanos（Nos）来部分概括GSC中的Sxl功能[34,35]。然而，Nos表达与早期Germarium中的Bam表达呈负相关[36]。因此，Bam 在 wMel 感染的突变果蝇的囊肿模式化和分化中的功能不能用与 sxl rescue 或 TomO 的已知功能共享机制来解释。

在之前的筛选中，我们的实验室将必需的生育基因减数分裂-P26 （mei-P26） 确定为影响 D 中 wMel 感染强度的宿主因子。黑腹果蝇细胞培养，可能通过调节蛋白质泛素化[37]。Mei-P26 是一种 Trim-NHL 蛋白，通过其多个结构域赋予广泛的功能：其蛋白质结合 NHL 和 B-box 结构域使其能够充当多种翻译阻遏蛋白复合物（例如，Sxl、Nanos （Nos）、Argonaute-1 （AGO1），参见 S1 至 S2A 图 和 S1 至 S2 表）。 其E3-泛素连接酶结构域可能使其能够调节蛋白水解[38]。鉴于mei-P26在感染中的体外作用[37]及其在GSC维持[38]、分化[39,40]和减数分裂[40,41]中的体内作用，我们选择它作为调节wMel-宿主相互作用的候选基因。

我们报告说，D.感染沃尔巴克氏体 wMel 菌株的黑腹果蝇部分挽救了 mei-P26 突变并表现出增强的生育能力。在亚态性mei-P26纯合子的果蝇中，wMel感染将雄性和雌性的生育能力提高到足以维持稳定种群的水平，而未感染的种群是不可持续的。感染通过减轻扰动的 mei-P26 功能对其他蛋白质和 mRNA 表达的下游影响来挽救 GSC 维持和囊肿分化。具体而言，wMel 感染恢复了磷酸化母亲对头瘫 （pMad）、Sxl、Bam 和 Oo18 RNA 结合 （Orb） 蛋白以及肿瘤睾丸 （tut） 和良性性腺细胞肿瘤 （bgcn） mRNA 的野生型样表达谱。我们在俄勒冈 R （OreR） 野生型果蝇中发现了 wMel 有益的生殖操纵能力的证据，说明了如何在自然界中选择细菌介导的发育恢复力。这些结果对于理解 wMel 如何在自然 D 中达到高频至关重要。黑腹果蝇种群和这些有益功能可能能够用于生物控制应用。

结果

在这里，我们探讨了 wMel Wolbachia 感染对 D 的影响。黑腹果蝇的必需生育基因 mei-P26 通过 RNAi 构建体的剂量敲低、亚态等位基因 mei-P26 的功能被破坏以及用无效等位基因 mei-P26 完全敲低[mfs1]。使用苍蝇繁殖力测定、免疫细胞化学以及宿主和细菌转录本的双 RNAseq，我们表明 wMel 可以补偿 mei-P26 的损失，从而显着挽救宿主生育能力。

感染 wMel 可挽救雌性 D。mei-P26 缺陷果蝇的黑腹果蝇生育能力

与OreR野生型菌株相比，感染w Mel显著挽救了由mei-P26功能丧失引起的生育缺陷，这是通过每个雌性D产生的后代来衡量的。每天黑腹肌（图 1A-1E 和 S3;p< = 2.2e-16 至 2.9e-2，Wilcoxon 秩和检验;见S2-S6图）。后代生产需要成功维持 GSC，将 GSC 子细胞分化为完全发育和受精的卵子，胚胎发生，并孵化为一龄幼虫。将后代产量分解为产卵和产蛋成分（图1B和1C）显示，随着等位基因强度的增加，从nos驱动的RNAi到亚态和无效等位基因，生育影响从影响分化/发育（产卵）的因素转变为影响产卵的因素（产卵）。

缩略图 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 1. wMel 感染挽救了雌性（和雄性，见 S4E-S4G 图）中基本宿主生育基因 mei-P26 的丧失。

（空调）蜂群箱线图的 （A） 总后代产量，分为 （B） 产卵和 （C） 孵化卵，从单个雌性 RNAi、亚态性和无效 mei-P26 敲低雌性果蝇杂交到相同感染状态和年龄（3-7 日龄）的单个 OreR 雄性。无效等位基因 mei-P26[mfs1] 将突变杂合子和纯合子的产卵率降低到感染和未感染雌性的平均 20 以下，因此需要对有后代和没有后代的雌性进行分析（见 D）。Wilcoxon 秩和检验 *p< = 0.05，**< = 0.01，***< = 0.001，****< = 1e-4。费舍尔精确检验 [**]p< = 0.01，[****]< = 1e-4。（D-E）（D） 有后代和没有后代、感染和未感染沃尔巴克氏体的指定基因型女性样本比例的条形图。（E） 表格列出了 wMel 感染（左）或未感染（右）mei-P26 突变体所表现出的野生型繁殖力的百分比，按严重程度增加的顺序，从上到下（另见 S4-S6 表）。从低到高比例的单元格值分别从浅蓝色到深蓝色着色。（女，女）敲除 mei-P26 D.黑腹肌繁殖力与雌性年龄的关系，与局部多项式回归拟合（深灰色边界 = 95% 置信区间）。在（F）mei-P26 RNAi和（G）mei-P26[1]亚态雌性寿命的前25天内，感染wMel会增加后代的产量。 （H-O）D的共聚焦平均投影。黑腹果蝇卵泡和胚芽（3-7 日龄）。（H-I'）细胞内 wMel FtsZ 定位于种系（黄色、Vas+、内虚线轮廓）和体细胞（Vas-，内虚线和外虚线轮廓之间的空间）细胞，滴度高，在未感染的果蝇中具有低背景。细菌连续位于mei-P26[1]种系中，从GSC（Hts结合光谱体附近的箭头）开始。体细胞区域用空箭头表示。（J-O）细胞学显示，wMel 感染挽救了 （J， K） mei-P26 RNAi、（L， M） mei-P26[1]（另见 S5 图）和 （N， O） mei-P26[1/mfs1] 诱导的卵子发生缺陷。 荧光通道连续采样并叠加，如每组图像所示，如下所示：青色 = 抗胡李泰少 （Hts） 环管亚型 （-RC） 或消融物亚型 （-FUS），黄色 = 抗 Vasa （Vas），蓝色 = wMel 抗丝状温度敏感突变体 Z （FtsZ），红色 = PI DNA 染色。比例尺：H–I' = 10 μm，L–O = 50 μm，J，K = 100 μm。（P） 野生型D的示意图。黑腹果蝇Germarium，按区域突出显示关键事件和细胞类型，如[42]。米色的体细胞，GSC衍生的细胞是颜色鲜艳的梯度，导致分化的囊肿细胞为黄色，指定的卵母细胞为蓝色。起源于GSC的黑色结构是光谱体，随着CB的形成，光谱体变成分支的fusome，远离生态位，并分裂成CC。这个数字背后的数据可以在 S3 表和 doi.org/10.7291/D1DT2C 的 Dryad 上找到。CB， 膀胱母细胞;CC，膀胱细胞;GSC，生殖系干细胞;俄勒冈州R;PI， 碘化丙啶。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g001

wMel 感染介导了所有等位基因强度和 nos：GAL4>UAS 驱动的 RNAi 敲低的显着程度的生育挽救，表明一种强大的细菌挽救机制，可以补偿蛋白质剂量和功能的损失。nos驱动的mei-P26 RNAi耗竭（来自未感染果蝇中26%的后代产生缺陷）的挽救已经完成：由于产卵率较高，感染的mei-P26 RNAi雌性比受感染的OreR野生型雌性多产生44%的后代（37 vs 25 只幼虫/雌性/天，p< = 1.15E-02 Wilcoxon 秩和检验，S4表和图1A和1E）（p< = 6.99E-05 Wilcoxon 秩和检验，S5 表和图 1B 和 1E），与更高的孵化率相反（图 1C 和 1E 和 S6 表）。这可能表明 wMel 和低剂量 mei-P26 在 GSC 中具有协同作用。在未感染和wMel感染的mei-P26[1]亚态雌性中，与匹配感染状态的OreR野生型相比，后代产量分别下降了94%和73%（p< = 2.26E-14和3.45E-12 Wilcoxon秩和检验，S4表和图1A和1E）。比较未感染和w Mel感染的雌性mei-P26[1]繁殖力表明，wMel感染通过增加产卵率（p< = 2.82E-02 Wilcoxon秩和检验，S5表和图1B）和卵孵化率（

wMel 介导的 mei-P26 拯救是稳健的，足以在稳定的储备库中拯救该基因。在mei-P26[1]亚态和nos驱动的RNAi敲低雌性中，wMel感染增加了在果蝇生命周期中每天产生的后代数量（p< = 1.5e-11至3.4e-2 Kolmogorov-Smirnov试验，S7表和图1F和1G）。然而，对于感染状态和基因型，每天产卵的潜在数量和孵化率确实随年龄而有很大差异（S4A-S4D图）。wMel 挽救机制并非女性所特有，因为 wMel 感染减轻了 mei-P26 缺失对男性生育能力的较弱影响（S4E–S4G 图;p< = 6.1e-6 至 2.9e-2 Wilcoxon 秩和检验，S3–S5 表）。因此，我们能够建立感染 wMel Wolbachia 的 mei-P26[1] 果蝇的纯合种群。相比之下，未感染的种群只持续了几代，没有平衡染色体（S4H和S4I图）。鉴于mei-P26[1]等位基因的严重性，但具有显着的可挽救性（图1A-1C，S2B和S2D），我们继续进行该基因型进行许多后续的特定免疫细胞学挽救表型的测定。

雌性种系形态被 mei-P26 缺陷果蝇的 wMel 感染挽救

在 D.黑腹果属癣，wMel在种系细胞和体细胞中均以高滴度持续存在（图1H–1H'，与图1I–1I'中的对照组相比），与先前的报道一致[26,27,43]。与体细胞相比，细菌更强烈地定位于种系来源的细胞（图 1H–1H' 中 FtsZ 和 Vas 的共定位）。细胞内 wMel 可以在 GSC、成囊细胞 （CB）、囊细胞 （CC） 和发育的囊肿中识别。这种定位使 wMel 处于 mei-P26 活跃的所有关键细胞类型和阶段，使细菌能够补偿 mei-P26 在 GSC 维持和分化中的发育功能。

比较感染和未感染沃尔巴克氏体的 mei-P26 敲低卵母细胞的细胞学证实，wMel 感染的卵巢比未感染的卵巢表现出更少的发育缺陷，更接近 OreR 野生型（图 1J-1O 和 S5 与图 1P;Vasa （Vas） = 种系 [44]，Hu Li Tai Shao （Hts） = 细胞骨架光谱体/烟团 [45]，碘化丙啶 （PI） = DNA）。具体来说，与未感染的卵巢相比，w Mel 感染的 mei-P26 敲低卵巢表现出更正常形成的囊肿，由生殖系衍生的护士细胞周围的体细胞衍生的卵泡细胞和卵母细胞组成。异常表型包括缺乏卵泡细胞外部（图1K和1M）、种系来源内部（图1M和1N）或正常数量的分化护士细胞（图1O）的囊肿。

这些一系列 mei-P26 等位基因、RNAi 敲低和宿主年龄的比较数据表明，wMel 在早期宿主卵子发生中挽救了 mei-P26 的发育功能。相比之下，wMel 并不能挽救 mei-P26 在减数分裂中的作用。wMel 感染未挽救分离缺陷，如感染和未感染的 mei-P26[1] 纯合子亚型的 X 染色体不分离 （NDJ） 率升高所表明的那样（NDJ = 7.7% 和 5.6% 通过实验，S6A 和 S6B 图）。在以下各节中，我们分析了 wMel 在早期卵子发生的每个关键时间点挽救 mei-P26 功能的能力。

宿主 GSC 在 wMel 感染的果蝇中维持率高于未感染的 mei-P26 缺陷果蝇

通过对“年轻”4-7日龄（图2）和“老年”10-13日龄雌性（S7A-S7C图）的基本GSC标志物pMad和Hts进行免疫荧光染色来定量GSC。pMad 染色阳性表明细胞对来自周围体细胞 GSC 生态位细胞的静止信号有反应。Hts染色阳性需要定位到单个点状光谱体，而不是分支模糊体[46]。

缩略图 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 2. wMel 感染挽救了 mei-P26 诱导的女性 GSC 维持缺陷。

（A-E）与未感染的果蝇相比，感染 wMel 使 mei-P26[1] germaria 中每个细菌的 GSC 数量更高。（A-D）D的共聚焦平均投影。黑腹果蝇 germaria 染色有针对 Hts 和 pMad 的抗体。（E） 每个天瑕菌中GSCs数量的小提琴图。由于功能齐全的 GSC 表达 pMad 并具有 Hts 标记的光谱体，因此每个光谱体的权重减半，从而获得部分分数。Wilcoxon 秩和检验 * = p<0.05， ** = 0.01， *** = 0.001， **** = 1e-4.（F-J）通过 pHH3 表达检测的有丝分裂 GSC 显示，相对于未感染的 GSC，w Mel 恢复了亚态性 mei-P26 GSC 的有丝分裂。 （F–I） D 的共聚焦平均投影。黑腹果蝇 germaria 染色有针对 Hts 和 pHH3 的抗体。（J） 在雌性菊花中发现表达 pHH3 的 GSC 比例的堆积条形图。费舍尔精确检验 * = p < 0.05。荧光通道按顺序采样并叠加，如每组图所示：青色 = 抗 Hts，黄色 = 抗 Vas，红色 = PI，绿色 = 抗 pMad in （A–D） 和抗 pHH3 in （F–I）。比例尺 A–D = 10 μm 和 F–I = 25 μm。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。GSC，生殖系干细胞;pHH3，磷酸化组蛋白H3。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g002

染色显示，在4至7日龄的年轻果蝇中，相对于未感染的幼蝇，每个mei-P26[1]幼稚叶中wMel感染的GSC平均数量增加（感染/亚型：1.0与未感染/亚型：0.58，p< = 2.9e-4 Wilcoxon 秩和检验，S8 表），但 GSC 维持未达到 OreR 野生型率（感染/WT： 2.3 和未感染/WT：1.9，p< = 1.2e-4 至 2.8e-4 Wilcoxon 秩和检验，图 2A-2E 和 S8 表）。w与未感染的菊叶相比，Mel感染的mei-P26[1]菊叶还具有更多的细胞表现出其他GSC特性，例如大细胞质和对体细胞生态位帽细胞的物理附着[46]。与mei-P26[1]等位基因相比，mei-P26的RNAi敲低对每个生殖器的GSC数量没有显着影响（感染/RNAi：2.1和未感染/RNAi：1.9，S7A-S7C图和S8表），表明适度减少mei-P26剂量对分化的影响比GSC维持更强。 由于 wMel 感染，OreR 野生型 germaria 没有表现出不同数量的 GSC（图 2C–2E 和 S8 表）。

在10至13日龄的幼龄幼虫中，w Mel感染的mei-P26[1]雌性中每个幼稚虫的GSC数量收敛于OreR野生型值（S7C图）。随着野生型果蝇年龄的增长，每个幼稚虫的GSC数量自然下降[47]，即使在wMel感染的果蝇中也是如此（老化/感染/WT：1.6 vs 年轻/感染/WT：2.3，p< = 0.019 Wilcoxon秩和检验，图2C–2E和S7C和S8表）。 随着年龄的增长，感染和未感染的mei-P26[1]雌性似乎都保留了一些GSC（年龄/感染/亚态：1.5和年龄/未感染/亚态：0.94，p< = 0.013–0.014 Wilcoxon秩和检验，S7C图和S8表）。虽然OreR野生型感染和未感染的果蝇在前2周内丢失了3%至31%的GSC，但感染和未感染的mei-P26[1]果蝇在这段时间内将其GSC丰度分别增加了43%和63%（S7C图），可能是通过募集差异化的GSCs[48]。考虑到GSC保留的两种年龄依赖性轨迹，当wMel感染的mei-P26[1]幼稚虫10至13天大时，它们所含的每只幼稚虫的GSC平均数量与野生型果蝇相同，并且GSCs明显多于未感染的mei-P26[1]果蝇（p< = 0.015 Wilcoxon秩和检验，S7C图和S8表）。因此，沃尔巴克氏体增强了年轻和老年mei-P26[1]女性的干细胞维持。

受感染的mei-P26[1] GSC具有功能性，如其按有丝分裂的能力所示（图2F-2J和S9表）。我们通过抗磷酸化组蛋白H3丝氨酸10（pHH3）染色阳性鉴定了有丝分裂细胞核，pHH3是Cdk1激活和有丝分裂进入的特异性标志物[49]。未感染的 mei-P26[1] germaria 中有丝分裂的 GSC 明显少于感染的 mei-P26[1] 和未感染的 OreR 野生型 germaria（0.09% vs 6%，p = 4.7e-2 和 4.6e-2 Fisher 精确检验，图 2F-2J 和 S9 表）。未感染和感染的野生型天芽虫在有丝分裂中GSCs的频率没有差异（5%至6%，图2H-2J和S9表）。有丝分裂的成胱细胞和囊细胞仅在感染的 mei-P26[1] germaria 中显着富集，与感染的野生型 germaria 相比 （p< = 1.3e-2 Wilcoxon 秩和检验，S7D 图 和 S10 表），尽管转运扩增 （TA） 有丝分裂期间的过度复制是未感染的 mei-P26[1] germaria 的常见表型（下文讨论和 [50]）。

在wMel感染的germaria中挽救了宿主Sxl表达的调节

GSC的维持和分化需要适当的Sxl表达[51]。GSC中高水平的Sxl维持干细胞静止[52]。当GSC分裂且CB远离生态位时，Sxl与Bam和Mei-P26合作，与nos 3′非翻译区（UTR）结合，并下调Nos蛋白水平以促进分化[50,53]。

我们通过对整个卵母细胞进行共聚焦显微镜，量化了用抗 Sxl 抗体染色的整个卵巢中的 Sxl 定位模式，揭示了 wMel 感染减轻了由于 mei-P26 丢失引起的 Sxl 失调（图 3）。相对于OreR野生型（p< = 5.7e-10至5.3e-5 Wilcoxon秩和检验，图3A-3B'与3F-3H'和3I，S7E图和S11表）在未感染的mei-P26[1]日耳胶区域1中表达较少的Sxl在区域2a和2b中表达。与未感染的mei-P26相比，wMel感染增加了Germarium区域1的Sxl表达，对区域2a没有影响，并抑制了区域2b的表达[1]，复制了类似于野生型germaria中的表达模式（p< = 5.7e-10至8.4e-3 Wilcoxon秩和检验，图3A-3B'与3C-3E'和3I以及S7E和S11表）。有趣的是，w Mel 感染可能会影响 OreR germaria 中 Sxl 的表达，因为相对于未感染的 germaria，w Mel 感染的 2a 区蛋白质显着升高（图 3I）。 因此，wMel的存在可以部分挽救mei-P26缺失导致的Sxl失调，这表明w Mel的mei-P26挽救机制可能是wMel感染的Sxl突变体中Nos调节的基础[31,34]。

缩略图 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 3. wMel 感染可减轻功能失调的 mei-P26 对天疣中 Sxl 表达的影响。

（A-H'）D的共聚焦平均投影。黑腹果蝇germaria染色有针对Sxl和pMad的抗体。显示了每种mei-P26[1]感染状态的三种表型，（左）一种尽可能与野生型相似，（中）一种代表GSC缺失，pMad阴性，（右）一种代表保留pMad阳性GSC的发育改变表型。我们连续对荧光通道进行采样，并按照每组图像的指示叠加它们：青色 = 抗 Sxl，红色 = PI，绿色 = 抗 pMad。比例尺 = 25 μm。（I） 按区域划分的整个天竺葵中相对 Sxl 荧光表达水平的条形散射图（A'–H' 中 Sxl 通道图像上的黄色轮廓）。图1A-1D和2E中标记的颜色，从左到右：深灰色=w梅尔感染的OreR，浅灰色=未感染的OreR，深粉色=w梅尔感染的mei-P26[1]，浅粉色=未感染的mei-P26[1]。Wilcoxon 秩和检验 * = p<0.05， ** = 0.01， *** = 0.001， **** = 1e-4。（J） mei-P26[1] germaria 中 wMel Sxl 表达挽救的模型。绿色虚线表示 wMel 对 GSC 中 pMad 表达的上调（图 2A–2E）。紫色虚线表示 wMel 在 GSC/CB 中对 Sxl 的上调和天瑕疱区域 2b 对 Sxl 的下调。带有 + 符号的箭头表示 wMel 对基因表达的作用。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。CB， 膀胱母细胞;GSC，生殖系干细胞;俄勒冈州R;PI， 碘化丙啶。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g003

Bam 表达在 wMel 感染的 mei-P26 突变体中部分恢复

在野生型雌性果蝇中，Bam表达在成胱母细胞子细胞远离其未分化的姐妹细胞后立即开始，该姐妹细胞仍与GSC生态位结合（[50,54]，如图1P所示）。Bam与fusome结合并稳定CyclinA以促进TA有丝分裂，从单个CB产生16个囊肿细胞[55]。紧接着这 4 个有丝分裂，Bam 表达在野生型卵巢中下调，以将生殖系囊肿限制为 16 个生殖系来源的细胞。

通过抗 Bam 免疫荧光共聚焦成像和定量，我们确定 wMel 感染减轻了 mei-P26[1] germaria 中 Bam 失调的各个方面（图 4）。Mei-P26 的缺失使 Bam 表达失调并将 Bam 表达扩展到天疣区域 1 之外（图 4A-4B“与 4C-4F”和 4G;S7F图和S12表），产生过量的护士样细胞[50]。与未感染的 germaria相比，w Mel 感染使 mei-P26[1] germaria 在 CB 至 16 细胞阶段的 Bam 上调 （p< = 0.016，图 4G）。在Mel感染的mei-P26[1]germaria的2a和2b阶段，Bam也可能下调，因为未感染的germaria表达的Bam明显高于野生型（p< = 0.019 Wilcoxon秩和检验，图4G和S12表），而wMel感染的germaria则不然（图4G和S12表）。不幸的是，样本之间mei-P26[1] Bam荧光强度的差异太大，无法确定未感染和感染的germaria在16细胞阶段后的Bam表达是否不同。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 4. wMel 感染减轻了功能失调的 mei-P26 对 Bam 在天窖中表达的影响。

（A-F“）D的共聚焦平均投影。黑腹果蝇 germaria 染色有针对 Bam 和 pMad 的抗体。显示了每种mei-P26[1]感染状态的两种表型，（左）一种尽可能与野生型相似，（右）一种代表发育改变的表型。（G） 按区域划分的整个天疽细菌中相对 Bam 荧光表达水平的条形散射图（A'–F' 中 Bam 通道图像上的黄色轮廓）。我们将区域 1 细分为 GSC 和 CB/囊细胞亚段，因为 Bam 在 CB 中的表达增加。（H） 相对Bam与pMad荧光之比的条形散射图。由于 pMad 和 Bam 表达分别在 GSC 和 CB/囊细胞中相互排斥，因此 OreR 野生型值接近于零。明显高于此值的值反映了干细胞状态的失调。（I） wMel 拯救 mei-P26[1] germaria 中 Bam 表达的模型。图1A-1C、2E和3I中标记的颜色，从左到右：深灰色=w梅尔感染的OreR，浅灰色=未感染的OreR，深粉色=w梅尔感染的mei-P26[1]，浅粉色=未感染的mei-P26[1]。Wilcoxon 秩和检验 * = p<0.05， ** = 0.01， **** = 1e-4。比例尺 = 25 μm。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。CB， 膀胱母细胞;GSC，生殖系干细胞;俄勒冈州俄勒冈州 R.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g004

wMel 感染会改变 GSC 和 CB 中 Bam 的表达，以分别达到与野生型 germaria 相似且更极端的表达谱（图 4H 和 4I）。在GSC生态位中，感染和未感染的mei-P26[1]germaria的Bam表达均低于野生型（图4G）。这与文献的预期形成鲜明对比：来自体细胞生态位的骨形态发生蛋白（BMP）信号转导诱导GSC中的pMad表达，直接抑制Bam转录，阻止分化[56]。GSC中mei-P26功能的丧失应使Brat去抑制，导致pMad抑制和Bam表达不当[38]。然而，我们看到 wMel 感染和未感染的 mei-P26[1] GSC 中 Bam 表达低于 OreR 野生型 （p< = 1.3e-6 至 1.4e-3 Wilcoxon 秩和检验，图 4G 和 S13 表）。未感染的mei-P26[1] GSCs中相对Bam/pMad表达比率升高（p<=2.5e-4至4.0e-4 Wilcoxon秩和检验，图4H和4I和S13表）可以解释这种偏离预期的原因。尽管GSC Bam的表达低于野生型，但与pMad表达相比，Bam表达明显失调和上调，这与失去干细胞身份的生殖细胞的预期一样[57,58]。针对 pMad 表达的归一化也强化了以下发现：在CB 至 16 细胞阶段，w Mel 将 mei-P26[1] 亚型的 Bam 表达水平提高到高于野生型水平 （p< = 1.2e-6 至 2.0e-2 Wilcoxon 秩和检验，图 4H 和 4I 和 S13 表）。

wMel 挽救因 mei-P26 敲低而受损的正常生殖系囊肿和卵母细胞发育

Mei-P26缺陷的苍蝇过度增殖护士细胞并部分分化GSCs以产生肿瘤生殖系囊肿（[38,39]和图5A-5D与5E-5H，图5I和S14表）。在RNAi敲除卵巢中，wMel感染显着减轻了肿瘤生殖系囊肿的形成（35.3%和16.3%的囊肿超过15个护士细胞;p = 4.5e-3 Fisher 精确检验，图 5E 和 5F 与 5G 和 5H 以及 S14 表）。相比之下，在mei-P26[1]等位基因germaria中发现的种系囊肿肿瘤没有被wMel感染挽救，尽管该细菌能够挽救这些卵孵化成后代的速度（图5I与图1A和1C），但与它们在germarium区域2a和2b中Bam表达的失调一致（图4G）。mei-P26[1]等位基因相对于nos驱动的RNAi敲低的更强性质可能是肿瘤囊肿数量差异的基础。缺乏肿瘤挽救表明，肿瘤囊肿以某种速率产生正常卵子，或者 wMel 感染在卵子发生后期挽救肿瘤，可能是通过某种体细胞机制[59\u201262]。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 5. wMel 感染挽救囊肿肿瘤并恢复 mei-P26 突变体的卵母细胞规格。

（A-I）Mei-P26 的缺失和过表达诱导肿瘤囊肿的形成，其中含有超过 15 个护士细胞。wMel 感染可减轻 nos>mei-P26 RNAi 敲低并加剧 nos>mei-P26 OE 表型。（A-H）D切片约25μm厚的共聚焦最大投影。用 PI 染色的黑腹果酸卵母细胞囊肿。（I） 含有异常数量护士细胞（少于或大于 15 个护士细胞）的种系囊肿比例的堆积条形图。（J-R）与未感染的囊肿相比，感染wMel的亚形性mei-P26[1]囊肿显着恢复了Orb翻译调节。卵母细胞规格发生在天竺葵的2b-3区域（见图1P中的图表），此时球体表达仅限于新生卵母细胞。（J-Q'）D的共聚焦平均投影。黑腹果蝇 germaria 染色有针对 Orb 和 Vas 的抗体。（R） 含有卵母细胞特异性 Orb 染色的种系囊肿比例的堆积条形图。样本量写在条形图上。N = 否，M = 可能，Y = 是。费舍尔精确检验 ** = p<1e-2， **** = p<1e-4。比例尺 = 50 μm。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。OE： 过表达;PI， 碘化丙啶。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g005

mei-P26 的过表达在未感染和感染的卵巢中产生肿瘤;然而，感染的卵巢比未感染的卵巢表现出更多的肿瘤（p = 1.6e-3 Fisher 精确检验，图 5I 和 S14 表）。发现过量的 mei-P26 概括了由 mei-P26 缺乏诱导的肿瘤表型，表明该基因对其自身功能产生浓度依赖性显性负面影响。鉴于 w Mel 感染使这种显性阴性表型更加严重，我们假设 wMel 可能通过直接相互作用或冗余功能产生增强 Mei-P26 功能的因子。

w Mel感染会增加mei-P26[1]种系囊肿中卵母细胞特异性球体定位的速率（图5J-5R和S7G和S15表），表明wMel挽救了功能性囊肿的形成。天竺葵区域2a的卵母细胞规格（见图1P中的图表）通过球体翻译的去抑制而丢失mei-P26[38]。Mei-P26 与球体 3′ UTR 结合并阻止其平移。在囊肿模式化和发育后，16个种系来源的细胞中的一个通过特异性oo18 RNA结合蛋白（Orb）表达被指定为卵母细胞[63]。在2a区，注定要成为卵母细胞的生殖系囊肿细胞激活球体翻译[38]。mei-P26缺失导致球体去抑制和非特异性表达[38]。与未感染的囊肿相比，wMel感染可恢复mei-P26[1]囊肿中卵母细胞特异性Orb表达（p = 5.9e-9 Fisher精确检验，图5L-5N'与5O-5Q'和S15表）。我们观察到野生型囊肿中卵母细胞特异性球体染色率为93%至94%，而mei-P26[1]将这一频率降低到25%，wMel感染将mei-P26[1]囊肿恢复到61%（S15表中的计数）。在 wMel 感染的囊肿中，Orb 的卵母细胞特异性表达是稳健的，即使在那些发育异常的囊肿中（例如，图 5M–5M' 中的双卵母细胞）。这些结果表明，wMel 挽救了卵母细胞特异性的 Orb 翻译，增强或复制了 Mei-P26 在 Orb 翻译抑制中的功能。

OreR 野生型宿主生育力受到 wMel 感染的有益影响

与 wMel 挽救包含一系列功能的基本种系维持基因的部分或完全丧失的能力一致，我们发现这种细胞内共生体可以增强 D 的生育能力。黑腹果蝇种群显示出完全的野生型繁殖力（图1C和S8A-S8C和S4-S6表）。我们独立分析了产卵、卵孵化和总体后代生产率，以检测 wMel 对生育力多个组成部分的影响。与未感染的雌性相比，wMel感染的nos：Gal4 / CyO雌性每天每只雌性的总后代产量增加了49%（27（未感染）与40（感染）后代/雌性/天，p< = 2.2e-3Wilcoxon秩和检验，S8A图和S4表）。感染wMel使nos：Gal4/CyO平衡种群的每只雌性每天产卵数增加了49%（42个卵 vs 28个卵/雌性/天，p< = 2.2e-3 Wilcoxon秩和检验，S8B图和S5表），但对其他具有野生型生育力的基因型的产卵率没有任何可检测的影响。胚胎发生后，wMel 感染使 OreR 和 nos：Gal4/CyO 野生型卵孵化成 L1 期幼虫的速率分别提高了 5.2% 和 2.5%（88% 和 91%（感染）与 83% 和 89%（未感染）孵化的卵，p< = 1e-4 至 2.1e-3 Wilcoxon 秩和检验，图 1C 和 S8C 和 S6 表）。这些结果表明，wMel 感染的有益影响是显而易见的，但在 D 之间却存在差异。具有野生型生育力的黑腹果蝇种群。

我们测量了 OreR 在其整个生命周期（约 50 天）中的生育力，发现相对于未感染的果蝇，wMel 可能产生更高的终生繁殖力（图 6A-6C 和 S7 表）。OreR雌性按照图6A-6C的x轴指示年龄，并与感染状态匹配的3至7日龄雄配。w随着果蝇年龄的增长，Mel感染保持较高的OreR卵孵化率（p< = 7.1e-9 Kolmogorov-Smirnov测试，图6C和S7表），同时保持与未感染果蝇相似的产蛋水平（图6B和S7表）。这最终导致受感染的果蝇相对于未受感染的果蝇可能产生过量的后代的年龄范围（参见果蝇大约20至30天龄时的回归置信区间之间的差距，图6A）。感染引起的孵化率升高给宿主带来的效率提升可能会累积起来，以获得更高的终生健康，因为资源可以更有效地转化为后代。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 6. 沃尔巴克氏体的 wMel 菌株增强了 OreR 野生型生育力。

（空调）D. melanogaster OreR 繁殖力与女性年龄的关系，与局部多项式回归拟合（深灰色边界 = 95% 置信区间）。wMel 感染可能通过持续提高 （C） 孵化率，在宿主生命周期的时间点提高 （A） 后代和 （B） 卵子后代的产量。（D-F'）D的共聚焦平均投影。黑腹肌 （D–D'） 感染和 （E-E'） 未感染的幼乳和 （F–F'） 感染的卵巢。细胞内 wMel FtsZ 定位于种系 （Vas+，用黄色虚线勾勒）和体细胞 （Vas-） 细胞，在感染的 OreR 野生型果蝇中以高滴度，在未感染的果蝇中具有低背景。GSC（*靠近Hts结合光谱体）中的细菌用箭头表示。荧光通道按顺序采样并叠加，如每组图像所示：青色 = 抗 Hts，黄色 = 抗 Vas，蓝色 = 抗 FtsZ，红色 = PI。比例尺 F–G = 10 μm，H = 50 μm。这个数字背后的数据可以在 S3 表和 doi.org/10.7291/D1DT2C 的 Dryad 上找到。GSC，生殖系干细胞;俄勒冈州R;PI， 碘化丙啶。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g006

抗 FtsZ 的免疫染色证实，wMel 在 OreR 野生型天瑕疱中表现出高滴度，并在早期囊肿的卵母细胞中浓缩（图 6D–6F'）。细胞内细菌连续位于种系中，从GSC开始，一直持续到胚胎发生和受精结束。因此，wMel在正确的时间位于正确的位置，通过与GSC和卵母细胞囊肿的相互作用来增强女性宿主的生育能力，并纠正由男性CI相关改变引起的扰动[64]。

沃尔巴克氏体的 wMel 菌株在其原生 D.黑腹肌宿主的CI较弱，随着年龄的增长而降低（S9A–S9D图），表明CI机制维持率低[8]。将感染 wMel 的 OreR 雄性与感染的 OreR 雌性（“救援杂交”）和未感染的 OreR 处女雌性（“CI 杂交”）交配后发现，当雄性 0 至 1 日龄时，wMel 将未感染的卵孵化减少 26%（p< = 4.6e-4 Wilcoxon 秩和检验，S9A 图和 S6 表），但这种中等效应在雄性 5 天大时被消除， 平均（S9C 图和 S6 表）。只有年轻的雄性显着影响后代的产生（p< = 1.7E-2 Wilcoxon 秩和检验，S9B 和 S9D 图和 S4 表）。相比之下，自然感染模拟果蝇（Riv84系）并诱导强CI的Wolbachia wRi菌株[10,65]，当雄性0-1日龄时，未感染的卵孵化率降低了95%（p<=5.6e-8 Wilcoxon秩和检验，S9E图和S6表），并且在5天时仅失去部分功效（孵化减少75%， p< = 3.6e-4，Wilcoxon 秩和检验;S9G图，S6表）。这显着影响了整体后代产量（p< = 6.5E-7 和 5.0E-2 Wilcoxon 秩和检验，S9F 和 S9H 图 和 S4 表）。CI 后代的祖母 3 至 7 日龄（即相对较年轻），导致 D 的 CI 较弱。黑腹果蝇杂交[17]。总体而言，这些结果表明，wMel 有益的生殖操作可能比其在自然界中的负面生殖操作更能影响其适应性。

wMel介导的mei-P26[1]挽救可以通过挽救和扰乱宿主转录来实现

通过双真核和细菌RNA测序（dual-RNAseq）探索w Mel对OreR和mei-P26[1]卵巢中宿主基因表达的影响，发现感染以多种方式显着改变宿主基因表达（图7A-7C和S16-S19表），这表明wMel介导的生育挽救的一些潜在机制。在 D 的 35,344 份成绩单中。黑腹果蝇基因组，10,720 个在每个基因型 + 感染组的 6 个样本中至少 5 个样本中以足够高的水平表达，以纳入分析。在 wMel 基因组的 1,286 个基因中，有 663 个在 D 中表达。黑腹肌卵巢（图7D和S20表）。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 7. wMel 和 D 的差异表达分析。来自宿主卵巢的黑腹果蝇基因揭示了 mei-P26 敲低和感染影响全球表达模式。

（A-D）在每个面板中进行的测试中，基因表达的 log2 倍变化与 log10-FDR 调整 p 值 （padj） 的火山图。（E-K）（E） padj 和 （F–K） D 的 3 个顶级基因型相关 （~G） Wald 测试命中的归一化转录本计数图。黑腹果蝇基因与感染 （~I） 显著相关 （padj< = 1e-3） 或基因型和感染 （~G*I） 共同相关，按差异表达模式组织。参见 S10–S15 图，了解其他有效和不显著的计数图。在所有条形图中，深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。俄勒冈州俄勒冈州 R.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g007

未感染和wMel感染的亚态性mei-P26[1]卵巢相对于OreR卵巢（S2B和S2D图）表现出5倍的mei-P26表达减少，并且由于FDR校正后mei-P26[1]等位基因的1,044个其他基因显着失调（Wald检验FDR调整的p值（padj）< = 0.05，图7A，7E和S10A和S17表).由于 mei-P26 的丢失和功能障碍导致的基因表达变化远远超过并超过感染引起的基因表达变化，在任一 D 中。黑腹果蝇基因型，并强调 MEI-P26 作为基因表达的全局调节因子的重要性。这个数字远远超过了被认为参与GSC自我更新的366个基因[66]，强调了mei-P26参与了从种系分化[50]到体细胞发育[61]的多个过程。在生物过程、细胞成分和分子功能GO类别中，mei-P26的缺失影响了染色质、重组、蛋白质-蛋白质相互作用和肌肉细胞分化的过程（S10B–S10G图），支持mei-P26在遗传抑制、分化和减数分裂中的已知作用[38,40,50]。

感染 wMel 显着改变数百个 D 的表达。黑腹果蝇基因，以恢复或补偿 mei-P26 调节的基因表达。我们在完整模型下测试了与 DESeq2 感染状态显着相关的基因：~基因型 + 感染 + 感染*基因型，揭示了 422 个显着差异表达的基因（Wald 检验 padj< = 0.05，图 7B 和 S18 表）。检测感染与基因型之间相互作用的影响，产生了另外 20 个显着差异表达的基因 （Wald test padj< = 0.05;图7C和S19表）。最显着的差异表达基因如图7F-7K所示，其他重要基因如图8、S11和S12所示。分箱基因表达模式显示，wMel感染诱导突变卵巢中至少有6种主要的挽救基因表达表型：完全挽救、过冲、下冲、野生型效应、反向效应和新奇（图7F–7K、8A、8C、S11A、S11B、S12A和S12B）。在“完全抢救”表型（图7F和S11A）中，mei-P26[1] wMel基因表达与OreR水平难以区分，与未感染的mei-P26[1]水平显着不同。“超调”表型（图7G）的表达与未感染的mei-P26[1]敲低效应相对于OreR表达的方向明显相反。相反，“下冲”表型（图7H）是对mei-P26[1] wMel卵巢中OreR表达的部分校正。一种“野生型效应”基因，即内质网和高尔基体细胞骨架膜锚定蛋白，仅在 wMel 感染和未感染的 OreR 卵巢之间表现出差异表达（图 7I）。五个基因表现出“反向”差异表达表型，例如钠同向转运蛋白（图7J）和转录因子Chronophage（S12A图），其中mei-P26[1]和OreR卵巢相对于未感染的基因型表现出相反的差异表达变化。总共只有这6个“野生型效应”和“反向”基因在OreR卵巢中因感染而差异表达。最后，“新”基因（图7K）是那些仅在wMel感染的mei-P26[1]卵巢中表现出差异表达的基因，表明这是一种新的挽救或补偿途径。例如，在感染和未感染的mei-P26[1]卵巢中，过表达2（sordd2）泛素连接酶mRNA表达时抑制视网膜变性疾病1的抑制，而没有挽救（图7E）。SKP1相关C（skpC）是SCF泛素连接酶的下调成分之一（图7K），它可能补偿了sordd2的上调。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 8. 文献中预测的Mei-P26相互作用得到了卵巢双RNAseq结果的支持。

（甲、乙）预测 mei-P26 （A） 蛋白质和 mRNA 物理相互作用和 （B） 遗传相互作用。基因名称附近的符号表示显著的 DE 相互作用：* = 基因型显著性;r = 感染显著性，表示挽救表型;_ = 仅通过未校正的 p 值得出显著性。A中的红色“X”表示在我们的数据集中未表达的基因（CG6304和mir-137）。（C） 用 A 和 B 中的符号指定的基因的归一化转录本计数图。在所有条形图中，深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。（D） 87 （~G*I） DE 基因的细胞成分 GO 项揭示了早期种系细胞骨架结构和膜蛋白的富集。括号中给出了列出的 padj 和 p 值的 Wald 检验关联，如图 7 所示：基因型 （~G）、感染 （~I）、基因型*感染 （~G*I）。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。俄勒冈州俄勒冈州 R.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g008

与感染相关的GO术语以及感染与基因型之间的相互作用（图S11C-S11G、S12C-S12G和8D）与wMel已知的与宿主肌动蛋白[67]、微管、运动蛋白[68-70]、膜相关蛋白[71]和染色质[72]结合的能力一致].感染相关基因在GO术语中富集，表明细胞骨架发育功能与染色质相互作用（S11C-S11G图）。在生物过程、细胞区室和分子功能类别中，基因在表明与肌动蛋白、肌球蛋白、收缩纤维和肌肉细胞分化的相互作用方面得到了丰富。染色质相互作用通过与凝聚素复合物、着丝粒和有丝分裂染色体的结合来指示。除了质膜/细胞连接相关术语（如细胞连接和突触结构维持、细胞皮层以及脂质和钙调蛋白结合）外，基因型感染相互作用相关基因还富集了细胞骨架和染色质相互作用 GO 术语（S12C–S12G 图）。

有趣的是，2种绒毛膜蛋白（图7F）、一种蜕皮类固醇22激酶相关蛋白（S11A图）和一种雌激素相关受体（ERR）（S12A图）可能参与绒毛膜的形成[73]。考虑到我们发现mei-P26[1]胚胎在用漂白剂处理时比OreR野生型胚胎具有更弱的冠状体，这一发现表明mei-P26具有新的绒毛膜相关功能，并且wMel具有新的挽救表型。

在对 p 值进行 FDR 校正后，663 个转录的 w Mel 基因在 OreR 和 mei-P26[1] 宿主基因型之间均未显著差异表达（图 7D、S13 和 S14 和 S20 表），表明 wMel 组成型表达基因对宿主的调控。平均而言，wMel 转录组的测序深度为 7.8 至 42.4×覆盖深度和 D。黑腹肌转录组的测序范围为25.9至35.9×（S16表）。虽然这些覆盖范围重叠，但检测到的 663 wMel 基因仅跨越了 -1.5 倍的耗竭到 1.3 倍的上调（S20 表）。相比之下，10,720 表示 D。黑腹果蝇基因的差异表达要高出一个数量级，耗竭 ?10.041 倍，上调 9.866 倍（S17–S19 表）。因此，与 D 相比，wMel 基因的差异转录较弱。黑腹果蝇基因，表明 wMel 可能通过组成型表达蛋白的下游影响来改变宿主表型。为了探索 wMel 表达的组成效应，我们测试了表达的转录组中 GO 通路富集（S13 图）。大量检测到 DNA 复制、蛋白表达、膜转运和异养（例如氧化磷酸化）的途径。虽然这些基因中有许多可能参与正常的细菌细胞维持和复制，但氧化磷酸化、翻译、转录和膜功能途径的显着富集（S13A图）表明，其中一些基因可能被用于宿主操作或处理宿主资源。

在1,044个显着差异调节的D.受mei-P26敲低和感染影响的黑腹肌基因是文献预测的6个基因（共24个），（padj<=0.05 Wald检验，9个基因（共24个）p值<=0.05;图8和S1以及S1和S2表）。 mei-P26 功能的丧失导致 oo18 RNA 结合蛋白 （orb）、gawky （gw）、性致死 （sxl）、良性性性细胞肿瘤 （bgcn）、肿瘤睾丸 （tut） 和矮脚鸡 （mir-ban） 的失调 （padj< = 0.05 Wald 检验，图 8A 和 8B 中的图 8C 和 *）。Bam、Pumilio （pum） 和 Justice Seizure （jus） 表达可能因敲低 mei-P26 而改变，但需要额外的样本来解析高感染方差（例如，mir-ban）和低差异表达变化（例如，gw）（p 值< = 0.05 Wald 检验，图 8C 和图 8A 和 8B 中的“*”）。6 个基因中有 2 个表现出具有“下冲”拯救表型（图 8A 和 8B 中的“r”）的 w Mel 拯救证据：bgcn 和 tut by padjust（图 8C）。如果我们考虑具有显着未调整 p 值的基因，gw 也可能表现出“下冲”拯救的证据（图 8C，图 8A 中的“r”）。矮脚鸡或mir-ban表达抑制也可以挽救，但wMel mei-P26[1]卵巢之间的高差异排除了该数据集的DE挽救检测（图8C）。相反，orb、sxl、bam 和 nos 转录水平不会因 mei-P26 敲低或 wMel 感染而改变，因此必须在转录后进行调节。总的来说，这些差异表达结果加强并扩展了我们对 wMel 如何在转录和转录后水平上挽救和加强宿主繁殖的理解。

讨论

沃尔巴克氏体的 wMel 菌株是一种成功且广泛的共生体：自然存在于 D 中。黑腹果蝇种群[19,20]，以及通过实验室产生的wMel反式感染到用于生物控制的非本地宿主[3]。然而，我们对塑造共生体和宿主如何共同进化并找到互利繁殖机制的过程知之甚少。在这项工作中，我们确认 wMel 的 CI 强度在 D 中通常较弱。黑腹果蝇，（图9A-9D，[14-18]），并表明wMel通过加强宿主GSC维持和配子分化对宿主生育能力有益（图1-8）。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 9. wMel 与重要宿主基因在早期 GSC 维持和种系囊肿形成中的相互作用模型。

（A） 在 mei-P26 突变体中，w Mel 通过各种机制恢复正常的 Bam、Sxl 和 Orb 表达，其中大多数机制是未知的（??? = 未知的 wMel 因子）。蛋白质和 mRNA 表达挽救与通过种系囊肿分化从 GSC 维持的细胞学挽救相关。（B） GSC 中的 Sxl 挽救是通过 TomO 与含有 nos mRNA 的 RNP 相互作用介导的，从而上调 Nos 翻译。后来，在囊肿卵子发生的第8阶段，发现TomO与球体mRNA结合，取代了翻译阻遏蛋白Cup，并上调了球体翻译[34,35]。A 中的虚线箭头表示 TomO 在早期囊肿分化中启用 Orb 去抑制的预测功能。在 mei-P26 突变体中恢复 mei-P26 对 Orb 翻译的抑制作用的因子尚未确定。GSC，生殖系干细胞;RNP，核糖核蛋白;TomO，卵子发生的毒性操纵剂。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g009

在这里，我们证明 w Mel 感染可以通过纠正受干扰的基因表达模式来增强 OreR 野生型和 mei-P26 突变体的宿主生育能力，并且我们揭示了 wMel 如何有益地影响宿主繁殖的长期谜团。此前，wMel 被证明可以挽救 Sxl [31] 和 Bam [32] 的部分损失，这是早期卵子发生 2 个截然不同阶段的 2 个基本基因：GSC 维持和 CB 分化以及 TA 有丝分裂。这些发现尚未解决 wMel 如何抑制这些机制和时间上不同的细胞过程，并表明 mei-P26 不参与 [31]。我们通过一系列等位基因和发育测定表明，wMel 感染可以挽救与突变 mei-P26 相关的缺陷，mei-P26 是 GSC 维持和分化所需的基因。wMel 感染可挽救 mei-P26 RNAi 敲低以及亚态和无效等位基因中卵子发生的所有阶段（图 1-5、7、8、S4-S7 和 S10-S12 和 S4-S15 和 S18 和 S19 表）。Mei-P26 是一种 TRIM-NHL 蛋白，通过 Nos mRNA 结合复合物、与 RNA 诱导的沉默复合物 （RISC） 相互作用和蛋白质泛素化进行 mRNA 翻译抑制来调节基因表达 [38,74]。重要的是，Mei-P26与GSC和CB中的Sxl以及CB和囊细胞中的Bam相互作用[36,50]。这些相互作用表明，wMel 用于挽救 mei-P26 功能的机制也可能负责挽救 Sxl 依赖性 GSC 维持和 CB 分化以及 Bam 依赖性囊肿分化方面。

在对 w Mel 介导的 GSC 维持和分化操作的深入分子和细胞分析中，我们发现 wMel 通过校正扰动的 pMad、Sxl、Bam 和 Orb 蛋白表达以及 bgcn 和 tut mRNA 表达来挽救 mei-P26 种系缺陷朝向 OreR 野生型水平（如图 9A 所示）。与野生型果蝇相比，w Mel感染部分挽救了GSC特异性pMad表达（图2A–2E），表明细菌从体细胞GSC生态位恢复了BMP信号传导[38]。发现这些细胞也能够分裂（图2F-2J），进一步支持它们的功能和干性。鉴于mei-P26可能参与果蝇Myc（dMyc）调控，并且dMyc的过表达诱导竞争性GSCs[75]，wMel的GSC挽救机制可能涉及dMyc上调。虽然，我们的转录组学数据表明 dMyc 在转录水平上没有被显着抑制（S15 图）。在离开生态位的生殖细胞中，wMel总结了pMad、Sxl和Bam表达的适当定时变化，这些变化通常受mei-P26的影响，并且在膀胱母细胞分化过程中形成16细胞生殖系囊肿[39,40,50,74]（图3,4和S7E–S7F）。虽然 bam 下调未被 wMel 完全挽救（图 4），但发现 wMel 感染的 mei-P26[1] germaria 中 tut mRNA 表达部分降低（图 8）表明，女性（如男性 [76]）中 Tut、Bam 和 Mei-P26 之间可能存在未报告的调节相互作用，这可以挽救 Bam 在生殖系囊肿发育晚期中的过度表达。

这是第一次发现 w Mel 可以挽救囊肿形成后的卵母细胞分化，这表明 wMel 在整个卵子发生过程中具有普遍的影响，可能会加强胚胎发生。我们通过在受感染的果蝇中发现较少的种系囊肿肿瘤，证实了 wMel 感染的 mei-P26[1] 卵巢中 Bam 表达挽救的下游后果（图 5A-5I）。相对于未感染的囊肿，这些种系囊肿似乎是功能性的，基于感染的mei-P26[1]囊肿中必需卵母细胞分化蛋白Orb的卵母细胞特异性表达（图5J-5R）。发现 w Mel 挽救卵巢组织中的 Cp16 和 Cp19 绒毛膜蛋白、tut、bgcn 和其他转录本表达（图 7F、8、S11 和 S12）进一步支持了 wMel 可以挽救 mei-P26 丢失的下游影响的结论。未来的工作需要探索过冲和新的DE类别如何减轻mei-P26的损失，这可能通过一些替代或补偿途径发生。除了前面讨论的泛素连接酶挽救机制外，离子型受体 76a （Ir76a） 或烟碱乙酰胆碱受体 α5 （nAChRα5） 表达的缺失（S10A 图）可以通过 wMel 感染的 mei-P26[1] 卵巢中作为受体或膜转运蛋白的 Wunen-2 脂质磷酸磷酸酶的新型上调来挽救（S12B 图）。像这样的功能可能是 w Mel 诱导的 OreR 胚胎发生发育弹性的基础，正如 wMel 感染的 OreR 果蝇的孵化率升高所证明的那样（图 1C 和 6C）。

wMel 菌株对 D 的救援。黑腹果蝇 mei-P26 可能独立于 Wolbachia TomO 蛋白。先前对TomO的研究表明，细菌蛋白的主要作用方式是通过破坏稳定的核糖核蛋白（RNP）复合物[35]（如图9B所示）。这就是TomO如何提高GSC中Nos的表达[34]，以及TomO如何抑制翻译阻遏蛋白Cup在卵子发生中期（第8阶段）抑制Orb翻译[35\u201277]。相比之下，Mei-P26与Ago1 RISC相互作用，通过结合orb ′3-UTR miRNA结合位点来抑制Orb翻译[38]。尽管 Mei-P26 和 TomO 对 Orb 表达产生相反的结果，并且 TomO 在 mei-P26[1] 卵巢中没有显着上调（S14C 图），但如果 w Mel 产生其他调节相互作用的因子，TomO-orb 结合可能是 wMel 挽救 Orb 抑制能力的基础。或者，wMel 可以制造另一种 RNA 结合蛋白。鉴于 Sxl 也被 Bruno [78] 通过 sxl 3′-UTR 抑制，这种蛋白质可能参与恢复 mei-P26 突变体的 Sxl 调节。wMel 感染在 mRNA 水平上均未挽救 orb 和 sxl 表达（图 8C），这进一步支持了翻译或蛋白质相互作用/修饰水平的挽救。

除了TomO之外，其他细菌因子必须参与增强野生型果蝇和生育突变体的宿主繁殖力。首先，Mei-P26 编码 3 个功能域，这些功能域赋予至少 3 种不同的功能机制来调节基因表达（mRNA 结合、miRNA 介导和泛素化）。在细菌基因组中，这些结构域/功能可能由1种以上的蛋白质编码[79]。其次，TomO通过结合nos mRNA来挽救Sxl的GSC维持功能，增加Nos翻译水平，但不能完全挽救Sxl的损失[34]。在GSC分裂产生CB后，Sxl立即与Bam、Mei-P26、Bgcn和Wh相互作用以抑制Nos翻译[36,74]。因此，抑制Nos翻译的wMel因子，抵消TomO通过RNA结合破坏Nos翻译阻遏蛋白稳定的功能[34,35]仍有待确定。此外，Nos上调不能解释Bam的挽救，因为在TA有丝分裂期间，Nos和Bam表现出相互的表达模式[36]。第三，w Mel感染诱导的nos：Gal4驱动的Mei-P26过表达诱导的肿瘤表型恶化（图5I）表明，wMel合成了一种直接模仿Mei-P26分化功能的蛋白质，可以达到抗形态水平。mei-P26样因子的表达失调可以解释为什么wMel感染的mei-P26 RNAi雌性比OreR野生型果蝇产生更多的卵和后代（图1A和1B）。虽然 TomO 可以概括 Mei-P26 的一些功能，例如球体结合，但至少还需要一个其他因素来概括正确的 Orb、Nos 和 Bam 调节。

了解沃尔巴克氏体如何在分子水平上与宿主发育相互作用，对于在新型宿主中部署这些细菌并依靠垂直传播在宿主种群中维持它们至关重要。CI是控制宿主种群[80]和驱动沃尔巴克氏体高感染频率的有力工具[3]。宿主GSC中细菌生殖操纵器的持续存在为代偿性发育功能的进化提供了机会，类似于我们对mei-P26所展示的。虽然尚不清楚是否有任何天然存在的mei-P26等位基因[32,81]赋予了沃尔巴克氏体的存在所弥补的功能丧失，但从理论上讲，发育基因的自然变异可能为wMel进化其有益的生殖功能提供了选择压力。鉴于如果实现对宿主生育力的相互冲突的有益影响，选择将有利于CI的丧失[8]，因此我们必须了解有益生殖操作（如生育力增强）的潜在机制。

材料和方法

Russell及其同事沃尔巴克氏体内共生体操纵GSC自我更新和分化，以提高宿主生育能力

候选基因选择

利用对wMel拯救基本维持和分化基因的能力的了解[31,32]，以及这些基因之间蛋白质-蛋白质和蛋白质-mRNA相互作用的经验数据（图S1A-S1D和图8中的esyN [82]网络;S1表中的参考文献）以及宿主基因与wMel滴度[37]之间的相互作用数据，我们确定了基本的种系翻译调节因子减数分裂P26（mei-P26）作为细菌影响GSC维持和分化途径的潜在靶标（S1A和S1B图）。在未感染的果蝇中，mei-P26的缺失通过抑制GSC维持、减数分裂以及生殖系囊肿增殖和分化的转变而产生轻度至重度的生育缺陷[38\u201240]。

果蝇种群和遗传杂交

根据布卢明顿果蝇库存中心（BDSC）玉米粉食品配方（又名“白色食品”，见 https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html）准备的白色食物上饲养苍蝇。沃尔巴克氏体的wMel菌株先前已杂交到2 D中。黑腹蝇，一种携带标记物和染色体平衡器w[1];sp/cyo;Sb/TM6B、Hu等携带种系双驱动：P{GAL4-Nos.NGT}40;P{GAL4：：VP16-Nos.UTR}MVD1.这些受感染的双平衡和卵巢驱动原液用于将 wMel 杂交到标记和平衡的 FM7cB 中;;;sv[spa-pol]、无效/亚态突变体和UAS RNAi TRiP系，以确保所有测试的wMel都具有相同的遗传背景。D.从印第安纳大学的BDSC获得的黑腹果神经株是：Oregon-R-C （#2），w1118;P{UASp-mei-P26.N}2.1 （#25771）， y[1] w[*] P{w[+mC] = lacW}mei-P26-1 mei-P26[1]/C（1）DX， y[1] f[1]/Dp（1;Y）y[+];SV[SPA-POL] （#25716）， y[1] w[1] mei-P26[mfs1];Dp（1;4）A17/sv[spa-pol] （#25919）， y[1] sc[*] v[1] sev[21];P{y[+t7.7] v[+t1.8] = TRiP.GL01124}attP40 （#36855）。我们从吉庆大学医学院的Manabu Ote获得了UASp-mRFP/CyO（1-7M）系。感染Riv84菌株并用四环素治愈的果蝇模拟果蝇来自Sullivan Lab种群[83,84]。所有苍蝇种群和杂交在室温或25°C下保持在白色食物（BDSC玉米面食物）上，因为宿主食物的糖/蛋白质组成会影响沃尔巴克氏菌滴度[84]。

野生型生育种群：通过将俄勒冈-R-C的雄性与基因型w的配对感染和未感染的平衡种群的遗传和未感染的平衡种群杂交，制备出配对的wMel感染（OreR_wMelDB）和未感染的俄勒冈R（OreR_uninf）种群[1];CyO/Sp;Hu/Sb.确保这 2 D 之间没有差异。在平衡杂交期间或随后，我们将OreR_wMelDB种群的雄性与OreR_uninf种群的雌性回交 10 代，并重复产卵和孵化试验 （F10_OreR_uninf）。如上所述，通过与配对的感染和未感染的平衡种群杂交来配对感染和未感染的nosGal4 / CyO和nosGal4 / Sb果蝇。

本文和之前研究的mei-P26等位基因（例如[31]）的基因组和表型后果已经得到表征[40]。亚态 mei-P26[1] 等位基因是通过在 mei-P26 的第一个内含子中插入一个 P{lacW} 转座子而产生的，该内含子编码 RING 结构域。Starr 和 Cline 在 2002 年测试的几乎无效的 mei-P26[fs1] 等位基因是由 mei-P26[1] 第一次插入中的第二次 P{lacW} 插入产生的。通过删除 mei-P26[1] 的 P{lacW} 插入以及大约 2.5 kb 的侧翼序列，产生了完全（雄性和雌性）无效的 mei-P26[mfs1] 等位基因。根据Page及其同事（2000）的说法，这3个等位基因形成一个系列，严重程度越来越高：mei-P26[1]

繁殖杂交

概述。

SLR在2020年10月至2022年1月期间连续进行了3,002次繁殖杂交，根据其结束日期分批进行（表1）。持续保持感染和未感染的OreR系，以（1）控制CI男性祖母的年龄;（2） 定期使用 OreR 原始体进行 mei-P26 和 CI 繁殖力测定;（3）收集WT雌性并进行老年生育力测定;（4）从mei-P26生育突变体中获得大样本量。完整的繁殖力数据集包含在 S2 表中，并绘制在 S3 图中。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

表 1. 繁殖力跨基因型、性别、年龄和对照杂交。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.t001

交叉条件。

食品（布卢明顿白食品配方的小瓶）、产蛋培养基（葡萄食品）和孵化条件每月在内部大批量制作。葡萄勺：将大约 1.5 mL 葡萄琼脂培养基（1.2× Welch's 葡萄汁浓缩物，含有 3% w/v 琼脂和 0.05% w/v tegosept/对羟基苯甲酸甲酯，首先以 5% w/v 溶解在乙醇中）分装到小勺中，使其硬化，并在 4°C 下储存直至使用。在十字架使用之前，我们在每个勺子的表面添加了磨碎的酵母。

为繁殖杂交准备苍蝇。

对 4 个 mei-P26 突变体 （RNAi、[mfs1]、[1]、[mfs1/1]）平行进行配对的 wMel 感染和未感染的基因杂交，以产生两种感染状态的纯合处女雌性进行平行繁殖杂交。在 14 个月内进行了多次（3 次或更多次）突变基因杂交，以产生来自许多不同亲本和交配的纯合子。CI 杂交是与 3 至 7 日龄受感染祖母的雄性进行的。雄性年龄为0（当天收集）或5天，具体取决于杂交。我们在多天内从小瓶中收集雄性，因此大多数雄性不是第一个出现的。

将收集用于繁殖杂交的原始雌性果蝇转移到新鲜食物中，并在室温下平均陈化 5 天（从 3 到 7），或更长时间的陈化 OreR、mei-P26 RNAi 和 mei-P26[1] 繁殖杂交。雄蝇和处女雌蝇分开储存，雄蝇的年龄为0或3至7天。长期年迈的处女女性被作为一小群饲养在新鲜的白色食物瓶中。每隔几天，检查小瓶是否有霉菌，苍蝇就会转移到新鲜食物上。

繁殖跨协议。

在每个十字架的第一天下午，1只雄性和1只雌性苍蝇被击倒在CO2垫子，加入装有葡萄勺的小瓶中，使其恢复，然后以 12 个光/暗循环转移到 25°C 恒湿培养箱中，以便求偶和交配。第二天，用新勺子替换每个勺子，并将小瓶放回 25°C 进行更多交配。第三天，我们从小瓶中取出苍蝇，计算勺子葡萄培养基上产卵的数量，并在25°C下更换小瓶中的勺子2天。大约40小时后，我们计算孵化和未孵化的鸡蛋的数量。记录了所有交叉中所有步骤的确切时间和日期（S2表）并绘制以显示整个时间范围内一致的结果（S3图）。

繁殖力交叉分析。

使用perl脚本解析繁殖力数据，并在R中绘制，单个杂交被视为离散样本。孵化率是根据产下 20 个或更多种蛋（对于 3 至 7 日龄雌性地块）和 10 个或更多种蛋（对于年龄与孵化率地块）的样品计算得出的。产蛋率和后代生产率是根据原始计数除以产蛋天数的分数计算得出的（S2表中的元数据）。与0产卵（和后代）的杂交没有被排斥，因为生育突变体通常产0到很少的卵。我们的交叉条件高度一致，并且每天运行，为这些零产卵/后代样品提供了信心（S3图）。果蝇繁殖力与雌性年龄数据使用stat_smooth黄土方法（公式 y~x）在 R 中拟合，置信区间为 0.95。

非分离检测

我们将带有黄色突变的 mei-P26[1] 等位基因 （y[1] w[*] mei-P26[1];;; sv[spa-pol]） 的雌性纯合子放入小瓶中，雄性携带与 Y 染色体融合的野生型黄色等位基因 （y[1] w[1] / Dp（1;Y）y+）。我们制作了 7 或 8 瓶 1 至 10 只雌性，分别与计数匹配的 1 至 10 只雄配，用于感染和未感染的 mei-P26 亚态型。闭合后，我们通过存在黄色雄性 （XO） 和正常颜色的雌性 （XXY） 来筛选后代的非分离性。计算不分离率 （NDJ） 以解释不可存活的后代（XXX 和 YO），公式为 NDJ rate = 2 *NDJ 后代/所有后代 = （2XXY + 2X0）/（XX+XY+2XXY+2X0），如 [41]。

卵巢固定和免疫细胞化学

在一天或两天或关闭期间，苍蝇被转移到新鲜食物中，并按照文本所示陈化 3 至 7 天或更长时间。对于长期老化实验，每周将苍蝇转移到新鲜食物中，每隔几天检查一次霉菌。我们在 1× PBS 中解剖了来自每个杂交的大约 10 只苍蝇的卵巢，并用针分离卵巢。将卵巢固定在600μl庚烷与200μl脱甲醛溶液（50%v / v多聚甲醛和0.5%v / v NP40在1×PBS中混合）中，强烈搅拌，并在室温下旋转20分钟。然后将卵母细胞在 PBS-T（1% Triton X-100 在 1× PBS 中）中洗涤 5×，并在室温下用 RNAse A （10 mg/ml） 处理过夜。

在 PBS-T 中洗涤 6 次后，我们在室温下将卵母细胞在 PBS-T 中的 1% 牛血清白蛋白中封闭 1 小时，然后将卵母细胞在 4°C 下在 PBS-T 中稀释的一抗中孵育过夜（抗体和稀释度如下）。第二天，我们在 PBS-T 中洗涤卵母细胞 6 次，并将它们在 4°C 下在 PBS-T 中以 1：500 稀释的二抗中孵育过夜。 在最后一天，我们在 PBS-T 中洗涤卵母细胞 6 次，并在 4°C 下在 PI 封固培养基（20 μg/ml PI （Invitrogen #P1304MP）的 70% 甘油和 1× PBS 中孵育 2 晚。 用透明培养基代替覆盖的PI培养基，并将卵母细胞安装在载玻片上。载玻片立即储存在?20°C下，并在一个月内成像。感染和未感染以及实验和对照样品并行处理，以尽量减少批次效应。配对的wMel感染和未感染的OreR储备液被用作野生型对照。

Primary monoclonal antibodies from the Developmental Studies Hybridoma Bank (University of Iowa) were used at the following dilutions in PBS-T: anti-Hts 1:20 (1B1) [45], anti-Vas 1:50 [44], anti-Orb 1:20 (4H8) [63], anti-Bam 1:5 [36], and anti-Sxl 1:10 (M18) [85]. Primary monoclonal antibodies from Cell Signaling Technology were used at the following dilutions: anti-Phospho-Smad1/5 (Ser463/465) (41D10) 1:300 (#9516S) and anti-Phospho-Histone H3 (Ser10) Antibody 1:200 (#9701S). Anti-Wolbachia FtsZ primary polyclonal antibodies were used at a 1:500 dilution (provided by Irene Newton). Secondary antibodies were obtained from Invitrogen: Alexa Fluor 405 Goat anti-Mouse (#A31553), Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit (#A12379), and Alexa Fluor 647 Goat anti-Rat (#A21247).

Confocal imaging

Oocytes were imaged on a Leica SP5 confocal microscope with a 63× objective. Optical sections were taken at the Nyquist value for the objective, every 0.38 μm, at variable magnifications, depending on the sample. Most germaria were imaged at 4× magnification and ovarioles and cysts were imaged at a 1.5× magnification. Approximately 10 μm (27 slices) were sampled from each germarium and 25 μm (65 slices) were sampled from each cyst for presentation and analysis.

PI was excited with the 514 and 543 nm lasers, and emission from 550 to 680 nm was collected. Alexa 405 was imaged with the 405 nm laser, and emission from 415 to 450 nm was collected. Alexa 488 was imaged with the 488 laser, and emission from 500 to 526 nm was collected. Alexa 647 was imaged with the 633 laser, and emission from 675 to 750 nm was collected.

Image analysis

Germaria and ovarioles were 3D reconstructed from mean projections of approximately 10 μm-thick nyquist-sampled confocal images (0.38 μm apart) in Fiji/ImageJ. Germline cyst developmental staging followed the standard conventions established by Spradling [86] and the criteria described below. We also scored and processed the confocal z-stacks for analysis as follows in the sections below.

GSC quantification.

GSC的得分是通过在体细胞生殖细胞生态位和末端细丝附近具有高细胞质体积的细胞中存在pMad和Hts标记的光谱体来评分[56]。当抗体相容性阻止 pMad 和 Hts 染色（例如，使用抗 pHH3 染色）时，仅使用一种用于 GSC 鉴定。光谱体与扩散体的区别在于其位于假定的 GSC 核前方，并且存在一个后扩散体，该扩散体继续进入后分裂的膀胱母细胞。我们将每个胚芽的 GSC 数量计算为 pMad 和 Hts 光谱体表达细胞的平均数量。GSC 的非完整增量表示假定的 GSC 表达一个属性而不表达另一个属性的情况。

有丝分裂 GSC 定量。

如上所述鉴定了推定的 GSC，并对抗 pHH3 染色的存在进行了评分。区域 1 中 pHH3 阳性囊细胞的数量也在整个 germaria 中进行了量化。

卵母细胞囊肿肿瘤定量。

使用 10× 的物镜，我们手动计数每个阶段 6 至 10b 囊肿中的护士细胞数量。每次计数一致地重复 3 次，囊肿被统计为每个囊肿的护士细胞少于 15、15 或超过 15 个。

通过荧光测量 Bam 和 Sxl 表达。

我们对斐济/ImageJ 中每个天瑕疣的 27 层奈奎斯特采样 z 堆栈求和。通过设置 ImageJ 测量荧光强度：面积、积分密度和平均灰度值。如[42]所示，使用Vas表达来指示种系。测量了三个具有代表性的背景选择进行减法。针对卵母细胞的每个区域计算校正后的总细胞荧光 （CTCF），如下所示：CTCF = 积分密度 - 所选细胞面积 * 背景读数的平均荧光。我们控制了香叶内的染色强度，并比较了香叶之间的相对值。

球体表达式。

在共聚焦 z 堆栈 ImageJ 中手动评分抗 Orb 染色的卵母细胞囊肿进行分期和 Orb 卵母细胞染色。

转录组学

我们收集了未感染和感染 wMel 和 wMel 感染的 nos：Gal4>UAS：mei-P26 RNAi 和 nos：Gal4/CyO 果蝇的 OreR 和亚态 mei-P26 果蝇，用于 RNAseq。苍蝇在关闭后被收集并转移到新鲜食物中，直到它们 3 到 5 天大。在 1× PBS 中进行卵巢解剖，每组 20 至 30 只苍蝇，为每个样品获得至少 10 mg 卵巢组织。在小心地去除所有非卵巢体细胞组织后，在室温下迅速将卵巢移至RNAlater，然后在30分钟内转移到-80°C进行储存。冷冻组织通过干冰运输到Genewiz Azenta Life Sciences进行RNA提取、cDNA合成、Illumina文库制备和Illumina测序。RNAi和对照样品（nos：Gal4>UAS：mei-P26 RNAi和nos：Gal4/CyO基因型）均使用T尾引物处理成cDNA，仅回收宿主转录本。使用随机六聚体将mei-P26[1]和OreR样品处理成cDNA，并用连续真核和细菌rRNA去除试剂盒（Qiagen FastSelect）去除核糖体序列。Illumina双索引文库由这些cDNA组成，测序为2×150 bp读长。

我们使用标准计算方法和自定义perl解析脚本处理和分析了RNAseq数据集的差异表达。简而言之，在解复用后，我们用Trimmomatic从RNAseq读段中修剪了接头片段[87]。为了生成站点覆盖率数据以直接检查读取比对，我们使用了STAR对准器[88]和samtools [89]，并在R中绘制了样本的读取深度。我们通过Kallisto的假比对来量化转录本[90]。参考转录组的选择是恢复最大比对数量的关键：我们合并了来自基因组（登录GCF_000008025.1）和D的wMel参考基因组CDS和RNA的NCBI RefSeq组装。来自基因组的黑腹肌参考基因组RNA（登录 GCF_000001215.4;Release_6_plus_ISO1_MT） 获得针对完整的、非冗余的宿主共生体转录组的比对。同时对两个基因组进行定位，以避免跨物种错误定位[91]。在Kallisto（0.45.1版）[90]中，该参考转录组的索引长度为31，并使用“kallisto quant”命令和默认参数将reads与该参考进行伪对齐。宿主和共生体具有不同的转录组分布[92]，因此在DESeq2中转录本归一化和定量之前，需要分离2个转录组[93]，我们使用自定义perl脚本执行。

我们导入了子集 D。melanogaster 和 wMel Kallisto 分别用 Tximport [94] 将转录组定量为 R 进行 DESeq2 分析 [93]。将转录水平丰度映射到基因 ID，以估计基因水平的归一化计数。对于每个转录组，我们通过要求至少 5 个样本的读取计数为 10 或更多来过滤掉样本中的低计数/覆盖基因。我们将实验组之间的相互作用建模为基因型、感染以及基因型与感染之间的相互作用（~基因型 + 感染 + 基因型*感染）的函数，并进行 Wald 检验以检测差异表达。简而言之，计算每个基因表达计数的最大似然基因模型系数，并除以其标准误差，以生成完整模型和简化模型下每个基因的 z 统计量。将这些 z 统计量与在标准正态分布下获得的值进行比较，以进行 p 值计算。对这些 p 值进行 FDR/Benjamini-Hochberg 校正以减少误报数量。使用 DESeq2 中的 plotCounts（） 函数输出每个基因的归一化计数，以便在 R 中绘图。

我们通过Flybase手动调查了Fly Cell Atlas项目[95]中每个测试的种系表达证据。从每个DESeq2 Wald测试返回的差异表达基因的GO类别，并使用ShinyGO0.77测试其与参考转录组ID集的显著性[96]。

本研究中产生的转录组学数据可通过 NCBI BioProject 编号 PRJNA1007602 获得。

绘图和统计分析

用非参数Wilcoxon秩和检验评估产蛋率、孵化率和后代产量的差异，分析繁殖力数据，并计算统计量。当由于非零样本太少（例如，无效等位基因）而无法做到这一点时，我们将产卵或未产卵的二项分布雌性分类组与Fisher's Exact检验进行了比较。所有样本数量、均值和 p 值都显示在 S2 表中。生育力被绘制在苍蝇年龄上，并用局部多项式回归拟合。用碱基R和蜂群[97]包制作单龄盆，用ggplot2 [98]包制作繁殖力与时间的关系图。

分析并绘制共聚焦显微照片荧光强度，并在R中计算统计量，将卵母细胞基因型之间的相对荧光强度与非参数Wilcoxon秩和检验进行比较。将 GSCs、有丝分裂 GSC、肿瘤种系囊肿和球体特异性囊肿的计数与 Fisher Exact 试验进行比较。用ggplot2 [98]包制作了绘图。

我们分析并绘制了 R. Bar 和 DESeq2 的双 RNAseq 结果，并使用 ggplot2 软件包 [98] 绘制散点图，并使用 EnhancedVolcano 软件包（版本 3.17）绘制火山图[99]。

支持信息

生殖系干细胞 （GSC） 维持和分化的关键遗传调节因子。黑腹果蝇卵子发生。

显示 1/35： pbio.3002335.s001.tif

跳到无花果共享导航

https://ndownloader.figstatic.com/files/42887463/preview/42887463/preview.jpg

1 / 35

下载

无花果分享

S1 图。 生殖系干细胞 （GSC） 维持和分化的关键遗传调节因子。黑腹果蝇卵子发生。

（A） GSC 生态位图，说明了 GSC 有丝分裂后膀胱母细胞表达转移的基因子集。（B）生殖系囊肿发育过程中蛋白质表达的相对水平模型。（C， D） （C） sxl 和 （D） bam 基因产物的 esyN 相互作用网络（S1 表中的支持参考文献）。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s001

（TIF）

S2 图。 果蝇mei-P26遗传资源和基因表达表征。

（A） mei-P26和所研究等位基因的基因组图谱和基因模型。在mei-P26[1]的第一个内含子中插入P{lacW}转座子会影响RING结构域。mei-P26[mfs1] 等位基因是通过删除该插入和插入位点两侧两侧的 0.7–1.6 kb DNA 产生的。（B， C） mei-P26 转录本覆盖率和 （D， E） Kallisto Kallisto 标准化转录本计数。来自 （B， D） mei-P26 的黑腹果蝇 mei-P26 转录本[1] 和 OreR w Mel 感染与未感染卵巢和 （C， E） nos：Gal4>UAS：meiP26RNAi vs. OreR wMel 感染卵巢。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s002

（TIF）

S3 图。 繁殖力数据采集图与时间的关系图。

（甲、乙）雌性mei-P26 RNAi，（C，D）雌性mei-P26[1]和（E，F）CI测定。（A、C、E）产卵率和（B、D、F）孵化率随时间推移、跨遗传杂交和繁殖杂交保持一致。在 y 轴值中添加了 0.1 因子作为偏移量，以查看零布局和零百分比剖面线数据点。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s003

（TIF）

S4 图。 感染 wMel 可挽救女性和男性的 mei-P26 功能。

（甲、乙）亚态性mei-P26[1]和（C，D）编号：Gal4>mei-P26RNAi D.黑腹果蝇雌性繁殖力与年龄的关系，与局部多项式回归拟合（深灰色边界 = 95% 置信区间）。感染 wMel 通过增加产卵数量和孵化卵的比例来提高雌性整个生命周期的后代产量。（E-G）雄性mei-P26抢救：在RNAi、亚态性和null mei-P26[1]敲除雄性果蝇与相同年龄和感染状态的野生型雌配中，Mel感染产生的（D）总后代产生率显著提高，破碎为（F）产卵和（F）卵孵化。Wilcoxon 秩和 * = p < 0.05， ** = 0.01， **** = 1e-4。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。（H，I）纯合子亚态性 mei-P26[1] 原液 （H） 感染 wMel Wolbachia 或 （I） 未感染。由于胚胎和幼虫死亡，霉菌生长（绿色食品与棕褐色/棕色食品）在未感染的种群中不受抑制，它们既会滋养霉菌，又无法阻止霉菌。感染使种群保持稳定、稳健，因为幼虫的产生超过了霉菌的生长。两只股票同时开始（见标签上的12/28）。受 wMel 感染的原液从不需要添加任何成虫，而未感染的原液产生的后代太少，必须在每次小瓶翻转时补充，以保持原液人工运行。几个月后，我们结束了这项工作，未受感染的库存完全消失了。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s004

（TIFF格式）

S5 图。 亚态性mei-P26[1]卵泡和germaria表现出一系列（A-I）wMel感染和（J-R）未感染的表型。

红色 = PI DNA 染色，黄色 = 抗输精管染色，青色 = 抗 Hts 染色。比例尺 A、D、G、H、I、J–L、N、O、Q、R = 50 μm;B、C、E、F、M、P = 25 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s005

（TIF）

S6 图。 wMel 感染并不能挽救 mei-P26 在减数分裂中的功能。

（A）包含X染色体不分离实验数据的表格。（B） 每个实验中 X 染色体不分离 （NDJ） 速率的蜂群箱线图。感染和未感染的mei-P26[1]女性之间没有显著差异。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s006

（TIF）

S7 图。 GSC维持和种系分化被 w Mel 感染挽救。

（甲、乙）D的共聚焦平均投影。黑腹果蝇 germaria 染色有针对 Hts 和 pMad 的抗体。mei-P26 的 RNAi 敲低不影响 GSC 的维持（图 2E）。（C） 10 至 13 日龄雌性每个生殖器中 GSC 数量的小提琴图。由于功能齐全的 GSC 表达 pMad 并具有 Hts 标记的光谱体，因此每个光谱体的权重减半并允许部分分数。Wilcoxon 秩和 * = p < 0.05，** = 0.01。（D） F-K） 通过 pH3 表达检测到的每个日耳胶有丝分裂囊细胞数量的小提琴图。（英、女）按区域划分的整个天疽细菌中总 （E） Sxl 和 （F） Bam 荧光表达水平的条形散射图。（G） 生殖系囊肿中卵母细胞特异性球体染色的 1D 条形图，分布在囊肿发育阶段。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s007

（TIF）

S8 图。 沃尔巴克氏体的 wMel 菌株是宿主繁殖的有益操纵者。

（空调）蜂群箱线图显示 wMel 感染会升高野生型 D。黑腹果蝇相对于相同基因型的未感染苍蝇的生育能力。（A）总后代产量，（B）产蛋量和（C）蛋孵化在不同的“野生型”基因型中受到不同程度的影响。（D） D.每只雌性每天产下的黑腹果蝇卵与雌性年龄的关系图，拟合局部多项式回归（深灰色边界 = 95% 置信区间）。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s008

（TIF）

S9 图。 果蝇-沃尔巴克氏体关联的细胞质不相容性 （CI） 强度不同，并随着男性年龄的增长而减弱。

（A-D）蜂群箱形图的（A，C）卵孵化率和（B，D）未感染和w梅尔感染D的后代产量。黑腹果蝇OreR 雌性与 （A， B） 零日龄和 （C， D） 5 日龄 wMel 感染雄配。（E-H）未感染和wRi感染的D的（E，G）卵孵化率和（F，G）后代产量的蜂群箱形图。模拟雌性与（A，B）零日龄和（C，D）5日龄wRi感染雄配。Wilcoxon 秩和 * = p < 0.05， ** = 0.01， *** = 0.001， **** = 1e-4.这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s009

（TIF）

S10 图。 黑腹果蝇基因因基因型而显著差异表达（Wald 检验 ~G vs. ~G+I+G*I）表明，mei-P26 是许多基因调控所必需的。

（A） D的Kallisto标准化转录本计数。黑腹果蝇基因（前 15 个命中（包括图 7E）padj< = 2。0E-30;其他图见图7和S2）。条形图按组着色：深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。 （B–G） MEI-P26 相关 DE 基因的 GO 分析揭示了涉及染色质、重组、蛋白质-蛋白质相互作用和肌肉细胞分化的过程的富集。（B，E）生物过程，（C，F）细胞成分和（D，G）分子功能类别的GO富集（B-D）类别图和（E-G）项相互作用网络。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s010

（TIF）

S11 图例. 由于感染状态（Wald 检验 ~I 与 ~G+I+G*I）显着差异表达的黑腹果蝇基因揭示了挽救事件的富集，其中 wMel 感染的 mei-P26[1] 卵巢表现出 OreR 表达水平。

（甲、乙）Kallisto 对 D 的转录本计数进行了标准化。黑腹肌基因表现出 （A） 拯救和 （B） OreR 表达水平过调 （padj< = 0.002;其他图见图 7）。条形图按组着色：深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。 感染DE基因的GO分析揭示了丰富的细胞骨架和染色质成分。GO 富集 （C–E） 类别图和 （F， G） 项相互作用网络，用于 （C， F） 生物过程、（D， G） 细胞成分和 （E） 分子功能类别（单个项无网络）。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s011

（TIF）

S12 图。 由于基因型关节感染状态（Wald 检验 ~G*I 与 ~G+I+G*I）显着差异表达的黑腹果蝇基因揭示了逆转性 DEG 的富集，其中 wMel 感染的卵巢对 mei-P26[1] 和 OreR 卵巢表现出相反的 DE 模式。

（空调）Kallisto 对 D 的转录本计数进行了标准化。黑腹果蝇基因表现出 （A） 逆向、（B） 下冲和 （C） OreR 表达水平的新调控 （padj< = 0.02;其他图见图 7）。条形图按组着色：深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。 感染DE基因的（D-G）GO分析揭示了细胞骨架和膜因子。GO富集（C-E）类别图和（F，G）项相互作用网络，用于（C，G）生物过程，（D）细胞成分（见图8D网络）和（E，F）分子功能类别。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s012

（TIF）

S13 图。 wMel 沃尔巴克氏体转录组差异表达 所有表达基因的 GO 类别揭示了细胞维持、中枢代谢和膜相关过程。

GO富集（A）类别图，（B）分层聚类树，（C）项交互网络生物过程类别。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s013

（TIFF格式）

S14 图。 Kallisto 对 wMel Wolbachia （A， B） 差异表达候选基因（有待更深入的采样）和 （C） 文献中感兴趣的基因的转录本计数进行了标准化。

条形图按组着色：深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。 Wald 检验基因型关联 p 值和校正 p 值 （padj）。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s014

（TIF）

S15 图例. 基本 D 子集的不显着 Kallisto 标准化转录本计数。根据已知的与 mei-P26、sxl、bam 或种质形成（卵子发生的中期 9）的相互作用，从文献中选择的黑腹果蝇卵子发生基因。

条形图按组着色：深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。 这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s015

（TIF）

S1 表。 S1C 中 sxl 和 bam 相互作用的 esyN 参考以及图 9 中 mei-P26 相互作用的参考。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s016

（PDF格式）

S2 表。 用于制作S1A和S1B图和图9C中的表格的注释参考文献。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s017

（PDF格式）

S3 表。 完整的繁殖力数据集 （n = 3,002）。

请参阅 S3 表。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s018

（TSV）

S4 表。 繁殖力统计：单雌与单雄杂交中每只雌性每天产生的后代。

列出了实验基因型、感染状态和性别。每个杂交的配偶是OreR，具有相同的感染状态，并且与实验果蝇具有异性。雄性年龄为3-6日龄，年轻雄性CI杂交的年龄为0日龄（用“-0d”和“-5d”标签区分）。为清楚起见，P 值 <0.01 为浅绿色，<0.05 为深绿色。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s019

（PDF格式）

S5 表。 繁殖力统计：在单雌与单雄杂交中，每只雌性每天产生的卵。

列出了实验基因型、感染状态和性别。每个杂交的配偶是OreR，具有相同的感染状态，并且与实验果蝇具有异性。雄性年龄为3-6日龄，年轻雄性CI杂交的年龄为0日龄（用“-0d”和“-5d”标签区分）。为清楚起见，P 值 <0.01 为浅绿色，<0.05 为深绿色。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s020

（PDF格式）

S6 表。 繁殖力统计：从产下>的单个雌性与单个雄性杂交孵化的卵的百分比 = 20 个卵。

列出了实验基因型、感染状态和性别。每个杂交的配偶是OreR，具有相同的感染状态，并且与实验果蝇具有异性。雄性年龄为3-6日龄，年轻雄性CI杂交的年龄为0日龄（用“-0d”和“-5d”标签区分）。括号中的样本计数 （n1， n2） 用于 Fisher 精确检验（有孵化蛋的样品与没有孵化蛋的样品，与产下 20 个或更多鸡蛋的样品的孵化百分比相反）。为清楚起见，P 值 <0.01 为浅绿色，<0.05 为深绿色。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s021

（PDF格式）

S7 表。 生育能力与年龄统计。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s022

（PDF格式）

S8 表。 每个种源干细胞 （GSC） 计数。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s023

（PDF格式）

S9 表。 每个日耳有丝分裂（抗 pHH3 阳性染色）中的 GSC 数量。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s024

（PDF格式）

S10 表。 每个生殖器有丝分裂（抗 pHH3 阳性染色）中的囊细胞 （CC） 数量。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s025

（PDF格式）

S11 表。 通过荧光强度测量的 Sxl 表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s026

（PDF格式）

S12 表。 通过荧光强度测量的 Bam 表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s027

（PDF格式）

S13 表。 GSC 中通过荧光测量的相对 Bam 与 pMad 表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s028

（PDF格式）

S14 表。 肿瘤生殖系囊肿计数。

正常囊肿包含 16 个生殖系来源的细胞、15 个护士细胞和 1 个卵母细胞。含有大于或少于 15 个护士细胞的囊肿分别被评定为肿瘤或异常。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s029

（PDF格式）

S15 表。 表现出卵母细胞特异性球体表达 （Y）、染色不清晰 （M） 或无特异性表达的种系囊肿计数，表明发育异常囊肿缺乏特定的卵母细胞。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s030

（PDF格式）

S16 表。 生成转录组数据集以测试 mei-P26 敲低和 wMel 感染的影响。

数据存放在 NCBI BioProject 编号 PRJNA1007602 下。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s031

（PDF格式）

S17 表。 黑腹果蝇 D. melanogaster 基因 Wald 检验 ~基因型与 ~基因型+感染+基因型*感染的显着结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s032

（PDF格式）

S18 表。 黑腹果蝇 D. melanogaster 基因 Wald 检验 ~感染与 ~基因型 + 感染 + 基因型*感染的显着结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s033

（PDF格式）

S19 表。 带有 Wald 检验的黑腹果蝇基因对 ~Genotype*Infection 与 ~Genotype+Infection+Genotype*Infection 的显着结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s034

（PDF格式）

S20 表。 wMel Wolbachia 基因 Wald 检验 ~基因型与 ~1 的显著结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s035

（PDF格式）

确认

我们感谢UCSC生命科学显微镜中心（RRID：SCR_021135）和Ben Abrams的培训和使用他们的显微镜。我们感谢 Irene Newton 提供的抗沃尔巴克氏体 FtsZ 抗体等分试样，以及 Manabu Ote 提供的 UASp-mRFP/CyO （1-7M） 苍蝇库存。我们感谢 Russ Corbett-Detig 在整个项目中的评论和反馈。

引用

1.Leftwich PT， Edgington MP， Chapman T. 传输效率驱动宿主-微生物关联。Proc R Soc B 生物学 2020;287：20200820。PMID：32873208

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

2.Bright M， Bulgheresi S.一个复杂的旅程：微生物共生体的传播。Nat Rev 微生物。2010;8:218–230.PMID：20157340

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

3.Utarini A、Indriani C、Ahmad RA、Tantowijoyo W、Arguni E、Ansari MR 等。沃尔巴克氏体感染蚊子部署对控制登革热的功效。N Engl J Med. 2021;384:2177–2186.PMID：34107180

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

4.淹死 DM、Zee PC、Brandvain Y、Wade MJ。专性共生体中传播模式的演变。生态研究 2013;15：43.PMID：24678268

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

5.Doremus MR，猎人 MS。破坏者的工具：操纵共生体的共同机制主题。Adv Insect Physiol. 爱思唯尔。2020:317–353.https://doi.org/10.1016/bs.aiip.2020.03.003

6.Werren JH、Baldo L、Clark ME。沃尔巴克氏体：无脊椎动物生物学的主要操纵者。Nat Rev 微生物。2008;6:741–751.PMID：18794912

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

7.詹森 VAA、图雷利 M、戈弗雷 HCJ。沃尔巴克氏体的随机传播。Proc R Soc B Biol Sci. 2008;275:2769–2776.PMID：18755670

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

8.Turelli M. 不相容诱导微生物及其宿主的进化。演化。1994;48:1500.PMID：28568404

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

9.周 AR、Turelli M、Harcombe WR、Reynolds KT、Hoffmann AA。从寄生虫到共生：沃尔巴克氏体在果蝇自然种群中的快速进化。Keller L，编辑。PLoS Biol. 2007年;5：E114。PMID：17439303

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

10.卡灵顿 LB、利普科维茨 JR、霍夫曼 AA、图雷利 M.沃尔巴克氏体诱导的加州果蝇模拟物细胞质不相容性的重新检查。Cordaux R，编辑。PLoS 一号。2011;6：e22565。PMID：21799900

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

11.Zug R， Hammerstein P. 坏人变好了？对节肢动物宿主中沃尔巴克氏体共生关系的批判性评估：节肢动物中的沃尔巴克氏体共生关系。Biol Rev. 2015 年;90:89–111.PMID：24618033

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

22 分钟Kriesner P， Hoffmann AA， Lee SF， Turelli M， Weeks AR. 两种沃尔巴克氏体变体在果蝇模拟物中的快速连续传播。Charlat S，编辑。PLoS 病理学。2013;9：e1003607。PMID：24068927

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

23米Ross PA、Axford JK、Yang Q、Staunton KM、Ritchie SA、Richardson KM 等。热浪导致埃及伊蚊的wMel沃尔巴克氏体密度和频率波动。Kohl A，编辑。PLoS Negl Trop Dis. 2020;14：e0007958。PMID：31971938

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

14.霍夫曼AA。两个澳大利亚果蝇黑腹果蝇种群之间的部分细胞质不相容。Entomol Exp Appl. 1988年;48:61–67.

查看文章谷歌学术搜索

25米Hoffmann AA， Hercus M， Dagher H. 沃尔巴克氏体感染导致黑腹果蝇细胞质不相容的种群动态。遗传学。1998;11.PMID：9475734

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

26 分钟雷诺兹 KT，霍夫曼 AA。母源性沃尔巴克氏体感染的果蝇菌株的雄性年龄、宿主效应和细胞质不相容性表达弱或不表达。基因研究 2002：80。PMID：12534211

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

27米Layton EM、On J、Perlmutter JI、Bordenstein SR、什罗普郡 JD。祖母的年龄会影响沃尔巴克氏体诱导的黑腹果蝇细胞质不相容的强度。Dubilier N，编辑。MBio的。2019;10：e01879–19，/mbio/10/6/mBio.01879-19.atom。PMID：31690673

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

18.Solignac M， Vautrin D， Rousset F. 变形菌沃尔巴克氏体的广泛发生和果蝇黑腹果蝇的部分细胞质不相容性。Comptes Rendus Acad Sci—Ser. 1994;III（317）：461–470。

查看文章谷歌学术搜索

19.Verspoor RL， Haddrill PR. 全球果蝇黑腹果蝇和模拟果蝇种群样本中的遗传多样性、种群结构和沃尔巴克氏体感染状况。韦尔奇 JJ，编辑。PLoS 一号。2011;6：e26318。PMID：22022599

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

10米Kriesner P、Conner WR、Weeks AR、Turelli M、Hoffmann AA。黑腹果蝇中沃尔巴克氏体感染频率斜线的持续存在以及生殖休眠的可能作用： 持续性沃尔巴克氏体频率斜线。演化。2016;70:979–997.PMID：27076356

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

21.Fry AJ， Palmer MR， Rand DM. 沃尔巴克氏体感染对黑腹果蝇的适应性影响。遗传。2004;93:379–389.PMID：15305172

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

12 分钟哈科姆 W，霍夫曼 AA。黑腹果蝇中的沃尔巴克氏体效应：寻找健身益处。J无脊椎动物病理。2004;87:45–50.PMID：15491598

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

13 分钟Serga SV、Maistrenko OM、Matiytsiv NP、Vaiserman AM、Kozeretska IA。沃尔巴克氏体感染对黑腹果蝇健身相关性状的影响。共生。2021;83:163–172.

查看文章谷歌学术搜索

14 分钟Strunov A， Lerch S， Blanckenhorn WU， Miller WJ， Kapun M. 环境和沃尔巴克氏体感染对黑腹果蝇宿主生活史的复杂影响。J Evol Biol. 2022;35:788–802.PMID：35532932

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

25.Serga S， Maistrenko O， Rozhok A， Mousseau T， Kozeretska I. 繁殖力是导致沃尔巴克氏体 wMel 基因型在黑腹果蝇自然种群中占主导地位的可能因素之一。共生。2014;63:11–17.

查看文章谷歌学术搜索

26.Frydman HM， Li JM， Robson DN， Wieschaus E. 沃尔巴克氏体中的体细胞生态位趋性。自然界。2006;441:509–512.PMID：16724067

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

17 分钟Toomey ME， Panaram K， Fast EM， Beatty C， Frydman HM. 进化上保守的沃尔巴克氏体编码因子控制果蝇卵巢中干细胞生态位趋向性的模式并有利于感染。美国国家科学院院刊，2013 年;110:10788–10793.PMID：23744038

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

18 分钟Foray V， Perez-Jimenez MM， Fattouh N， Landmann F. 沃尔巴克氏体控制干细胞行为并刺激丝虫的种系增殖。开发单元。2018;45:198–211.PMID：29689195

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

19米Pannebakker BA， Loppin B， Elemans CP， Humblot L， Vavre F. 寄生抑制细胞死亡促进共生。美国国家科学院院刊，2007年;104:213–215.PMID：17190825

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

30.Russell SL， Castillo JR. 共生体诱导的宿主细胞分化的趋势。在：Kloc M，编辑。共生：细胞、分子、医学和进化方面。Cham：施普林格国际出版社;2020 年，第 137–176 页。https://doi.org/10.1007/978-3-030-51849-3_5 pmid：33263871

31.斯塔尔DJ，克莱恩TW。宿主-寄生虫相互作用挽救了果蝇卵子发生缺陷。自然界。2002;418:76.PMID：12097909

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

32.弗洛雷斯·哈、布内尔 JE、阿夸德罗 CF、巴巴什 DA。果蝇弹珠袋基因与沃尔巴克氏体在遗传上相互作用，并显示出女性特异性的分化效应。PLoS 基因。2015;11：e1005453。

查看文章谷歌学术搜索

33.Bubnell JE， Fernandez-Begne P， Ulbing CKS， Aquadro CF. 沃尔巴克氏菌的不同 wMel 变体差异挽救了黑腹果蝇中弹珠袋部分功能丧失突变的生育力和细胞学缺陷。G3的。2021 [引用日期：2021 年 10 月 2 日]。PMID：34580706

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

34.Ote M， Ueyama M， Yamamoto D. 沃尔巴克氏体蛋白 TomO 靶向纳米 mRNA 并恢复果蝇性致死突变体中的生殖干细胞。Curr Biol. 2016年;26:2223–2232.PMID：27498563

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

35.Ote M， 山本 D.沃尔巴克氏体蛋白 TomO 与宿主 RNA 相互作用，诱导果蝇卵母细胞的极化缺陷。Arch Insect Biochem Physiol. 2018;99：e21475。PMID：29851149

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

36.Li Y， Minor NT， Park JK， McKearin DM， Maines JZ.Bam 和 Bgcn 拮抗 Nanos 依赖性生殖系干细胞维持。美国国家科学院院刊，2009年;106:9304–9309.PMID：19470484

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

37.White PM、Serbus LR、Debec A、Codina A、Bray W、Guichet A 等。沃尔巴克氏体对果蝇细胞全基因组RNAi筛选揭示的高宿主蛋白水解率的依赖。遗传学。2017：遗传学.116.198903.PMID：28159754

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

38.Li Y， Maines JZ， Tastan OY， McKearin DM， Buszczak M. Mei-P26 通过促进 BMP 信号传导来调节卵巢生殖系干细胞的维持。发展。2012;139:1547–1556.PMID：22438571

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

39.Neumüller RA、Betschinger J、Fischer A、Bushati N、Poernbacher I、Mechtler K 等人。Mei-P26 调节果蝇卵巢干细胞谱系中的 microRNA 和细胞生长。自然界。2008;454:241–245.PMID：18528333

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

40.佩奇 SL、麦金 KS、丹妮 B、范胡克 TL、霍利 RS。mei-p26 的遗传研究揭示了控制两性生殖细胞增殖的过程与控制果蝇减数分裂交换的过程之间的联系。遗传学。2000;155:1757.

查看文章谷歌学术搜索

41.Sekelsky JJ、McKim KS、Messina L、French RL、Hurley WD、Arbel T 等。鉴定在P元素筛选中回收的新型果蝇减数分裂基因。遗传学。1999;152:529–542.PMID：10353897

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

42.Waghmare I， Page-McCaw A. 果蝇生殖器干细胞维持和分化中的 Wnt 信号传导。基因。2018;9:127.PMID：29495453

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

73 分钟Fast EM， Toomey ME， Panaram K， Desjardins D， Kolaczyk ED， Frydman HM. 沃尔巴克氏体增强果蝇干细胞增殖并靶向生殖系干细胞生态位。科学。2011;334:990–992.PMID：22021671

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

44.阿鲁纳 S、弗洛雷斯 HA、巴巴什 DA。果蝇黑腹果蝇杂交雄性救援 （Hmr） 突变雌性的生育能力降低部分由来自兄弟物种的 Hmr 直系同源物补充。遗传学。2009;181:1437–1450.PMID：19153254

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

75 分钟Zaccai M， Lipshitz HD. 果蝇卵巢和早期胚胎中两种 adducin 样蛋白亚型的差异分布。受精卵。1996;4:159–166.PMID：8913030

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

46.Hinnant TD、Merkle JA、Ables ET。协调果蝇雌性种系中的增殖、极性和细胞命运。前细胞开发生物学 2020;8：19。PMID：32117961

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

47.果蝇生殖系干细胞活性、生态位信号活性和产蛋量的年龄相关变化.老化细胞。2008;7:344–354.PMID：18267001

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

48.Kai T， Spradling A. 分化生殖细胞可以恢复为果蝇黑腹腔卵巢中的功能性干细胞。自然界。2004;428:564–569.PMID：15024390

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

79 分钟Su TT， Sprenger F， DiGregorio PJ， Campbell SD， O'Farrell PH. 果蝇合胞体胚胎有丝分裂的退出需要蛋白水解和细胞周期蛋白降解，并且与局部去磷酸化有关。基因开发 1998;12:1495–1503.PMID：9585509

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

50.Li Y， Zhang Q， Carreira-Rosario A， Maines JZ， McKearin DM， Buszczak M. Mei-P26 与 Bam、Bgcn 和 Sxl 合作促进果蝇卵巢早期种系发育。Singh SR，编辑。PLoS 一号。2013;8：e58301。PMID：23526974

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

51.Chau J， Kulnane LS， Salz HK.性致死促进果蝇卵巢中从生殖系干细胞到承诺子细胞的过渡。遗传学。2009;182:121–132.PMID：19237687

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

52.曾春莹， 高氏华， 万国升， 曹英， 董潼贤， 徐华杰.Notch信号转导介导了与年龄相关的生殖系干细胞与生态位的粘附性降低。Kim SK，编辑。PLoS 基因。2014;10：e1004888。PMID：25521289

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

53.Chau J， Kulnane LS， Salz HK.性别致死通过在果蝇卵子发生过程中下调 Nanos 蛋白水平来实现生殖系干细胞分化。美国国家科学院院刊，2012 年;109:9465–9470.PMID：22645327

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

54.乔利 W、夏蒂埃 A、罗哈斯-里奥斯 P、布索 I、西蒙内利格 M.CCR4 去烯酰化酶与 Nanos 和 Pumilio 一起微调 Mei-P26 表达，促进生殖系干细胞自我更新。干细胞代表 2013;1:411–424.PMID：24286029

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

55.Ji S， Li C， Hu L， Liu K， Mei J， Luo Y， 等.Bam 依赖性去泛素化酶复合物可以通过靶向细胞周期蛋白 A 来破坏生殖系干细胞的维持。 Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114:6316–6321.PMID：28484036

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

56.谢婷， Spradling AC.果蝇卵巢中维持生殖系干细胞的生态位。科学。2000;290:328–330.PMID：11030649

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

57.Chen D， Mckearin D. Dpp 信号转导直接沉默 bam 转录以建立生殖系干细胞的不对称分裂。Curr Biol. 2003 年;13:1786–1791.PMID：14561403

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

58.Song X， Wong MD， Kawase E， Xi R， Ding BC， McCarthy JJ， et al.来自生态位细胞的 Bmp 信号直接抑制果蝇卵巢生殖系干细胞中促进分化基因（弹珠袋）的转录。发展。2004;131:1353–1364.PMID：14973291

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

59.格拉斯科克 E.mei-p26 基因编码一种无名指 b 盒卷曲螺旋-NHL 蛋白，该蛋白调节果蝇的癫痫发作易感性。遗传学。2005;170:1677–1689.PMID：15937125

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

50米Herranz H、Hong X、Pérez L、Ferreira A、Olivieri D、Cohen SM 等。miRNA 机制靶向 Mei-P26 并调节果蝇翼中的 Myc 蛋白水平。EMBO J. 2010 年;29:1688–1698.PMID：20400939

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

61.Ferreira A， Boulan L， Perez L， Milán M. Mei-P26 介导果蝇中对 Brat 肿瘤抑制因子和 dMyc 原癌基因的组织特异性反应。遗传学。2014;198:249–258.PMID：24990993

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

62.桑托索 CS、米汉 TL、彼得森 JS、塞达诺 TM、特洛 CV、麦考尔 K。ABC 转运蛋白 Eato 促进黑腹果蝇卵巢中的细胞清除。G3的。2018;8:833–843.PMID：29295819

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

53米Lantz V， Chang JS， Horabin JI， Bopp D， Schedl P.果蝇球体 RNA 结合蛋白是卵室形成和极性建立所必需的。基因开发 1994;8:598–613.PMID：7523244

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

64.Kaur R、Leigh BA、Ritchie IT、Bordenstein SR。来自沃尔巴克氏体噬菌体 WO 的 Cif 蛋白修饰精子基因组完整性以建立细胞质不相容性。Malik HS，编辑。PLoS Biol. 2022;20：e3001584。PMID：35609042

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

55米Turelli M，霍夫曼 AA。模拟果蝇中的细胞质不相容性：来自自然种群的动力学和参数估计。遗传学。1995;140:1319.

查看文章谷歌学术搜索

66.Yan D， Neumüller RA， Buckner M， Ayers K， Li H， Hu Y， et al.果蝇种系干细胞自我更新的调控网络。开发单元。2014;28:459–473.PMID：24576427

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

57 分钟希恩 KB、马丁 M、Lesser CF、Isberg RR、牛顿 ILG。鉴定和表征与肌动蛋白细胞骨架相互作用的候选沃尔巴克氏菌 IV 型效应子。MBio的。2016;7：E00622–E00616。PMID：27381293

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

58 分钟Russell SL， Lemseffer N， White P， Sullivan WT. 沃尔巴克氏体和宿主生殖系成分竞争驱动蛋白介导的转运到果蝇卵母细胞的后极。McGraw EA，编辑。PLoS 病理学。2018;14：e1007216。PMID：30110391

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

69.Serbus LR，沙利文 W.沃尔巴克氏体募集到宿主种系的细胞基础。PLoS 病理学。2007;3：e190.PMID：18085821

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

40 分钟Ferree PM， Frydman HM， Li JM， Cao J， Wieschaus E， Sullivan W. Wolbachia 利用宿主微管和动力蛋白在果蝇卵母细胞中进行前定位。PLoS 病理学。2005;1：e14。PMID：16228015

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

41米White PM， Pietri JE， Debec A， Russell SL， Patel B， Sullivan W. 黑腹果蝇沃尔巴克氏菌属水平细胞间转移的机制。应用环境微生物。2017;83：E03425–E03416。PMID：28087534

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

42 分钟Albertson R， Casper-Lindley C， Cao J， Tram U， Sullivan W. 对称和不对称有丝分裂分离模式影响沃尔巴克氏体在宿主体细胞组织中的分布。细胞科学杂志 2009;122:4570–4583.PMID：19934219

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

43米Hackney JF， Pucci C， Naes E， Dobens L. Ras 信号转导在果蝇卵巢细胞迁移过程中调节蜕皮激素受体 EcR 的活性。Dev Dyn.2007;236:1213–1226.PMID：17436275

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

44 分钟Rastegari E， Kajal K， Tan B-S， Huang F， Chen R-H， Hsieh T-S， et al. WD40 蛋白 Wuho 通过 TRIM-NHL 肿瘤抑制因子 Mei-p26 控制果蝇中的种系稳态。发展。2020;147：dev182063。PMID：31941704

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

45 分钟Rhiner C、Díaz B、Portela M、Poyatos JF、Fernández-Ruiz I、López-Gay JM 等。果蝇卵巢生殖系生态位中干细胞及其女儿之间的持续竞争。发展。2009;136:995–1006.PMID：19211674

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

76.Chen D， Wu C， Zhao S， Geng Q， Gao Y， Li X， 等.三种RNA结合蛋白形成复合物，促进果蝇种系干细胞谱系的分化。Fuller MT，编辑。PLoS 基因。2014;10：e1004797。PMID：25412508

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

47米Ote M， Yamamoto D. 沃尔巴克氏体感染对果蝇雌性生殖系干细胞的影响。Curr Opin 昆虫科学 2020;37:8–15.PMID：31726321

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

48 分钟-lethal 是 Bruno 介导的翻译抑制在果蝇卵子发生过程中促进干细胞后代分化的靶标。开发生物学 2007;302:160–168.PMID：17067567

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

49米Ye Y， Godzik A. 蛋白质结构域组织的比较分析.基因组研究 2004;14:343–353.PMID：14993202

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

80.Beebe NW、Pagendam D、Trewin BJ、Boomer A、Bradford M、Ford A 等。释放不相容的雄性会在澳大利亚野生和携带沃尔巴克氏体的埃及伊蚊种群中产生强烈的抑制作用。美国国家科学院院刊 2021;118：e2106828118。PMID：34607949

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

81.Anderson JA， Gilliland WD， Langley CH. 分子群体遗传学和果蝇减数分裂基因的进化。遗传学。2009;181:177–185.PMID：18984573

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

82.Bean DM、Heimbach J、Ficorella L、Micklem G、Oliver SG、Favrin G. esyN：网络构建、共享和发布。Promponas VJ，编辑。PLoS 一号。2014;9：e106035。PMID：25181461

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

83.Casper-Lindley C， Kimura S， Saxton DS， Essaw Y， Simpson I， Tan V， et al. 果蝇种系和体细胞组织中基于荧光的沃尔巴克氏体内共生体的快速荧光筛选。应用环境微生物。2011;77:4788–4794.PMID：21622788

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

84.Serbus LR、White PM、Silva JP、Rabe A、Teixeira L、Albertson R 等。宿主饮食对果蝇沃尔巴克氏体滴度的影响。PLoS 病理学。2015;11：e1004777。

查看文章谷歌学术搜索

85.Bopp D， Bell LR， Cline TW， Schedl P. 雌性特异性性致死蛋白在黑腹果蝇中的发育分布。基因开发 1991;5:403–415.PMID：1900493

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

86.Spradling A.卵子发生的发育遗传学。Dev Drosoph Melanogaster。1993.

查看文章谷歌学术搜索

87.Bolger AM， Lohse M， Usadel B. Trimmomatic：用于Illumina序列数据的灵活微调器。生物信息学。2014;30:2114–2120.PMID：24695404

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

88.Dobin A， Davis CA， Schlesinger F， Drenkow J， Zaleski C， Jha S， et al. STAR：超快通用RNA-seq比对仪。生物信息学。2013;29:15–21.PMID：23104886

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

89.Li H， Handsaker B， Wysoker A， Fennell T， Ruan J， Homer N， et al.序列对齐/映射格式和 SAMtools。生物信息学。2009;25:2078–2079.PMID：19505943

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

90.Bray NL， Pimentel H， Melsted P， Pachter L. 近优概率 RNA-seq 定量。国家生物技术。2016;34:525–527.PMID：27043002

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

91.Chung M、Bruno VM、Rasko DA、Cuomo CA、Mu?oz JF、Livny J 等。多物种RNA-seq差异表达分析的最佳实践。基因组生物学 2021;22：121.PMID：33926528

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

92.Marsh JW、Hayward RJ、Shetty AC、Mahurkar A、Humphrys MS、Myers GSA。细菌和宿主细胞双重RNA测序实验的生物信息学分析。简短的生物信息。2017 [引用于 2023 年 2 月 10 日]。PMID：28535295

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

93.Love MI， Huber W， Anders S. 使用 DESeq2 对 RNA-seq 数据的倍数变化和分散进行适度估计。基因组生物学 2014;15：550。PMID：25516281

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

94.Soneson C、Love MI、Robinson 医学博士。RNA-seq的差异分析：转录水平的估计可改善基因水平的推断。F1000研究。2016年PMID：26925227

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

95.Li H， Janssens J， De Waegeneer M， Kolluru SS， Davie K， Gardeux V， et al. 果蝇细胞图谱：成虫果蝇的单核转录组图谱。科学。2022;375：EABK2432。PMID：35239393

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

96.Ge SX， Jung D， Yao R. ShinyGO：一种用于动植物的图形化基因集富集工具。瓦伦西亚 A，编辑。生物信息学。2020;36:2628–2629.PMID：31882993

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

97.Eklund A. 蜂群。2023. 可从： https://github.com/aroneklund/beeswarm.

查看文章谷歌学术搜索

98.Wickham H. ggplot2：用于数据分析的优雅图形。纽约，纽约：斯普林格;2009. https://doi.org/10.1007/978-0-387-98141-3

99.Blighe K， Rana S， Turkes E， Ostendorf B， Grioni A， Lewis M. EnhancedVolcano：具有增强着色和标签的可出版火山图。生物导体版本：发布。2023;(3.17).

查看文章

免费医学论文发表-沃尔巴克氏体内共生体操纵生殖系干细胞的自我更新和分化，以增强其果蝇宿主的生育能力

抽象

α变形杆菌沃尔巴克氏菌（Wolbachia pipientis）感染全世界的节肢动物和线虫物种，使其成为宿主生物防治的关键靶标。沃尔巴克氏体驱动的宿主生殖操作，如细胞质不相容 （CI），被认为将这些细胞内细菌在宿主种群中高频传播。积极的（也许是互惠的）生殖操作也会增加感染频率，但尚不清楚。在这里，我们确定了沃尔巴克氏体影响生殖系干细胞（GSC）自我更新和分化的分子不同过程的分子和细胞机制。我们证明 wMel 感染挽救了缺乏翻译调节因子 mei-P26 的果蝇的生育能力，并且足以无限期地维持不育的纯合子 mei-P26 敲低储备。细胞学显示，wMel 通过恢复适当的 pMad、Bam、Sxl 和 Orb 表达来减轻 mei-P26 丢失的影响。在具有野生型生育力的俄勒冈州 R 文件中，wMel 感染提高了终生卵孵化率。通过对真核生物和细菌转录本的双RNAseq定量来探索这些表型，发现wMel感染在mRNA水平上挽救并抵消了mei-P26缺失诱导的许多基因表达变化。总体而言，我们发现 wMel 感染在 mRNA、蛋白质和表型水平上有益地增强了宿主的生育能力，这些机制可能促进共生关系的出现和宿主生殖操作的破坏。

数字

Table 1图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 9Table 1Fig 1Fig 2Fig 3

引文： Russell SL、Castillo JR、Sullivan WT （2023） 沃尔巴克氏体内共生体操纵生殖系干细胞的自我更新和分化，以增强其果蝇宿主的生育能力。PLoS 生物学 21（10）： E3002335 中。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335

学术编辑： Nancy A. Moran，德克萨斯大学奥斯汀分校，美国

收到： 2023年1月18日;接受： 2023年9月14日;发表： 10月 24， 2023

版权所有： ? 2023 Russell et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都包含在论文、支持信息文件、NCBI BioProject 编号 PRJNA1007602 或树妖：https://doi.org/10.7291/D1DT2C 上。

资金： 这项工作得到了加州大学圣克鲁斯分校校长博士后奖学金和NIH（R00GM135583 SLR;R35GM139595 至 WTS）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

缩写： BDSC， 布卢明顿果蝇库存中心;.BMP 骨形态发生蛋白;联邦调查局 膀胱母细胞;抄送， 囊细胞;词 细胞质不相容;CTCF， 校正了总细胞荧光;犯 错 雌激素相关受体;GSC， 生殖干细胞;NDJ， 不分离;OreR， 俄勒冈州 R;pHH3， 磷酸化组蛋白 H3;圆周率 碘化丙啶;RISC， RNA诱导的沉默复合物;核酸核酸（RNP）， 核糖核蛋白;UAM公司 转运放大;TomO， 卵子发生的毒性操纵剂;UTR， 未翻译的区域

介绍

内共生细菌已经进化出多种感染和操纵宿主种群的策略[1,2]，这些策略现在正被用于生物防治应用[3]。这些细菌中有许多存在于宿主细胞内，并引导雌性宿主发育以定植后代，从而通过垂直传播将其适应性与宿主的适应性联系起来[4]。具有生殖操纵能力的遗传性内共生体更进一步，通过改变宿主发育的方式迅速增加宿主种群中受感染的生殖雌性的频率。生殖操纵策略包括胞浆不相容（cytoplasmic incock， CI），其中受感染的精子需要通过受感染的卵子、雄性杀伤、女性化和孤雌生殖来挽救[5,6]。这些操作可以非常有效地将细菌共生体驱赶到宿主种群中，而不管宿主个体或种群的成本如何[7]。

尽管寄生生殖操作取得了成功，但自然选择偏向于提高受感染母亲生育能力的共生体，即使这些变异降低了最初导致感染的高频寄生机制的功效[8]。在节肢动物和 αproteobacterium Wolbachia pipientis 菌株之间的关联中，这种情况可能很常见。例如，在1980年代wRi的CI介导的横扫加利福尼亚之后，感染沃尔巴克氏体wRi菌株的果蝇种群的繁殖力在20年内从-20%波动到+10%[9]。这种从适应度成本到收益的转变与CI强度在同一时间段的减弱相吻合[10]。其他沃尔巴克氏体菌株的生育能力增强机制可能在其原生宿主中达到高感染频率，但目前没有寄生虫生殖操纵的证据[11]。重要的是，这些适应性益处也可能在人群感染的早期阶段发挥作用，此时受感染宿主的频率太低，CI无效[12]。

目前，沃尔巴克氏体的wMel菌株及其编码的CI机制已成功用于生物控制非天然宿主[3]。在埃及伊蚊中，CI导致未感染母亲所生后代的死亡率接近100%[13]。然而，在其原生宿主果蝇黑腹果蝇中，wMel表现出的CI很少超过50%，并且对父亲年龄[14–16]以及祖母年龄极为敏感，因为滴度随年龄增加而增加[17,18]。尽管其天然宿主的CI较弱，但在全世界人群中发现wMel的感染频率为中至高[19,20]。其他数据表明，这些频率可能由一些增加宿主适应性的新兴有益功能来解释[21\u201225]。这些有益功能的分子基础可能与 D 中 CI 疗效的丧失有关。黑腹果蝇。鉴于 wMel 在非原生宿主中的使用依赖于强大而高效的 CI，我们必须了解其最终可能破坏 CI 功能的有益功能的基础。

宿主生殖系干细胞 （GSC） 维持和分化途径是沃尔巴克氏体介导的生殖操作的强大靶点。沃尔巴克氏体菌株对宿主生殖组织具有很强的亲和力[26,27]，可将其定位在正确的位置，以操纵和提高宿主的生育能力。在与布鲁吉亚丝虫线虫[28]和阿索巴拉黄蜂[29]形成专性关联的菌株中，沃尔巴克氏体在种系中是防止过早分化和成功卵子发生的必要条件（见[30]）。在兼性 w Mel-D 中。黑腹肌协会，WMel菌株可以部分挽救雌性果蝇中基本种系维持和分化基因性致死（SXL）和弹珠袋（BAM）的部分功能等位基因丧失[31–33]。已知wMel编码其自身因子，即卵子发生毒性操纵因子（toxic manipululator of oogenesis， TomO），通过去抑制和过表达翻译阻遏蛋白Nanos（Nos）来部分概括GSC中的Sxl功能[34,35]。然而，Nos表达与早期Germarium中的Bam表达呈负相关[36]。因此，Bam 在 wMel 感染的突变果蝇的囊肿模式化和分化中的功能不能用与 sxl rescue 或 TomO 的已知功能共享机制来解释。

在之前的筛选中，我们的实验室将必需的生育基因减数分裂-P26 （mei-P26） 确定为影响 D 中 wMel 感染强度的宿主因子。黑腹果蝇细胞培养，可能通过调节蛋白质泛素化[37]。Mei-P26 是一种 Trim-NHL 蛋白，通过其多个结构域赋予广泛的功能：其蛋白质结合 NHL 和 B-box 结构域使其能够充当多种翻译阻遏蛋白复合物（例如，Sxl、Nanos （Nos）、Argonaute-1 （AGO1），参见 S1 至 S2A 图 和 S1 至 S2 表）。 其E3-泛素连接酶结构域可能使其能够调节蛋白水解[38]。鉴于mei-P26在感染中的体外作用[37]及其在GSC维持[38]、分化[39,40]和减数分裂[40,41]中的体内作用，我们选择它作为调节wMel-宿主相互作用的候选基因。

我们报告说，D.感染沃尔巴克氏体 wMel 菌株的黑腹果蝇部分挽救了 mei-P26 突变并表现出增强的生育能力。在亚态性mei-P26纯合子的果蝇中，wMel感染将雄性和雌性的生育能力提高到足以维持稳定种群的水平，而未感染的种群是不可持续的。感染通过减轻扰动的 mei-P26 功能对其他蛋白质和 mRNA 表达的下游影响来挽救 GSC 维持和囊肿分化。具体而言，wMel 感染恢复了磷酸化母亲对头瘫 （pMad）、Sxl、Bam 和 Oo18 RNA 结合 （Orb） 蛋白以及肿瘤睾丸 （tut） 和良性性腺细胞肿瘤 （bgcn） mRNA 的野生型样表达谱。我们在俄勒冈 R （OreR） 野生型果蝇中发现了 wMel 有益的生殖操纵能力的证据，说明了如何在自然界中选择细菌介导的发育恢复力。这些结果对于理解 wMel 如何在自然 D 中达到高频至关重要。黑腹果蝇种群和这些有益功能可能能够用于生物控制应用。

结果

在这里，我们探讨了 wMel Wolbachia 感染对 D 的影响。黑腹果蝇的必需生育基因 mei-P26 通过 RNAi 构建体的剂量敲低、亚态等位基因 mei-P26 的功能被破坏以及用无效等位基因 mei-P26 完全敲低[mfs1]。使用苍蝇繁殖力测定、免疫细胞化学以及宿主和细菌转录本的双 RNAseq，我们表明 wMel 可以补偿 mei-P26 的损失，从而显着挽救宿主生育能力。

感染 wMel 可挽救雌性 D。mei-P26 缺陷果蝇的黑腹果蝇生育能力

与OreR野生型菌株相比，感染w Mel显著挽救了由mei-P26功能丧失引起的生育缺陷，这是通过每个雌性D产生的后代来衡量的。每天黑腹肌（图 1A-1E 和 S3;p< = 2.2e-16 至 2.9e-2，Wilcoxon 秩和检验;见S2-S6图）。后代生产需要成功维持 GSC，将 GSC 子细胞分化为完全发育和受精的卵子，胚胎发生，并孵化为一龄幼虫。将后代产量分解为产卵和产蛋成分（图1B和1C）显示，随着等位基因强度的增加，从nos驱动的RNAi到亚态和无效等位基因，生育影响从影响分化/发育（产卵）的因素转变为影响产卵的因素（产卵）。

缩略图 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 1. wMel 感染挽救了雌性（和雄性，见 S4E-S4G 图）中基本宿主生育基因 mei-P26 的丧失。

（空调）蜂群箱线图的 （A） 总后代产量，分为 （B） 产卵和 （C） 孵化卵，从单个雌性 RNAi、亚态性和无效 mei-P26 敲低雌性果蝇杂交到相同感染状态和年龄（3-7 日龄）的单个 OreR 雄性。无效等位基因 mei-P26[mfs1] 将突变杂合子和纯合子的产卵率降低到感染和未感染雌性的平均 20 以下，因此需要对有后代和没有后代的雌性进行分析（见 D）。Wilcoxon 秩和检验 *p< = 0.05，**< = 0.01，***< = 0.001，****< = 1e-4。费舍尔精确检验 [**]p< = 0.01，[****]< = 1e-4。（D-E）（D） 有后代和没有后代、感染和未感染沃尔巴克氏体的指定基因型女性样本比例的条形图。（E） 表格列出了 wMel 感染（左）或未感染（右）mei-P26 突变体所表现出的野生型繁殖力的百分比，按严重程度增加的顺序，从上到下（另见 S4-S6 表）。从低到高比例的单元格值分别从浅蓝色到深蓝色着色。（女，女）敲除 mei-P26 D.黑腹肌繁殖力与雌性年龄的关系，与局部多项式回归拟合（深灰色边界 = 95% 置信区间）。在（F）mei-P26 RNAi和（G）mei-P26[1]亚态雌性寿命的前25天内，感染wMel会增加后代的产量。 （H-O）D的共聚焦平均投影。黑腹果蝇卵泡和胚芽（3-7 日龄）。（H-I'）细胞内 wMel FtsZ 定位于种系（黄色、Vas+、内虚线轮廓）和体细胞（Vas-，内虚线和外虚线轮廓之间的空间）细胞，滴度高，在未感染的果蝇中具有低背景。细菌连续位于mei-P26[1]种系中，从GSC（Hts结合光谱体附近的箭头）开始。体细胞区域用空箭头表示。（J-O）细胞学显示，wMel 感染挽救了 （J， K） mei-P26 RNAi、（L， M） mei-P26[1]（另见 S5 图）和 （N， O） mei-P26[1/mfs1] 诱导的卵子发生缺陷。 荧光通道连续采样并叠加，如每组图像所示，如下所示：青色 = 抗胡李泰少 （Hts） 环管亚型 （-RC） 或消融物亚型 （-FUS），黄色 = 抗 Vasa （Vas），蓝色 = wMel 抗丝状温度敏感突变体 Z （FtsZ），红色 = PI DNA 染色。比例尺：H–I' = 10 μm，L–O = 50 μm，J，K = 100 μm。（P） 野生型D的示意图。黑腹果蝇Germarium，按区域突出显示关键事件和细胞类型，如[42]。米色的体细胞，GSC衍生的细胞是颜色鲜艳的梯度，导致分化的囊肿细胞为黄色，指定的卵母细胞为蓝色。起源于GSC的黑色结构是光谱体，随着CB的形成，光谱体变成分支的fusome，远离生态位，并分裂成CC。这个数字背后的数据可以在 S3 表和 doi.org/10.7291/D1DT2C 的 Dryad 上找到。CB， 膀胱母细胞;CC，膀胱细胞;GSC，生殖系干细胞;俄勒冈州R;PI， 碘化丙啶。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g001

wMel 感染介导了所有等位基因强度和 nos：GAL4>UAS 驱动的 RNAi 敲低的显着程度的生育挽救，表明一种强大的细菌挽救机制，可以补偿蛋白质剂量和功能的损失。nos驱动的mei-P26 RNAi耗竭（来自未感染果蝇中26%的后代产生缺陷）的挽救已经完成：由于产卵率较高，感染的mei-P26 RNAi雌性比受感染的OreR野生型雌性多产生44%的后代（37 vs 25 只幼虫/雌性/天，p< = 1.15E-02 Wilcoxon 秩和检验，S4表和图1A和1E）（p< = 6.99E-05 Wilcoxon 秩和检验，S5 表和图 1B 和 1E），与更高的孵化率相反（图 1C 和 1E 和 S6 表）。这可能表明 wMel 和低剂量 mei-P26 在 GSC 中具有协同作用。在未感染和wMel感染的mei-P26[1]亚态雌性中，与匹配感染状态的OreR野生型相比，后代产量分别下降了94%和73%（p< = 2.26E-14和3.45E-12 Wilcoxon秩和检验，S4表和图1A和1E）。比较未感染和w Mel感染的雌性mei-P26[1]繁殖力表明，wMel感染通过增加产卵率（p< = 2.82E-02 Wilcoxon秩和检验，S5表和图1B）和卵孵化率（

wMel 介导的 mei-P26 拯救是稳健的，足以在稳定的储备库中拯救该基因。在mei-P26[1]亚态和nos驱动的RNAi敲低雌性中，wMel感染增加了在果蝇生命周期中每天产生的后代数量（p< = 1.5e-11至3.4e-2 Kolmogorov-Smirnov试验，S7表和图1F和1G）。然而，对于感染状态和基因型，每天产卵的潜在数量和孵化率确实随年龄而有很大差异（S4A-S4D图）。wMel 挽救机制并非女性所特有，因为 wMel 感染减轻了 mei-P26 缺失对男性生育能力的较弱影响（S4E–S4G 图;p< = 6.1e-6 至 2.9e-2 Wilcoxon 秩和检验，S3–S5 表）。因此，我们能够建立感染 wMel Wolbachia 的 mei-P26[1] 果蝇的纯合种群。相比之下，未感染的种群只持续了几代，没有平衡染色体（S4H和S4I图）。鉴于mei-P26[1]等位基因的严重性，但具有显着的可挽救性（图1A-1C，S2B和S2D），我们继续进行该基因型进行许多后续的特定免疫细胞学挽救表型的测定。

雌性种系形态被 mei-P26 缺陷果蝇的 wMel 感染挽救

在 D.黑腹果属癣，wMel在种系细胞和体细胞中均以高滴度持续存在（图1H–1H'，与图1I–1I'中的对照组相比），与先前的报道一致[26,27,43]。与体细胞相比，细菌更强烈地定位于种系来源的细胞（图 1H–1H' 中 FtsZ 和 Vas 的共定位）。细胞内 wMel 可以在 GSC、成囊细胞 （CB）、囊细胞 （CC） 和发育的囊肿中识别。这种定位使 wMel 处于 mei-P26 活跃的所有关键细胞类型和阶段，使细菌能够补偿 mei-P26 在 GSC 维持和分化中的发育功能。

比较感染和未感染沃尔巴克氏体的 mei-P26 敲低卵母细胞的细胞学证实，wMel 感染的卵巢比未感染的卵巢表现出更少的发育缺陷，更接近 OreR 野生型（图 1J-1O 和 S5 与图 1P;Vasa （Vas） = 种系 [44]，Hu Li Tai Shao （Hts） = 细胞骨架光谱体/烟团 [45]，碘化丙啶 （PI） = DNA）。具体来说，与未感染的卵巢相比，w Mel 感染的 mei-P26 敲低卵巢表现出更正常形成的囊肿，由生殖系衍生的护士细胞周围的体细胞衍生的卵泡细胞和卵母细胞组成。异常表型包括缺乏卵泡细胞外部（图1K和1M）、种系来源内部（图1M和1N）或正常数量的分化护士细胞（图1O）的囊肿。

这些一系列 mei-P26 等位基因、RNAi 敲低和宿主年龄的比较数据表明，wMel 在早期宿主卵子发生中挽救了 mei-P26 的发育功能。相比之下，wMel 并不能挽救 mei-P26 在减数分裂中的作用。wMel 感染未挽救分离缺陷，如感染和未感染的 mei-P26[1] 纯合子亚型的 X 染色体不分离 （NDJ） 率升高所表明的那样（NDJ = 7.7% 和 5.6% 通过实验，S6A 和 S6B 图）。在以下各节中，我们分析了 wMel 在早期卵子发生的每个关键时间点挽救 mei-P26 功能的能力。

宿主 GSC 在 wMel 感染的果蝇中维持率高于未感染的 mei-P26 缺陷果蝇

通过对“年轻”4-7日龄（图2）和“老年”10-13日龄雌性（S7A-S7C图）的基本GSC标志物pMad和Hts进行免疫荧光染色来定量GSC。pMad 染色阳性表明细胞对来自周围体细胞 GSC 生态位细胞的静止信号有反应。Hts染色阳性需要定位到单个点状光谱体，而不是分支模糊体[46]。

缩略图 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 2. wMel 感染挽救了 mei-P26 诱导的女性 GSC 维持缺陷。

（A-E）与未感染的果蝇相比，感染 wMel 使 mei-P26[1] germaria 中每个细菌的 GSC 数量更高。（A-D）D的共聚焦平均投影。黑腹果蝇 germaria 染色有针对 Hts 和 pMad 的抗体。（E） 每个天瑕菌中GSCs数量的小提琴图。由于功能齐全的 GSC 表达 pMad 并具有 Hts 标记的光谱体，因此每个光谱体的权重减半，从而获得部分分数。Wilcoxon 秩和检验 * = p<0.05， ** = 0.01， *** = 0.001， **** = 1e-4.（F-J）通过 pHH3 表达检测的有丝分裂 GSC 显示，相对于未感染的 GSC，w Mel 恢复了亚态性 mei-P26 GSC 的有丝分裂。 （F–I） D 的共聚焦平均投影。黑腹果蝇 germaria 染色有针对 Hts 和 pHH3 的抗体。（J） 在雌性菊花中发现表达 pHH3 的 GSC 比例的堆积条形图。费舍尔精确检验 * = p < 0.05。荧光通道按顺序采样并叠加，如每组图所示：青色 = 抗 Hts，黄色 = 抗 Vas，红色 = PI，绿色 = 抗 pMad in （A–D） 和抗 pHH3 in （F–I）。比例尺 A–D = 10 μm 和 F–I = 25 μm。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。GSC，生殖系干细胞;pHH3，磷酸化组蛋白H3。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g002

染色显示，在4至7日龄的年轻果蝇中，相对于未感染的幼蝇，每个mei-P26[1]幼稚叶中wMel感染的GSC平均数量增加（感染/亚型：1.0与未感染/亚型：0.58，p< = 2.9e-4 Wilcoxon 秩和检验，S8 表），但 GSC 维持未达到 OreR 野生型率（感染/WT： 2.3 和未感染/WT：1.9，p< = 1.2e-4 至 2.8e-4 Wilcoxon 秩和检验，图 2A-2E 和 S8 表）。w与未感染的菊叶相比，Mel感染的mei-P26[1]菊叶还具有更多的细胞表现出其他GSC特性，例如大细胞质和对体细胞生态位帽细胞的物理附着[46]。与mei-P26[1]等位基因相比，mei-P26的RNAi敲低对每个生殖器的GSC数量没有显着影响（感染/RNAi：2.1和未感染/RNAi：1.9，S7A-S7C图和S8表），表明适度减少mei-P26剂量对分化的影响比GSC维持更强。 由于 wMel 感染，OreR 野生型 germaria 没有表现出不同数量的 GSC（图 2C–2E 和 S8 表）。

在10至13日龄的幼龄幼虫中，w Mel感染的mei-P26[1]雌性中每个幼稚虫的GSC数量收敛于OreR野生型值（S7C图）。随着野生型果蝇年龄的增长，每个幼稚虫的GSC数量自然下降[47]，即使在wMel感染的果蝇中也是如此（老化/感染/WT：1.6 vs 年轻/感染/WT：2.3，p< = 0.019 Wilcoxon秩和检验，图2C–2E和S7C和S8表）。 随着年龄的增长，感染和未感染的mei-P26[1]雌性似乎都保留了一些GSC（年龄/感染/亚态：1.5和年龄/未感染/亚态：0.94，p< = 0.013–0.014 Wilcoxon秩和检验，S7C图和S8表）。虽然OreR野生型感染和未感染的果蝇在前2周内丢失了3%至31%的GSC，但感染和未感染的mei-P26[1]果蝇在这段时间内将其GSC丰度分别增加了43%和63%（S7C图），可能是通过募集差异化的GSCs[48]。考虑到GSC保留的两种年龄依赖性轨迹，当wMel感染的mei-P26[1]幼稚虫10至13天大时，它们所含的每只幼稚虫的GSC平均数量与野生型果蝇相同，并且GSCs明显多于未感染的mei-P26[1]果蝇（p< = 0.015 Wilcoxon秩和检验，S7C图和S8表）。因此，沃尔巴克氏体增强了年轻和老年mei-P26[1]女性的干细胞维持。

受感染的mei-P26[1] GSC具有功能性，如其按有丝分裂的能力所示（图2F-2J和S9表）。我们通过抗磷酸化组蛋白H3丝氨酸10（pHH3）染色阳性鉴定了有丝分裂细胞核，pHH3是Cdk1激活和有丝分裂进入的特异性标志物[49]。未感染的 mei-P26[1] germaria 中有丝分裂的 GSC 明显少于感染的 mei-P26[1] 和未感染的 OreR 野生型 germaria（0.09% vs 6%，p = 4.7e-2 和 4.6e-2 Fisher 精确检验，图 2F-2J 和 S9 表）。未感染和感染的野生型天芽虫在有丝分裂中GSCs的频率没有差异（5%至6%，图2H-2J和S9表）。有丝分裂的成胱细胞和囊细胞仅在感染的 mei-P26[1] germaria 中显着富集，与感染的野生型 germaria 相比 （p< = 1.3e-2 Wilcoxon 秩和检验，S7D 图 和 S10 表），尽管转运扩增 （TA） 有丝分裂期间的过度复制是未感染的 mei-P26[1] germaria 的常见表型（下文讨论和 [50]）。

在wMel感染的germaria中挽救了宿主Sxl表达的调节

GSC的维持和分化需要适当的Sxl表达[51]。GSC中高水平的Sxl维持干细胞静止[52]。当GSC分裂且CB远离生态位时，Sxl与Bam和Mei-P26合作，与nos 3′非翻译区（UTR）结合，并下调Nos蛋白水平以促进分化[50,53]。

我们通过对整个卵母细胞进行共聚焦显微镜，量化了用抗 Sxl 抗体染色的整个卵巢中的 Sxl 定位模式，揭示了 wMel 感染减轻了由于 mei-P26 丢失引起的 Sxl 失调（图 3）。相对于OreR野生型（p< = 5.7e-10至5.3e-5 Wilcoxon秩和检验，图3A-3B'与3F-3H'和3I，S7E图和S11表）在未感染的mei-P26[1]日耳胶区域1中表达较少的Sxl在区域2a和2b中表达。与未感染的mei-P26相比，wMel感染增加了Germarium区域1的Sxl表达，对区域2a没有影响，并抑制了区域2b的表达[1]，复制了类似于野生型germaria中的表达模式（p< = 5.7e-10至8.4e-3 Wilcoxon秩和检验，图3A-3B'与3C-3E'和3I以及S7E和S11表）。有趣的是，w Mel 感染可能会影响 OreR germaria 中 Sxl 的表达，因为相对于未感染的 germaria，w Mel 感染的 2a 区蛋白质显着升高（图 3I）。 因此，wMel的存在可以部分挽救mei-P26缺失导致的Sxl失调，这表明w Mel的mei-P26挽救机制可能是wMel感染的Sxl突变体中Nos调节的基础[31,34]。

缩略图 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 3. wMel 感染可减轻功能失调的 mei-P26 对天疣中 Sxl 表达的影响。

（A-H'）D的共聚焦平均投影。黑腹果蝇germaria染色有针对Sxl和pMad的抗体。显示了每种mei-P26[1]感染状态的三种表型，（左）一种尽可能与野生型相似，（中）一种代表GSC缺失，pMad阴性，（右）一种代表保留pMad阳性GSC的发育改变表型。我们连续对荧光通道进行采样，并按照每组图像的指示叠加它们：青色 = 抗 Sxl，红色 = PI，绿色 = 抗 pMad。比例尺 = 25 μm。（I） 按区域划分的整个天竺葵中相对 Sxl 荧光表达水平的条形散射图（A'–H' 中 Sxl 通道图像上的黄色轮廓）。图1A-1D和2E中标记的颜色，从左到右：深灰色=w梅尔感染的OreR，浅灰色=未感染的OreR，深粉色=w梅尔感染的mei-P26[1]，浅粉色=未感染的mei-P26[1]。Wilcoxon 秩和检验 * = p<0.05， ** = 0.01， *** = 0.001， **** = 1e-4。（J） mei-P26[1] germaria 中 wMel Sxl 表达挽救的模型。绿色虚线表示 wMel 对 GSC 中 pMad 表达的上调（图 2A–2E）。紫色虚线表示 wMel 在 GSC/CB 中对 Sxl 的上调和天瑕疱区域 2b 对 Sxl 的下调。带有 + 符号的箭头表示 wMel 对基因表达的作用。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。CB， 膀胱母细胞;GSC，生殖系干细胞;俄勒冈州R;PI， 碘化丙啶。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g003

Bam 表达在 wMel 感染的 mei-P26 突变体中部分恢复

在野生型雌性果蝇中，Bam表达在成胱母细胞子细胞远离其未分化的姐妹细胞后立即开始，该姐妹细胞仍与GSC生态位结合（[50,54]，如图1P所示）。Bam与fusome结合并稳定CyclinA以促进TA有丝分裂，从单个CB产生16个囊肿细胞[55]。紧接着这 4 个有丝分裂，Bam 表达在野生型卵巢中下调，以将生殖系囊肿限制为 16 个生殖系来源的细胞。

通过抗 Bam 免疫荧光共聚焦成像和定量，我们确定 wMel 感染减轻了 mei-P26[1] germaria 中 Bam 失调的各个方面（图 4）。Mei-P26 的缺失使 Bam 表达失调并将 Bam 表达扩展到天疣区域 1 之外（图 4A-4B“与 4C-4F”和 4G;S7F图和S12表），产生过量的护士样细胞[50]。与未感染的 germaria相比，w Mel 感染使 mei-P26[1] germaria 在 CB 至 16 细胞阶段的 Bam 上调 （p< = 0.016，图 4G）。在Mel感染的mei-P26[1]germaria的2a和2b阶段，Bam也可能下调，因为未感染的germaria表达的Bam明显高于野生型（p< = 0.019 Wilcoxon秩和检验，图4G和S12表），而wMel感染的germaria则不然（图4G和S12表）。不幸的是，样本之间mei-P26[1] Bam荧光强度的差异太大，无法确定未感染和感染的germaria在16细胞阶段后的Bam表达是否不同。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 4. wMel 感染减轻了功能失调的 mei-P26 对 Bam 在天窖中表达的影响。

（A-F“）D的共聚焦平均投影。黑腹果蝇 germaria 染色有针对 Bam 和 pMad 的抗体。显示了每种mei-P26[1]感染状态的两种表型，（左）一种尽可能与野生型相似，（右）一种代表发育改变的表型。（G） 按区域划分的整个天疽细菌中相对 Bam 荧光表达水平的条形散射图（A'–F' 中 Bam 通道图像上的黄色轮廓）。我们将区域 1 细分为 GSC 和 CB/囊细胞亚段，因为 Bam 在 CB 中的表达增加。（H） 相对Bam与pMad荧光之比的条形散射图。由于 pMad 和 Bam 表达分别在 GSC 和 CB/囊细胞中相互排斥，因此 OreR 野生型值接近于零。明显高于此值的值反映了干细胞状态的失调。（I） wMel 拯救 mei-P26[1] germaria 中 Bam 表达的模型。图1A-1C、2E和3I中标记的颜色，从左到右：深灰色=w梅尔感染的OreR，浅灰色=未感染的OreR，深粉色=w梅尔感染的mei-P26[1]，浅粉色=未感染的mei-P26[1]。Wilcoxon 秩和检验 * = p<0.05， ** = 0.01， **** = 1e-4。比例尺 = 25 μm。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。CB， 膀胱母细胞;GSC，生殖系干细胞;俄勒冈州俄勒冈州 R.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g004

wMel 感染会改变 GSC 和 CB 中 Bam 的表达，以分别达到与野生型 germaria 相似且更极端的表达谱（图 4H 和 4I）。在GSC生态位中，感染和未感染的mei-P26[1]germaria的Bam表达均低于野生型（图4G）。这与文献的预期形成鲜明对比：来自体细胞生态位的骨形态发生蛋白（BMP）信号转导诱导GSC中的pMad表达，直接抑制Bam转录，阻止分化[56]。GSC中mei-P26功能的丧失应使Brat去抑制，导致pMad抑制和Bam表达不当[38]。然而，我们看到 wMel 感染和未感染的 mei-P26[1] GSC 中 Bam 表达低于 OreR 野生型 （p< = 1.3e-6 至 1.4e-3 Wilcoxon 秩和检验，图 4G 和 S13 表）。未感染的mei-P26[1] GSCs中相对Bam/pMad表达比率升高（p<=2.5e-4至4.0e-4 Wilcoxon秩和检验，图4H和4I和S13表）可以解释这种偏离预期的原因。尽管GSC Bam的表达低于野生型，但与pMad表达相比，Bam表达明显失调和上调，这与失去干细胞身份的生殖细胞的预期一样[57,58]。针对 pMad 表达的归一化也强化了以下发现：在CB 至 16 细胞阶段，w Mel 将 mei-P26[1] 亚型的 Bam 表达水平提高到高于野生型水平 （p< = 1.2e-6 至 2.0e-2 Wilcoxon 秩和检验，图 4H 和 4I 和 S13 表）。

wMel 挽救因 mei-P26 敲低而受损的正常生殖系囊肿和卵母细胞发育

Mei-P26缺陷的苍蝇过度增殖护士细胞并部分分化GSCs以产生肿瘤生殖系囊肿（[38,39]和图5A-5D与5E-5H，图5I和S14表）。在RNAi敲除卵巢中，wMel感染显着减轻了肿瘤生殖系囊肿的形成（35.3%和16.3%的囊肿超过15个护士细胞;p = 4.5e-3 Fisher 精确检验，图 5E 和 5F 与 5G 和 5H 以及 S14 表）。相比之下，在mei-P26[1]等位基因germaria中发现的种系囊肿肿瘤没有被wMel感染挽救，尽管该细菌能够挽救这些卵孵化成后代的速度（图5I与图1A和1C），但与它们在germarium区域2a和2b中Bam表达的失调一致（图4G）。mei-P26[1]等位基因相对于nos驱动的RNAi敲低的更强性质可能是肿瘤囊肿数量差异的基础。缺乏肿瘤挽救表明，肿瘤囊肿以某种速率产生正常卵子，或者 wMel 感染在卵子发生后期挽救肿瘤，可能是通过某种体细胞机制[59\u201262]。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 5. wMel 感染挽救囊肿肿瘤并恢复 mei-P26 突变体的卵母细胞规格。

（A-I）Mei-P26 的缺失和过表达诱导肿瘤囊肿的形成，其中含有超过 15 个护士细胞。wMel 感染可减轻 nos>mei-P26 RNAi 敲低并加剧 nos>mei-P26 OE 表型。（A-H）D切片约25μm厚的共聚焦最大投影。用 PI 染色的黑腹果酸卵母细胞囊肿。（I） 含有异常数量护士细胞（少于或大于 15 个护士细胞）的种系囊肿比例的堆积条形图。（J-R）与未感染的囊肿相比，感染wMel的亚形性mei-P26[1]囊肿显着恢复了Orb翻译调节。卵母细胞规格发生在天竺葵的2b-3区域（见图1P中的图表），此时球体表达仅限于新生卵母细胞。（J-Q'）D的共聚焦平均投影。黑腹果蝇 germaria 染色有针对 Orb 和 Vas 的抗体。（R） 含有卵母细胞特异性 Orb 染色的种系囊肿比例的堆积条形图。样本量写在条形图上。N = 否，M = 可能，Y = 是。费舍尔精确检验 ** = p<1e-2， **** = p<1e-4。比例尺 = 50 μm。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。OE： 过表达;PI， 碘化丙啶。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g005

mei-P26 的过表达在未感染和感染的卵巢中产生肿瘤;然而，感染的卵巢比未感染的卵巢表现出更多的肿瘤（p = 1.6e-3 Fisher 精确检验，图 5I 和 S14 表）。发现过量的 mei-P26 概括了由 mei-P26 缺乏诱导的肿瘤表型，表明该基因对其自身功能产生浓度依赖性显性负面影响。鉴于 w Mel 感染使这种显性阴性表型更加严重，我们假设 wMel 可能通过直接相互作用或冗余功能产生增强 Mei-P26 功能的因子。

w Mel感染会增加mei-P26[1]种系囊肿中卵母细胞特异性球体定位的速率（图5J-5R和S7G和S15表），表明wMel挽救了功能性囊肿的形成。天竺葵区域2a的卵母细胞规格（见图1P中的图表）通过球体翻译的去抑制而丢失mei-P26[38]。Mei-P26 与球体 3′ UTR 结合并阻止其平移。在囊肿模式化和发育后，16个种系来源的细胞中的一个通过特异性oo18 RNA结合蛋白（Orb）表达被指定为卵母细胞[63]。在2a区，注定要成为卵母细胞的生殖系囊肿细胞激活球体翻译[38]。mei-P26缺失导致球体去抑制和非特异性表达[38]。与未感染的囊肿相比，wMel感染可恢复mei-P26[1]囊肿中卵母细胞特异性Orb表达（p = 5.9e-9 Fisher精确检验，图5L-5N'与5O-5Q'和S15表）。我们观察到野生型囊肿中卵母细胞特异性球体染色率为93%至94%，而mei-P26[1]将这一频率降低到25%，wMel感染将mei-P26[1]囊肿恢复到61%（S15表中的计数）。在 wMel 感染的囊肿中，Orb 的卵母细胞特异性表达是稳健的，即使在那些发育异常的囊肿中（例如，图 5M–5M' 中的双卵母细胞）。这些结果表明，wMel 挽救了卵母细胞特异性的 Orb 翻译，增强或复制了 Mei-P26 在 Orb 翻译抑制中的功能。

OreR 野生型宿主生育力受到 wMel 感染的有益影响

与 wMel 挽救包含一系列功能的基本种系维持基因的部分或完全丧失的能力一致，我们发现这种细胞内共生体可以增强 D 的生育能力。黑腹果蝇种群显示出完全的野生型繁殖力（图1C和S8A-S8C和S4-S6表）。我们独立分析了产卵、卵孵化和总体后代生产率，以检测 wMel 对生育力多个组成部分的影响。与未感染的雌性相比，wMel感染的nos：Gal4 / CyO雌性每天每只雌性的总后代产量增加了49%（27（未感染）与40（感染）后代/雌性/天，p< = 2.2e-3Wilcoxon秩和检验，S8A图和S4表）。感染wMel使nos：Gal4/CyO平衡种群的每只雌性每天产卵数增加了49%（42个卵 vs 28个卵/雌性/天，p< = 2.2e-3 Wilcoxon秩和检验，S8B图和S5表），但对其他具有野生型生育力的基因型的产卵率没有任何可检测的影响。胚胎发生后，wMel 感染使 OreR 和 nos：Gal4/CyO 野生型卵孵化成 L1 期幼虫的速率分别提高了 5.2% 和 2.5%（88% 和 91%（感染）与 83% 和 89%（未感染）孵化的卵，p< = 1e-4 至 2.1e-3 Wilcoxon 秩和检验，图 1C 和 S8C 和 S6 表）。这些结果表明，wMel 感染的有益影响是显而易见的，但在 D 之间却存在差异。具有野生型生育力的黑腹果蝇种群。

我们测量了 OreR 在其整个生命周期（约 50 天）中的生育力，发现相对于未感染的果蝇，wMel 可能产生更高的终生繁殖力（图 6A-6C 和 S7 表）。OreR雌性按照图6A-6C的x轴指示年龄，并与感染状态匹配的3至7日龄雄配。w随着果蝇年龄的增长，Mel感染保持较高的OreR卵孵化率（p< = 7.1e-9 Kolmogorov-Smirnov测试，图6C和S7表），同时保持与未感染果蝇相似的产蛋水平（图6B和S7表）。这最终导致受感染的果蝇相对于未受感染的果蝇可能产生过量的后代的年龄范围（参见果蝇大约20至30天龄时的回归置信区间之间的差距，图6A）。感染引起的孵化率升高给宿主带来的效率提升可能会累积起来，以获得更高的终生健康，因为资源可以更有效地转化为后代。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 6. 沃尔巴克氏体的 wMel 菌株增强了 OreR 野生型生育力。

（空调）D. melanogaster OreR 繁殖力与女性年龄的关系，与局部多项式回归拟合（深灰色边界 = 95% 置信区间）。wMel 感染可能通过持续提高 （C） 孵化率，在宿主生命周期的时间点提高 （A） 后代和 （B） 卵子后代的产量。（D-F'）D的共聚焦平均投影。黑腹肌 （D–D'） 感染和 （E-E'） 未感染的幼乳和 （F–F'） 感染的卵巢。细胞内 wMel FtsZ 定位于种系 （Vas+，用黄色虚线勾勒）和体细胞 （Vas-） 细胞，在感染的 OreR 野生型果蝇中以高滴度，在未感染的果蝇中具有低背景。GSC（*靠近Hts结合光谱体）中的细菌用箭头表示。荧光通道按顺序采样并叠加，如每组图像所示：青色 = 抗 Hts，黄色 = 抗 Vas，蓝色 = 抗 FtsZ，红色 = PI。比例尺 F–G = 10 μm，H = 50 μm。这个数字背后的数据可以在 S3 表和 doi.org/10.7291/D1DT2C 的 Dryad 上找到。GSC，生殖系干细胞;俄勒冈州R;PI， 碘化丙啶。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g006

抗 FtsZ 的免疫染色证实，wMel 在 OreR 野生型天瑕疱中表现出高滴度，并在早期囊肿的卵母细胞中浓缩（图 6D–6F'）。细胞内细菌连续位于种系中，从GSC开始，一直持续到胚胎发生和受精结束。因此，wMel在正确的时间位于正确的位置，通过与GSC和卵母细胞囊肿的相互作用来增强女性宿主的生育能力，并纠正由男性CI相关改变引起的扰动[64]。

沃尔巴克氏体的 wMel 菌株在其原生 D.黑腹肌宿主的CI较弱，随着年龄的增长而降低（S9A–S9D图），表明CI机制维持率低[8]。将感染 wMel 的 OreR 雄性与感染的 OreR 雌性（“救援杂交”）和未感染的 OreR 处女雌性（“CI 杂交”）交配后发现，当雄性 0 至 1 日龄时，wMel 将未感染的卵孵化减少 26%（p< = 4.6e-4 Wilcoxon 秩和检验，S9A 图和 S6 表），但这种中等效应在雄性 5 天大时被消除， 平均（S9C 图和 S6 表）。只有年轻的雄性显着影响后代的产生（p< = 1.7E-2 Wilcoxon 秩和检验，S9B 和 S9D 图和 S4 表）。相比之下，自然感染模拟果蝇（Riv84系）并诱导强CI的Wolbachia wRi菌株[10,65]，当雄性0-1日龄时，未感染的卵孵化率降低了95%（p<=5.6e-8 Wilcoxon秩和检验，S9E图和S6表），并且在5天时仅失去部分功效（孵化减少75%， p< = 3.6e-4，Wilcoxon 秩和检验;S9G图，S6表）。这显着影响了整体后代产量（p< = 6.5E-7 和 5.0E-2 Wilcoxon 秩和检验，S9F 和 S9H 图 和 S4 表）。CI 后代的祖母 3 至 7 日龄（即相对较年轻），导致 D 的 CI 较弱。黑腹果蝇杂交[17]。总体而言，这些结果表明，wMel 有益的生殖操作可能比其在自然界中的负面生殖操作更能影响其适应性。

wMel介导的mei-P26[1]挽救可以通过挽救和扰乱宿主转录来实现

通过双真核和细菌RNA测序（dual-RNAseq）探索w Mel对OreR和mei-P26[1]卵巢中宿主基因表达的影响，发现感染以多种方式显着改变宿主基因表达（图7A-7C和S16-S19表），这表明wMel介导的生育挽救的一些潜在机制。在 D 的 35,344 份成绩单中。黑腹果蝇基因组，10,720 个在每个基因型 + 感染组的 6 个样本中至少 5 个样本中以足够高的水平表达，以纳入分析。在 wMel 基因组的 1,286 个基因中，有 663 个在 D 中表达。黑腹肌卵巢（图7D和S20表）。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 7. wMel 和 D 的差异表达分析。来自宿主卵巢的黑腹果蝇基因揭示了 mei-P26 敲低和感染影响全球表达模式。

（A-D）在每个面板中进行的测试中，基因表达的 log2 倍变化与 log10-FDR 调整 p 值 （padj） 的火山图。（E-K）（E） padj 和 （F–K） D 的 3 个顶级基因型相关 （~G） Wald 测试命中的归一化转录本计数图。黑腹果蝇基因与感染 （~I） 显著相关 （padj< = 1e-3） 或基因型和感染 （~G*I） 共同相关，按差异表达模式组织。参见 S10–S15 图，了解其他有效和不显著的计数图。在所有条形图中，深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。俄勒冈州俄勒冈州 R.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g007

未感染和wMel感染的亚态性mei-P26[1]卵巢相对于OreR卵巢（S2B和S2D图）表现出5倍的mei-P26表达减少，并且由于FDR校正后mei-P26[1]等位基因的1,044个其他基因显着失调（Wald检验FDR调整的p值（padj）< = 0.05，图7A，7E和S10A和S17表).由于 mei-P26 的丢失和功能障碍导致的基因表达变化远远超过并超过感染引起的基因表达变化，在任一 D 中。黑腹果蝇基因型，并强调 MEI-P26 作为基因表达的全局调节因子的重要性。这个数字远远超过了被认为参与GSC自我更新的366个基因[66]，强调了mei-P26参与了从种系分化[50]到体细胞发育[61]的多个过程。在生物过程、细胞成分和分子功能GO类别中，mei-P26的缺失影响了染色质、重组、蛋白质-蛋白质相互作用和肌肉细胞分化的过程（S10B–S10G图），支持mei-P26在遗传抑制、分化和减数分裂中的已知作用[38,40,50]。

感染 wMel 显着改变数百个 D 的表达。黑腹果蝇基因，以恢复或补偿 mei-P26 调节的基因表达。我们在完整模型下测试了与 DESeq2 感染状态显着相关的基因：~基因型 + 感染 + 感染*基因型，揭示了 422 个显着差异表达的基因（Wald 检验 padj< = 0.05，图 7B 和 S18 表）。检测感染与基因型之间相互作用的影响，产生了另外 20 个显着差异表达的基因 （Wald test padj< = 0.05;图7C和S19表）。最显着的差异表达基因如图7F-7K所示，其他重要基因如图8、S11和S12所示。分箱基因表达模式显示，wMel感染诱导突变卵巢中至少有6种主要的挽救基因表达表型：完全挽救、过冲、下冲、野生型效应、反向效应和新奇（图7F–7K、8A、8C、S11A、S11B、S12A和S12B）。在“完全抢救”表型（图7F和S11A）中，mei-P26[1] wMel基因表达与OreR水平难以区分，与未感染的mei-P26[1]水平显着不同。“超调”表型（图7G）的表达与未感染的mei-P26[1]敲低效应相对于OreR表达的方向明显相反。相反，“下冲”表型（图7H）是对mei-P26[1] wMel卵巢中OreR表达的部分校正。一种“野生型效应”基因，即内质网和高尔基体细胞骨架膜锚定蛋白，仅在 wMel 感染和未感染的 OreR 卵巢之间表现出差异表达（图 7I）。五个基因表现出“反向”差异表达表型，例如钠同向转运蛋白（图7J）和转录因子Chronophage（S12A图），其中mei-P26[1]和OreR卵巢相对于未感染的基因型表现出相反的差异表达变化。总共只有这6个“野生型效应”和“反向”基因在OreR卵巢中因感染而差异表达。最后，“新”基因（图7K）是那些仅在wMel感染的mei-P26[1]卵巢中表现出差异表达的基因，表明这是一种新的挽救或补偿途径。例如，在感染和未感染的mei-P26[1]卵巢中，过表达2（sordd2）泛素连接酶mRNA表达时抑制视网膜变性疾病1的抑制，而没有挽救（图7E）。SKP1相关C（skpC）是SCF泛素连接酶的下调成分之一（图7K），它可能补偿了sordd2的上调。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 8. 文献中预测的Mei-P26相互作用得到了卵巢双RNAseq结果的支持。

（甲、乙）预测 mei-P26 （A） 蛋白质和 mRNA 物理相互作用和 （B） 遗传相互作用。基因名称附近的符号表示显著的 DE 相互作用：* = 基因型显著性;r = 感染显著性，表示挽救表型;_ = 仅通过未校正的 p 值得出显著性。A中的红色“X”表示在我们的数据集中未表达的基因（CG6304和mir-137）。（C） 用 A 和 B 中的符号指定的基因的归一化转录本计数图。在所有条形图中，深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。（D） 87 （~G*I） DE 基因的细胞成分 GO 项揭示了早期种系细胞骨架结构和膜蛋白的富集。括号中给出了列出的 padj 和 p 值的 Wald 检验关联，如图 7 所示：基因型 （~G）、感染 （~I）、基因型*感染 （~G*I）。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。俄勒冈州俄勒冈州 R.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g008

与感染相关的GO术语以及感染与基因型之间的相互作用（图S11C-S11G、S12C-S12G和8D）与wMel已知的与宿主肌动蛋白[67]、微管、运动蛋白[68-70]、膜相关蛋白[71]和染色质[72]结合的能力一致].感染相关基因在GO术语中富集，表明细胞骨架发育功能与染色质相互作用（S11C-S11G图）。在生物过程、细胞区室和分子功能类别中，基因在表明与肌动蛋白、肌球蛋白、收缩纤维和肌肉细胞分化的相互作用方面得到了丰富。染色质相互作用通过与凝聚素复合物、着丝粒和有丝分裂染色体的结合来指示。除了质膜/细胞连接相关术语（如细胞连接和突触结构维持、细胞皮层以及脂质和钙调蛋白结合）外，基因型感染相互作用相关基因还富集了细胞骨架和染色质相互作用 GO 术语（S12C–S12G 图）。

有趣的是，2种绒毛膜蛋白（图7F）、一种蜕皮类固醇22激酶相关蛋白（S11A图）和一种雌激素相关受体（ERR）（S12A图）可能参与绒毛膜的形成[73]。考虑到我们发现mei-P26[1]胚胎在用漂白剂处理时比OreR野生型胚胎具有更弱的冠状体，这一发现表明mei-P26具有新的绒毛膜相关功能，并且wMel具有新的挽救表型。

在对 p 值进行 FDR 校正后，663 个转录的 w Mel 基因在 OreR 和 mei-P26[1] 宿主基因型之间均未显著差异表达（图 7D、S13 和 S14 和 S20 表），表明 wMel 组成型表达基因对宿主的调控。平均而言，wMel 转录组的测序深度为 7.8 至 42.4×覆盖深度和 D。黑腹肌转录组的测序范围为25.9至35.9×（S16表）。虽然这些覆盖范围重叠，但检测到的 663 wMel 基因仅跨越了 -1.5 倍的耗竭到 1.3 倍的上调（S20 表）。相比之下，10,720 表示 D。黑腹果蝇基因的差异表达要高出一个数量级，耗竭 ?10.041 倍，上调 9.866 倍（S17–S19 表）。因此，与 D 相比，wMel 基因的差异转录较弱。黑腹果蝇基因，表明 wMel 可能通过组成型表达蛋白的下游影响来改变宿主表型。为了探索 wMel 表达的组成效应，我们测试了表达的转录组中 GO 通路富集（S13 图）。大量检测到 DNA 复制、蛋白表达、膜转运和异养（例如氧化磷酸化）的途径。虽然这些基因中有许多可能参与正常的细菌细胞维持和复制，但氧化磷酸化、翻译、转录和膜功能途径的显着富集（S13A图）表明，其中一些基因可能被用于宿主操作或处理宿主资源。

在1,044个显着差异调节的D.受mei-P26敲低和感染影响的黑腹肌基因是文献预测的6个基因（共24个），（padj<=0.05 Wald检验，9个基因（共24个）p值<=0.05;图8和S1以及S1和S2表）。 mei-P26 功能的丧失导致 oo18 RNA 结合蛋白 （orb）、gawky （gw）、性致死 （sxl）、良性性性细胞肿瘤 （bgcn）、肿瘤睾丸 （tut） 和矮脚鸡 （mir-ban） 的失调 （padj< = 0.05 Wald 检验，图 8A 和 8B 中的图 8C 和 *）。Bam、Pumilio （pum） 和 Justice Seizure （jus） 表达可能因敲低 mei-P26 而改变，但需要额外的样本来解析高感染方差（例如，mir-ban）和低差异表达变化（例如，gw）（p 值< = 0.05 Wald 检验，图 8C 和图 8A 和 8B 中的“*”）。6 个基因中有 2 个表现出具有“下冲”拯救表型（图 8A 和 8B 中的“r”）的 w Mel 拯救证据：bgcn 和 tut by padjust（图 8C）。如果我们考虑具有显着未调整 p 值的基因，gw 也可能表现出“下冲”拯救的证据（图 8C，图 8A 中的“r”）。矮脚鸡或mir-ban表达抑制也可以挽救，但wMel mei-P26[1]卵巢之间的高差异排除了该数据集的DE挽救检测（图8C）。相反，orb、sxl、bam 和 nos 转录水平不会因 mei-P26 敲低或 wMel 感染而改变，因此必须在转录后进行调节。总的来说，这些差异表达结果加强并扩展了我们对 wMel 如何在转录和转录后水平上挽救和加强宿主繁殖的理解。

讨论

沃尔巴克氏体的 wMel 菌株是一种成功且广泛的共生体：自然存在于 D 中。黑腹果蝇种群[19,20]，以及通过实验室产生的wMel反式感染到用于生物控制的非本地宿主[3]。然而，我们对塑造共生体和宿主如何共同进化并找到互利繁殖机制的过程知之甚少。在这项工作中，我们确认 wMel 的 CI 强度在 D 中通常较弱。黑腹果蝇，（图9A-9D，[14-18]），并表明wMel通过加强宿主GSC维持和配子分化对宿主生育能力有益（图1-8）。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

图 9. wMel 与重要宿主基因在早期 GSC 维持和种系囊肿形成中的相互作用模型。

（A） 在 mei-P26 突变体中，w Mel 通过各种机制恢复正常的 Bam、Sxl 和 Orb 表达，其中大多数机制是未知的（??? = 未知的 wMel 因子）。蛋白质和 mRNA 表达挽救与通过种系囊肿分化从 GSC 维持的细胞学挽救相关。（B） GSC 中的 Sxl 挽救是通过 TomO 与含有 nos mRNA 的 RNP 相互作用介导的，从而上调 Nos 翻译。后来，在囊肿卵子发生的第8阶段，发现TomO与球体mRNA结合，取代了翻译阻遏蛋白Cup，并上调了球体翻译[34,35]。A 中的虚线箭头表示 TomO 在早期囊肿分化中启用 Orb 去抑制的预测功能。在 mei-P26 突变体中恢复 mei-P26 对 Orb 翻译的抑制作用的因子尚未确定。GSC，生殖系干细胞;RNP，核糖核蛋白;TomO，卵子发生的毒性操纵剂。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.g009

在这里，我们证明 w Mel 感染可以通过纠正受干扰的基因表达模式来增强 OreR 野生型和 mei-P26 突变体的宿主生育能力，并且我们揭示了 wMel 如何有益地影响宿主繁殖的长期谜团。此前，wMel 被证明可以挽救 Sxl [31] 和 Bam [32] 的部分损失，这是早期卵子发生 2 个截然不同阶段的 2 个基本基因：GSC 维持和 CB 分化以及 TA 有丝分裂。这些发现尚未解决 wMel 如何抑制这些机制和时间上不同的细胞过程，并表明 mei-P26 不参与 [31]。我们通过一系列等位基因和发育测定表明，wMel 感染可以挽救与突变 mei-P26 相关的缺陷，mei-P26 是 GSC 维持和分化所需的基因。wMel 感染可挽救 mei-P26 RNAi 敲低以及亚态和无效等位基因中卵子发生的所有阶段（图 1-5、7、8、S4-S7 和 S10-S12 和 S4-S15 和 S18 和 S19 表）。Mei-P26 是一种 TRIM-NHL 蛋白，通过 Nos mRNA 结合复合物、与 RNA 诱导的沉默复合物 （RISC） 相互作用和蛋白质泛素化进行 mRNA 翻译抑制来调节基因表达 [38,74]。重要的是，Mei-P26与GSC和CB中的Sxl以及CB和囊细胞中的Bam相互作用[36,50]。这些相互作用表明，wMel 用于挽救 mei-P26 功能的机制也可能负责挽救 Sxl 依赖性 GSC 维持和 CB 分化以及 Bam 依赖性囊肿分化方面。

在对 w Mel 介导的 GSC 维持和分化操作的深入分子和细胞分析中，我们发现 wMel 通过校正扰动的 pMad、Sxl、Bam 和 Orb 蛋白表达以及 bgcn 和 tut mRNA 表达来挽救 mei-P26 种系缺陷朝向 OreR 野生型水平（如图 9A 所示）。与野生型果蝇相比，w Mel感染部分挽救了GSC特异性pMad表达（图2A–2E），表明细菌从体细胞GSC生态位恢复了BMP信号传导[38]。发现这些细胞也能够分裂（图2F-2J），进一步支持它们的功能和干性。鉴于mei-P26可能参与果蝇Myc（dMyc）调控，并且dMyc的过表达诱导竞争性GSCs[75]，wMel的GSC挽救机制可能涉及dMyc上调。虽然，我们的转录组学数据表明 dMyc 在转录水平上没有被显着抑制（S15 图）。在离开生态位的生殖细胞中，wMel总结了pMad、Sxl和Bam表达的适当定时变化，这些变化通常受mei-P26的影响，并且在膀胱母细胞分化过程中形成16细胞生殖系囊肿[39,40,50,74]（图3,4和S7E–S7F）。虽然 bam 下调未被 wMel 完全挽救（图 4），但发现 wMel 感染的 mei-P26[1] germaria 中 tut mRNA 表达部分降低（图 8）表明，女性（如男性 [76]）中 Tut、Bam 和 Mei-P26 之间可能存在未报告的调节相互作用，这可以挽救 Bam 在生殖系囊肿发育晚期中的过度表达。

这是第一次发现 w Mel 可以挽救囊肿形成后的卵母细胞分化，这表明 wMel 在整个卵子发生过程中具有普遍的影响，可能会加强胚胎发生。我们通过在受感染的果蝇中发现较少的种系囊肿肿瘤，证实了 wMel 感染的 mei-P26[1] 卵巢中 Bam 表达挽救的下游后果（图 5A-5I）。相对于未感染的囊肿，这些种系囊肿似乎是功能性的，基于感染的mei-P26[1]囊肿中必需卵母细胞分化蛋白Orb的卵母细胞特异性表达（图5J-5R）。发现 w Mel 挽救卵巢组织中的 Cp16 和 Cp19 绒毛膜蛋白、tut、bgcn 和其他转录本表达（图 7F、8、S11 和 S12）进一步支持了 wMel 可以挽救 mei-P26 丢失的下游影响的结论。未来的工作需要探索过冲和新的DE类别如何减轻mei-P26的损失，这可能通过一些替代或补偿途径发生。除了前面讨论的泛素连接酶挽救机制外，离子型受体 76a （Ir76a） 或烟碱乙酰胆碱受体 α5 （nAChRα5） 表达的缺失（S10A 图）可以通过 wMel 感染的 mei-P26[1] 卵巢中作为受体或膜转运蛋白的 Wunen-2 脂质磷酸磷酸酶的新型上调来挽救（S12B 图）。像这样的功能可能是 w Mel 诱导的 OreR 胚胎发生发育弹性的基础，正如 wMel 感染的 OreR 果蝇的孵化率升高所证明的那样（图 1C 和 6C）。

wMel 菌株对 D 的救援。黑腹果蝇 mei-P26 可能独立于 Wolbachia TomO 蛋白。先前对TomO的研究表明，细菌蛋白的主要作用方式是通过破坏稳定的核糖核蛋白（RNP）复合物[35]（如图9B所示）。这就是TomO如何提高GSC中Nos的表达[34]，以及TomO如何抑制翻译阻遏蛋白Cup在卵子发生中期（第8阶段）抑制Orb翻译[35\u201277]。相比之下，Mei-P26与Ago1 RISC相互作用，通过结合orb ′3-UTR miRNA结合位点来抑制Orb翻译[38]。尽管 Mei-P26 和 TomO 对 Orb 表达产生相反的结果，并且 TomO 在 mei-P26[1] 卵巢中没有显着上调（S14C 图），但如果 w Mel 产生其他调节相互作用的因子，TomO-orb 结合可能是 wMel 挽救 Orb 抑制能力的基础。或者，wMel 可以制造另一种 RNA 结合蛋白。鉴于 Sxl 也被 Bruno [78] 通过 sxl 3′-UTR 抑制，这种蛋白质可能参与恢复 mei-P26 突变体的 Sxl 调节。wMel 感染在 mRNA 水平上均未挽救 orb 和 sxl 表达（图 8C），这进一步支持了翻译或蛋白质相互作用/修饰水平的挽救。

除了TomO之外，其他细菌因子必须参与增强野生型果蝇和生育突变体的宿主繁殖力。首先，Mei-P26 编码 3 个功能域，这些功能域赋予至少 3 种不同的功能机制来调节基因表达（mRNA 结合、miRNA 介导和泛素化）。在细菌基因组中，这些结构域/功能可能由1种以上的蛋白质编码[79]。其次，TomO通过结合nos mRNA来挽救Sxl的GSC维持功能，增加Nos翻译水平，但不能完全挽救Sxl的损失[34]。在GSC分裂产生CB后，Sxl立即与Bam、Mei-P26、Bgcn和Wh相互作用以抑制Nos翻译[36,74]。因此，抑制Nos翻译的wMel因子，抵消TomO通过RNA结合破坏Nos翻译阻遏蛋白稳定的功能[34,35]仍有待确定。此外，Nos上调不能解释Bam的挽救，因为在TA有丝分裂期间，Nos和Bam表现出相互的表达模式[36]。第三，w Mel感染诱导的nos：Gal4驱动的Mei-P26过表达诱导的肿瘤表型恶化（图5I）表明，wMel合成了一种直接模仿Mei-P26分化功能的蛋白质，可以达到抗形态水平。mei-P26样因子的表达失调可以解释为什么wMel感染的mei-P26 RNAi雌性比OreR野生型果蝇产生更多的卵和后代（图1A和1B）。虽然 TomO 可以概括 Mei-P26 的一些功能，例如球体结合，但至少还需要一个其他因素来概括正确的 Orb、Nos 和 Bam 调节。

了解沃尔巴克氏体如何在分子水平上与宿主发育相互作用，对于在新型宿主中部署这些细菌并依靠垂直传播在宿主种群中维持它们至关重要。CI是控制宿主种群[80]和驱动沃尔巴克氏体高感染频率的有力工具[3]。宿主GSC中细菌生殖操纵器的持续存在为代偿性发育功能的进化提供了机会，类似于我们对mei-P26所展示的。虽然尚不清楚是否有任何天然存在的mei-P26等位基因[32,81]赋予了沃尔巴克氏体的存在所弥补的功能丧失，但从理论上讲，发育基因的自然变异可能为wMel进化其有益的生殖功能提供了选择压力。鉴于如果实现对宿主生育力的相互冲突的有益影响，选择将有利于CI的丧失[8]，因此我们必须了解有益生殖操作（如生育力增强）的潜在机制。

材料和方法

Russell及其同事沃尔巴克氏体内共生体操纵GSC自我更新和分化，以提高宿主生育能力

候选基因选择

利用对wMel拯救基本维持和分化基因的能力的了解[31,32]，以及这些基因之间蛋白质-蛋白质和蛋白质-mRNA相互作用的经验数据（图S1A-S1D和图8中的esyN [82]网络;S1表中的参考文献）以及宿主基因与wMel滴度[37]之间的相互作用数据，我们确定了基本的种系翻译调节因子减数分裂P26（mei-P26）作为细菌影响GSC维持和分化途径的潜在靶标（S1A和S1B图）。在未感染的果蝇中，mei-P26的缺失通过抑制GSC维持、减数分裂以及生殖系囊肿增殖和分化的转变而产生轻度至重度的生育缺陷[38\u201240]。

果蝇种群和遗传杂交

根据布卢明顿果蝇库存中心（BDSC）玉米粉食品配方（又名“白色食品”，见 https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html）准备的白色食物上饲养苍蝇。沃尔巴克氏体的wMel菌株先前已杂交到2 D中。黑腹蝇，一种携带标记物和染色体平衡器w[1];sp/cyo;Sb/TM6B、Hu等携带种系双驱动：P{GAL4-Nos.NGT}40;P{GAL4：：VP16-Nos.UTR}MVD1.这些受感染的双平衡和卵巢驱动原液用于将 wMel 杂交到标记和平衡的 FM7cB 中;;;sv[spa-pol]、无效/亚态突变体和UAS RNAi TRiP系，以确保所有测试的wMel都具有相同的遗传背景。D.从印第安纳大学的BDSC获得的黑腹果神经株是：Oregon-R-C （#2），w1118;P{UASp-mei-P26.N}2.1 （#25771）， y[1] w[*] P{w[+mC] = lacW}mei-P26-1 mei-P26[1]/C（1）DX， y[1] f[1]/Dp（1;Y）y[+];SV[SPA-POL] （#25716）， y[1] w[1] mei-P26[mfs1];Dp（1;4）A17/sv[spa-pol] （#25919）， y[1] sc[*] v[1] sev[21];P{y[+t7.7] v[+t1.8] = TRiP.GL01124}attP40 （#36855）。我们从吉庆大学医学院的Manabu Ote获得了UASp-mRFP/CyO（1-7M）系。感染Riv84菌株并用四环素治愈的果蝇模拟果蝇来自Sullivan Lab种群[83,84]。所有苍蝇种群和杂交在室温或25°C下保持在白色食物（BDSC玉米面食物）上，因为宿主食物的糖/蛋白质组成会影响沃尔巴克氏菌滴度[84]。

野生型生育种群：通过将俄勒冈-R-C的雄性与基因型w的配对感染和未感染的平衡种群的遗传和未感染的平衡种群杂交，制备出配对的wMel感染（OreR_wMelDB）和未感染的俄勒冈R（OreR_uninf）种群[1];CyO/Sp;Hu/Sb.确保这 2 D 之间没有差异。在平衡杂交期间或随后，我们将OreR_wMelDB种群的雄性与OreR_uninf种群的雌性回交 10 代，并重复产卵和孵化试验 （F10_OreR_uninf）。如上所述，通过与配对的感染和未感染的平衡种群杂交来配对感染和未感染的nosGal4 / CyO和nosGal4 / Sb果蝇。

本文和之前研究的mei-P26等位基因（例如[31]）的基因组和表型后果已经得到表征[40]。亚态 mei-P26[1] 等位基因是通过在 mei-P26 的第一个内含子中插入一个 P{lacW} 转座子而产生的，该内含子编码 RING 结构域。Starr 和 Cline 在 2002 年测试的几乎无效的 mei-P26[fs1] 等位基因是由 mei-P26[1] 第一次插入中的第二次 P{lacW} 插入产生的。通过删除 mei-P26[1] 的 P{lacW} 插入以及大约 2.5 kb 的侧翼序列，产生了完全（雄性和雌性）无效的 mei-P26[mfs1] 等位基因。根据Page及其同事（2000）的说法，这3个等位基因形成一个系列，严重程度越来越高：mei-P26[1]

繁殖杂交

概述。

SLR在2020年10月至2022年1月期间连续进行了3,002次繁殖杂交，根据其结束日期分批进行（表1）。持续保持感染和未感染的OreR系，以（1）控制CI男性祖母的年龄;（2） 定期使用 OreR 原始体进行 mei-P26 和 CI 繁殖力测定;（3）收集WT雌性并进行老年生育力测定;（4）从mei-P26生育突变体中获得大样本量。完整的繁殖力数据集包含在 S2 表中，并绘制在 S3 图中。

thumbnail 下载：

.PPTPowerPoint 幻灯片

.PNG放大图像

.TIFF原始图像

表 1. 繁殖力跨基因型、性别、年龄和对照杂交。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.t001

交叉条件。

食品（布卢明顿白食品配方的小瓶）、产蛋培养基（葡萄食品）和孵化条件每月在内部大批量制作。葡萄勺：将大约 1.5 mL 葡萄琼脂培养基（1.2× Welch's 葡萄汁浓缩物，含有 3% w/v 琼脂和 0.05% w/v tegosept/对羟基苯甲酸甲酯，首先以 5% w/v 溶解在乙醇中）分装到小勺中，使其硬化，并在 4°C 下储存直至使用。在十字架使用之前，我们在每个勺子的表面添加了磨碎的酵母。

为繁殖杂交准备苍蝇。

对 4 个 mei-P26 突变体 （RNAi、[mfs1]、[1]、[mfs1/1]）平行进行配对的 wMel 感染和未感染的基因杂交，以产生两种感染状态的纯合处女雌性进行平行繁殖杂交。在 14 个月内进行了多次（3 次或更多次）突变基因杂交，以产生来自许多不同亲本和交配的纯合子。CI 杂交是与 3 至 7 日龄受感染祖母的雄性进行的。雄性年龄为0（当天收集）或5天，具体取决于杂交。我们在多天内从小瓶中收集雄性，因此大多数雄性不是第一个出现的。

将收集用于繁殖杂交的原始雌性果蝇转移到新鲜食物中，并在室温下平均陈化 5 天（从 3 到 7），或更长时间的陈化 OreR、mei-P26 RNAi 和 mei-P26[1] 繁殖杂交。雄蝇和处女雌蝇分开储存，雄蝇的年龄为0或3至7天。长期年迈的处女女性被作为一小群饲养在新鲜的白色食物瓶中。每隔几天，检查小瓶是否有霉菌，苍蝇就会转移到新鲜食物上。

繁殖跨协议。

在每个十字架的第一天下午，1只雄性和1只雌性苍蝇被击倒在CO2垫子，加入装有葡萄勺的小瓶中，使其恢复，然后以 12 个光/暗循环转移到 25°C 恒湿培养箱中，以便求偶和交配。第二天，用新勺子替换每个勺子，并将小瓶放回 25°C 进行更多交配。第三天，我们从小瓶中取出苍蝇，计算勺子葡萄培养基上产卵的数量，并在25°C下更换小瓶中的勺子2天。大约40小时后，我们计算孵化和未孵化的鸡蛋的数量。记录了所有交叉中所有步骤的确切时间和日期（S2表）并绘制以显示整个时间范围内一致的结果（S3图）。

繁殖力交叉分析。

使用perl脚本解析繁殖力数据，并在R中绘制，单个杂交被视为离散样本。孵化率是根据产下 20 个或更多种蛋（对于 3 至 7 日龄雌性地块）和 10 个或更多种蛋（对于年龄与孵化率地块）的样品计算得出的。产蛋率和后代生产率是根据原始计数除以产蛋天数的分数计算得出的（S2表中的元数据）。与0产卵（和后代）的杂交没有被排斥，因为生育突变体通常产0到很少的卵。我们的交叉条件高度一致，并且每天运行，为这些零产卵/后代样品提供了信心（S3图）。果蝇繁殖力与雌性年龄数据使用stat_smooth黄土方法（公式 y~x）在 R 中拟合，置信区间为 0.95。

非分离检测

我们将带有黄色突变的 mei-P26[1] 等位基因 （y[1] w[*] mei-P26[1];;; sv[spa-pol]） 的雌性纯合子放入小瓶中，雄性携带与 Y 染色体融合的野生型黄色等位基因 （y[1] w[1] / Dp（1;Y）y+）。我们制作了 7 或 8 瓶 1 至 10 只雌性，分别与计数匹配的 1 至 10 只雄配，用于感染和未感染的 mei-P26 亚态型。闭合后，我们通过存在黄色雄性 （XO） 和正常颜色的雌性 （XXY） 来筛选后代的非分离性。计算不分离率 （NDJ） 以解释不可存活的后代（XXX 和 YO），公式为 NDJ rate = 2 *NDJ 后代/所有后代 = （2XXY + 2X0）/（XX+XY+2XXY+2X0），如 [41]。

卵巢固定和免疫细胞化学

在一天或两天或关闭期间，苍蝇被转移到新鲜食物中，并按照文本所示陈化 3 至 7 天或更长时间。对于长期老化实验，每周将苍蝇转移到新鲜食物中，每隔几天检查一次霉菌。我们在 1× PBS 中解剖了来自每个杂交的大约 10 只苍蝇的卵巢，并用针分离卵巢。将卵巢固定在600μl庚烷与200μl脱甲醛溶液（50%v / v多聚甲醛和0.5%v / v NP40在1×PBS中混合）中，强烈搅拌，并在室温下旋转20分钟。然后将卵母细胞在 PBS-T（1% Triton X-100 在 1× PBS 中）中洗涤 5×，并在室温下用 RNAse A （10 mg/ml） 处理过夜。

在 PBS-T 中洗涤 6 次后，我们在室温下将卵母细胞在 PBS-T 中的 1% 牛血清白蛋白中封闭 1 小时，然后将卵母细胞在 4°C 下在 PBS-T 中稀释的一抗中孵育过夜（抗体和稀释度如下）。第二天，我们在 PBS-T 中洗涤卵母细胞 6 次，并将它们在 4°C 下在 PBS-T 中以 1：500 稀释的二抗中孵育过夜。 在最后一天，我们在 PBS-T 中洗涤卵母细胞 6 次，并在 4°C 下在 PI 封固培养基（20 μg/ml PI （Invitrogen #P1304MP）的 70% 甘油和 1× PBS 中孵育 2 晚。 用透明培养基代替覆盖的PI培养基，并将卵母细胞安装在载玻片上。载玻片立即储存在?20°C下，并在一个月内成像。感染和未感染以及实验和对照样品并行处理，以尽量减少批次效应。配对的wMel感染和未感染的OreR储备液被用作野生型对照。

Primary monoclonal antibodies from the Developmental Studies Hybridoma Bank (University of Iowa) were used at the following dilutions in PBS-T: anti-Hts 1:20 (1B1) [45], anti-Vas 1:50 [44], anti-Orb 1:20 (4H8) [63], anti-Bam 1:5 [36], and anti-Sxl 1:10 (M18) [85]. Primary monoclonal antibodies from Cell Signaling Technology were used at the following dilutions: anti-Phospho-Smad1/5 (Ser463/465) (41D10) 1:300 (#9516S) and anti-Phospho-Histone H3 (Ser10) Antibody 1:200 (#9701S). Anti-Wolbachia FtsZ primary polyclonal antibodies were used at a 1:500 dilution (provided by Irene Newton). Secondary antibodies were obtained from Invitrogen: Alexa Fluor 405 Goat anti-Mouse (#A31553), Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit (#A12379), and Alexa Fluor 647 Goat anti-Rat (#A21247).

Confocal imaging

Oocytes were imaged on a Leica SP5 confocal microscope with a 63× objective. Optical sections were taken at the Nyquist value for the objective, every 0.38 μm, at variable magnifications, depending on the sample. Most germaria were imaged at 4× magnification and ovarioles and cysts were imaged at a 1.5× magnification. Approximately 10 μm (27 slices) were sampled from each germarium and 25 μm (65 slices) were sampled from each cyst for presentation and analysis.

PI was excited with the 514 and 543 nm lasers, and emission from 550 to 680 nm was collected. Alexa 405 was imaged with the 405 nm laser, and emission from 415 to 450 nm was collected. Alexa 488 was imaged with the 488 laser, and emission from 500 to 526 nm was collected. Alexa 647 was imaged with the 633 laser, and emission from 675 to 750 nm was collected.

Image analysis

Germaria and ovarioles were 3D reconstructed from mean projections of approximately 10 μm-thick nyquist-sampled confocal images (0.38 μm apart) in Fiji/ImageJ. Germline cyst developmental staging followed the standard conventions established by Spradling [86] and the criteria described below. We also scored and processed the confocal z-stacks for analysis as follows in the sections below.

GSC quantification.

GSC的得分是通过在体细胞生殖细胞生态位和末端细丝附近具有高细胞质体积的细胞中存在pMad和Hts标记的光谱体来评分[56]。当抗体相容性阻止 pMad 和 Hts 染色（例如，使用抗 pHH3 染色）时，仅使用一种用于 GSC 鉴定。光谱体与扩散体的区别在于其位于假定的 GSC 核前方，并且存在一个后扩散体，该扩散体继续进入后分裂的膀胱母细胞。我们将每个胚芽的 GSC 数量计算为 pMad 和 Hts 光谱体表达细胞的平均数量。GSC 的非完整增量表示假定的 GSC 表达一个属性而不表达另一个属性的情况。

有丝分裂 GSC 定量。

如上所述鉴定了推定的 GSC，并对抗 pHH3 染色的存在进行了评分。区域 1 中 pHH3 阳性囊细胞的数量也在整个 germaria 中进行了量化。

卵母细胞囊肿肿瘤定量。

使用 10× 的物镜，我们手动计数每个阶段 6 至 10b 囊肿中的护士细胞数量。每次计数一致地重复 3 次，囊肿被统计为每个囊肿的护士细胞少于 15、15 或超过 15 个。

通过荧光测量 Bam 和 Sxl 表达。

我们对斐济/ImageJ 中每个天瑕疣的 27 层奈奎斯特采样 z 堆栈求和。通过设置 ImageJ 测量荧光强度：面积、积分密度和平均灰度值。如[42]所示，使用Vas表达来指示种系。测量了三个具有代表性的背景选择进行减法。针对卵母细胞的每个区域计算校正后的总细胞荧光 （CTCF），如下所示：CTCF = 积分密度 - 所选细胞面积 * 背景读数的平均荧光。我们控制了香叶内的染色强度，并比较了香叶之间的相对值。

球体表达式。

在共聚焦 z 堆栈 ImageJ 中手动评分抗 Orb 染色的卵母细胞囊肿进行分期和 Orb 卵母细胞染色。

转录组学

我们收集了未感染和感染 wMel 和 wMel 感染的 nos：Gal4>UAS：mei-P26 RNAi 和 nos：Gal4/CyO 果蝇的 OreR 和亚态 mei-P26 果蝇，用于 RNAseq。苍蝇在关闭后被收集并转移到新鲜食物中，直到它们 3 到 5 天大。在 1× PBS 中进行卵巢解剖，每组 20 至 30 只苍蝇，为每个样品获得至少 10 mg 卵巢组织。在小心地去除所有非卵巢体细胞组织后，在室温下迅速将卵巢移至RNAlater，然后在30分钟内转移到-80°C进行储存。冷冻组织通过干冰运输到Genewiz Azenta Life Sciences进行RNA提取、cDNA合成、Illumina文库制备和Illumina测序。RNAi和对照样品（nos：Gal4>UAS：mei-P26 RNAi和nos：Gal4/CyO基因型）均使用T尾引物处理成cDNA，仅回收宿主转录本。使用随机六聚体将mei-P26[1]和OreR样品处理成cDNA，并用连续真核和细菌rRNA去除试剂盒（Qiagen FastSelect）去除核糖体序列。Illumina双索引文库由这些cDNA组成，测序为2×150 bp读长。

我们使用标准计算方法和自定义perl解析脚本处理和分析了RNAseq数据集的差异表达。简而言之，在解复用后，我们用Trimmomatic从RNAseq读段中修剪了接头片段[87]。为了生成站点覆盖率数据以直接检查读取比对，我们使用了STAR对准器[88]和samtools [89]，并在R中绘制了样本的读取深度。我们通过Kallisto的假比对来量化转录本[90]。参考转录组的选择是恢复最大比对数量的关键：我们合并了来自基因组（登录GCF_000008025.1）和D的wMel参考基因组CDS和RNA的NCBI RefSeq组装。来自基因组的黑腹肌参考基因组RNA（登录 GCF_000001215.4;Release_6_plus_ISO1_MT） 获得针对完整的、非冗余的宿主共生体转录组的比对。同时对两个基因组进行定位，以避免跨物种错误定位[91]。在Kallisto（0.45.1版）[90]中，该参考转录组的索引长度为31，并使用“kallisto quant”命令和默认参数将reads与该参考进行伪对齐。宿主和共生体具有不同的转录组分布[92]，因此在DESeq2中转录本归一化和定量之前，需要分离2个转录组[93]，我们使用自定义perl脚本执行。

我们导入了子集 D。melanogaster 和 wMel Kallisto 分别用 Tximport [94] 将转录组定量为 R 进行 DESeq2 分析 [93]。将转录水平丰度映射到基因 ID，以估计基因水平的归一化计数。对于每个转录组，我们通过要求至少 5 个样本的读取计数为 10 或更多来过滤掉样本中的低计数/覆盖基因。我们将实验组之间的相互作用建模为基因型、感染以及基因型与感染之间的相互作用（~基因型 + 感染 + 基因型*感染）的函数，并进行 Wald 检验以检测差异表达。简而言之，计算每个基因表达计数的最大似然基因模型系数，并除以其标准误差，以生成完整模型和简化模型下每个基因的 z 统计量。将这些 z 统计量与在标准正态分布下获得的值进行比较，以进行 p 值计算。对这些 p 值进行 FDR/Benjamini-Hochberg 校正以减少误报数量。使用 DESeq2 中的 plotCounts（） 函数输出每个基因的归一化计数，以便在 R 中绘图。

我们通过Flybase手动调查了Fly Cell Atlas项目[95]中每个测试的种系表达证据。从每个DESeq2 Wald测试返回的差异表达基因的GO类别，并使用ShinyGO0.77测试其与参考转录组ID集的显著性[96]。

本研究中产生的转录组学数据可通过 NCBI BioProject 编号 PRJNA1007602 获得。

绘图和统计分析

用非参数Wilcoxon秩和检验评估产蛋率、孵化率和后代产量的差异，分析繁殖力数据，并计算统计量。当由于非零样本太少（例如，无效等位基因）而无法做到这一点时，我们将产卵或未产卵的二项分布雌性分类组与Fisher's Exact检验进行了比较。所有样本数量、均值和 p 值都显示在 S2 表中。生育力被绘制在苍蝇年龄上，并用局部多项式回归拟合。用碱基R和蜂群[97]包制作单龄盆，用ggplot2 [98]包制作繁殖力与时间的关系图。

分析并绘制共聚焦显微照片荧光强度，并在R中计算统计量，将卵母细胞基因型之间的相对荧光强度与非参数Wilcoxon秩和检验进行比较。将 GSCs、有丝分裂 GSC、肿瘤种系囊肿和球体特异性囊肿的计数与 Fisher Exact 试验进行比较。用ggplot2 [98]包制作了绘图。

我们分析并绘制了 R. Bar 和 DESeq2 的双 RNAseq 结果，并使用 ggplot2 软件包 [98] 绘制散点图，并使用 EnhancedVolcano 软件包（版本 3.17）绘制火山图[99]。

支持信息

生殖系干细胞 （GSC） 维持和分化的关键遗传调节因子。黑腹果蝇卵子发生。

显示 1/35： pbio.3002335.s001.tif

跳到无花果共享导航

https://ndownloader.figstatic.com/files/42887463/preview/42887463/preview.jpg

1 / 35

下载

无花果分享

S1 图。 生殖系干细胞 （GSC） 维持和分化的关键遗传调节因子。黑腹果蝇卵子发生。

（A） GSC 生态位图，说明了 GSC 有丝分裂后膀胱母细胞表达转移的基因子集。（B）生殖系囊肿发育过程中蛋白质表达的相对水平模型。（C， D） （C） sxl 和 （D） bam 基因产物的 esyN 相互作用网络（S1 表中的支持参考文献）。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s001

（TIF）

S2 图。 果蝇mei-P26遗传资源和基因表达表征。

（A） mei-P26和所研究等位基因的基因组图谱和基因模型。在mei-P26[1]的第一个内含子中插入P{lacW}转座子会影响RING结构域。mei-P26[mfs1] 等位基因是通过删除该插入和插入位点两侧两侧的 0.7–1.6 kb DNA 产生的。（B， C） mei-P26 转录本覆盖率和 （D， E） Kallisto Kallisto 标准化转录本计数。来自 （B， D） mei-P26 的黑腹果蝇 mei-P26 转录本[1] 和 OreR w Mel 感染与未感染卵巢和 （C， E） nos：Gal4>UAS：meiP26RNAi vs. OreR wMel 感染卵巢。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s002

（TIF）

S3 图。 繁殖力数据采集图与时间的关系图。

（甲、乙）雌性mei-P26 RNAi，（C，D）雌性mei-P26[1]和（E，F）CI测定。（A、C、E）产卵率和（B、D、F）孵化率随时间推移、跨遗传杂交和繁殖杂交保持一致。在 y 轴值中添加了 0.1 因子作为偏移量，以查看零布局和零百分比剖面线数据点。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s003

（TIF）

S4 图。 感染 wMel 可挽救女性和男性的 mei-P26 功能。

（甲、乙）亚态性mei-P26[1]和（C，D）编号：Gal4>mei-P26RNAi D.黑腹果蝇雌性繁殖力与年龄的关系，与局部多项式回归拟合（深灰色边界 = 95% 置信区间）。感染 wMel 通过增加产卵数量和孵化卵的比例来提高雌性整个生命周期的后代产量。（E-G）雄性mei-P26抢救：在RNAi、亚态性和null mei-P26[1]敲除雄性果蝇与相同年龄和感染状态的野生型雌配中，Mel感染产生的（D）总后代产生率显著提高，破碎为（F）产卵和（F）卵孵化。Wilcoxon 秩和 * = p < 0.05， ** = 0.01， **** = 1e-4。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。（H，I）纯合子亚态性 mei-P26[1] 原液 （H） 感染 wMel Wolbachia 或 （I） 未感染。由于胚胎和幼虫死亡，霉菌生长（绿色食品与棕褐色/棕色食品）在未感染的种群中不受抑制，它们既会滋养霉菌，又无法阻止霉菌。感染使种群保持稳定、稳健，因为幼虫的产生超过了霉菌的生长。两只股票同时开始（见标签上的12/28）。受 wMel 感染的原液从不需要添加任何成虫，而未感染的原液产生的后代太少，必须在每次小瓶翻转时补充，以保持原液人工运行。几个月后，我们结束了这项工作，未受感染的库存完全消失了。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s004

（TIFF格式）

S5 图。 亚态性mei-P26[1]卵泡和germaria表现出一系列（A-I）wMel感染和（J-R）未感染的表型。

红色 = PI DNA 染色，黄色 = 抗输精管染色，青色 = 抗 Hts 染色。比例尺 A、D、G、H、I、J–L、N、O、Q、R = 50 μm;B、C、E、F、M、P = 25 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s005

（TIF）

S6 图。 wMel 感染并不能挽救 mei-P26 在减数分裂中的功能。

（A）包含X染色体不分离实验数据的表格。（B） 每个实验中 X 染色体不分离 （NDJ） 速率的蜂群箱线图。感染和未感染的mei-P26[1]女性之间没有显著差异。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s006

（TIF）

S7 图。 GSC维持和种系分化被 w Mel 感染挽救。

（甲、乙）D的共聚焦平均投影。黑腹果蝇 germaria 染色有针对 Hts 和 pMad 的抗体。mei-P26 的 RNAi 敲低不影响 GSC 的维持（图 2E）。（C） 10 至 13 日龄雌性每个生殖器中 GSC 数量的小提琴图。由于功能齐全的 GSC 表达 pMad 并具有 Hts 标记的光谱体，因此每个光谱体的权重减半并允许部分分数。Wilcoxon 秩和 * = p < 0.05，** = 0.01。（D） F-K） 通过 pH3 表达检测到的每个日耳胶有丝分裂囊细胞数量的小提琴图。（英、女）按区域划分的整个天疽细菌中总 （E） Sxl 和 （F） Bam 荧光表达水平的条形散射图。（G） 生殖系囊肿中卵母细胞特异性球体染色的 1D 条形图，分布在囊肿发育阶段。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s007

（TIF）

S8 图。 沃尔巴克氏体的 wMel 菌株是宿主繁殖的有益操纵者。

（空调）蜂群箱线图显示 wMel 感染会升高野生型 D。黑腹果蝇相对于相同基因型的未感染苍蝇的生育能力。（A）总后代产量，（B）产蛋量和（C）蛋孵化在不同的“野生型”基因型中受到不同程度的影响。（D） D.每只雌性每天产下的黑腹果蝇卵与雌性年龄的关系图，拟合局部多项式回归（深灰色边界 = 95% 置信区间）。这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s008

（TIF）

S9 图。 果蝇-沃尔巴克氏体关联的细胞质不相容性 （CI） 强度不同，并随着男性年龄的增长而减弱。

（A-D）蜂群箱形图的（A，C）卵孵化率和（B，D）未感染和w梅尔感染D的后代产量。黑腹果蝇OreR 雌性与 （A， B） 零日龄和 （C， D） 5 日龄 wMel 感染雄配。（E-H）未感染和wRi感染的D的（E，G）卵孵化率和（F，G）后代产量的蜂群箱形图。模拟雌性与（A，B）零日龄和（C，D）5日龄wRi感染雄配。Wilcoxon 秩和 * = p < 0.05， ** = 0.01， *** = 0.001， **** = 1e-4.这个数字背后的数据可以在树妖上找到，doi.org/10.7291/D1DT2C。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s009

（TIF）

S10 图。 黑腹果蝇基因因基因型而显著差异表达（Wald 检验 ~G vs. ~G+I+G*I）表明，mei-P26 是许多基因调控所必需的。

（A） D的Kallisto标准化转录本计数。黑腹果蝇基因（前 15 个命中（包括图 7E）padj< = 2。0E-30;其他图见图7和S2）。条形图按组着色：深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。 （B–G） MEI-P26 相关 DE 基因的 GO 分析揭示了涉及染色质、重组、蛋白质-蛋白质相互作用和肌肉细胞分化的过程的富集。（B，E）生物过程，（C，F）细胞成分和（D，G）分子功能类别的GO富集（B-D）类别图和（E-G）项相互作用网络。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s010

（TIF）

S11 图例. 由于感染状态（Wald 检验 ~I 与 ~G+I+G*I）显着差异表达的黑腹果蝇基因揭示了挽救事件的富集，其中 wMel 感染的 mei-P26[1] 卵巢表现出 OreR 表达水平。

（甲、乙）Kallisto 对 D 的转录本计数进行了标准化。黑腹肌基因表现出 （A） 拯救和 （B） OreR 表达水平过调 （padj< = 0.002;其他图见图 7）。条形图按组着色：深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。 感染DE基因的GO分析揭示了丰富的细胞骨架和染色质成分。GO 富集 （C–E） 类别图和 （F， G） 项相互作用网络，用于 （C， F） 生物过程、（D， G） 细胞成分和 （E） 分子功能类别（单个项无网络）。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s011

（TIF）

S12 图。 由于基因型关节感染状态（Wald 检验 ~G*I 与 ~G+I+G*I）显着差异表达的黑腹果蝇基因揭示了逆转性 DEG 的富集，其中 wMel 感染的卵巢对 mei-P26[1] 和 OreR 卵巢表现出相反的 DE 模式。

（空调）Kallisto 对 D 的转录本计数进行了标准化。黑腹果蝇基因表现出 （A） 逆向、（B） 下冲和 （C） OreR 表达水平的新调控 （padj< = 0.02;其他图见图 7）。条形图按组着色：深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。 感染DE基因的（D-G）GO分析揭示了细胞骨架和膜因子。GO富集（C-E）类别图和（F，G）项相互作用网络，用于（C，G）生物过程，（D）细胞成分（见图8D网络）和（E，F）分子功能类别。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s012

（TIF）

S13 图。 wMel 沃尔巴克氏体转录组差异表达 所有表达基因的 GO 类别揭示了细胞维持、中枢代谢和膜相关过程。

GO富集（A）类别图，（B）分层聚类树，（C）项交互网络生物过程类别。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s013

（TIFF格式）

S14 图。 Kallisto 对 wMel Wolbachia （A， B） 差异表达候选基因（有待更深入的采样）和 （C） 文献中感兴趣的基因的转录本计数进行了标准化。

条形图按组着色：深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。 Wald 检验基因型关联 p 值和校正 p 值 （padj）。这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s014

（TIF）

S15 图例. 基本 D 子集的不显着 Kallisto 标准化转录本计数。根据已知的与 mei-P26、sxl、bam 或种质形成（卵子发生的中期 9）的相互作用，从文献中选择的黑腹果蝇卵子发生基因。

条形图按组着色：深灰色 = w Mel 感染的 OreR，浅灰色 = 未感染的 OreR，深粉色 = wMel 感染的 mei-P26[1]，浅粉色 = 未感染的 mei-P26[1]。 这个数字背后的数据可以在NCBI的BioProject编号PRJNA1007602下找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s015

（TIF）

S1 表。 S1C 中 sxl 和 bam 相互作用的 esyN 参考以及图 9 中 mei-P26 相互作用的参考。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s016

（PDF格式）

S2 表。 用于制作S1A和S1B图和图9C中的表格的注释参考文献。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s017

（PDF格式）

S3 表。 完整的繁殖力数据集 （n = 3,002）。

请参阅 S3 表。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s018

（TSV）

S4 表。 繁殖力统计：单雌与单雄杂交中每只雌性每天产生的后代。

列出了实验基因型、感染状态和性别。每个杂交的配偶是OreR，具有相同的感染状态，并且与实验果蝇具有异性。雄性年龄为3-6日龄，年轻雄性CI杂交的年龄为0日龄（用“-0d”和“-5d”标签区分）。为清楚起见，P 值 <0.01 为浅绿色，<0.05 为深绿色。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s019

（PDF格式）

S5 表。 繁殖力统计：在单雌与单雄杂交中，每只雌性每天产生的卵。

列出了实验基因型、感染状态和性别。每个杂交的配偶是OreR，具有相同的感染状态，并且与实验果蝇具有异性。雄性年龄为3-6日龄，年轻雄性CI杂交的年龄为0日龄（用“-0d”和“-5d”标签区分）。为清楚起见，P 值 <0.01 为浅绿色，<0.05 为深绿色。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s020

（PDF格式）

S6 表。 繁殖力统计：从产下>的单个雌性与单个雄性杂交孵化的卵的百分比 = 20 个卵。

列出了实验基因型、感染状态和性别。每个杂交的配偶是OreR，具有相同的感染状态，并且与实验果蝇具有异性。雄性年龄为3-6日龄，年轻雄性CI杂交的年龄为0日龄（用“-0d”和“-5d”标签区分）。括号中的样本计数 （n1， n2） 用于 Fisher 精确检验（有孵化蛋的样品与没有孵化蛋的样品，与产下 20 个或更多鸡蛋的样品的孵化百分比相反）。为清楚起见，P 值 <0.01 为浅绿色，<0.05 为深绿色。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s021

（PDF格式）

S7 表。 生育能力与年龄统计。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s022

（PDF格式）

S8 表。 每个种源干细胞 （GSC） 计数。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s023

（PDF格式）

S9 表。 每个日耳有丝分裂（抗 pHH3 阳性染色）中的 GSC 数量。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s024

（PDF格式）

S10 表。 每个生殖器有丝分裂（抗 pHH3 阳性染色）中的囊细胞 （CC） 数量。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s025

（PDF格式）

S11 表。 通过荧光强度测量的 Sxl 表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s026

（PDF格式）

S12 表。 通过荧光强度测量的 Bam 表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s027

（PDF格式）

S13 表。 GSC 中通过荧光测量的相对 Bam 与 pMad 表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s028

（PDF格式）

S14 表。 肿瘤生殖系囊肿计数。

正常囊肿包含 16 个生殖系来源的细胞、15 个护士细胞和 1 个卵母细胞。含有大于或少于 15 个护士细胞的囊肿分别被评定为肿瘤或异常。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s029

（PDF格式）

S15 表。 表现出卵母细胞特异性球体表达 （Y）、染色不清晰 （M） 或无特异性表达的种系囊肿计数，表明发育异常囊肿缺乏特定的卵母细胞。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s030

（PDF格式）

S16 表。 生成转录组数据集以测试 mei-P26 敲低和 wMel 感染的影响。

数据存放在 NCBI BioProject 编号 PRJNA1007602 下。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s031

（PDF格式）

S17 表。 黑腹果蝇 D. melanogaster 基因 Wald 检验 ~基因型与 ~基因型+感染+基因型*感染的显着结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s032

（PDF格式）

S18 表。 黑腹果蝇 D. melanogaster 基因 Wald 检验 ~感染与 ~基因型 + 感染 + 基因型*感染的显着结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s033

（PDF格式）

S19 表。 带有 Wald 检验的黑腹果蝇基因对 ~Genotype*Infection 与 ~Genotype+Infection+Genotype*Infection 的显着结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s034

（PDF格式）

S20 表。 wMel Wolbachia 基因 Wald 检验 ~基因型与 ~1 的显著结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002335.s035

（PDF格式）

确认

我们感谢UCSC生命科学显微镜中心（RRID：SCR_021135）和Ben Abrams的培训和使用他们的显微镜。我们感谢 Irene Newton 提供的抗沃尔巴克氏体 FtsZ 抗体等分试样，以及 Manabu Ote 提供的 UASp-mRFP/CyO （1-7M） 苍蝇库存。我们感谢 Russ Corbett-Detig 在整个项目中的评论和反馈。

引用

1.Leftwich PT， Edgington MP， Chapman T. 传输效率驱动宿主-微生物关联。Proc R Soc B 生物学 2020;287：20200820。PMID：32873208

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

2.Bright M， Bulgheresi S.一个复杂的旅程：微生物共生体的传播。Nat Rev 微生物。2010;8:218–230.PMID：20157340

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

3.Utarini A、Indriani C、Ahmad RA、Tantowijoyo W、Arguni E、Ansari MR 等。沃尔巴克氏体感染蚊子部署对控制登革热的功效。N Engl J Med. 2021;384:2177–2186.PMID：34107180

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

4.淹死 DM、Zee PC、Brandvain Y、Wade MJ。专性共生体中传播模式的演变。生态研究 2013;15：43.PMID：24678268

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

5.Doremus MR，猎人 MS。破坏者的工具：操纵共生体的共同机制主题。Adv Insect Physiol. 爱思唯尔。2020:317–353.https://doi.org/10.1016/bs.aiip.2020.03.003

6.Werren JH、Baldo L、Clark ME。沃尔巴克氏体：无脊椎动物生物学的主要操纵者。Nat Rev 微生物。2008;6:741–751.PMID：18794912

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

7.詹森 VAA、图雷利 M、戈弗雷 HCJ。沃尔巴克氏体的随机传播。Proc R Soc B Biol Sci. 2008;275:2769–2776.PMID：18755670

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

8.Turelli M. 不相容诱导微生物及其宿主的进化。演化。1994;48:1500.PMID：28568404

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

9.周 AR、Turelli M、Harcombe WR、Reynolds KT、Hoffmann AA。从寄生虫到共生：沃尔巴克氏体在果蝇自然种群中的快速进化。Keller L，编辑。PLoS Biol. 2007年;5：E114。PMID：17439303

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

10.卡灵顿 LB、利普科维茨 JR、霍夫曼 AA、图雷利 M.沃尔巴克氏体诱导的加州果蝇模拟物细胞质不相容性的重新检查。Cordaux R，编辑。PLoS 一号。2011;6：e22565。PMID：21799900

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

11.Zug R， Hammerstein P. 坏人变好了？对节肢动物宿主中沃尔巴克氏体共生关系的批判性评估：节肢动物中的沃尔巴克氏体共生关系。Biol Rev. 2015 年;90:89–111.PMID：24618033

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

22 分钟Kriesner P， Hoffmann AA， Lee SF， Turelli M， Weeks AR. 两种沃尔巴克氏体变体在果蝇模拟物中的快速连续传播。Charlat S，编辑。PLoS 病理学。2013;9：e1003607。PMID：24068927

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

23米Ross PA、Axford JK、Yang Q、Staunton KM、Ritchie SA、Richardson KM 等。热浪导致埃及伊蚊的wMel沃尔巴克氏体密度和频率波动。Kohl A，编辑。PLoS Negl Trop Dis. 2020;14：e0007958。PMID：31971938

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

14.霍夫曼AA。两个澳大利亚果蝇黑腹果蝇种群之间的部分细胞质不相容。Entomol Exp Appl. 1988年;48:61–67.

查看文章谷歌学术搜索

25米Hoffmann AA， Hercus M， Dagher H. 沃尔巴克氏体感染导致黑腹果蝇细胞质不相容的种群动态。遗传学。1998;11.PMID：9475734

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

26 分钟雷诺兹 KT，霍夫曼 AA。母源性沃尔巴克氏体感染的果蝇菌株的雄性年龄、宿主效应和细胞质不相容性表达弱或不表达。基因研究 2002：80。PMID：12534211

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

27米Layton EM、On J、Perlmutter JI、Bordenstein SR、什罗普郡 JD。祖母的年龄会影响沃尔巴克氏体诱导的黑腹果蝇细胞质不相容的强度。Dubilier N，编辑。MBio的。2019;10：e01879–19，/mbio/10/6/mBio.01879-19.atom。PMID：31690673

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

18.Solignac M， Vautrin D， Rousset F. 变形菌沃尔巴克氏体的广泛发生和果蝇黑腹果蝇的部分细胞质不相容性。Comptes Rendus Acad Sci—Ser. 1994;III（317）：461–470。

查看文章谷歌学术搜索

19.Verspoor RL， Haddrill PR. 全球果蝇黑腹果蝇和模拟果蝇种群样本中的遗传多样性、种群结构和沃尔巴克氏体感染状况。韦尔奇 JJ，编辑。PLoS 一号。2011;6：e26318。PMID：22022599

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

10米Kriesner P、Conner WR、Weeks AR、Turelli M、Hoffmann AA。黑腹果蝇中沃尔巴克氏体感染频率斜线的持续存在以及生殖休眠的可能作用： 持续性沃尔巴克氏体频率斜线。演化。2016;70:979–997.PMID：27076356

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

21.Fry AJ， Palmer MR， Rand DM. 沃尔巴克氏体感染对黑腹果蝇的适应性影响。遗传。2004;93:379–389.PMID：15305172

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

12 分钟哈科姆 W，霍夫曼 AA。黑腹果蝇中的沃尔巴克氏体效应：寻找健身益处。J无脊椎动物病理。2004;87:45–50.PMID：15491598

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

13 分钟Serga SV、Maistrenko OM、Matiytsiv NP、Vaiserman AM、Kozeretska IA。沃尔巴克氏体感染对黑腹果蝇健身相关性状的影响。共生。2021;83:163–172.

查看文章谷歌学术搜索

14 分钟Strunov A， Lerch S， Blanckenhorn WU， Miller WJ， Kapun M. 环境和沃尔巴克氏体感染对黑腹果蝇宿主生活史的复杂影响。J Evol Biol. 2022;35:788–802.PMID：35532932

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

25.Serga S， Maistrenko O， Rozhok A， Mousseau T， Kozeretska I. 繁殖力是导致沃尔巴克氏体 wMel 基因型在黑腹果蝇自然种群中占主导地位的可能因素之一。共生。2014;63:11–17.

查看文章谷歌学术搜索

26.Frydman HM， Li JM， Robson DN， Wieschaus E. 沃尔巴克氏体中的体细胞生态位趋性。自然界。2006;441:509–512.PMID：16724067

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

17 分钟Toomey ME， Panaram K， Fast EM， Beatty C， Frydman HM. 进化上保守的沃尔巴克氏体编码因子控制果蝇卵巢中干细胞生态位趋向性的模式并有利于感染。美国国家科学院院刊，2013 年;110:10788–10793.PMID：23744038

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

18 分钟Foray V， Perez-Jimenez MM， Fattouh N， Landmann F. 沃尔巴克氏体控制干细胞行为并刺激丝虫的种系增殖。开发单元。2018;45:198–211.PMID：29689195

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

19米Pannebakker BA， Loppin B， Elemans CP， Humblot L， Vavre F. 寄生抑制细胞死亡促进共生。美国国家科学院院刊，2007年;104:213–215.PMID：17190825

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

30.Russell SL， Castillo JR. 共生体诱导的宿主细胞分化的趋势。在：Kloc M，编辑。共生：细胞、分子、医学和进化方面。Cham：施普林格国际出版社;2020 年，第 137–176 页。https://doi.org/10.1007/978-3-030-51849-3_5 pmid：33263871

31.斯塔尔DJ，克莱恩TW。宿主-寄生虫相互作用挽救了果蝇卵子发生缺陷。自然界。2002;418:76.PMID：12097909

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

32.弗洛雷斯·哈、布内尔 JE、阿夸德罗 CF、巴巴什 DA。果蝇弹珠袋基因与沃尔巴克氏体在遗传上相互作用，并显示出女性特异性的分化效应。PLoS 基因。2015;11：e1005453。

查看文章谷歌学术搜索

33.Bubnell JE， Fernandez-Begne P， Ulbing CKS， Aquadro CF. 沃尔巴克氏菌的不同 wMel 变体差异挽救了黑腹果蝇中弹珠袋部分功能丧失突变的生育力和细胞学缺陷。G3的。2021 [引用日期：2021 年 10 月 2 日]。PMID：34580706

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

34.Ote M， Ueyama M， Yamamoto D. 沃尔巴克氏体蛋白 TomO 靶向纳米 mRNA 并恢复果蝇性致死突变体中的生殖干细胞。Curr Biol. 2016年;26:2223–2232.PMID：27498563

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

35.Ote M， 山本 D.沃尔巴克氏体蛋白 TomO 与宿主 RNA 相互作用，诱导果蝇卵母细胞的极化缺陷。Arch Insect Biochem Physiol. 2018;99：e21475。PMID：29851149

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

36.Li Y， Minor NT， Park JK， McKearin DM， Maines JZ.Bam 和 Bgcn 拮抗 Nanos 依赖性生殖系干细胞维持。美国国家科学院院刊，2009年;106:9304–9309.PMID：19470484

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

37.White PM、Serbus LR、Debec A、Codina A、Bray W、Guichet A 等。沃尔巴克氏体对果蝇细胞全基因组RNAi筛选揭示的高宿主蛋白水解率的依赖。遗传学。2017：遗传学.116.198903.PMID：28159754

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

38.Li Y， Maines JZ， Tastan OY， McKearin DM， Buszczak M. Mei-P26 通过促进 BMP 信号传导来调节卵巢生殖系干细胞的维持。发展。2012;139:1547–1556.PMID：22438571

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

39.Neumüller RA、Betschinger J、Fischer A、Bushati N、Poernbacher I、Mechtler K 等人。Mei-P26 调节果蝇卵巢干细胞谱系中的 microRNA 和细胞生长。自然界。2008;454:241–245.PMID：18528333

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

40.佩奇 SL、麦金 KS、丹妮 B、范胡克 TL、霍利 RS。mei-p26 的遗传研究揭示了控制两性生殖细胞增殖的过程与控制果蝇减数分裂交换的过程之间的联系。遗传学。2000;155:1757.

查看文章谷歌学术搜索

41.Sekelsky JJ、McKim KS、Messina L、French RL、Hurley WD、Arbel T 等。鉴定在P元素筛选中回收的新型果蝇减数分裂基因。遗传学。1999;152:529–542.PMID：10353897

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

42.Waghmare I， Page-McCaw A. 果蝇生殖器干细胞维持和分化中的 Wnt 信号传导。基因。2018;9:127.PMID：29495453

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

73 分钟Fast EM， Toomey ME， Panaram K， Desjardins D， Kolaczyk ED， Frydman HM. 沃尔巴克氏体增强果蝇干细胞增殖并靶向生殖系干细胞生态位。科学。2011;334:990–992.PMID：22021671

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

44.阿鲁纳 S、弗洛雷斯 HA、巴巴什 DA。果蝇黑腹果蝇杂交雄性救援 （Hmr） 突变雌性的生育能力降低部分由来自兄弟物种的 Hmr 直系同源物补充。遗传学。2009;181:1437–1450.PMID：19153254

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

75 分钟Zaccai M， Lipshitz HD. 果蝇卵巢和早期胚胎中两种 adducin 样蛋白亚型的差异分布。受精卵。1996;4:159–166.PMID：8913030

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

46.Hinnant TD、Merkle JA、Ables ET。协调果蝇雌性种系中的增殖、极性和细胞命运。前细胞开发生物学 2020;8：19。PMID：32117961

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

47.果蝇生殖系干细胞活性、生态位信号活性和产蛋量的年龄相关变化.老化细胞。2008;7:344–354.PMID：18267001

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

48.Kai T， Spradling A. 分化生殖细胞可以恢复为果蝇黑腹腔卵巢中的功能性干细胞。自然界。2004;428:564–569.PMID：15024390

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

79 分钟Su TT， Sprenger F， DiGregorio PJ， Campbell SD， O'Farrell PH. 果蝇合胞体胚胎有丝分裂的退出需要蛋白水解和细胞周期蛋白降解，并且与局部去磷酸化有关。基因开发 1998;12:1495–1503.PMID：9585509

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

50.Li Y， Zhang Q， Carreira-Rosario A， Maines JZ， McKearin DM， Buszczak M. Mei-P26 与 Bam、Bgcn 和 Sxl 合作促进果蝇卵巢早期种系发育。Singh SR，编辑。PLoS 一号。2013;8：e58301。PMID：23526974

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

51.Chau J， Kulnane LS， Salz HK.性致死促进果蝇卵巢中从生殖系干细胞到承诺子细胞的过渡。遗传学。2009;182:121–132.PMID：19237687

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

52.曾春莹， 高氏华， 万国升， 曹英， 董潼贤， 徐华杰.Notch信号转导介导了与年龄相关的生殖系干细胞与生态位的粘附性降低。Kim SK，编辑。PLoS 基因。2014;10：e1004888。PMID：25521289

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

53.Chau J， Kulnane LS， Salz HK.性别致死通过在果蝇卵子发生过程中下调 Nanos 蛋白水平来实现生殖系干细胞分化。美国国家科学院院刊，2012 年;109:9465–9470.PMID：22645327

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

54.乔利 W、夏蒂埃 A、罗哈斯-里奥斯 P、布索 I、西蒙内利格 M.CCR4 去烯酰化酶与 Nanos 和 Pumilio 一起微调 Mei-P26 表达，促进生殖系干细胞自我更新。干细胞代表 2013;1:411–424.PMID：24286029

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

55.Ji S， Li C， Hu L， Liu K， Mei J， Luo Y， 等.Bam 依赖性去泛素化酶复合物可以通过靶向细胞周期蛋白 A 来破坏生殖系干细胞的维持。 Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114:6316–6321.PMID：28484036

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

56.谢婷， Spradling AC.果蝇卵巢中维持生殖系干细胞的生态位。科学。2000;290:328–330.PMID：11030649

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

57.Chen D， Mckearin D. Dpp 信号转导直接沉默 bam 转录以建立生殖系干细胞的不对称分裂。Curr Biol. 2003 年;13:1786–1791.PMID：14561403

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

58.Song X， Wong MD， Kawase E， Xi R， Ding BC， McCarthy JJ， et al.来自生态位细胞的 Bmp 信号直接抑制果蝇卵巢生殖系干细胞中促进分化基因（弹珠袋）的转录。发展。2004;131:1353–1364.PMID：14973291

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

59.格拉斯科克 E.mei-p26 基因编码一种无名指 b 盒卷曲螺旋-NHL 蛋白，该蛋白调节果蝇的癫痫发作易感性。遗传学。2005;170:1677–1689.PMID：15937125

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

50米Herranz H、Hong X、Pérez L、Ferreira A、Olivieri D、Cohen SM 等。miRNA 机制靶向 Mei-P26 并调节果蝇翼中的 Myc 蛋白水平。EMBO J. 2010 年;29:1688–1698.PMID：20400939

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

61.Ferreira A， Boulan L， Perez L， Milán M. Mei-P26 介导果蝇中对 Brat 肿瘤抑制因子和 dMyc 原癌基因的组织特异性反应。遗传学。2014;198:249–258.PMID：24990993

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

62.桑托索 CS、米汉 TL、彼得森 JS、塞达诺 TM、特洛 CV、麦考尔 K。ABC 转运蛋白 Eato 促进黑腹果蝇卵巢中的细胞清除。G3的。2018;8:833–843.PMID：29295819

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

53米Lantz V， Chang JS， Horabin JI， Bopp D， Schedl P.果蝇球体 RNA 结合蛋白是卵室形成和极性建立所必需的。基因开发 1994;8:598–613.PMID：7523244

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

64.Kaur R、Leigh BA、Ritchie IT、Bordenstein SR。来自沃尔巴克氏体噬菌体 WO 的 Cif 蛋白修饰精子基因组完整性以建立细胞质不相容性。Malik HS，编辑。PLoS Biol. 2022;20：e3001584。PMID：35609042

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

55米Turelli M，霍夫曼 AA。模拟果蝇中的细胞质不相容性：来自自然种群的动力学和参数估计。遗传学。1995;140:1319.

查看文章谷歌学术搜索

66.Yan D， Neumüller RA， Buckner M， Ayers K， Li H， Hu Y， et al.果蝇种系干细胞自我更新的调控网络。开发单元。2014;28:459–473.PMID：24576427

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

57 分钟希恩 KB、马丁 M、Lesser CF、Isberg RR、牛顿 ILG。鉴定和表征与肌动蛋白细胞骨架相互作用的候选沃尔巴克氏菌 IV 型效应子。MBio的。2016;7：E00622–E00616。PMID：27381293

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

58 分钟Russell SL， Lemseffer N， White P， Sullivan WT. 沃尔巴克氏体和宿主生殖系成分竞争驱动蛋白介导的转运到果蝇卵母细胞的后极。McGraw EA，编辑。PLoS 病理学。2018;14：e1007216。PMID：30110391

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

69.Serbus LR，沙利文 W.沃尔巴克氏体募集到宿主种系的细胞基础。PLoS 病理学。2007;3：e190.PMID：18085821

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

40 分钟Ferree PM， Frydman HM， Li JM， Cao J， Wieschaus E， Sullivan W. Wolbachia 利用宿主微管和动力蛋白在果蝇卵母细胞中进行前定位。PLoS 病理学。2005;1：e14。PMID：16228015

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

41米White PM， Pietri JE， Debec A， Russell SL， Patel B， Sullivan W. 黑腹果蝇沃尔巴克氏菌属水平细胞间转移的机制。应用环境微生物。2017;83：E03425–E03416。PMID：28087534

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

42 分钟Albertson R， Casper-Lindley C， Cao J， Tram U， Sullivan W. 对称和不对称有丝分裂分离模式影响沃尔巴克氏体在宿主体细胞组织中的分布。细胞科学杂志 2009;122:4570–4583.PMID：19934219

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

43米Hackney JF， Pucci C， Naes E， Dobens L. Ras 信号转导在果蝇卵巢细胞迁移过程中调节蜕皮激素受体 EcR 的活性。Dev Dyn.2007;236:1213–1226.PMID：17436275

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

44 分钟Rastegari E， Kajal K， Tan B-S， Huang F， Chen R-H， Hsieh T-S， et al. WD40 蛋白 Wuho 通过 TRIM-NHL 肿瘤抑制因子 Mei-p26 控制果蝇中的种系稳态。发展。2020;147：dev182063。PMID：31941704

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

45 分钟Rhiner C、Díaz B、Portela M、Poyatos JF、Fernández-Ruiz I、López-Gay JM 等。果蝇卵巢生殖系生态位中干细胞及其女儿之间的持续竞争。发展。2009;136:995–1006.PMID：19211674

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

76.Chen D， Wu C， Zhao S， Geng Q， Gao Y， Li X， 等.三种RNA结合蛋白形成复合物，促进果蝇种系干细胞谱系的分化。Fuller MT，编辑。PLoS 基因。2014;10：e1004797。PMID：25412508

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

47米Ote M， Yamamoto D. 沃尔巴克氏体感染对果蝇雌性生殖系干细胞的影响。Curr Opin 昆虫科学 2020;37:8–15.PMID：31726321

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

48 分钟-lethal 是 Bruno 介导的翻译抑制在果蝇卵子发生过程中促进干细胞后代分化的靶标。开发生物学 2007;302:160–168.PMID：17067567

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

49米Ye Y， Godzik A. 蛋白质结构域组织的比较分析.基因组研究 2004;14:343–353.PMID：14993202

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

80.Beebe NW、Pagendam D、Trewin BJ、Boomer A、Bradford M、Ford A 等。释放不相容的雄性会在澳大利亚野生和携带沃尔巴克氏体的埃及伊蚊种群中产生强烈的抑制作用。美国国家科学院院刊 2021;118：e2106828118。PMID：34607949

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

81.Anderson JA， Gilliland WD， Langley CH. 分子群体遗传学和果蝇减数分裂基因的进化。遗传学。2009;181:177–185.PMID：18984573

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

82.Bean DM、Heimbach J、Ficorella L、Micklem G、Oliver SG、Favrin G. esyN：网络构建、共享和发布。Promponas VJ，编辑。PLoS 一号。2014;9：e106035。PMID：25181461

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

83.Casper-Lindley C， Kimura S， Saxton DS， Essaw Y， Simpson I， Tan V， et al. 果蝇种系和体细胞组织中基于荧光的沃尔巴克氏体内共生体的快速荧光筛选。应用环境微生物。2011;77:4788–4794.PMID：21622788

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

84.Serbus LR、White PM、Silva JP、Rabe A、Teixeira L、Albertson R 等。宿主饮食对果蝇沃尔巴克氏体滴度的影响。PLoS 病理学。2015;11：e1004777。

查看文章谷歌学术搜索

85.Bopp D， Bell LR， Cline TW， Schedl P. 雌性特异性性致死蛋白在黑腹果蝇中的发育分布。基因开发 1991;5:403–415.PMID：1900493

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

86.Spradling A.卵子发生的发育遗传学。Dev Drosoph Melanogaster。1993.

查看文章谷歌学术搜索

87.Bolger AM， Lohse M， Usadel B. Trimmomatic：用于Illumina序列数据的灵活微调器。生物信息学。2014;30:2114–2120.PMID：24695404

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

88.Dobin A， Davis CA， Schlesinger F， Drenkow J， Zaleski C， Jha S， et al. STAR：超快通用RNA-seq比对仪。生物信息学。2013;29:15–21.PMID：23104886

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

89.Li H， Handsaker B， Wysoker A， Fennell T， Ruan J， Homer N， et al.序列对齐/映射格式和 SAMtools。生物信息学。2009;25:2078–2079.PMID：19505943

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

90.Bray NL， Pimentel H， Melsted P， Pachter L. 近优概率 RNA-seq 定量。国家生物技术。2016;34:525–527.PMID：27043002

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

91.Chung M、Bruno VM、Rasko DA、Cuomo CA、Mu?oz JF、Livny J 等。多物种RNA-seq差异表达分析的最佳实践。基因组生物学 2021;22：121.PMID：33926528

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

92.Marsh JW、Hayward RJ、Shetty AC、Mahurkar A、Humphrys MS、Myers GSA。细菌和宿主细胞双重RNA测序实验的生物信息学分析。简短的生物信息。2017 [引用于 2023 年 2 月 10 日]。PMID：28535295

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

93.Love MI， Huber W， Anders S. 使用 DESeq2 对 RNA-seq 数据的倍数变化和分散进行适度估计。基因组生物学 2014;15：550。PMID：25516281

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

94.Soneson C、Love MI、Robinson 医学博士。RNA-seq的差异分析：转录水平的估计可改善基因水平的推断。F1000研究。2016年PMID：26925227

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

95.Li H， Janssens J， De Waegeneer M， Kolluru SS， Davie K， Gardeux V， et al. 果蝇细胞图谱：成虫果蝇的单核转录组图谱。科学。2022;375：EABK2432。PMID：35239393

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

96.Ge SX， Jung D， Yao R. ShinyGO：一种用于动植物的图形化基因集富集工具。瓦伦西亚 A，编辑。生物信息学。2020;36:2628–2629.PMID：31882993

查看文章PubMed/NCBI公司谷歌学术搜索

97.Eklund A. 蜂群。2023. 可从： https://github.com/aroneklund/beeswarm.

查看文章谷歌学术搜索

98.Wickham H. ggplot2：用于数据分析的优雅图形。纽约，纽约：斯普林格;2009. https://doi.org/10.1007/978-0-387-98141-3

99.Blighe K， Rana S， Turkes E， Ostendorf B， Grioni A， Lewis M. EnhancedVolcano：具有增强着色和标签的可出版火山图。生物导体版本：发布。2023;(3.17).

查看文章